WO2003096008A1 - Analyseur chimique et appareil de diagnostic genique - Google Patents

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WO2003096008A1
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holding
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reagent
liquid
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Yoshihiro Nagaoka
Naruo Watanabe
Kei Takenaka
Tomoki Ohashi
Yuji Miyahara
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Hitachi High-Technologies Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to a chemical analyzer that extracts a specific chemical substance such as a nucleic acid from a biological sample such as blood or urine, and mixes the extracted chemical substance such as a nucleic acid with a reagent for detection to analyze. Also, the present invention relates to a genetic diagnostic device having the chemical analyzer.
  • This device has reagents such as a lysis solution, washing solution, and eluent, and capture components for capturing nucleic acids inside the integrated force cartridge. After the sample containing nucleic acids is injected into the force cartridge, Mixing the sample and eluent, passing through the capture component, further passing a wash solution through the capture component, passing eluent through the capture component, and eluting after passing through the capture component. The solution is brought into contact with the PCR reagent and flows to the reaction chamber.
  • reagents such as a lysis solution, washing solution, and eluent
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-501321 describes a method for purifying and separating a nucleic acid mixture by chromatography.
  • a nucleic acid mixture is adsorbed onto an inorganic substrate such as silica gel from an aqueous adsorption solution containing a high concentration of salt, washed with a washing solution, and the nucleic acid is eluted with a solution containing a low concentration of salt.
  • Silica gel is fixed in a hollow cylindrical column, and the solution of the nucleic acid mixture to be separated is poured, and the solution is passed through the inorganic substrate by suction or centrifugation.
  • WO 00/78445 discloses a microstructure and a method for inspection using amplification.
  • DNA mixing is performed using the method for purifying and separating a nucleic acid mixture described in JP-A-8-501321.
  • a glass filter as an inorganic substrate, only the DNA is recovered by passing through a washing solution and an eluent.
  • the glass filter is provided on a rotatable structure, and reagents such as washing solution and eluent are held in each reagent reservoir in the same structure.
  • Each reagent flows by the centrifugal force generated by the rotation of the structure, and the reagent passes through the glass filter by opening a valve provided in a fine flow path connecting each reagent reservoir and the glass filter.
  • Japanese Patent Publication No. 2001-520273 discloses an apparatus and a method for chemical analysis.
  • chambers, channels, reservoirs, and analysis cells are provided inside the disk-shaped member, blood samples are injected into the centrifugal chamber, blood cells and serum are centrifuged, and serum is coated on the surface with reagents. Only the serum is flowed into the reaction chamber having the beads, the solution for washing is then flowed into the reaction chamber, the elution solution is further flowed into the reaction chamber, and the elution solution is moved from the reaction chamber to the analysis cell. . Disclosure of the invention
  • each reagent chamber and capture components are separated.
  • the reagent passes through the capture component by opening a valve or the like provided in the connecting microchannel.
  • the washing liquid is switched to a waste liquid chamber, and the eluent is switched to a reaction chamber by a valve or the like provided in a flow path between the capturing components and each chamber.
  • Contamination may occur at the junction.
  • the cleaning solution and the eluent that have passed through the capturing component are switched by a valve or the like to flow into separate chambers, the upstream flow path of a valve or the like that switches the cleaning solution that has flown to the waste chamber to the reaction chamber first.
  • Eluent may be contaminated with washing solution.
  • nucleic acid mixture is poured into a cylindrical hollow column on which silica gel is fixed, and the nucleic acid mixture is passed through silica gel using centrifugal force and then through multiple reagents to collect only nucleic acid. It does not disclose a method for injecting each reagent into a hollow column or a method for collecting a washing solution and an eluate passed through silica gel.
  • each reagent is subjected to the action of centrifugal force by opening a valve provided in a fine flow path connecting each reagent reservoir and the glass filter. It flows and passes through the glass fill.
  • the valve uses wax that melts when heated, but the reagent that has passed may remain in the valve and contaminate the collected DNA.
  • the DNA mixture and the cleaning solution remaining in the valve flow into the valve in the process of passing the eluent through the glass filter by centrifugal force while the DNA mixture and the cleaning solution remain in the valve.
  • the disk-shaped member is rotated (revolved) about the central axis outside the disk-shaped member during serum separation.
  • the serum is introduced into the reaction chamber, the serum is rotated (rotated) about the central axis in the disk-shaped member. Therefore, a revolving mechanism and a rotating mechanism are required, and the apparatus is complicated.
  • the biston is driven in a cylinder provided inside the disk-shaped member, and the apparatus is complicated.
  • the object is to provide an eluent holding section for holding an eluent after a specific chemical substance is eluted from a trapping section, and an eluent discarding section communicating with the eluent holding section for discarding a part of the eluent,
  • This problem can be solved by providing a connecting portion between the eluent holding portion and the eluent discarding portion on the rotation center side with respect to the connecting portion with the eluent discarding portion in the communication channel communicating the eluent holding portion and the eluent discarding portion.
  • the eluent holding section for holding the eluent after passing through the capturing section is provided with an eluent outlet for discharging a part of the eluent and a disposal port for discarding liquids other than the eluent,
  • the problem can be solved by providing the liquid outlet on the inner peripheral side of the waste port.
  • an eluent holding section for holding the eluent after a specific chemical substance has been eluted from the capturing section, a waste liquid disposal channel for discarding liquid other than the eluent from the eluent holding section, and
  • This problem can be solved by providing an eluent waste flow path for partially discarding, and providing a connecting portion between the eluate holding section and the eluate waste flow path on the outer peripheral side of the innermost peripheral part of the waste liquid waste flow path.
  • an eluent holding section that holds the eluent after a specific chemical substance has been eluted from the trapping section, and a detection reagent supply flow path that supplies a reagent for detection to the eluent holding section are provided.
  • This problem can be solved by providing the connection part with the reagent supply flow path on the inner peripheral side of the innermost peripheral part of the waste liquid disposal flow path.
  • a separate holding section is provided for holding the sample solution and the eluent after passing through the capturing section, and after the sample solution has passed through the capturing section, the vent hole of the eluent holding section is opened to allow the eluent to flow into the capturing section.
  • an eluent holding section for holding an eluent after a specific chemical substance is eluted from the capturing section, and a detection reagent container for supplying a detection reagent to the eluent holding section are provided to control the flow of the detection reagent.
  • Eluent flow path for disposing a part of the eluent from the eluent holding part is provided upstream of the detection reagent outlet for supplying the detecting reagent to the eluent holding part.
  • the reagent control section may have an openable vent and an opening mechanism.
  • the reagent control section may be a reagent dispenser.
  • an eluent holding part for holding the eluent after passing through the trapping part and an outflow passage for flowing out the liquid in the eluent holding part are provided, and an outflow passage inlet serving as a connection part between the eluent holding part and the outflow passage is provided.
  • the reagent is provided on the inner peripheral side of the outlet of the outflow channel, which is the other end of the outflow channel, and the reagent that has flowed through the capturing section during rotation of the rotating structure is an outflow channel. The flow can be solved by stopping the rotating structure once and then rotating again, and after stopping again, the eluent is allowed to flow through the trapping section.
  • FIG. 1 is an overall configuration diagram of a gene analyzer according to the present invention.
  • FIG. 2 is a configuration diagram of an analysis disk according to the present invention.
  • FIG. 3 is a configuration diagram of a flow path unit according to the present invention.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram showing a procedure of an analyzing operation according to the present invention.
  • FIG. 5 is an explanatory view showing each analysis operation according to the present invention and the correspondence between each operation and each drawing.
  • FIG. 6 is an explanatory view of the operation of the flow path during the serum separation operation according to the present invention.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram of the operation of the flow path during the serum separation operation according to the present invention.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram of the operation of the flow path during the serum separation operation according to the present invention.
  • FIG. 9 is an explanatory view of the operation of the flow path during the mixing / binding operation of the serum and the lysate according to the present invention.
  • FIG. 10 is an explanatory diagram of the operation of the flow path during the mixing / reaction operation of the serum and the lysis solution according to the present invention.
  • FIG. 11 is an explanatory view of the operation of the flow path section during the joining operation according to the present invention.
  • FIG. 12 is an explanatory view of the operation of the flow path section during the washing operation according to the present invention.
  • FIG. 13 is an explanatory view of the operation of the flow path during the cleaning operation according to the present invention.
  • FIG. 14 is an explanatory diagram of the operation of the flow path during the cleaning operation according to the present invention.
  • FIG. 10 is an explanatory diagram of the operation of the flow path during the mixing / binding operation of the serum and the lysate according to the present invention.
