WO2004012751A1

WO2004012751A1 - 細菌細胞壁骨格成分製剤

Info

Publication number: WO2004012751A1
Application number: PCT/JP2003/009801
Authority: WO
Inventors: Takehiko Nomura; Makoto Sunagawa; Yuko Uenishi
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited
Priority date: 2002-08-02
Filing date: 2003-08-01
Publication date: 2004-02-12
Also published as: JP2010271322A; US20050250175A1; JP4726485B2; AU2003254792A1; EP1547607A4; EP1547607A1; JP5156924B2; JPWO2004012751A1

Abstract

　新規な細菌細胞壁骨格成分製剤、および細菌の細胞壁骨格成分の分析方法の提供。　細菌細胞壁骨格成分（細菌−CWS）および油からなるペーストであり、０．２～０．７poise（２５℃）の粘度を有する細菌−CWS含有ペースト、該ペーストを含有するエマルジョン、および凍結乾燥製剤を提供することが可能となった。また、細菌細胞壁骨格成分に含まれる高級脂肪酸またはその誘導体を分析することによって、細菌の細胞壁骨格成分を有効成分として含有する医薬組成物およびその製造中間体の品質を評価し、力価を検定し、有効成分を同定することが可能となった。

Description

明細書細菌細胞壁骨格成分製剤技術分野

本発明は、細菌の細胞壁骨格成分 (細菌- CWS) を有効成分として含有する凍結乾燥製剤、該凍結乾燥製剤の製造中間体および該凍結乾燥製剤、該製造中間体の調製方法、ならびにミコバタテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌- CWSを有効成分として含有する医薬品の分析方法等に関する。背景技術

微生物死菌、細菌の細胞壁骨格成分（以下細菌一 CWSと略する）は、免疫賦活作用を有し、例えば動物モデルを用いた実験的腫瘍系、およびヒト癌の免疫療法において抗腫瘍活性を示すことが知られている。

細胞壁骨格成分を油成分中に分散、乳化させ、水中油型ェマルジヨン製剤として投与した場合、免疫賦活作用による抗腫瘍効果などが著しく高まることが知られている。例えばゥシ型結核菌の細胞壁骨格成分 (以下、 B C G— CW Sと略す）の水中油型ェマルジヨンを用いた癌免疫療法では、ヒトの癌治療において優れた成績が得られたことが報告されている (Pro. Japan Acad.,70,Ser.B 205- 209(1994)、 Pro. Japan Acad.，74,Ser.B 20550-55(1998))。この水中油型ェマルジョン製剤は、細菌- CWSを油中に分散したペースト状の原体に、界面活性剤を含む水を加えてェマルジョン化する等して調製することができる（J. Nat. Cancerlnst. 48, 831-835 (1972)、 J. Bacterid, 92, 869-879 (1966)、 Gann, 69， 619-626 (1978)) 。

一般に、細菌- CWSを含有する水中油型ェマルジョン製剤は非常に不安定であり、数日で不溶性凝集物が生成する。その傾向は油成分の量が少ない場合、特に顕著である。一方、油成分の多い水中油型ェマルジヨン製剤は、投与された生体への負担が大きく、副作用をもたらす可能性がある。そのため、現在、臨床現場では、使用時に必要な量の水中油型ェマルジヨン製剤を手作業にて用時調製している。しカゝし、手作業による用時調製では、常に一定規格を有する製剤を調製することは困難である。よって、水中油型ェマルジヨン製剤を凍結乾燥して保存安定性の高い凍結乾燥製剤とし、使用時に注射用蒸留水等の水性溶媒を加えて水中油型ェマルジヨン製剤を再懸濁させる方法が、臨床現場での使い易さ、製剤の保存安定 I¹生の点から好ましい。このように、事実上医薬品として実用化できる、恒常的生産が可能な、安定な水中油型ェマルジヨン製剤やその凍結乾燥製剤が求められている。

一方、細菌- CWSを有効成分とする製剤が調製できたとしても、医薬品として上巿するには、その生物学的力価を評価し、有効成分の同一性を確認しなければならない。通常、化学物質を有効成分とする医薬品は有効成分が化学分析により測定できるため、その同一性や含量を評価できる。

しカゝしながら、細菌- CWSはミコール酸等の高級脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンからなる 3層構造を有する生体高分子であり、水や有機溶媒に不溶であるため、化学物質を測定するために通常用いられる H P L C、 G C等の分析方法では測定することができない。

細菌は、属、種および株によって構成成分が異なるが、結核菌、 B C G菌等のミコパクテリゥム属細菌の同定方法として、遺伝子解析による方法のほか、ミコバタテリゥム属細菌等に特徴的に存在するミコール酸を分析する方法が知られている。すなわち、ミコパクテリゥム属細菌等をアルカリ加水分解した後、有機溶媒でミコール酸を抽出し、これを H P L Cで分析することにより、その溶出パターンから、属、種の同定が可能であることが報告されている（J. Clinical

Microbiology, 1327-1330, May 1992) 。

し力、し、細菌一 CW S中のミコール酸を正確に定量する方法は知られていない。発明の開示

本発明の課題は、細菌の細胞壁骨格成分を有効成分とする、安定で凍結乾燥可能な水中油型ェマルジヨン、本宪明の水中油型ェマルジヨンの凍結乾燥製剤、本発明製剤の原料である細菌一 CWSやその製造中間体に当たる細菌一 CWS含有べースト、これらの調製方法、および本発明製剤中の有効成分を同定しその力価を定量的に測定する方法、有効成分として用いられる細菌一 CWSの由来細菌の属、種および株を同定する方法、ならぴに本発明の製剤およびその製造中間体が標準品と同一であることを検定する方法を^することにある。

本発明者らは、細菌一 CWSを有効成分として含有する安定性に富む水中油型ェマルジヨン、および凍結乾燥製剤を得るべく、細菌- CWS、油、界面活性剤、および安定化剤等の組成、および調製工程について、鋭意検討を行った。まず、安定な水中油型ェマルジョンおよび、優れた再懸濁安定性を有するェマルジヨンの凍結乾燥製剤を良好に調製するには、製造中間体となる細胞壁骨格成分および油からなるペーストの性状が重要であると考えた。そこで、油の種類、油の組成、および油と細胞壁骨格成分の比率等を指標として、詳細に検討を進めたところ、安定な水中油型ェマルジョンの性状を左右する大きなファクタ一は、細菌一

CWSと油カゝらなる細胞壁骨格成分含有ペーストの粘度であることを見出した。また、良好な粘度を得るための、細胞壁骨格成分と油の比率を明らかにした。すなわち、細菌一 CWSは、水、油のいずれにも溶角早しないため、均一な粒度分布を有するェマルジヨンとするのが困難である。特に、油の粘度が高い場合および油の量が少ない場合、混合攪拌時に均一に細菌一 CWSを油中に拡散させることができないことがわかった。種々の油を用いて検討したところ、油の種類によらず、ある一定の粘度以下で、ェマルジヨン化に適した細菌一CWS含有ぺーストが得られることがわかった。具体的には粘度約 0 . 7poise以下の細菌一 CWS含有ペーストを用いて乳ィヒ工程を行えば、良好な粒度分布を示すェマルジョンが得られることがわかった。

一方で、細菌一 CWSに対する油の割合が高く、低い粘度を有する細菌一CWS 含有ペーストを用いた場合、問題なくェマルジヨンを得ることができるものの、凍結乾燥後に水を加えて再懸濁した場合、好適な粒度分布のェマルジョンが再現できないことも判明した。鋭意検討した結果、粘度約 0 . 2 poise以上の細菌一

CWS含有ペーストであれば、凍結乾燥後の再懸濁安定性も維持できることがわかった。

また、細菌一 CWSを有効成分として含有する凍結乾燥製剤においては、上記細菌- CWS含有ペーストの性状の他、界面活性剤および安定化剤によって、その安定性、および再懸濁した後に得られる水中油型製剤の安定性（再懸濁安定性）等の製剤品の品質は異なる。

上記国際公開パンフレツト WO00/3724には、グリシンを安定化剤として用いる方法が知られているが、安定な凍結乾燥製剤を得るためには、約 900mM〜 1200mM (約 6.9%〜9.2%) のグリシンが必要であることが記載されている。しかし、グリシンの場合 300mM (2.3%) が生体にとって等張濃度であるため、このような高濃度では生体への負担が懸念される。

そこで、鋭意検討した結果、安定化剤としてマン-トールを用いることにより、再懸濁安定性に富む凍結乾燥製剤を調製できることがわかつた。

本発明者は鋭意検討した結果、前記本発明の細菌一CWS含有ペーストの水中油型ェマルジョンにおいて、 1 ~ 10。好ましくは 1〜 5 %のマン-トールを安定化剤として用いることによって、凍結乾燥製剤の安定性、および再懸濁した後の水中油型ェマルジョンの安定性が高まることがわかった。

さらに、発明者は、該細菌一 CWS含有ペーストの調製工程について検討した。既に、細菌一CWSと油を混合する際、有機溶媒で一旦希釈して攪拌した後、溶媒を留去する方法が、前記国際公開パンフレツト WO00/3724に記載されている。

発明者らは、種々の有機溶媒を分散捕助溶媒として用いて鋭意検討を行ったところ、非極性溶媒を用いることによって、極性溶媒のみを用いた場合よりも優れた細菌細胞壁骨格成分含有ペーストが得られることを見出した。

本発明は、上記の知見に基づき、完成するに至ったものである。

すなわち、本発明は、

[1] 細菌一 CWSおよぴ油からなる細菌一CWS含有ペーストであり、 0. 7 poise (25°C) 以下の粘度を有するペースト、

[2] 0. 2~0. 7 poise (25°C) の粘度を有する [ 1 ]記載の細菌一CWS 含有ペースト、

[3] 0. 28〜0. 55 poise (25°C) の粘度を有する [1] 記載の細菌一 CWS含有ペースト、

[4] 細菌一 CWSの粒子径が、 0.15 ！〜 6 zmであることを特徴とする、 [I] 〜 [3] のいずれか記載の細菌一 CWS含有ペースト、

[5] 細菌一 CWSの粒子径において、 D10%： 0.38 以上、 D90% : 0.70 /zm以下であることを特徴とする [4] 記載の細菌一CWS含有ペースト、

[6] 細菌一 CWS力 SBCG-CWSである、 [1] 〜 [5] のいずれか記載の細菌一 CWS含有ペースト、

[7] 油が、スクヮラン、スクワレン、シンセラン 4、落花生油、ツバキ油、大豆油、流動パラフィン、およびォレイン酸ェチルの中から選ばれる 1または複数の油の混合物である、 [1] 〜 [6] のいずれ力記載の細菌一 CWS含有ペース卜、

[8] 油が、スクヮラン、スクワレン、大豆油、流動パラフィンおよびォレイン酸ェチルの中から選ばれる 2種類の油の混合物である、 [7] 記載の細菌一 CWS含有ペースト、

[9] 油が、大豆油、流動パラフィンおよぴォレイン酸ェチルの中から選ばれる 1種の油とスクヮランとの混合物である、 [8] 記載の細菌一 CWS含有ペース K

[10] 油が、ォレイン酸ェチルとスクヮランとの 1 ： 1の混合物である、

[9] 記載の細菌— CWS含有ペースト、

[I I] 油が、スクヮランである、 [7] 記載の細菌一 CWS含有ペースト、

[12] 細菌一CWS力 ¾CG-CWSであって、 BCG-CWS約 0. 67 gに対して、スクヮラン 6. 6g~35. 2 gを含有することを特徴とする、 [1：] 〜 [5] のいずれ力記載の細菌一 CWS含有ペースト、

[13] 以下の（1) および（2) の工程を含むことを特徴とする、細菌一

CWS含有ペーストの調製方法、

(1) 細菌一 CWSおよび油を、分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合するェ程、

(2) (1) の有機溶媒を留去する工程、

[14] 有機溶媒がエーテル系溶媒である、 [13]記載の調製方法、

[15] 有機溶媒が炭化水素系溶媒、またはハロゲン化炭化水素系溶媒である、

[13] 記載の調製方法、 [16] 有機溶媒がハロゲン化炭化水素系溶媒であって、該ハロゲン化炭化水素系溶媒が、 1， 2—ジクロロェタン、クロ口ホルム、またはジクロロェタンである、 [15] 記載の調製方法、

[17] 有機溶媒が炭化水素系溶媒であって、該炭化水素系溶媒が、ヘプタン、またはへキサンである、 [15] 記載の調製方法、

[18] 有機溶媒が、 5〜 20 % (V/V) のアルコール系溶媒を含むことを特徴とする、 [15] 〜 [17] のいずれか記載の調製方法、

[19] [13] 〜 [18] のいずれ力記載の調製方法によって得られる細菌一 CWS含有ペースト、

[20] 細菌力 ¾CG菌であることを特徴とする [19] 記載のペースト、

[21] 油がスクヮラン、または流動パラフィンであることを特^ [とする、 [1 9] または [20] 記載のペースト、

[22] [1] 〜 [12] 、および [19] 〜 [21] のいずれか記載の細菌一 CWS含有ペースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有することを特徴と ' する水中油型ェマルジヨン、

[23] 水 2Lあたり、 0. 66 g〜3. 35 gの細菌一 CWS、および 0.

