WO2004000352A1 - Compuesto terapéutico frente a la infección por leishmania y su uso - Google Patents

Compuesto terapéutico frente a la infección por leishmania y su uso Download PDF

Info

Publication number
WO2004000352A1
WO2004000352A1 PCT/ES2003/000306 ES0300306W WO2004000352A1 WO 2004000352 A1 WO2004000352 A1 WO 2004000352A1 ES 0300306 W ES0300306 W ES 0300306W WO 2004000352 A1 WO2004000352 A1 WO 2004000352A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sign
cells
leishmania
parasite
binding
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2003/000306
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Angel CORBI LÓPEZ
María COLMENARES BRUNET
Luis Ignacio RIVAS LÓPEZ
Miguel Relloso Cerceda
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority to AU2003242790A priority Critical patent/AU2003242790A1/en
Publication of WO2004000352A1 publication Critical patent/WO2004000352A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/716—Glucans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/7056—Lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72

Definitions

  • the present invention falls within the pharmaceutical sector and describes a therapeutic compound for use against Leishmania infection, capable of blocking or canceling the binding of infectious forms of Leishmania with the DC-SIGN receptor present in eukaryotic cells.
  • Leishrnaniasis is a parasitic disease transmitted by a vector with a wide spectrum of clinical manifestations, from local skin lesions to visceral forms of mortal risk, mainly due to differences between Leishmania species and the host's immune status.
  • the Leishmania parasite infects mononuclear phagocytes, a key factor in the immune response against the parasite. This location allows the parasite to subvert from within the effector and regulatory functions of these cells.
  • Antigen presenting skin cells APC
  • LC Langerhans epidermal cells
  • DC dendritic cells
  • Murine dendritic cells internalize Leishmania major promastigotes, produces IL-12 p40 and stimulate primary T cell proliferation in vitro Eur J Immunol 29: 1803-1811; von Stebut, E., Y. Belkaid, T. Jakob, DL Sacks, and MC Udey. 1998. Uptake of Leishmania major amastigotes results in activation and interleukin 12 relée from murine skin-derived dendritic cells: implications for the initiation of anti-Leishmania immunity. JExp Med 188: 1547-1552).
  • Dendritic cells transport Leishmania major from the infected skin to the draining lymph node for presentation to antigen-specific T cells. Eur JImmunol 23: 1595- 1601).
  • Dendritic cells are antigen presenting cells (APCs) that capture antigens in peripheral tissues and migrate through lymph or blood to the lymph nodes where T cells are found. In this location, cells Dendritic present processed antigens to immature T cells initiating these specific antigen-specific primary responses.
  • APCs antigen presenting cells
  • Dendritic cells express several pathogen-associated molecular pattern receptors (PAMP), including numerous C-type lectins and lectin-like receptors (Figdor CG, VKT, Adema GJ. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cell. Nat Rev. Immun 2: 77-84).
  • PAMP pathogen-associated molecular pattern receptors
  • Figdor CG, VKT, Adema GJ. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cell. Nat Rev. Immun 2: 77-84 Given that the surface of Leishmania spp. It presents abundant glycoconjugates rich in ma ⁇ osa (Ilgoutz, SC, and MJ. McConville. 2001. Function and assembly of the Leishmania surface coat. Int J Parasitol 31: 899-908), it was postulated as a reasonable hypothesis to think that lectin-oligosaccharide interactions are involved in the recognition of
  • DC-SIGN dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin, CD209
  • CD209 is a C-type lectin with a cell surface expressed in dendritic cells and involved in cell-cell adhesion due to its ability to bind ICAM-3 and ICAM-2, found on the surface of T and endothelial cells, respectively (Geijtenbeek, TB, DJ Krooshoop, DA Bleijs, SJ van Vliet, GC van Duijnhoven, V. Grabovsky, R. Alón, CG Figdor, and Y. van Kooyk. 2000.
  • DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking, Nat Immunol 1: 353-357; Geijtenbeek, TB, R. Torensma, SJ van Vliet, GC van Duijnhoven, GJ Adema, Y. van Kooyk, and CG Figdor 2000. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 100: 575-585).
  • DC-SIGN and its counterpart DC-SIGN-related are capable of binding to viruses with pathogenic activity, as is the case of the interaction of DC-SIGN with the gp 120 protein of HIV-1 (Geijtenbeek, TB, DS Kwon, R. Torensma, SJ van Vliet, GC van Duijnhoven, J. Middel, IL Cornelissen, HS Nottet, VN KewalRamani, DR Littman, CG Figdor, and Y. van Kooyk. 2000.
  • DC-SIGN a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells.
  • DC-SIGN and DC-SIGNR helping hands for HIV. Trenas Immunol 22: 643-646; Alvarez, CP, F. Lasala, J. Carrillo, O. Mufiiz, AL Corb ⁇ , R. Slim 2002.
  • C-Type Lectins DC-SIGN and L-SIGN Mediated Cellular Entry by Ebola Virus in cis and in trans. J Virol. 76: 6841-6844).
  • DC-SIGN is the main dendritic cell receptor involved in HIV-1 virus infection and facilitates its transmission to T cells.
  • N3 ⁇ -1 virus and resting T cells have a ligand on their surface. with high expression level and that interacts with dendritic cells.
  • the active domain of the DC-SIGN receptor corresponds mainly to the lectin domain of its molecule, and mediates interactions with the HIN-1 virus (through recognition of gpl20), Ebola virus, T cells (through interaction with ICAM-3) and endothelial cells (through interaction with ICAM-2).
  • Type C lectin inhibitors and / or specific antibodies directed against the type C lectin receptor DC-SIG S can modulate, and more specifically reduce, T cell adhesion to dendritic cells, and thereby influence the immune response , especially in its early stages (Geijtenbeek, TB, R. Torensma, SJ van Nliet, GC van Duijnhoven, GJ Adema, Y. van Kooyk, and CG Figdor. 2000. Identification of DC-SIG ⁇ , a novel dendritic cell-specific ICAM -3 receptor that supports primary immune responses.
  • the present invention aims to find solutions for the problem of infections by the Leishmania parasite.
  • This invention is based on the observation by the inventors that the infectious amastigote forms of the Leishmania pifanoi parasite bind specifically and with great affinity to the DC-SIGN receptor. Blocking this type of receptor can modulate, and more specifically reduce, the adhesion of the parasite to eukaryotic cells, and thus can influence the immune response.
  • An object of the present invention is a therapeutic compound capable of blocking or canceling the binding of infectious forms of the Leishmania parasite to the DC-SIGN receptor in eukaryotic cells in mammals, preferably human, and which allows inhibition of receptor binding and internalization. of the parasite by these cells and the subsequent development of the immune response.
  • a particular object of the present invention is a therapeutic compound of the present invention which belongs, among others, to the following group: a) anti-DC-SIGN antibody, b) soluble morning, c) DC-SIGN receptor or the DC lectin domain -SIGN, recombinants, and homologous isoforms and proteins thereof, d) recombinant receptor present in the Leishmania parasite responsible for binding to the DC-SIGN receptor, and their homologous forms.
  • a particular object of the present invention is the anti-DC-SIGN monoclonal antibody, MR-1.
  • Another object of the present invention is a procedure for the identification and evaluation of compounds capable of blocking or canceling the binding of the infectious form of the Leishmania parasite to the DC-SIGN receptor, characterized by the following steps: a) addition of the candidate compound, b) determination of the blocking activity of the candidate by means of the assessment, among others, of cellular parameters: in vitro binding or invasion capacity in K562-CD209 cells transfected with the DC-SIGN receptor, dendritic cells, monocyte-derived cells (MDDC), or other cells that have on their surface the DC-SIGN receptor, and competition in the process of inhibiting binding with a specific anti-DC-SIGN antibody or with mannan, c) identification of a binding blocker of the infectious form of the Leishmania parasite to the DC-SIGN receptor.
  • a further object of the present invention is a therapeutic compound of the present invention identified by the aforementioned method.
  • a further object of the present invention is a pharmaceutical composition containing a therapeutically effective amount of the therapeutic compound of the present invention together with at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • Another additional object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition in the treatment of infections caused by the Leishmania parasite in mammals, preferably in humans.
  • Another additional object of the present invention is the use of the DC-SIGN receptor as a target for the design of therapeutic compounds, capable of blocking or canceling the binding of the infectious forms of the Leishmania parasite to the DC-SIGN receptor, or to any of its isoforms. or homologous proteins.