  • FIG. 10 is an explanatory diagram of the operation of the flow path during the mixing /
  • FIG. 15 is an explanatory diagram of the operation of the flow channel unit during the eluent flow operation according to the present invention.
  • FIG. 16 is an explanatory diagram of the operation of the flow path during the elution and the eluent solution quantitative holding operation according to the present invention.
  • FIG. 17 is an explanatory diagram of the operation of the flow path during the amplification operation according to the present invention.
  • FIG. 18A is a sectional view of a reagent inlet and a vent of each reagent container according to the present invention
  • FIG. 18B is a sectional view of a reagent inlet and a vent of each reagent container according to the present invention. is there.
  • FIG. 19 is a circuit diagram of a positioning mechanism according to the present invention.
  • FIG. 19 is a circuit diagram of a positioning mechanism according to the present invention.
  • FIG. 2.0 is an evening timing chart of the positioning operation according to the present invention.
  • FIG. 21 is an overall configuration diagram of another gene analyzer according to the present invention.
  • FIG. 22 shows another procedure of the analysis operation according to the present invention.
  • FIG. 1 is an overall configuration diagram of a gene analyzer according to the present invention.
  • the gene analyzer 1 controls the fluid flow, with a holding disk 12 rotatably supported by a motor 11 and a plurality of fan-shaped analysis disks 2 positioned by protrusions 1 2 1 on the holding disk 12.
  • an optical device 14 for heating and detection that is, an upper optical device 14 and a lower optical device 15, and a positioning sensor 16 described later (FIG. 19).
  • the holding disk 12 has a holding disk optical window 122 for the lower optical device 15.
  • FIG. 2 is a configuration diagram of the analysis disk 2.
  • the analysis disk 2 is configured by joining an upper cover 20 and a flow path 30.
  • the upper cover 20 has a sample inlet 210, a plurality of reagent inlets 220, 230, 240, 250, 260, 270, and a plurality of vents 21. 2, 2 2 2, 2 2 3 and multiple vents with lid 2 2 1, 2 3 1, 2 4 1, 2 5 1, 2 6 1, 2 7 1, 2 7 2, 2 7 3, 2 It has 7 4.
  • the flow path section 30 includes a positioning hole 7 10 and a container and a flow path described later.
  • the analysis disk 2 is positioned by fitting the positioning holes 7 10 into the projections 12 1 of the holding disk 12.
  • FIG. 3 shows a configuration diagram of the flow path section 30.
  • the nucleic acid extracted extract is quantified, and a detection reagent is added thereto for analysis.
  • the road is constructed.
  • FIGS. 4 and 5 show the flow of the extraction and analysis operations
  • FIGS. 6 to 17 show the flow states in the flow path section 30 step by step.
  • the operator passes the reagent from the upper cover 20 of the analysis disk 2 through the reagent inlets 220, 230, 240, 250, 260, 270 to each of the reagent containers 3 2, 0, 3 Dispense 30, 340, 350, 360, 370 and cover. After injecting the reagent into the required number of analysis disks according to the number of analysis, attach the analysis disks to the holding disk 12.
  • the holding disk 12 After injecting 501 whole blood, the holding disk 12 is rotated by the motor 11.
  • the whole blood injected into the sample container 310 flows to the outer peripheral side due to the centrifugal force generated by the rotation of the holding disk 12 and fills the blood cell storage container 311 and the serum measurement container 312.
  • Excess whole blood flows from the overflow thin-tube flow channel 3 13 to the whole blood waste container 3 15 through the overflow thick-tube flow channel 3 14 (FIG. 7).
  • the whole blood discarding container 3 15 has a whole blood discarding ventilation channel 3 18, and the whole cover is located at a position corresponding to the whole blood discarding vent channel 3 18 of the upper cover 20. Since the blood-discharging vent holes 2 1 and 2 are provided, air can freely enter and exit.
  • connection from the overflow capillary channel 3 13 to the overflow capillary channel 3 14 is rapidly expanding and is located at the innermost circumference (radial position 600 1) of the overflow capillary channel 3 13. Therefore, the whole blood is cut off at the connection portion in a state of filling the overflow one capillary channel 3 13. Therefore, since the liquid cannot exist on the inner peripheral side from the radial position 6001, the liquid level of the serum quantitative container 312 also becomes the radial position 6101. In addition, whole blood also flows into the serum capillary tube 316 branched from the serum quantitation container 314, and the innermost circumference of the whole blood is also at the radial position 601 here.
  • the whole blood 501 is separated into blood cells and serum (centrifugation), and the blood cells 502 move to the outer peripheral blood cell storage container 311. (Fig. 8).
  • a flow path structure (return flow paths 32, 32, 33, 34, 3, 52, 3 6) is used to return the reagent flowing from the outer circumference of each reagent vessel to the inner circumference once. 2, 3 7 2)
  • return flow paths 32, 32, 33, 34, 3, 52, 3 6) is used to return the reagent flowing from the outer circumference of each reagent vessel to the inner circumference once. 2, 3 7 2)
  • the analysis disk 2 stops, and a part of the serum 503 in the serum quantification container 3 12 flows into the serum capillary 3 16 by capillary flow due to surface tension, and the mixing section The fluid flows to the mixing section inlet 4 11, which is the connection between 4 10 and the serum capillary 3 16, and fills the serum capillary 3 16.
  • the drilling machine 13 makes holes in the vent holes at the top of each reagent container one by one and rotates the motor 11 to flow each reagent by centrifugal force.
  • the top cover 20 has reagent inlets (240, 250, 260) and vent holes (241, 2) at the top of each reagent container. 5 1, 2 6 1), and the vents are covered.
  • the perforator 13 makes a state in which air enters the reagent container by making a hole in this lid. Further, as shown in FIG. 18B, by placing filters 24, 25, 26, 26 between the vent and the reagent container, contamination of the perforator 13 can be prevented.
  • a lysis solution 521 for dissolving virus membrane proteins in serum is dispensed into the lysis solution container 320. After drilling a hole in the lid of the solution vent 2 2 1 with the drilling machine 13, rotating the motor 11 causes the solution 5 2 1 to dissolve from the solution container 3 20 by the action of centrifugal force. Mixing section 4 1 via return flow path 3 2 2 Flow into 0.
  • the innermost circumference of the serum in the serum determination container 3 12 (at the radial position 600 1 at the end of the serum separation) is closer to the inner circumference than the mixing section entrance 4 1 1 (radial position 6 02), Due to the head difference due to the centrifugal force, the serum in the serum quantification container 3 12 and the serum capillary 3 16 flows from the mixing section entrance 4 1 1 to the mixing section 4
  • the mixing section 410 is composed of a member that mixes the serum and the lysis solution.
  • a member that mixes the serum and the lysis solution For example, porous films or fibers of resin, glass, paper, or the like, or protrusions of silicon or metal manufactured by etching, machining, or the like.
  • the serum and the lysate are mixed in the mixing section 410 and flow into the reaction vessel 420 (FIG. 10).
  • the reaction vessel 420 is provided with a reaction vessel ventilation flow path 43, and a reaction vessel ventilation flow path 43 is provided at a position corresponding to the reaction vessel ventilation flow path 43 of the upper cover 210. Since the pores 222 are provided, air can freely enter and exit. Since the junction 3 17 (radius position 60 3) from the serum quantitative container 3 12 to the serum capillary tube 3 16 is located on the inner circumference side from the mixing section entrance 4 1 1 (radius position 60 2), the siphon effect As a result, all the serum in the serum capillary 3 16 flows out to the mixing section 4 10.
  • the serum in the serum quantification container 312 flows into the serum capillary 316 by centrifugal force, so that the serum level in the serum quantification container 312 reaches the junction 317 (radius position 603).
  • the serum continues to flow into the mixing section 4 10 until it reaches the point, and when the serum level reaches the branching section 3 17, air enters the serum capillary 3 16 and becomes empty and the flow ends. . That is, the serum in the serum quantitative container 3 12 from the radial position 60 1 to the radial position 60 3 at the end of the serum separation, the overflow capillary channel 3 13 and the serum in the serum capillary channel 3 16 are mixed with the serum 4 1 Run off to 0 and mix with lysate.
  • a predetermined volume (required serum amount) is set in the serum quantitative container 3 12, the overflow capillary channel 3 13 and the serum capillary channel 3 16 from the radial position 601 to the radial position 603.
  • the serum used for analysis can be quantified even if the ratio of serum to whole blood differs for each whole blood sample.
  • the whole blood volume is set at 500 microliters. After dispensing an aliquot of mouth, 50 microliters of whole blood overflowed into the whole blood waste container 3 15 and the remaining 450 microliters were separated into serum and blood cells and separated.