4%〜8重量％の油を含有することを特徴とする、 [22] 記載の水中油型エマルジョン、

[24] 安定化剤として 1〜： L0%のマンニトールを含有する [22] または [2 3] 記載の水中油型ェマルジヨン、

[25] 界面活性剤として 0. 01 %〜 3 %のポリエチレンォキシソルビタン脂肪酸エステルを含有する [22] 〜 [24] のいずれ力記載の水中油型ェマルジョン、

[26] ポリエチレンォキシソルビタン脂肪酸エステルがツイーン 80である [25] 記載の水中油型ェマルジヨン、

[27] 以下の①〜②の特徴を有する [22] 〜 [26] のいずれか記載の水中油型エマノレジョン、

①ェマルジョン油滴粒子径が、 0. 2〜 30 μ mである。

②細菌一 CWSが油滴中に包含され、レクチン反応が陰性を示す。 [28] ェマルジョン油滴粒子径において、 D10%： 0.5/ m以上、 D90%： 20 m以下であることを特徴とする [27] 記載の水中油型ェマルジヨン、

[29] 以下の（1) 〜（2) の工程を含むことを特徴とする、 [22] 〜 [28] のいずれ力記載の水中油型ェマルジョンの調製方法、

(1) [1] ~ [12] _s および [19] 〜 [21] のいずれか記載の細菌一

CWS含有ペーストと、界面活性剤を含む水溶液の混合液を、曇点以上の温度で乳化する工程、

(2) 安定化剤を含む水溶液を加えて希釈する工程、

[30] 前項（2) の工程が、曇点以下の温度で実施されることを特徴とする [29] 記載の調製方法。

[31] 前項の（1) における乳化する工程が、以下の（3) 〜（4) の工程を含むことを特徴とする [29] または [30] 記載の調製方法、

(3) [1：! 〜 [12] 、および [19] 〜 [21] のいずれ力記載の細菌一 CWS含有ペーストと、 0.02%〜0.8%の界面活性剤を含む水溶液の混合液を乳化する工程（粗乳化工程）、

(4) (3) の混合液に界面活性剤を含む水溶液を加えて界面活性剤濃度を調整し、強攪拌して本乳化を行う工程、

[32] 界面活性剤がポリエチレンォキシソルビタン脂肪酸エステルである [ 3 1] 記載の調製方法、

[33] 記載のポリエチレンォキシソルビタン脂肪酸エステルがツイーン 80である [32] 記載の水中油型ェマルジヨンの調製方法、

[34] 安定化剤がマンニトールである [29] 〜 [33] のいずれか記載の水中油型ェマルジョンの調製方法、

[35] [22] - [28] のいずれ力記載のェマルジヨンを凍結乾燥することによって得られる、凍結乾燥製剤、

[36] 粒度分布において、粒子径が、 0.15〜6/xmであることを特徴とする、細菌の細胞壁骨格成分粒子集合体（細菌— CWS粒子集合体）、

[37] 粒度分布において、粒子径が、 0.2~2umであることを特徴とする、細菌— CWS粒子集合体、 [38] 粒度分布において、 D10%が 0.2以上であり、 D90%が 0.7以下であり、力 o、単一ピークを有することをことを特徴とする [36] または [37] 記載の細菌一 CWS粒子集合体、

[39] 粒度分布において、 D10%が 0·23±0.05であり、 D90%が 0·60±0·05 であり、かつ、単一ピークを有することをことを特徴とする [36] 〜 [38] のいずれ力記載の細菌一 CWS粒子集合体、

[40] 脂肪族炭化水素系溶媒を含む溶媒中で分散することを特徴とする、 [36] 〜 [39] のいずれ力記載の細菌一 CWS粒子集合体の調製方法、

[41] 溶媒が、脂肪族炭化水素系溶媒と、アルコール系溶媒の混合物であることを特徴とする [ 40 ] 記載の調製方法、

[42] 溶媒が、 5〜20%エタノールを含むヘプタンであることを特徴とする [41] 記載の調製方法、

[42-2] [40] 〜 [： 42] のいずれ力記載の調製方法により得られることを特徴とする細菌一 CWS、

に関する。

さらに、本発明はこの態様において、

[42-3] 粒度分布において、粒子径が 0.1μιη〜20/zm、好ましくは 0.15〜6μ m、さらに好ましくは 0·2μιη~2μ mである細菌- CWS粒子集合体を含有する、本発明の細菌一 CWS含有ペースト、

[42-4] 細菌一 CWS粒子集合体が粒度分布において D10%が 0.23±0.05であり、 D90%が 0·60±0.05であり、かつ単一ピークを有する、 [42— 3] 記載の細菌一CWS含有ペースト、

[42-5] [42-3] または [42— 4] 記載の細菌一 CWS含有ペースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有する、水中油型ェマルジヨン、 [42-6] [42— 5] 記載のェマルジヨンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤。

[42-7] 本発明のェマルジヨンからなる医薬組成物、に関する。

また、ミコノクテリゥム属の CWSには構成成分として約 30〜45%の高級脂肪酸が含まれ、高級脂肪酸のパターンによって細菌の属、種等を同定する方法 1

9

が知られていた。しかし、ミコパクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌一 C WSに含まれる高級脂肪酸の量を正確に定量する方法や、該高級脂肪酸によって細菌一 CWSの由来細菌の属、種または株を同定する方法は知られていなかった。発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、ミコパクテリゥム属およぴノカルジァ属等の細菌の CWSに含まれる高級脂肪酸を抽出して分析することによって、ミコバクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の菌種 ·菌株が同定され、該細菌の C WSの力価を評価できることを見出した。さらに、検出感度を上げるべく誘導体へ変換した後、 H P L C等で分析することによって、高級脂肪酸の定量を効率的に行う方法を確立した。

一方、ミコパクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の CWSは、ミコール酸等の高級脂肪酸、糖類、ペプチドダリカン等からなる生体高分子であるが、力価に影響を与えるその成分、成分比おょぴ分子量は、細菌の培養条件により異なる。そのため、ミコバタテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の CWSについては、その製造口ットごとの同等性おょぴカ価を評価する必要がある。

発明者らは、鋭意検討した結果、 BCG菌の CWS (BCG-CWS) において、 CWSに含まれるミコール酸の量と、 BCG— CWSの生物活性が相関していることを見出し、簡便な力価評価方法を確立した。具体的には、 BCG— CW S標準品において、ミコール酸含量と、 BCG— CWSの生物活性、すなわち免疫賦活能の一つである T N F - _α産生誘導活性が比例関係を示すことがわかった (図 8) 。すなわち、ミコバタテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の、 CW

Sの構成成分である高級脂肪酸を定量することにより、ミコバタテリゥム属およぴノカルジァ属等の細菌- CWSの免疫賦活剤、および /または、抗腫瘍剤としての力価を評価できることがわかった。また、菌体、原薬および製剤から得た高級脂肪酸のクロマトグラムから、細菌の属、種および株を同定できることがわかつた。

本発明は、上記の知見を基に完成するに至ったものである。すなわち本発明は、

[43] 細菌の細胞壁骨格成分（Cell Wall Skeleton, 以下 C W Sと称する。）の菌種 '菌株の同定方法であって、以下の工程 (1) 〜（3) を含むことを特徴とする方法； (1) 細菌の cws中に含まれる、高級脂肪酸を分離および Zまたは抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、

(2) (1) の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィ一により分析する工程、

(3) (2) の分析結果に基づき、細菌の CWSの菌種 '菌株を評価する工程、

[44] 前項の工程 (2) 1 高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を標識化して標識化高級脂肪酸誘導体を調製する工程を含むことを特徴とする、 [43] 記載の方法、

[45] 前記 [43] における工程 (3) 力細菌の CWSの標準品と比較することを含む、 [43] または [44] 記載の方法、

[46] 細菌の細胞壁骨格成分（Cell Wall Skeleton, 以下 C W Sと称する。）の力価検定方法であって、以下の工程（1) 、（4) 、および（5) を含むことを特徴とする方法；

(1) 細菌の CWS中に含まれる、高級脂肪酸を分離 '抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、

(4) (1) の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程、

(5) (4) の分析結果に基づき、細菌の CWSの免疫賦活能を評価する工程、

[47] 高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する（4) の工程が、高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を蛍光標識化して蛍光標識化高級脂肪酸誘導体を調製する工程を含むことを特徴とする、 [46] 記載の方法、

[48] 細菌の CWSの免疫賦活能を評価する（5) の工程が、細菌の CW Sの標準品と比較することを含む、 [46] または [47] 記載の方法、

[49] 高級脂肪酸誘導体が高級脂肪酸エステルであることを特徴とする、

[43] 〜 [48] のいずれか記載の方法、

[50] 高級脂肪酸誘導体が、蛍光標識された誘導体であることを特徴とする [49] 記載の方法、

[51] 細菌がミコバタテリゥム属またはノカルジァ属の細菌であることを特徴とする、 [43] 〜 [50] のいずれかに記載の方法、

[52] ミコパクテリゥム属の細菌が BCG菌であることを特徴とする、 [51] 記載の方法、

[53] 高級脂肪酸がミコール酸であることを特徴とする、 [43] 〜 [5 2] のいずれかに記載の方法、

に関するものである。図面の簡単な説明

図 1は、分散補助溶媒にヘプタンを用いた場合のペースト中の BCG— CWS の粒度分布を示した。

図 2は、分散補助溶媒に 90%ヘプタン /10%エタノールを用いた場合のペーストの粒度分布を示した。

図 3は、凍結乾燥前のスクワラン 1.6%処方製剤における、水中油型ェマルジヨンの粒度分布を示した。

図 4は、凍結乾燥後のスクヮラン 1.6%処方製剤における、水中油型ェマルジョンの粒度分布を示した。

図 5は、被験サンプルのクロマトグラムを示す図であり、横軸は H PLCの保持時間、縦軸は蛍光強度を示す。

図 6は、 B CG— CWS原薬の標準品の検量線を示す図である。

図 7は、細菌の菌株による違いで、クロマトグラムから同定できる（上図： B

CG菌の東京株、下図： BCG菌のパスツール株）ことを示す図である。

図 8は、被験物質のミコール酸量と生物活性の相関関係を示す図である。発明を実施するための最良の形態

本発明において、細菌- CWSの由来微生物としては、グラム陽性棹菌のミコパクテリゥム属細菌、ノカノレジァ属細菌、コリネパクテリゥム属細菌 (プロプリオネパクテリゥム属)、ロドコッカス属細菌、ポノレデテラ属、リステリア属、またはゴルドナ属細菌などが挙げられ、好ましくはミコパクテリゥム属細菌およびノカルジァ属細菌が肇げられる。「ミコパクテリゥム属細菌」とは、抗酸菌のミコバタテリゥム属の細菌を表し、具体的には、結核菌群細菌の Mycobacterium tuberculosis (結核菌）、 Mycobacterium bovis (ゥシ型結核菌、 B C G菌を含む) ヽ Mycobacterium africanum (アフリカ ) 、 Mycobacterium microti 、ズミ型結核菌）があり、この他、 Mycobacterium leprae (ライ菌)、非結核性抗酸菌群である Mycobacterium kansasii、 Mycobacterium avium_s

Mycobacterium phlei等が挙げられる。ノカルジァ属細菌として具体的には、ノカルジァ .ルブラなどが挙げられる。細菌- CWSは、物理的に細菌を粉砕した後、除核酸、除蛋白、脱脂等の精製工程を経て、不溶性残渣として得られ、その製法自体は公知である（J. Nat. Cancer Inst.， 52， 95- 101 (1974))。

なお、細胞壁骨格成分の濃度は、ェマルジヨンとして 0. 0 1 ~ 1 0 m g /m

1になるように使用される。好ましくは、 O.lm g Zm 1〜2 m g Zm 1、さらに好ましくは 0.2m g Zm 1〜： L m g Zm 1である。

本宪明の「油」としては、 Immunolog 第 2 7卷、第 3 1 1〜 3 2 9項（1 9 7 4年）に記載されているような鉱物油、動植物油が挙げられる。鉱物油としては、例えば、流動パラフィン（ドレコール 6VR、モレスコバイオレス U-6、モレスコバイオレス U-8等）、バイオール (Bayol F；)、などが挙げられる。植物油としては、例えば、大豆油、シンセラン 4、ォレイン酸ェチル、落花生油、椿油、ゴマ油、 AD-65 (落花生油とァラセルとアルミニウムモノステアレートの混合物）等が挙げられる。動物油としては、例えば、スクヮラン、スクワレンのようなテルぺノイド誘導体が挙げられる。また、これら、動植物油、鉱物油の中から選ばれる複数の油の混合物を挙げることができる。好ましいものとしては、スクヮランあるいは例えば、大豆油、ォレイン酸ェチル、ォレイン酸等の植物油（またはそれに由来する油）とスクヮランとの混合物、例えば、ドレコール 6VR、各種流動バラフィン等の鉱物油とスクワランの混合物が挙げられる。