  • This invention is based on the discovery made by the inventors that the infectious amastigote forms of the Leishmania pifanoi parasite bind specifically and with great affinity to the DC-SIGN receptor, suggesting a role of this receptor in the development of immune responses against Leishmania This is the first time that the binding of a non-viral pathogen, more specifically a parasite, to the DC-SIGN receptor has been described.
  • the invention is also based on the fact that blocking of this type of receptor in dendritic cells, by inhibitors of type C lectins and / or specific antibodies directed against the type C lectin receptor DC-SIGN, can modulate, and more specifically reduce, the adhesion of the parasite to dendritic cells, and thus can influence the immune response, in particular the initial stages of the immune response as seen in other infectious processes (Patent "Composition and Method for modulating dendritic cell-T cell interaction"
  • the present invention provides a therapeutic compound, hereinafter the therapeutic compound of the present invention, capable of blocking or canceling the binding of infectious forms of the Leishmania parasite to the DC-SIGN receptor in eukaryotic cells in mammals, preferably human, and which allows an inhibition of receptor binding and internalization of the parasite by these cells and the subsequent development of the immune response.
  • infectious forms of the Leishmania parasite refers to infectious forms of amastigotes and promastigotes, among others, but not exclusively, of the species of L. amazonensis, L. major, L. pifanoi , L. infanium (Herwaldt, BL 1999. Leishmaniasis. Lancei. 354: 1191-1199;
  • DC-SIGN receptor refers to a type C lectin that acts as a receptor in dendritic cells or other cells that present it and identified by the patent "Composition and Method for modulating dendritic cell-T cell mteraction "(WO0063251, October 26, 2000, University
  • the term "inhibition of receptor binding” refers to blocking the binding of the Leishmania parasite to the DC-SIGN receptor by at least 20%, preferably at least 85%, or more. preferably 100%.
  • eukaryotic cell refers to any type of human or animal cell that has on its surface the DC-SIGN receptor, among others, dendritic cells, macrophages and monocyte derived cells.
  • the term "therapeutic compound” refers to any substance capable of blocking or canceling the binding of infectious forms of Leishmania to the DC-SIGN receptor present in eukaryotic cells.
  • a particular object of the present invention is a therapeutic compound of the present invention which belongs, among others, to the following group: a) anti-DC-SIGN antibody, b) soluble morning, c) DC-SIGN receptor or the DC lectin domain -SIGN, recombinants, and homologous isoforms and proteins thereof, d) recombinant receptor present in the Leishmania parasite responsible for binding to the DC-SIGN receptor, and their homologous forms.
  • soluble morning it refers in this invention to any polysaccharide whose component sugars are mostly manesa residues, being able to present additional modifications and ramifications by other sugar residues, but in which the proportion of ma ⁇ osa is majority (Haworth WN ⁇ t al 1937. J. Chem.
  • the term "recombinant DC-SIGN receptor” refers to the recombinant form of the DC-SIGN receptor, in a soluble form, and produced in eukaryotic or prokaryotic cells, which has the ability to bind to the receptor. present in the Leishmania parasite, covering this parasite and saturating the binding points to the eukaryotic cells carrying the DC-SIGN receptor.
  • the term "recombinant receptor present in the Leishmania parasite” refers to the recombinant form of the receptor present in the Leishmania parasite, in a soluble form, and produced in eukaryotic or prokaryotic cells, which has the capacity of binding to the DC-SIGN receptor present in eukaryotic cells, coating these cells and saturating the binding points to the infectious forms of the Leishmania parasite carrying the receptor.
  • homologous forms refers to all proteins that, with respect to the DC-SIGN receptor and the receptor present in the Leishmania parasite, regardless of their origin, have a homology of at least 20% in the zone of recognition of the parasite and from the DC-SIGN receiver.
  • a particular object of the present invention is the anti-DC-SIGN monoclonal antibody, MR-1.
  • Another additional object of the present invention is a procedure for the identification and evaluation of compounds capable of blocking or canceling the binding of the infectious form of the Leishmania parasite to the DC-SIGN receptor, characterized by the following steps: a) addition to the environment of the Candidate compound, b) determination of the candidate's blocking activity by assessing among others, cellular parameters: in vitro binding or invasion capacity in K562-CD209 cells transfected with the DC-SIGN receptor, dendritic cells, monocyte derived cells ( MDDC), or other cells that have on their surface the DC-SIGN receptor, and competition in the process of inhibition of binding with a specific anti-DC-SIGN antibody or with mannans, c) identification of a binding blocker of the infectious form of the Leishmania parasite to the DC-SIGN receptor.
  • a particular object of the present invention is a therapeutic compound of the present invention identified by the aforementioned method.
  • a particular object of the present invention is a pharmaceutical composition containing a therapeutically effective amount of the therapeutic compound of the present invention together with at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of therapeutic compound of the present invention sufficient to inhibit or reduce the binding process between the parasite.
  • a further object of the present invention is the use of the pharmaceutical composition in the treatment of infections caused by the Leishmania parasite in mammals, among others, in humans.
  • Another additional object of the present invention is the use of the DC-SIGN receptor as a target for the design of therapeutic compounds, capable of blocking or canceling the binding of infectious forms of the Leishmania parasite to the receptor.
  • Figure 1 Amastigotes of L. pifanoi bind to K562 cells stably transfected with DC-SIGN. Untransfected cells (K562) or K562 cells transfected with DC-SIGN (K562-CD209) were incubated with CFSE-labeled amastigotes at different rates for 2h at 37 ° C. The proportion of cells with amastigotes linked by "gating" in K562 and determination of the percentage of fluorescent cells was quantified by flow cytometry. Two random regions were established: K562 with unbound parasites and K562 fluorescent due to binding to cells of amastigote forms labeled with CFSE. For comparison purposes, the scales were established in relation to the number of cells without attached parasites.
  • FIG. 1 Amastigotes of L. pifanoi specifically bind to DC-SIGN in transfected K562-CD209 cells.
  • K562 cells transfected with DC-SIGN K562-CD209), previously untreated (control), pre-treated for 10 min at room temperature with an anti-DC-SIGN monoclonal antibody (MR-1), soluble morning (300 ⁇ g / ml) or purified Leishmania GIPLs (5 ⁇ g / ml) (high-potency molecules abundantly present in the plasma membrane of the promastigote and amastigote forms of the Leishmania parasite), were incubated at a 1: 5 cell: parasite ratio, with amastigotes marked with CFSE during different times at 37 ° C.
  • MR-1 anti-DC-SIGN monoclonal antibody
  • soluble morning 300 ⁇ g / ml
  • purified Leishmania GIPLs 5 ⁇ g / ml
  • the percentage of DC cells with attached amastigote forms was quantified by flow cytometry by gating in MDDC cells. Two random regions were established: MDDC cells without bound parasites (C) and fluorescent MDDC cells due to the union of amastigote forms labeled with CFSE (G).
  • FIG. 4 Amastigotes of L. pifanoi specifically bind to DC-SIGN in MDDC cells.
  • A Immature human MDDC cells, previously untreated (control), pretreated for 10 min at room temperature with an anti-DC-SIGN monoclonal antibody (MR-1) or soluble morning, were incubated at a 1: 5 ratio with amastigotes marked with CFSE for 2h at 37 ° C. A representative field of each sample (1200x) was photographed in an epifluorescence microscope.
  • Soluble morning inhibits the adhesion of MDDC to immobilized ICAM-3.
  • ELISA plates were upholstered with ICAM-3 and incubated with MDEC labeled with BCECF and anti-DC-SIGN (MR-1), CD18 (TS1 / 18) or morning antibodies at 100 ⁇ g / ml. The cells were then allowed to adhere for 15 min at 37 ° C. The adhered cells were quantified on a fluorescence analyzer.
  • Figure 6. Leishmania binding to K562 cells transfected with DC-SIGN.
  • Cells not transfected (K562) or transfected with DC-SIGN (K562-DC-SIGN) are pre-incubated or not with soluble morning (500 ⁇ g / ml) and then incubated (35 ° C, lh) with CFSE-labeled parasites at a parasite / cell ratio of 5/1. The percentage of cells with attached parasites was quantified by flow cytometry.
  • the axenic amastigotes of Leishmania are amastigote forms of the parasite that are not coated with opsonizing antibodies, thus the participation of other different receptors is not masked, and the participation of the DC-SIGN receptor in the union and internalization of Leishmania amastigotes can be analyzed .
  • This binding is blocked by means of the anti-DC-SIGN monoclonal antibody (MR-1) that inhibits the binding of the parasite to dendritic cells.
  • MR-1 anti-DC-SIGN monoclonal antibody