  • a device of the present invention can analyze a whole blood sample having a serum amount of 200 microliters or more with respect to 450 microliters of whole blood.
  • the volume of the blood cell storage container may be increased to increase the number of whole blood samples.
  • the mixed serum and the lysate react. After the mixture of the serum and the lysate flows into the reaction vessel 420, the liquid level in the reaction vessel 420 is higher than the innermost periphery (radial position 604) of the reaction solution flow path 421. Since it is on the outer peripheral side, it cannot cross the innermost peripheral part of the reaction liquid flow path, and the liquid mixture is held in the reaction vessel 420 during rotation.
  • the lysing solution functions to dissolve the membrane from the virus or bacteria in the serum to elute the nucleic acid, but further promotes the adsorption of the nucleic acid to the nucleic acid binding member 301, which is the capturing portion in the present invention. Let it.
  • a reagent guanidine hydrochloride may be used for elution and adsorption of DNA, and guanidine thiosocyanate may be used for RNA, and a porous material such as quartz or glass or a fiber filter is used as a nucleic acid binding member. I just need.
  • the motor 11 is stopped.
  • the additional fluid vent 2 3 1 for supplying air to the additional fluid vessel 3 3 0 with the drilling machine 13
  • the additional liquid 5 3 1 flows from the additional liquid container 3 3 0 through the additional liquid return channel 3 3 2 due to the action of centrifugal force.
  • the reaction container 4 2 0 To move the liquid surface of the mixture in the reaction vessel toward the inner circumference (Fig. 11).
  • the liquid surface reaches the innermost periphery (radial position 6 04) of the reaction solution flow path 4 2 1
  • the mixed solution flows out beyond the innermost circumference of the reaction solution flow path, and the combined flow path 4 2 2 , And flows into the nucleic acid binding member 301.
  • the additional solution for example, the above-mentioned dissolving solution may be used.
  • the mixed solution may flow in the reaction solution flow path 421 by capillary action.
  • the additional liquid 5 3 1 is not required.
  • the nucleic acid is adsorbed on the nucleic acid binding member, and the liquid flows into the waste liquid storage container 4330 via the waste liquid flow path 431. Downstream of the eluent flow path 451, there are a plurality of vessels and a flow path, and a hole for supplying air to each vessel is formed in a later step.
  • the waste liquid storage container 4340 communicates with the pressure adjustment container 4440 via the pressure adjustment flow path 432.
  • the pressure regulating container 4440 is provided with a pressure regulating ventilation channel 441, and a pressure regulating ventilation channel 441 of the upper cover 20 is provided at a position corresponding to the innermost peripheral portion. Vent 2
  • the motor 11 is stopped, and a hole is made in the lid of the first cleaning liquid vent hole 241, which is used to supply air to the first cleaning liquid container 340, by the drilling machine 13.
  • the first washing liquid 5 41 is sent from the first washing liquid container 3 40 through the first washing liquid return flow path 3 4 2 by the action of the centrifugal force to the nucleic acid binding member.
  • the substrate 301 flows into the substrate 301 and is cleaned of unnecessary components such as proteins attached to the nucleic acid binding member 301 (FIG. 12).
  • the first washing solution for example, the above-described solution or a solution in which the salt concentration of the solution is reduced may be used.
  • the waste liquid after washing flows into the waste liquid storage container 4330 via the waste liquid flow path 431 as in the above-described mixed liquid.
  • the same cleaning operation is repeated a plurality of times. For example, after the first cleaning liquid, with the motor stopped, a hole is made in the lid of the second cleaning liquid ventilation hole 2 41 for supplying air to the second cleaning liquid container 350 with the drilling machine 13, and the motor 1 Rotate 1 to wash unnecessary components such as salts attached to the nucleic acid binding member 301.
  • the second cleaning liquid for example, ethanol or an aqueous ethanol solution may be used.
  • each washing liquid flows through the waste liquid flow path 431 to the waste liquid storage vessel 430, but a part of the eluent flow path 451, particularly the waste liquid flow path There is a possibility that the vicinity of the branching point with is contaminated.
  • the nucleic acid eluted from the nucleic acid binding member 301 passes through the eluent flow channel 451, it is desirable to wash the eluent flow channel 451 as well.
  • Example 1 of FIGS. 6 to 17 the eluent flow path 451 is washed with two kinds of washing liquids, that is, the first washing liquid 541, and the second washing liquid 551, and the second washing liquid. The case will be described.
  • FIG. 13 shows a state in which all of the first cleaning liquid has passed through the waste liquid flow path 431.
  • the waste liquid overflows from the waste liquid storage container 4330 to the pressure adjustment flow path 4440 via the pressure adjustment flow path 432.
  • a hole is made in the lid of the second cleaning liquid vent hole 2 41 for supplying air to the second cleaning liquid container 350 with the drilling machine 13, and the detection container 450 is communicated with the outside.
  • a hole is made in the lid of the vent hole 272 for the detection vessel to be closed and the vent hole 273 for the final cleaning solution for communicating the final cleaning liquid waste container 460 with the outside.
  • the second washing solution 55 1 flows from the second washing solution container 350 into the nucleic acid binding member 301 through the second washing solution return flow path 35 2 by the action of centrifugal force.
  • the first washing solution attached to the nucleic acid binding member 301 is washed (FIG. 14).
  • the second washing solution that has passed through the nucleic acid binding member 301 tries to flow into both the detection container 450 and the waste storage container 430, but the waste storage container 430 has a pressure adjustment flow path.
  • a head difference (h 2) for pushing air from the pressure adjustment flow path 4 32 into the pressure adjustment vessel 4 40 is required.
  • the second cleaning liquid cannot flow in.
  • the detection container 450 since the detection container 450 is provided with a vent hole by the above-described piercing operation, it flows with almost no resistance. In other words, the second washing solution that has passed through the nucleic acid binding member 301 flows into the detection container 450, which is the eluent holding part of the present invention, via the eluent flow channel 451. At this time, the vicinity of the branch to the waste liquid flow path 431, which is contaminated with the mixed liquid or the first cleaning liquid, is cleaned.
  • the second cleaning liquid flows into the detection container 450, and the liquid level reaches the innermost periphery (radial position 605) of the cleaning liquid waste flow path 452, which is the waste liquid waste flow path referred to in the present invention. Then, it flows out to the final cleaning liquid waste container 460. Since the connection part (radial position 606) of the cleaning liquid waste flow path 452 with the detection container is located on the outer peripheral side from the innermost peripheral part (radial position 605), it flows out to the final cleaning liquid waste container 460 once. Then, all the liquid in the detection container 450 is to be discharged by the siphon effect.
  • the liquid remaining in the detection container 450 is filled with the washing liquid waste flow path 452 by capillary flow, and then rotated again, the detection container 450 is again activated by the siphon effect. Drain the remaining liquid into the final washing liquid waste container 460. Therefore, for the final cleaning liquid, it is desirable to repeat the rotation and stop twice after drilling the ventilation holes.
  • the process proceeds to the nucleic acid elution step.
  • a hole is made in the lid of the eluent vent hole 261 for supplying air to the eluent container 360 with the drilling machine 13, and furthermore, the eluent disposal section referred to in the present invention is used.
  • a hole is made in the lid of the eluent waste vent hole 274 for allowing a certain eluent waste container 470 to communicate with the outside.
  • the motor 11 is again rotated, and the eluent is supplied to the nucleic acid binding member 301 (FIG. 15).
  • a nucleic acid is eluted from the nucleic acid binding member 301, and water or an aqueous solution having a pH adjusted to 7 to 9 may be used.
  • the eluent After passing through the nucleic acid binding member 301, the eluent flows into the detection container 450 through the eluent flow path 451. Since the eluent waste container 470 is in communication with the outside by the above-described perforation operation, the eluent flows out to the eluent waste container 470 through the eluent waste flow channel 471.
  • the connection (radius position 607) of the eluent waste flow path 471 with the detection vessel 450 is located on the inner side of the connection (radius position 608) with the eluent waste container 470.
  • the eluent at the inner periphery from the radial position 600 in the detection container 450 is discharged to the eluent waste container 470 Put out. In this way, the eluate containing the nucleic acid can be measured and held in the detection container 450 (FIG. 16).
  • the detection solution is a reagent for amplifying and detecting nucleic acids, and contains deoxynucleoside triphosphate, DNA synthase, a fluorescent reagent, and the like.
  • the upper optical device 14 may be used to irradiate light from above the detection container 450 to heat it.
  • the lower optical device 15 is moved below the detection container 450 to detect, for example, the amount of fluorescent light emission.