よ好ましくは、スクヮラン、ドレコール 6VE、スクヮランと大豆油の混合物、スクヮランとォレイン酸ェチルの混合物、またはスクヮランとドレコール 6VRの混合物を挙げることができる。

本明の「粘度」とは、動的粘弾性法により測定されるものであり、例えば、共軸二重円筒型の粘度測定装置を使用して得られる値を言う。本発明では、 (株）レオ口ジ社製共軸二重円筒型の粘度測定装置 (MR-300 ソリキッドメータ）を使用し、窒素雰囲気下 2 5 °Cで粘度を測定することができる。 1 poiseは、 0 . l Pa-s (パスカル ·秒）を表す。

本発明のペーストを調製する際に使用可能な「分散補助溶媒としての有機溶媒 j は、窒素気流下加熱あるいは減圧下などで留去可能な有機溶媒が挙げられ、 2種類以上の溶媒の混合物であってもよい。具体的には、大気圧での沸点が 3 0 °C〜1 4 0 °Cの溶媒が挙げられる。

本発明のペースト調製にエタノール等のアルコール系溶媒を単独で用いた場合、細菌一 CWSは十分に分散されず、他方トルエン等の芳香族炭化水素、へキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素、クロロホゾレム等のハロゲン系溶媒、またはテトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒といった非極性溶媒を用いると、均一な分散溶液が得られ、均一性に優れたペーストが得られることが判明した。さらに、一部にアルコール系溶媒を含む非極性溶媒を用いると、非極性溶媒のみを用いた場合よりもさらに優れた細菌一 CWS含有ペーストを得られることがわかった。非極性溶媒を単独で用いた場合、粒子径が約 1 0 /z mの巨大粒子が若干混在し、ベースト内の細菌一 CW Sの粒度分布は 2つのピークを示し（図 1 ) 、水中油型エマルジョンを調製した場合、ロット間のばらつきを生じやすい傾向があつたが、ァルコール系溶媒を混合させると、均一な粒度分布が得られることが判明した。そこで、本発明のペースト調製にとって好ましい分散補助溶媒としては、非極性溶媒、および非極性溶媒とアルコール系溶媒の混合溶媒を挙げることができる。ここで溶媒としては、 I C Hの残留溶媒ガイドラインに記載のクラス 2、クラス

3の溶媒を選択することが好ましい。

非極性溶媒としては具体的には、例えばトルエン等の芳香族炭化水素、例えばシクロペンタン、シク口へキサン、ペンタン、へキサン、ヘプタン、才クタン等の脂肪族炭化水素、例えばジクロロメタン、クロ口ホ^^ム、トリクロロエチレン等のハロゲン化炭化水素等、およびテトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒が挙げられる。非極性溶媒は一種類に限らず、適宜数種類組み合わせて使用することができる。

アルコール系溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、またはプタノール等が挙げられ、特に好ましくはエタノールが挙げられる。

分散捕助溶媒がアルコール系溶媒と非極性溶媒の混合物である場合、アルコ一ル系溶媒は 5〜 3 0 %、好ましくは 5〜 2 0 %、さらに好ましくは 5 ~ 1 5 %含有する。

より好ましくは溶媒としては、クロ口ホルム、ジクロロメタン、トリクロロェチレン等のハロゲン化炭化水素、へキサン、ヘプタン、ペンタン、オクタン等の脂肪族炭化水素、 0〜20%のエタノールを含む方芳香族炭化水素もしくは脂肪族炭化水素が挙げられる。具体的には、 5〜 2 0 %エタノール一ヘプタン、 5〜2 0 ⁰/₀エタノ一ルーへキサン、 5〜 2 0 %エタノ一ルートルエン、 5— 2 0 %エタノールーシクロへキサン、 5〜2 0 %プロパノール一ヘプタン、 5〜2 0 %イソプロパノール一ヘプタン等を例示することができ、好ましくは、 1 0 %エタノールーヘプタンが挙げられる。

本発明で使用可能な「界面活性剤」としては、医薬品製剤に使用される界面活性剤であれば特に制限されるものではない。例えばリン脂質、非イオン性界面活十生剤などを挙げることができる。リン脂質としては、ホスファチジルァミン、ホスファチジルェタノールァミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジノレセリン、スフインゴミエリン、またはレシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も使用することができる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン一ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート 2 0 ) 、同モノパルミテート（ポリソノレべート 4 0)、同モノステアレート（ポリソノレべート 6 0)、または同モノォレート（ポリソルベート 8 0 ) 等のポリォキシエチレンソルビタン脂肪酸エステノレ類およびソルビタンモノラウレート（S p a n 2 0 ) 、同モノパルミネート（S p a n 4 0 ) 、同モノステアレート（S p a n 6 0 ) 、同モノォレート（S p a n 8 0)等のソルビタン脂肪酸エステル類などを挙げることができる。好ましい界面活性剤としては、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、ポリソルベート 8 0、ポリソノレべ一ト 2 0、ポリォキシエチレン硬化ヒマシ油 6 0 (HCO-60) 、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 50 (HCO- 50) 、ポリオキシエチレン（160) ポリオキシプロピレン（30) グリコール（プノレ口ニック F 68) を挙げることができる。より好ましくは、ポリソルベート 80 が挙げられる。

界面活个生剤の濃度は、水中油型ェマルジョンにおいて 0. 01〜 10 %_W w の範囲が適当であり、 0. 01~3%が好ましい。これら界面活性剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。

「安定化剤」とは、上記ェマルジヨンのェマルジヨンとしての安定性を維持，向上する目的で使用される成分である。本発明で使用可能な安定化剤としては、単糖類、糖アルコール、多糖類、アミノ酸、タンパク質、ゥレア、または無機塩などが挙げられる。単糖類および二糖類としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ラタトース、トレハロース等が挙げられる。糖アルコールとしては、ンニトール、ソルビトール等が挙げられ、より好ましい糖アルコールとしてはン-トールが挙げられる。多糖類としては、デキストラン、でんぷん、マルトデキストリン、セルロース、ポリビエルピロリドン、またはアルギン酸ナトリウム等が好ましいものとして挙げられる。アミノ酸としては、ァラニン、グリシン、プロリン等の中性ァミノ酸が好ましく、より好ましい中性ァミノ酸としてグリシンを挙げることができる。タンパク質としては、ァノレブミン、ゼラチン、コラーゲン等が好ましいものとして挙げられる。無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化ナトリゥム、塩化カルシウム、硫酸ナトリゥム、炭酸ナトリゥム等が挙げられる。

好ましい安定化剤としては単糖類、または糖アルコールが挙げられ、特に好ましい安定化剤としてはマンニトールが挙げられる。

これら安定化剤は、 1種類に限らず、適宜、数種類組み合わせて使用することができる。

安定化剤の濃度は、水中油型ェマルジヨンにおいて 0.1〜20%w/wの範囲が適当であり、 0.1〜： I0%w/wが好ましい。安定化剤の好適な濃度は、安定化剤の種類によって異なるが、製造スケールや各含有成分の含有量に応じて、適宜調整することができる。グリシン等のアミノ酸の場合、 2. 25% (30 OmM) 〜1 1 . 2 5 % ( 1 5 0 0 mM) 、好ましくは約 6 . 7 5 % ( 9 0 0 mM) である。マンュトーノレの場合、水中油型ェマルジョンにおける濃度は、好ましくは 1〜 1 0 %、さらに好ましくは 1〜 8 %、より好ましくは約 3〜 6 %である。マンニトールを安定化剤として用いることにより、等張と同程度の濃度で用いることができるので、より生体に負担の少ない安定な製剤を調製することができる。

本発明における凍結乾燥製剤を再懸濁するために使用される 7性溶媒は、エマルジョン粒子の分散媒体となるものであり、注射用蒸留水、生理食塩水等が挙げられるが、 ¾ 可能な水性溶媒であれば特に限定されない。

「高級脂肪酸」とは、ミコパクテリゥム属細菌、ノカルジァ属細菌、コリネバクテリゥム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌等の細胞壁に特徴的に存在する高級脂肪酸を表す。高級脂肪酸としては、例えばミコール酸が挙げられ、該ミコール酸とは、 _α -ァルキル- -ヒドロキシ脂肪酸を表し、総炭素数約 22〜

90を有する。このうちミコバタテリゥム属におけるミコール酸の総炭素数は約 60〜90であり、ノカルジァ属では約 44〜60であり、通常複数種類の分子の混合物として単離される。ミコール酸の α鎖は、直鎖の炭化水素からなり、その長さは属 '種によって異なり、 C22〜C26を中心とし、幅広い分布を有する。一方、鎖にはすべてのミコバクテリアに共通する -ミコール酸（シクロプロピル基および Zまたは二重結合が存在）の他、菌株によって種々サブミコール酸（メトキシ基、ケト基、エポキシ基、メチル基等）の官能基が存在することがわかつている。例えば、 B C G—東京株ではひ-、メトキシ-およびケト-ミコール酸が存在する。

本明細書において、「力価」とは、一定重量、または一定容量の、ミコパクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の CW Sもしくは該 CWSを含有する医薬品の生物活 '性の強さ、または検定された標準品との相対的な値を表す。

該医薬品としては、 CWSの水性溶媒懸濁液； CW Sと鉱物油、スクヮランまたはスクワレン等の油とを含有するペースト；該ペーストから再懸濁されたエマルジョン溶液；または、前記水性溶媒懸濁液もしくはェマルジョン溶液を凍結乾燥して得られる凍結乾燥製剤等が挙げられる。

ここで、生物活性とは、ミコバタテリゥム属およぴノカルジァ属等の細菌の C WSの免疫賦活活性、および Zまたは抗腫瘍活性を表し、当業者に公知の、 in vivoおよび in vitroの任意の活性が挙げられる。具体的には、インターフェロン V誘導活性、 TNF— _α誘導活性、実験的腫瘍動物モデルに対する抗腫瘍活性等が挙げられる。

本発明に係る第 1の態様は、水中油型エマルジョン、および凍結乾燥製剤を調製する際に好適な製造中間体となる、細菌一CWSを有効成分として含有するぺ一ストである。すなわち、細菌一 CWSと油とのペースト（混合油状物）であり、約 0.7 poise ( 25 °C) 以下の粘度、好ましくは約 0. 2〜約 0. 6 poise (2 5 °C) の粘度を示すことを特徴とする、細菌一 CWS含有ペーストである。さらに好ましくは、約 0. 28〜0. 55 poise ( 25 °C) の粘度を示す細菌一 CWS 含有ペーストである。

油としてスクヮランを用いた場合、約 0. 35〜0. 55 oise(25°C) 、さらに好ましくは約 0. 39〜 0. 51 oise( 25 °C) の粘度を有する細菌一 CWS含有ペーストが好適である。例えば CG-CWS : l gに対して 26. 7 g のスクヮランを用いた BCG-CWS含有ペースト（粘度値： 0.43poiseに相当）力、ら、後述する手順により、水中油型ェマルジヨンを調製して凍結乾燥を行ったところ、凍結乾燥品を再度懸濁して得られる水中油型ェマルジヨンにおける油滴の粒度分布は平均粒子径 2~3 /z mの、半値幅の小さレ、単一ピークを与えた（図 4 を参照）。一方、 BCG-CWS含有ペーストの粘度値が上昇するに従って、凍結乾燥品を再度懸濁して得られる水中油型ェマルジヨンの油滴の粒度分布は、平均粒子径 2〜 3 μ mの主分布以外に、粒子径約 10〜50μ mの粒子が増え、粒子の均一性が損なわれた。また、前記凍結乾燥品の長期保存安定性についても、容器の器壁への付着物の生成およびそれに伴う再懸濁水中油型ェマルジヨン中の原薬濃度の観点から、前記粘度値： 0.43poiseの BCG-CWS含有ペーストが製造中間体としてより優れていた。具体的な BCG-CWS含有ペーストの態様として、約 0.