  • the next step was to determine whether blocking the DC-SIGN receptor with certain compounds, such as the MR-1 monoclonal antibody, soluble morning or an anti-CD18 antibody (TS1 / 18) altered the number of dendritic cells infected with amastigotes.
  • the incomplete morning inhibitory effect on the DC-SIGN-Leishmania interaction may be due to various alternative reasons.
  • the Leishmania binding sites in DC-SIGN may be different from those involved in tomorrow's binding.
  • directed mutagenesis experiments have indicated that the HIV gpl20 and ICAM-3 binding sites are not completely identical, and in fact, the recognition of HIV gpl20 is not dependent on its glycosylation (Geijtenbeek, TB, GC van Duijnhoven , SJ van Vliet, E. Krieger, G. Vriend, CG Figdor, and Y. van Kooyk. 2002. Identification of different binding sites in the dendritic cell-specific DC-sIGN receptor for ICAM-3 and HIN-1.
  • Example 1 The binding of amastigotes to DC-SIGN is specific and of great affinity. Preliminary results indicated that the axenic amastigotes of Leishmania pifanoi were effectively internalized by human MDDCs.
  • DC-SIGN was involved in the union of amastigotes.
  • K562-CD209 The axenic amastigotes of L. pifanoi were able to bind in a dose-dependent manner to the transfected cells, but not to the non-transfected ones, as assessed by flow cytometry using CSFE-labeled parasites ( Figure 1).
  • Leishmania GLPLs which are high-potency molecules present in high numbers in the plasma membranes of the promastigote and amastigote forms, at a concentration of 5 ⁇ g / ml (approximately equivalent to 2x10 amastigotes / ml)
  • the glycoinositolphospholipids from Leishmania panamensis contain unusual glycan and lipid moieties. J Mol Biol 282: 287-299) ( Figure 2). Therefore, DC-SIGN functions as a receptor for amastigotes of L. pifanoi, whose binding to DC-SIGN can be totally or partially displaced in the morning, depending on the cell type tested.
  • Example 2 DC-SIGN is involved in the union of amastigotes to DC.
  • the initial incubation of MDDC with the MR-1 antibody reduces the number of parasites bound to the cells in a dose-dependent manner, inhibition being observed with dilutions of less than 1/40000 of the ascites fluid of the hybridoma ( Figure 3).
  • the dose-dependent inhibitory effect of the MR-1 antibody demonstrates the specificity of the interaction between DC-SIGN-Leishmania.
  • the parasite's binding to eukaryotic cells was completely inhibited by EGTA, which is an inhibitor of interactions mediated by type C lectins, but not by human immunoglobulins, nor by the anti-CD18 TS1 / 18 antibody ( Figure 3).
  • Pre-incubation of immature human MDDC with soluble morning had little influence on the process of binding the parasite to the cells.
  • DC-SIGN Due to the wide diversity of possible DC receptors for amastigotes, the role of DC-SIGN was evaluated by preincubation of immature human MDDC with a soluble anti-DC-SIGN or morning antibody, prior to the addition of CFSE-labeled axenic amastigotes (ratio 1: 5, 2h, 37 ° C). The number of DC-bound amastigotes, determined microscopically, were 17.7 ( ⁇ 4.9) and 7.25 ( ⁇ 2.0) in the control and in MDDC treated with MR-1 respectively.
  • Table L- The MR-1 antibody inhibits the infection of immature human MDDC by axenic amastigotes of L. pifanoi.
  • Metacyclogenesis is a process by which Leishmania transforms from the procyclic phase of promastigote, with very low infectivity, to the highly infective metacyclic phase. In Nature, this process takes place within the digestive tract of the vector insect. Such transformation entails an increase in the ability to infect and survive within the vertebrate host, where the parasite faces the host's immune system.
  • DC-SIGN binds both metacyclic promastigotes and amastigotes of L. pifanoi (causing cutaneous leishmaniasis) and L. infantum (visceral leishmaniasis agent).
  • DC-SIGN (CD209) expression is IL-4 dependent and is negatively regulated by IFN, TGF- ⁇ , and anti-inflammatory agents.
  • Soluble morning from Saccharomyces cerevisiae, Sigma M-7504 was prepared at 2mg / ml as stock solution in PBS, sterile filtered, and used at the indicated concentrations.
  • the GIPLs of amastigotes from Leishmania pifanoi were isolated by successive extractions of whole parasites with organic solvents, as described above (Piedrafita, D., L. Proudfoot, AV Nikolaev, D. Xu, W. Sands, GJ Feng, E. Thomas, J.
  • Mexican Leishmania serial cultivation of intracellular stages in a cell-free medium.
  • Exp Parasiiol 58: 72-80 The axenic amastigotes of Leishmania infantum (MCAN / ES / 89 / TPZ229 / 1/89 are grown according to the protocols described at 37 ° C (Pan, AA 1984.
  • Mexican Leishmania serial cultivation of intracellular stages in a cell-free medium.
  • the promastigotes of L. pifanoi and L. infantum are grown at 27 ° C in RPMI 1640 medium supplemented with 20% heat-inactivated fetal bovine serum.
  • the promastigotes of the logarithmic and stationary growth phase are obtained at 3 or 7-8 days of growth of a culture with an initial inoculum of 10 6 cells / ml
  • the fluorescent dye CFSE Molecular Probes
  • Immature MDDCs were prepared from peripheral blood monocytes by using IL-4 (1000 U / ml) and GM-CSF (1000 U / ml), as already described (Relloso, M., Puig-Kroger, A., Muniz Pello, O., Rodriguez-Fernandez, JL., De la Rosa, G., Longo, ⁇ ., Navarro, J., Mu ⁇ oz-Fernandez, MA., Sánchez-Mateos, P., Corbi AL.
  • DC-SIGN CD209 expression is IL-4 dependent and is negatively regulated by IFN, TGF- ⁇ , and anti-inflammatory agents, JImmunol 168: 2634-2643; Sallusto, F., and A. Lanzavecchia. 1994. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte / macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med 179: 1109-1118). K562 cells were cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), 2 ⁇ M glutamine and 10 ⁇ g / ml gentamicin (complete medium).
  • FCS fetal calf serum
  • DC-SIGN K562 cells transfected with DC-SIGN (K562-CD209) (Relloso, M., Puig-Kroger, A., Muniz Pello, O., Rodriguez-Fernandez, JL., De la Rosa, G., Longo, N. , Navarro, J., Mu ⁇ oz-Fernandez, MA., Sánchez-Mateos, P., Corbi AL. 2002.
  • DC-SIGN (CD209) expression is IL-4 dependent and is negatively regulated by IFN, TGF- ⁇ , and anti - inflammatory agents J Immunol 168: 2634-2643) were grown in complete medium supplemented with 300 ⁇ g / ml of G418. Parasite binding assays.
  • Immature MDDC cells, K562 or K562-CD209 were resuspended in complete medium and aliquoted in 24-well plates (2 x 10 5 cells / well). To the cells were added parasites labeled with CFSE, in the indicated proportions, and incubated at 37 ° C for a time reported in each experiment. Subsequently, the cells were fixed (1% paraformaldehyde in PBS) for 1 hour at room temperature, mounted in Mowiol (Calbiochem, 475904) and analyzed in a Nikon Eclipse E800 microscope (Nikon, Melville, NY) equipped for epifluorescence or by cytometry of flow in an EPICS-CS (Scientific Coulter, Madrid, Spain).
  • the percentages of cells without or with attached parasites are resolved in two populations of low (B) and high (C) fluorescence.
  • the cells were washed with PBS-lmM EDTA and before the addition of parasites, they were pre-incubated for 10 min at room temperature with the MR-1 antiserum (1/1000 diluted hybridoma supernatant), irrelevant antiquants ( 100 ⁇ g / ml of human immunoglobulins or supernatant of the anti-CD18 hybridoma TS1 / 18, diluted 1/500), EGTA (5 mM), soluble morning (300 ⁇ g / ml) or GJ LS purified from amastigotes of L.
  • pifanoi amastigotes ( 5 ⁇ g / ml) in complete medium.
  • K562 cells are first incubated for 2 minutes with CSFE labeled parasites, and then an excess (4: 1) of unlabeled L. pifanoi amastigotes is added.
  • DC-SIGN adhesion tests The adhesion of DCDC-SIGN-dependent MDDC was evaluated using ICAM-3-Fc.
  • 96-well EIA II-Linbro plates were coated overnight with ICAM-3-Fc at 3 ⁇ g / ml in 100 mM NaHCO 3 pH 8.8 and at 4 ° C, and blocked with bovine serum albumin (BSA) at 0.4 % in the same solution for 2h at 37 ° C.
  • BSA bovine serum albumin
  • the MDDCs were labeled in complete medium with the fluorescent dye 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (and-6) -carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester (BCECF) (Molecular Probes, The Netherlands), and then they were pre-incubated for 20 min at 37 ° C in RPMI + 0.4% BSA and with blocking antibodies against CD209 (MR-1), CD18 (TS1 / 18) or with morning at 100 ⁇ g / ml. The cells were then allowed to adhere to each well for 15 min at 37 ° C. Unbound cells were removed by three washes with tempered RPMI and the adhered cells were quantified in a fluorescence analyzer. DC infection with Leishmania.
  • the DC concentration was adjusted to 10 cells / well in 24-well plates and incubated with different proportions of parasites for 1 hour at 37 ° C.
  • the cells were washed with PBS-lmM EDTA, prior to the addition of the parasite, and pre-incubated for 10 min at room temperature with the MR-1 antiserum, the TS1 / 18 antiserum or soluble medium in complete medium .
  • the OC-Leishmania samples were incubated for 48h at 34 ° C. It was subsequently washed with PBS, fixed with methanol and mixed with Giemsa in order to visualize DCs infected with amastigotes.
  • the percentage of infected DC and the ratio of parasites-DCs was determined by microscopy after examination of at least 200 cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