  • the holding disk 12 is provided with a positioning projection 17, the position detector 16 detects the rotation position of the holding disk, and the controller 18 controls the rotation and rotation of the motor 11. It controls the rotation and vertical movement of the drilling machine 13, and the rotation, irradiation, and detection of the upper optical device 14 and the lower optical device 15.
  • FIG. 20 shows the operation timing of the drilling machine 13.
  • the holding disk 12 reduces the rotation speed after the flow of whole blood or each reagent is completed, and maintains the low-speed rotation for positioning.
  • the position detector 16 detects the positioning projection 17
  • the holding disk 12 is stopped, the punch 13 is lowered, a hole is made in the lid of the vent hole of each reagent storage container, and then the plate is raised again.
  • the holding disc 12 after piercing rotates at such a low speed that the reagent does not flow out of the reagent storage container after piercing, and then rotates to the next analysis disc position, that is, 60 degrees when six analysis discs are mounted. And stop, and repeat the same drilling operation.
  • the analysis disk is mounted may be determined by, for example, irradiating light from the flow path optical window 490 with the lower optical device and examining the reflected light. After all analysis discs have been pierced, the holding disc rotates at high speed to allow the reagents to flow.
  • a valve for controlling the flow of the sample and each reagent It is not necessary to provide a liquid in the middle of the flow path, no liquid remains in the valve section in the middle of the flow path, contamination by reagents in the previous process can be prevented, and specific components such as nucleic acids in the liquid sample have high purity. And can be analyzed with high accuracy.
  • the flow of the reagent is controlled by opening the air hole with the perforator, but a reagent dispensing mechanism may be used. That is, as shown in FIG. 21, after a predetermined reagent is dispensed from each reagent bottle 400 into the reagent storage container shown in FIG. 3 by the reagent dispenser 19, the analysis disk is rotated to flow the reagent. .
  • the procedure is shown in Figure 22.
  • the present embodiment it is not necessary to provide a valve for controlling the flow of the sample and each reagent in the middle of the flow path, and no liquid remains in the valve section in the middle of the flow path, and the flow rate in the previous process is reduced. Prevents contamination by reagents, allows extraction of specific components such as nucleic acids in liquid samples with high purity, and enables highly accurate analysis.
  • the present invention there is no need to provide a valve for controlling the flow of the sample and each reagent in the middle of the flow path, and no liquid remains in the valve section in the middle of the flow path. Contamination can be prevented, and specific components such as nucleic acids in liquid samples can be extracted with high purity and analyzed with high precision. Thereby, gene diagnosis can be performed with high accuracy and high efficiency.

Description

明 細 書
化学分析装置及び遺伝子診断装置 技術分野
本発明は、 血液や尿等の生体試料から核酸等の特定の化学物質を抽出 し、 抽出した核酸等の化学物質に検出のための試薬を混合して分析する 化学分析装置に関する。 また、 該化学分析装置を有する遺伝子診断装置 に関する。 背景技術
複数の化学物質を含む試料から核酸等の特定の化学物質を抽出し分析 する化学分析装置としては、 特表 2 0 0 1 - 5 2 7 2 2 0号公報に、 一 体型流体操作カートリ ッジが記載されている。 この装置では、 一体型力 一トリッジ内部に溶解液や洗浄液や溶離液等の試薬、 及び核酸を捕獲す る捕獲構成部品を備え、 核酸を含む試料を力一卜リ ッジ内部に注入した 後、 前記試料と溶離液を混合させて前記捕獲構成部品に通過させ、 さら に捕獲構成部品に洗浄液を通過させ、 さらに捕獲構成部品に溶離液を通 過させ、 捕獲構成部品を通過した後の溶離液を P C R試薬に接触させ反 応チヤンバへと流している。
上記第一の従来技術で利用している核酸抽出方法としては、 特表平 8 - 5 0 1 3 2 1号公報に、 クロマトグラフィ一による核酸混合物の精製 分離法が記載されている。 この方法では、 核酸混合液を高濃度の塩を含 む吸着水溶液からシリカゲル等の無機基体上に吸着させた後、 洗浄液で 洗浄し、 低濃度の塩を含む溶液で核酸を溶出している。 シリカゲルは円 筒状の中空カラム内に固定されており、 分離すべき核酸混合物の溶液を 注ぎ、 吸引または遠心分離で溶液を無機基体に通している。