43 ± 0. 3 poiseの粘度を有するものを好適な組成として例示することができる。

また、粒度分布において、粒子径が0.1^ 111〜20/ 111、好ましくは 0.15〜6μ m、さらに好ましくは 0.2 μ m〜2 μ mである細菌- CWS粒子集合体を含有する細菌一 CWS含有ペースト、およぴ細菌一 CWS粒子集合体が粒度分布にお、て D10%が 0.23±0.05であり、 D90%が 0.60士 0.05であり、力つ単一ピークを有する細菌一CWS含有ペーストが好ましい。

複数の油との混合物を使用する場合、それぞれの油を適切な組成比で混合して使用できる力細菌一CWSとの混合時の粘度が約 0. 7 poise (25°C) 以下の粘度になるような組成比であることが望ましい。さらに、懸濁後安定な凍結乾燥製剤を作成するためには、それぞれの油の組成比が、細菌一 CWSとの混合時の粘度が約 0. 2poise (25°C) 以上になるような組成比であることが望ましレ、。具体的には、細菌一CWS約 0. 66gに対して、スクヮランであれば、約 6. 6 g~35. 2 g、好ましくは約 8. 4 g〜 35.2 g等の組成が挙げられる。前記のペーストは、（1) 細菌- CWS、油、および有機溶媒を混合撹拌するェ程、および、（2) 前記（1) の有機溶媒を留去し、細菌- CWS含有ペーストを得る工程を経て、大量スケールで調製することができる。

前記 (1) において用いられる有機溶媒の量としては、細菌一 CWS0.67gあたり、 50ml〜 500mlが挙げられる。原料を加える順序については特に限定は無い。また、これらの原料を混合攪拌する時間は特に限定されないが、 10分間〜 1時間が好ましい。

前記（2) において、溶媒を留去するための加熱温度としては、溶媒の沸点、蒸気圧に応じて適宜選択することが可能である。なお、高温になれば細胞壁骨格成分の失活が生じるため、失活の生じない 100°C以下の温度が望ましい。好ましくは 80°C以下である。

溶媒を留去する工程は、常圧下もしくは減圧下に行うことができる。

また、本発明の細菌- CWS含有ペーストは、細菌- CWS粒子集合体の粒子径が 0.1 ！〜 20 /imであり、好ましくは0.15〜6 111、さらに好ましくは 0.2 /x m 〜2μΐηである。すなわち、（1)粘度が約 0.2〜0.7poise(25°C) であり、（2)細菌-

CWS粒子集合体の粒子径が 0.15 μ m〜 6 // mである細菌- CWS含有ペースト等もまた、本発明の好ましい態様である。

本発明に係る第 2の態様は、均一な、粒度分布を有する、細菌一 CWSを有効成分として含有する水中油型ェマルジョン、および該水中油型ェマルジョンからなる医薬組成物である。すなわち、前記細菌- CWS含有ペーストを含み、力つ、 0.1%〜20%、好ましくは 1%〜10%の安定化剤、 0.01%~10%、好ましくは

0.01%〜3%の界面活性剤を含むことを特徴とする、水中油型エマルジョンおよびその医薬組成物である。

具体的には、 2Lあたり、 0 . 6 7 g〜3 . 3 5 gの細菌一CWSおよび、

0.1~10%w/Ws 好ましくは 0.4〜8%w/w、さらに好ましくは 0.6〜5%のスクワランを含み、かつ、 1 %〜 1 0 %w/wの安定化剤、 0. 0 1 %〜 3 %w/wの界面活性剤を含むことを特徴とする、水中油型ェマルジョンが挙げられる。

本発明の水中油型ェマルジョンを調製する方法については特に限定されないが、国際公開パンフレット（WO00/3724) に記載された方法等を用いることができる。例えば、前記の方法で調製した細菌細胞壁骨格成分含有ペーストを、 2段階乳化方法等を用いて乳化する方法、すなわち、下記の乳化方法 1、および乳化方法 2が挙げられる。

乳化方法 1：

1 ) 細菌細胞壁骨格成分油状混合物（ペースト）に、低濃度（油濃度の約 1 0 % 以下）の界面活性剤を含む水溶液を加えて、緩やかに攪拌して粗乳化を行う工程、 2 ) 前記 1 ) の粗乳化ェマルジヨン溶液に、所望の濃度を得るべく、目的の最終濃度となる量の界面活性剤、および安定化剤を加えて、ェマルジヨン溶液の濃度を調整し、室温〜 1 0 0°Cで、分散■乳化機器で強く攪拌して本乳化を行う工程、を経て、本発明の水中油型ェマルジヨンを調製することができる。

本発明で使用可能な分散 ·乳化機器としては、例えば Potter-Elvehjem型ホモジナイザー、ホモミキサー、超音波ホモジナイザー、マイクロフノレイダィザー

(商品名）、ナノマイザ一（商品名）、アルティマイザ一（商品名）、マントン —ガウリンホモジナイザー型高圧ホモジナイザー等の分散 ·乳化機により、分散もしくは乳化を行って所望の水中油型ェマルジョンを得ることが出来る。調製上の都合によっては、水中油型ェマルジヨンを調製後、賦形剤、安定化剤等の添加剤を添加しても良い。

乳化方法 2

4 ) 細菌細胞壁骨格成分油状混合物（ペースト）に、低濃度（油濃度の約 1 0 % 09801

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以下）の界面活性剤を含む水溶液を加えて、緩やかに攪搾して粗乳化を行う工程、 5 ) 前記 4 ) の粗乳化エマルジョン溶液に、最終濃度が約 0 . 1 %~ 3 %となるような界面活性剤を加えて、ェマルジヨン溶液の濃度を調整し、室温〜 1 0 0 °C で、分散 ·乳化機器で強く攪拌して本乳化を行う工程、

6 ) 前記 5 ) のェマルジョン溶液を、使用する安定化剤がァミノ酸'無機塩等の電解質である場合は必要に応じて曇点以下の温度まで冷却した後、所望の濃度を得るべく、最終濃度が約 0 . 1 %〜 3 %となるような界面活性剤、および最終濃度が 1 . 0 %〜 1 0 %となるような安定化剤を含む水溶液を加えて希釈する工程、を経て、本発明の水中油型ェマルジヨンを調製することができる。前記 6 ) において、好ましくは、前記 5 ) で得られるェマルジヨン溶液を²倍〜 1 0倍に希釈して水中油型ェマルジョンを調製することができる。

前記乳化方法 2を用いて、本発明の水中油型ェマルジョンを調製することにより、乳化方法 1を用いた調製方法においては、安定化剤としてアミノ酸、無機塩などの電解質を含むェマルジョンを調製する場合に懸念される、界面活性剤の析出が避けられる。しかも乳化方法 2の 6 ) で表される希釈工程によって、ェマルジョンの粒度分布は全く変化しない。また、乳化方法 1を用いて大量調製を実施する場合、調製スケールに応じた乳化機器が必要であり、調製スケールの限界であった。し力し、乳化方法 2を用いて、高濃度ェマルジヨン溶液を中間体として用いることにより、 1回あたりに調製できる水中油型ェマルジョン量が増大するという利点がある。

上記の乳化方法 1、または乳化方法 2等の水中油型ェマルジョンの調製工程においては、必要に応じて、等張化剤を加えてもよい。これら等張化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。該等張化剤は、凍結乾燥品を凍乾ケーキとして形成させるための賦形剤を兼ねることができる。該等張化剤もしくは賦形剤としては、糖類、アミノ酸、ゥレア、無機塩等が挙げられる。糖類としては、単糖類、二糖類、糖アルコールが挙げられる。単糖類としては、グルコース、フルクトース等、二糖類としては、マルトース、ラタトース、トレハロース、スクロス等、糖アルコーノレとしては、マンニトール、ソノレビトール等が挙げられる。アミノ酸としては、ァラニン、グリシン、リシン、アルギ 3 009801

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ニン、プロリン等が挙げられる。これらの等張化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。等張化剤としては、上記安定化剤として挙げられた物質を使用することができ、安定化剤は等張化剤を兼ねていてもよい。また、等張化剤として、安定化剤とは異なる物質を選択することも可能である。尚、等張化剤の濃度は、他の成分の含有量に応じて適宜設定される力通常 0.1%〜30%w/wの範囲が適当である。

本発明の水中油型ェマルジョンは、ェマルジョンの油滴の粒子径が 0 . 2〜 3 0 μ m、好ましくは 0 . 2〜2 0 μ mであり、平均粒子径としては 2 ~ 3 μ mが好ましい。細菌- CWSは油滴中に包含される。

本発明の水中油型ェマルジヨンにおいて、細菌- CWSが油に包含されているか否かは、レクチンによる細胞壁骨格成分の凝集反応を利用して検定することができる。該検定方法については、国際公開パンフレット WO00/3724に記載された方法等を用いることができる。

すなわち、（1)ェマルジョン油滴の粒子径が 0 . 2 ~ 1 0 μ m、平均粒子径が、 2〜3 μ πιであり、（2)細菌- CWSが油滴中に包含され、レクチン反応が陰性を示すことを特徴とする水中油型ェマルジヨンもまた、本発明の態様として挙げられる。また、該ェマルジヨン油滴の粒子径において、好ましくは D10%:0.5 m以上、 D90%： 20μ πι以下である。

本発明に係る第 3の態様は、前記水中油型ェマルジョンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤である。

前記凍結乾燥製剤は、前記水中油型ェマルジヨンを、凍結乾燥させることにより、調製することができる。すなわち本発明に係る凍結乾燥製剤は、水中油型ェマルジヨンを凍結乾燥処理し、最後に通常はバイアル内部を窒素置換し、打栓を行うことにより得ることができる。

水中油型ェマルジヨンを凍結乾燥する際、凍結乾燥温度、および時間等は特に限定されず、例えば、国際公開パンフレット WO00/3724に記載された方法を挙げることができる。

該凍結乾燥製剤を再懸濁させて水中油型ェマルジヨンを調製するために用いる水性溶媒としては、前記等張液等を用いることができる。該凍結乾讓剤は、適当な水性溶媒の添加により速やかに再懸濁し、凍結乾燥前と同等の粒度分布、および安定性を有する水中油型ェマルジヨンが得られる。

本発明の第 4の態様は、粒度分布において、粒子径が 0.15〜6 /x mであり、好ましくは粒子怪力^.2〜2 μ mであることを特徴とする、細菌の細胞壁骨格成分粒子集合体（細菌一CWS粒子集合体〉に関する。また、粒子径において、

D10%： 0.2 / m (ここで「D10^o/o： 0.2 μ πι」とは、粒度分布において、粒子径の小さい側から積算して 10%に達した時の粒子径を表す。すなわち、細菌一

CWS粒子集合体の 90%までが粒子径 0.2 // m以上であることを意味する。）以上であり、かつ D90%： 0.7 m (ここで「D90% : 0.7 t m」とは、粒度分布において、粒子径の大きい側から積算して 10%に達した時の粒子径を表す。すなわち、細菌一 CWS粒子集合体の 90%までが粒子径 0. 7 μ m以下であることを意味する。）以下の細菌一 CWS粒子集合体であり、さらに好ましくは、 D10%： 0.23 ±0.05 / mでありかつ D90%： 0.6± 0.05 μ mである。

また本宪明には、前記粒子径を有する細菌の細胞壁骨格成分粒子集合体（細菌一 CWS粒子集合体）を含有するペーストゃ、該ペーストから調製されるェマルジョン、および凍結乾燥製剤も含まれる。すなわち、上記細菌一CWSを含有したェマルジヨン（油滴）の粒子径カ 0.2〜30 /1 111、好ましくは 0.3〜20 μ πι、さらに好ましくは、 1〜： ΙΟμ πιであることを特徴とする、ェマルジヨンや凍結乾燥製剤が挙げられる。

本明細書において、粒子径は、粒度分布を測定することにより得られる。該粒度分布は、当業者に公知の方法で測定することができる力具体的には、細菌一 CWSの溶媒懸濁液の場合は、レーザー回折式粒度測定装置（SALD3000；島津製作所製）や、マイクロトラック UPA (ハネウエル社製〉を用いて、測定する。細菌一 CWSの粒子径が 1 μ m以下の場合には好ましくはマイクロトラック UPA を用いて測定することができる。具体的には、 BCG-CWSを、約 O.lmg/mLの濃度で溶媒に懸濁したものを測定サンプルとする。

また、細菌一 CWS含有ペーストや、ェマルジヨンの場合には、レーザー回折式粒度測定装置（SALD3000；島津製作所製）を用いて測定することができる。具体的には、本発明の細菌—CWS含有ペーストを、約 300倍以上に油で希釈して測定サンプルとすることができ、好ましくは 0.1〜0.2mgZmLの細菌一 CWS 濃度となるように測定サンプルを調製すればよい。

本発明に係る水中油型ェマルジヨンは、注射など非経口で投与される。投与形態は、治療目的などにより異なり、特に制限されるものではない。通常用いられる投与形態として例えば、注射剤として皮膚より投与すること等ができる。エマルジョン中の細菌一 CWSの量は通常 0. 2mg/ml〜0. 6mg/mlの濃度である。本発明の凍結乾燥製剤は適量の水性溶媒、例えば前記等張液等を用いて本発明ェマルジョンに再懸濁して用いる。凍結乾燥製剤を再懸濁して生体に投与する場合の水中油型ェマルジヨンにおける各成分の濃度は、凍結乾燥前の、製造中間体としての水中油型ェマルジョンにおける各成分の濃度と異なっていてもよレ、。水性溶媒の適量とは、凍結乾燥前の液量の、好ましくは 0.5〜4倍量の範囲であればよい。