En la presente invención se ha demostrado por primera vez el papel del receptor DC-SIGN (Dendritic cell-specific ICAM 3 grabbing non-integrin), presente en la superficie de las células dendríticas, en el proceso de unión del parásito Leishmania a células eucarióticas humanas, entre otras células dendríticas, macrófagos y células derivadas de monocitos. La invención consiste en un nuevo compuesto terapéutico frente a la infección por Leishmania capaz de bloquear o anular el proceso de unión de las formas infecciosas del parásito Leishmania con el receptor DC-SIGN, presente en células eucarióticas, entre otras, en células dendríticas humanas y ciertas poblaciones de macrófagos, y la subsecuente inhibición de internalización del parásito.

Description

COMPUESTO TERAPÉUTICO FRENTE A LA INFECCIÓN POR Leishmania Y SU USO.
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se encuadra dentro del sector farmacéutico y describe un compuesto terapéutico para uso frente a la infección por Leishmania, capaz de bloquear o anular la unión de las formas infecciosas de Leishmania con el receptor DC-SIGN presente en células eucarióticas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La leishrnaniasis es una enfermedad parasitaria transmitida por un vector con un amplio espectro de manifestaciones clínicas, desde lesiones cutáneas locales hasta formas viscerales de riesgo mortal, debido principalmente a las diferencias entre las especies de Leishmania y al estado inmunológico del hospedador.
Entre los eventos iniciales que tienen lugar en el sitio de inoculación de Leishmania se incluye la infección de células hospedadoras por parte de promastigotes metacíclicos seguido de su transformación intracelular en amastigote. Una vez liberados al medio extracelular, los amastigotes invaden nuevas células provocando la diseminación de la infección. Durante las primeras fases de este ciclo expansivo, están ausentes anticuerpos específicos, lo cual impide mecanismos opsonizantes.
El parásito Leishmania infecta fagocitos mononucleares, un factor clave de la respuesta inmune frente al parásito. Esta localización le permite al parásito subvertir desde dentro las funciones efectora y reguladora de estas células. Las células cutáneas presentadoras de antígeno (APC), específicamente las células epidérmicas de Langerhans (LC) y las células dendríticas (DC), están implicadas activamente en la vigilancia de su entorno (Banche eau, J., and R.M. Steinman. 1998. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392:245-252; Mellman, L, and R.M. Steinman. 2001. Dendritic cells: specialized and regulated antigen processing machines. Cell 106:255- 258). En el caso de Leishmania amazonensis (complejo L. mexicana), ambos, amastigotes y promastigotes metacíclicos, infectan células DC murinas (Qi, H., V. Popov, and L. Soong. 2001. Leishmania amazonensis-denόήtic cell interactions in vitro and the priming of parasite-specific CD4(+) T cells in vivo. JImmunol 167:4534-4542), aunque la capacidad de LC y DC de capturar otras especies de Leishmania sigue siendo un tema en debate (Konecny, P., AJ. Stagg, H. Jebbari, N. English, R.N. Davidson, and S.C. Knight. 1999. Murine dendritic cells internalize Leishmania major promastigotes, produce IL-12 p40 and stimulate primary T cell proliferation in vitro. Eur J Immunol 29:1803-1811; von Stebut, E., Y. Belkaid, T. Jakob, D.L. Sacks, and M.C. Udey. 1998. Uptake of Leishmania major amastigotes results in activation and interleukin 12 reléase from murine skin-derived dendritic cells: implications for the initiation of anti- Leishmania immunity. JExp Med 188:1547-1552). La presencia en lesiones cutáneas de LC y DC parasitadas por Leishmania in vivo ha sido divulgada tanto en leishmaniasis cutánea humana (Ridley, M.J., and C.W. Wells. 1986. Macrophage-parasite interaction in the lesions of cutaneous leishmaniasis. An ultrastructural study. Am JPathol 123:79- 85; Isaza, D.M., M. Restrepo, R. Restrepo, G. Caceres-Dittmar, and FJ. Tapia. 1996. hrtmunocytochemical and histopathologic characterization of lesions from patients with localized cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania panamensis. Am J Trop Med Hyg 55:365-369; el-Hassan, A.M., S.E. Meredith, H.I. Yagi, E.A. Khalil, H.W. Ghalib, K. Abbas, E.E. Zijlstra, C.C. Kroon, G.J. Schoone, and A. Ismail. 1995. Sudanese mucosal leishmaniasis: epidemiology, clinical features, diagnosis, immune responses and treatment. Trans R Soc Trop Med Hyg 89:647-652) como en leishmaniasis murina experimental (Blank, C, H. Fuchs, K. Rappersberger, M. Rollinghoff, and H. Molí. 1993. Parasitism of epidemial Langerhans cells in experimental cutaneous leishmaniasis with Leishmania major. J Infecí Dis 167:418-425 ; Williams, R.O. 1988. Invasión of murine dendritic cells by Leishmania major and L. mexicana mexicana. J Parasitol 74:186-187). Debido a la proximidad de las células dendríticas inmaduras a los lugares en que el parásito Leishmania penetra en la dermis, tras la ingesta de sangre por el flebotomo, el papel de estas células es crítico para el inicio de la respuesta inmune específica de Leishmania. (Molí, H., H. Fuchs, C. Blank, and M. Rollinghoff. 1993. Langerhans cells transport Leishmania major from the infected skin to the draining lymph node for presentation to antigen-specific T cells. Eur JImmunol 23: 1595-1601). Las células dendríticas son células presentadoras de antígeno (APC) que capturan antígenos en tejidos periféricos y migran por la linfa o la sangre hasta los ganglios linfáticos donde se encuentran las células T. En esta localización las células dendríticas presentan los antígenos procesados a las células T inmaduras iniciando éstas respuestas primarias específicas de antígenos.
Las células dendríticas expresan varios receptores de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), incluyendo numerosas lectinas de tipo C y receptores tipo lectina (Figdor CG, V.K.T., Adema GJ. 2002. C-type lectin receptors on dendritic cells and Langerhans cell. Nat. Rev. Immun 2:77-84). Teniendo en cuenta que la superficie de Leishmania spp. presenta abundantes glicoconjugados ricos en mañosa (Ilgoutz, S.C., and MJ. McConville. 2001. Function and assembly of the Leishmania surface coat. Int J Parasitol 31:899-908), se postuló como hipótesis razonable pensar que las interacciones lectina-oligosacáridos están implicadas en el reconocimiento del parásito.
DC-SIGN (dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin, CD209) es una lectina de tipo C de superficie celular expresada en células dendríticas e implicada en adhesión célula-célula debido a su capacidad para unir ICAM-3 e ICAM-2, que se encuentran en la superficie de las células T y endoteliales, respectivamente (Geijtenbeek, T.B., D.J. Krooshoop, D.A. Bleijs, S.J. van Vliet, G.C. van Duijnhoven, V. Grabovsky, R. Alón, C.G. Figdor, and Y. van Kooyk. 2000. DC-SIGN-ICAM-2 interaction mediates dendritic cell trafficking. Nat Immunol 1:353-357; Geijtenbeek, T.B., R. Torensma, S.J. van Vliet, G.C. van Duijnhoven, G.J. Adema, Y. van Kooyk, and C.G. Figdor. 2000. Identification of DC-SIGN, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 100:575-585). Fue también observado que DC-SIGN y su homólogo DC-SIGN-related (DC-SIGNR) son capaces de unirse a virus con actividad patógena, como es el caso de la interacción de DC-SIGN con la proteína gp 120 del HIV-1 (Geijtenbeek, T.B., D.S. Kwon, R. Torensma, S.J. van Vliet, G.C. van Duijnhoven, J. Middel, I.L. Cornelissen, H.S. Nottet, V.N. KewalRamani, D.R. Littman, C.G. Figdor, and Y. van Kooyk. 2000. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell 100:587-597; WO0063251, 26 Octubre 2000, Universidad Nijmegen) y el virus del Ebola (Pohlmann, S., F. Baribaud, and R.W. Doms. 2001. DC-SIGN and DC-SIGNR: helping hands for HIV. Trenas Immunol 22:643-646; Alvarez, C.P., F. Lasala, J. Carrillo, O. Mufiiz, A.L. Corbí, R. Delgado. 2002. C-Type Lectins DC-SIGN and L- SIGN Medíate Cellular Entry by Ebola Virus in cis and in trans. J Virol. 76:6841-6844). DC-SIGN es el principal receptor de las células dendríticas involucrado en la infección por virus VIH-1 y facilita su transmisión a las células T. De este modo tanto el virus N3Η-1 como las células T en reposo presentan en su superficie un ligando con nivel de expresión elevado y que interacrúa con las células dendríticas. El dominio activo del receptor DC-SIGN corresponde principalmente al dominio lectina de su molécula, y media las interacciones con el virus HIN-1 (mediante el reconocimiento de gpl20), virus del Ebola, células T (mediante la interacción con ICAM-3) y células endoteliales (mediante la interacción con ICAM-2).
Sin embargo, los receptores utilizados por amastigotes de Leishmania para adherirse e infectar macrófagos, la diana final, no están totalmente establecidos y, según nuestro conocimiento, no se han caracterizado todavía receptores específicos para Leishmania en DCs.
Los inhibidores de lectinas de tipo C y/o anticuerpos específicos dirigidos contra el receptor de lectinas de tipo C DC-SIGΝ pueden modular, y más específicamente reducir, la adhesión de células T a las células dendríticas, y de este modo influenciar la respuesta inmune, especialmente en sus fases iniciales (Geijtenbeek, T.B., R. Torensma, S.J. van Nliet, G.C. van Duijnhoven, G.J. Adema, Y. van Kooyk, and C.G. Figdor. 2000. Identification of DC-SIGΝ, a novel dendritic cell-specific ICAM-3 receptor that supports primary immune responses. Cell 100:575-585) Actualmente, el único modo eficaz de tratamiento para la leishmaniasis se basa exclusivamente en la quimioterapia, ya que no existe una vacuna eficaz en humanos, y los programas de control del vector invertebrado o del reservorio vertebrado sólo han resultado con éxito en circunstancias muy especiales. Por otro lado, los fármacos utilizados contra la leishmaniasis, como los derivados orgánicos de antimonio pentavalente o la anfotericina, presentan con frecuencia efectos muy tóxicos y aparición de resistencias. Un fármaco que disminuya la carga parasitaria, además del beneficio intrínseco en la patología de la enfermedad, favorecería que los mecanismos inmunes de destrucción del parásito, inhibidos proporcionalmente a la carga parasitaria, sean eficaces, existiendo una sinergia clara del tratamiento farmacológico con la respuesta inmune protectiva (Murray, H.W. (2000) Treatment of visceral leishmaniasis (kala-azar): a decade of progress and future approaches Int. J. Infecí. Dis. 4:158-77). DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Descripción breve
La presente invención tiene como objetivo buscar soluciones para el problema de infecciones por el parásito Leishmania. Esta invención se basa en la observación por parte de los inventores de que las formas amastigotes infecciosas del parásito Leishmania pifanoi se unen específicamente y con gran afinidad al receptor DC-SIGN. El bloqueo de este tipo de receptor puede modular, y más específicamente reducir, la adhesión del parásito a las células eucarióticas, y de este modo puede influenciar la respuesta inmune. Un objeto de la presente invención lo constituye un compuesto terapéutico capaz de bloquear o anular la unión de formas infecciosas del parásito Leishmania al receptor DC-SIGN en células eucarióticas en mamíferos, preferentemente humanos, y que permite una inhibición de la unión al receptor e internalización del parásito por estas células y el subsecuente desarrollo de la respuesta inmune. Un objeto particular de la presente invención es un compuesto terapéutico de la presente invención que pertenece, entre otros, al siguiente grupo: a) anticuerpo anti DC-SIGN, b) mañano soluble, c) receptor DC-SIGN o el dominio lectina de DC-SIGN, recombinantes, y isoformas y proteínas homologas de los mismos, d) receptor recombinante presente en el parásito Leishmania responsable de la unión con el receptor DC-SIGN, y sus formas homologas.