また、 W O 0 0 / 7 8 4 5 5号公報に、 増幅を用いた検査のための微 小構造体及び方法が記載されている。 この装置では、 前記特表平 8— 5 0 1 3 2 1号公報記載の核酸混合物の精製分離法を用いて、 D N A混合 液を無機基体としてのガラスフィル夕に通過させた後、 洗浄液及び溶離 液を通過させて D N Aのみを回収している。 ガラスフィル夕は回転可能 な構造体に設けてあり、 洗浄液や溶離液等の試薬は同じ構造体内の各試 薬リザーバに保持してある。 各試薬は構造体が回転することにより発生 する遠心力で流動し、 各試薬リザーバとガラスフィル夕を結ぶ微細流路 に設けたバルブを開く ことにより試薬がガラスフィル夕を通過する。 また、 特表 2 0 0 1— 5 0 2 7 9 3号公報に、 化学分析用の装置及び 方法が記載されている。 この装置では、 ディスク形状部材内部にチャン バ、 流路、 リザーバ、 分析用セルを設け、 遠心チャンバ内に血液サンプ ルを注入後血球と血清を遠心分離し、 血清を試薬が表面にコーティ ング されたビーズを有する反応チャンバに血清のみを流し、 その後洗浄のた めの溶液を反応チャンバに流し、 さらに溶出溶液を反応チャンバに流し て、 前記溶出溶液を反応チヤンバから分析用セルに移動させている。 発明の開示
第一の従来技術である特表 2 0 0 1 — 5 2 7 2 2 0号公報記載の一体 型流体操作カートリッジでは、 各試薬をポンプで送液する際、 各試薬チ ャンバと捕獲構成部品を結ぶ微細流路に設けたバルブ等を開く ことで試 薬が捕獲構成部品を通過する。 さらに捕獲構成部品を通過した試薬のう ち洗浄液は廃液チャンバへ、 溶離液は反応チヤンバへと流れるように捕 獲構成部品と各チャンバとの間の流路に設けたバルブ等で切り替えてい る。 ポンプで複数の試薬を送液する場合流路壁に試薬が残り、 特にバル ブ等の障害物があると液が残りやすく、 一旦液が残ると流動することが ないため、 別の試薬との合流部で汚染する可能性がある。 また、 捕獲構 成部品を通過した洗浄液と溶離液とをバルブ等で切り替えて別々のチヤ ンバに流動させる場合、 先に廃液チヤンバへと流動した洗浄液が反応チ ャンバへ切り替えるバルブ等の上流流路を汚染するため、 溶離液に洗浄 液が混入する恐れがある。
第二の従来技術である特表平 8 - 5 0 1 3 2 1号公報記載の精製分離 法では、 シリカゲルを固定した円筒状の中空カラムに核酸混合液を注ぎ 遠心力を利用してシリカゲルに核酸混合液を通過させた後複数の試薬を 通過させることで核酸のみを回収しているが、 中空カラムへの各試薬の 注入方法及びシリカゲルを通過した洗浄液と溶離液の回収方法について は開示されていない。
第三の従来技術である W O 0 0 / 7 8 4 5 5号公報記載の構造体では 各試薬リザーバとガラスフィルタを結ぶ微細流路に設けたバルブを開く ことで各試薬は遠心力の作用で流動しガラスフィル夕を通過する。 バル ブには加熱することで溶けるワックス等を使用しているが、 通過した試 薬がバルブ部に残り回収した D N Aを汚染する可能性がある。 すなわち D N A混合液や洗浄液がバルブ部に残り、 遠心力で溶離液をガラスフィ ル夕に通過させている工程で、 バルブ部に残った D N A混合液や洗浄液 が流れ込む可能性がある。
第四の従来技術である特表 2 0 0 1— 5 0 2 7 9 3号公報記載の装置 では、 血清分離の際にはディスク形状部材をディスク形状部材外部の中 心軸に関して回転 （公転） させ、 血清を反応チャンバに導く際にはディ スク形状部材内の中心軸に関して回転 （自転） させるため、 公転と自転 それぞれの回転機構が必要となり、 装置が複雑である。 さらに洗浄液及 び溶出溶液を反応チャンバに導く際には、 ディスク形状部材内部に設け たシリンダ内でビス トンを駆動する構造にしており、 装置が複雑である, 本発明の目的は、 上記課題のうち少なく ともいずれか一つを解決する ことにより、 液体試料中の特定の化学物質を高精度に分析する安価な化 学分析装置を提供することにある。 また、 これら化学分析装置を有する 遺伝子診断装置を提供することにある。
上記課題は、 特定の化学物質を捕捉部から溶離した後の溶離液を保持 する溶離液保持部と溶離液保持部に連通して溶離液の一部を廃棄する溶 離液廃棄部を設け、 前記溶離液保持部と溶離液廃棄部を連通する連通流 路において、 溶離液保持部との接続部を溶離液廃棄部との接続部より回 転中心側に設けることにより解決できる。 或いは捕捉部を通過後の溶離液を保持する溶離液保持部に、 溶離液の 一部を流出させるための溶離液流出口と溶離液以外の液を廃棄するため の廃棄口を設け、 前記溶離液流出口を廃棄口より内周側に設けることに より解決できる。
或いは特定の化学物質を捕捉部から溶離した後の溶離液を保持する溶 離液保持部と溶離液保持部から溶離液以外の液を廃棄する廃液廃棄流路 と溶離液保持部から溶離液の一部を廃棄する溶離液廃棄流路を設け、 溶 離液保持部と溶離液廃棄流路との接続部を廃液廃棄流路の最内周部より 外周側に設けることにより解決できる。
或いは特定の化学物質を捕捉部から溶離した後の溶離液を保持する溶 離液保持部と溶離液保持部に検出用の試薬を供給する検出試薬供給流路 を設け、 溶離液保持部と検出試薬供給流路との接続部を廃液廃棄流路の 最内周部より内周側に設けることにより解決できる。
或いは捕捉部を通過後の試料液と溶離液とを保持する保持部を別々に 設け、 試料液が捕捉部を通過後に溶離液保持部の通気孔を開けて、 溶離 液を捕捉部に流過させることにより解決できる。
或いは特定の化学物質を捕捉部から溶離した後の溶離液を保持する溶 離液保持部と、 溶離液保持部に検出用の試薬を供給する検出試薬容器を 設け、 検出試薬の流動を制御するための検出試薬制御部を、 検出試薬を 溶離液保持部に供給するための検出試薬流出口よりも上流側に設け、 溶 離液保持部から溶離液の一部を廃棄する溶離液廃棄流路を設け、 溶離液 の一部を溶離液廃棄流路から廃棄した後に検出試薬を溶離液保持部内に 流動させることにより解決できる。
特に試薬制御部を開放可能な通気孔と開孔機構にすればよい。
或いは特に試薬制御部を試薬分注器にすればよい。
或いは捕捉部を通過後の溶離液を保持する溶離液保持部と溶離液保持 部の液を流出する流出流路を設け、 溶離液保持部と流出流路の接続部で ある流出流路入り口を流出流路のもう一端である流出流路出口より内周 側に設け、 回転構造体の回転中に前記捕捉部を流過した試薬が流出流路 を流動後、 回転構造体が一度停止後再度回転し、 さらに再度停止した後 溶離液を前記捕捉部を流過させることにより解決できる。
更に、 上記化学分析装置を有する遺伝子診断装置により、 上記課題は 解決される。 図面の簡単な説明
第 1 図は、 本発明による遺伝子分析装置の全体構成図である。 第 2図 は、 本発明による分析ディスクの構成図である。 第 3図は、 本発明によ る流路部の構成図である。 第 4図は、 本発明による分析動作の手順を示 す説明図である。 第 5図は、 本発明による分析の各操作及び該各操作と 各図面との対応を示す説明図である。 第 6図は、 本発明による血清分離 操作時の流路部の動作説明図である。 第 7図は、 本発明による血清分離 操作時の流路部の動作説明図である。 第 8図は、 本発明による血清分離 操作時の流路部の動作説明図である。 第 9図は、 本発明による血清と溶 解液の混合 · 結合操作時の流路部の動作説明図である。 第 1 0図は、 本 発明による血清と溶解液の混合 · 反応操作時の流路部の動作説明図であ る。 第 1 1図は、 本発明による結合操作時の流路部の動作説明図である 第 1 2図は、 本発明による洗浄操作時の流路部の動作説明図である。 第 1 3図は、 本発明による洗浄操作時の流路部の動作説明図である。 第 1 4図は、 本発明による洗浄操作時の流路部の動作説明図である。 第 1 5 図は、 本発明による溶離液流動操作時の流路部の動作説明図である。 第 1 6図は、 本発明による溶離及び溶離液定量保持操作時の流路部の動作 説明図である。 第 1 7図は、 本発明による増幅操作時の流路部の動作説 明図である。 第 1 8図 Aは、 本発明による各試薬容器の試薬注入口及び 通気孔の断面図であり、 第 1 8図 Bは、 本発明による各試薬容器の試薬 注入口及び通気孔の断面図である。 第 1 9図は、 本発明による位置決め 機構の回路図である。 第 2 .0図は、 本発明による位置決め動作の夕イミ ングチャートである。 第 2 1図は、 本発明による他の遺伝子分析装置の 全体構成図である。 第 2 2図は、 本発明による分析動作の他の手順を示 す説明図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施例を説明する.