投与量、投与回数は対象とする疾患、患者の症状、年齢、体重、性別等によつて異なるが、非経口投与する場合、特に注射剤として使用する場合には、通常は成人に対して週 1回若しくは 4週 1回の投与で 1回当たり 10〜250 ^ _§の範囲、好ましくは 25〜200 μ gの範囲を投与することができる。

本発明の第 5の実施の態様は、ミコバクテリゥム属およぴノカルジァ属等の細菌 -CWSに含まれる高級脂肪酸のク口マトグラムから定性的にその菌種■菌株を同定、確認する方法であり、以下の工程 (1) 〜（3) を含む方法である。すなわち、

(1) ミコパクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の CWSに含まれる、高級脂肪酸を分離■抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程

(2) (1) の高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィーにより分析する工程、

(3) (2) の分析結果に基づき、細菌の CWSの菌種'菌株を評価する工程。以下、各工程について詳細に説明する。

(1) ミコパクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の CWSより、高級脂肪酸を分離 ·抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程

試料として一定質量のミコパクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の CW Sを秤量し、溶媒中で、 10°C〜溶媒の沸点の範囲内で塩基を反応させることにより、加水分解を行う。ここで用いられる溶媒としては、加水分解を行うに十分な水を含む有機溶媒であれば特に限定されないが、具体的な有機溶媒としては、例えばエタノール、メタノーノレ、イソプロパノール、エチレングリコール等のァルコール性溶媒、テトラヒドロフラン、ジェチルエーテル、ジォキサン等のエーテル系溶媒、アセトン、ジメチルスルホキシド等の親水性溶媒、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素系溶媒、へキサン、ヘプタン等の脂肪族炭化水素系溶媒、クロロホノレム、ジクロロメタン、ジクロロェタン等のハロゲンィ匕炭化水素系溶媒、またはこれらの有機溶媒の任意の溶媒の混合物が挙げられる。

前記有機溶媒として、好ましくは、エタノール等のアルコール系溶媒、あるいは、前記アルコール系溶媒および疎水性有機溶媒の混合物が挙げられ、具体的には、エタノール—トルェン一水混液等が挙げられる。

反応温度は、用いられる有機溶媒の種類によって適当な温度を選択することができるが、好ましくは、室温〜溶媒の沸点で加温する力 \ あるいは 105°C〜

135°Cでオートクレープを用いる方法が挙げられる。

加温の場合の反応時間としては、 5分〜 72時間が挙げられ、高級脂肪酸のパターンを分析する場合の反応時間としては、好ましくは 5分〜 5時間、高級脂肪酸量を定量的に分析する場合の反応時間としては、好ましくは 30分〜 5時間が挙げられる。オートクレープの場合の反応時間としては、 5分から 8時間が挙げられ、好ましくは、パターンを分析する場合は 5分〜 3時間、定量的に分析する場合は

10分〜 5時間が挙げられる。

使用される塩基としては、当業者に知られたものであれば任意の塩基を用いることができるが、具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化力リゥム、水酸化バリゥム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸バリウム、炭酸セシウム等の無機塩基が挙げられる。

ここで、被験サンプルが細菌一 CWSの場合、反応効率を上げるために、試料をそのまま一定質量秤量するか、またはトルエン、クロロホ /レム、ヘプタンおよびェタノ一ル等から選択される有機溶媒、またはこれらの溶媒の混液等に懸濁し、必要量を採取し、該有機溶媒を留去した後、加水分解に供することが好ましい。また、被験サンプルが「細菌」または「菌体」である場合は、水に懸濁した状態で、原薬と同様に加水分解を行うほ力、反応効率を上げるために温度を沸点まで上げて 5分〜 72時間反応させる力、、オートクレ^"ブを用いて 5分〜 8時間反応させることが好ましい。医薬品製剤の場合は、水を加えてェマルジヨンを形成させ、その全部または一部を採取して加水分解反応させるほ力反応効率を上げるために、一旦水でェマルジヨンとするのではなく、直接加水分解試液を加えて、反応させることが好ましい。

加水分解反応終了後、酸を加えて反応溶液を酸性とした後、疎水性有機溶媒を用いて高級脂肪酸画分を抽出する。ここで用いられる酸としては、当業者に知られたものであれば任意の酸を用いることができるが、具体的には、塩酸、硫酸、燐酸等の無機酸、トリフルォロ酢酸等の有機酸、スルホン基を有する酸性イオン交換樹脂等を用いることができる。疎水性溶媒は、水層との分離が可能な溶媒であれば特に限定はないが、具体的には、へキサン、ヘプタン、ジェチルエーテル、トルエン、クロロホルム等が挙げられる。

( 2 ) ( 1 ) の高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィーにより分析する工程

( 1 ) において得られた高級脂肪酸画分に含まれる高級脂肪酸またはその誘導体のクロマトグラムを得、その溶出パターンを確認する。該溶出パターンとは、溶出ピークの形状、各溶出ピークの保持時間（リテンションタイム）、ピーク面積、ピーク幅、もしくは極大値等のパラメ一ター、および、各溶出ピーク間の該パラメーターの比等、クロマトグラムにおける任意の性質を表す。その確認方法は、当業者に公知の方法であれば、任意の方法を用いることができる。高級脂肪酸、または、高級脂肪酸をエステル化もしくはアミド化することにより調製される、高級脂肪酸の誘導体を、 H P L C、 G C、 T L C等で分析し、高級脂肪酸またはその誘導体のクロマトグラムを得ることができる。ここで、高級脂肪酸または高級脂肪酸の標識化誘導体におけるクロマトグラムは、 H P L Cもしくは G C におけるクロマトグラム、すなわちピークの溶出パターンや、 T L Cにおけるスポットの検出パターン等を表す。また、検出方法としては、特に限定はないが、蛍光、 UV— V I S、ラジオアイソトープ、 R I (示差屈折計）、質量分析、電気化学、化学発光、エバポレイティブ光散乱、またはレーザー励起吸光等を用いることができる。

好ましくは、高級脂肪酸に標識化試薬を作用させることにより、標識化高級脂肪酸誘導体を調製した後、その溶出パターンを分析する方法等が挙げられる。高級脂肪酸の標識ィヒ方法としては、高級脂肪酸のカルボン酸または水酸基を、蛍光、 UV— V I S、ラジオアイソトープ、 R I (示差屈折計）、質量分析、電気化学、化学発光、エバポレイティブ光散乱、レーザー励起吸光等で検出可能な原子もしくは部分構造を有する高級脂肪酸エステル、または高級脂肪酸ァミドへ導く方法が挙げられる。

具体的な標識化高級脂肪酸誘導体としては、高級脂肪酸のカルボキシル基と反応するプロモメチル（プロモアセチル）基、、：ァゾメチル基、アミノ基、ヒドラジノ基などを有するとともに、同時に紫外、可視または蛍光で検出可能な置換基を有する 9-アントリルメチルエステル、 p—プロモフエナシノレエステル、 6,7-ジメトキシ -4-クマリニルメチルエステル、 2-(2,3-ナフタルイミド)ェチルエステル、 2-(2,3-アントラセンジカルポキシィミド)ェチルエステル等が挙げられる。

誘導ィ匕反応条件としては、個々の標識化高級脂肪酸誘導体に適当な条件を、当業者によく知られた方法から選択することができるが、通常は、必要に応じて塩基もしくは酸等の補助試薬の存在下、一10°C〜溶媒の沸点で 5分〜 72時間標識化試薬と反応させることにより、標識化高級脂肪酸誘導体を調製することができる。具体的には、 9-アントリルメチルエステルの場合、高級脂肪酸画分を、 AD AM

(9-アントリルジァゾメタン）等の蛍光標識化試薬を用いて、 _ 10°C〜溶媒の沸点で 5分〜 72時間、好ましくは 20°C〜60°Cで 3時間〜 12時間反応させることによって、高級脂肪酸 9-アントラニルメチルエステルを得ることができる。

分析方法としては、 H P L C、 G C、 T L C等、当業者によく知られた方法を用いることができる。例えば、分析される高級脂肪酸、もしくは標識化高級脂肪酸誘導体の性質に応じて、 H P L Cの逆相クロマトグラフ法、順相クロマトダラフ法、疎水クロマトグラフ法、イオン交換クロマトグラフ法、イオンクロマトグラフ法、サイズ排除クロマトグラフ法、ァフィ二ティーク口マトグラフ法において、溶出される高級脂肪酸もしくは標識ィ匕高級脂肪酸誘導体を含有する複数のピークのパターンを得ることができる。ここで検出方法としては、前記標識化方法に応じて、蛍光分析、 UV— VI S分析、ラジオアイソトープ分析、 R I (示差屈折計）分析、質量分析、電気化学分析、化学発光、エバポレイティブ光散乱、またはレーザー励起吸光等が挙げられる。

(3) (2) の分析結果に基づき、細菌の CWSの菌種 ·菌株を評価する工程一般的には、被験サンプル、すなわち評価対象の細菌の CWSにおける（2) のクロマトグラムと、基準となる該細菌の CWSの標準品における（2) のクロマトグラムのパターンを比較することにより、被験サンプルの菌種'菌株を同定、確認することができる。また、被験サンプルである細菌の CWSが、同種同株の標準サンプルと、 CWSの構成成分において等価である力、否かを評価することができる。すなわち、細菌の培養条件によって、同種同株である場合でも該構成成分は変化する可能性があるが、（2) の分析結果を標準品と比較することにより、 CWSの構成成分において等価な菌株であることを同定することができる。

具体的には、例えば高級脂肪酸がミコール酸である場合、逆相 HPLCカラム (ォクタデシル基（C18) を有するカラムまたはトリアコンチル基 (C30) を有するカラム（2〜： ΙΟπιηιφ X5〜30cm、粒径 2〜： ΙΟμιη) を使用し、水および/またはメタノールぉよぴ 2-プロパノ一ルを用 V、たグラジェント条件、メタノールぉよびトルェンを用いたグラジェント条件、または、メタノールおよびジクロロメタンのグラジェント条件で分析した場合は約 5〜約 120分に溶出する特徴的なピ一タカそれぞれ高級脂肪酸のパターンに相当する。

本発明の、第 6の実施の態様は、ミコバタテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の CWSを含む被験サンプルにおける CWSの含量を定量して評価するとともに、有効成分量すなわち力価を検定、評価する方法であり、以下の工程（1) 、

(4) 、および（5) を含む方法である。すなわち、

( 1 ) 細菌の CWS中に含まれる、高級脂肪酸を分離■抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、 (4) (1) の高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程、 (5) (4) の分析結果に基づき、細菌の CWSの免疫賦活能を評価する工程。以下、それぞれの工程について具体的に述べる。

(1) ミコバタテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の CWSより、高級月旨肪酸を抽出してその含有画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級月旨肪酸を誘導体に変換する工程

この工程については前記のとおりである。

(4) (1) の高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程

(1) で得られる高級脂肪酸を含む画分を、前記 (2) に記載された方法で分析し、得られたクロマトグラムより高級脂肪酸または高級脂肪酸誘導体の量を定量すればよい。すなわち、前記 (2) のクロマトグラムにおいて、高級脂肪酸または高級脂肪酸誘導体に相当する複数のピークの、面積値の総和を算出することにより、高級脂肪酸を定量することができる。

なお、細菌、または、細菌の CWSを有効成分として含有する医薬品の原薬もしくは製剤の定量分析において、内部標準を使用する場合、該内部標準としては、 HP LC等の分析において、被験サンプルもしくは標準品と分離して、検出可能であれば、特に限定されない。また、上記 (1) 、 (2) 、および（4) のいずれの工程で添加してもよい。

(5) (4) の分析結果に基づき、細菌の CWSの免疫賦活能を評価する工程一般的には、被験サンプル、すなわち評価対象の細菌の CWSにおける（4) の値と、基準となる該細菌（被験サンプルと同種 ·同株の細菌）における CWS の標準品における（4) の値を比較することによって、被験サンプルの力価を評価することができる。例えば、 B C G— C W S ·東京株の場合、高級脂肪酸はミコール酸であり、被験サンプルのミコール酸の含量を前記 (1) および（4) の工程によって分析した結果を、 BCG— CWS '東京株の標準品におけるミコール酸の含量と比較することにより、被験サンプルの力価を定量することができる。被験サンプル、すなわち評価対象の細菌の CWSにおける（4) の値と、基準となる該細菌の C W Sの標準品における（ 4 ) の値を比較することにより、被験サンプルの力価を評価することができる。

具体的には、ミコバクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の CWSの標準品における（4 ) の値： Vstdを、被験サンプルにおける（4 ) の値： Vsamと比較することにより、被験サンプ /レのカ価を、標準品に対して、下式 (%) ： Vsam/VstdX 1 0 0 (%) で表すことができる。

ここで、好ましくは、標準品における（4 ) の値を、複数の濃度で、複数回数測定し、標準品の濃度と、高級脂肪酸量の相関関係を表す検量線を作成し、該検量線に被験サンプルにおける高級脂肪酸量の測定値（すなわち（4 ) の値）を当てはめることにより、被験サンプルにおける有効成分量、すなわち力価を逆算することができる。

本発明の方法により、ミコバクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の CW Sだけでなく、ミコバタテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌、ミコバタテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌の CW Sを含有する医薬品の有効成分を同定、確認するとともに、力価を評価することも可能である。すなわち、前記と同様の方法で、一定量の菌体、または医薬品から、水または有機溶媒等の懸濁液を調製し、該菌体または医薬品中の高級脂肪酸の量を測定することができる。実施例

以下、実施例により本発明を具体的に説明する力本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

実施例 1

BCG— CWS含有ペーストの調製

J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)に記載されているようにして調製した細胞壁骨格成分としての B C G— CW S 670mgを、油として使用するスクワラン 8.4gとトルエン 200mLの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素あるいは空気気流下 60〜70°Cに加熱しトルエンを留去し、 B C G— CW S含有ペーストを得た。

このペーストに関して、共軸二重円筒型粘度測定器 (MR - 3 0 0ソリキッドメータ：（株）レオロジ社製）を用いて 2 5 °Cでの粘度を測定した。その結果、 0 . 5 4 5 poiseであることが示された。

また、同様にして、油としてスクヮランとォレイン酸ェチルの混合物を 8.4g使用し、 BCG— CWS含有ペーストを得た。同様に、共軸二重円筒型粘度測定器 (MR— 300ソリキッドメータ：（株）レオ口ジ社製）を用いて 25 °Cでの粘度を測定した。これらの結果を表 1に示す。

表 1に示されるように、スクヮラン自体の粘度は 0. 236であり、これに細胞壁骨格成分の BCG— CWSが上記のように混合された場合、そのペーストの粘度は 0. 545となる。より粘度の低いォレイン酸ェチルの割合を増やすと、 BCG— CWS含有ペーストの粘度は次第に低くなった。実施例 2

BCG—CWS含有ペーストの調製

細胞壁骨格成分として BCG— CWS670mgを用い、油として大豆油 8.4gを使用し、実施例 1と同様にして油状混合物（ペースト）を調製し、粘度を測定した。

また、油としてシンセラン 4、ドラケオールを使用し、同様にペーストを調製し、粘度を視 IJ定した。

以上の結果を表 2に示す。表 2

表 2に示されるように、スクワラン以外の油を使用した場合の B C G— C W S 含有ペーストの粘度は、使用する油によって大きく変動する。実施例 3

スクヮランの量の変化と粘度の変化

細胞壁骨格成分として BCG— CWS670mgを用い、油として使用するスクヮランの量を 4. 2 gから 33. 6 gへと変化させる以外は実施例 1と同様にしてペーストを調製し、その粘度変化を測定した。

その結果を表³に示す。

表 3

+表 3に示されるように、 BCG— CWSに対するスクヮランの量比が小さくなれば粘度が増加し、スクワランの量比が大きくなれば粘度が減少する傾向にある。実施例 4

スクワランの量比の変化とエマジョン製剤化の可否

実施例 3の③のペーストに 0.02 / ^/。ポリソルベート 80水溶液 281.5gを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化を行い、さらに、 5.2gの 10w/w%ポリソノレべート 80 水溶液を添加し本乳化を行った。最後に、 204.2gの 10w/w%ポリソルベート 80溶液を添加混合し、ポリソルベート 80最終濃度を 1.0w/w%に調整し、水中油型ェマルジヨンを得た。その後、 4w/w%マンニトール水溶液 1500mLを添加し、 2L の最終製剤を得た。これは、 B C G— CWSの原体濃度 0. 3 m g /m lのエマノレジョンである。

同様にして、 ③以外の実施例 3のペーストを用いてェマルジヨンを調製し、ェマルジョンの製剤化の可否に対するスクワラン量の影響を調べた。ェマルジョン製剤化の可否は、 ①乳化中の難物出現の有無、 ②乳化直後の粒度分布、 ③凍結乾燥前後での粒度分布維持性、 ④凍結乾燥品再懸濁後の性状）を基準とした。その結果を表 4に示す。表中、「〇」は上記①〜④をすべて満たすことを示し、「X」はこれらを満たさないことを示し、そして「△」は②の粒度分布の均一性が若干劣ることを示す。表 4

実施例 3記載の B C G— C W S含有ペーストを使用してェマルジョンを調製する場合、表 4に示されるように、約 0.7poise以下のペーストを使用した場合では良好なェマルジヨンが調製される。一方、それより粘度が高い①の場合、 ( 0 . 8 8 8 poise) 、良好なェマルジヨンは製剤化できないことがわかった。これは、粘度の上昇に伴い、一部の油滴において過乳化が起こり、非常に少量の油に包埋された原薬の塊（均一に懸濁されずに凝集する物質）が出現し、製剤の性状と安定性を著しく低下させることを示唆している。

一方、粘度： 0 . 6 7 Opoise程度では、原薬の塊が出現することはないが、ェマルジヨンの油滴の粒度分布は、均一性が乏しかった。また、粘度 0 . 5 4 5 poise以下の製剤では、ェマルジヨンの油滴は均一性に富むシャープな粒度分布を示した (データは示していない) 。実施例 5

油の種類とェマルジョン製剤化の可否

油として実施例 2の種類のものを使用し、実施例 4と同様にしてェマルジョンを調製し、製剤化の可否を評価した。その結果を表 5に示す。表 5

表 5に示されるように、油の種類に関係なく、 B C G— CW S含有ペーストの粘度が約 0 . 5 5 poise以下のものを使用して、ェマルジヨンを調製すれば、ェマルジヨンとして良好なものが得られた。表中、「〇」は、 ①乳化直後の粒度分布が平均粒子径 2 ~ 3 ^u mでありシャープな単一ピーク、 ②凍結乾燥前後において粒度分布に変化が無い、 ③凍結乾燥品を再懸濁した後にバイアルへの製剤付着やそれに伴う製剤中原薬濃度低下が認められない、ことを示している。特に、粘度： 0. 4 9〜0. 5 5 poiseである②ぉよぴ③の製剤が良好な結果を示した。実施例 6

油の組成とェマルジョン製剤化の可否

油として実施例 1の組成のものを使用し、実施例 4と同様にしてェマルジョンを調製し、製剤化の可否を評価した。その結果を表 6に示す。表 6

表 6は、油の組成（スクヮランとォレイン酸ェチルの混合比）が変化してもェマルジョンの性質にはあまり大きな影響を与えず、 B C G— CWS含有ペーストの粘度が 0. 5 4 5以下であれば、良好なェマルジョンが調製されることを示している。実施例 7 '

ペーストにおけるスクワランの量の変化と凍結乾燥製剤化の可否

実施例 4にて調製した水中油型ェマルジョンをバイアルに 10mLずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機 (G T 一 6、フィンテック社製）を用いて行った。次いで、凍結乾燥製剤の再懸濁安定性、粒度分布等の面で調製の可否を判断した。その結果を表 7に示す。表 7

表 7で示されるように、ェマルジョンの凍結乾燥製剤の良否も B C G— CWS 含有ペーストの粘度によって影響を受ける。 BCG— CWS含有ペーストの粘度が 0. 672以下の場合であれば良好な凍結乾燥製剤が調製される。 0. 545 以下の場合であれば、さらに良好な凍結乾燥製剤が調製されることがわかった。実施例 8

油の組成と凍結乾燥製剤化の可否

実施例 6にて調製したェマルジョンの凍結乾燥製剤を調製し、凍結乾燥製剤の再懸濁安定性、粒度分布等の面で調製の可否を判断した。

その結果を表 8に示す。表 8

BCG- スクヮランォレイン酸ェ粘度凍結乾燥製剤の可 CWS量チル量 (poise) 否

① 670mg 8. 4 g 0 0. 545 〇

② 同上 6. 3 g 2. 1 g 0. 258 〇

③ 同上 4. 2 g 4. 2 g 0. 260 〇

④ 同上 2. 1 g 6. 3 g 0. 165 X

⑤ 同上 0 8. 4 g 0. 112 X

⑥ 0 8. 4 g 0 0. 239 〇実施例 7では、ェマルジョンの凍結乾燥製剤は、使用される B C G— CWS含有ペーストの粘度に影響を受け、良好な凍結乾燥製剤はペーストの粘度が 0. 5

4 5以下であることが示された。上記表 8は、ペーストの粘度が低すぎても良好な凍結乾燥製剤が得られないことを示している。従って、良好なェマルジョンの凍結乾燥製剤が得られるための、好適なペーストの粘度は、 0 , 2 5 8から 0.

5 4 5の範囲であることが分かる。実施例 9

油の種類とェマルジヨンの凍結乾燥製剤化の可否

油として実施例 2の種類のものを使用し、実施例 7と同様にしてェマルジョンの凍結乾燥製剤を調製し、その製剤の可否を評価した。その結果を表 9に示す。表 9

表 9に示されるように、油の種類が相違してもェマルジョンの凍結乾燥製剤化には大きな影響は与えず、使用する B C G—CWS含有ペーストの粘度の大きく影響されることが分かった。また、実施例 8を参考にすれば、良好な凍結乾燥製剤が得られるところの B C G— CWS含有ペーストの好適な粘度は 0. 2 8から 0 . 5 5であることが示されている。実施例 1 0

製剤例

細胞壁骨格成分として B C G— CWS2640mgを用いて、スクヮラン 35.2gおよび 10%エタノール /90%ヘプタン 400mLの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下 60°Cに加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、 0.02w/w%ポリソノレべート 80水溶液 924gを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（7，000rpm (逆回転） /minX5分間）を行い、さらに、 36.6gの 10w/w%ポリソルベート 807_Κ溶液を添力卩し本乳化（12,000rpm (正転） /miaX lO分間）を行った。最後に、 1.5gの 10w/w° /。ポリソルベート 80溶液を添加混合し攪拌 (7,000rpm (逆回転） X 1分間）し、ポリソルベート 80最終濃度を 0.4w/w%に調整し、水中油型ェマルジヨンを得た。その後、 4w/w%マンニトール水溶液 3500gを添加し、 4000gの最終製剤を得た。（このときの処方は、 CWS ： 0.6mg/mL、 SQA： 0.8w/w%、 Tween80 ： 0.1w/w%、マンニトール： 3w/w%)

この水中油型ェマルジョンをバイアルに 2mLずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾赚（G T— 6、

ク社製あるいは ULVAC13A、日本真空社製）を用いて行った。実施例 1 1

分散補助溶媒についての検討

B C G- CWS ( 2 1 O m g ) を各種有機溶媒（トノレェン、へキサン、ヘプタン、クロロホノレム、ジクロロェタン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン；各 20m l ) 中に、超音波処理により分散し、分散原薬を調製した後、さらに、必要に応じてポッター型ホモジナイザー（20ml 型）により攪拌 (3000rpm x 5分）した。得られた分散原薬について粒度分布評価を行った。さらに、実施例 1 0と同様に、上記分散原液にスクヮラン（2.64 g ) を混合し、さらに有機溶媒を留去することにより調製したペーストの粒度分布評価を行った。

粒度分布は、分散原薬については、 O.lmgCWS/mLの濃度で、マイクロトラック UPA (ハネウエル社製）、およびレーザー回折式粒度測定装置 (SALD3000；島津製作所製）を用いて測定した。また、ペーストは、スクヮランで希釈し、 0.1〜0.2mgCWS/mLSQAの濃度で、レーザー回折式粒度測定装置（SALD3000；島津製作所製）を用いて測定した。

[結果]

トルエン中に分散された分散原薬の粒度分布を調べた結果、 400〜600nmに分布するサブミクロンでのピークと、 ΙΟ μ πιを中心とした大きな粒子の分布の二つに分かれた。

次に、上記トルエン分散原薬にスクヮランを混合した混合物の粒度分布、およびこれをさらにポッター型ホモジナイザーでさらに分散して調製したペーストの粒度分布を調べた結果、これらはいずれもスクヮランを混合する前の粒度分布をほぼ維持していた。

一方、分散補助溶媒として、へキサン、ヘプタン、クロロホノレム、ジクロロェタン、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン等において、トルエン分散で見られた数十 μ πιを中心とした粒度分布は減少した（図 1 ) 。 90%ヘプタン/ θο/οェタノールを用いた場合の、ペースト内の BCG-CWS原薬の粒度分布結果を図 2に示す。図 2のとおり、サブピークは無く、 0.3〜2 μ πιに単一ピークを持つ均一な混合物が得られていることがわかった。

表 1 0には、各溶媒における溶媒に分散した BCG-CWS原薬をマイクロトラック UPAで測定した場合の、 D10%値、 D90%値、および平均粒子径の実測値を示す。表 1 0

* μ πιオーダーの直については、機械の特性から精度が低いので、表の値を参照することが好ましい。以下の表 1 1には、各溶媒における溶媒に分散した BCG-CWS原薬を

SALD3000で測定した場合の、 D10%値、 D90¼値、およぴ平均粒子径の実測値を示す。

* ιηオーダーの値については、機械の特性から精度が低いので、表 1 1の値を参照することが好ましい。以下の表 1 2には、各溶媒における溶媒に BCG-CWS含有ペーストをスクワランで希釈し、 SALD3000で粒子径を測定した場合の、 D10%値、 D90%値、および平均粒子径の実測値を示す。表 1 2

実施例 1 2

製剤例

細胞壁骨格成分として8。 —じ^¥ 3 132011^を用ぃて、スクヮラン 17.6gおょぴ 10%エタノール/ 90%ヘプタン 200mLの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下 60~70°Cにカロ熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、 0.02w/w%ポリソルベート 80水溶液 462.0gを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（7,000rpm (逆回転） /minX 5分間）を行い、さらに、 18.3gの 10w/w%ポリソルベート 80τΚ溶液を添加し本乳化（12,000rpm (正転） /minX5分間）を行った。最後に、 0.76gの 10w/w%ポリソルベート 80溶液を添加混合し攪拌 (7,000rpm (逆回転） X I分間）し、ポリソルベート 80最終濃度を 0.4w/w%に調整し、水中油型ェマルジヨンを得た。その後、 4w/w%マンェトール水溶液 1500gを添加し、 2000gの最終製剤を得た。（このときの処方は、 CWS： 0.6mg/mL、 SQA： 0.8w/w%、 Tween80： 0.1w/w%, マンニトール： 3w/w%)

この水中油型ェマルジョンをバイアルに lmLまたは 2mLずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾赚（G T _ 6、フィンテック社製あるいは ULVAC13A、日本真空社製）を用いて行った。実施例 1 3

製剤例

細胞壁骨格成分として B C G— CW S2640mgを用いて、スクヮラン 70.4gおよび 10%エタノール Z90%ヘプタン 400mLの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下 60〜70°Cに加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、 0.02w/w%ポリソルベート 80水溶液 888.7gを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（7，000rpm (逆回転） /minX 5分間）を行い、さらに、 36.7gの 10w/w°/oポリソノレペート 80水溶液を添加し本乳化（12，000¾)m (正転） /minX lO分間）を行った。最後に、 1.5gの 10w/w%ポリソルベート 80溶液を添加混合し攪拌 (7,000rpm (逆回転） X I分間）し、ポリソルベート 80最終濃度を 0.4w/w%に調整し、水中油型ェマルジヨンを得た。その後、 1.2 %ポリソルベート 80/6.7w/w%マンニトール水溶液 3000gを添加し、 4000gの最終製剤を得た。（このときの処方は、 CWS： 0.6mg/mL、 SQA : 1.6w/w%、

Tween80： lw/w%、マン-トール： 5w/w%)

この水中油型ェマルジョンをバイアルに lmLまたは 2mLずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾纖（G T— 6、フィンテック社製あるいは ULVAC13A、日本真空社製）を用いて行つた。実施例 1 4

製剤例

細胞壁骨格成分として B C G— CWS 1320mgを用いて、スクヮラン 35.2gおよび 10%エタノール/ ^O^/oヘプタン 200mLの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素気流下 60〜70°Cに加熱し、攪拌下溶媒を留去した。ついで、 0.02w/w。 /。ポリソルベート 80τΚ溶液 444.3gを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化（7,000rpm (逆回転） /minX 5分間）を行い、さらに、 18.4gの 10w/w%ポリソルベート 807J溶液を添加し本乳化（12，000rpm (正転） /minX5分間）を行った。最後に、 0.76gの 10w/w%ポリソノレべート 80溶液を添加混合し攪拌 (7,000rpm (逆回転） X I分間）し、ポリソルベート 80最終濃度を 0.4w/w%に調整し、水中油型ェマルジヨンを得た。その後、 1.2w/w%ポリソルベート 80/6.7w/w%マンニトール水溶液 1500gを添加し、 2000gの最終製剤を得た。（このときの処方は、 CWS： 0.6mg/mL、 SQA： 1.6w/w%、

Tween80： lw/w%、マンニトール： 5w/w%)

この水中油型ェマルジョンをバイアルに lmLまたは 2mLずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾匪剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾賺（G T— 6、フィンテック社製あるいは ULVAC13A、日本真空社製）を用いて行った。実施例 1 5

凍結乾燥後における粒度分布変化

実施例 1 2で調製したスクワラン 1.6%処方 (BCG-CWS 1 gに対して、スクヮラン 2 6 . 7 gを含むもの；粘度値： 0.43poise) の凍結乾燥品について、凍結乾燥前後における粒度分布変化を、実施例 1 1と同様の方法で評価した。その結果、図 4に示すように、凍結乾燥製剤を再懸濁した場合も、凍結乾燥前の水中油型ェマルジヨン（図 3 ) と同様に、平均粒子径 2〜3 μ πιの単一ピークの粒度分布を維持し、 90%径値が約 5 おであった。一方、スクヮランの含量を減らした処方では、さらに粒子径が大きい（ 1 0 m〜 5 0 / m) 粒子が混在した。凍結乾燥後の粒度分布については、大きな粒子の存在比率の指標となる 90% 径値が、 1.6%処方では 5μηι前後となった。

以上の結果から、実施例 1 2の製剤は凍結乾燥前後における粒度分布維持性が高いことが判った。実施例 1 6

凍乾製剤保存による性状および懸濁液中原薬濃度変化

実施例 1 2で調製したスクワラン 1.6%処方 (BCG-CWS 1 gに対して、スクヮラン 2 6 . 7 gを含むもの；粘度値： 0.43poise) 製剤について、長期 ·カロ速保存条件として 5°C、 25°C、 40°C、および苛酷条件として 60°C、 80°Cでの安定性を検討した。評価基準は、実施例 1 7に記載の懸濁液原薬濃度をミコール酸定量法により算出し、懸濁液の溶状を目視により評価した。

その結果、表 1 3に示すように、スクヮラン 1.6%処方製剤において、 40°CX3 ケ月保存品で懸濁後における付着物の生成およびそれに伴う懸濁液原薬濃度の低下は認められなかった。また、表 1 4に示すように、 60°C、 80°CX1ヶ月保存の苛酷条件下においても、付着物の生成および懸濁液原薬濃度の低下は全く認められなかった。

以上の結果から、実施例 1 2の製剤は、優れた保存安定性を示すことが判った。表 1 3

※懸濁液の SMP-105濃度を対目標濃度％で示し、付着物量を（）内に示す。表 1 4

※懸濁液の SMP-105濃度を対目標濃度％で示し、付着物量を（）内に示す。実施例 1 7

B C G— CWSにえまれるミコール酸の定量 (1)溶液の調製

① B C G-CWSは、 B C G菌東京株（日本ビーシージ一製）から公知の方法

(J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974))) で調製した。 B C G— CW Sの被験サンプル、および生物活性が確認されている B C G-CW Sの標準品約 mgをそれぞれ精密に量り、トルエンまたはヘプタン/エタノール (99.5)混液 (9:1)を加えて正確に 25mLとし、超音波を 15分間照射し、試料原液および標準原液とした。試料原液 2mLを正確に量り、溶媒を留去した。また、標準原液 1、 2および 3mLを正確に量り、同様に溶媒を留去した。

③ 試料溶液および標準溶液にそれぞれ内標準溶液（エル力酸（アルドリッチ製）のトルエン溶液 ( 1 g /5000mL) またはトリコセン酸（東京化成製）のトル工ン溶液 (3g/1000mL) ) 100 /i Lを正確にカロえた。

④ 0.5mol/L7R酸化カリウムのエタノール (99.5)/トルエン/水混液 (10:10:1) 溶液 l mLを加え、超音波を 1分間照射した。

⑤ 65°Cの恒温槽で 3時間加熱し、放冷後、 2mol/L塩酸 500 / Lを正確に加え、よく振り混ぜた。さらにへキサン 2mLを加え、よく振り混ぜた後静置し、上層

(有機層）をサンプノレ瓶に移した。同操作を、へキサン lmLずつを用いて、さらに 2回繰り返した。

⑥ 集めた上層に水 lmL加え、よく混ぜ、遠心分離を行ったのち、水層（下層）を除去した。前記操作をさらに 1回繰り返した。

⑦遠心型エバポレーターまたは窒素を用いて上層の溶媒を留去した。

⑧残渣にトルエン 4mLを加えて溶かした後、この溶液 200 をサンプル瓶に正碓に量り、さらにトルエン 300 Lおよび蛍光標識化試液 (AD AM (9- Anthryldiazomethane;フナコシ製）のアセトン溶液 ( 1 g /250mL) をさらにメタノールで正確に 10倍に希釈したもの） 500 /z Lを加え、 40°Cで 5時間以上反応させた。反応終了後、すみやかに 5°Cに冷却した。これらをそれぞれ試料溶液および標準溶液として分析に供した。

(2)分析

試料溶液およぴ標準溶液の各 10 /X Lを H P L Cにて以下の条件で分析した。試料溶液からクロマトグラムのミコール酸に由来する複数ピークの溶出パターンと、標準溶液のそれと比較した。また、内標準物質のピーク面積に対するミコール酸誘導体のピーク面積比を求め、標準溶液から得られた検量線を用いて、被験サンプルの力価を求めた。

[高速液体クロマトグラフィー（HPLC) の設定条件]

力ラム温度： 50°C

カラム：関東化学製 Mightysil (登録商標） RP-18 GP 150-4.6 (5 μ m、 4.6mm φ X 15cm), または住化分析センター製 SUMIPAX ODS A-211(5 μ m、 4.6mm φ X25cm)

または野村化学製 Develosil C30-UG (登録商標）（3 / m、 4.6mm φ X 15cm_N または 5 μ m、 4.6mm φ X 25cm)

溶媒： A液：メタノール /τΚ混液 (9: 1) Β液： 2-プロパノールグラジェント条件または Α液：メタノール B液：トルエンダラジェント条件を表 1 5に示した。表 1 5

A液：メタノール /7混液 (9: 1) B液： 2-プロパノールグラジェント条件

nun 0 25 35 36 39

A(%) 90 5 5 90 90

B(%) 10 95 95 10 10

A液：メタノー -ル B液：トノレェンダラント条件

mm 0 15 30 50 50.1 60

A(%) 100 90 50 40 100 100

B(%) 0 10 50 60 0 0 移動相の流速： 1.0または 1.5mL/min

蛍光検出条件：

励起波長： 365 nm

検出波長： 412 nm

(3)結果

図 5に代表的なク口マトグラム、図 6に標準品について複数濃度でミコール酸含量を測定した結果をプロットして作成した検量線を示した。試料溶液のミコール酸の溶出パターンは、標準溶液と比較し、同様の位置に同様の強度のピークを認めることを確認した。また、被験サンプルの測定結果から図 6の検量線を用いて力価を算出した結果を、表 1 6に示した。表 1 6

力価 (％)=検量線から得られた試料中の c w s量 Z試料の採取量 X 100 上記のように、 B C G— CWSを有効成分として含有する医薬品の製造中間体となる B C G— CWSの各製造口ットにおける力価を評価することができた。実施例 1 8

菌株の同定おょぴ定量

(1)溶液の調製

① B C G菌東京株（日本ビーシージ一製）を公知の方法で死滅したものを約 lOmg (CWS量に換算して）を精密に量り、 5mol/L水酸ィ匕カリウムのエタノール (99.5)Z水混液 (1:1) 溶液 2mLを加えて、 100°Cで 2時間反応させた。放冷後、 6mol/L塩酸 1.5mLを加えて酸性にし、よく振り混ぜた。

② 別に、生物活性が確認されている B C G-CWSの標準品約 15mgを精密に量り、トルエンまたはへプタン /エタノール (99.5)混液 (9:1)を加えて正確に 25mLとし、超音波を 15分間照射し、標準原液とした。標準原液 1、 2および 3mLを正確に量り、溶媒を留去した。 0.5mol/L7酸化力リウムのェタノール (99.5)/トルエン冰混液 (10:10:1) 溶液 I mLを加え、超音波を 1分間照射した。 65°Cの恒温槽で 3時間加熱し、放冷後、 2mol7L塩酸 500;/ Lを正確に加え、よく振り混ぜた。

③ 試料溶液および標準溶液にそれぞれへキサン 2mLを加え、よく振り混ぜた後静置し、上層（有機層）をサンプル瓶に移した。同操作を、へキサン lmLず 1

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つを用いて、さらに 2回繰り返した。

④ 集めた上層に水 lmL加え、よく混ぜ、遠心分離を行ったのち、 7]層（下層）を除去した。前記操作をさらに 1回繰り返した。

⑤ 遠心型エバポレーターまたは窒素を用いて上層の溶媒を留去した。

⑥ 残渣にトルエンを約 0.3mg/mL (CWS量に換算して）となるよう一定量を正確に加えて溶かし、この溶液 200 μ ΐをサンプル瓶に正確に量り、さらにトルェン 300 /z Lおよび蛍光標識化試薬 (AD AM (9-Anthryldiazomet ane) ；フナコシ製） 500 Lを加え、 40°Cで 5時間以上反応させた。反応終了後、すみやかに 5°Cに冷却した。これらをそれぞれ試料溶液および標準溶液として分析に供した。

(2)分析

試料溶液および標準溶液の各 10 Lを B C G— CWSの H P L Cと同じ試験条件で分析した。試料溶液からクロマトグラムのミコール酸に由来する複数ピークの溶出パターンと、標準溶液のそれと比較した。また、試料溶液のミコ一ル酸誘導体のピーク面積を求め、標準溶液のミコール酸誘導体のピーク面積から得られた検量線を用いて、被験サンプル（菌体）における CWS含量（％) を求めた。

(3)結果

被験サンプルの測定結果を表 1 7に示した。表 1 7

CW S含量 (％)=検量線から得られた試料中の C W S量 Z試料の採取量 X 100 上記のように、 B C G— CWSを有効成分として含有する医薬品の製造中間体となる B〇。菌 ·東京株の菌体について、各製造口ットにおける有効成分量を評価することができた。実施例 1 9

凍結乾燥製剤の分析例

(1)溶液の調製

① B C G- CW S凍結乾燥製剤は実施例 1 0に記載された方法で調製した。生物活性が確認されている B C G- CW S凍結乾燥製剤の標準品約 15mgを精密に量り、トルエンまたはへプタン /エタノール (99.5)混液 (9:1)を加えて正確に 25mLとし、超音波を 15分間照射し、標準原液とした。標準原液 1、 2および 3mLを正確に量り、溶媒を留去した。標準原液に内標準溶液（エル力酸（ァノレドリツチ製）のトルエン溶液 ( 1 mL/5000mL) またはトリコセン酸（東京化成製）のトルェン溶液 (3g/1000mL) ) ) 100 Lを正確に加え、 0.5mo]7L水酸ィ匕カリウムのエタノール (99.5)/トルエン/水混液 (20:10:1) 溶液 l mLを加え、超音波を 1分間照射した。 ② BCG-CWS凍結乾燥製剤の被験サンプルを精密に量り、内標準溶液 100 μ Lを正確に加え、 0.5mol/L7酸化力リゥムのエタノール (99.5)/トルエン/ 水混液 (10:10:1) 溶液 l mLを加え、超音波を 1分間照射した。

以下、実施例 1と同様に加水分解を行い、ミコール酸を溶媒抽出し、標識化を行った。ただし、用いる標識化試薬は 10倍濃度が濃いものを用いた。

(2)分析

試料溶液および標準溶液の各 10 μ Lを H P L Cにて以下の条件で分析した。試料溶液からクロマトグラムのミコール酸に由来する複数ピークの溶出パターンと、標準溶液のそれと比較した。また、内標準物質のピーク面積に対するミコール酸誘導体のピーク面積比を求め、標準溶液から得られた検量線を用いて、被験サンプ /レのカ価を求めた。

(3)結果

被験サンプルの測定結果を表 1 8に示した。 03009801

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表 18

力価 (％)二検量線から得られた製剤中の C W S量/製剤中の原薬の表示量 X 100 上記のように、 BCG— CWSを有効成分として含有する医薬品について、各製造ロットにおける力価を評価することができた。実施例 20

B CG— CWSの菌株の同定

実施例 1と同様の方法で BCG菌東京株の CWSと、 BCG菌パスツール株の CWSの、ミコール酸の溶出パターンを HP LCで分析した。結果を図 7に示した。

図 7からわかるように、 BCG菌の株の種類によって、含まれるミコール酸の分子種およびミコール酸分子の量比が異なり、クロマトグラムで判別できることが明らかとなった。参考例 1 B C G— C W S標準品の生物活性評価

(1) 方法

RAW264.7細胞を 96穴プレートに播種後 37°C、 5%二酸化炭素、湿条件で 5 時間培養し、複数濃度の BCG-CWS (標準品）の生理食塩水懸濁液を添加して、さらに約 15時間培養した。培養上清の TNF-口量を AN'ALYZA (登録商標）

Mouse TNF-ロ Dlmmunoassayキットを用いて ELISA測定を行った。付属の手順書に従い、 450nmの吸光度を測定することによって測定した。上記 BCG-CWS の生理食塩水懸濁液のミコール酸含量を、実施例 17記載の方法で測定した。

(2) 結果

測定した BCG-CWSのミコール酸含量と TNF-o;量をプロットした結果を図 8 に不した。

上記の結果から、 BCG-CWS標準品において、本発明の方法で検定したミコーノレ酸含量の分析値と、実際の生物活性値（TNF-ひ産生誘導活性）が相関していることがわかった。すなわち、ミコール^量を生物活性の力価の指標として用いることができることが確認できた。発明の効果

本発明により、安定な水中油型ェマルジヨン製剤が提供できる。また、固体成分を油中に含有する安定で凍結乾燥可能な水中油型ェマルジョン製剤とその凍結乾燥製剤が提供できることから、この方法を用いて、 B C G— CWS製剤を創出でき、免疫賦活抗がん療法が、より効果的に実施できるようになった。

本発明により、ミコパクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌- CWSに含まれる高級脂肪酸またはその誘導体のクロマトグラムのパターンから細菌- CWS、および該細菌- CWSを含む製剤等における細菌の属、種および株を同定、確認することができた。また、ミコバタテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌- CW Sを含有する製造中間体菌体、原薬および製剤の力価を定量的に評価することが可能になった。このことにより、ミコパクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌 -CWSおよびそれを有効成分とする医薬品の品質を一定に保ち、ミコバクテリゥム属およびノカルジァ属等の細菌- CWSを含有する医薬品を提供することが可能になった。

Claims

請求の範囲

1. 細菌一CWSおよび油からなる細菌- CWS含有ペーストであって、 0. 7 poise ( 25 °C) 以下の粘度を有するペースト。

2. 0. 2〜0. 7poise (25°C) の粘度を有する請求項 1記載の細菌一

CWS含有ペースト。

3. 0. 28〜0. 55 poise (25°C) の粘度を有する請求項 1記載の細菌- CWS含有ペースト。

4. 細菌一CWS力 SBCG-CWSである、請求項 1〜 3のいずれか記載の細菌一 CWS含有ペースト。

5. 油がスクヮランである、請求項:！〜 4のいずれ力己載の細菌一 CWS含有ペースト。

6. 細菌一 CWS力 SBCG-CWSであり、 BCG-CWS約 0. 67 gに対してスクヮラン 6. 6g〜35. 2 gを含有することを特徴とする細菌一 CWS含有ペースト。

7. (1) 細菌一 CWSおよび油を分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合する工程、および

(2) 得られた（1) の混合物から有機溶媒を留去する工程を含む、細菌一 CWS含有ペーストの調製方法。

8. 有機溶媒が炭化水素系溶媒、またはハロゲン化炭化水素系溶媒を含む、請求項 7記載の調製方法。

9. 有機溶媒が、 5〜20% (V/V) のアルコール系溶媒を含む炭化水素系溶媒である、請求項 8記載の調製方法。

10. 炭化水素系溶媒がヘプタンまたはへキサンである、請求項 8または 9記載の調製方法。

11. 請求項 7〜10のいずれ力記載の調製方法によって得られる細菌一

CWS含有ペースト。

12. 細菌力 SBCG菌である請求項 11記載のペースト。

13. 油がスクヮランである、請求項 7〜12のいずれか記載のペースト。

14. 請求項 1〜6および 11~13のいずれ力記載の細菌一 CWS含有ぺースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有する、水中油型ェマルジヨン。

15. 水 2Lあたり、 0. 66 g〜3. 35 _§の細菌ー〇\¥8、および 0. 4 〜 8重量％の油を含有することを特徴とする、請求項 14記載の水中油型ェマルジョン。

16. 安定化剤が 1〜： 10%のマンニトールである、請求項 14または 15記載の水中油型ェマルジョン。

17. 界面活性剤が 0. 01 %〜 3 %のポリエチレンォキシソルビタン脂肪酸エステルである、請求項 14〜16のいずれ力記載の水中油型ェマルジヨン。

18. ポリエチレンォキシソルビタン脂肪酸エステルがツイーン 80である請求項 17記載の水中油型ェマルジョン。

19. 以下の（1) および（2〉の特徴を有する請求項 1 ：〜 18のいずれか記載の水中油型ェマルジョン：

(1) ェマルジヨン油滴粒子径が 0. 2〜30//πι ;および

(2) 細菌一 CWSが油滴中に包含され、レクチン反応が陰性。

20. 以下の（1) および（2) の工程を含む、請求項 14〜19のいずれか記載の水中油型ェマルジョンの調製方法：

( 1 ) 請求項 1〜： L 0および 17〜： L 9のいずれ力、記載の細菌一 CWS含有ぺーストと、界面活性剤を含む水溶液の混合液を、曇点以上の温度で乳化する工程、および

(2) 安定化剤を含む水溶液を加えて希釈する工程。

21. 前項の（1) における乳化工程力以下の（3) および（4) の工程を含む請求項²0記載の調製方法：

(3)請求項 1〜6および 11〜13のいずれ力記載の細菌一 CWS含有ペーストと、 0.02%〜0.8%の界面活性剤を含む水溶液の混合液を乳化する工程（粗乳化工程）、

(4) (3) の粗乳化液に界面活性剤を含む水溶液を加え、界面活性剤濃度を調整し、強攪袢して本乳化を行う工程。

22. 請求項 14〜 19のいずれか記載のェマルジョンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤。

23. ェマルジョンが請求項 20または 21記載の調製方法で得られることを特徴とする、請求項 22記載の凍結乾燥製剤。

24. 粒度分布において、粒子径が 0.15〜6μπιである細菌一CWS粒子集合体。

25. 粒度分布において、 D10%が 0.23土 0·05μΐηであり、 D90%が 0.60土 0.05μΐηであり、力つ単一ピークを有する、請求項 24記載の細菌一 CWS粒子集合体。

26. 脂肪族炭化水素系溶媒を含む溶媒中に細菌一 CWSを分散することを特徴とする、請求項 24または 25記載の細菌一 CWS粒子集合体の調製方法。

27. 溶媒が、脂肪族炭化水素系溶媒とアルコール系溶媒との混合物である、請求項 26記載の調製方法。

28. 溶媒が、 5〜20%エタノールを含むヘプタンである請求項 27記載の調製方法。

29. 細菌一 CWSの菌種および Ζまたは菌株の同定方法であって、以下のェ程（1) 〜（3) を含むことを特徴とする方法；

(1) 細菌一 CWS中に含まれる、高級脂肪酸を分離および/または抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、

(2) (1) の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体をクロマトグラフィ一により分析する工程、および

(3) (2) の分析結果に基づき、細菌の CWSの菌種おょひブまたは菌株を同定する工程。

30. 前項の工程 (1) 力高級月旨肪酸画分における高級脂肪酸を標識化して標識化高級脂肪酸誘導体を調製する工程を含むことを特徴とする、請求項 29記載の方法。

31. 細菌一 CWSの力価検定方法であって、以下の工程（1) 、 (4) および（5) を含むことを特徴とする方法；

( 1 ) 細菌一 CWS中に含まれる高級脂肪酸を分離および Ζまたは抽出して高級脂肪酸画分を調製し、要すれば高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を誘導体に変換する工程、 (4) (1) の高級脂肪酸画分における高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する工程、

(5) (4) の分析結果に基づき、細菌一 CWSの免疫賦活能を評価する工程。

32. 高級脂肪酸またはその誘導体の含量を分析する（1) の工程が、高級脂肪酸画分における高級脂肪酸を標識化して標識ィ匕高級脂肪酸誘導体を調製するェ程を含むことを特徴とする、請求項 31記載の方法。

33. 高級脂肪酸の誘導体が高級脂肪酸エステルであることを特徴とする、請求項 30または 32記載の方法。

34. 細菌がミコバタテリゥム属またはノカルジァ属の細菌である、請求項 2 9〜 33のいずれ力記載の方法。

35. ミコバクテリウム属の細菌が BCG菌である、請求項 34記載の方法。

36. 高級脂肪酸がミコール酸である、請求項 29〜 35のいずれか記載の方法。

37. 粒度分布において、粒子径が O.l/ζπ！〜 20μπι、好ましくは 0.15〜6/χ m、さらに好ましくは 0.2 μ m〜2 // mである細菌- CWS粒子集合体を含有する、請求項 1から 6および 11から 13までの、ずれ力記載の細菌一 CWS含有ぺースト。

38. 細菌一 CWS粒子集合体が粒度分布において D10%が 0.23±0.05μπιであり、 D90%が 0.60±0.05μπιであり、かつ単一ピークを有する、請求項 37記載の細菌一 CWS含有ペースト。

39. 請求項 37または 38記載の細菌一 CWS含有ペースト、界面活性剤、安定化剤、および水を含有する、水中油型ェマルジヨン。

40. 請求項 39記載のェマルジヨンを凍結乾燥することによって得られる凍結乾燥製剤。

41. 請求項 14〜 19および 39のいずれか記載のェマルジョンからなる医薬組成物。