Un objeto particular de la presente invención lo constituye el anticuerpo monoclonal anti-DC-SIGN, MR-1. Otro objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento para la identificación y evaluación de compuestos capaces de bloquear o anular la unión de la forma infecciosa del parásito Leishmania al receptor DC-SIGN, caracterizado por los siguientes pasos: a) adición del compuesto candidato, b) determinación de la actividad bloqueadora del candidato mediante la valoración entre otros, de parámetros celulares: capacidad de unión o invasión in vitro en células K562-CD209 transfectadas con el receptor DC-SIGN, células dendríticas, células derivadas de monocitos (MDDC), u otras células que presentan en su superficie el receptor DC-SIGN, y competición en el proceso de inhibición de la unión con un anticuerpo específico anti-DC-SIGN o con mananos, c) identificación de un bloqueador de la unión de la forma infecciosa del parásito Leishmania al receptor DC-SIGN.
Un objeto adicional de la presente invención es un compuesto terapéutico de la presente invención identificado por el procedimiento anteriormente mencionado.
Un objeto adicional de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto terapéutico de la presente invención junto con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye el empleo de la composición farmacéutica en el tratamiento de infecciones provocadas por el parásito Leishmania en mamíferos, preferentemente en humanos. Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye el empleo del receptor DC-SIGN como diana para el diseño de compuestos terapéuticos, capaces de bloquear o anular la unión de las formas infecciosas del parásito Leishmania al receptor DC-SIGN, o a cualquiera de sus isoformas o proteínas homologas.
Descripción detallada
Esta invención se basa en el descubrimiento que han hecho los inventores de que las formas amastigotes infecciosas del parásito Leishmania pifanoi se unen específicamente y con gran afinidad al receptor DC-SIGN, sugiriendo un papel de este receptor en el desarrollo de las respuestas inmunes frente a Leishmania. Esta es la primera vez que se describe la unión de un patógeno no viral, más específicamente un parásito, al receptor DC-SIGN.
La invención también se basa en el hecho de que el bloqueo de este tipo de receptor en las células dendríticas, por inhibidores de lectinas de tipo C y/o anticuerpos específicos dirigidos contra el receptor de lectina tipo C DC-SIGN, pueden modular, y más específicamente reducir, la adhesión del parásito a las células dendríticas, y de este modo pueden influenciar la respuesta inmune, en particular los estadios iniciales de la respuesta inmune tal como se ha visto en otros procesos infecciosos (Patente "Composition and Method for modulating dendritic cell-T cell interaction"
WO0063251, 26 Octubre 2000, Universidad Nijmegen).
La presente invención proporciona un compuesto terapéutico, en adelante compuesto terapéutico de la presente invención, capaz de bloquear o anular la unión de formas infecciosas del parásito Leishmania al receptor DC-SIGN en células eucarióticas en mamíferos, preferentemente humanos, y que permite una inhibición de la unión al receptor e internalización del parásito por estas células y el subsecuente desarrollo de la respuesta inmune.
Tal como se utiliza en la presente invención, el término "formas infecciosas del parásito Leishmania" se refiere a formas infecciosas de amastigotes y promastigotes, entre otras, pero no exclusivamente, de las especies de L. amazonensis, L. major, L. pifanoi, L. infanium (Herwaldt, B.L. 1999. Leishmaniasis. Lancei. 354: 1191-1199;
Croft, S.L., Yardley, V. 2002 Chemotherapy of leishmaniasis. Current Pharmaceuiical
Design 8: 319-42; Murray, H.W. 2000 Treatment of visceral leishmaniasis (kala-azar): a decade of progress and future approaches. Iní J Infecí Dis. 4(3): 158-77; Handman, E.
1999 Cell biology oí Leishmania. Adv Parasitol. 44:1-39).
Tal como se utiliza en esta invención, el término "receptor DC-SIGN" se refiere a una lectina de tipo C que actúa como receptor en las células dendríticas u otras células que lo presenten e identificado por la patente "Composition and Method for modulating dendritic cell-T cell mteraction" (WO0063251, 26 Octubre 2000, Universidad
Nijmegen).
Tal como se utiliza en esta invención, el término "inhibición de la unión al receptor" se refiere al bloqueo de la unión del parásito Leishmania al receptor DC-SIGN en al menos un 20%, preferentemente en al menos un 85%, ó más preferentemente en un 100%.
El termino "célula eucariótica", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a cualquier tipo de célula humana o animal que presente en su superficie el receptor DC-SIGN, entre otras, células dendríticas, macrófagos y células derivadas de monocitos. (Soilleux, E.J., Morris, L.S., Leslie, G., Chehimi, J., Luo, Q., Levroney, E., Trowsdale, J., Montaner, L.J., Doms, R.W., Weissman, D., Coleman, N., Lee, B. 2002
Constitutive and induced expression of DC-SIGN on dendritic cell and macrophage subpopulations in situ and in vitro. J Leukoc Biol. 71(3):445-57). Tal como se utiliza en la presente invención, el término "compuesto terapéutico" se refiere a cualquier sustancia capaz de bloquear o anular la unión de las formas infecciosas de Leishmania al receptor DC-SIGN presente en células eucarióticas.
Un objeto particular de la presente invención es un compuesto terapéutico de la presente invención que pertenece, entre otros, al siguiente grupo: a) anticuerpo anti DC-SIGN, b) mañano soluble, c) receptor DC-SIGN o el dominio lectina de DC-SIGN, recombinantes, y isoformas y proteínas homologas de los mismos, d) receptor recombinante presente en el parásito Leishmania responsable de la unión con el receptor DC-SIGN, y sus formas homologas.
Como "mañano soluble", se refiere en esta invención a cualquier polisacárido cuyos azúcares componentes sean mayoritariamente residuos de mañosa, pudiendo presentar modificaciones adicionales y ramificaciones por otros residuos de azúcar, pero en los que la proporción de mañosa es mayoritaria (Haworth WN βt al. 1937. J. Chem.
Soc. Chem. Commun. 784).
Tal como se utiliza en esta invención, el término "receptor DC-SIGN recombinante" se refiere a la forma recombinante del receptor DC-SIGN, en una forma soluble, y producido en células eucarióticas o procarióticas, que tiene la capacidad de unirse al receptor presente en el parásito Leishmania, recubriendo este parásito y saturando los puntos de unión a las células eucarióticas portadoras del receptor DC- SIGN.
Tal como se utiliza en esta invención, el término "receptor recombinante presente en el parásito Leishmania" se refiere a la forma recombinante del receptor presente en el parásito Leishmania, en una forma soluble, y producido en células eucarióticas o procarióticas, que tiene la capacidad de unirse al receptor DC-SIGN presente en células eucarióticas, recubriendo estas células y saturando los puntos de unión a las formas infecciosas del parásito Leishmania portadoras del receptor.
Como formas homologas, se refiere a todas las proteínas que, con respecto al receptor DC-SIGN y al receptor presente en el parásito Leishmania, independientemente de su origen, presentan una homología de al menos, un 20% en la zona de reconocimiento del parásito y del receptor DC-SIGN. Un objeto particular de la presente invención lo constituye el anticuerpo monoclonal anti-DC-SIGN, MR-1.
Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye un procedimiento para la identificación y evaluación de compuestos capaces de bloquear o anular la unión de la forma infecciosa del parásito Leishmania al receptor DC-SIGN, caracterizado por los siguientes pasos: a) adición al medio del compuesto candidato, b) determinación de la actividad bloqueadora del candidato mediante la valoración entre otros, de parámetros celulares: capacidad de unión o invasión in vitro en células K562-CD209 transfectadas con el receptor DC-SIGN, células dendríticas, células derivadas de monocitos (MDDC), u otras células que presentan en su superficie el receptor DC-SIGN, y competición en el proceso de inhibición de la unión con un anticuerpo específico anti-DC-SIGN o con mananos, c) identificación de un bloqueador de la unión de la forma infecciosa del parásito Leishmania al receptor DC-SIGN.
Un objeto particular de la presente invención es un compuesto terapéutico de la presente invención identificado por el procedimiento anteriormente mencionado.
Un objeto particular de la presente invención lo constituye una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto terapéutico de la presente invención junto con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal como se utiliza en esta invención el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de compuesto terapéutico de la presente invención suficiente para inhibir o reducir el proceso de unión entre el parásito
Leishmania y el receptor DC-SIGN. Por otro lado, un objeto adicional de la presente invención lo constituye el empleo de la composición farmacéutica en el tratamiento de infecciones provocadas por el parásito Leishmania en mamíferos, entre otros, en humanos.
Otro objeto adicional de la presente invención lo constituye el empleo del receptor DC-SIGN como diana para el diseño de compuestos terapéuticos, capaces de bloquear o anular la unión de las formas infecciosas del parásito Leishmania al receptor
DC-SIGN, o a cualquiera de sus isoformas o proteínas homologas. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1.- Amastigotes de L. pifanoi se unen a células K562 establemente transfectadas con DC-SIGN. Se incubaron células no transfectadas (K562) o células K562 transfectadas con DC-SIGN (K562-CD209) con amastigotes marcados con CFSE a distintas proporciones durante 2h a 37°C. Se cuantificó por citometría de flujo la proporción de células con amastigotes unidos mediante "gating" en K562 y determinación del porcentaje de células fluorescentes. Dos regiones al azar fueron establecidas: K562 con parásitos no unidos y K562 fluorescentes debido a la unión a las células de formas amastigotes marcadas con CFSE. Para efectos de comparación, las escalas fueron establecidas con relación al numero de células sin parásitos unidos.