(実施例 1 )
図 1〜図 1 7を参照して、 本発明による化学分析装置の一実施例を説 明する。
図 1 は本発明による遺伝子分析装置の全体構成図である。 遺伝子分析 装置 1 は、 モータ 1 1 により回転可能に支持された保持ディスク 1 2 と 保持ディスク 1 2上の突起 1 2 1 により位置決めされた複数の扇形の分 析ディスク 2 と、 液体の流動を制御するための穿孔機 1 3 と、 加温及び 検出のための 2台の光学装置即ち上部光学装置 1 4及び下部光学装置 1 5、 後述 （図 1 9 ) する位置決めセンサ 1 6を備えている。 保持ディス ク 1 2は、 下部光学装置 1 5用の保持ディスク光学窓 1 2 2を備えてい る。
図 2は分析ディスク 2の構成図である。 分析ディスク 2は上カバー 2 0と流路部 3 0を接合して構成している。 上カバ一 2 0は、 試料注入口 2 1 0、 複数の試薬注入口 2 2 0、 2 3 0、 2 4 0、 2 5 0、 2 6 0、 2 7 0、 及び複数の通気孔 2 1 2 , 2 2 2 , 2 2 3、 および複数の蓋付 通気孔 2 2 1、 2 3 1、 2 4 1、 2 5 1、 2 6 1、 2 7 1、 2 7 2、 2 7 3、 2 7 4を備えている。 流路部 3 0は、 位置決め孔 7 1 0および後 述の容器および流路等を備えている。 分析ディスク 2は、 保持ディスク 1 2の突起 1 2 1 に対して位置決め孔 7 1 0が嵌め合うことで位置決め される。
流路部 3 0の構成図を図 3に示す。 図 3に示す流路部の実施例は、 全 血から血清を分離後、 血清中のウィルスに含まれる核酸を抽出し、 核酸 を抽出した抽出液を定量後検出試薬を添加して分析する流路を構成して いる。
以下全血を試料として用いた場合のウィルス核酸の抽出及び分析動作 を説明する。 抽出及び分析動作の流れを図 4及び図 5に示し、 流路部 3 0内での流動状態を図 6〜 1 7に段階を追って示す。
操作者は分析ディスク 2の上カバー 2 0より各試薬注入口 2 2 0、 2 3 0、 2 4 0 、 2 5 0、 2 6 0、 2 7 0を通して試薬を各試薬容器 3 2 0、 3 3 0、 3 4 0、 3 5 0、 3 6 0、 3 7 0に分注し、 蓋をする。 分 析数に応じて必要な数の分析ディスクに試薬を注入後、 保持ディスク 1 2に分析ディスクを装着する。
次に真空採血管等で採血した全血を試料注入口 2 1 0より試料容器 3 1 0に注入する （図 6 ) 。
全血 5 0 1 を注入後、 モータ 1 1で保持ディスク 1 2を回転する。 試 料容器 3 1 0に注入された全血は、 保持ディスク 1 2の回転により発生 する遠心力の作用で外周側に流動し、 血球貯蔵容器 3 1 1および血清定 量容器 3 1 2を満たし、 余分な全血はオーバーフロー細管流路 3 1 3か らオーバーフロー太管流路 3 1 4を通って全血廃棄容器 3 1 5へ流れる (図 7 ) 。 全血廃棄容器 3 1 5には全血廃棄用通気流路 3 1 8が設けて あり、 さらに上カバー 2 0の全血廃棄用通気流路 3 1 8最内周部に対応 する位置に全血廃棄用通気孔 2 1 2を設けているため、 空気が自由に出 入り可能である。 オーバーフロー細管流路 3 1 3からオーバーフロー太 管流路 3 1 4にかけての接続部は急拡大しておりかつオーバ一フロー細 管流路 3 1 3の最内周側 （半径位置 6 0 1 ) にあるため、 全血はオーバ 一フロー細管流路 3 1 3を満たした状態で前記接続部で切れる。 したが つて半径位置 6 0 1より内周側に液は存在できないので、 血清定量容器 3 1 2の液面も半径位置 6 0 1 になる。 また、 血清定量容器 3 1 2から 分岐している血清毛細管 3 1 6にも全血が流れ込み、 ここでも全血の最 内周部は半径位置 6 0 1 になる。
さらに回転を続けると全血 5 0 1 は血球と血清に分離し（遠心分離）、 血球 5 0 2は外周側の血球貯蔵容器 3 1 1へ移動し、 血清定量容器内は 血清 5 0 3だけになる （図 8 ) 。
上記一連の血清分離動作時に、 上カバー 2 0にある各試薬容器の通気 孔 2 2 1、 2 3 1、 2 4 1、 2 5 1、 2 6 1、 2 7 1は蓋をしていて空 気が入らない状態になっている。 遠心力により各試薬は試薬容器外周側 より流出しょうとするが、 容器内に空気が入らないため試薬容器内の圧 力が低下し、 遠心力と釣り合って試薬は流出することができない。 しか し回転数が増加し遠心力が大きくなると、 試薬容器内の圧力は徐々に低 下し、 試薬の飽和蒸気圧以下になると気泡が発生する。 そこで、 図 6に 示すように、 各試薬容器外周側から流出する試薬を一旦内周側に戻すよ うな流路構造 （戻り流路 3 2 2、 3 3 2、 34 2、 3 52、 3 6 2、 3 7 2 ) とすることで、 試薬容器内の圧力低下を抑制し、 気泡の発生を防 ぐ。 このように血清分離動作時には、 各試薬は試薬容器に保持されたま ま流動しない。
所定の時間回転させ血清分離動作が終了すると分析ディスク 2は停止 し、 血清定量容器 3 1 2内の血清 5 0 3の一部が血清毛細管 3 1 6内部 に表面張力により毛細管流動し、 混合部 4 1 0と血清毛細管 3 1 6との 接続部である混合部入り口 4 1 1まで流動し、 血清毛細管 3 1 6を満た す。
以下穿孔機 1 3が各試薬容器上部の通気孔の蓋にひとつづつ穴をあけ てはモー夕 1 1を回転し、 各試薬を遠心力で流動させる。 図 1 8 Aの分 析ディスク断面に示すように、 上カバー 2 0には各試薬容器上部に試薬 注入口 （ 2 4 0、 2 5 0、 2 6 0 ) および通気孔 （ 2 4 1、 2 5 1、 2 6 1 ) があり、 通気孔には蓋がしてある。 穿孔機 1 3はこの蓋に穴を開 けることで試薬容器内に空気が入る状態にする。 さらに図 1 8 Bに示す ように、 フィル夕 2 4 2、 2 5 2、 2 6 2を通気孔と試薬容器の間に設 けることで、 穿孔機 1 3の汚染を防止できる。
以下に血清分離終了後の動作を示す。
溶解液容器 3 2 0には血清中のウィルスの膜蛋白を溶解するための溶 解液 5 2 1が分注してある。 穿孔機 1 3が溶解液通気孔 2 2 1の蓋に穴 をあけた後、 モー夕 1 1 を回転させると、 遠心力の作用により溶解液 5 2 1は溶解液容器 3 2 0より溶解液戻り流路 3 2 2を経て、 混合部 4 1 0に流れ込む。 また、 血清定量容器 3 1 2内の血清の最内周側 （血清分 離終了時には半径位置 6 0 1 ) が混合部入り口 4 1 1 (半径位置 6 0 2 ) より内周側にあるため、 遠心力によるヘッ ド差で血清定量容器 3 1 2 および血清毛細管 3 1 6内の血清は、 混合部入り 口 4 1 1から混合部 4
1 0に流れ込む （図 9 ) 。 混合部 4 1 0は血清と溶解液を混合する部材 で構成してある。 例えば樹脂やガラス、 紙等の多孔性フィル夕や繊維、 或いはエッチングや機械加工等で製作したシリコンゃ金属等の突起物な どである。
血清と溶解液は混合部 4 1 0で混合し反応容器 4 2 0へ流れ込む （図 1 0 ) 。 反応容器 4 2 0には反応容器用通気流路 4 2 3が設けてあり、 さらに上カバー 2 0の反応容器用通気流路 4 2 3最内周部に対応する位 置に反応容器用通気孔 2 2 2を設けているため、 空気が自由に出入り可 能である。 血清定量容器 3 1 2から血清毛細管 3 1 6への分岐部 3 1 7 (半径位置 6 0 3 ) は混合部入り口 4 1 1 (半径位置 6 0 2 ) より内周 側にあるため、 サイホン効果により血清毛細管 3 1 6内の血清はすべて 混合部 4 1 0に流れ出る。 一方血清定量容器 3 1 2の血清は遠心力で血 清毛細管 3 1 6に流れ込むから、 血清定量容器 3 1 2内での血清の液面 が分岐部 3 1 7 (半径位置 6 0 3 ) に到達するまで血清は混合部 4 1 0 に流出し続け、 血清の液面が分岐部 3 1 7に到達した時点で、 血清毛細 管 3 1 6に空気が混入し空になって流動は終了する。 すなわち血清分離 終了時点での半径位置 6 0 1から半径位置 6 0 3までの血清定量容器 3 1 2、 オーバーフロー細管流路 3 1 3および血清毛細管流路 3 1 6内の 血清が混合部 4 1 0に流出し、 溶解液と混合する。
このように、 半径位置 6 0 1から半径位置 6 0 3までの血清定量容器 3 1 2、 オーバーフロー細管流路 3 1 3および血清毛細管流路 3 1 6を 所定の容積 （必要血清量） になるよう設計すれば、 全血に対する血清の 比率が全血試料ごとに異なっても、 分析に使用する血清を定量すること ができる。 例えば、 血球貯蔵容器の容積を 2 5 0マイクロリ ッ トルとし、 必要血清量を 2 0 0マイクロリ ツ トルに設計したとき、 全血を 5 0 0マ イク口リ ツ トル分注すれば、 全血廃棄容器 3 1 5へ 5 0マイクロリ ッ ト ルの全血がオーバーフローし、 残りの 4 5 0マイクロリツ トルが血清と 血球に分離し、 分離した血清のうち 2 0 0マイクロリ ッ トルが混合部 4 1 0へ流出する。 すなわち 4 5 0マイクロリッ トルの全血に対して、 血 清の量が 2 0 0マイクロリツ トル以上の全血試料については本発明のデ バイスで分析が可能になる。 血清の比率が小さい全血に対しては、 血球 貯蔵容器の容積を大きく し全血試料を多くすればよい。
反応容器 4 2 0では混合した血清と溶解液が反応する。 血清と溶解液 の混合液が反応容器 4 2 0に流動した後の反応容器 4 2 0内の液面は、 反応液流路 4 2 1 の最内周部 （半径位置 6 0 4 ) よりも外周側にあるた め、 反応液流路最内周部を越えることができず、 回転中は混合液が反応 容器 4 2 0に保持される。
溶解液は、 血清中のウィルスや細菌等からその膜を溶解して核酸を溶 出させる働きをするが、 さらに本発明で言う捕捉部である核酸結合部材 3 0 1への核酸の吸着を促進させる。 このような試薬としては、 D N A の溶出及び吸着には塩酸グァニジンを、 R N Aにはグァニジンチオシァ ネー 卜を用いればよく、 核酸結合部材としては石英やガラスの多孔質材 や繊維フィルタ等を用いればよい。
血清と溶解液が反応容器 4 2 0に保持された後、 モータ 1 1 を停止し. 穿孔機 1 3で追加液容器 3 3 0に空気を供給するための追加液通気孔 2 3 1の蓋に穴をあけ、 再びモー夕 1 1 を回転させると、 遠心力の作用に より追加液 5 3 1 は追加液容器 3 3 0より追加液戻り流路 3 3 2を経て. 反応容器 4 2 0に流れ込み、 反応容器内の混合液の液面を内周側に移動 させる （図 1 1 ) 。 液面が反応液流路 4 2 1の最内周部 （半径位置 6 0 4 ) に達すると、 混合液は反応液流路の最内周部を越えて流れ出し、 合 流流路 4 2 2を経て、 核酸結合部材 3 0 1へ流れ込む。 追加液としては. たとえば上述の溶解液を使用すればよい。
尚、 試料によっては混合液の壁面に対する濡れ性がよく、 停止状態で は反応液流路 4 2 1内を毛細管現象で混合液が流動する場合もあり、 こ のときは追加液 5 3 1 を必要としない。
このようにして溶解液と血清の混合液が核酸結合部材を通過すると、 核酸が核酸結合部材に吸着し、 液は廃液流路 4 3 1 を経て廃液貯蔵容器 4 3 0へと流れ込む。 溶離液流路 4 5 1の下流側には複数の容器と流路 があり、 後の工程で各容器に空気を供給するための穴を穿孔するが、 混 合液が核酸結合部材 3 0 1 を通過する際には密閉されており、 液は溶離 液流路 4 5 1 には流れない。 一方廃液貯蔵容器 4 3 0は圧力調整用流路 4 3 2を経て圧力調整容器 4 4 0に連通している。 圧力調整容器 4 4 0 には圧力調整用通気流路 4 4 1が設けてあり、 さらに上カバー 2 0の圧 力調整用通気流路 4 4 1最内周部に対応する位置に圧力調整用通気孔 2
2 3を設けているため、 空気が自由に出入り可能である。
次にモー夕 1 1 を停止し、 穿孔機 1 3で第一洗浄液容器 3 4 0に空気 を供給するための第一洗浄液通気孔 2 4 1の蓋に穴をあけた後、 再びモ —夕 1 1を回転させると、 遠心力の作用により第一洗浄液 5 4 1 は第一 洗浄液容器 3 4 0より第一洗浄液戻り流路 3 4 2を経て、 核酸結合部材
3 0 1 に流れ込み、 核酸結合部材 3 0 1 に付着した蛋白等の不要成分を 洗浄する （図 1 2 ) 。 第一洗浄液としては、 たとえば上述の溶解液或い は溶解液の塩濃度を低減した液を使用すればよい。
洗浄後の廃液は、 上述の混合液同様、 廃液流路 4 3 1 を経て廃液貯蔵 容器 4 3 0へと流れ込む。
同様の洗浄動作を複数回繰り返す。 たとえば第一洗浄液に引き続き、 モータ停止の状態で、 穿孔機 1 3で第二洗浄液容器 3 5 0に空気を供給 するための第二洗浄液通気孔 2 4 1 の蓋に穴をあけ再びモー夕 1 1 を回 転させ、 核酸結合部材 3 0 1に付着した塩等の不要成分を洗浄する。 第 二洗浄液としては、 たとえばエタノール或いはエタノール水溶液を用い ればよい。
必要に応じてさらに同様の洗浄を繰り返してもよい。
このような洗浄工程において、 各洗浄液は廃液流路 4 3 1 を経て廃液 貯蔵容器 4 3 0へと流れるが、 溶離液流路 4 5 1 の一部、 特に廃液流路 との分岐部付近が汚染される可能性がある。 後述のように、 核酸結合部 材 3 0 1から溶離した核酸は溶離液流路 4 5 1 を通過するため、 溶離液 流路 4 5 1 も洗浄することが望ましい。
図 6〜 1 7の実施例 1では、 二種類の洗浄液すなわち第一洗浄液 5 4 1および第二洗浄液 5 5 1で洗浄しており、 第二の洗浄液で溶離液流路 4 5 1 を洗浄する場合について述べる。
まず図 1 3に第一の洗浄液がすべて廃液流路 4 3 1 を通過した状態を 示す。 廃液は廃液貯蔵容器 4 3 0から圧力調整用流路 4 3 2を経て圧力 調整流路 4 4 0へ溢れている。 一旦モータを停止後、 穿孔機 1 3で第二 洗浄液容器 3 5 0に空気を供給するための第二洗浄液通気孔 2 4 1の蓋 に穴をあけ、 さらに検出容器 4 5 0を外部と連通させるための検出容器 通気孔 2 7 2および最終洗浄液廃棄容器 4 6 0を外部と連通させるため の最終洗浄液用通気孔 2 7 3の蓋に穴をあける。
再びモータ 1 1 を回転させると、 遠心力の作用により第二洗浄液 5 5 1は第二洗浄液容器 3 5 0より第二洗浄液戻り流路 3 5 2を経て、 核酸 結合部材 3 0 1 に流れ込み、 核酸結合部材 3 0 1 に付着した第一洗浄液 を洗浄する （図 1 4 ) 。 核酸結合部材 3 0 1 を通過した第二洗浄液は、 検出容器 4 5 0および廃液貯蔵容器 4 3 0の両方に流れ込もうとするが， 廃液貯蔵容器 4 3 0の方は圧力調整用流路 4 3 2に液が流入する際のへ ッ ド差 （h i ) に加え、 圧力調整用流路 4 3 2から圧力調整容器 4 4 0 に空気を押し出すためのヘッ ド差 （h 2 ) が必要となり、 第二洗浄液は 流入することができない。 一方検出容器 4 5 0には前述の穿孔動作にて 通気孔をあけているため、 ほとんど抵抗なく流れる。 すなわち核酸結合 部材 3 0 1 を通過した第二洗浄液は、 溶離液流路 4 5 1 を経て本発明で 言う溶離液保持部である検出容器 4 5 0に流れ込む。 このとき、 混合液 や第一洗浄液等で汚染された、 廃液流路 4 3 1 との分岐部付近が洗浄さ れる。
第二洗浄液が検出容器 4 5 0に流れ込み、 液面が本発明で言う廃液廃 棄流路である洗浄液廃棄流路 4 5 2の最内周部 （半径位置 6 0 5 ) に達 すると、 最終洗浄液廃棄容器 4 6 0へと流れ出す。 洗浄液廃棄流路 4 5 2の検出容器との接続部 （半径位置 6 0 6 ) は最内周部 （半径位置 6 0 5 ) より外周側にあるため、 一旦最終洗浄液廃棄容器 4 6 0へ流れ出す と、 サイホン効果により検出容器 4 5 0内の液をすベて排出しようとす る。 しかし、 排出が完了した後で、 核酸結合部材 3 0 1等に残っていた 微量の液が流れ込んだ場合には、 検出容器 4 5 0内に液が残る。 この場 合は、 一度回転を停止し、 検出容器 4 5 0内に残った液が毛細管流動で 洗浄液廃棄流路 4 5 2を満たした後再び回転すれば、 再度サイホン効果 により検出容器 4 5 0に残った液を最終洗浄液廃棄容器 4 6 0へ排出す る。 したがって、 最終洗浄液に関しては、 通気孔の穿孔の後回転と停止 を二度繰り返すことが望ましい。
このように核酸結合部材 3 0 1 を洗浄し核酸のみが吸着している状態 にした後、 核酸の溶離工程に移行する。
すなわちモー夕停止の状態で、 穿孔機 1 3で溶離液容器 3 6 0に空気 を供給するための溶離液通気孔 2 6 1の蓋に穴をあけ、 さらに本発明で 言う溶離液廃棄部である溶離液廃棄容器 4 7 0を外部と連通させるため の溶離液廃棄用通気孔 2 7 4の蓋に穴をあける。 再びモータ 1 1 を回転 させ、 核酸結合部材 3 0 1に溶離液を流す （図 1 5 ) 。 溶離液は、 核酸 を核酸結合部材 3 0 1から溶離する液で、 水或いは p Hを 7から 9に調 整した水溶液を用いればよい。 特に溶離しやすくするため、 4 0度以上 に加温することが望ましい。 加温には図 1の上部光学装置 1 4を用い、 溶離液容器 3 6 0の上から光を照射すればよい。
溶離液は核酸結合部材 3 0 1 を通過後、 溶離液流路 4 5 1 を経て検出 容器 4 5 0に流れ込む。 前述の穿孔動作により溶離液廃棄容器 4 7 0は 外部と連通しているので、 溶離液は溶離液廃棄流路 4 7 1 を経て溶離液 廃棄容器 4 7 0へ流出する。 溶離液廃棄流路 4 7 1の検出容器 4 5 0 と の接続部 （半径位置 6 0 7 ) は溶離液廃棄容器 4 7 0 との接続部 （半径 位置 6 0 8 ) より内周側にあるため、 サイホン効果により検出容器 4 5 0内の半径位置 6 0 7より内周部の溶離液を溶離液廃棄容器 4 7 0へ排 出する。 このようにして、 核酸を含んだ溶離液を検出容器 4 5 0内に定 量して保持することができる （図 1 6 ) 。
次にモー夕停止の状態で、 穿孔機 1 3で検出液貯蔵容器 3 7 0に空気 を供給するための検出液通気孔 2 7 1の蓋に穴をあけ再びモータ 1 1 を 回転させ、 検出容器 4 5 0に検出液 5 7 1 を流す （図 1 7 ) 。 検出液は 核酸を増幅して検出するための試薬で、 デォキシヌクレオシド三リ ン酸 や D N A合成酵素及び蛍光試薬等を含んでいる。 増幅方法に応じて、 上 部光学装置 1 4を用いて、 検出容器 4 5 0の上から光を照射して加温し てもよい。
次に下部光学装置 1 5を検出容器 4 5 0の下に移動させ、 例えば蛍光 発光量を検出する。
上記穿孔、 加温、 検出時には保持ディスク 1 2を所定の位置に停止さ せる必要がある。 図 1 9に示すように、 保持ディスク 1 2 には位置決め 用突起 1 7を設けてあり、 位置検出器 1 6で保持ディスクの回転位置を 検出し、 コントローラ 1 8でモー夕 1 1の回転及び穿孔機 1 3の回転及 び上下動、 上部光学装置 1 4及び下部光学装置 1 5の回転、 照射、 検出 を制御する。
例えば図 2 0に穿孔機 1 3の動作タイミングを示す。 保持ディスク 1 2は、 全血或いは各試薬の流動終了後回転数を低下させ、 位置決め用の 低速回転を維持する。 位置検出器 1 6が位置決め用突起 1 7を検出する と保持ディスク 1 2を停止し、 穿孔機 1 3を下降させ各試薬貯蔵容器の 通気孔の蓋に穴をあけた後、 再び上昇する。 穿孔後保持ディスク 1 2は、 穿孔終了後の試薬貯蔵容器から試薬が流出しない程度の低速で回転し、 次の分析ディスクの位置、 すなわち分析ディスクが 6枚装着されている 場合は 6 0度回転して停止し、 同様の穿孔動作を繰り返す。 分析ディス クがどこに装着されているかは、 例えば下部光学装置で流路部光学窓 4 9 0から光を照射しその反射光を調べればよい。 すべての分析ディスク の穿孔が終了した後、 保持ディスクは高速で回転し試薬を流動させる。 本実施例によれば、 試料および各試薬の流動を制御するためのバルブ を流路途中に設ける必要がなく、 流路途中でのバルブ部での液残りは発 生せず、 前工程での試薬による汚染を防止でき、 液体試料中の核酸等の 特定成分を高純度に抽出でき、 高精度に分析できる。
(実施例 2 )
上記実施例 1では、 穿孔機により通気孔を開けて試薬の流動を制御し ていたが、 試薬の分注機構を用いてもよい。 すなわち図 2 1 に示すよう に、 試薬分注器 1 9で各試薬ボ トル 4 0 0より所定の試薬を図 3に示す 試薬貯蔵容器に分注した後、 分析ディスクを回転し試薬を流動させる。 手順を図 2 2に示す。
本実施例によれば、 試料および各試薬の流動を制御するためのバルブ を流路途中に設ける必要がなく、 流路途中でのバルブ部での液残りは発 生せず、 前工程での試薬による汚染を防止でき、 液体試料中の核酸等の 特定成分を高純度に抽出でき、 高精度に分析できる。
本発明によれば、 試料および各試薬の流動を制御するためのバルブを 流路途中に設ける必要がなく、 流路途中でのバルブ部での液残りは発生 せず、 前工程での試薬による汚染を防止でき、 液体試料中の核酸等の特 定成分を高純度に抽出でき、 高精度に分析できる。 これにより、 遺伝子 診断を高精度かつ高効率に行うことができる。

Claims

請 求 の. 範 囲
1 . 回転可能に支持した構造体を備え、 該構造体に、 試料中の特定の 化学物質を捕捉する捕捉部と、 前記捕捉部に流過させる液体を保持する 複数の試薬容器とを備えた化学分析装置において、
前記特定の化学物質を捕捉部から溶離した後の溶離液を保持する溶離液 保持部と該溶離液保持部に連通して前記溶離液の一部を廃棄する溶離液 廃棄部を設け、 前記溶離液保持部と前記溶離液廃棄部を連通する連通流 路と前記溶離液保持部との接続部を前記連通流路と前記溶離液廃棄部と の接続部より回転中心側に設けたことを特徴とする化学分析装置。
2 . 回転可能に支持した構造体を備え、 該構造体に、 試料中の特定の 化学物質を捕捉する捕捉部と、 前記捕捉部に流過させる液体を保持する 複数の試薬容器とを備えた化学分析装置において、
前記捕捉部を通過後の溶離液を保持する溶離液保持部は、 前記溶離液の 一部を流出させるための溶離液流出口と溶離液以外の液を廃棄するため の廃棄口を設け、 前記溶離液流出口を前記廃棄口より内周側に設けたこ とを特徴とする化学分析装置。
3 . 回転可能に支持した構造体を備え、 該構造体に、 試料中の特定の 化学物質を捕捉する捕捉部と、 前記捕捉部に流過させる液体を保持する 複数の試薬容器とを備えた化学分析装置において、
前記特定の化学物質を捕捉部から溶離した後の溶離液を保持する溶離液 保持部と該溶離液保持部から溶離液以外の液を廃棄する廃液廃棄流路と 前記溶離液保持部から溶離液の一部を廃棄する溶離液廃棄流路を設け、 前記溶離液保持部と前記溶離液廃棄流路との接続部を前記溶離液廃棄流 路の最内周部より外周側に設けたことを特徴とする化学分析装置。
4 . 回転可能に支持した構造体を備え、 該構造体に、 試料中の特定の 化学物質を捕捉する捕捉部と、 前記捕捉部に流過させる液体を保持する 複数の試薬容器とを備えた化学分析装置において、
前記特定の化学物質を捕捉部から溶離した後の溶離液を保持する溶離液 保持部と該溶離液保持部に検出用の試薬を供給する検出試薬供給流路を 設け、 前記溶離液保持部と前記検出試薬供給流路との接続部を前記溶離 液廃棄流路の最内周部より内周側に設けたことを特徴とする化学分析装 置。
5 . 回転可能に支持した構造体を備え、 該構造体に、 試料中の特定の 化学物質を捕捉する捕捉部と、 前記捕捉部に流過させる液体を保持する 複数の試薬容器とを備えた化学分析装置において、
前記捕捉部を通過後の試料液と溶離液とを保持する保持部を別々に設け 前記試料液が前記捕捉部を通過後に溶離液保持部の通気孔を開けて、 前 記溶離液を前記捕捉部に流過させることを特徴とした化学分析装置。
6 . 回転可能に支持した構造体を備え、 該構造体に、 試料中の特定の 化学物質を捕捉する捕捉部と、 前記捕捉部に流過させる液体を保持する 複数の試薬容器とを備えた化学分析装置において、
前記特定の化学物質を前記捕捉部から溶離した後の溶離液を保持する溶 離液保持部と、 該溶離液保持部に検出用の試薬を供給する検出試薬容器 を設け、 検出試薬の流動を制御するための検出試薬制御部を、 検出試薬 を前記溶離液保持部に供給するための検出試薬流出口よりも上流側に設 け、 前記溶離液保持部から溶離液の一部を廃棄する溶離液廃棄流路を設 け、 溶離液の一部を前記溶離液廃棄流路から廃棄した後に検出試薬を溶 離液保持部内に流動させることを特徴とした化学分析装置。
7 . 請求項 6において、 前記試薬制御部は開放可能な通気孔と開孔機 構であることを特徴とする抽出装置。
8 . 請求項 6において、 前記試薬制御部は試薬分注器であることを特 徴とする抽出装置。
9 . 回転可能に支持した回転構造体を備え、 該構造体に、 試料中の特 定の化学物質を捕捉する捕捉部と、 前記捕捉部に流過させる液体を保持 する複数の試薬容器とを備えた化学分析装置において、
前記捕捉部を通過後の溶離液を保持する溶離液保持部と該溶離液保持部 から溶離液以外の液を廃棄する廃液廃棄流路を設け、
前記溶離液保持部と前記廃液廃棄流路の接続部である廃液廃棄流路入り 口を前記廃液廃棄流路のもう一端である廃液廃棄流路出口より内周側に 設け、 前記回転構造体の回転中に前記捕捉部を流過した試薬が前記廃液 廃棄流路を流動後、 前記回転構造体が一度停止後再度回転し、 さらに再 度停止した後溶離液を前記捕捉部に流過させることを特徴とする化学分 析装置。
1 0 . 請求項 1〜 9に記載の化学分析装置を有する遺伝子診断装置。
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