Figura 2.- Amastigotes de L. pifanoi se unen específicamente a DC-SIGN en células transfectadas K562-CD209. Células K562 transfectadas con DC-SIGN (K562- CD209), previamente no tratadas (control), pre-tratadas durante 10 min a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal anti-DC-SIGN (MR-1), mañano soluble (300 μg/ml) o GIPLs de Leishmania purificados (5 μg/ml) (moléculas con alto contenido en mañosa abundantemente presentes en la membrana plasmática de las formas promastigotes y amastigotes del parásito Leishmania), se incubaron a una proporción 1:5 célula:parásito, con amastigotes marcados con CFSE durante distintos tiempos a 37°C. Se cuantificó por citometría de flujo la proporción de células con amastigotes unidos mediante gating en K562 y determinación del porcentaje de células fluorescentes. Dos regiones al azar fueron establecidas: K562 con parásitos no unidos y K562 fluorescentes debido a la unión a las células de formas amastigotes marcadas con CFSE. Para efectos de comparación, las escalas fueron establecidas con relación al numero de células sin parásitos unidos. Figura 3.- La unión de amastigotes de L. pifanoi a células dendríticas derivadas de monocitos (MDDC) se ve afectada por la presencia de un anticuerpo anti-DC- SIGN (MR-1). MDDC previamente no tratadas (control), pre-tratadas durante 10 min a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal anti-DC-SIGN MR-1 (columna izquierda), otros anticuerpos irrelevantes (inmunoglobulinas humanas, anti-CD18), mañano soluble o EGTA, fueron incubadas con formas amastigotes marcadas con CFSE en la proporción 1:5 célula:parásito, durante 2 horas a 37°C. El porcentaje de células DC con formas amastigotes unidas fue cuantificada por citometría de flujo mediante gating en células MDDC. Dos regiones al azar fueron establecidas: células MDDC sin parásitos unidos (C) y células MDDC fluorescentes debido a la unión de formas amastigotes marcadas con CFSE (G). Para efectos de comparación, las escalas fueron establecidas con relación al numero de células sin parásitos unidos. Figura 4.- Amastigotes de L. pifanoi se unen específicamente a DC-SIGN en células MDDC. (A) Células MDDC humanas inmaduras, previamente no tratadas (control), pre-tratadas durante 10 min a temperatura ambiente con un anticuerpo monoclonal anti-DC-SIGN (MR-1) o mañano soluble, se incubaron a una proporción 1:5 con amastigotes marcados con CFSE durante 2h a 37°C. Se fotografío en un microscopio de epifluorescencia un campo representativo de cada muestra (1200x). (B) Mañano soluble inhibe la adhesión de MDDC a ICAM-3 inmovilizado. Se tapizó placas de ELISA con ICAM-3 y se incubaron con MDDC marcadas con BCECF y anticuerpos anti-DC-SIGN (MR-1), CD18 (TS1/18) o mañano a 100 μg/ml. Entonces se dejo que las células se adhiriesen durante 15 min a 37° C. Las células adheridas se cuantificaron en un analizador de fluorescencia.
Figura 5.- Unión de Leishmania a las células dendríticas inmaduras humanas. Las células fueron preincubadas ( 10 min , 25°C) o no, con el anticuerpo monoclonal bloqueante de DC-SIGN MR-1 (1.2 μg/ml), e incubadas posteriormente con parásitos marcados con CSFE (relación parásitos/célula= 5/1). El porcentaje de las células con parásitos unidos fue cuantificado por citometría de flujo.
Figura 6.-Unión de Leishmania a células K562 transfectadas con DC-SIGN. Células no transfectadas (K562) o transfectadas con DC-SIGN (K562-DC-SIGN), son preincubadas o no con mañano soluble (500 μg/ml) y a continuación, son incubadas(35°C, lh) con parásitos marcados con CFSE a una relación parásito/célula de 5/1. El porcentaje de células con parásitos unidos se cuantificó por citometría de flujo.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
En la presente invención se ha demostrado por primera vez que el proceso de unión e internalización de las formas amastigotes del parásito Leishmania se realiza por medio del receptor DC-SIGN presente en las células dendríticas humanas. De este modo, se empezó por demostrar que los amastigotes axénicos se unen a células dendríticas de forma dependiente de DC-SIGN, tal como hemos demostrado utilizando tanto células K562 transfectadas con DC-SIGN (K562-CD209) como células dendríticas derivadas de monocitos (MDDC) (Figuras 1-3). Los amastigotes axénicos de Leishmania son formas amastigotes del parásito que no están recubiertos de anticuerpos opsonizantes, no quedando de este modo enmascarada la participación de otros receptores distintos, y pudiendo analizarse la participación del receptor DC-SIGN en la unión e internalización de amastigotes de Leishmania. Esta unión es bloqueada por medio del anticuerpo monoclonal anti-DC-SIGN (MR-1) que inhibe la unión del parásito a las células dendríticas. El siguiente paso consistió en determinar si el bloqueo del receptor DC-SIGN con determinados compuestos, tales como el anticuerpo monoclonal MR-1, mañano soluble o un anticuerpo anti CD18 (TS1/18) alteraba el número de células dendríticas infectadas con amastigotes. Se observó que el número de DCs con formas infecciosas del parásito unidas era menor en el grupo tratado con el anticuerpo MR-1. Este hecho sugiere un papel importante de este receptor en la infección inicial de células dendríticas por Leishmania. Contrariamente a la unión de MDDC a ICAM-3 (presente en las células T), los mananos bloquearon parcialmente la unión de amastigotes a células dendríticas, resultado que se asemeja a resultados previos sobre la incapacidad de compuestos constituidos por mañano soluble de inhibir la interacción entre amastigotes de Leishmania y macrófagos (Kane, M.M., and D.M. Mosser. 2000. Leishmania parasites and their ploys to disrupt macrophage activation. Curr Opin Hemaíol 7:26-31). El efecto inhibidor incompleto de mañano sobre la interacción DC-SIGN-Leishmania puede deberse a diversas razones alternativas. En primer lugar, los sitios de unión de Leishmania en DC-SIGN pueden ser diferentes a los que están implicados en la unión de mañano. En este sentido, experimentos de mutagénesis dirigida han indicado que los lugares de unión de HIV gpl20 e ICAM-3 no son completamente idénticos, y de hecho, el reconocimiento de HIV gpl20 no es dependiente de su glicosilación (Geijtenbeek, T.B., G.C. van Duijnhoven, S.J. van Vliet, E. Krieger, G. Vriend, C.G. Figdor, and Y. van Kooyk. 2002. Identification of different binding sites in the dendritic cell- specific receptor DC-sIGN for ICAM-3 and HIN-1. J Biol Chem 17:17). En segundo lugar, la afinidad del los ligando(s) de Leishmania por DC-SIGΝ puede ser superior a la del mañano. De hecho, sutiles cambios en la estructura oligosacárida de moléculas relacionadas ricas en mañano da lugar a diferencias sustanciales en la afinidad por DC-SIGΝ (Mitchell, D.A., A.J. Fadden, and K. Drickamer. 2001. A novel mechanism of carbohydrate recognition by the C-type lectins DC- SIGN and DC-SIGNR. Subunit organization and binding to multivalent ligands. J Biol Chem 276:28939-28945). En cualquier caso, no se puede descartar la posibilidad de un mecanismo cooperativo en la interacción entre Leishmania y DC- SIGN, ya que el parásito podría actuar como un ligando multivalente.
Puesto que la composición de la membrana del parásito varía a lo largo de su ciclo vital (Wright, E. P., and E. R. el Amin. 1989. Leishmania infection: surfaces and immunity. Biochem Cell Biol 67:525; Bahr, V., Y. D. Stierhof, T. Ilg, M. Demar, M. Quinten, and P. Overath. 1993. Expression of lipophosphoglycan, high-molecular weight phosphoglycan and glycoprotein 63 in promastigotes and amastigotes of Leishmania mexicana. Mol Biochem Parasitol 58:107), la implicación de DC-SIGN como receptor para las tres formas principales del ciclo vital del parásito (promastigotes logarítmicos y estacionarios , conjuntamente con amastigotes) fue analizada. Los amastigotes mostraron la interacción más fuerte, y dentro de los promastigotes, aquellos de fase estacionaria (metacíclicos e infectivos) poseen una mayor avidez por DC-SIGN que los promastigotes de fase logarítmica ( procíclicos y no infectivos).
Ejemplo 1.- La unión de amastigotes a DC-SIGN es específica y de gran afinidad. Los resultados preliminares indicaron que los amastigotes axénicos de Leishmania pifanoi eran eficazmente internalizados por MDDCs humanas. Con el objetivo de explorar si DC-SIGN estaba implicado en la unión de amastigotes, primero analizamos la interacción de amastigotes axénicos con células K562 transfectadas con DC-SIGN (K562-CD209). Los amastigotes axénicos de L. pifanoi fueron capaces de unirse de forma dosis dependiente a las células transfectadas, pero no a las no transfectadas, según se evaluó por citometría de flujo usando parásitos marcados con CSFE (Figura 1). Mediante el empleo de distintas proporciones de células K562- CD209: amastigotes (1:1, 1:5 y 1:10), se determinó que la unión era máxima dentro del rango 1:10-1:5. Consecuentemente, para evitar el exceso de ligandos del parásito, en los demás experimentos de cinética y competición, se empleó la proporción 1:5. La unión de amastigotes a K562-CD209 fue rápida y alcanzó la saturación en lh (Figura 2). El anticuerpo monoclonal MR-1 bloqueó completamente la unión de amastigotes a células K562-CD209 (Figura 2), confirmándose la participación de DC-SIGN en esta interacción específica. Con relación al mañano soluble (300 μg/ml), este redujo en un 30% la unión de amastigotes al receptor DC-SIGN (Figura 2). No se observó inhibición empleando GLPLs de Leishmania, que son moléculas con un alto contenido en mañosa presentes en elevado número en las membranas plasmáticas de las formas promastigotes y amastigotes, a una concentración de 5 μg/ml (aproximadamente equivalente a 2x10 amastigotes/ml) (Zawadzki, J., C. Scholz, G. Currie, G.H. Coombs, and M.J. McConville. 1998. The glycoinositolphospholipids from Leishmania panamensis contain unusual glycan and lipid moieties. J Mol Biol 282:287-299) (Figura 2). Por lo tanto, DC-SIGN funciona como un receptor para amastigotes de L. pifanoi, cuya unión a DC-SIGN puede ser total o parcialmente desplazada por mañano, dependiendo del tipo celular ensayado.
Ejemplo 2.- DC-SIGN está implicado en la unión de amastigotes a DC.
Para evaluar el papel desarrollado por el receptor DC-SIGN en el proceso de intemalización de las formas amastigotes de Leishmania por DC, se pre-incubaron MDDC humanas inmaduras con un exceso de anticuerpo anti-DC-SIGN (MR-1), inmunoglobulinas humanas, anticuerpo anti-CD18 TS1/18, EGTA o mañano soluble antes de la adición de amastigotes axénicos marcados con CFSE, en la proporción 1:5 DC:parásito, por 2 horas a 37°C. La incubación inicial de MDDC con el anticuerpo MR- 1 reduce el número de parásitos unidos a las células en una forma dosis dependiente, observándose inhibición con diluciones inferiores a 1/40000 del fluido ascítico del hibridoma (figura 3). De este modo, el efecto inhibidor dependiente de la dosis del anticuerpo MR-1 demuestra la especificidad de la interacción entre DC-SIGN - Leishmania. La unión del parásito a las células eucarióticas fue completamente inhibida por EGTA, que es un inhibidor de las interacciones mediadas por lectinas de tipo C, pero no por las inmunoglobulinas humanas, ni por el anticuerpo anti-CD18 TS1/18 (Figura 3). La pre-incubación de MDDC humanas inmaduras con mañano soluble tuvo poca influencia en el proceso de unión del parásito a las células.
Debido a la amplia diversidad de posibles receptores en DC para amastigotes, el papel de DC-SIGN se evaluó mediante la preincubación de MDDC humanas inmaduras con un anticuerpo anti-DC-SIGN o mañano soluble, previamente a la adición de amastigotes axénicos marcados con CFSE (proporción 1:5, 2h, 37°C). El número de amastigotes unidos a DC, determinado microscópicamente, fue 17.7 (± 4.9) y 7.25 (± 2.0) en el control y en las MDDC tratadas con MR-1 respectivamente. En contraste, el mañano tuvo un efecto menor en la reducción del número de amastigotes unidos por DC (Figura 4A), pero en cambio suprimió la unión de MDDC dependiente de DC-SIGN a ICAM-3 inmovilizado (Figura 4B). Estos resultados se complementaron mediante análisis por citometría de flujo (Figura 3).
Para evaluar el significado fisiológico de la interacción DC-SIGN-amastigotes de L. pifanoi, se incubaron MDDC humanas inmaduras con amastigotes axénicos, en la proporción 1:5 DC:parásito, después de la previa incubación con el anticuerpo MR-1, anticueφo TS1/18 o mañano soluble (500μg/ml). Al cabo de 48h, la infección se evaluó mediante el examen de al menos 200 células teñidas con Giemsa. Como se resume en la Tabla I, los amastigotes axénicos de L. pifanoi fueron eficazmente internalizados por MDDC humanas inmaduras en ausencia de anticueφos opsonizantes (anticueφos específicos que recubren el parásito y que tienen un papel primordial entre los mecanismos desarrollados por este para sobrevivir). Se observó que en el control, el 82.5% de DC infectadas presentaba 2.3 parásitos internalizados por célula (Tabla I). Sin embargo, la pre-incubación de MDDC humanas inmaduras con el anticueφo MR-1 reducía significativamente el numero de células infectadas (82.5% vs. 7.4%) (Tabla I). Como se observó en ensayos de unión, la pre-incubación con el anticueφo anti-CD18 no produjo una reducción del porcentaje de células infectadas (91.0%). Una vez más, el mañano soluble solo inhibió parcialmente la internalización del parásito Leishmania por las MDDC.
Tabla L- El anticuerpo MR-1 inhibe la infección de MDDC humanas inmaduras por amastigotes axénicos de L. pifanoi.
% Número de
DC infectadas * parásitos/DC infectada *
Control 82.5 2.3
MR-1 7.4 2.4
TS1/18 91.0 1.1
Mañano soluble 34.0 2.3 * El porcentaje de DCs infectadas y el número de amastigotes internalizados por célula infectada se determinó por microscopía tras el examen (200 células) de preparaciones teñidas con Giemsa. Ejemplo 3.- Los promastigotes y amastigotes de Leishmania infantum y L.pifanoi se unen vía DC- SIGN a las células dendríticas.
La metaciclogénesis es un proceso mediante el cual Leishmania se transforma de la fase procíclica del promastigote, con muy baja infectividad, a la fase metacíclica, muy infectiva . En la Naturaleza, dicho proceso tiene lugar dentro del tubo digestivo del insecto vector. Dicha transformación conlleva un incremento en la capacidad para infectar y sobrevivir dentro del huésped vertebrado, donde el parásito se enfrenta al sistema immune del hospedador .
Para identificar las formas infectivas del parásito reconocidas por DC-SIGN, los inventores analizaron la capacidad de las células dendríticas inmaduras humanas para unir promastigotes metacíclicos y amastigotes tanto de L. pifanoi como de L.infantum. Conforme a los gráficos de la figura 5, ambas especies se unen a células dendríticas(54.1% y 65.0% para los amastigotes de L.pifanoi y L.infaníum respectivamente), independientemente de qué forma infectiva del parásito se ensaye. En todos los casos , la unión del parásito se inhibe drásticamente si las células de mamífero se preincuban con el anticueφo monoclonal MR-1, que bloquea DC-SIGN (64% de reducción para ambas formas infectivas de L. pifanoi y de 55% para las formas de L. infaníum). En las células dendríticas inmaduras humanas, el porcentaje de las mismas con parásitos unidos fue siempre inferior para promastigotes que para amastigotes, lo que sugiere una menor afinidad de unión de la forma flagelada del parásito hacia DC- SIGN . Por consiguiente, DC-SIGN une tanto promastigotes metacíclicos y amastigotes de L. pifanoi (causante de la leishmaniasis cutánea) como de L. infantum (agente de leishmaniasis visceral).
Con el fin de profundizar en el papel de DC-SIGN en la interacción de Leishmania con las células dendríticas, los experimentos fueron repetidos en células K562 DC-SIGN. Como sucedió con las células dendríticas inmaduras humana, el porcentaje de células con promastigotes metacíclicos unidos (58.9% y 34.1% para L. pifanoi y L.infantum respectivamente ) son más bajos que los correspondientes para amastigotes de ambas especies (65.6% y 51.8% para L. pifanoi y L. infantum, respectivamente) (Figura 6). Estos resultados confirman las diferencias en la unión relativa a DC-SIGN para promastigotes y amastigotes. Por otra parte, el efecto bloqueante del mañano, que bloquea DC-SIGN , es mayor sobre promastigotes (reducción de 40.3% para L. pifanoi y 84.8% para L. infantum) que sobre los amastigotes (13.0% y 27.8% de reducción para L. pifanoi y L.infaníum, respectivamente), independientemente de la especie de parásito (Figura 6). En conjunto, estos resultados avalan una diferente avidez de ambas formas infectivas hacia DC-SIGN, que es confirmada mediante los ensayos de desplazamiento, mediante utilización de un exceso de amastigotes sin marcar: La adición de amastigotes de L. pifanoi reduce la unión de promastigotes logarítmicos (30%) y de fase estacionaria (32%), con porcentajes muy similares, pero no desplazan los amastigotes previamente unidos a DC-SIG(6.2% de reducción).
En la siguiente sección de Materiales y Métodos se identifican los reactivos, anticueφos, parásitos y células, así como una descripción detallada de los ensayos utilizados en dichos Ejemplos. MATERIALES Y MÉTODOS Reactivos y anticuerpos. El anticueφo monoclonal específico para DC-SIGN (MR-1) ha sido descrito anteriormente (Relloso, M., Puig-Kroger, A., Muniz Pello, O., Rodriguez-Fernandez, JL., de la Rosa, G., Longo, N., Navarro, J., Muñoz-Fernandez, MA., Sánchez-Mateos, P., Corbi AL. 2002. DC-SIGN (CD209) expression is IL-4 dependent and is negatively regulated by IFN, TGF-β, and anti-inflammatory agents. J Immunol 168: In press). El mañano soluble (de Saccharomyces cerevisiae, Sigma M- 7504) se preparó a 2mg/ml como solución stock en PBS, se filtró esterilemente, y se usó a las concentraciones indicadas. Los GIPLs de amastigotes de Leishmania pifanoi se aislaron mediante sucesivas extracciones de parásitos enteros con solventes orgánicos, según descrito anteriormente (Piedrafita, D., L. Proudfoot, A.V. Nikolaev, D. Xu, W. Sands, G.J. Feng, E. Thomas, J. Brewer, M.A. Ferguson, J. Alexander, and F.Y. Liew. 1999. Regulation of macrophage IL-12 synthesis by Leishmania phosphoglycans. Eur J Immunol 29:235-244), se analizaron por TLC y se guardaron como solución stock estéril a 10 mg/ml en PBS (1% DMSO). ICAM-3/Fc recombinante humana se obtuvo de R&D Systems (cat. 715-IC). Parásitos. Los amastigotes axénicos de Leishmania pifanoi MHOM VE/60Ltrod fueron cultivados a 31°C en medio F29 simplificado suplementado con 20% de suero bovino fetal inactivado por calor (HIFBS) (Pan, A.A. 1984. Leishmania mexicana: serial cultivation of intracellular stages in a cell-free médium. Exp Parasiiol 58:72-80). Los amastigotes axénicos de Leishmania infantum (MCAN/ES/89/TPZ229/1/89 son cultivados conforme a los protocolos descritos a 37°C (Pan, A. A. 1984. Leishmania mexicana: serial cultivation of intracellular stages in a cell-free médium. Exp Parasiiol 58:72; Armson, A., S. W. Kamau, F. Grirnm, J. A. Reynoldson, W. M. Best, L. M. MacDonald, and R. C. Thompson. 1999. A comparison of the effects of a benzimidazole and the dinitroanilines against Leishmania infantum. Acta Trop 73:303). Los promastigotes de L.pifanoi y L.infantum son crecidos a 27°C en medio RPMI 1640 suplementado con 20% de suero fetal bovino inactivado por calor. Los promastigotes de la fase de crecimiento logarítmica y estacionaria se obtienen a los 3 ó 7-8 días de crecimiento de un cultivo con un inoculo inicial de 106 células/ml. Para la localización de los parásitos en los experimentos de unión, se marcaron con el colorante fluorescente CFSE (Molecular Probes), según un procedimiento previamente descrito (Qi, H., N. Popov, and L. Soong. 2001. Leishmania amazonensis-denáήúc cell interactions in vitro and the priming of parasite-specific CD4(+) T cells in vivo. JImmunol 167:4534-4542) Células. Las MDDC inmaduras se prepararon a partir de monocitos de sangre periférica mediante la utilización de IL-4 (1000 U/ml) y GM-CSF (1000 U/ml), según lo ya descrito (Relloso, M., Puig-Kroger, A., Muniz Pello, O., Rodriguez-Fernandez, JL., de la Rosa, G., Longo, Ν., Navarro, J., Muñoz-Fernandez, MA., Sánchez-Mateos, P., Corbi AL. 2002. DC-SIGN (CD209) expression is IL-4 dependent and is negatively regulated by IFN, TGF-β, and anti-inflammatory agents. JImmunol 168: 2634-2643; Sallusto, F., and A. Lanzavecchia. 1994. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med 179:1109- 1118). Las células K562 se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con 10% suero de ternera fetal (FCS), 2 uiM glutamina y 10 μg/ml gentamicina (medio completo). Las células K562 transfectadas con DC-SIGN (K562-CD209) (Relloso, M., Puig-Kroger, A., Muniz Pello, O., Rodriguez-Fernandez, JL., de la Rosa, G., Longo, N., Navarro, J., Muñoz-Fernandez, MA., Sánchez-Mateos, P., Corbi AL. 2002. DC-SIGN (CD209) expression is IL-4 dependent and is negatively regulated by IFN, TGF-β, and anti- inflammatory agents. J Immunol 168: 2634-2643) se crecieron en medio completo suplementado con 300 μg/ml de G418. Ensayos de unión del parásito. Se resuspendieron células MDDC inmaduras, K562 o K562-CD209 en medio completo y se alicuotaron en placas de 24 pocilios (2xl05 células/pocilio). A las células se añadieron parásitos marcados con CFSE, en las proporciones indicadas, y se incubaron a 37°C durante en tiempo reseñado en cada experimento. Posteriormente, las células se fijaron (1% paraformaldehyde en PBS) durante lh a temperatura ambiente, se montaron en Mowiol (Calbiochem, 475904) y se analizaron en un microscopio Nikon Eclipse E800 (Nikon, Melville, NY) equipado para epifluorescencia o mediante citometría de flujo en un EPICS-CS (Coulter Científica, Madrid, Spain). Los porcentajes de células sin o con parásitos unidos se resuelven en dos poblaciones de baja (B) y alta (C) fluorescencia. Para los ensayos de inhibición, las células se lavaron con PBS-lmM EDTA y antes de la adición de parásitos, se preincubaron durante 10 min a temperatura ambiente con el anticueφo MR-1 (sobrenadante de hibridoma diluido 1/1000), anticueφos irrelevantes (100 μg/ml de inmunoglobulinas humanas o sobrenadante del hibridoma anti-CD18 TS1/18, diluido 1/500), EGTA (5 mM), mañano soluble (300 μg/ml) o GJ LS purificados de amastigotes de L. pifanoi amastigotes (5 μg/ml) en medio completo. Para los ensayos de desplazamiento, las células K562 son primeramente incubadas durante 2 minutos con parásitos marcados con CSFE, y a continuación se añade un exceso (4: 1) de amastigotes de L. pifanoi no marcados. Ensayos de adhesión de DC-SIGN. La adhesión de MDDC dependiente de DC-SIGN fue evaluada mediante la utilización de ICAM-3-Fc. Placas EIA II-Linbro de 96 pocilios se recubrieron durante una noche con ICAM-3-Fc a 3 μg/ml en 100 mM NaHCO3 pH 8,8 y a 4° C, y se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 0.4 % en la misma solución durante 2h a 37°C. Las MDDC se marcaron en medio completo con el colorante fluorescente 2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester (BCECF) (Molecular Probes, The Netherlands), y entonces se preincubaron durante 20 min a 37°C en RPMI + 0.4% BSA y con anticuerpos bloqueantes contra CD209 (MR-1), CD18 (TS1/18) o con mañano a 100 μg/ml. Entonces se dejó que las células se adhiriesen a cada pocilio durante 15 min a 37° C. Se eliminaron las células no unidas mediante tres lavados con RPMI atemperado y las células adheridas se cuantificaron en un analizador de fluorescencia. Infección de DC con Leishmania. Se ajustó la concentración de DC a 10 células/pocilio en placas de 24 pocilios y se incubaron con distintas proporciones de parásitos durante lh a 37°C. Para los ensayos de inhibición las células fueron lavadas con PBS-lmM EDTA, previamente a la adición del parásito, y pre-incubadas durante 10 min a temperatura ambiente con el anticueφo MR-1, el anticueφo TS1/18 o mañano soluble en medio completo. Después de eliminar por lavado los parásitos no unidos, las muestras OC-Leishmania se incubaron durante 48h a 34°C. Posteriormente se lavó con PBS, se fijó con metanol y se tino con Giemsa para poder visualizar las DC infectadas con amastigotes. El porcentaje de DC infectadas y la relación de parásitos-DCs se determinó por microscopía tras el examen de al menos 200 células.

Claims

REIVINDICACIONES
1.- Compuesto terapéutico capaz de bloquear la unión de formas infecciosas del parásito Leishmania a células eucarióticas en mamíferos, entre otros, humanos, caracterizado porque permite bloquear o anular la unión del parásito Leishmania al receptor DC- SIGN presente en estas células y la internalización del parásito por las mismas.
2.- Compuesto terapéutico según la reivindicación 1 caracterizado porque las formas infecciosas de Leishmania son amastigotes y promastigotes, entre otras, de las especies de L. amazonensis, L. major, L. pifanoi, L. infantum.
3.- Compuesto terapéutico según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque la célula eucariótica pertenece, entre otras, al siguiente grupo: células dendríticas, macrófagos y células derivadas de monocitos.
4.- Compuesto terapéutico según reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque permite bloquear o anular la unión de las formas infecciosas del parásito Leishmania al receptor DC-SIGN en al menos un 20%, preferentemente en al menos un 85%, ó más preferentemente en un 100%.
5.- Compuesto terapéutico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4 caracterizado porque pertenece, entre otros, al siguiente grupo: a) anticueφo anti DC-SIGN, b) mañano soluble, c) receptor DC-SIGN o el dominio lectina de DC-SIGN, recombinantes, y isoformas y proteínas homologas de los mismos, d) receptor recombinante presente en el parásito Leishmania responsable de la unión con el receptor DC-SIGN, y sus formas homologas.
6.- Compuesto terapéutico según la reivindicación 5 caracterizado porque las formas homologas, independientemente de su origen, presentan una homología de al menos, un 20%, en la zona de reconocimiento del parásito y del receptor DC-SIGN.
7 - Compuesto terapéutico según la reivindicación 5 caracterizado porque el anticueφo anti-DC-SIGN es el anticueφo monoclonal MR-1.
8.- Procedimiento para la identificación y evaluación de compuestos según las reivindicaciones 1 a la 4 caracterizado porque engloba los siguientes pasos: a) adición al medio del compuesto candidato, b) determinación de la actividad bloqueadora del candidato mediante la valoración entre otros, de parámetros celulares: capacidad de unión o invasión in vitro en células K562-CD209 transfectadas con el receptor DC-SIGN, células dendríticas, células derivadas de monocitos (MDDC), u otras células que presentan en su superficie el receptor DC-SIGN, y competición en el proceso de inhibición de la unión con un anticueφo específico anti-DC-SIGN o con mananos, c) identificación de un bloqueador de la unión de la forma infecciosa del parásito Leishmania al receptor DC-SIGN.
9.- Composición farmacéutica caracterizada porque contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto terapéutico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7, junto con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
10.- Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 9 para el tratamiento de infecciones provocadas por el parásito Leishmania en mamíferos, preferentemente en humanos.
11.- Uso del receptor DC-SIGN como diana para el diseño de compuestos terapéuticos según las reivindicaciones 1 a la 7.
PCT/ES2003/000306 2002-06-21 2003-06-20 Compuesto terapéutico frente a la infección por leishmania y su uso Ceased WO2004000352A1 (es)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2003242790A AU2003242790A1 (en) 2002-06-21 2003-06-20 Therapeutic compound against leishmania infection and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP200201436 2002-06-21
ES200201436A ES2197826B1 (es) 2002-06-21 2002-06-21 Compuesto terapeutico frente a la infeccion por leishmania y su uso.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004000352A1 true WO2004000352A1 (es) 2003-12-31

Family

ID=29797395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2003/000306 Ceased WO2004000352A1 (es) 2002-06-21 2003-06-20 Compuesto terapéutico frente a la infección por leishmania y su uso

Country Status (3)

Country Link
AU (1) AU2003242790A1 (es)
ES (1) ES2197826B1 (es)
WO (1) WO2004000352A1 (es)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004026326A3 (en) * 2002-09-20 2004-05-21 Stichting Katholieke Univ Antigen uptake receptor for candida albicans on dendritic cells
CN114072167A (zh) * 2019-05-10 2022-02-18 耶迪特普大学 寄生虫和从寄生虫获得的细胞外囊泡在癌症治疗中的用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000063251A1 (en) * 1999-04-19 2000-10-26 Katholieke Universiteit Nijmegen Composition and method for modulating dendritic cell-t cell interaction
US6391567B1 (en) * 2000-03-02 2002-05-21 New York University Identifying compounds inhibiting DC-sign facilitation of HIV into cells

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000063251A1 (en) * 1999-04-19 2000-10-26 Katholieke Universiteit Nijmegen Composition and method for modulating dendritic cell-t cell interaction
US6391567B1 (en) * 2000-03-02 2002-05-21 New York University Identifying compounds inhibiting DC-sign facilitation of HIV into cells

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COLMENARES M. ET AL.: "Dendritic cell (DC)-specific intercellular adhesion molecule 3 (ICAM-3) grabbing nonintegrin (DC-SIGN, CD 209), a C-type surface lectin in human DCs, is a receptor for Leihsmania amastigotes" *
RELLOSO M. ET AL.: "DC-SIGN (CD 209) expression is IL-4 dependent and is negatively regulated by IFN, TGF-beta and anti-inflammatory agents", THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 168, March 2002 (2002-03-01), pages 2634 - 2643 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004026326A3 (en) * 2002-09-20 2004-05-21 Stichting Katholieke Univ Antigen uptake receptor for candida albicans on dendritic cells
CN114072167A (zh) * 2019-05-10 2022-02-18 耶迪特普大学 寄生虫和从寄生虫获得的细胞外囊泡在癌症治疗中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
AU2003242790A1 (en) 2004-01-06
ES2197826A1 (es) 2004-01-01
ES2197826B1 (es) 2005-04-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Geijtenbeek et al. DC-SIGN, a C-type lectin on dendritic cells that unveils many aspects of dendritic cell biology
Sattin et al. Inhibition of DC-SIGN-mediated HIV infection by a linear trimannoside mimic in a tetravalent presentation
Geijtenbeek et al. Pathogens target DC‐SIGN to influence their fate DC‐SIGN functions as a pathogen receptor with broad specificity
Berzi et al. A glycomimetic compound inhibits DC-SIGN-mediated HIV infection in cellular and cervical explant models
Koppel et al. Identification of the mycobacterial carbohydrate structure that binds the C-type lectins DC-SIGN, L-SIGN and SIGNR1
St-Pierre et al. Host-soluble galectin-1 promotes HIV-1 replication through a direct interaction with glycans of viral gp120 and host CD4
Shimizu et al. Intraperitoneal immunization with oligomannose‐coated liposome‐entrapped soluble leishmanial antigen induces antigen‐specific T‐helper type immune response in BALB/c mice through uptake by peritoneal macrophages
Garcia-Vallejo et al. Glycodendrimers prevent HIV transmission via DC-SIGN on dendritic cells
IE860075L (en) Antiviral agents
CA2663633A1 (en) Synthetic polyvalent carbohydrates as components of microbicides
KR20170141830A (ko) 인플루엔자를 치료하기 위한 화합물 및 방법
Sawettanai et al. Synthetic lipomannan glycan microarray reveals the importance of α (1, 2) mannose branching in DC-SIGN binding
Lozano et al. Targeting HIV entry through interaction with envelope glycoprotein 120 (gp120): synthesis and antiviral evaluation of 1, 3, 5-triazines with aromatic amino acids
Campo et al. Antibodies against mucin‐based glycopeptides affect Trypanosoma cruzi cell invasion and tumor cell viability
WO2012156750A1 (en) Hiv vaccine
Bastos et al. A new heparan sulfate from the mollusk Nodipecten nodosus inhibits merozoite invasion and disrupts rosetting and cytoadherence of Plasmodium falciparum
CHAKRABORTY et al. Neoglycoproteins as carriers for receptor‐mediated drug targeting in the treatment of experimental visceral leishmaniasis
US20060134100A1 (en) Dc-sign blockers and their use for preventing or treating viral infections
KR100635722B1 (ko) 비뮤신형 합성 화합물-캐리어 콘주게이트 화합물
EP0837867B1 (en) MODIFIED ALPHA-D-Glcp-(1-2)-ALPHA-D-Glcp-(1-3)-ALPHA-D-Glcp-ANALOGUES
CZ238796A3 (en) Pharmacological preparation containing oligosaccharide and the use of such oligosaccharide
Gurale et al. Toward the development of the next generation of a rapid diagnostic test: synthesis of glycophosphatidylinositol (GPI) analogues of Plasmodium falciparum and immunological characterization
Travassos et al. Synthesis and immunological activity of a branched peptide construction carrying the T cell epitope of Paracoccidioides brasiliensis major exocellular antigen, the gp43
SALIM DEPARTMENT OF ENGINEERING SCIENCE GRADUATE SCHOOL OF ENGINEERING GIFU UNIVERSITY JAPAN
Toledo et al. Monoclonal antibody specific to glucosylceramide found in pathogenic fungi

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP