WO2003085107A1 - Cellules à génome modifié - Google Patents

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Naoko Ohnuki
Mitsuo Satoh
Katsuhiro Mori
Kazuya Yamano
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Description

• 明 細 書 ゲノムが改変された細胞 技術分野

本発明は、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1 位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞よ りも低下または欠失するように、 ゲノムが改変された細胞および該細胞を用いた 抗体分子の製造方法に関する。 背景技術

抗体 IgG分子の Fc領域には、 2個所の N-グリコシド型の糖鎖結合部位が存在し ており、 血清中の IgG では、 通常、 この部位に、 シアル酸やバイセクティングの N-ァセチルダルコサミンの付加の程度が少ない複数本の枝を持つコンプレックス 型糖鎖が結合している。 このコンプレックス型糖鎖の非還元末端でのガラクトー スの付加おょぴ還元末端の N-ァセチルダルコサミンへのフコースの付加に関して は多様性があることが知られている [バイオケミストリー (Biochemistry) , 36, 130, 1997] o

このような糖鎖の構造は、 糖鎖遺伝子、 すなわち、 糖鎖を合成する糖転移酵素 と糖鎖を分解する糖分解酵素の遺伝子によって規定されていると考えられている。 以下に、 N-ダリコシド結合糖鎖の生合成に関して述べる。

糖蛋白質は、 小胞体 (以下、 E Rと表記する) 内腔で糖鎖の修飾を受ける。 N- グリコシド結合糖鎖の生合成過程では、 比較的大きな糖鎖が、 E R内腔で伸長し つつあるポリペプチド鎖に転移される。 この際、 糖鎖はまず、 ドリコールリン酸

(以下、 P- Dol とも表記する) と呼ばれる ーィソプレン単位を 20個程度含む長 鎖の脂質担体のリン酸基に順次付カ卩される。 すなわち、 ドリコーノレリン酸に N-ァ セチル -ダルコサミン (以下、 GlcNA とも表記する) が転移され GlcNAc - P- P_Dol となり、 続いてもう 1個 GlcNAcが転移され GlcNAc - GlcNAc - P - P - Dolとなる。 次い で、 マンノース (以下、 Man とも表記する) 力 S 5個転移され (Man) 5 - (GlcNAc) 2 - P_P- Dol に、 さらに、 Manが 4個、 グルコース (以下、 Glc とも表記する) 力 S 3 個転移される。 このようにして、 コアオリゴ糖と呼ばれる糖鎖の前駆体 (Glc) 3 -

(Man) 9- (GlcNAc) 2- P- P-Dolができる。 この 14個の糖からなる糖鎖の前駆体は ァスパラギン一 X—セリンまたはァスパラギン一 X—スレオニン配列を持ったポ リペプチドへ E R內腔でひとかたまりのまま転移される。 この際、 コアオリゴ糖 に結合していたドリコールピロリン酸 (P- P- Dol) は遊離するが、 ピロホスファタ ーゼ'の分解を受けて再ぴドリコールリン酸となり再利用される。 糖鎖のトリミン グは、 糖鎖がポリペプチドに結合すると直ちに開始される。 すなわち、 3個の Glc と 1ないし 2個の Manが E R上で除去され、 この除去には ο; 1、 2ダルコシダーゼ I、 ひ 1、 3—ダルコシダーゼ IIおよぴひ 1、 2マンノシダーゼが関与することが知 られている。 E R上でトリミングを受けた糖蛋白質はゴルジ体へ輸送され様々な 修飾を受ける。 ゴルジ体シス部には、 マンノースリン酸を付加する Ν-ァセチルダ ノレコサミンホスホトランスフェラーゼ、 Ν-ァセチノレグノレコサミン 1一ホスホジェ ステル α— Ν-ァセチルグルコサミニダーゼおよび α—マンノシダーゼ I が存在し、 Man残基を 5 個にまで減少させる。 ゴルジ体メディア部には、 コンプレックス型 の N -ダリコシド結合糖鎖の最初の外側の GlcNAc を付加する N-ァセチルダルコサ ミン転移酵素 I (GnTI) 、 2個の Man を除去する α—マンノシダーゼ II、 外側か ら 2個目の GlcNAcを付加する N-ァセチルダルコサミン転移酵素 II (GnTII) 、 還 元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースを付カ卩するひ 1, 6-フコシルトランス フェラーゼが存在する。 ゴルジ体トランス部にはガラク トースを付加するガラク トース転移酵素、 N-ァセチルノイラミン酸などのシアル酸を付加するシアル酸転 移酵素が存在する。 このような各種酵素の作用を受けて N-グリコシド結合糖鎖が 作られることが知られている。

抗体の糖鎖に関しては、 抗体の N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダ ルコサミンへのフコースの付加修飾によって、 抗体の抗体依存性細胞障害活性

(以下、 ADCC 活性と表記する) が大きく変化することが報告されている

(W000/61739) 。 これらの報告は、 ヒ ト IgGlサブクラスの抗体のエフヱクタ一機 能に糖鎖の構造が極めて重要な役割を果たしていることを示している。

一般的に、 医薬への応用が考えられているヒ ト化抗体の多くは、 遺伝子組換え 技術を用いて作製され、 動物細胞、 例えばチャイニーズハムスター卵巣組織由来 C H O細胞などを宿主細胞として用いて製造されているが、 上述したように、 抗 体のエフェクター機能には糖鎖構造が極めて重要な役割を担っていること、 宿主 細胞によって発現された糖蛋白質の糖鎖構造に違レ、が観察されることから、 より 高いエフェクター機能を有する抗体を作製することが可能な宿主細胞の開発が望 まれている。 また、 糖鎖の修飾に関わる酵素遺伝子を導入することによって、 生産される糖 蛋白質の糖鎖構造を改変することも試みられており、 その具体的な例としては、

1) ラットの ]3—ガラクトシド (¾ 2、 6—シァリルトランスフェラーゼを C H O細胞 に導入することで糖鎖の非還元末端にシアル酸が多く付加された蛋白質の製造が 可能であること [ジャーナル'ォブ 'バイオロジカル'ケミストリーひ. Biol. Chem. ), 261, 13848, 1989]、 2) ヒ トの j8—ガラク トシド 2— αフコシルトラン スフヱラーゼをマウス L細胞に導入することで糖鎖の非還元末端にフコース (以 下、 Fuc とも表記する) が付カ卩された H抗原 (Fuc α 1 - 2Gal 0 1 -) の発現が可能で あること [サイエンス(Science) , 252, 1668, 1991]、 3) β 1、 4—Ν-ァセチルグル コサミン転移酵素 III (GnTIII) を導入した C H O細胞を用いて抗体を生産する ことで N -グリコシド結合糖鎖のバイセクティングに位置する N -ァセチルダルコサ ミンの付加の割合が高い抗体の生産が可能であること [ダリコバイオロジー (Glycobiology) , 5, 813 (1995) : W099/54342] が報告されている。 GnTIII を導 入した C H O細胞を用いて抗体を発現させた場合には、 親株で発現させた抗体と 比べて 16倍高い A D C C活性が得られることが示されている。 しかしながら、 GnTIII あるいは /3 1, 4一 N-ァセチルダルコサミン転移酵素 V (GnTV) の過剰発現 は C H O細胞に対して毒性を示すと報告されているため、 抗体医薬の生産には適 切ではない。

糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子の活性が変化した突然変異体を宿主細胞として 用いることで、 生産される糖鎖構造が変化した糖蛋白質の生産例も報告されてお り、 その具体的な例としては、 N-ァセチルダルコサミン転移酵素 I (GnTI) の活 性が欠損している C H O細胞変異株を用いてハイマンノース型糖鎖構造を有する 抗体を生産した報告を挙げることができる [ジャーナル'ォブ 'ィムノロジー(J. Immunol. ) , 160, 3393, 1998]。 また、 C M P—シアル酸トランスポーターや U D P—ガラクトーストランスポーターの欠損株を用いて、 糠鎖非還元末端側にシァ ル酸が付加していない糖鎖構造を有する抗体の発現や、 ガラクトースの付加のな レ、抗体の発現例が報告されているが、 医薬への応用に適したエフェクタ一作用が 向上した抗体の発現には成功していない [ジャーナル'ォブ ·ィムノ口ジー (J. Immunol. ) , 160, 3393, 1998]。 これら変異株は、 変異剤処理によりランダムに変 異が導入された結果の株として取得されており、 医薬品製造に用いる株としては 適切ではない。 一方、 宿主細胞の糖鎖の修飾に係わる酵素遺伝子を標的とし意図 的に標的遺伝子のみを破壊した細胞株を用いて糖蛋白質である抗体の生産を試み た報告はこれまでにない。

このように、 生産される糖蛋白質の糖鎖構造を改変するために、 宿主細胞の糖 鎖の修飾に関わる酵素の活性を調節する試みがなされているが、 実際には糖鎖の 修飾機構は多様かつ複雑であり、 力つ糖鎖が持つ生理的な役割の解明も十分とは 言い難いため試行錯誤を繰り返しているのが現状である。 特に、 抗体のエフヱク タ一機能は糖鎖構造により大きな影響を受けることが明らかになりつつあるが、 最適な糖鎖構造で修飾された抗体分子を生産しうる宿主細胞の取得には至ってい ない。 発明の開示

本発明は、 以下の (1) 〜 (43) に関する。

(1) N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞よりも 低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞。

(2) Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノック アウトされた、 (1) 記載の細胞。

(3) Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子 のすべてがノックァゥトされた(1)または(2)に記載の細胞。

(4) Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、 ひ 1, 6 -フコシノレトラ ンスフヱラーゼである、 (1)〜(3)のレ、ずれか 1項に記載の細胞。

(5) a l, 6-フコシルトランスフェラーゼが、 以下の (a)、 (b)、 (c)および(d) からなる群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 (4)に記載の細胞。

(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA;

(b) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA;

(c) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件 でハイブリダィズし、 かつ α 1, 6-フコシルトランスフエラーゼ活性を有する蛋白 質をコードする DNA; (d) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA とストリンジ ントな条件 でハイブリダイズし、 かつひ 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白 質をコードする DNA。

(6) ひ 1, 6-フコシルトランスフヱラーゼが、 以下の (a)、 (b)、 (c) (d)、 (e) および (f) からなる群から選ばれる蛋白質である、 (4)に記載の細胞。

(a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;

(b) 配列番号 5で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;

(c) 配列番号 4 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入おょぴ Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ《1, 6 -フコシ ルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質;

(d) 配列番号 5 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 揷入おょぴノまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ α 1,6 -フコシ ルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質;

(e) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ α 1, 6 -フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質;

(f) 配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつひ 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。

(7) N-グリコシド結合複合型糖鎮還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が 結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、 (1)〜 (6)のいずれか 1項に記載の細胞。

(8) 少なくとも、 以下の(a)、 (b)、 (c)および (d)からなる群から選ばれるレク チンの一つに耐性である、 (7)記載の細胞。

(a) レンズマメレクチン;

(b) ェンドウマメレクチン;

(c) ソラマメレクチン;

(d) ヒィロチャワンタケレクチン。

(9) 細胞が、 下記の (a;)〜(j) からなる群から選ばれる細胞である、 (1)〜(8) のいずれか 1項に記載の細胞。

(a) チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞;

(b) ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞;

(c) マウスミエ口一マ細胞株 NS0細胞;

(d) マウスミエ口一マ細胞株 SP2/0- Agl4細胞; (e) シリアンハムスタ一腎臓組織由来 BHK細胞;

(f) 抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞;

(g) ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞;

(h) 胚性幹細胞;

(i) 受精卵細胞;

(j) 植物細胞。

(10) 抗体分子をコードする遺伝子を含む(1)〜(9)のいずれか 1項に記載の細 胞。

(11) 抗体分子が、 以下の(a)、 (b)、 (c)および (d)からなる群から選ばれる抗 体分子である、 (10に記載の細胞。

(a) ヒト抗体;

(b) ヒト化抗体;

(c) (a)または (b)の Fc領域を含む抗体断片;

(d) (a)または (b)の Fc領域を有する融合蛋白質。

(12) 抗体分子のクラスが IgGである、 (10) または(11)に記載の細胞。

(13) 親株細胞が生産する抗体組成物より、 抗体依存性細胞障害活性が高い抗 体組成物を生産する能力を有する、 α)〜α2)のいずれか 1項に記載の細胞。

(14) 抗体依存性細胞障害活性が高レ、抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していなレ、糖鎖の割合が、 親株細胞が生産 する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、 (13)に記載の細胞。

(15) フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に (¾結合していない糖鎖 である、 (14)に記載の細胞。

(16) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である抗 体組成物である、 (13)〜(15)のいずれか 1項に記載の細胞。

(17) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルグルコサミンとフコースが結合してレヽる糖鎖を有しない抗体組成物である、 (13)〜(16)のいずれか 1項に記載の細胞。 (18) (10)〜(: 17)のいずれか 1項に記載の細胞を用いること特徴とする、 抗体 組成物を製造する方法。

(19) (10)〜(18)のいずれか 1項に記載の細胞を培地に培養し、 培養物中に抗 体組成物を生成蓄積させ、 該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、 抗体 組成物を製造する方法。

(20) 抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障 害活性が高い抗体組成物である、 (18)または(19)に記載の方法。

(21) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞が生産 する抗体組成物より高いことを特徴とする、 (20)に記載の方法。

(22) フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に a結合していない糖鎖 である、 (21)に記載の方法。

(23) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である抗 体組成物である、 (20)〜(22)のいずれか 1項に記載の方法。

(24) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルダルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、

(20)〜(23) V、ずれか 1項に記載の方法。

(25) (1)〜(9)のいずれかに記載の細胞を用いて作製された、 トランスジヱニ ック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。

(26) トランスジエニック非ヒト動物が、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 ニヮトリ、 サルおよぴゥサギからなる群から選ばれる動物であ る、 (24)に記載のトランスジヱニック非ヒト動物、 またはその子孫。

(27) 抗体分子をコードする遺伝子を導入した(25)または(26)に記載のトラン スジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。

(28) 抗体分子が、 以下の(a)、 (b)、 (c)および(d)からなる群から選ばれる抗 体分子である、 (27)に記載のトランスジヱニック非ヒト動物あるいは植物、 また はその子孫。

(a) ヒ ト抗体; (b) ヒト化抗体;

(c) (a)または (b)の Fc領域を含む抗体断片;

(d) (a)または (b)の Fc領域を有する融合蛋白質。

(29) 抗体分子のクラスが IgGである、 (27)または(28)に記載のトランスジェ ニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。

(30) (27:)〜(29)のいずれか 1 項に記載のトランスジエニック非ヒト動物ある ヽは植物を飼育し、 飼育した動物あるいは植物から導入した抗体組成物を含む組 織あるいは体液を取得し、 該組織あるいは体液から抗体組成物を採取する工程を 含む、 抗体組成物を製造する方法。

(31) (26)〜(29)のいずれか 1 項に記載のトランスジエニック非ヒト動物ある いは植物、 またはその子孫の抗体生産細胞を取得し、 取得した抗体生産細胞を培 地に培養し、 培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物から抗体組成物を 採取する工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。

(32) 抗体組成物が、 ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、 ま たはその子孫から得られる抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障害活性が高い抗 体組成物である、 (30)または(31)に記載の方法。

(33) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、 ゲノムが改変さ れていない非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫から得られる抗体組成物よ り高いことを特徴とする、 (32)に記載の方法。

(34) フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 (33)に記載の方法。

(35) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である抗 体糸且成物である、 (32)〜(34)のいずれか 1項に記載の方法。

(36) 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルダルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、 (32)〜(35)レ、ずれか 1項に記載の方法。 (37) N -グリコシド結合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子からなる抗体組成物 であって、 該抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ダリコシド結合複合型 糠鎖のうち、 糠鎖還元末端の N-ァセチルダリコサミンにフコースが結合していな レ、糖鎖を有する抗体組成物。

(38) フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N-グリコシド結 合複合型糠鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に a結合していない糖鎖 である、 (37)記載の抗体組成物。

(39) (18)〜 (24)のいずれか 1 項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。

(40) (27)〜(36)のいずれか 1 項に記載の方法を用いて製造される抗体組成物。

(41) (37)〜(40)のいずれか 1 項に記載の記載の抗体組成物を有効成分として 含有する医薬。

(42) 医薬が、 腫瘍を伴う疾患、 アレルギーを伴う疾患、 炎症を伴う疾患、 自 己免疫疾患、 循環器疾患、 ウィルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に 対する診断薬、 予防薬または治療薬である、 (41)に記載の医薬。

(43) (41)または (42)に記載の医薬を製造するための、 (37)〜(40)のいずれか 1項に記載の抗体組成物の使用。 本発明の Ν -ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν -ァセチルダルコサミンの 6 位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞より も低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞 (以下、 「本発明の細胞」 と表記する) は、 Ν-ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルグルコサミ ンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素 (以下、 「ひ 1, 6-フコース修飾酵素」 と表記する) の活性が親株細胞よりも低下または欠失す るようにゲノムが改変された細胞であれば、 ゲノムの改変の手段はいかなるもの であってもよい。

親株細胞とは、 ひ 1, 6 -フコース修飾酵素の活性が低下または欠失させるための 方法をゲノムに対して施す前の細胞をいう。 親株細胞としては、 特に限定はない 力 例えば、 以下の細胞があげられる。

NS0 細胞の親株細胞としては、 バイオ/テクノロジー(BI0/TECHN0L0GY), 10, 169 (1992)、 バイオテクノロジー.バイオエンジニアリ ング (Biotechnol. Bioeng. ) , 73, 261, (2001)等の文献に記載されている NS0細胞があげられる。 ま た、 理化学研究所細胞開発銀行に登録されている NSO細胞株 (RCB0213) 、 あるい はこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。

SP2/0 - Agl4 細胞の親株細胞としては、 ジャーナル'ォプ'ィムノロジー(J. Immunol. ) , 126, 317, (1981)、 ネイチヤー(Nature), 276, 269, (1978) 、 ヒュ 一マン'アンチイボディズ'アンド'ノヽィプリ ドーマズ(Human Antibodies and Hybridomas) , 3, 129, (1992) 等の文献に記載されている SP2/0-Agl4細胞があげ られる。 また、 ATCCに登録されている SP2/0 - Agl4細胞 (ATCC CRL- 1581) あるい はこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株 (ATCC CRL- 1581. 1) などもあげら れる。

チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞の親株細胞としては、 Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968)、 Genetics, 55, 513 (1968)、 Chromosoma, 41, 129 (1973)、 Methods in Cell Science, 18, 115 (1996)、 Radiation Research, 148, 260 (1997)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)、 Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968)、 Cell, 6, 121 (1975)、 Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (p883 - 900)等の文献に記載されている CH0細胞があげられる。 ま た、 ATCC に登録されている CH0-K1 株 (ATCC CCL-61) 、 DUXB11 株 (ATCC CRL - 9096) 、 Pro- 5株 (ATCC CRL-1781) や、 市販の CHO- S株 (Lif etechnologies社製 Cat#11619) 、 あるいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげら れる。

ラットミエローマ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20 細胞の親株細胞としては、 Y3/Agl. 2. 3 細胞 (ATCC CRL-1631) から樹立された株化細胞が包含される。 その 具体的な例としては、 J. Cell. Biol. 93, 576 (1982)、 Methods Enzymol. 73B, 1 (1981)等の文献に記載されている YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞があげられる。 また、 ATCCに登録されている YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞 (ATCC CRL- 1662) あ るいはこれら株を生育可能な培地に馴化させた亜株などもあげられる。

a 1, 6-フコース修飾酵素としては、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N- ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合する反応に関与する酵素 であれば 1、かなる酵素も包含される。 Ν -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν- ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位が α結合する反応に関与する酵素 としては、 該反応に影響を与える酵素も包含される。 W

CK I, 6 -フコース修飾酵素としては、 具体的には、 ひ 1, 6 -フコシルトランスフエ ラーゼゃ α— Lーフコシダーゼなどがあげられる。

また、 Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位が α結合する反応に影響を与える酵素としては、 上述のひ 1, 6- フコース修飾酵素の活性に影響を与えたり、 該酵素の基質となる物質の構造に影 響を与える酵素も包含される。

本発明において、 a l, 6-フコシルトランスフェラーゼとしては、 下記(a;)、 (b)、 (c)あるいは(d)の DNAがコードする蛋白質、 または下記(e)、 (f)、 (g) 、 (h) 、 (i) あるいは (j) の蛋白質などがあげられる。

(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA

(b) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA

(c) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でハ イブリダィズし、 かつ α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を コードする DNA

(d) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件でノ、 イブリダィズし、 かつひ 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質を コードする DNAまたは、

(e) 配列番号 4で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質

(f) 配列番号 5で表されるァミノ酸配列からなる蛋白質

(g) 配列番号 4 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置 換、 揷入および または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ a 1, 6 -フコシル トランスフヱラーゼ活性を有する蛋白質

(h) 配列番号 5 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置 換、 揷入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつひ 1, 6 -フコシル トランスフェラーゼ活性を有する蛋白質

(i) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配 列からなり、 かつ a 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質

(j) 配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するアミノ酸配 列からなり、 かつ a 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活 1"生を有する蛋白質

本発明において、 ストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする D N Aとは、 例えば配列番号 1または 2で表される塩基配列を有する D N Aなどの D N Aまた はその一部の断片をプローブとして、 コロニー ·ハイブリダィゼーシヨン法、 プ ラーク ·ハイプリダイゼーシヨン法あるいはサザンプロッ ト 'ハイブリダィゼー シヨン法等を用いることにより得られる D NAをいい、 具体的には、 コロニーあ るいはプラーク由来の D N Aを固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1. 0Mの 塩化ナトリウム存在下、 65°Cでハイプリダイゼーシヨンを行った後、 0. 1〜2倍 濃度の S S C溶液 (1倍濃度の S S C溶液の組成は、 150mM塩化ナトリウム、 15 mMクェン酸ナトリウムよりなる) を用い、 65°C条件下でフィルターを洗浄する ことにより同定できる D N Aをあげることができる。 ハイプリダイゼーシヨンは、 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, し old spring Harbor Laboratory Press, 1989 (以下、 モレキュラー 'クローニング第 2版と略 す) 、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987— 1997 (以下、 カレント'プロ トコールズ'イン'モレキュラー'バイオロジーと略 す) 、 DNA Cloning 1 : Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等に記載されている方法に準じて行うことが できる。 ハイブリダィズ可能な D N Aとして具体的には、 配列番号 1または 2で 表される塩基配列と少なくとも 60%以上の相同性を有する D N A、 好ましくは 70%以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 特に好ましく は 95%以上、 最も好ましくは 98%以上の相同性を有する D N Aをあげることがで きる。

本発明において、 配列番号 4または 5で表されるアミノ酸配列において 1以上 のァミノ酸が欠失、 置換、 揷入および Zまたは付加されたァミノ酸配列からなり、 かつ α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質とは、 モレキユラ 一 · クロ一ユング第 2 版、 力レント ·プロ トコーノレズ 'イン 'モレキュラー ·バ ィォロジ一、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特 異的変異導入法を用いて、 例えば、 配列番号 4または 5で表されるアミノ酸配列 を有する蛋白質をコードする D N Aに部位特異的変異を導入することにより取得 することができる蛋白質を意味する。 欠失、 置換、 揷入および Zまたは付加され るアミノ酸の数は 1 個以上でありその数は特に限定されないが、 上記の部位特異 的変異導入法等の周知の技術により、 欠失、 置換、 揷入もしくは付加できる程度 の数であり、 例えば、 1〜数十個、 好ましくは 1〜20個、 より好ましくは 1〜10個、 さらに好ましくは 1〜5個である。 また、 本発明において、 配列番号 4または 5で表されるアミノ酸配列と 80%以 上の相同性を有し、 かつひ 1, 6 -フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質 とは、 B L A S T 〔J. Mol. Biol. , 215, 403 (1990)〕 や F A S T A [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)〕 等の解析ソフトを用いて計算したときに、 配列 番号 4または 5に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質と少なくとも 80%以上、 好 ましくは 85%以上、 より好ましくは 90%以上、 さらに好ましくは 95%以上、 特 に好ましくは 97%以上、 最も好ましくは 99%以上である蛋白質であることを意味 する。

本発明において、 N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコ サミンの 6位にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親 株細胞より低下または欠失するようにゲノムが改変されたとは、 該酵素の発現を 低下または欠失させるように該酵素の遺伝子の発現調節領域に変異を導入したり、 あるいは該酵素の機能を低下または欠失させるように該遺伝子のアミノ酸配列に 変異を導入することをいう。 変異を導入するとは、 ゲノム上の塩基配列に欠失、 置換、 挿入および/または付加といつた塩基配列の改変を行うことをいう。

ゲノム遺伝子がノックアウトされた細胞とは、 ゲノム遺伝子の発現または機能 を完全に抑制することをいう。 ゲノム遺伝子がノックァゥトされた細胞の具体的 な例としては、 標的となる遺伝子のすべてまたは一部がゲノムから削除された細 胞があげられる。 このような細胞を取得する方法としては、 目的とするゲノムの 改変を行うことができれば、 いずれの手法でも用いることができるが、 遺伝子ェ 学的な手法が望ましい。 その具体的な手法としては、

( a ) a l, 6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的した遺伝子破壌の手法;

( b ) a 1 , 6—フコース修飾酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入す る方法

(c) a 1, 6-フコース修飾酵素についての突然変異を導入する手法;

(d) a 1, 6-フコース修飾酵素の転写または翻訳を抑制する手法などがあげられる。 また、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位とフコ ースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性な細胞株を選択する 方法を用いることにより、 本発明の細胞を選択することができる。

レクチンに耐性な細胞とは、 レクチンを有効濃度与えたときにも、 生育が阻害 されない細胞をいう。 有効濃度とは、 親株細胞が正常に生育できない濃度以上で あり、 好ましくは親株細胞が正常に生育できない濃度と同濃度、 より好ましくは

2〜5倍、 さらに好ましくは 10倍、 最も好ましくは 20倍以上である。

本発明において、 生育が阻害されないレクチンの有効濃度は、 細胞株に応じて 適宜定めればよいが、 通常 10 μ §/ηι1〜10. 0mg/ml、 好ましくは 0. 5〜2. Omg/ml で める。

N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルグルコサミンの 6位とフコ ースの 1 位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンとしては、 該糖鎖構造を認 識できるレクチンであれば、 いずれのレクチンも包含される。 その具体的な例と しては、 レンズマメ レクチン L C A ( Lens Culinaris 由来の Lentil Agglutinin) 、 エン ドゥマメ レクチン P S A ( Pi sum sativum 由来の Pea Lectin) 、 ソラマメレクチン V F A (Vicia faba由来の Agglutinin) 、 ヒイロチ ャワンタケレクチン AA L (Aleuria aurantia由来の Lectin) などがあげられる。 本発明の細胞としては、 抗体分子を発現できる細胞であればいかなる細胞でも よいが、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞などがあげられ、 これらの細胞の 具体的な例としては、 後述の 3. に記載のものがあげられる。 動物細胞の具体例 としては、 チャイニーズハムスター卵巣糸且織由来の CH0 細胞、 ラットミエローマ 細胞株 Y B 2/3H L . P 2. G il. 16A g . 20 細胞、 マウスミエローマ細胞株 N S O 細胞、 マウスミエローマ細胞株 S P 2/0— A g l4 細胞、 シリアンハムスター 腎臓組織由来 B H K細胞、 抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞、 ヒ ト白血病細胞 株ナマルバ細胞、 胚性幹細胞、 受精卵細胞などがあげられる。 好ましくは、 抗体 組成物の製造に用いられる、 上述のミエローマ細胞、 ハイブリ ドーマ細胞、 ヒ ト 化抗体おょぴヒ ト抗体を製造するための宿主細胞、 ヒ ト抗体を生産するヒ ト以外 のトランスジヱニック動物を製造するために用いる胚性幹細胞または受精卵細胞、 ならびにヒ ト化抗体およびヒ ト抗体を生産するトランスジヱニック植物を製造す るために用いる植物細胞などがあげられる。

本発明の細胞は、 親株細胞が生産する抗体組成物より、 高い ADCC活性を有する 抗体糸且成物を生産することができる。

また、 本発明の細胞は、 抗体組成物中に含まれる Fc 領域に結合する全 N-グリ コシド結合複合型糖鎖のうち、 糠鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンとフコー スが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞よりも高い抗体組成物を生産するこ とができる。 本発明は、 本発明の細胞を用いることを特徴とする抗体組成物の製造方法に関 する。

抗体組成物とは、 N-グリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子から なる組成物をいう。

抗体は、 重鎖および軽鎖 (以下、 それぞれ 「H鎖」 および 「L鎖」 と表記する) の 2種類のポリぺプチド鎖がそれぞれ 2分子ずつ会合した 4量体である。 H鎖の N 末端側の約 4分の 1 と L鎖の N末端側の約 4分の 1 (それぞれ 100余アミノ酸) は可変領域 (以下、 V領域と表記する) と呼ばれ、 多様性に富み、 抗原との結合 に直接関与する。 V領域以外の部分の大半は定常領域 (以下、 C領域と表記する) と呼ばれる。 抗体分子は C領域の相同性により IgG、 IgM、 IgA、 IgD、 IgEの各ク ラスに分類される。

また IgGクラスは C領域の相同性により、 さらに IgGl~IgG4のサブクラスに分 類される。

H鎖は N末端側より VH、 CHI, CH2、 CH3の 4つのィムノグロプリンドメインに 分かれ、 CH1 と CH2 の間にはヒンジ領域と呼ばれる可動性の高いペプチド領域が あり、 CH1 と CH2 とが区切られる。 ヒンジ領域以降の CH2 と CH3からなる構造単 位は Fc領域と呼ばれ、 N-グリコシド結合型糖鎖が結合している。 また、 この領域 は、 Fc レセプター、 補体などが結合する領域である (免疫学イラストレイテッド 原書第 5版、 2000年 2月 10日発行、 南江堂版、 抗体工学入門、 1994年 1月 25日 初版、 地人書館) 。

抗体などの糖タンパク質の糖鎖は、 タンパク質部分との結合様式により、 ァス パラギンと結合する糖鎖 (N -グリコシド結合糖鎖) とセリン、 スレオニンなどと 結合する糖鎖 (0-グリコシル結合糖鎖) の 2種類に大別される。 N -グリコシド結 合糖鎖は、 以下の構造式 (I) に示す基本となる共通のコア構造を有する [生物化 学実験法 23—糖蛋白質糖鎖研究法 (学会出版センター) 高橋禮子編 (1989年) ] 。

β 1 ► 4GlcNAc (D 上記構造式 (I ) において、 ァスパラギンと結合する糖鎖の末端を還元末端、 反対側を非還元末端という。 N -グリコシド結合糖鎖としては、 上記構造式 ( I ) のコア構造を有するもので あればいかなるものでもよいが、 コア構造の非還元末端にマンノースのみが結合 するハイマンノース型、 コア構造の非還元末端側にガラクトース- N -ァセチルダル コサミン (以下、 Gal- GlcNAc と表記する) の枝を並行して 1ないしは複数本有し、 更に Gal_GlcNAc の非還元末端側にシアル酸、 パイセクティングの N-ァセチルダ ルコサミンなどの構造を有するコンプレックス型 (複合型) 、 コア構造の非還元 末端側にハイマンノース型とコンプレックス型の両方の枝を持つハイプリッド型 などがあげられる。

抗体分子の Fc領域には、 N-グリコシド結合糖鎖が 1力所ずつ結合する領域を有 しているので、 抗体 1分子あたり 2本の糖鎖が結合している。 抗体分子に結合す る N -グルコシド結合糖鎖としては、 前記構造式 (I) で示されるコア構造を含む いかなる糖鎖も包含されるので、 抗体に結合する 2本の N -ダルコシド結合糖鎖に は多数の糖鎖の組み合わせが存在することになる。

したがって、 本発明において、 本発明の細胞を用いて製造される抗体組成物は、 本発明の効果が得られる範囲であれば、 単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構 成されていてもよいし、 複数の異なる糖鎖構造を有する抗体分子から構成されて いてもよい。 そのような本発明により得られる抗体組成物として、 好ましくは、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ダリコシド結合複合型糠鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合 が、 ゲノムが改変されていない親株細胞が生産する抗体組成物よりも高い抗体組 成物があげられる。

また、 本発明において、 a l, 6-フコース修飾酵素の活性が欠失または低下する ようにゲノムが改変された、 トランスジエニック非ヒ ト動物あるいは植物、 また はその子孫を用いて製造した抗体組成物も、 本発明の効果が得られる範囲であれ ば、 単一の糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよいし、 複数の異な る糖鎖構造を有する抗体分子から構成されていてもよい。

そのような抗体組成物として、 好ましくは、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に 結合する全グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコ サミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が、 ゲノムが改変されていない非 ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫 (以下、 親個体と称す) が生産する抗体 組成物よりも高い抗体組成物があげられる。 ' a 1, 6 -フコース修飾酵素の活性が欠失または低下するようにゲノムが改変され た、 トランスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫は、 胚性幹細 胞、 受精卵細胞、 または植物細胞を用いて作製することができる。

抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖の うち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖 の割合とは、 該組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ての N-グリコシド結合 複合型糖鎖の合計数に対して、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコー スが結合していない糖鎖の数が占める割合をいう。

N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが 結合していない糖鎖とは、 フコースが、 N -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンに α結合していない糖鎖をいう。 具体的には、 フコース の 1位が Ν-グリコシド結合複合型糖鎖の Ν-ァセチルグルコサミンの 6位に α結合 していない糖鎖があげられる。

本発明の抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合 型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合してい ない糖鎖の割合としては、 好ましくは 2 0 %以上、 より好ましくは 3 0 %以上、 さらに好ましくは 4 0 %以上、 特に好ましくは 5◦%以上、 最も好ましくは 1 0 0 %である抗体組成物があげられる。

親株細胞または親個体が生産する抗体組成物よりも ADCC活性が高い抗体組成物 としては、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合 型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合してい ない糖鎖の割合が、 親株細胞または親個体が生産する抗体組成物の該割合よりも 高いものがあげられる。 具体的には、 該割合が 2倍以上、 好ましくは 3倍以上、 より好ましくは 5倍以上、 特に好ましくは 10倍以上高い抗体組成物があげられ、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する N-グリコシド結合複合型糖鎖の全て が、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が結合して いない糖鎖である抗体組成物が最も好ましい。

上述の糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合が 1 0 0 %である抗体組成物、 または抗体組成物中に含まれる Fc領域に 結合する N -ダルコシド結合複合型糖鎖の全てが、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダル コサミンの 6位にフコースの 1位が結合していない糖鎖である抗体組成物として は、 後述 5に記載の糖鎖分析において、 フコースが実質的には検出できない程度 である場合をいう。

本発明により得られる抗体組成物において、 Fc領域に結合する全 N-グリコシド 結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結 合していない糖鎖の割合が、 親株または親個体が生産する抗体組成物よりも高い 場合、 本発明により得られる抗体組成物は、 親株または親個体が生産する抗体分 子からなる抗体組成物より高い ADCC活性を有する。

ADCC活性とは、 生体内で、 腫瘍細胞等の細胞表面抗原などに結合した抗体が、 抗体 Fc領域とエフェクター細胞表面上に存在する Fc レセプターとの結合を介し てエフェクター細胞を活性化し、 腫瘍細胞等を障害する活性をいう [モノクロ一 ナル · ァンティボディズ: プリンシプルズ · アンド · アプリケーシヨンズ (Monoclonal Antibodies : Principles and Applications) , Wiley-Liss, Inc. , Capter 2. 1 (1995) ] 。 エフェクター細胞としては、 キラー細胞、 ナチュラルキラ 一細胞、 活十生ィ匕されたマクロファージ等があげられる。

N -ダリコシド結合複合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子からなる組成物中に含 まれる、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンにフコースが結合していない糖 鎖の割合は、 抗体分子からヒドラジン分解や酵素消化などの公知の方法 [生物化学 実験法 23—糖タンパク質糖鎖研究法 (学会出版センター) 高橋禮子編 (1989) ] を用い、 糖鎖を遊離させ、 遊離させた糠鎖を蛍光標識または同位元素標識し、 標 識した糖鎖をクロマトグラフィ一法にて分離することによつて決定することがで きる。 また、 遊離させた糖鎖を HPAED- PAD法 [ジャーナル ·ォブ.リキッド 'クロマ トグラフィー (J. Liq. Chromatogr. ) , 6, 1577 (1983) ]によって分析すること によっても決定することができる。

また、 本発明の抗体としては、 腫瘍関連抗原を認識する抗体、 アレルギーある レ、は炎症に関連する抗原を認識する抗体、 循環器疾患に関連する抗原を認識する 抗体、 自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、 またはウィルスあるいは細 菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、 抗体のクラスは IgGが好ましい。

腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、 抗 GD2 抗体 (Anticancer Res. , 13, 331-336, 1993) 、 抗 GD3 抗体 (Cancer Immunol. Immunother. , 36, 260-266, 1993) 、 抗 G M2 抗体 (Cancer Res. , 54, 1511-1516, 1994) 、 抗 HER2 抗体

(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992) 、 抗 CD52抗体 (Nature, 332, 323-327, 1988) 、 抗 MAGE抗体 (British J. Cancer, 83, 493 - 497, 2000) 、 抗 HMl. 24抗体 (Molecular Immunol. , 36, 387-395, 1999) 、 抗副甲状腺ホル モン関連蛋白 (PTHrP) 抗体 (Cancer, 88, 2909-2911, 2000) 、 抗 FGF8 抗体

(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911-9915, 1989) 抗塩基性繊維芽細胞増殖 因子抗体、 抗 FGF8受容体抗体 (J. Biol. Chem. , 265, 16455-16463, 1990) 、 抗 塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、 抗インスリ ン様増殖因子抗体 (J. Neurosci. Res., 40, 647-659, 1995) 、 抗ィンスリン様増殖因子受容体抗体 (J. Neurosci. Res. , 40, 647—659, 1995) 、 抗 PMSA抗体 (J. Urology, 160, 2396- 2401, 1998) 、 抗血管内皮細胞増殖因子抗体 (Cancer Res., 57, 4593-4599, 1997) 、 抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体 (Oncogene, 19, 2138-2146, 2000) 、 抗 CA125抗体、 抗 17-1A抗体、 抗ィンテグリン α ν /3 3抗体、 抗 CD33抗体、 抗 CD22抗体、 抗 HLA抗体、 抗 HLA-DR抗体、 抗 CD20抗体、 抗 CD19抗体、 抗 EGF受 容体抗体 ( Immunology Today、 21 (8)、 403-410 ( 2000 ) )、 抗 CD10 抗体

(American Journal of Clinical Pathology, 113, 374—382, 2000)などがあげら れる。

アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗インター ロイキン 6抗体 (Immunol. Rev. , 127, 5-24, 1992) 、 抗インターロイキン 6受 容体抗体 (Molecular Immunol. , 31, 371 - 381, 1994) 、 抗インターロイキン 5抗 体 (Immunol. Rev. , 127, 5-24, 1992) 、 抗インターロイキン 5受容体抗体、 抗 インターロイキン 4抗体 (Cytokine, 3, 562-567, 1991) 、 抗ィンターロイキン 4受容体抗体 (J. Immunol. Meth. , 217, 41-50, 1998) 、 抗腫瘍壌死因子抗体 (Hybridoma, 13, 183-190, 1994) 、 抗腫瘍壊死因子受容体抗体 (Molecular Pharmacol. , 58, 237-245, 2000 ) 、 抗 CCR 抗体 (Nature, 400, 776-780, 1999) 、 抗ケモカイン抗体 (J. Immunol. Meth. , 174, 249 - 257, 1994) 、 抗ケモ 力イン受容体抗体 (J. Exp. Med. , 186, 1373-1381, 1997) 、 抗 IgE抗体、 抗 CD23 抗体、 抗 CDlla 抗体 (Immunology Today、 21 (8)、 403-410 (2000) )、 抗 CRTH2抗体 (J Immunol. , 162, 1278-1286 (1999) )、 抗 CCR8抗体 (W099/25734)、 抗 CCR3抗体 (US6207155) などがあげられる。

循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗 GpIIb/IIIa抗体 (J. Immunol. , 152, 2968-2976, 1994) 、 抗血小板由来増殖因子抗体 (Science, 253, 1129—1132, 1991) 、 抗血小板由来増殖因子受容体抗体 (J. Biol. Chem. , 272, 17400-17404, 1997) または抗血液凝固因子抗体 (Circulation, 101, 1158-1164, 2000) などが挙げられる。

自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗自己 DNA 抗体

(Immunol. Letters, 72, 61-68, 2000) などが挙げられる。

ウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗 g p l20 抗体 (Structure, 8, 385 - 395, 2000) 、 抗 CD4 抗体 (J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998) 、 抗 CCR4抗体、 抗ベロ毒素抗体 (J. Clin. Microbiol. , 37, 396-399, 1999) 、 自己免疫疾患 (乾癬、 関節リウマチ、 クローン病、 潰瘍性大腸 炎、 全身性エリテマトーデス、 多発性硬化症など)、 抗 CDlla抗体、 抗 ICAM3抗体、 抗 CD80抗体、 抗 CD2抗体、 抗 CD3抗体、 抗 CD4抗体、 抗インテグリン α; 4 j3 7抗 体、 抗 CD40L 抗体、 抗 IL- 2 受容体抗体 (Immunology Today, 21 (8)、 403-410

(2000) ) などが挙げられる。

抗体分子としては、 抗体の Fc領域を含む分子であればいかなる分子も包含され る。 具体的には、 抗体、 抗体の断片、 Fc領域を含む融合タンパク質などがあげら れる。

抗体としては、 外来抗原刺激の結果、 免疫反応によって生体内に生産される蛋 白質で、 抗原と特異的に結合する活性を有するものであればいかなるものでもよ いが、 動物に抗原を免疫し、 免疫動物の脾臓細胞より作製したハイプリ ドーマ細 胞が分泌する抗体、 遺伝子組換え技術により作製された抗体、 すなわち、 抗体遺 伝子を揷入した抗体発現ベクターを、 宿主細胞へ導入することにより取得された 抗体などがあげられる。 具体的には、 ハイプリ ドーマが生産する抗体、 ヒ ト化抗 体、 ヒ ト抗体などをあげることができる。

ハイプリ ドーマは、 ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得された B細胞と、 マウス、 ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、 所望 の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をいう。

ヒト化抗体としては、 ヒト型キメラ抗体、 ヒト型 CDR移植抗体などがあげられ る。

ヒト型キメラ抗体は、 ヒト以外の動物の抗体 H鎖 V領域 (以下、 HVまたは VH とも称す) および抗体 L鎖 V領域 (以下、 LVまたは VLとも称す) とヒト抗体の H 鎖 C領域 (以下、 CHとも称す) およぴヒト抗体の L鎖 C領域 (以下、 CL とも称 す) とからなる抗体を意味する。 ヒト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハ ムスター、 ゥサギ等、 ハイプリ ドーマを作製することが可能であれば、 いかなる ものも用いることができる。

ヒ ト型キメラ抗体は、 モノクローナル抗体を生産するハイプリ ドーマより、 VH および VLをコードする cDNAを取得し、 ヒト抗体 CHおよぴヒ ト抗体 CLをコード する遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗 体発現ベクターを構築し、 宿主細胞へ導入することにより発現させ、 製造するこ とができる。·

ヒト型キメラ抗体の CH としては、 ヒ トイムノグロブリン (以下、 hlg と表記す る) に属すればいかなるものでもよいが、 hlgG クラスのものが好適であり、 更に hlgG クラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3N hIgG4 といったサブクラスのいずれ も用いることができる。 また、 ヒト型キメラ抗体の CL としては、 hlgに属すれば いかなるものでもよく、 κクラスあるいは; Lクラスのものを用いることができる。 ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのァミノ 酸配列をヒ ト抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をいう。

ヒト型 CDR移植抗体は、 ヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR配列を任 意のヒト抗体の VHおよび VLの CDR配列に移植した V領域をコードする cDNAを構 築し、 ヒト抗体の CHおよびヒト抗体の CLをコードする遺伝子を有する宿主細胞 用発現ベクターにそれぞれ揷入してヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、 該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒ ト型 CDR移植抗体を発現させ、 製造することができる。

ヒト型 CDR移植抗体の CHとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、 更に hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 gG3、 hIgG といったサブクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型 CDR移 植抗体の CL としては、 hlgに属すればいかなるものでもよく、 κクラスあるいは えクラスのものを用いることができる。

ヒ ト抗体は、 元来、 ヒ ト体内に天然に存在する抗体をいうが、 最近の遺伝子ェ 学的、 細胞工学的、 発生工学的な技術の進歩により作製されたヒ ト抗体ファージ ライブラリーならびにヒ ト抗体生産トランスジエニック非ヒ ト動物あるいはヒ ト 抗体生産トランスジエニック植物から得られる抗体等も含まれる。

ヒ ト体内に存在する抗体は、 例えば、 ヒ ト末梢血リンパ球を単離し、 EB ウィル ス等を感染させ不死化、 クローユングすることにより、 該抗体を生産するリンパ 球を培養でき、 培養物中より該抗体を精製することができる。 ヒ ト抗体ファージライブラリ一は、 ヒ ト B細胞から調製した抗体遺伝子をファ ージ遺伝子に挿入することにより Fab、 一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面 に発現させたライブラリーである。 該ライブラリーより、 抗原を固定化した基質 に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現して いるファージを回収することができる。 該抗体断片は、 更に遺伝子工学的手法に より、 2本の完全な H鎖および 2本の完全な L鎖からなるヒト抗体分子へも変換 することができる。

ヒト抗体生産トランスジエニック非ヒト動物は、 ヒト抗体遺伝子が細胞内に組 込まれた非ヒト動物をいう。 具体的には、 マウス胚性幹細胞へヒト抗体遺伝子を 導入し、 該胚性幹細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、 発生させることによりヒ ト抗体生産トランスジヱニック動物を作製することができる。 また、 動物の受精 卵にヒト抗体遺伝子を導入し、 該受精卵を発生させることにヒ ト抗体生産トラン スジヱニック非ヒト動物を作製することもできる。 ヒト抗体生産トランスジェ- ック非ヒ ト動物からのヒト抗体の作製方法は、 通常のヒト以外の哺乳動物で行わ れているハイプリ ドーマ作製方法によりヒト抗体生産ハイプリ ドーマを得、 培養 することで培養物中にヒト抗体を生産蓄積させることができる。

トランスジエニック非ヒト動物としては、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 プタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 ニヮトリ、 サルまたはゥサギ等があげられる。

また、 本発明において、 抗体が、腫瘍関連抗原を認識する抗体、 アレルギーある 、は炎症に関連する抗原を認識する抗体、 循環器疾患に関連する抗原を認識する 抗体、 自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体、 またはウィルスあるいは細 菌感染に関連する抗原を認識する抗体であることが好ましく、 抗体のクラスが IgGのヒト抗体が好ましい。

抗体の断片は、 上記抗体の少なくとも Fc領域の一部を含んだ断片をいう。 Fc 領域とは、 抗体の H鎖の C末端側の領域、 CH2領域および CH3領域を意味し、 天 然型およびその変異型を包含する。 少なくとも Fc領域の一部とは、 好ましくは CH2領域を含む断片、 より好ましくは CH2領域内に存在する 1番目のァスパラギ ン酸を含む領域をいう。 IgG クラスの Fc 領域は、 力パット (Kabat) らの EU Index [シーケンシズ ·ォブ ·プロテインズ ·ォブ 'ィムノロジカル ·インタレス 卜 (Sequences of Proteins of Immunological Interest^ , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ] のナ ンバリングで 226番目の Cysから C末端、 あるいは 230番目の Proから C末端ま でを意味する。 抗体の断片としては、 H鎖の単量体、 H鎖の 2量体などがあげられ る。

Fc領域の一部を有する融合蛋白質とは、 抗体の Fc領域の一部を含んだ抗体あ るいは抗体の断片と、 酵素、 サイト力インなどの蛋白質とを融合させた物質 (以 下、 Fc融合蛋白質と称す) を意味する。

以下、 本発明を詳細に説明する。

1. 本発明の細胞の作製

本発明の細胞は、 以下に述べる手法により作製することができる。

(1) 酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壌の手法

本発明の細胞は、 α 1, 6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、 遺伝子破壊の 方法を用いることにより作製することができる。 Ν -グリコシド結合複合型糖鎖還 元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する酵素とし ては、 具体的には a l, 6-フコシルトランスフェラーゼ、 a -L-フコシダーゼなどが あげられる。

遺伝子破壊の方法としては、 標的とする酵素の遺伝子を破壌することができる 方法であればいかなる方法も包含される。 その例としては、 相同組換え法、 RNA - DNA oligonucleotide (R D O) 法、 レトロウイ/レスを用いた方法、 トランスポゾ ンを用いた方法等があげられる。 以下これらを具体的に説明する。

( a ) 相同組換え法による本発明の抗体生産細胞の作製

本発明の細胞は、 ひ 1, 6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、 染色体上の標 的遺伝子を相同糸且換え法を用い改変することによって作製することができる。

染色体上の標的遺伝子の改変は、 Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor laboratory Press (1994) (以下、 「マ二ピュレイティング'ザ'マウス'ェンブリオ ·ァ ·ラボラトリ一' マ-ユアノレ」と略す) 、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 バイオマニュアルシリーズ 8 ジーンターゲッ ティング, E S細胞を用いた変異マウスの作製,羊土社 (1995) (以下、 「E S細胞 を用いた変異マウスの作製」と略す) 等に記載の染色体工学の手法を用い、 例えば 以下のように行うことができる。 a 1,6-フコース修飾酵素の c DNAを取得する。

取得した c DNAの塩基配列に基づき、 al,6 -フコース修飾酵素のゲノム DN Aを調製する。

該ゲノム DN Aの塩基配列にも基づき、 改変する標的遺伝子 (例えば、 al,6- フコース修飾酵素の構造遺伝子、 あるいはプロモーター遺伝子) を相同組換えす るためのターゲットベクターを作製する。

作製したターゲットベクターを宿主細胞に導入し、 標的遺伝子とターゲットべ クタ一の間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、 本発明の宿主細 胞を作製することができる。

宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする a 1,6-フコース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることが できる。 具体的には、 後述の 3. に記載の細胞があげられる。

a 1, 6-フコース修飾酵素の cDNAおよびゲノム DNAを取得する方法として は、 例えば、 以下に記載の方法があげられる。 c DNAの調製方法

各種宿主細胞から全 RN Aまたは mRN Aを調製する。

調製した全 RNAまたは mRNAから c DNAライブラリーを作製する。

a 1, 6-フコース修飾酵素の既知アミノ酸配列、 例えばヒ トのアミノ酸配列、 に 基づいて、 デジエネレイティブプライマーを作製し、 作製した c DNAライブラ リーを鎵型として P CR法にて、 a 1, 6-フコース修飾酵素をコードする遺伝子断 片を取得する。

取得した遺伝子断片をプローブとして用い、 c DNAライブラリーをスクリー ユングし、 a 1, 6-フコース修飾酵素をコードする c DNAを取得することができ る。

各種宿主細胞の m R N Aは、 市販のもの(例えば Clontech社製)を用いてもよい し、 以下のごとく各種宿主細胞から調製してもよい。 各種宿主細胞から全 RN A を調製する方法としては、 チォシアン酸グァニジン一トリフルォロ酢酸セシウム 法 [メソッズ ·イン ·ェンザィモロジ一 (Methods in Enzymology) , 154, 3 (1987) ] 、 酸性チォシアン酸グァ-ジン ' フヱノール ' クロ口ホルム (AGP C) 法 [アナリティカル 'パイオケミストリー(Analytical Biochemistry), 162, 156 (1987); 実験医学、 9, 1937 (1991)] などがあげられる。 また、 全 RNAから p o l y (A) + RN Aとして mRNAを調製する方法とし ては、 オリゴ (dT) 固定化セルロースカラム法 (モレキュラー ·クローユング 第 2版) 等があげられる。

さらに、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 社製) 、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製) などのキットを用いることにより mR N Aを調製することができる。

調製した各種宿主細胞 mRNAから c DNAライプラリーを作製する。 c DN Aライブラリ一作製法としては、 モレキュラー 'クローニング第 2 版、 カレン 卜 -プロ卜コールズ ·イン ·モレキュラー -ノ ィォロジ一、 A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989)等に記載された方法、 あるいは市販のキット、 例えば Superscript Plasmid System ior cDNA Synthesis and Plasmia C丄 oning (Life Technologies 社製) 、 ZAP- cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE社製) を用いる方法などがあげら れる。

c DNAライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、 大腸 菌 K12株中で自立複製できるものであれば、 ファージベクター、 プラスミ ドべク ター等いずれでも使用できる。 具体的には、 ZAP Express [STRATAGENE社製、 ス トラテジーズ(Strategies), 5, 58 (1992)] 、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイ ック ' アシッ ド ' リサーチ(Nucleic Acids Research) , 17, 9494 (1989) ] 、 Lambda ZAP II (STRATAGENE社製) 、 ; LgtlO、 ^gtll [ディーェヌエー 'クロー ニ ング ' ァ · プラクティカノレ ' アプローチ(DNA cloning, A Practical Approach) , 1, 9 (1985)] 、 XTriplEx (Clontech社製) 、 ExCell (Pharmacia 社製) 、 pT7T318U (Pharmacia社製) 、 pcD2 [モレキュラー 'セルラー 'バイオ ロジー(Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)] および pUC18 [ジーン(Gene), 33, 103 (1985)] 等をあげることができる。

cDNA ライプラリーを作製するための宿主微生物としては、 微生物であればいず れでも用いることができるが、 好ましくは大腸菌が用いられる。 具体的には、 Escherichia coli XL1 - Blue MRF' [ STRATAGENE 社製、 ス ト ラテ ジーズ (Strategies), 5, 81 (1992) ] 、 Escherichia coli C600 [ジヱネテイ クス (Genetics), 39, 440 (1954) ] 、 Escherichia coli Y1088 [サイ エンス (Science), 222, 778 (1983)] 、 Escherichia coli Y1090 [サイエンス(Science), 222, 778 (1983) ] 、 Escherichia coli NM522 [ジヤーナノレ 'ォブ ·モレキユラ 一'バイオロジー(J. Mol. Biol.), 166, 1 (1983) ] 、 Escherichia coli K802 [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオ口ジー(J. Mol. Biol.), 16, 118 (1966)] および Escherichia coli JM105 [ジーン(Gene), 38, 275 (1985)] 等が 用いられる。

この cDNAライプラリーを、 そのまま以降の解析に用いてもよいが、 不完全 長 c DNAの割合を下げ、 なるべく完全長 c DNAを効率よく取得するために、 菅野らが開発したオリゴキャップ法 [ジーン(Gene), 138, 171 (1994); ジーン (Gene) , 200, 149 (1997); 蛋白質核酸酵素, 41, 603 (1996); 実験医学, 11, 2491 (1993); c DN Aクローニング(羊土社)(1996); 遺伝子ライブラリーの作 製法(羊土社) (1994)] を用いて調製した cDNAライブラリーを以下の解析に用 いてもよい。

al, 6-フコース修飾酵素のアミノ酸配列に基づいて、 該アミノ酸配列をコード することが予測される塩基配列の 5'端および 3'端の塩基配列に特異的なデジエネ レイティブプライマーを作製し、 作製した cDNAライプラリーを錶型として P CR法 [ピーシーアール 'プロ トコールズ(PCR Protocols), Academic Press (1990)] を用いて DNAの増幅を行うことにより、 ひ 1, 6-フコース修飾酵素をコ 一ドする遺伝子断片を取得することができる。

取得した遺伝子断片が α 1,6 -フコース修飾酵素をコードする DN Αであること は、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー (Sanger) らのジデォキ シ法 [プ口シーディンダス'ォブ 'ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] あるいは AB I PR I S M377DNAシークェンサ一 (PE Biosystems社製) 等の塩基配列分析装置を用い て分析することにより、 確認することができる。

該遺伝子断片を DNAプローブとして、 各種宿主細胞に含まれる mRNAから 合成した c DNAあるいは c DNAライブラリ一対してコロニーハイブリダィゼ ーションゃプラークハイブリダイゼーション (モレキュラー ·クローニング第 2 版) を行うことにより、 al, 6 -フコース修飾酵素の DNAを取得することができ る。

また、 《1,6-フコース修飾酵素をコードする遺伝子断片を取得するために用い たプライマーを用い、 各種宿主細胞に含まれる mRNAから合成した c DNAあ るいは c DN Aライブラリーを铸型として、 P CR法を用いてスクリーユングを 行うことにより、 al, 6 -フコース修飾酵素の DN Aを取得することもできる。 取得したひ 1, 6-フコース修飾酵素をコードする D Ν Αの塩基配列を末端から、 通常用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー (Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーデイングス'ォブ ·ザ ·ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] あるいは AB I P R I SM377D N Aシークェンサ一 (PE Biosystems社製) 等の塩基配列分析装置を用いて分析 することにより、 該 DN Aの塩基配列を決定する。

決定した c DN Aの塩基配列をもとに、 B LAST等の相同性検索プログラム を用いて、 Ge nB a n k、 EMB Lおよび D D B Jなどの塩基配列データべ一 スを検索することにより、 データベース中の遺伝子の中で a 1,6-フコース修飾酵 素をコードしている遺伝子を決定することもできる。

上記の方法で得られるひ 1, 6 -フコース修飾酵素をコードしている遺伝子の塩基 配列としては、 例えば、 配列番号 1または 2に記載の塩基配列が挙げられる。 決定された DN Aの塩基配列に基づいて、 フォスフォアミダイト法を利用した パーキン ·エルマ一社製の DN A合成機 model 392等の D N A合成機で化学合成 することにより、 1, 6 -フコース修飾酵素の c DNAを取得することもできる。 α1, 6-フコース修飾酵素のゲノム DNAを調製する方法としては、 例えば、 以 下に記載の方法が挙げられる。 ゲノム DN Αの調製方法

ゲノム DNAを調製する方法としては、 モレキュラー ·クロー-ング第 2版や カレント ·プロ トコールズ 'イン 'モレキュラー ·バイオロジー等に記載された 公知の方法があげられる。 また、 ゲノム DNAライブラリースクリーニングシス テム (Genome Systems 社製) や Universal GenomeWalker™ Kits (CL0NTECH 社 製) などを用いることにより、 cκl,6-フコース修飾酵素のゲノムDNAを単離す ることもできる。

上記の方法で得られる α1, 6-フコース修飾酵素のゲノム DNAの塩基配列とし て、 例えば配列番号 3に記載の塩基配列があげられる。

標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 ノ^ィ才 マニュアルシリーズ 8 ジーンターゲッティング, E S細胞を用いた変異マウスの 作製(羊土社)(19%)等に記載の方法にしたがって作製することができる。 ターゲ ットベクターは、 リプレースメント型、 インサーシヨン型いずれでも用いること ができる。

各種宿主細胞へのターゲットベクターの導入には、 後述の 3. に記載の各種細 胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。

相同組換え体を効率的に選別する方法として、 例えば、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 ノヽづォマ -ュアルシリーズ 8 ジーンターゲッティング, E S細胞を用いた変異マウスの作 製(羊土社)(1995)等に記載のポジティブ選択、 プロモーター選択、 ネガティブ選 択、 ポリ A選択などの方法を用いることができる。 選別した細胞株の中から目的 とする相同組換え体を選択する方法としては、 ゲノム D N Aに対するサザンハイ プリダイゼーシヨン法 (モレキュラー ·クローニング第 2版) や P C R法 [ピー シーアール ·プロトコールズ(PCR Protocols) , Academic Press (1990) ] 等があ げられる。

また、 N -ダリコシド結合糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位とフコ ースの 1位が α結合する糖鎖修飾に係わる酵素活性の変化を指標として、 相同組 換え体を取得することもできる。 具体的な方法としては、 例えば、 以下に記載の 形質転換体を選択する方法が挙げられる。 形質転換体を選択する方法

a 1, 6 -フコース修飾酵素の活性が低下または欠失した細胞を選択する方法とし ては、 文献 if生化学実験講座 3—糖質 I,糖タンパク質 (東京化学同人)日本生化 学会編(1988) ] 、 文献 [細胞工学, 別冊, 実験プロトコールシリーズ,グライコバ ィォロジー実験プロトコール,糖タンパク質 ·糖脂質.プロテオグリカン (秀潤社)谷 口直之 .鈴木明美 '古川清 ·营原一幸監修 (1996) ] 、 モレキュラー.クローニン グ第 2版、 カレント 'プロ トコールズ'イン'モレキユラ一'バイオロジー等に記載 された生化学的な方法あるいは遺伝子工学的な方法などがあげられる。 生化学的 な方法としては、 例えば、 酵素特異的な基質を用いて酵素活性を評価する方法が あげられる。 遺伝子工学的な方法としては、 例えば、 酵素遺伝子の m R N A量を 測定するノーザン解析や R T— P C R法等があげられる。

レクチン耐性細胞であることを確認する方法としては、 GDP -フコース合成酵素、 α 1, 6 -フコース修飾酵素または GDP-フコース輸送蛋白質の発現を確認する方法、 直接レクチンを加えた培地に細胞を培養する方法などがあげられる。 具体的には 細胞内の 《1, 6-フコース修飾酵素の一つである a 1, 6-フコシルトランスフェラー ゼの mRNAの発現量を測定し、 mRNAの発現が低下していればレクチン耐性の細胞 であるといえる。

また、 a 1, 6-フコース修飾酵素の活性が低下した結果生じる形質の変化を指標 に細胞を選択する方法としては、 例えば、 生産抗体分子の糠鎖構造を指標として 形質転換体を選択する方法や、 細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形 質転換体を選択する方法などが挙げられる。 生産抗体分子の糖鎖構造を指標とし て形質転換体を選択する方法としては、 後述の 5. に記載の方法が挙げられる。 細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法として は、 N-グリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位とフコース の 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法 を挙げることができる。 その具体的な例としては、 ソマテイク 'セル'アンド 'モレ キュラー 'ジエネテイクス (Somatic Cell ol. Genet. ) , 12, 51 (1986)等に記 載のレクチンを用いた方法が挙げられる。

レクチンとしては、 N-ダリコシド結合糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミン の 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンであればいず れのレクチンでも用いることができるが、 レンズマメレクチン L C A (Lens Culinaris 由来の Lentil Agglutinin) 、 エンドゥマメレクチン P S A (Pi sum sativum 由来の Pea Lectin) 、 ソラマメレクチン V F A (Vicia faba 由来の Agglutinin) 、 ヒ ロチャワンタケレクテン A A L (Aleuria aurantia 由来の Lectin) 等が好ましい。

具体的には、 数 10 g /m 1〜: 10m g /m 1、 好ましくは 0. 5〜2· 0m g /m 1 の濃度の上述のレクチンを含む培地にで 1日〜2週間、 好ましくは 3日〜1週間培 養し、 生存している細胞を継代培養あるいはコロニーを採取後、 別の培養器に移 し、 さらに引き続きレクチンを含む培地で培養を続けることで、 本発明の宿主細 胞を選択することができる。

( b ) R D O方法による本発明の細胞の作製

' 本発明の細胞は、 《1, 6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、 R D O法を用 い、 例えば、 以下のように作製することができる。

ひ 1, 6-フコース修飾酵素の c D NAあるいはゲノム D N Aを調製する。

調製した c D NAあるいはゲノム D NAの塩基配列を決定する。 決定した DNAの配列に基づき、 al, 6-フコース修飾酵素をコードする部分、 非翻訳領域の部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さの RDOのコンスト ラクトを設計し合成する。

合成した RDOを宿主細胞に導入し、 標的とした酵素、 すなわち α1,6-フコー ス修飾酵素に変異が生じた形質転換体を選択することにより、 本発明の細胞を作 製することができる。

宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする α 1,6-フコース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることが できる。 具体的には、 後述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。

各種宿主細胞への R DOの導入には、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適し た組み換えベクターの導入方法を用いることができる。

αΐ, 6 -フコース修飾酵素の c DNAを調製する方法としては、 例えば、 上記 1 の (1) の (a) に記載の 「cDNAの調製方法」 などがあげられる。

al,6 -フコース修飾酵素のゲノム DNAを調製する方法としては、 例えば、 上 記 1の (1) の (a) に記載の 「ゲノム DN Aの調製方法」 などがあげられる。

DN Aの塩基配列は、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene社製) 等のプラスミドにクローニングし、 通常用いられる塩基配列 解析方法、 例えば、 サンガー (Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーデイング ス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.), 74, 5463 (1977)] 等の反応を行い、 塩基配列自動分析装置、 例 えば、 A. L. F. DNA シークェンサ一 (Pharmacia社製) 等を用いて解析すること で該 DNAの塩基配列を決定することができる。

RDOは、 常法または DN A合成機を用いることにより調製することができる。

RDOを宿主細胞に導入し、 標的とした酵素、 α1, 6-フコース修飾酵素の遺伝 子に変異が生じた細胞を選択する方法としては、 モレキュラー 'クローニング第 2 版、 カレント 'プロトコールズ'イン'モレキュラー'バイオロジー等に記載された 染色体上の遺伝子の変異を直接検出する方法があげられる。

また、 上記 1の (1) の (a) に記載の、 α 1,6-フコース修飾酵素活性の変化を 指標とした 「形質転換体を選択する方法」 を用いることもできる。

RDOのコンストラク トは、 サイエンス(Science), 273, 1386, (1996); ネィ チヤ一 · メ デイ シン(Nature Medicine), 4, 285, (1998); へパ ト ロ ジー (Hepatology) , 25, 1462, (1997); ジーン 'セラピー(Gene Therapy), 5, 1960, (1999); ジーン ·セラピー(Gene Therapy), 5, I960, (1999); ジャーナル 'ォ ブ .モレキュラー 'メディシン(J. Mol. Med. ) , 75, 829, (1997); プロシーディ ングス 'ォブ 'ザ 'ナショナノレ'アカデミー'ォブ 'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8774, (1999); プロシーディンダス 'ォブ ·ザ'ナショナル'ァカデ ミー'ォプ'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8768, (1999); ヌク レイツク 'アシッド ' リサーチ(Nuc. Acids. Res. ) , 27, 1323, (1999); インべ スティゲーシヨン ·ォブ ' ダーマトロジー(Invest. Dematol. ), 111, 1172, (1998); ネイチヤー . バイオテクノロジー(Nature Biotech.), 16, 1343, (1998); ネイチヤー 'バイオテクノロジー(Nature Biotech.), 18, 43, (2000); ネイチヤー 'バイオテクノロジー(Nature Biotech. ), 18, 555, (2000)等の記載 に従って設計することができる。

(c) トランスポゾンを用いた方法による、 本発明の細胞の作製

本発明の細胞は、 ネイチヤー 'ジエネテイク(Nature Genet.), 25, 35, (2000) 等に記載のトランスポゾンのシステムを用い、 α 1,6-フコース修飾酵素の活性、 あるいは生産抗体分子または細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に突然変 異体を選択することで、 本発明の細胞を作製することができる。

トランスポゾンのシステムとは、 外来遺伝子をランダムに染色体上に揷入させ ることで突然変異を誘発させるシステムであり、 通常、 トランスポゾンに揷まれ た外来遺伝子を突然変異を誘発させるベクターとして用い、 この遺伝子を染色体 上にランダムに揷入させるためのトランスポゼースの発現べクタ一を同時に細胞 の中に導入する。

トランスポゼ一スは、 用いるトランスポゾンの配列に適したものであればいか なるものも用いることができる。

外来遺伝子としては、 細胞の DNAに変異を誘起するものであればいかなる遺 伝子も用いることができる。

細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする α1,6_フ コース修飾酵素の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述の 3. に記載の宿主細胞があげられる。

本発明の細胞を宿主細胞として抗体分子をコードする遺伝子を導入するには、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適した組み換えベクターの導入方法を用いる ことができる。 α 1, 6 -フコース修飾酵素の活性を指標として突然変異体を選択する方法として は、 例えば、 上記 1の (1) の (a ) に記載の、 a l,6-フコース修飾酵素活性の変 化を指標とした 「形質転換体を選択する方法」 が挙げられる。

( d ) ァンチセンス法又はリボザィム法による本発明の細胞の作製

本発明の細胞は、 (¾ 1, 6—フコース修飾酵素をコードしている遺伝子を標的 とし、 細胞工学, 12, 239, (1993)、 バイオ Zテクノロジー(BI0/TECHN0L0GY) , 17, 1097, (1999)、 ヒユーマン ·モレキュラー · ジエネティタス(Hum. Mol. Genet. ) , 5, 1083, (1995)、 細胞工学, 1¾ 255, (1994) 、 プロシーディングス 'ォブ ·ザ' ナショナル'ァカデミ' ~ ·ォブ ·サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 96, 1886 (1999)等に記載されたアンチセンス法又はリボザィム法を用いて、 例えば、 以下のように作製することができる。

標的遺伝子の c D NAあるいはゲノム D NAを調製する。

調製した c D N Aあるいはゲノム D N Aの塩基配列を決定する。

決定した D N Aの配列に基づき、 標的遺伝子の翻訳領域の部分、 非翻訳領域の 部分あるいはイントロン部分を含む適当な長さのアンチセンス遺伝子またはリボ ザィムのコンストラタトを設計する。

該アンチセンス遺伝子、 またはリボザィムを細胞内で発現させるために、 調製 した D N Aの断片、 または全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷 入することにより、 組換えベクターを作製する。

該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り形質転換体を得る。

標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択すること により、 本発明の細胞を得ることができる。 また、 細胞膜上の糖タンパク質の糖 鎖構造または産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択することに より、 本発明の細胞を得ることもできる。

本発明の細胞を作製するために用いられる宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞など、 標的とする遺伝子を有しているものであればいずれも 用いることができる。 具体的には、 後述の 3 . に記載の宿主細胞が挙げられる。 発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 設計したアンチセンス遺伝子、 またはリボザィムを転写 できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述 の 3 . に記載の発現ベクターがあげられる。

各種宿主細胞への遺伝子の導入方法としては、 後述の 3 . に記載の各種宿主細 胞に適した組換えベクターの導入方法を用いることができる。

標的遺伝子の c D NA及ぴゲノム D N Aを取得する方法としては、 例えば、 上 記 1の (1 ) の (a ) に記載の 「c D N Aの調製方法」 及び 「ゲノム D N Aの調 製方法」 などがあげられる。

標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法 としては、 上記 1の (1 ) の (a ) に記載の 「形質転換体を選択する方法」 があ げられる。

また、 標的遺伝子がコードする蛋白質の活性が低下した結果生じる形質の変化 を指標に細胞を選択する方法としては、 例えば、 産生抗体分子の糖鎖構造を指標 として形質転換体を選択する方法や、 細胞表面上の糖蛋白質の糖鎖構造を指標と して形質転換体を選択する方法などが挙げられる。 産生抗体分子の糖鎖構造を指 標として形質転換体を選択する方法としては、 後述の 5 . に記載の方法が挙げら れる。 細胞表面上の糠蛋白質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法 としては、 上述の、 N—グリコシド結合糖鎖還元末端の N—ァセチルダルコサミ ンの 6位とフコースの 1位が α結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性であ る株を選択する手法を挙げることができる。 その具体的な例としては、 ソマティ ク.セノレ.アンド.モレキュラー.ジエネテイクス (Somatic Cell Mol. Genet. ) , 12, 51, (1986)等に記載のレクチンを用いた方法が挙げられる。

また、 発現ベクターを用いず、 標的遺伝子の塩基配列に基づいて設計したアン チセンスオリゴヌクレオチドまたはリポザィムを、 直接宿主細胞に導入すること で、 本発明の細胞を得ることもできる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザィムは、 常法または D N A合成 機を用いることにより調製することができる。 具体的には、 標的遺伝子の c D N Aおよびゲノム D N Aの塩基配列のうち、 連続した 5〜1 5 0塩基、 好ましくは 5〜6 0塩基、 より好ましくは 1 0〜4 0塩基に相当する配列を有するオリゴヌ クレオチドの配列情報に基づき、 該オリゴヌクレオチドと相補的な配列に相当す るオリゴヌクレオチド (アンチセンスオリゴヌクレオチド) または該オリゴヌク レオチドの配列を含むリボザィムを合成することで調製することができる。 オリゴヌクレオチドとしては、 オリゴ R NAおよび該オリゴヌクレオチドの誘 導体 (以下、 オリゴヌクレオチド誘導体という) 等があげられる。

オリゴヌクレオチド誘導体としては、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステ ル結合がホスフォロチォエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 ォ リゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合が N 3 '— P 5 'ホスフォアミデート 結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリポース とリン酸ジエステル結合がぺプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘 導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C一 5プロピニルゥラシルで置換され たォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のゥラシルが C一 5チアゾ ールゥラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中の シトシンが C一 5プロピニルシトシンで置換されたォリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のシトシンがフエノキサジン修飾シトシン (phenoxazine- modified cytosine) で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチ ド中のリボースが 2 ' _ O—プロピルリボースで置換されたォリゴヌクレオチド誘 導体、 あるいはオリゴヌクレオチド中のリポースが 2 '—メ トキシエトキシリボー スで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等があげられる [細胞工学, 1^, 1463 (1997) ] 。

( e ) R NA i方法による本発明の細胞の作製

本発明の細胞は、 本発明の蛋白質をコードする遺伝子を標的とし、 R N A i (RNA interference) 法を用い、 例えば、 以下のように作製することができる。 R NA i法とは、 2本鎖の RNAを細胞中に導入して、 細胞中に存在する該 R Aの配列 に相同な mRNAを分解破壌し、 遺伝子発現を抑える方法をいう。

標的遺伝子の c D N Aを調製する。

調製した c D NAの塩基配列を決定する。

決定した D N Aの配列に基づき、 標的遺伝子の翻訳領域の部分ある ヽは非翻訳 領域の部分を含む適当な長さの R NA i遺伝子のコンストラクトを設計する。 該 R NA i遺伝子を細胞内で発現させるために、 調製した D NAの断片、 また は全長を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、 組換 えベクターを作製する。

該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り形質転換体を得る。 標的遺伝子がコードする蛋白質の活性、 あるいは産生抗体分子または細胞表面 上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、 本発明の細 胞を得ることができる。

宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的遺伝子を有 しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述の 3. に 記載の宿主細胞があげられる。

発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 設計した RNA i遺伝子を転写できる位置にプロモータ 一を含有しているものが用いられる。 具体的には、 ポリメラーゼ IIIにより転写が 行われるタイプの発現ベクターあるいは後述の 3. に記載の発現ベクターがあげ られる。

各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述の 3. に記載の各種宿主細胞に適し た組換えべクターの導入方法を用レ、ることができる。

標的遺伝子がコードする蛋白質の活性を指標として形質転換体を選択する方法、 あるいは、 細胞膜上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択す る方法としては、 例えば、 前記 1の (1) の (a) に記載の方法が挙げられる。 また、 産生抗体分子の糖鎖構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述の 5. に記載の方法が挙げられる。

標的遺伝子がコードする蛋白質の c DN Aを調製する方法としては、 例えば、 前記 1の (1) の (a) に記載された 「cDNAの調製方法」 などがあげられる。 また、 発現ベクターを用いず、 標的遺伝子の塩基配列に基づいて設計した RN A i遺伝子を、 直接宿主細胞に導入することで、 本発明の細胞を得ることもでき る。

RNA i遺伝子は、 常法または DNA合成機を用いることにより調製すること ができる。

R N A i遺伝子のコンス トラク トは、 [ネイチヤー(Nature), 391, 806, (1998); プロシ一ディングス 'ォブ 'ザ'ナショナル'ァカデミ' ~·ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 15502, (1998); ネイチヤー(Nature), 395, 854, (1998); プロシーディングス 'ォブ 'ザ'ナショナル'ァカデミ一'ォプ.サイエ ンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049, (1999); セル(Cell), 95, 1017, (1998); プロシーディングス 'ォブ ·ザ.ナショナル ·アカデミー ·ォブ.サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 1451, (1999); プ口シーデイングス.ォブ . ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 95, 13959, (1998) ; ネイチヤー 'セル 'パイォォロジー(Nature Cell Biol. ), 2, 70, (2000) ]等の記載に従って設計することができる。

本発明の RNAi法に用いられる R Aとしては、 N -ダリコシド結合複合型糖鎖還元末 端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関 与する酵素蛋白質をコードする DNAに対応する RNAがあげられる。 好ましくは Ν -グ リコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位力 S α結合する糖鎖修飾に関与する酵素蛋白質が、 ひ 1, 6 -フコシルトランスフ エラーゼである DNAに対応する RNAがあげられる。

本発明の R N A i法で使用される RNA としては、 R NAおよびその相捕 R NA で構成され、 かつ a l, 6-フコシルトランスフェラーゼの m R NA量を減少させる ことが可能な 2本鎖 RNA であればいかなるものでもよいが、 RNA の長さとしては、 好ましくは 1 〜 3 0、 より好ましくは 5〜 2 9、 さらに好ましくは 1 0〜 2 9、 最も好ましくは 1 5〜 2 9の連続した RNAがあげられる。

( 2 ) ドミナントネガティブ体を導入する手法による、 本発明の細胞の作製 本発明の細胞は、 1, 6—フコース修飾酵素を標的とし、 該蛋白質のドミナ ントネガティブ体を導入する手法を用いることにより作製することができる。

ドミナントネガティブ体の具体的な例として、 細胞内糖ヌクレオチド GDP -フコ ースのゴルジ体への輸送に関与する蛋白質の例が挙げられる。

細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターは、 小胞体及びゴルジ体の膜上にお いてダイマーを形成して機能していることが知られている [ジャーナル ·ォブ ·バ ィォロジカル 'ケミストリー(J. Biol. Chem. ) , 275, 17718, 2000]。 また、 細 胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を細胞内で強制発現させること により、 野生型トランスポーターとヘテロダイマーを形成し、 形成したヘテロダ イマ一は野生型ホモダイマーに対して阻害活性を示すことが報告されている [ジャ ーナル ·ォブ ·バイオロジカル 'ケミストリー(J. Biol. Chem. ) , 275, 17718, 2000]。 従って、 細胞内糖ヌクレオチドのトランスポーターの変異体を作製し細胞 内に導入することで、 ドミナントネガティプ体として機能させることが可能であ る。 このような変異体の作製は、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント

•プロトコールズ 'イン'モレキュラー 'バイオロジー等に記載された部位特異 的変異導入法を用いて行うことができる。 本発明の細胞は、 上述のように作製したひ 1, 6—フコース修飾酵素のドミナ ントネガティブ体遺伝子を用い、 モレキュラー 'クローユング第 2版、 カレント' プロトコールズ'イン'モレキユラ' ~·バイオロジー、 マニピュレーティング ·マウ ス ·ェンブリオ第 2版等に記載された遺伝子導入の方法に従って、 例えば、 以下 のように作製することができる。

a 1 , 6—フコース修飾酵素のドミナントネガティブ体遺伝子を調製する。

調製したドミナントネガティブ体遺伝子の全長 D N Aをもとにして、 必要に応 じて、 該タンパク質をコードする部分を含む適当な長さの D NA断片を調製する。 該 D NA断片、 または全長 D NAを適当な発現ベクターのプロモーターの下流 に挿入することにより、 糸且換えベクターを作製する。

該組換えべクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り、 形質転換体を得る。

ひ 1, 6—フコース修飾酵素の活性、 あるいは産生抗体分子または細胞膜上の 糖タンパク質の糖鎖構造を指標に形質転換体を選択することで、 本発明の宿主細 胞を作製することができる。

宿主細胞としては、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 標的とする蛋白 質の遺伝子を有しているものであればいずれも用いることができる。 具体的には、 後述の 3 . に記載の宿主細胞があげられる。

発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中 への組み込みが可能で、 目的とするドミナントネガティブ体をコードする D N A を転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 具体的には、 後述の 3 . に記載の発現ベクターがあげられる。

各種宿主細胞への遺伝子の導入には、 後述の 3 . に記載の各種宿主細胞に適し た組み換えベクターの導入方法を用いることができる。

標的蛋白質の活性を指標として突然変異体を選択する方法、 あるいは、 細胞膜 上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として突然変異体を選択する方法としては、 例えば、 前記 1の (1 ) に記載の方法が挙げられる。 また、 産生抗体分子の糖鎖 構造を指標として形質転換体を選択する方法としては、 例えば、 後述の 4 . に記 載の方法が挙げられる。 (3) 酵素についての突然変異を導入する手法

本発明の細胞は、 1, 6-フコース修飾酵素の遺伝子について突然変異を導入し、 該酵素に突然変異を生じた所望の細胞株を選択する手法を用いることにより作製 することができる。

N -ダリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する酵素としては、 具体的にはひ 1, 6 -フコシルトランスフヱ ラーゼ、 ひ- L-フコシダーゼなどがあげられる。

具体的には、 1) 突然変異誘発処理で親株細胞を処理した突然変異体あるいは自 然発生的に生じた突然変異体から、 α 1, 6-フコース修飾酵素活性の変化を指標と して所望の細胞株を選択する方法、 2) 突然変異誘発処理で親株細胞を処理した突 然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、 生産抗体分子の糖鎖構造 を指標として所望の細胞株を選択する方法、 3) 突然変異誘発処理で親株細胞を処 理した突然変異体あるいは自然発生的に生じた突然変異体から、 該細胞の細胞膜 上の糖タンパク質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法などが挙 げられる。

突然変異誘発処理としては、 親株細胞の D N Aに点突然変異、 欠失あるいはフ レームシフト突然変異を誘起するものであればいかなる処理も用いることができ る。 具体的には、 ェチル二トロソゥレア、 ニトロソグァュジン、 ベンゾピレン、 アタリジン色素による処理、 放射線の照射などがあげられる。 また、 種々のアル キル化剤や発癌物質も突然変異誘発物質として用いることができる。 突然変異誘 発物質を細胞に作用させる方法としては、 例えば、 組織培養の技術第三版 (朝倉 書店) 日本組織培養学会編(1996)、 ネィチヤ一 ·ジヱネティクス (Nature Genet. ) , 24, 314, (2000)等に記載の方法を挙げることができる。

自然発生的に生じた突然変異体としては、 特別な突然変異誘発処理を施さない で、 通常の細胞培養の条件で継代培養を続けることによって自然発生的に生じる 突然変異体を挙げることができる。

α 1, 6 -フコース修飾酵素活性の変化を指標として所望の細胞株を選択する方法、 生産抗体分子の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法、 細胞膜上の 糖タンパク質の糖鎖構造を指標として所望の細胞株を選択する方法としては、 例 えば、 上記 1の (1) の (a ) に記載の、 α 1, 6-フコース修飾酵素活性の変化を指 標とした 「形質転換体を選択する方法」 が挙げられる。 ( 4 ) GDP -フコース輸送蛋白質の転写または翻訳を抑制する手法

本発明の宿主細胞は、 α ΐ , 6—フコース修飾酵素の遺伝子を標的とし、 アン チセンス RNA/DNA技術 [バイォサイエンスとィンダストリー, 50, 322 (1992)、 化 学 , , 681 (1991) 、 Biotechnology, 9, 358 (1992) 、 Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992)、 Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992)、 細胞 工学, l^, 1463 (1997) ] 、 ト リ プル · ヘ リ ッ ク ス技術 [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992) ] 等を用い、 標的とする遺伝子の転写または翻訳 を抑制することで作製することができる。

2. 本発明の、 トランスジエニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら子孫の作 製

本発明の、 抗体分子の糖鎖の修飾に係わる酵素の活性が制御されるようにゲノ ム遺伝子が改変されたトランスジエニック非ヒト動物あるいは植物またはそれら 子孫は、 α 1, 6-フコース修飾酵素の遺伝子を標的として、 1. に記載の手法を用い て作製した胚性幹細胞、 受精卵細胞、 または植物細胞より、 公知の方法を用い作 製することができる。

Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコ ースの 1位が α結合する酵素としては、 具体的には a 1, 6-フコシルトランスフエ ラーゼ、 a _L_フコシダーゼなどがあげられる。

具体的な方法について、 以下に記す。

トランスジェユック非ヒト動物の場合、 目的とする非ヒト動物、 例えばゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 プタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 ニヮトリ、 サル、 ゥサギ等の胚性 幹細胞に、 1. に記載の手法を用いることにより、 a l, 6-フコース修飾酵素の活性 が制御された本発明の胚性幹細胞を作製することができる。

具体例としては、 染色体上の a l, 6-フコース修飾酵素をコードする遺伝子を公 知の相同組換えの手法 [例えば、 Nature, 326, 6110, 295 (1987)、 Cell, 51, 3, 503 (1987)等] により不活化または任意の配列と置換した変異クローンなどがあ げられる。 作製した胚性幹細胞 (例えば、 該変異クローン) を用い、 動物の受精 卵の胚盤胞(blastocyst)への注入キメラ法または集合キメラ法等の手法により、 性幹細胞クローンと正常細胞からなるキメラ個体を調製することができる。 こ のキメラ個体と正常個体の掛け合わせにより、 全身の細胞で a 1, 6 -フコース修飾 酵素の活性が低下したトランスジェエック非ヒト動物を得ることができる。 標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターは、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 E S糸田月包 を用いた変異マウスの作製等に記載の方法にしたがって作製することができる。 ターゲットベクターは、 リプレースメント型、 インサーシヨン型、 ジーントラッ プ型いずれでも用いることができる。

胚性幹細胞へのターゲットベクターの導入方法としては、 動物細胞に DNA を導 入する方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレク ト口ポレーショ ン法 [サイ トテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990) ] 、 リン酸カルシ ゥム法 (特開平 2-227075)、 リボフヱクシヨン法 [プロシーディンダス 'ォブ 'ザ' ナショナル'ァカデミ ォブ'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 84, 7413 (1987) ] 、 インジェクション法 (マニピュレーティング 'マウス 'ェンプリ ォ第 2版) 、 パーティクルガン (遺伝子銃) を用いる方法 (日本特許第 2606856、 日本特許第 2517813)、 DEAE-デキストラン法 [バイオマニュアルシリーズ4一遺伝 子導入と発現 ·解析法 (羊土社) 横田崇 ·新井賢一編(1994) ] 、 ウィルスベクタ 一法 (マニピユレ一ティング 'マウス 'ェンブリオ第 2 版) 等をあげることがで きる。

相同組換え体を効率的に選別する方法として、 例えば、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 E S糸田胞 を用いた変異マウスの作製等に記載のポジティブ選択、 プロモーター選択、 ネガ ティブ選択、 ポリ A選択などの方法を用いることができる。 具体的には、 hprt遺 伝子を含むターゲットベクターの場合は、 hprt 遺伝子を欠損した胚性幹細胞に導 入後、 胚性幹細胞をァミノプテリン、 ヒポキサンチンおょぴチミジンを含む培地 で培養し、 アミノブテリン耐性の株を選別することにより、 hprt 遺伝子を含む相 同組換え体を選別するポジティブ選択を行なうことができる。 ネオマイシン耐性 遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、 ベクターを導入した胚性幹細胞を G418を含む培地で培養し、 G418耐性の株を選別することにより、 ネオマイシン耐 性遺伝子を含む相同組換え体を選別するポジティプ選択を行なうことができる。 DT遺伝子を含むターゲットベクターの場合は、 ベクターを導入した胚性幹細胞を 培養し、 生育してきた株を選別する (相同組換え以外のランダムに染色体に挿入 された組換え体は、 DT遺伝子が染色体に組み込まれて発現するため、 DTの毒性に より生育できない) ことにより、 DT遺伝子を含まない相同組換え体を選別するネ ガティブ選択を行なうことができる。 選別した細胞株の中から目的とする相同組 換え体を選択する方法としては、 ゲノム DNA に対するサザンハイブリダィゼーシ ョン法 (モレキュラー ·クローニング第 2版) や PCR法 [ピーシーアール ·プロ トコ一ルス、 (PCR Protocols) , Academic Press (1990) ] 等があげられる。

胚性幹細胞を集合キメラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、 一般に 8 細胞期以前の発生段階の受精卵を用いることが好ましい。 胚性幹細胞を注入キメ ラ法を用いて受精卵に取り込ませる場合には、 一般に 8細胞期から胚盤胞の発生 段階の受精卵を用いることが好ましい。

雌マウスへ受精卵を移植する場合には、 精管結紮雄非ヒト哺乳動物と交配させ ることにより、 受精能を誘起された偽妊娠雌マゥスに得られた受精卵を人工的に 移植および着床させる方法が好ましく、 偽妊娠雌マウスは自然交配によっても得 られる力 黄体形成ホルモン放出ホルモン (以下、 LHRH と略する) あるいはその 類縁体を投与後、 雄マウスと交配させることにより、 受精能を誘起された偽妊娠 雌マウスを得ることもできる。 LHRHの類縁体としては、 例えば [3, 5- Dil- Tyr5]- LHRH, [Gln8]_LHRH、 [D- Ala6]- LHRH、 des- GlylO_[D- His (Bzl) 6]- LHRH ethylamide 等があげられる。

また、 目的とする非ヒ ト動物、 例えばゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウ ス、 ラット、 ニヮトリ、 サル、 ゥサギ等の受精卵細胞に、 1. に記載の手法を用い ることにより、 ひ 1, 6-フコース修飾酵素の活性が低下した本発明の受精卵細胞を 作製することができる。

作製した受精卵細胞を、 マ二ピューレ一ティング'マウス'ェンブリオ第 2版等 に記載の胚移植の方法を用いて偽妊娠雌の卵管あるいは子宮に移植し出産させる ことで、 1, 6-フコース修飾酵素の活性が低下したトランスジエニック非ヒト動 物を作製することもできる。

トランスジヱニック植物の場合、 目的とする植物体力ルスまたは細胞に、 1. に 記載の手法を施すことで α 1, 6-フコース修飾酵素の活性が低下した本発明の植物 細胞からなる力ルスを作製することができる。

作製したカルスを、 公知の方法 [組織培養, 20 (1994); 組織培養, 21 (1995); トレンド.イン 'バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology) , 15, 45 (1997) ] に準じてオーキシンおよびサイトカイニンを含む培地で培養することで再分化さ せ、 α 1, 6 -フコース修飾酵素の活性が低下したトランスジエニック植物を作製す ることができる。 3. 抗体組成物の製造方法

抗体組成物は、 モレキュラー 'クローニング第 2版、 カレント'プロトコールズ' イン *モレやュフ■—ノ ィォロン一、 Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (以下、 アンチボディズと略す) 、 Monoclonal Antibodies : principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1996 (以 下、 モノクローナル 'アンチボディズと略す) 、 Antibody Engineering, A Practical Approacn, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (以 T、 ァ ンチボディ 'エンジニアリングと略す) 等に記載された方法を用い、 例えば、 以 下のように宿主細胞中で発現させて取得することができる。

抗体分子の c D NAを調製する。

調製した抗体分子の全長 c D N Aをもとにして、 必要に応じて、 該蛋白質をコ ードする部分を含む適当な長さの D N A断片を調製する。

該 D N A断片、 または全長 c D NAを適当な発現ベクターのプロモーターの下 流に揷入することにより、 組換えベクターを作製する。

該組換えベクターを、 該発現べクタ一に適合した宿主細胞に導入することによ り、 抗体組成物を生産する形質転換体を得ることができる。

宿主細胞として、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等、 目的とする遺伝子 を発現できるものであればいずれも用いることができる。

抗体分子の Fc領域に結合する N-グリコシド結合糖鎖の修飾に係わる酵素を遺 伝子工学的な手法を用いて導入した、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等の 細胞を宿主細胞として用いることもできる。

抗体組成物の製造法に用いられる宿主細胞としては、 上記 1. で作製した、 本 発明の細胞をあげることができる。

発現ベクターとしては、 上記各種宿主細胞において自立複製可能ないしは染色 体中への組込が可能で、 目的とする抗体分子をコードする D N Aを転写できる位 置にプロモーターを含有しているものが用いられる。

c D NAは、 上記 1. の (1) の (a ) に記載の 「c D N Aの調製方法」 に従い、 ヒトまたは非ヒト動物の組織または細胞より、 目的とする抗体分子に特異的なプ ローブプライマーを用いて調製することができる。

酵母を宿主細胞として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 YEP13 (ATCC37115) 、 YEp24 (ATCC37051) 、 YCp50 (ATCC37419) 等をあげることができ る。 プロモーターとしては、 酵母菌株中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糠系の遺伝子のプロモーター、

PHO5 プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーター、 ADHプロ モーター、 gal 1 プロモーター、 gal 10 プロモーター、 ヒートショックタンパク 質プロモーター、 MFal プロモーター、 CUP 1 プロモーター等をあげることがで きる。

宿主細胞としては、 サッカロミセス属、 シゾサッカロミセス属、 クリュイべ口 ミセス属、 トリコスポロン属、 シュヮニォミセス属等に属する酵母、 例えば、 Saccharomyces cerevisiae^ schizosaccharomyces pomi3e、 Kluyveromyces lactis、 Trichosporon pullulans Schwanniomyces alluvius等をあげ、ること力 sできる。 組換えベクターの導入方法としては、 酵母に DN Aを導入する方法であればい ずれも用いることができ、 例えば、 エレク ト口ポレーシヨン法 [メソッズ 'ェン ザィモロジ一(Methods. Enzymol. ), 194, 182 (1990)] 、 スフエロプラスト法 [プ 口シーデイングス ·ォブ'ザ'ナショナル 'ァカデミ一'ォブ'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 84, 1929 (1978)] 、 酢酸リチウム法 [ジャーナル .ォブ . パクテリォロジ一(J. Bacteriology), 153, 163 (1983)] 、 プロシーデイングス' ォブ'ザ'ナショナル'アカデミー'ォブ'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 75, 1929 (1978)] に記載の方法等をあげることができる。

動物細胞を宿主として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 pc DN AI、 p c DM8 (フナコシ社より市販) 、 pAGE107 [特開平 3-22979 ;サイトテク ノロジー(Cytotechnology), 3, 133, (1990) ] 、 pAS3 - 3 [特開平 2-227075] 、 PCDM8 [ネイチヤー(Nature), 329, 840, (1987)] 、 pcDNAI/Amp (Invitrogen 社 製) 、 pREP4 (Invitrogen社製) 、 pAGE103 [ジャーナル ·ォブ ·バイオケミスト リー(J. Biochemistry), 101, 1307 (1987)] 、 pAGE210 等をあげることができる。 プロモーターとしては、 動物細胞中で発現できるものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイトメガロウィルス (CMV) の IE (immediate early) 遺 伝子のプロモーター、 SV40 の初期プロモーター、 レトロゥイノレスのプロモーター、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートショックプロモーター、 SRaプロモー ター等をあげることができる。 また、 ヒ ト CMVの I E遺伝子のェンハンサーを プロモーターと共に用いてもよい。

宿主細胞としては、 ヒ トの細胞であるナマルバ (Naraalwa) 細胞、 サルの細胞で ある COS細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH0細胞、 HBT5637 (特開 昭 63 - 299) 、 ラットミエローマ細胞、 マウスミエローマ細胞、 シリアンハムスタ 一腎臓由来細胞、 胚性幹細胞、 受精卵細胞等をあげることができる。

組換えベクターの導入方法としては、 動物細胞に D N Aを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、 例えば、 エレクトロポレーシヨン法 [サイ トテク ノロジー(Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] 、 リン酸カルシウム法 [特開平 2- 227075] 、 リボフヱクシヨン法 [プロシーディングス'ォプ'ザ 'ナショナル 'ァ力 デミ一 'ォブ 'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 84, 7413 (1987) ] 、 インジェクション法 [Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (以下、 マニピ ユレ一ティング 'マウス 'ェンプリオ第 2版と略す) ]、 パーティクルガン (遺伝 子銃) を用いる方法 [日本特許第 2606856、 日本特許第2517813] 、 D E A E—デ キストラン法 レ ィォマニュアルシリーズ 4一遺伝子導入と発現 '解析法 (羊土 社) 横田崇 ·新井賢一編(1994) ] 、 ウィルスベクター法 [マニピユレ一ティング ' マウス ·ェンブリオ第 2版]等をあげることができる。

昆虫細胞を宿主細胞として用いる場合には、 例えばカレント ·プロ トコール ス · づ ン · モレ = ュフー · / ィォロン一、 Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman ana Company, New York (1992)、 ノヽィォ/ァ クノロジー(Bio/Technology), 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、 タン パク質を発現することができる。

して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを昆 虫細胞に感染させ、 タンパク質を発現させることができる。

該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともに Invitorogen社製) 等をあげることができる。

パキュロウィルスとしては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスである アウ トグラファ 'カリフオノレニ力 ·ヌクレアー ' ポリへドロシス · ウイノレス (Autographa californica nuclear polynedrosis virusノ等を用レヽること力飞、、きる。 昆虫細胞としては、 Spodopterafrugiperda の卵巣細胞である Sf9、 Sf21 [カレ ント · プロ トコーノレズ ' イン · モレキュラー · バイオ口ジー Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992) ] 、 Trichoplusia ni の卵巣細胞である High 5 (Invitrogen社製) 等を用いることができる。 組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べクタ 一と上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法

(特開平 2-227075) 、 リボフヱクシヨン法 [プロシーデイングス'ォブ 'ザ 'ナシ ョナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 84, 7413 (1987) ] 等をあげることができる。

植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現ベクターとして、 例えば、 T iプラスミド、 タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。

プロモーターとしては、 植物細胞中で発現できるものであればいずれのものを 用いてもよく、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス (CaMV) の 35S プロモー ター、 ィネアクチン 1プロモーター等をあげることができる。

宿主細胞としては、 タバコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 アブラ ナ、 アルフアルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植物細胞をあげることができ る。

組換えベクターの導入方法としては、 植物細胞に D N Aを導入する方法であれ ばいずれも用いることができ、 例えば、 ァグロバタテリゥム (Agrobacterium) を 用いる方法 [特開昭 59-140885、 特開昭 60-70080、 W094/00977] 、 エレクトロポ レーシヨン法 [特開昭 60-251887] 、 パーティクルガン (遺伝子銃) を用いる方 法 [日本特許第 2606856、 日本特許第 2517813] 等をあげることができる。

抗体遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー 'クローニン グ第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 Fc領域と他のタンパク質 との融合タンパク質発現等を行うことができる。

糖鎖の合成に関与する遺伝子を導入した、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞または植 物細胞等により発現させた場合には、 導入した遺伝子によって糖あるいは糖鎖が 付加された抗体分子を得ることができる。

以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、 培養物中に抗体分子を 生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 抗体組成物を製造することが できる。 形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主細胞の培養に用いられる通常 の方法に従って行うことができる。

酵母を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 該生物が資化 し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行え る培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。 炭素源としては、 該生物が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラク トース、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプン加水分 解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロパノール などのアルコール類等を用いることができる。

窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸ァ ンモユウム、 リン酸アンモェゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム塩、 その他の含窒素'化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンス チープリカー、 カゼイン加水分解物、 大豆粕および大豆粕加水分解物、 各種発酵 菌体およびその消化物等を用いることができる。

無機塩類としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マン癌、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。

培養は、 通常振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培 養温度は 15〜40°Cがよく、 培養時間は、 通常 16時間〜 7日間である。 培養中の p Hは 3. 0〜9. 0に保持する。 p Hの調製は、 無機または有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行う。

また、 培養中必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。

プロモーターとして誘導性のプ口モーターを用いた組換えべクターで形質転換 した微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデューサーを培地に添加して もよい。 例えば、 lac プロモーターを用いた組換えベクターで形質転換した微生 物を培養するときにはイソプロピル一 ]3— D—チォガラタトピラノシド等を、 trp プロモーターを用いた組換えべクターで形質転換した微生物を培養するときには インドールァクリル酸等を培地に添加してもよい。

動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されている RPMI1640培地 [ザ ·ジャーナル ·ォプ ·ザ ·アメリカン'メデ イ カノレ ' ァ ソ シェイ シ ヨ ン (The Journal of the American Medical Association) , 199, 519 (1967) ] 、 Eagleの MEM培地 [サイエンス(Science), 122, 501 (1952) ] 、 ダルベッコ改変 MEM培地邊 [ヴユウロロジー(Virology), 8, 396 (1959) ] 、 199 培地 [プロシーディング ·ォブ ·ザ · ソサイエティ 'フォア ' ザ · ノ ィォロジカル · メディスン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine) , 73, 1 (1950) ] 、 Whitten培地 [発生工学実験マ二ユア ル-トランスジエニック ·マウスの作り方 (講談社) 勝木元也編 (1987) ]またはこ れら培地に牛胎児血淸等を添加した培地等を用いることができる。

培養は、 通常 p H6〜8、 30〜40°C、 5%C02存在下等の条件下で 1〜7 日間行う。 フエドパッチ培養、 ホロファイバー培養などの培養法を用いて 1 日〜数ケ月培養 を行うこともできる。

また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地に 添加してもよい。

昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般 に使用されている TNM- FH培地 (Pharmingen社製) 、 Sf- 900 II SFM培地 (Life Technologies社製) 、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製) 、 Grace' s Insect Medium [ネイチヤー(Nature) , 195, 788 (1962) ] 等を用いるこ とができる。

培養は、 通常 p H6〜7、 25〜30°C等の条件下で、 1〜5日間行う。

また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加しても よい。

植物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体は、 細胞として、 または植物の 細胞や器官に分化させて培養することができる。 該形質転換体を培養する培地と しては、 一般に使用されているムラシゲ ·アンド · スターグ (MS)培地、 ホワイト (White)培地、 またはこれら培地にオーキシン、 サイトカイニン等、 植物ホルモン を添力 Bした培地等を用いることができる。

培養は、 通常 p H5〜9、 20〜40°Cの条件下で 3〜60日間行う。

また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質を 培地に添加してもよい。

上記のとおり、 抗体分子をコードする D N Aを組み込んだ組換え体ベクターを 保有する酵母、 動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換体を、 通常の培養方 法に従って培養し、 抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物より抗体組成物を採取 することにより、 抗体組成物を製造することができる。

抗体組成物の生産方法としては、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞外に 分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、 使用する宿 主細胞や、 生産させる抗体分子の構造を変えることにより、 該方法を選択するこ とができる。 抗体組成物が宿主細胞内あるレ、は宿主細胞外膜上に生産される場合、 ポールソ ンらの方法 [ジャーナル ·ォブ ·バイオロジカル 'ケミストリー(J. Biol. Chem. ) , 264, 17619 (1989) ] 、 ロウらの方法 [プロシーディングス'ォブ'ザ 'ナ ショナル'アカデミー'ォプ 'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 86, 8227 (1989) ; ジーン ·デベロップメント(Genes Develop. ) , 4, 1288 (1990) ] 、 または特開平 05-336963、 特開平 06-823021 等に記載の方法を準用することによ り、 該抗体組成物を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。

すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 発現ベクターに、 抗体分子をコード する D N A、 および抗体分子の発現に適切なシグナルぺプチドをコードする D N Aを揷入し、 該発現ベクターを宿主細胞へ導入した後に抗体分子を発現させるこ とにより、 目的とする抗体分子を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。 また、 特開平 2-227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵素 遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。

さらに、 遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、 遺 伝子が導入された動物個体 (トランスジェニック非ヒ ト動物) または植物個体 (トランスジヱニック植物) を造成し、 これらの個体を用いて抗体組成物を製造 することもできる。

形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育ま たは栽培し、 抗体組成物を生成蓄積させ、 該動物個体または植物個体より該抗体 組成物を採取することにより、 該抗体組成物を製造することができる。

動物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、 例えば公知の方法 [ァ メリカン 'ジャーナノレ ·オフ ·クリ二力ノレ ·ニュートリション (American Journal of Clinical Nutrition) , 63, 639S (1996); アメ リカン ·ジャーナル ·ォブ ·ク リニ力,レ 'ニュートリション (American Journal of Clinical Nutrition) , 63, 627S (1996) ; バイオ/テクノロジー(Bio/Technology) , 9, 830 (1991) ] に準じ て遺伝子を導入して造成した動物中に目的とする抗体組成物を生産する方法があ げられる。

動物個体の場合は、 例えば、 抗体分子をコードする D NAを導入したトランス ジ ニック非ヒト動物を飼育し、 抗体組成物を該動物中に生成 ·蓄積させ、 該動 物中より抗体組成物を採取することにより、 抗体組成物を製造することができる。 該動物中の生成 '蓄積場所としては、 例えば、 該動物のミルク (特開昭 63- 309192) 、 卵等をあげることができる。 この際に用いられるプロモーターとして は、 動物で発現できるものであればいずれも用いることができるが、 例えば、 乳 腺細胞特異的なプロモーターであるひカゼインプロモーター、 カゼインプロモ 一ター、 j8ラクトグロプリンプロモーター、 ホエー酸性プロテインプロモーター 等が好適に用いられる。

植物個体を用いて抗体組成物を製造する方法としては、 例えば抗体分子をコー ドする D N Aを導入したトランスジヱニック植物を公知の方法 [組織培養, 20 (1994); 組織培養, 21 (1995); トレンド 'イン 'バイオテクノロジー(Trends in Biotechnology) , 15, 45 (1997) ] に準じて栽培し、 抗体組成物を該植物中に生 成 -蓄積させ、 該植物中より該抗体組成物を採取することにより、 抗体組成物を 生産する方法があげられる。

抗体分子をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造された抗体組成 物は、 例えば抗体組成物が、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培養終了後、 細胞を遠心分離により回収し、 水系緩衝液にけん濁後、 超音波破碎機、 フレンチ プレス、 マントンガウリンホモゲナイザー、 ダイノミル等により細胞を破碎し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清か ら、 通常の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル (DEAE) —セファロース、 DIAI0N HPA-75 (三菱化学 (株) 製) 等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー 法、 S_Sepharose FF (Pharmacia社製) 等のレジンを用いた陽イオン交換クロマ トグラフィ一法、 プチルセファロース、 フエニノレセファロース等のレジンを用い た疎水性クロマトグラフィー法、 分子篩を用いたゲルろ過法、 ァフィ二ティーク ロマトグラフィ一法、 クロマトフォーカシング法、 等電点電気泳動等の電気泳動 法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 抗体組成物の精製標品を得ること ができる。

また、 抗体組成物が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に細胞を 回収後破砕し、 遠心分離を行うことにより、 沈殿画分として抗体組成物の不溶体 を回収する。 回収した抗体組成物の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。 該 可溶化液を希釈または透析することにより、 該抗体組成物を正常な立体構造に戻 した後、 上記と同様の単離精製法により該抗体組成物の精製標品を得ることがで さる。

抗体 la成物が細胞外に分泌された場合には、 培養上清に該抗体組成物を回収す ることができる。 即ち、 該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理す ることにより可溶性画分を取得し、 該可溶性画分から、 上記と同様の単離精製法 を用いることにより、 抗体組成物の精製標品を得ることができる。

このようにして取得される抗体組成物として、 例えば、 抗体、 抗体の断片、 抗 体の Fc領域を有する融合タンパク質などを挙げることができる。

以下に、 抗体組成物の取得のより具体的な例として、 ヒ ト化抗体の組成物およ び Fc融合蛋白質の製造方法について記すが、 他の抗体組成物を上述の方法および 当該方法に準じて取得することもできる。

A. ヒ ト化抗体の組成物の製造

(1) ヒ ト化抗体発現用ベクターの構築

ヒ ト化抗体発現用ベクターとは、 ヒ ト抗体の H鎖および L鎖 C領域をコードす る遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、 動物細胞用発現べクタ 一にヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子をそれぞれクローニングするこ とにより構築することができる。

ヒ ト抗体の C領域としては、 任意のヒ ト抗体の CHおよび CLであることができ、 例えば、 ヒ ト抗体の H鎖の IgGlサブクラスの C領域 (以下、 hC y l と表記する) およびヒ ト抗体の L鎖の κクラスの C領域 (以下、 hC Kと表記する) 等があげら れる。

ヒ ト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子としてはェキソンとイントロンか ら成る染色体 DNAを用いることができ、 また、 cDNAを用いることもできる。

動物細胞用発現ベクターとしては、 ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組 込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 PAGE107 [サイトテクノロジー(Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] 、 pAGE103 [ジ ヤーナル .ォブ .パイオケミストリー(j. Biochem. ) , 101, 1307 (1987) ] 、 PHSG274 [ジーン(Gene) , 27, 223 (1984) ] 、 pKCR [プロシーディングス .ォプ . ザ ' ナショナル ' アカデミー · ォブ · サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 78, 1527 (1981) ] 、 pSGl β d2-4 [サイ ト テ ク ノ ロ ジー (Cytotechnology) , 4, 173 (1990) ] 等があげられる。 動物細胞用発現ベクターに 用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40 の初期プロモーターとェンハ ンサー [ジャーナル ' ォブ 'パイオケミス ト リ ー(J. Biochem. ) , 101, 1307 (1987) ] 、 モロニ一マウス白血病ウィルスの LTR レ ィォケミカル 'アンド ·バ ィオフイジ力ノレ ' リサーチ ' コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commun. ) , 149, 960 (1987) ] 、 免疫グロブリン H鎖のプロモーター [セ3ル(Cell) , 41, 479 (1985) ] とェンハンサー [セル(Cell) , 33, 717 (1983) ] 等があげられ る 0

ヒト化抗体発現用ベクターは、 抗体 H鎖おょぴ L鎖が别々のベクター上に存在 するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ (以下、 タンデム型と表 記する) のどちらでも用いることができるが、 ヒ ト化抗体発現ベクターの構築の 容易さ、 動物細胞への導入の容易さ、 動物細胞内での抗体 H鎖および L鎖の発現 量のパランスが均衡する等の点からタンデム型のヒ ト化抗体発現用ベクターの方 が好ましい [ジャーナノレ'ォプ'ィムノロジカノレ'メソッズ(J. Immunol. Methods) , 167, 271 (1994) ] 。

構築したヒ ト化抗体発現用ベクターは、 ヒ ト型キメラ抗体おょぴヒト型 CDR移 植抗体の動物細胞での発現に使用できる。

(2) ヒト以外の動物の抗体の V領域をコードする cDNAの取得

ヒト以外の動物の抗体、 例えば、 マウス抗体の VHおよび VLをコードする cDNA は以下のようにして取得することができる。

目的のマウス抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞より mRNA を抽出し、 cDNA を 合成する。 合成した cDNAをファージ或いはプラスミ ド等のベクターにクローニン グして cDNAライブラリーを作製する。 該ライブラリーより、 既存のマウス抗体の C領域部分或いは V領域部分をプローブとして用い、 VHをコードする cDNAを有す る組換えファージ或いは組換えプラスミ ドおよび VLをコードする cDNAを有する 組換えファージ或いは組換えプラスミ ドをそれぞれ単離する。 組換えファージ或 いは組換えプラスミ ド上の目的のマウス抗体の VHおよび VLの全塩基配列を決定 し、 塩基配列より VHおよび VLの全ァミノ酸配列を推定する。

ヒ ト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ等、 ハイプリ ドーマ細胞を作製することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。 ハイプリ ドーマ細胞から全 RNA を調製する方法としては、 チォシアン酸グァ- ジン一トリフルォロ酢酸セシウム法 [メソッズ 'ィン 'ェンザィモロジ一(Methods in Enzymol. ) , 154, 3 (1987) ] 、 また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、 オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法 [モレキュラー · クローニング: ァ · ラボ フ 卜 リー · マニュゾノレ (Molecular Cloning: A Laooratory Manual) , Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989] 等があげられる。 また、 ハイプリ ドーマ細 胞から mRNA を調製するキッ トと しては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen社製) 、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製) 等 があげられる。

cDNA の合成おょぴ cDNA ライプラリー作製法としては、 常法 [モレキュラー ' ク ローニング : ァ · ラボラ ト リ ー · マ二ユアノレ (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) , Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; カレン 卜 ,プロ卜: πーノレズ ·イン ·モレキュラー ·ノ ィ才ロジ一 (Current Protocols in MolecularBiology), Supplement ト 34] 、 或レヽは市販のキット、 例えば、 Super Script™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL 社製) や ZAP- cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製) を用いる方法などがあげら れる。

cDNA ライブラリーの作製の際、 ハイプリ ドーマ細胞から抽出した mRNA を錶型 として合成した cDNAを組み込むベクターは、 該 cDNAを組み込めるベクターであ ればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 ZAP Express [ストラテジー ズ(Strategies), 5, 58 (1992) ] 、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイック · ァシ ッズ . リ サーチ(Nucleic Acids Research) , 17, 9494 (1989) ] 、 λ zap II (Stratagene社製) 、 Lgtl0、 ^gtll [ディーェヌエー ·クロー-ング: ァ 'プ ラタティカノレ · アプローチ (DNA Cloning: A Practical Approach) , I, 49 (1985)] 、 Lambda BlueMid (Clontech社製) 、 ExCell、 pT7T3 18U (Pharmacia 社製) 、 pcD2 [モレキュラー ' アンド ' セルラー 'バイオロジー(Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)] および pUC18 [ジーン(Gene), 33, 103 (1985)] 等が用 いられる。

ファージ或いはプラスミ ドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入 する大腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、 発現おょぴ維持できるものであ ればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 XL1- Blue MRF' [ストラテジ ーズ(Strategies), 5, 81 (1992) ] 、 C600 [ジェネティックス(Genetics), 39, 440 (1954)] 、 Y1088、 Y1090 [サイエンス(Science), 222, 778 (1983)] 、 丽 522 [ジャーナル 'ォブ .モレキュラー 'バイオロジー(J. Mol. Biol.), 166, 1 (1983) ] 、 K802 [ジャーナル 'ォブ 'モレキュラー 'バイオロジー(J. Mol. Biol.), 16, 118 (1966)] および JM105 [ジーン(Gene), 38, 275 (1985)] 等が 用いられる。 cDNA ライブラリーからのヒト以外の動物の抗体の VHおよび VL をコードする cDNA クローンの選択法としては、 アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用 いたコロニー ·ハイブリダィゼーション法或いはプラーク ·ハイブリダィゼーシ ヨン法 [モレキュラー · クローニング : ァ · ラボラ トリー · マ-ユアノレ (Molecular Cloning : A Laboratory Manual) , Cold Spring Harbor Lab. Press NewYork, 1989] により選択することができる。 また、 プライマーを調製し、 mRNA から合成した cDNA或いは cDNA ライブラリーを錶型として、 Polymerase Chain Reaction [以下、 PCR 法と表記する ;モレキュラー ·クローニング:ァ · ラボラ トリ 1 ~ · マニュ /ノレ (Molecular Cloning: A Laboratory Manual) , Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; カレント ·プロ トコーノレズ 'イン .モレキ ュフ' ~ ·ノ ィォロン一 (Current Protocols in Molecular Biology; , Supplement 1-34] により VHおよび VLをコードする cDNAを調製することもできる。

上記方法によ り選択された cDNA を、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene 社製) 等のプラスミ ドにクローニングし、 通常 用いられる塩基配列解析方法、 例えば、 サンガー (Sanger) らのジデォキシ法 [プロシーディングス ·ォプ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. , U. S. A. ) , 74, 5463 (1977) ] 等の反応を行い、 塩基配 列自動分析装置、 例えば、 A. L. F. DNA シークェンサ一 (Pharmacia社製) 等を 用いて解析することで該 cDNAの塩基配列を決定することができる。

決定した塩基配列から VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定し、 既知の抗体の VHおよび VL の全アミノ酸配列 [シーケンシズ'ォブ'プロテインズ'ォプ'ィムノ ロン力ノレ *ィンタレスト (Sequences or Proteins of Immunologicallnterest) , US Dept. Health and Human Services, 1991 ] と比較することにより、 取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なァミノ酸配列をコー ドしているかを確認することができる。

(3) ヒト以外の動物の抗体の V領域のアミノ酸配列の解析

分泌シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配列に関しては、 既知の抗体の VHおよび VLの全ァミノ酸配列 [シーケンシズ'ォブ'プロティンズ. オフ ' ムノロンカスレ 'インタレス ト (Sequences of Proteins of Immunological Interest) , US Dept. Health and Human Services, 1991] と比較することにより、 分泌シグナル配列の長さおよび N末端アミノ酸配列を推定でき、 更にはそれらが 属するサブグループを知ることができる。 また、 VHおよび VLの各 CDRのァミノ 酸配列についても、 既知の抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列 [シーケンシズ 'ォ ブ 'プロテインズ'ォブ'ィムノロジカル 'インタレスト(Sequences of Proteins of Immunological Interest) , US Dept. Health and Human Services, 1991] と比較 することによって見出すことができる。

(4) ヒ ト型キメラ抗体発現ベクターの構築

本項 3の (1) に記載のヒ ト化抗体発現用ベクターのヒ ト抗体の CHおよび CLを コードする遺伝子の上流に、 ヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNA をクローニングし、 ヒ ト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。 例えば、 ヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを、 ヒ ト以外の 動物の抗体の VHおよび VLの 3'末端側の塩基配列とヒ ト抗体の CHおよび CLの 5, 末端側の塩基配列とから成り、 力つ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合 成 DNAとそれぞれ連結し、 それぞれを本項 3の (1) に記載のヒ ト化抗体発現用べ クタ一のヒ ト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形 で発現するようにクローユングし、 ヒ ト型キメラ抗体発現ベクターを構築するこ とができる。

(5) ヒ ト型 CDR移植抗体の V領域をコードする cDNAの構築

ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは、 以下のようにして構 築することができる。 まず、 目的のヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDR を移植するヒ ト抗体の VHおよび VLのフレームワーク (以下、 FRと表記する) の ァミノ酸配列を選択する。 ヒ ト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸配列としては、 ヒ ト抗体由来のものであれば、 いかなるものでも用いることができる。 例えば、 Protein Data Bank等のデータベースに登録されているヒ ト抗体の VHおよび VL の FRのァミノ酸配列、 ヒ ト抗体の VHおよび VLの FRの各サブグループの共通ァ ミノ酸配列 [シーケンシズ 'ォブ 'プロテインズ 'ォブ ·ィムノロジカル 'インタレス 卜 (Sequences of Proteins of Immunological Interest) , US Dept. Health and Human Services, 1991] 等があげられるが、 その中でも、 十分な活性を有するヒ ト型 CDR移植抗体を作製するためには、 目的のヒ ト以外の動物の抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性 (少なくとも 60%以上) を有する ァミノ酸配列を選択することが望ましい。 次に、 選択したヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列に目的のヒト以外 の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのァミノ酸配列を移植し、 ヒト型 CDR移植抗 体の VHおよび VLのァミノ酸配列を設計する。 設計したァミノ酸配列を抗体の遺 伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度 [シーケンシズ'ォブ'プロテインズ' ォプ *ィムノロン力ノレ ' ンタレスト (Sequences of Proteins of Immunological Interest) , US Dept. Health and Human Services, 1991] を考慮して DNA配列に 変換し、 ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列をコードする DNA配 列を設計する。 設計した DNA配列に基づき、 100塩基前後の長さから成る数本の 合成 DNAを合成し、 それらを用いて PCR法を行う。 この場合、 PCRでの反応効率 および合成可能な DNAの長さから、 H鎖、 L鎖とも 6本の合成 DNAを設計すること が好ましい。

また、 両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入す ることで、 本項 3の (1) で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクロー二 ングすることができる。 PCR後、 増幅産物を pBluescript SK (-) (Stratagene社 製) 等のプラスミドにクローニングし、 本項 3の (2) に記載の方法により、 塩基 配列を決定し、 所望のヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列をコー ドする DNA配列を有するプラスミドを取得する。

(6) ヒト型 CDR移植抗体の V領域のァミノ酸配列の改変

ヒト型 CDR移植抗体は、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRの みをヒト抗体の VHおよび VLの FRに移植しただけでは、 その抗原結合活性は元の ヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている [バイオ/テク ノロジー(BI0/TECHN0L0GY), 9, 266 (1991) ] 。 この原因としては、 元のヒ ト以外 の動物の抗体の H鎖および L鎖 V領域では、 CDRのみならず、 FRのいくつかのァ ミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、 それらァミノ 酸残基が CDRの移植に伴い、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRの異なるァミノ酸残基 へと変化してしまうことが考えられている。 この問題を解決するため、 ヒ ト型 CDR移植抗体では、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸配列の中で、 直接抗 原との結合に関与しているアミノ酸残基や CDRのアミノ酸残基と相互作用したり、 抗体の立体構造を維持し、 間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を 同定し、 それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、 低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている レ ィォ /テクノ口ジー

(BI0/TECHN0L0GY) , 9, 266 (1991) ] 。

ヒト型 CDR移植抗体の作製において、 該抗体と抗原との結合活性に関わる FRの アミノ酸残基を如何に効率よく同定することが、 最も重要な点である。 抗体と抗 原との結合活性に関わる FR のアミノ酸を同定する方法としては、 X線結晶解析 [ジャーナル'ォブ'モレキュラー 'バイオロジー (J. Mol. Biol. ) , 112, 535 (1977) ] 或いはコンピューターモデリング [プロテイン 'エンジニアリング (Protein Engineering) , 7, 1501 (1994) ] 等の抗体の立体構造の構築および解析 方法があげられる。 これら抗体の立体構造の情報は、 ヒト型 CDR移植抗体の作製 に多くの有益な情報をもたらした。 しかしながら、 あらゆる抗体に適応可能なヒ ト型 CDR移植抗体の作製法は未だ確立されていない。 したがって、 現状ではそれ ぞれの抗体について数種の改変体を作製し、 それぞれの抗原結合活性との相関を 検討する等の種々の試行錯誤が必要である。

ヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸残基の改変は、 改変用合成 DNAを用い て本項 3の (5) に記載の PCR法により行うことができる。 PCR後の増幅産物につ いて本項 3の (2) に記載の方法により、 塩基配列を決定し、 目的の改変が施され たことを確認する。

(7) ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターの構築

本項 3の (1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLを コードする遺伝子の上流に、 本項 3の (5) および (6) で構築したヒト型 CDR移 植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAをクローニングし、 ヒト型 CDR移植抗体 発現ベクターを構築することができる。 例えば、 本項 3 の (5) および (6) でヒ ト型 CDR移植抗体の VHおよび VLを構築する際に用いる合成 DNAのうち、 両端に 位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、 本項 3の (1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコード する遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、 ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。 (8) ヒト化抗体の安定的生産

本項 3 の (4) および (7) に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な動物細胞 に導入することによりヒ ト型キメラ抗体およびヒ ト型 C D R移植抗体 (以下、 併 せてヒト化抗体と称す) を安定に生産する形質転換株を得ることができる。

動物細胞へのヒ ト化抗体発現ベクターの導入法としては、 エレクトロポレーシ ヨン法 [特開平 2 - 257891 ; サイ トテクノ ロジー(Cytotechnology) , 3 ,133 (1990) ] 等があげられる。

ヒト化抗体発現ベクターを導入する動物細胞としては、' ヒ ト化抗体を生産させ ることができる動物細胞であれば、 いかなる細胞でも用いることができる。

具体的には、 マウスミエローマ細胞である NS0 細胞、 SP2/0 細胞、 チヤィニー ズハムスター卵巣細胞 CHO/dhfr-細胞、 CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0 細胞、 IR983F細胞、 シリアンハムスター腎臓由来である B HK細胞、 ヒ トミエロ 一マ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、 好ましくは、 チャイニーズハ ムスター卵巣細胞である CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0細胞、 1. に記 載の細胞等があげられる。

ヒト化抗体発現ベクターの導入後、 ヒ ト化抗体を安定に生産する形質転換株は、 特開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 G418 sulfate (以下、 G418 と表 記する ; SIGMA社製) 等の薬剤を含む動物細胞培養用培地により選択できる。 動 物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地 (日水製薬社製) 、 GIT培地 (日本製 薬社製) 、 EX- CELL302 培地 (JRH 社製) 、 IMDM 培地 (GIBCO BRL 社製) 、 Hybridoma - SFM培地 (GIBCO BRL社製) 、 またはこれら培地に牛胎児血清 (以下、 FBS と表記する) 等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。 得ら れた形質転換株を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を生産蓄積さ せることができる。 培養上清中のヒト化抗体の生産量および抗原結合活性は酵素 免疫抗体法 [以下、 ELISA 法と表記する ;アンティボディズ,' Chapter 14、 モノ クローナル ·アンティボディズ] 等により測定できる。 また、 形質転換株は、 特 開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 DHFR遺伝子増幅系等を利用してヒ ト化抗体の生産量を上昇させることができる。

ヒト化抗体は、 形質転換株の培養上清よりプロテイン A カラムを用いて精製す ることができる [アンティポディズ Chapter 8、 モノクローナル 'アンティボディ ズ] 。 また、 その他に通常、 タンパク質の精製で用いられる精製方法を使用する ことができる。 例えば、 ゲル濾過、 ィオン交換ク口マトグラフィ一および限外濾 過等を組み合わせて行い、 精製することができる。 精製したヒト化抗体の H鎖、 L 鎖或いは抗体分子全体の分子量は、 ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 [以下、 SDS - PAGE と表記する ;ネイチヤー(Nature) , 227, 680 (1970) ] やウェスタンブ ロッテイング法 [アンティボディズ:ァ'ラボラトリ^ マニュアル, Chapter 12、 モノクローナル.アンティボディズ] 等で測定することができる。

B. Fc融合蛋白質の製造

(1) Fc融合蛋白質発現用ベクターの構築

Fc融合蛋白質発現用ベクターとは、 ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質と をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであり、 動物細胞用 発現ベクターにヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子をク ローニングすることにより構築することができる。

ヒト抗体の Fc領域としては、 CH2と CH3領域を含む領域のほか、 ヒンジ領域、 CH1 の一部が含まれるものも包含される。 また CH2または CH3 の少なくとも 1つ のアミノ酸が欠失、 置換、 付加または揷入され、 実質的に Fe y受容体への結合活 性を有するものであればいかなるものでもよい。

ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする遺伝子としてはェキソン とイントロンから成る染色体 DNAを用いることができ、 また、 cDNAを用いること もできる。 それら遺伝子と Fc領域を連結する方法としては、 各遺伝子配列を鏡型 として、 PCR法 (レキユラ一'クローニング第 2版;カレント 'プロトコールズ 'ィ ン 'モレキュラ^ バイオロジー, Supplement 1-34) を行うことがあげられる。 動物細胞用発現べクタ一としては、 ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組 込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 PAGE107 [サイトテクノロジー (Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ]、 pAGE103 [ジ ヤーナル . ォブ 'バイオケミス トリー (J. Biochem. ) , 101, 1307 (1987) ]、 PHSG274 [ジーン (Gene) , 27, 223 (1984) ]、 pKCR [プロシーディンダス ·ォブ · ザ .ナショナノレ ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 78, 1527 (1981) ] 、 pSGl j3 d2_4 [ サ イ ト テ ク ノ ロ ジー (Cytotechnology) , 4, 173 (1990) ] 等があげられる。 動物細胞用発現ベクターに 用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40 の初期プロモーターとェンハ ンサー [ジャーナル 'ォブ 'パイオケミス トリー (J. Biochem. ) , 101, 1307 (1987) ]、 モロ-一マウス白血病ウィルスの LTR レ ィォケミカル 'アンド ·バイ オフイジ力ノレ ' リサーチ ' コミュニケーショ ンズ (Biochem. Biophys. Res. Commun. ) , 149, 960 (1987) ]、 免疫グロブリン H鎖のプロモーター [セル (Cell) , 41, 479 (1985) ] とェンハンサー [セル (Cell) , 33, 717 (1983) ] 等があげられ る。

(2) ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする DNAの取得

ヒト抗体の Fc領域と融合させる蛋白質とをコードする DNAは以下のようにして 取得することができる。

目的の Fc と融合させる蛋白質を発現している細胞や組織より mRNAを抽出し、 cDNA を合成する。 合成した cDNA をファージ或いはプラスミド等のベクターにク ローニングして cDNAライブラリーを作製する。 該ライブラリーより、 目的の蛋白 質の遺伝子配列部分をプローブとして用い、 目的の蛋白質をコードする cDNAを有 する糸且換えファージ或いは組換えプラスミドを単離する。 組換えファージ或いは 組換えプラスミ ド上の目的の蛋白質の全塩基配列を決定し、 塩基配列より全アミ ノ酸配列を推定する。

ヒ ト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ゥサギ等、 細胞や組 織を摘出することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。

細胞や組織から全 RNAを調製する方法としては、 チォシアン酸グァニジン-トリ フルォロ酢酸セシウム法 [メ ソッズ 'イン 'ェンザィモロジ一(Methods in Enzymol. ) , 154, 3 (1987) ] 、 また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、 ォ リゴ(dT)固定ィヒセルロースカラム法 (モレキュラー 'クローニング第 2版) 等があ げられる。 また、 細胞や組織から mRNA を調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 社製)、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharraac i a社製) 等があげられる。

cDNAの合成及ぴ cDNAライブラリ一作製法としては、 常法 (モレキュラー 'クロ 一二ング第 2版;カレント 'プロ トコールズ 'ィン 'モレキュラー 'バイオロジー, Supplement 1-34) , 或いは市販のキッ ト、 例えば、 Super Script™ Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製) や ZAP- cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製) を用いる方法などがあげられる。

cDNA ライブラリーの作製の際、 細胞や組織から抽出した mRNA を铸型として合 成した cDNAを組み込むベクターは、 該 cDNAを組み込めるベクターであればいか なるものでも用いることができる。 例えば、 ZAP Express [ストラテジーズ (Strategies) , 5, 58 (1992) ] 、 pBluescript II SK (+) [ヌクレイック ·ァシッ ズ . リ サーチ (Nucleic Acids Research) , 17, 9494 (1989) ] 、 λ zapll (Stratagene社製)、 L gtlO、 L gtll [ディーェヌエー ·クローニング:ァ 'プラ クティカノレ ·アプローチ (DNA Cloning: A Practical Approach) , I, 49 (1985) ]、 Lambda BlueMid (Clontech社製)、 ; L ExCell、 pT7T3 18U (Pharmacia社製)、 cD2 [モレキュラー 'アンド 'セルラー 'バイオロジー(Mol. Cell. Biol. ) , 3, 280 (1983) ] 及ぴ pUC18 [ジーン(Gene) , 33. 103 (1985) ] 等が用いられる。

ファージ或いはプラスミ ドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入 する大腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、 発現及び維持できるものであれ ばいかなるものでも用いることができる。 例えば、 XLl-Blue MRF, [ストラテジー ズ (Strategies) , 5, 81 (1992) ] 、 C600 [ジェネティックス (Genetics) , 39, 440 (1954) ] 、 Y1088、 Y1090 [サイエンス (Science) , 222, 778 (1983) ] 、 匪 522 [ジャーナル.ォブ .モレキュラー♦バイオロジー (J. Mol. Biol. ) , 166, 1 (1983) ] 、 K802 [ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー (J. Mol. Biol. ) , 16, 118 (1966) ] 及び JM105 [ジーン (Gene) , 38, 275 (1985) ] 等が用 いられる。

cDNA ライブラリーからの目的の蛋白質をコードする cDNA クローンの選択法と しては、 アイソトープ或いは蛍光標識したプローブを用いたコロニー ·ハイプリ ダイゼーシヨン法或いはプラーク 'ハイプリダイゼーシヨン法 (モレキユラ一'ク ローニング第 2 版) により選択することができる。 また、 プライマーを調製し、 raRNAから合成した cDNA或いは cDNAライブラリーを铸型として、 PCR法により目 的の蛋白質をコードする cDNAを調製することもできる。

目的の蛋白質をヒ ト抗体の Fc領域と融合させる方法としては、 PCR法があげら れる。 例えば、 目的の蛋白質の遺伝子配列の 5' 側と 3' 側に任意の合成オリゴ DNA (プライマー)を設定し、 PCR法を行い PCR産物を取得する。 同様に、 融合させ るヒト抗体の Fc領域の遺伝子配列に対しても任意のプライマーを設定し、 PCR産 物を得る。 このとき、 融合させる蛋白質の PCR産物の 3' 側と Fc領域の PCR産物 の 5' 側には同じ制限酵素部位もしくは同じ遺伝子配列が存在するようにプライ マーを設定する。 この連結部分周辺のアミノ酸改変が必要である場合には、 その 変異を導入したプライマーを用いることで変異を導入する。 得られた., 2 種類の PCR 断片を用いてさらに PCR を行うことで、 両遺伝子を連結する。 もしくは、 同 一の制限酵素処理をした後にライゲーシヨンすることでも連結することができる。 上記方法により連結された遺伝子配列を、 適当な制限酵素などで切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene社製) 等のプラスミ ドにクローニングし、 通常 用いられる塩基配列解析方法、 例えばサンガー (Sanger) らのジデォキシ法 [プ 口シーディングス ·ォブ 'ザ'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ) , 74, 5463 (1977) ] あるいは ABI PRISM 377DNA シー タエンサー (PE Biosystems社製) 等の塩基配列分析装置を用いて分析すること により、 該 DNAの塩基配列を決定することができる。

決定した塩基配列から Fc融合蛋白質の全アミノ酸配列を推定し、 目的のァミノ 酸配列と比較することにより、 取得した cDNAが分泌シグナル配列を含む Fc融合 蛋白質の完全なァミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。

(3) Fc融合蛋白質の安定的生産

前記の (1) 項に記載の Fc融合蛋白質発現べクタ一を適当な動物細胞に導入す ることにより Fc融合蛋白質を安定に生産する形質転換株を得ることができる。 動物細胞への Fc融合蛋白質発現ベクターの導入法としては、 エレクト口ポレー シヨン法 [特開平 2-257891 ; サイ トテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990) ] 等があげられる。

Fc融合蛋白質発現ベクターを導入する動物細胞としては、 Fc融合蛋白質を生産 させることができる動物細胞であれば、 いかなる細胞でも用いることができる。 具体的には、 マウスミエローマ細胞である NS0細胞、 SP2/0細胞、 チヤィニー ズハムスター卵巣細胞 CHO/dhfr-細胞、 CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0 細胞、 IR983F細胞、 シリアンハムスター腎臓由来である BHK細胞、 ヒトミエロー マ細胞であるナマルバ細胞などがあげられるが、 好ましくは、 チャイニーズハム スタ一卵巣細胞である CH0/DG44細胞、 ラットミエローマ YB2/0細胞、 前記 1項に 記載の本発明の方法に用いられる宿主細胞等があげられる。

Fc融合蛋白質発現ベクターの導入後、 Fc S虫合蛋白質を安定に生産する形質転換 株は、 特開平 2-257891 に開示されている方法に従い、 G418等の薬剤を含む動物 細胞培養用培地により選択できる。 動物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地 (日水製薬社製)、 GIT培地 (日本製薬社製)、 EX-CELL302培地 (JRH社製)、 IMDM 培地 (GIBCO BRL社製)、 Hybridoma - SFM培地 (GIBCO BRL社製)、 またはこれら培 地に牛胎児血清等の各種添加物を添加した培地等を用いることができる。 得られ た形質転換株を培地中で培養することで培養上清中に Fc融合蛋白質を生産蓄積さ せることができる。 培養上清中の Fc 融合蛋白質の生産量及び抗原結合活性は ELISA法等により測定できる。 また、 形質転換株は、 特開平 2- 257891に開示され ている方法に従い、 dhfr遺伝子増幅系等を利用して Fc融合蛋白質の生産量を上 昇させることができる。

Fc融合蛋白質は、 形質転換株の培養上清よりプロテイン Aカラムやプロティン Gカラムを用いて精製することができる (アンチボディズ, Chapter 8、 モノクロ 一ナル'アンティボディズ)。 また、 その他に通常、 タンパク質の精製で用いられ る精製方法を使用することができる。 例えば、 ゲル濾過、 イオン交換クロマトグ ラフィー及び限外濾過等を組み合わせて行い、 精製することができる。 精製した Fc 融合蛋白質分子全体の分子量は、 SDS- PAGE [ネイチヤー (Nature) , 227, 680 (1970) ] やウェスタンブロッティング法 (アンチボディズ, Chapter 12、 モノク ローナル 'アンティボディズ) 等で測定することができる。 以上、 動物細胞を宿主とした抗体の製造方法を示したが、 上述したように、 酵 母、 昆虫細胞、 植物細胞または動物個体あるいは植物個体においても製造するこ とができる。

既に、 抗体分子を発現する能力を有している細胞の場合には、 上記 1. に記載 の方法を用いて抗体生産細胞を調製した後に、 該細胞を培養し、 該培養物から目 的とする抗体組成物を精製することにより、 抗体組成物を製造することができる

4. 抗体組成物の活性評価

精製した抗体組成物の蛋白量、 抗原との結合性あるいはエフェクタ一機能を測 定する方法としては、 モノクローナル ·アンチボディズ、 あるいはアンチボデ ィ ·エンジニアリング等に記載の公知の方法を用いることができる。

その具体的な例としては、 抗体組成物がヒト化抗体の場合、 抗原との結合活性、 抗原陽性培養細胞株に対する結合活性は ELISA法およぴ蛍光抗体法 [キャンサー' ィムノ 口ジー 'ィムノセラ ピー (Cancer Immunol. Iramunother. ) , 36, 373

(1993) ] 等により測定できる。 抗原陽性培養細胞株に対する細胞障害活性は、 補 体依存性細胞障害活性 (以下、 CDC活性と表記する) 、 ADCC活性等を測定するこ とにより、 評価することができる [キャンサー'ィムノロジー ·ィムノセラピー

(Cancer Immunol. Iramunother. ) , 36, 373 (1993) ]。 また、 抗体組成物のヒトでの安全性、 治療効果は、 力-クイザル等のヒ トに比 較的近い動物種の適当なモデルを用いて評価することができる。

5. 抗体組成物の糖鎖の分析

各種細胞で発現させた抗体分子の糖鎖構造は、 通常の糖蛋白質の糖鎖構造の解 析に準じて行うことができる。 例えば、 IgG分子に結合している糖鎖はガラクト ース、 マンノース、 フコースなどの中性糖、 N-ァセチルダルコサミンなどのアミ ノ糖、 シアル酸などの酸性糖から構成されており、 糖組成分析およぴ二次元糖鎖 マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。

(1) 中性糖 'ァミノ糖組成分析

抗体分子の糖鎖の組成分析は、 トリフルォロ酢酸等で、 糖鎖の酸加水分解を行 うことにより、 中性糖またはアミノ糖を遊離し、 その組成比を分析することがで きる。

具体的な方法として、 Dionex社製糖組成分析装置 (BioLC) を用いる方法が挙 げ り れ る 。 BioLC は HPAEC-PAD ( high performance anioN - exchange chromatography— pulsed amperometric detection) 法 [ンャ 1 ~ナノレ ·ォブ · リキ ッド ' クロマトグラフィー (J. Liq. Chromatogr. ) , 6, 1577 (1983) ] によって糖 組成を分析する装置である。

また、 2 -ァミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができ る。 具体的には、 公知の方法 [ァグリカルチュラル ·アンド ·バイオロジカル · ケミストリー (Agruc. Biol. Chem. ), 55 (1), 283-284 (1991) ] に従つて酸加水分解 した試料を 2 -ァミノピリジル化で蛍光ラベル化し、 HPLC分析して組成比を算出す ることができる。

(2) 糖鎖構造解析

抗体分子の糖鎖の構造解析は、 2 次元糖鎖マップ法 [アナリティカル ·バイオ ケミストリー (Anal. Biochem. ) , 171, 73 (1988)、 生物化学実験法 23—糖蛋白質 糖鎖研究法 (学会出版センター) 高橋禮子編 (1989年) ] により行うことができ る。 2次元糖鎖マップ法は、 例えば、 X軸には逆相クロマトグラフィー糖鎖の保持 時間または溶出位置を、 Y軸には順相クロマトグラフィーによる糖鎖の保持時間 W または溶出位置を、 それぞれプロットし、 既知糖鎖のそれらの結果と比較するこ とにより、 糖鎖構造を推定する方法である。

具体的には、 抗体をヒドラジン分解して、 抗体から糖鎖を遊離し、 2 -アミノピ リジン (以下、 PA と略記する) による糠鎖の蛍光標識 [ジャーナル'ォプ 'パイ オケミストリー (J. Biochem. ) , 95, 197 (1984) ] を行った後、 ゲルろ過により 糖鎖を過剰の PA化試薬などと分離し、 逆相クロマトグラフィーを行う。 次いで、 分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィーを行う。 これらの結果 をもとに、 2次元糖鎖マップ上にプロットし、 糖鎖スタンダード (TaKaRa社製) 、 文献 [アナリティカル 'バイオケミス トリー (Anal. Biochem. ) , 171, 73 (1988) ] とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。

さらに各糖鎖の MALDI-T0F - MSなどの質量分析を行い、 2次元糖鎖マップ法によ り推定される構造を確認することができる。

6. 本発明により得られる抗体組成物の利用

本発明により得られる抗体組成物は高い ADCC活性を有する。 高い ADCC活性を 有する抗体は、 癌、 炎症疾患、 自己免疫疾患、 アレルギーなどの免疫疾患、 循環 器疾患、 またはウィルスあるいは細菌感染をはじめとする各種疾患の予防およぴ 治療において有用である。

癌、 すなわち悪性腫瘍では癌細胞が増殖している。 通常の抗癌剤は癌細胞の増 殖を抑制することを特徴とする。 し力 し、 高い ADCC活性を有する抗体は、 殺細胞 効果により癌細胞を障害することにより癌を治療することができるため、 通常の 抗癌剤よりも治療薬として有効である。 特に癌の治療薬において、 現状では抗体 医薬単独の抗腫瘍効果は不充分な場合が多く化学療法との併用療法が行われてい るが [サイエンス(Science) , 280, 1197, 1998] 、 本発明により得られる抗体組 成物単独でのより強い抗腫瘍効果が認められれば、 化学療法に対する依存度が低 くなり、 副作用の低減にもつながる。

炎症疾患、 自己免疫疾患、 アレルギーなどの免疫疾患において、 それら疾患に おける生体内反応は、 免疫細胞によるメディエータ分子の放出により惹起される ため、 高い ADCC活性を有する抗体を用いて免疫細胞を除去することにより、 ァレ ルギー反応を抑えることができる。

循環器疾患としては、 動脈硬化などがあげられる。 動脈硬化は、 現在バルーン カテーテルによる治療を行うが、 治療後の再狭窄での動脈細胞の増殖を高い ADCC 活性を有する抗体を用いて抑えることより、 循環器疾患を予防および治療するこ とができる。

ウィルスまたは細菌に感染した細胞の増殖を、 高い ADCC活性を有する抗体を用 いて抑えることにより、 ウィルスまたは細菌感染をはじめとする各種疾患を予防 およぴ治療することができる。

腫瘍関連抗原を認識する抗体、 アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識 する抗体、 循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体、 自己免疫疾患に関連する 抗原を認識する抗体、 またはウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識す る抗体の具体例を以下に述べる。

腫瘍関連抗原を認識する抗体としては、 抗 GD2 抗体 (Anticancer Res. , 13, 331-336, 1993) 、 抗 GD3 抗体 (Cancer Immunol. Imraunother. , 36, 260-266, 1993) 、 抗 G M2 抗体 (Cancer Res., 54, 1511-1516, 1994) 、 抗 HER2 抗体

(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 4285-4289, 1992) 、 抗 CD52抗体 (Nature, 332, 323-327, 1988) 、 抗 MAGE抗体 (British J. Cancer, 83, 493-497, 2000) 、 抗 HM1. 24抗体 (Molecular Immunol. , 36, 387-395, 1999) 、 抗副甲状腺ホル モン関連蛋白 (PTHrP) 抗体 (Cancer, 88, 2909 - 2911, 2000) 、 抗 FGF8 抗体

(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9911-9915, 1989) 抗塩基性繊維芽細胞増殖 因子抗体、 抗 FGF8受容体抗体 (J. Biol. Chem., 265, 16455-16463, 1990) 、 抗 塩基性繊維芽細胞増殖因子受容体抗体、 抗インスリン様増殖因子抗体 (J. Neurosci. Res. , 40, 647-659, 1995) 、 抗ィンスリン様増殖因子受容体抗体 (J. Neurosci. Res., 40, 647-659, 1995) 、 抗 PMSA抗体 (J. Urology, 160, 2396- 2401, 1998) 、 抗血管内皮細胞増殖因子抗体 (Cancer Res., 57, 4593-4599, 1997) 、 抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体 (Oncogene, 19, 2138-2146, 2000) 、 抗 CA125抗体、 抗 17- 1A抗体、 抗インテグリン o; v j3 3抗体、 抗 CD33抗体、 抗 CD22抗体、 抗 HLA抗体、 抗 HLA- DR抗体、 抗 CD20抗体、 抗 CD19抗体、 抗 EGF受 容体抗体 (Immunology Today、 21 (8)、 403-410 ( 2000 ) ) 抗 CD10 抗体

(American Journal of Clinical Pathology, 113, 374-382, 2000)などがあげら れる。

アレルギーあるいは炎症に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗インター ロイキン 6抗体 (Immunol. Rev. , 127, 5 - 24, 1992) 、 抗インタ二ロイキン 6受 容体抗体 (Molecular Immunol. , 31, 371-381, 1994) 、 抗インターロイキン 5抗 体 (Immunol. Rev. , 127, 5-24, 1992) 、 抗インターロイキン 5受容体抗体、 抗 インターロイキン 4抗体 (Cytokine, 3, 562-567, 1991) 、 抗インターロイキン 4 受容体抗体 (J. Immunol. Meth. , 217, 41-50, 1998) 、 抗腫瘍壊死因子抗体 (Hybridoma, 13, 183 - 190, 1994) 、 抗腫瘍壌死因子受容体抗体 (Molecular Pharmacol. , 58, 237-245, 2000 ) 、 抗 CCR4 抗体 ( Nature, 400, 776 - 780,

1999) 、 抗ケモカイン抗体 (J. Immunol. Meth. , 174, 249-257, 1994) 、 抗ケモ 力イン受容体抗体 (J. Exp. Med. , 186, 1373-1381, 1997) 、 抗 IgE 抗体、 抗 CD23 抗体、 抗 CDlla 抗体 (Immunology Today、 21 (8)、 403-410 (2000) )、 抗 CRTH2抗体 (J Immunol. , 162, 1278-1286 (1999) )、 抗 CCR8抗体 (W099/25734)、 抗 CCR3抗体 (US6207155) などがあげられる。

循環器疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗 GpIIb/IIIa抗体 (J. Immunol. , 152, 2968-2976, 1994) 、 抗血小板由来増殖因子抗体 (Science, 253, 1129-1132, 1991) 、 抗血小板由来増殖因子受容体抗体 (J. Biol. Chem. , 272, 17400-17404, 1997) または抗血液凝固因子抗体 (Circulation, 101, 1158-1164,

2000) などが挙げられる。

自己免疫疾患に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗自己 DNA 抗体

(Immunol. Letters, 72, 61-68, 2000) などが挙げられる。

ウィルスあるいは細菌感染に関連する抗原を認識する抗体としては、 抗 g p l20 抗体 (Structure, 8, 385—395, 2000) 、 抗 CD4 抗体 (J. Rheumatology, 25, 2065-2076, 1998) 、 抗 CCR4抗体、 抗ベロ毒素抗体 (J. Clin. Microbiol. , 37, 396-399, 1999) 、 自己免疫疾患 (乾癬、 関節リウマチ、 クローン病、 潰瘍性大腸 炎、 全身性エリテマトーデス、 多発性硬化症など)、 抗 CDlla抗体、 抗 ICAM3抗体、 抗 CD80抗体、 抗 CD2抗体、 抗 CD3抗体、 抗 CD4抗体、 抗インテグリン α 4 ]3 7抗 体、 抗 CD40L 抗体、 抗 IL- 2 受容体抗体 (Immunology Today, 21 (8)、 403-410

(2000) ) などが挙げられる。

上記抗体は、 A T C C (The American Type Culture Collection) 、 理化学研 究所細胞開発銀行、 工業技術院生命工業技術研究所等の公的な機関、 あるいは大 日本製薬株式会社、 R&D SYSTEMS社、 PharMingen社、 コスモバイオ社、 フナコシ 株式会社等の民間試薬販売会社から入手することができる。

本発明により得られる抗体組成物を含有する医薬は、 治療薬として単独で投与 することも可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上 の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法によ り製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。 投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投 与、 または口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与 をあげることができ、 抗体製剤の場合、 望ましくは静脈内投与をあげることがで さる。

投与形態としては、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。

経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等があげられる。

乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果 糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油等の油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の 防腐剤、 ストロベリーフレーバー、 ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤と して用いて製造できる。

カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 プドウ糖、 ショ糖、 マンュトー ル等の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグ ネシゥム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビュルアルコール、 ヒ ドロキシプロピルセル ロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の 可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。

非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。

注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等を用 いて調製される。 または、 抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、 これに塩化ナ トリゥムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。

座剤は力力ォ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。

また、 噴霧剤は該抗体組成物そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜 を刺激せず、 かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる 担体等を用いて調製される。

担体として具体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 該抗体組成物および 用いる担体の性質により、 エアロゾル、 ドライパウダー等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加す ることもできる。

投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等により異なるが、 通常成人 1日当たり 10 /i g/kg〜20mg/kgである。 また、 抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、 イン ビトロ実験としては、 CDC活性測定法、 ADCC活性測定法等があげられ、 インビポ 実験としては、 マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等があげられ る。

CDC活性、 ADCC活性、 抗腫瘍実験は、 文献 [キャンサー ·ィムノロジー .ィム ノセラピー(Cancer Immunology Immunotherapy) , 36, 373 (1993) ;キャンサー - リサーチ(Cancer Research) , 54, 1511 (1994) ] 等記載の方法に従って行うこと ができる。

以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、 実施例は本発明の単な る例示を示すものにすぎず、 本発明の範囲を限定するものではない。 図面の簡単な説明

第 1図は、 ラットミエローマ YB2/0細胞 KM2760#58- 35- 16株おょぴ 1-15株が生 産する抗 CCR4キメラ抗体の CCR4/EL- 4細胞に対する ADCC活性を示した図である。 縦軸に細胞障害活性、 横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。 口が KM2760#58-35- 16株 生産抗 CCR4キメラ抗体 KM2760- 1、 △が抗 CCR4キメラ抗体 1 - 15株生産 KM2760-2 の活性をそれぞれ示す。

第 2図は、 mfFUT8 - 6、 pAGE249導入株によって生産した抗 CCR4キメラ抗体から 調製した PA化糖鎖を、 それぞれ逆相 HPLCで分析して得た溶離図を示したもので ある。 第 2A図に mfFUT8-6株によって生産した抗体から調製した PA化糖鎖、 第 2B図に PAGE249導入株によって生産した抗体から調製した PA化糖鎖の溶離図を それぞれ示す。 縦軸に相対蛍光強度、 横軸に溶出時間をそれぞれ示す。

第 3図は、 RT-PCR法を用いた各宿主細胞株における FUT8および ァクチン転 写産物量の定量結果を示した写真である。 ΚΜ2760- 1 生産株である ΚΜ2760#58-35- 16株、 ΚΜ2760- 2 生産株である 1 - 15 株、 および親株であるラットミエローマ ΥΒ2/0細胞から調製した cDNAを鎵型とし、 FU8特異的プライマーセット (配列番 号 13 および 14) あるいは ]3 -ァクチン特異的プライマー (配列番号 11 および 12) を用いて PCR反応を行い、 該反応液をァガロースゲル電気泳動に供した結果 を示す。

第 4図は、 プラスミド ploxPPuroの構築を示した図である。

第 5図は、 プラスミド PK0FUT8gE2- 1の構築を示した図である。

第 6図は、 プラスミド pK0FUT8gE2-2の構築を示した図である。 第 7図は、 プラスミド pscFUT8gE2- 3の構築を示した図である。

第 8図は、 プラスミド pK0FUT8gE2-3の構築を示した図である。

第 9図は、 プラスミド pK0FUT8gE2-4の構築を示した図である。

第 10図は、 プラスミド pK0FUT8gE2_5の構築を示した図である。

第 11図は、 プラスミド pK0FUT8Puroの構築を示した図である。

第 12 図は、 ひ 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子破壌 CH0細胞株である

1st. AFUT8 2-46-1株および 1st. AFUT8 2-46株のゲノムサザン解析結果を示し た写真である。

第 13図は、 α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ(FUT8) 遺伝子破壊 CH0細胞株 である lst. AFUT8 2-46株おょぴ 2-46-H10株のゲノムサザン解析結果を示した図 である。

第 14図は、 FUT8対立遺伝子破壌株より精製した抗 CCR4キメラ抗体の ADCC活 性を示した写真である。 縦軸に細胞障害活性、 横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。 ▲、 醒はそれぞれ、 抗 CCR4キメラ抗体生産 CH0細胞 5-03株由来の精製抗体、 お よび 1st. AFUT8 2-46-1株由来の精製抗体の活性をそれぞれ示す。

第 15図は、 プラスミド PK0FUT8Neoの構築を示した図である。

第 16図は、 CH0/DG44細胞の FUT8対立遺伝子を 1コピー破壊したクローンのゲ ノムサザン解析結果を示した写真である。

第 17図は、 CH0/DG44細胞の FUT8両対立遺伝子を破壊したクローンのゲノムサ ザン解析結果を示した写真である。

第 18図は、 CH0/DG44細胞の FUT8両対立遺伝子より薬剤耐性遺伝子を除去した クローンのゲノムサザン解析結果を示した写真である。

第 19図は、 プラスミド pBs-2B8Lの構築を示した図である。

第 20図は、 プラスミド pBs- 2B8Hおよびプラスミド pBs_2B8Hmの構築を示した 図である。

第 21図は、 プラスミド pKANTEX2B8Pの構築を示した図である。

第 22図は、 CH0/DG44細胞由来 FUT8遺伝子ダブルノックァゥト株より精製した 抗 CD20キメラ抗体のヒト Bリンパ球培養細胞株 Rajiに対する ADCC活性を示した 図である。 縦軸に細胞障害活性、 横軸に抗体濃度をそれぞれ示す。

第 23図は、 プラスミド CHfFUT8- pCR2. 1の構築を示した図である。 発明を実施するための最良の形態

実施例 1. 抗 CCR4キメラ抗体の安定生産細胞の作製

W001/64754記載の抗 CCR4キメラ抗体のタンデム型発現ベクター pKANTEX2160を 用いて抗 CCR4キメラ抗体の安定生産細胞を以下のようにして作製した。

(1) ラットミエローマ YB2/0細胞を用いた生産細胞の作製

10 μ gの抗 CCR4キメラ抗体発現べクター pKANTEX2160を 4 X 106細胞のラットミ エローマ YB2/0細胞 (ATCC CRL1662) へエレク トロポレーシヨン法 [サイ トテク ノロジー (Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] により導入後、 40mLの Hybridoma- SFM- FBS (5) [FBS (PAAラボラトリーズ社製) を 5%含む Hybridoma- SFM培地 (ィ ンビトロジヱン社製) ] に懸濁し、 96 ゥヱル培養用プレート (住友ベークライト 社製) に 200 !7ゥヱルずつ分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°C、 24時 間培養した後、 G418を lmg/mLになるように添加して 1〜2週間培養した。 G418耐 性を示す形質転換株のコロニーが出現し、 増殖の認められたゥヱルより培養上清 を回収し、 上清中の抗 CCR4 キメラ抗体の抗原結合活性を実施例 2 (2) 項記載の ELISA法により測定した。

培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥエルの形質転換株につい ては、 DHFR遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、 G418 を lmg/mL、 DHFR の阻害剤である MTX (SIGMA社製) を δΟηΜ含む Hybridoma- SFM- FBS (5) 培地に 1〜2 X 105細胞/ ml になるように懸濁し、 24 ゥ: nルプレート (Greiner社製)に 1mlずつ分注した。 5%C02ィンキュベータ一内で 37°Cで 1〜2週 間培養して、 50nM MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。 形質転換株の増殖が認 められたゥエルの培養上清中の抗 CCR4 キメラ抗体の抗原結合活性を実施例 2 (2) 項記載の ELISA法により測定した。

培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥヱルの形質転換株につい ては、 上記と同様の方法により、 MTX濃度を上昇させ、 最終的に MTXを 200nMの 濃度で含む Hybridoma_SFM-FBS (5) 培地で増殖可能かつ、 抗 CCR4キメラ抗体を高 生産する形質転換株を得た。 得られた形質転換株について、 2 回の限界希釈法に よる単一細胞化 (クローン化) を行い、 得られたクローン化株を 腿 2760#58- 3δ - 16と名付けた。 尚、 W000/61739記載の a l,6 -フコシルトランスフェラーゼ (以下、

「FUT8」 と表記する) の遺伝子の転写物の定量法を用い、 該転写物が比較的低い 株を優良株として選択し用いた。 (2) CH0/DG44細胞を用いた生産細胞の作製

抗 CCR4 キメラ抗体発現ベクター pKANTEX2160 の 4 / g を 1. 6 X 106細胞の CH0/DG44 細胞 [Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986) ]へエレ クトロポレーシヨン法 [サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990) ] により導入後、 10ml の IMDM- dFBS (10) _HT (l) [dFBS (インビトロジェン社製) を 10%、 HT supplement (インビトロジェン社製) を 1倍濃度で含む IMDM培地 (ィ ンビトロジヱン社製) ] に懸濁し、 96 ゥヱル培養用プレート (岩城硝子社製) に 100 1/ゥエルずつ分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°C、 24時間培養し た後、 IMDM- dFBS (10) (透析 FBSを 10%で含む IMDM培地) に培地交換し、 1〜2週 間培養した。 HT非依存的な増殖を示す形質転換株のコロニーが出現したため、 増 殖の認められたゥエルより培養上清を回収し、 上清中の抗 CCR4キメラ抗体の発現 量を実施例 2 (2) 記載の ELISA法により測定した。

培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥエルの形質転換株につい ては、 DHFR遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、 MTXを 50nM 含む IMDM- dFBS (10) 培地に 1〜2 X 105細胞/ mlになるように懸濁し、 24 ゥエルプ レート (岩城硝子社製) に 0. 5ml ずつ分注した。 5%C02インキュベーター内で 37°Cで 1〜2週間培養して、 50nM MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。 増殖が 認められたゥエルの形質転換株については、 上記と同様の方法により、 MTX濃度 を 200nMに上昇させ、 最終的に MTXを 200nMの濃度で含む IMDM- dFBS (10) 培地で 増殖可能かつ、 抗 CCR4キメラ抗体を高生産する形質転換株を得た。 得られた形質 転換株は 5 - 03株と名付けた。 実施例 2. FUT8遺伝子の発現が低下した抗体生産細胞が生産する抗体組成物と 親株細胞が生産する抗体組成物との比較

a 1, 6-フコース修飾酵素の活性が親株細胞より低下した抗体生産細胞が生産す る抗体組成物と、 親株細胞が生産する抗体組成物との ADCC活性の比較を行った。

(1) 抗体組成物の調製

1, 6-フコース修飾酵素の活性が親株より低下した抗体生産細胞が生産する抗 体組成物としては、 実施例 1 の(1)記載の FUT8 遺伝子の転写物量が低い KM2760#58-35- 16株の培養上清より精製した抗体組成物 KM2760-1を用いた。 親株細胞であるラットミエローマ YB2/0細胞 (ATCC CRL1662)が生産する抗体組 成物は、 以下のようにして調製した。

lO ^i gの抗 CCR4キメラ抗体発現ベクター pKANTEX2l60 (W001/64754記載) を 4 X 106細胞のラットミエロ一マ YB2/0細胞 (ATCC CRL1662) へェレクト口ポレーシ ヨン法 [サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990) ] により導入後、 40mL の Hybridoma- SFM - FBS (5) [FBS (PAA ラボラ トリーズ社製) を 5 %含む Hybridoma-SFM培地 (ィンビトロジェン社製) ] に懸濁し、 96ゥエル培養用プレー ト (住友べ一クライト社製) に 200 I L/ゥエルずつ分注した。 5%C02インキュべ 一ター内で 37° (:、 24時間培養した後、 G418を lmg/mLになるように添加して 1〜2 週間培養した。 G418耐性を示す形質転換株のコロニーが出現し、 増殖の認められ たゥヱルより培養上清を回収し、 上清中の抗 CCR4キメラ抗体の抗原結合活性を本 項 (2) 記載の ELISA法により測定した。

培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥエルの形質転換株につい ては、 DHFR遺伝子増幅系を利用して抗体生産量を増加させる目的で、 G418 を lmg/mL、 DHFR の阻害剤である MTX (SIGMA社製) を 50nM含む Hybridoma- SFM - FBS (5) 培地に 1〜2 X 105細胞/ ml になるように懸濁し、 24 ゥエルプレート (Greiner社製)に 1mlずつ分注した。 5%C02ィンキュベータ一内で 37°Cで 1〜2週 間培養して、 50nM MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。 形質転換株の増殖が認 められたゥエルの培養上清中の抗 CCR4 キメラ抗体の抗原結合活性を本項 (2) 記 載の ELISA法により測定した。

培養上清中に抗 CCR4キメラ抗体の生産が認められたゥヱルの形質転換株につい ては、 上記と同様の方法により、 ΜΤΧ濃度を上昇させ、 最終的に ΜΤΧを 200ηΜの 濃度で含む Hybridoma- SFM-FBS (5) 培地で増殖可能かつ、 抗 CCR4キメラ抗体を高 生産する形質転換株を得た。 得られた形質転換株を 1 - 15株と名付けた。 尚、 1 - 15 株に関しては限界希釈法による単一細胞化 (クローン化) を行わなかった。

取得した形質転換株 1-15が生産する抗 CCR4キメラ抗体の精製は以下のように 行った。

抗 CCR4 キメラ抗体を発現する形質転換株 1-15 を 200nM MTX、 Daigo' s GF21 (和光純薬製) を 5%の濃度で含む Hybridoma-SFM (インビトロジヱン社製) 培地 に 2 X 105細胞/ ml となる様に懸濁し、 スピナ一ボトル (岩城硝子社製) を用いて 37°Cの恒温室内で Fed- Batch攪拌培養した。 8-10 日間培養して回収した培養上清 より、 Prosep_A (ミリポア社製) カラムおよびゲルろ過法を用いて、 抗 CCR4キメ ラ抗体を精製した。 精製した抗 CCR4キメラ抗体を KM2760-2と名づけた。

(2) 抗体組成物の抗原結合活性

本実施例 (1) で得られた 2種類の抗体組成物について抗原結合活性を以下に示 す ELISA法により測定した。

抗 CCR4キメラ抗体が反応し得るヒト CCR4細胞外領域べプチドとして化合物 1 (配列番号 6) を選択した。 ELISA法による活性測定に用いるため、 以下の方法で BSA (Bovine Serum Albumin) (ナカライテスク社製) とのコンジュゲートを作製 し、 抗原として用いた。 すなわち、 10 mg の BSA を含む PBS溶液 900 mL に、 100ml の 25mg/mL SMCC [4- (N -マレイミ ドメチル) シク口へキサン -1-カルボキシ リックァシッド N-ヒドロキシサクシンィミドエステル] (シグマ社製)- DMS0溶液 を撹拌しながら滴下し、 30 分間ゆつくりと攪拌した。 25 mL PBS で平衡化した NAP-10カラムなどのゲルろ過カラムに反応液 ImLをアプライし、 1. 5mLの PBSで 溶出させた溶出液を BSA - SMCC溶液とした (A28。測定から BSA濃度を算出)。 次に、 0. 5 mgの化合物 1に 250mL PBSを加え、 次いで 250mL DMFを加えて完全に溶解さ せた後、 前述の BSA- SMCC溶液 (BSA換算 1. 25mg) を撹拌しながら添加して 3時間 ゆっくり攪拌した。 反応液を PBSに対して 4°C、 一晚透析し、 最終濃度 0. 05%とな るようにアジ化ナトリウムを添加して、 0. 22 瞧フィルターでろ過した後 BSA -化 合物 1溶液とした。

96穴の EIA用プレート (グライナ一社製) に、 上述のように調製したコンジュ ゲートを 0. 05 Ai g/mL、 50 1/ゥヱルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。 PBSで洗浄後、 1%BSA- PBSを lOO /z L/ゥエルで加え、 室温で 1時間反応させて残存 する活性基をブロックした。 各ゥヱルを 0. 05 %Tween20 を含む PBS (以下、 TweeN-PBS と表記する) で洗浄後、 形質転換株の培養上清を 50 L/ゥヱルで加え、 室温で 1 時間反応させた。 反応後、 各ゥエルを TweeN- PBS で洗浄後、 1%BSA- PBS で 6000 倍に希釈したペルォキシダーゼ標識ャギ抗ヒ ト IgG ( T/ ) 抗体溶液 (American Qualex社製) を二次抗体溶液として、 それぞれ 50 μ L/ゥヱルで加え、 室温で 1時間反応させた。 反応後、 Tween - PBSで洗浄後、 ABTS基質液を 50 μ ΐ ゥ ヱルで加えて発色させ、 20分後に 5%SDS溶液を 50 μ !7ゥヱル加えて反応を停止 した。 その後 415nmの吸光度を測定した。 その結果、 精製した KM2760-1および KM2760-2の CCR4部分べプチドに対する結 合活性を上記記載の ELISAにより測定した結果、 同等の結合活性を示した。

(3) 抗体組成物の ADCC活性

精製した KM2760- 1および KM2760-2の ADCC活性を以下の方法で測定した。

抗 CCR4キメラ抗体のヒト CCR4高発現細胞である CCR4/EL- 4細胞 (W001/64754) に対する ADCC活性は、 以下のようにして測定した。

(a) 標的細胞溶液の調製

W001/64754に記載のヒト CCR4を発現している CCR4/EL- 4細胞の 1. 5 X 106細胞 を調製し、 放射性物質である Na2 51Cr04を 5. 55MBq当量加えて 37°Cで 1時間 30分 間反応させ、 細胞を放射線標識した。 反応後、 培地を用いた懸濁および遠心分離 操作により 3回洗浄し、 培地に再懸濁し、 4°Cで 30分間氷中に放置して放射性物 質を自然解離させた。 遠心分離後、 培地を 15mLカロえ、 2 X 105細胞/ mLに調製し、 標的細胞溶液とした。

(b) ヒ トェフエクタ一細胞溶液の調製

健常人末梢血 60mLを採取し、 へパリンナトリゥム (清水製薬社製) を 0. 6mLを 加え穏やかに混ぜた。 これを Lymphoprep (AXIS SHIELD社製) を用いて使用説明 書に従い、 遠心分離 (800g、 20分間) して単核球層を分離した。 培地で 3回遠心 分離 (1400rpm、 5分間) して洗浄後、 培地を用いて 5 X 106細胞/ mLの濃度で再懸 濁し、 ヒ トエフヱクタ一細胞溶液とした。

(c) ADCC活性の測定

96 ゥヱル U字底プレート (Falcon社製) の各ゥヱルに上記 (1) で調製した標 的細胞溶液の 50 (1 X 104細胞/ゥエル) を分注した。 次いで上記 (2) で調製 したヒトエフェクター細胞溶液を 100 i L (5 X 105細胞/ゥエル、 ヒトェフエクタ 一細胞と標的細胞の比は 50 : 1 となる) 添加した。 さらに、 抗 CCR4キメラ抗体を 各最終濃度 0. 0001〜10 μ g/mLとなるように加え、 37°Cで 4時間反応させた。 反応 後、 プレートを遠心分離し、 上清中の51 Cr量を カウンタ一にて測定した。 自然 解離 51Cr量は、 ヒトエフェクター細胞溶液、 抗体溶液の代わりに培地のみを用い て上記と同様の操作を行い、 上清中の 51Cr量を測定することにより求めた。 全解 離 51Cr量は、 抗体溶液とヒトエフヱクタ一細胞溶液の代わりに lmol/Lの塩酸溶液 を添加し、 上記と同様の操作を行い、 上清中の 51Cr量を測定することにより求め た。 ADCC活性 (%) は下式 (I) により求めた。

(検体上清中の51 Cr量) 一 (自然遊離51 Cr量)

ADCC活性(%) = X 100 (I)

(全遊離51 Cr量) ― (自然遊離51 Cr量) 上記記載の方法により測定した結果、 KM2760- 1 と KM2760- 2 では有意に活性が 相違し、 KM2760-2の方が有意に低かった (第 1図) 。

(4) 抗体組成物の糖鎖解析

KM2760-1および KM2760- 2の糖鎖分析を以下の方法に従って行った。

KM2760-1 および KM2760-2 についてそれぞれヒドラジン分解を行い、 糖鎖を蛋 白質から切断した [メソッド 'ォブ ·ェンザィモロジ一 (Method of Enzymology) , 83, 263, 1982]。 減圧留去することによってヒドラジンを除去した後、 酢酸アン モユウム水溶液と無水酢酸加えて Ν-ァセチルイヒを行った。 凍結乾燥後、 2 -ァミノ ピリジンによる蛍光標識を行った [ジャーナル ·ォブ ·バイオケミストリー (J. Biochem. ) , 95, 197, 1984]。 蛍光標識した糖鎖群 (PA 化糖鎖群) を、 Surperdex Peptide HR 10/30 カラム (Pharmacia社製) を用いて過剰な試薬と分 離した。 糖鎖画分を遠心濃縮機にて乾固させ、 精製 PA化糖鎖群とした。 次に、 CLC-0DSカラム (Shimadzu社製) を用いて、 精製 PA化糖鎖群の逆相 HPLC分析を 行った (第 2図)。

緩衝液 Aとしてリン酸ナトリゥム緩衝液 (pH3. 8) 、 緩衝液 Bとして 0. 5%1 -ブ タノールを含むリン酸ナトリウム緩衝液 (pH3. 8) を用い、 以下のグラジェントで 分析した。 時間 (分) 0 80 90 90. 1 120

緩衝液 B (%) 0 60 60 0 0 第 2図で示した(1)〜(8)のピークは、 それぞれ以下の構造を示す。 (1)

GlcNAcjSl-2 an«l

0 Man/81-4G1CNAC/8 l-4GlcNAc-PA

Glc Ac^l^ anffl7

(2)

Galj9 l-4GlcNAc β l-2Man al

Man 51一 4GlcNAc β 1一 4<3cNAc — PA

GlcNAc β 1 - 2Man

(3)

GlcNAc

ManjS l- GlcNA(¾g l-4GlcNAo-PA

Gal l-4GlcNAqg l-2Manof V

(4)

Gal β 1— 4GlcNAc β 1— 2Man L

\ Man β 1一 4C3cNAc β 1― 4<3cNAc — PA

(5)

GlcNAc β 1一 2Man a 1、 Fuc

V 6

¾ Man β 1一 43cNAc β 1一 GlcNAc - PA

GlcNAc β 1― 2 anノ

(6)

Gal β 1- 4C3cNAc β I一 2Man K Fuc a \

V 6 ,

¾ Man β 1― 4C3cNAc β 1一 4GlcNAc 一 PA

GlcNAc β 1一 2Man a l

(7)

GlcNAc β 1一 2Man 1 Fuc α

6

° Man β 1― 4G5。NAc β 1一 4 cNAc 一 PA

Oal β 1- cNAc β 1一 2Manノ

(8)

Gal β 1— 4GlcNAc β 1― 2 an of Fuc α

V 6

° Man β 1— 4GlcNAc β 1— 4GlcNAc—PA

Gal β 1— 4GlcNAc β 1— 2Man ofゾ 1

GlcNAc は N-ァセチルダルコサミン、 Gal はガラク トース、 Man はマンノース、 Fucはフコース、 PAはピリジルァミノ基を示す。

第 2図において、 eel,6-フコースを持たない糖鎖群の割合は、 (1)〜(8) のうち (1)〜(4)のピークが占める面積、 al,6-フコースが結合した糖鎖群の割合は、 (1) 〜(8)のうち (5)〜(8) のピークが占める面積から算出した。

ひ 1, 6-フコースを持たない糖鎖の割合に関して違いが観察され、 匿 760-2 の方 が有意に低かった。 (5) 抗体組成物を生産する細胞の FUT8遺伝子の発現量

親株細胞であるラッ トミエローマ YB2/0 細胞、 KM2760- 1 生産株である KM2760#58-35-16株、 および KM2760- 2生産株である 1-15株の FUT8および] 3 -ァ クチン遺伝子の転写物の量を、 W000/61739の実施例 8に記載の定量法にしたがつ て測定した結果を第 3図に示す。 1-15株の FUT8遺伝子の発現量は、 親株細胞で あるラットミエローマ YB2/0細胞と同等であつたが、 KM2760#58-35- 16株の発現 量はこれら株と比較して明らかに低かつた。

以上の結果より、 ct l, 6 -フコース修飾酵素の活性が親株細胞より低下した抗体 生産細胞は、 親株細胞が生産する抗体組成物より ADCC活性の高い抗体組成物を生 産することが可能であることが確認された。 実施例 3. FUT8遺伝子が破壊された CH0細胞の作製と該細胞を用いた抗体の生 産

CH0細胞 FUT8遺伝子のエタソン 2を含むゲノム領域を欠失した CH0細胞を作製 し、 該細胞が生産する抗体の ADCC活性を評価した。

1. チャイニーズハムスター FUT8遺伝子ェクソン 2 ターゲティングベクタープ ラスミ ド pK0FUT8Puroの構築

(1) プラスミ ド ploxPPuroの構築

以下の手順でプラスミド ploxPPuroを構築した (第 4図)。

プラスミド pKOSelectPuro (Lexicon社製) 1. 0 gを NEBuf f er 4 (New England Biolabs社製) 35 μ ΐ に溶解し、 20単位の制限酵素 ^I (New England Biolabs 社製) を加えて 37°Cで 2 時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8 % (w/v)ァガロースゲル電気泳動に供し、 ピューロマイシン耐' 1"生遺伝子発現ュニット を含む約 1. 5Kbの DNA断片を精製した。

一方、 特開平 11-314512に記載のプラスミド ploxP l. O w gを NEBuffer 4 (New England Biolabs社製) 35 μ 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 2 時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を

0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 2. 0Kbの DNA断片を精製した。 上記で得たプラスミド pKOSelectPuro由来の Ascl-Ascl断片 (約 1. 5Kb) 4. 5 μ

1、 プラスミド ploxP由来の Ascl-Ascl断片 (約 2. 0Kb) 0· 5 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製) 5. 0 μ 1を混合し、 16°Cで 30分間反応させることにより結合反応を 行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られたアンピシリン 耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離した。 本プラス ミドを以下、 ploxPPuroと称す。

(2) プラスミ ド PK0FUT8gE2- 1の構築

参考例(2) で得たチャイニーズハムスター FUT8 のェクソン 2を含むゲノム領域 を有するプラスミ ド pFUT8fgE2- 2 を用いて、 以下の手順でプラスミ ド pK0FUT8gE2-lを構築した (第 5図)。

プラスミ ド pFUT8fgE2_2 2. O g を、 lOO g/ml BSA (New England Biolabs社 製) を含む NEBuffer 1 (New England Biolabs社製) 35 μ ΐ に溶解し、 制限酵素 Sacl (New England Biolabs社製) 20単位を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行つ た。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 lOO w g/ml BSA (New England Biolabs 社製) を含む NEBuffer 2 (New England Biolabs 社 製) 35 1に溶解し、 20単位の制限酵素 EcoRV (New England Biolabs社製) を加 えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロー スゲル電気泳動に供し、 約 1. 5Kbの DNA断片を精製した。

—方、 プラスミ ド LITMUS28 (New England Biolabs 社製) 1. 0 ^ g を、 100 g/ml BSA (New England Biolabs社製) を含む NEBuffer 1 (New England Biolabs 社製) 35 μ ΐに溶解し、 制限酵素 (New England Biolabs社製) 20単位を加 えて 37°Cで 2 時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA 断片を回収した後、 100 μ g/ml BSA (New England Biolabs 社製) を含む NEBuffer 2 (New England Biolabs 社製) 35 μ 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 EcoRV (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消 化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 2. 8Kb の DNA 断片を精製した。

上記で得たプラスミド pFUT8fgE2- 2由来の EcoRV- Sacl断片 (約 1. 5Kb) 4. 5 μ 1、 プラスミド LITMUS28由来の EcoRV- Sacl断片 (約 2. 8Kb) 0. 5 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製) 5. 0 1を混合し、 16°Cで 30分間反応させることにより結合反応を 行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られたアンピシリン 耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離した。 本プラス ミドを以下、 pK0FUT8gE2-lと称す。 (3) プラスミ ド pK0FUT8gE2_2の構築

本項 (2) で得たプラスミド pK0FUT8gE2- 1 を用いて、 以下の手順でプラスミド pK0FUT8gE2-2を構築した (第 6図)。

プラスミ ド pK0FUT8gE2-l 2. 0 // gを、 lOO ^ g/ml BSA (New England Biolabs社 製) を含む NEBuffer 2 (New England Biolabs社製) 30 μ ΐ に溶解し、 制限酵素 EcoRV (New England Biolabs社製) 20単位を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行 つた。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 lOO ^u g/ml BSA (New England Biolabs社製) を含む NEBuffer 1 (New England Biolabs 社 製) 30 i l に溶解し、 20単位の制限酵素 Kpnl (New England Biolabs社製) を加 えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロー スゲル電気泳動に供し、 約 1. 5Kbの DNA断片を精製した。

一方、 プラスミド ploxPPuro 1. を、 NEBuffer 4 (New England Biolabs社 製) 30 μ ΐに溶解し、 制限酵素 1^1 (New England Biolabs社製) 20単位を加え て 37°Cで 2時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA 断片を回収.した後、 lOO ^ g/ml BSA (New England Biolabs社製) を含む NEBuffer 1 (New England Biolabs社製) 30 μ 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 3. 5Kb の DNA断片を精 製した。

上記で得たプラスミド pK0FUT8gE2- 1由来の EcoRV-Kpnl断片 (約 1. 5Kb) 4. 0 μ 1、 プラスミド ploxPPuro 由来の Hpal-Kpnl 断片 (約 3. 5Kb) Ι. Ο μ 1 Ligation High (東洋紡社製) 5. 0 1 を混合し、 16°Cで 30分間反応させることにより結合 反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られたアンピ シリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離した。 本 プラスミドを以下、 pK0FUT8gE2 - 2と称す。

(4) プラスミ ド pscFUT8gE2- 3の構築

参考例(2) で得たチャイニーズハムスター FUT8のェクソン 2を含むゲノム領域 を有するプラスミ ド PFUT8fgE2- 4 を用いて、 以下の手順でプラスミ ド pscFUT8gE2-3を構築した (第 7図)。

プラスミド pFUT8fgE2- 4 2. O /^t gを NEBuffer 1 (New England Biolabs社製) 35 μ ΐ に溶解し、 20単位の制限酵素 (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断 片を回収した後、 Blunting High (東洋紡社製) を用い、 添付の説明書に従って DNA末端の平滑ィ匕を行った。 フエノール/クロ口ホルム抽出処理およびエタノール 沈殿を行って DNA 断片を回収した後、 NEBuffer 2 (New England Biolabs社製) 35 / lに溶解し、 20単位の制限酵素 Hindlll (New England Biolabs社製) を加え て 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロース ゲル電気泳動に供し、 約 3. 5Kbの DNA断片を精製した。

一方、 プラスミド LITMUS39 (New England Biolabs社製) 1. 0 gを NEBuffer 2 (New England Biolabs 社製) 35 /x 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 EcoRV (New England Biolabs社製) および 20単位の制限酵素 Hindlll (New England Biolabs 社製) を加えて 37°Cで 2 時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 2. 8Kbの DNA断片を精製した。

上記で得たプラスミ ド pFUT8fgE2- 4 由来の Hpall - Hindlll 断片 (約 3. 5Kb) 4. 0 i l, プラスミド LITMUS39 由来の EcoRV-Hindlll 断片 (約 2. 8Kb) 1. 0 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製) 5· 0 μ 1を混合し、 16°Cで 30分間反応させることに より結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られ たアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離 した。 本プラスミドを以下、 pscFUT8gE2-3と称す。

(5) プラスミ ド pK0FUT8gE2-3の構築

参考例 (2)で得たチャイニーズハムスタ一 FUT8のェクソン 2を含むゲノム領域 を有するプラスミ ド pFUT8fgE2- 4 を用いて、 以下の手順でプラスミ ド pK0FUT8gE2-3を構築した (第 8図)。

プラスミド pFUT8fgE2— 4 を NEBuffer for EcoRI (New England Biolabs 社製) 35 i lに溶解し、 20単位の制限酵素 EcoRI (New England Biolabs社製) お ょぴ 20単位の制限酵素 Hindlll (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 2 時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳 動に供し、 約 1. 8Kbの DNA断片を精製した。

一方、 プラスミド pBluescriptll KS (+) (Strategene社製) 1. 0 μ gを NEBuffer for EcoRI (New England Biolabs 社製) 3δ μ 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 EcoRI (New England Biolabs 社製) および 20 単位の制限酵素幽(1111 (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 3. 0Kbの DNA断片を精製 した。

上記で得たプラスミド pFUT8fgE2- 4由来の Hindlll-EcoRI断片 (約 1. 8Kb) 4. 0 μ 1、 プラスミド pBluescriptll KS (+)由来の Hindlll- EcoRI断片 (約 3. 0Kb) 1. 0 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製) 5. 0 ^ 1 を混合し、 16°Cで 30分間反応させる ことにより結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離した。 本プラスミドを以下、 PK0FUT8gE2 - 3と称す。

(6) プラスミド pK0FUT8gE2- 4の構築

本項 (4) および (5) で得たプラスミド pscFUT8gE2- 3および PK0FUT8gE2_3を 用いて、 以下の手順でプラスミド pK0FUT8gE2- 4を構築した (第 9図)。

プラスミド pscFUT8gE2- 3 1. 0 /i gを、 lOO g/ml BSA (New England Biolabs社 製) を含む NEBuffer for Sail (New England Biolabs社製) 35 1に溶解し、 制 限酵素 il (New England Biolabs社製) 20単位を加えて 37°Cで 2時間消化反応 を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA 断片を回収した後、 NEBuffer 2 (New England Biolabs 社製) 30 / 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 Hindi II (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 3. 6Kb の DNA断片を精製した。

一方、 プラスミ ド pK0FUT8gE2- 3 1. 0 μ g を、 100 μ g/ml BSA (New England Biolabs社製) を含む NEBuffer for Sail (New England Biolabs社製) 35 μ ΐに 溶解し、 制限酵素 Sail (New England Biolabs社製) 20単位を加えて 37°Cで 2時 間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収し た後、 NEBuffer 2 (New England Biolabs社製) 35 1 に溶解し、 20単位の制限 酵素 Hindlll (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行 つた。 消化反応後、 PH8. 0の lmol/1 Tris-HCl緩衝液 35 / lおよび大腸菌 C15株 由来 Alkaline Phosphatase (宝酒造社製) 3. 5 μ 1 を添加し、 65°Cで 30分間反応 させることにより DNA末端の脱リン酸ィ匕を行った。 脱リン酸化処理後、 フエノー ル /クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した DNA断片を滅菌 水 10 に溶解した。 上記で得たプラスミド pscFUT8gE2- 3 由来の Sail- Hindi II 断片 (約 3. 1Kb) 4. 0 1、 プラスミド pK0FUT8gE2 3由来の Sail- Hindlll断片 (約 4. 8Kb) 1. 0 1、 Ligation High (東洋紡社製) 5· 0 μ 1を混合し、 16°Cで 30分間反応させることに より結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5ひ株を形質転換し、 得られ たアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミド DNA を単離 した。 本プラスミドを以下、 pK0FUT8gE2- 4と称す。

(7) プラスミド pK0FUT8gE2- 5の構築

本項 (3) および (6) で得たプラスミド pK0FUT8gE2- 2および pK0FUT8gE2- 4を 用いて、 以下の手順でプラスミド pK0FUT8gE2- 5を構築した (第 10図)。

プラスミド pK0FUT8gE2- 2 1. 0 z g を NEBuffer 4 (New England Biolabs社製) 30 ΐ に溶解し、 制限酵素 胆1 (New England Biolabs社製) 20単位を加えて 25°Cで 2時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断 片を回収した後、 NEBuffer 2 (New England Biolabs 社製) 30 1 に溶解し、 20 単位の制限酵素 BamHI (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 2時間消ィ匕 反応を行った。 消化反応後、 PH8. 0の lmol/1 Tris-HCl緩衝液 30 1および大腸 菌 C15株由来 Alkal ine Phosphatase (宝酒造社製) 3. 0 μ ΐを添カ卩し、 65°Cで 1時 間反応させることにより DNA末端の脱リン酸化を行った。 脱リン酸化処理後、 フ ェノール /ク口口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した DNA断片 を滅菌水 10 μ ΐに溶解した。

一方、 プラスミド pK0FUT8gE2- 4 1. 0 ^ g を NEBu; fer 4 (New England Biolabs 社製) 30 β 1に溶解し、 制限酵素 (New England Biolabs社製) 20単位を加 えて 25°Cで 2 時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 NEBuffer 2 (New England Biolabs社製) 30 1に溶解し、 20単位の制限酵素 BamHI (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 2時間消 化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供 し、 約 5. 2Kbの DNA断片を精製した。

上記で得たプラスミド pK0FUT8gE2- 2由来の Smal-BamHI断片 (約 5. 0Kb) 0. 5 μ 1、 プラスミ ド pK0FUT8gE2-4 由来の Smal - BamHI 断片 (約 5. 4Kb) 4. 5 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製) 5. 0 1を混合し、 16°Cで 15時間反応させることに より結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られ たアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミ ド DNA を単離 した。 本プラスミ ドを以下、 PK0FUT8gE2_5と称す。

(8) プラスミ ド pKOFUTSPuroの構築

本項 (7) で得たプラスミ ド PK0FUT8gE2_5 を用いて、 以下の手順でプラスミ ド pK0FUT8Puroを構築した (第 11図)。

プラスミ ド pKOSelectDT (Lexicon社製) 1. 0 /i g を NEBuffer 4 (New England Biolabs社製) 50 μ ΐ に溶解し、 制限酵素 ^ίΠ (New England Biolabs社製) 16 単位を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 ジフテリアトキシン発現ュ-ットを含む約 1. 2Kbの DNA断片を精製した。

一方、 プラスミ ド pK0FUT8gE2_5 1. O ^ g を NEBuffer 4 (New England Biolabs 社製) 50 μ ΐに溶解し、 制限酵素 Rsrll (New England Biolabs社製) 16単位を加 えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 PH8. 0の lmol/1 Tris-HCl緩 衝液 30 /i lおよび大腸菌 C15株由来 Alkaline Phosphatase (宝酒造社製) 3. 0 μ ΐ を添加し、 65°Cで 1 時間反応させることにより DNA末端の脱リン酸化を行った。 脱リン酸化処理後、 フエノール/クロ口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行 レ、、 回収した DNA断片を滅菌水 ΙΟ μ Ιに溶解した。

上記で得たプラスミ ド pKOSelectDT由来の RsrII-RsrII断片 (約 1. 2Kb) Ι. Ο μ 1、 プラスミ ド pK0FUT8gE2 - 5由来の Rsrll - Rsrll断片 (約 10. 4Kb) 1. 0 1、 滅菌 水 3. 0 μ 1、 Ligation High (東洋紡社製) 5. 0 1を混合し、 16°Cで 30分間反応さ せることにより結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5ひ株を形質転換 し、 得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミ ド DNAを単離した。 本プラスミ ドを以下、 PK0FUT8Puroと称す。

2. FUT8遺伝子ェクソン 2を含むゲノム領域が 1コピー破壊された CH0細胞の 作製

(1) ターゲティングベクターの導入

本実施例第 1項で構築したチャイニーズハムスター FUT8ゲノム領域ターゲティ ングベタタ一 pK0FUT8Puroを実施例 1の(2)で作製した 5- 03株へ導入した。

プラスミ ド pK0FUT8Puroの 5-03株への遺伝子導入はェレク トロポレーション法 [サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手順で 行った。 まず、 プラスミ ド pK0FUT8Puro 150 μ g を NEBuffer for Sail (New England Biolabs社製) 1. 8mlに溶解し、 600単位の制限酵素 §§JJ (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 5時間消化反応を行うことにより線状ィヒした。 該 反応液に対しフエノール/クロロホルム抽出処理おょぴエタノール沈殿を行い、 回 収した線状化プラスミドを 水溶液とした。 一方、 5 - 03株を K- PBS緩衝 液 (137mraol/l KC1、 2. 7mmol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP0い 1. 5mmol/l KH2P04、 4. Ommol/1 MgCl2) に懸濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 1 (1. 6 X 106 個) を上記線状ィ匕プラスミド 4 μ 1 (4 §) と混和した後、 細胞 -DNA混和液の全量 を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BI0-RAD社製) へ移し、 細胞融合装 置 Gene Pulser (BI0-RAD社製) を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 μ Ρの条 件で遺伝子導入を行った。 同様にしてキュべット 30本分に対し遺伝子導入した後、 細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清 (Life Technologies社製) および 1倍濃度の HT supplement (Life Technologies 社製) を添加した IMDM 培地 (Life Technologies社製) に懸濁し、 接着細胞培養用 10cmディッシュ (Falcon社製) 30枚へ播種した。 5%C02、 37°Cの条件下で 24時間培養した後、 培養上清を除去し、 15 μ g/mlPuromycin (SIGMA 社製) および 10 % ゥシ胎児透析血清 (Life Technologie社製) を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製) を 10mlずつ 分注した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰り返しながら 10 日間の培養を行い、 ピュー口マイシン耐性株を取得した。

(2) ターゲティングベクター導入株の取得

本項 (1) で得たピューロマイシン耐性株より任意の 900個のコロニーを以下の 手順で採取した。

まず、 ピューロマイシン耐性株が出現した 10cmディッシュより培養上清を除 去し、 リン酸緩衝液 7ml を注入した後、 実体顕微鏡下に移した。 次にピペットマ ン (GILS0N社製) を用いてコロニーを搔き取って吸い込み、 丸底 96穴プレート (Falcon社製) へ採取した。 トリプシン処理を行った後、 接着細胞用平底 96穴プ レート (岩城硝子社製) へ各クローンを播種し、 15 /^ g/ml Puromycin (SIGMA社 製) および 10% ゥシ胎児透析血清 (Ufe Technologie社製) を添カ卩した IMDM培 地 (Life Technologies社製) を用いて 1週間培養した。 培養後、 上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 2倍量の凍 結培地 (20% DMS0、 40% ゥシ胎児血清、 40% IMDM) と混和した。 このうち半量 を接着細胞用平底 96穴プレート (岩城硝子社製) へ播種してレプリカプレートと する一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。 レプリカプ レートは、 15 /i g/ml Puromycin (SIGMA社製) および 10% ゥシ胎児透析血清 (Life Technologie社製) を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製) を用 いて 1週間培養することにより作製した。

(3) ゲノム PCRによる相同組換えの診断

本項 (2) で得た 900クローンに対し、 以下の手順でゲノム PCRによる相同組換 えの診断を行った。

まず、 本項 (2) で作製したレプリカプレートより公知の方法 [アナリティカ ノレ ' ノ ィオケミストリー (Analytical Biochemistry) , 201, 331 (1992) ] に従つ て各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE- RNase緩衝液 (pH8. 0) (10醒 ol/l Tris- HC1、 lramol/1 EDTA、 200 μ g/ml RNase A) 30 μ 1 にー晚溶解した。 また、 参 考例で得た FUT8ゲノム領域のうちターゲティングべクター相同領域を越えた部分 の配列に結合するプライマー (配列番号 15に示す) およびベクター内の ΙοχΡ配 列に結合するプライマー (配列番号 16に示す) を設計した。

DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製) を用いて、 上記で調製したゲノム DNA溶 液を各々 10 1 含む 25 /z l の反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製)、 0. 2匪 ol/l dNTPs、 0. 5 /i niol/l 上記遺伝子特異的プライマー (配列番号 15 および配列番号 16) ] を調製し、 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行った。 PCR は、 94°Cで 3分間 の加熱の後、 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 2分間からなる反応を 1サイ クルとした 38サイクルの条件で行った。

PCR後、 反応液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 CH0細胞ゲノ ム領域とターゲテイングベクター相同領域との境界部を含む約 1. 7Kb の特異的増 幅が認められるものを陽性クローンとした。 本法により陽性を示す 1 クローンを 見出した。

(4) ゲノムサザンプロットによる相同組換えの診断

本項 (3) で陽性が確認された 1クローンに対し、 以下の手順でゲノムサザンブ ロットによる相同糸且換えの診断を行った。 本項 (2) で凍結保存したマスタープレートのうち、 本項 (3) で見出された陽 性クローンを含む 96穴プレートを選択し、 5%C02、 37°Cの条件下で 10分間静置 した。 静置後、 陽性クローンに該当するゥエルから細胞を接着細胞用平底 24穴プ レート (Greiner社製) へ播種した。 15 i g/ml ピューロマイシン(SIGMA社製) お ょぴ 10% ゥシ胎児透析血清 (L e Technologie 社製) を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製) を用いて 1週間培養した後、 接着細胞用平底 6穴プレ ート (Greiner社製) へ播種した。 該プレートより公知の方法 [ヌクレイック · アシッド . リサーチ (Nucleic Acids Research) , 3, 2303 (1976) ] に従って各ク ローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE- RNase緩衝液 (ρΗδ. 0) (10mmol/l Tris- HC1、 1醒 ol/l EDTAヽ 200 μ §/ιη1 RNase A) 150 μ 1にー晚溶解した。

上記で調製したゲノム DNA 12 ;u g を NEBuffer 3 (New England Biolabs社製) 120 μ 1に溶解し、 25単位の制限酵素 Pstl (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで一晩消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片 を回収した後、 TE緩衝液 (pH8. 0) (10ramol/l Tris - HC1、 1画 ol/l EDTA) 20 ^ 1に 溶解し、 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プ口シーデイングス'ォブ 'ザ.ナショナル'アカデミー'オフ、、 'サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 3683 (1979) ] に従い、 ナイロン膜へゲノム DNA を 転写した。 転写終了後、 ナイ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行つた。

一方、 サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 参考 例で得た FUT8ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の 配列に結合するプライマー (配列番号 9および配列番号 10) を設計した。 次に、 DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製) を用いて、 参考例 (2) で得たプラスミド PFUT8fgE2-2 4. Ong を含む 20 μ 1 の反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製)、 0. 2mmol/l dNTPs、 0. 5 mol/l 上記遺伝子特異的プライマー (配列番号 9 および 配列番号 10) ] を調製し、 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行った。 PCR は、 94°C で 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°Cで 1分間からなる反 応を 1 サイクルとした 25 サイクルの条件で行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v)ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bpのプローブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液 5 μ 1に対し、 [ α - 32P] dCTP 1. 75MBqおよぴ Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech社製) を用いて放射 線標識した。 ハイプリダイゼーシヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイブリダィゼーシヨン液 [5 X SSPE、 50 X Denhaldt' s 液、 0. 5% (w/v) SDS、 100 II g/ml サケ精子 DNA] 15ml を加えて 65°Cで 3時間の プレハイプリダイゼーシヨンを行った。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性 してボトルへ投入し、 65°Cで一 B免加温した。

ハイプリダイゼーシヨン後、 ナイロン膜を 2 X SSC-0. 1% (w/v) SDS 50ml に浸 漬し、 65°Cで 15分間加温した。 上記の洗浄操作を 2回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. 1% (w/v) SDS 50ml に浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイ口 ン膜を X線フィルムへ- 80°Cでニ晚暴露し現像した。

前述の制限酵素 Pstl処理により、 野生型 FUT8対立遺伝子から約 4. 4Kbの DNA 断片が生じる。 一方、 同制限酵素処理により、 ターグティングベクターとの相同 組換えが起こった対立遺伝子から約 6. 0Kbの DNA断片が生じる。

本法により、 本項 (3) における陽性クローンのゲノム DNAより上記約 4. 4Kbお よび約 6. 0Kbの特異的断片が見出された。 両断片の量比が 1 : 1であったことから、 本クローンは、 FUT8対立遺伝子を 1 コピー破壊したクローンであることが確認さ れた。 本クローンを以下、 1st. AFUT8 2 - 46株と称す。

3. FUT8遺伝子が 1コピー破壊された CH0細胞からの薬剤耐性遺伝子の除去 (1) Creリコンビナーゼ発現ベクターの導入

本実施例第 2項で作製した 1st. AFUT8 2-46株へ、 Cre リコンビナーゼ発現べ クタ一 pBS185 (Life Technologies社製) を導入した。

プラスミド pBS185の 1st. AFUT8 2-46株への遺伝子導入はエレクトロポレーシ ヨン法 [サイトテクノロジー (Cytotechnology), 3, 133 (1990) ] に準じて以下 の手順で行った。 まず、 1st. AFUT8 2-46株を K- PBS緩衝液 [137賺 ol/l KC1、 2. 7腿 ol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP04、 1. 5讓 ol/l KH2P04、 4. 0mmol/l MgCl2] に懸 濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 μ ΐ (1. 6 X 106個) をプラスミ ド PBS185 Α μ と混和した後、 細胞- DNA混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電 極間距離 2mm) (BI0-RAD社製) へ移し、 細胞融合装置 Gene Pulser (BIO- RAD社 製) を用いてパルス電圧 350V, 電気容量 250 /i F の条件で遺伝子導入を行った。 導入後、 細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血淸 (Life Technologies社製) および 1倍 濃度の HT supplement (Life Technologies社製) を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製) 10mlに懸濁し、 さらに同培地を用いて 2万倍希釈した。 接着 細胞培養用 10cmディッシュ (Falcon社製) 7枚へ播種後、 5%C02、 37°Cの条件下 で 24 時間培養した。 培養後、 上清を除去し、 10 % ゥシ胎児透析血清 (Life Technologie社製)を添加した IMDM培地 (L e Technologies社製) を 10mlずつ 分注した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰り返しながら 10 日間の培養を行つ た。

(2) Creリコンビナーゼ発現ベクター導入株の取得

本項 (1) で得た株より任意の 400個のコロニーを以下の手順で採取した。

まず、 10cmディッシュより培養上清を除去し、 リン酸緩衝液 7mlを注入した後、 実体顕微鏡下に移した。 次にピペットマン (GILSON社製) を用いてコロニーを搔 き取って吸い込み、 丸底 96穴プレート (Falcon社製) へ採取した。 トリプシン 処理を行った後、 接着細胞用平底 96穴プレート (岩城硝子社製) へ各クローンを 播種し、 10%ゥシ胎児透析血清 (Life Technologie社製) を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製) を用いて 1週間培養した。

培養後、 上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 2倍量の凍 結培地 (20%DMS0、 40% ゥシ胎児血清、 40% IMDM) と混和した。 このうち半量 を接着細胞用平底 96穴プレート (岩城硝子社製) へ播種してレプリカプレートを 作製する一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。

次に、 レプリカプレートを 15 μ 8/ιη1 ピューロマイシン(SIGMA社製) および 10% ゥシ胎児透析血清 (Life Technologie社製) を添加した IMDM培地 (Ufe Technologies社製) を用いて 6 日間培養した。 Cre リコンビナーゼの発現により ΙοχΡ配列に挟まれたピュー口マイシン耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、 ピューロマイシン存在下で死滅する。 本選択法により 91個の陽性クローンを見出 した。

(3) ゲノムサザンプロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断

本項 (2) で見出された陽性クローンのうち任意の 6クローンに対し、 以下の手 順でゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断を行つた。

本項 (2) で凍結保存したマスタープレートのうち、 上記 6 クローンを含む 96 穴プレートを選択し、 5%C02、 37°Cの条件下で 10分間静置した。 静置後、 上記ク ローンに該当するゥエルから細胞を接着細胞用平底 24穴プレート (Greiner社 、播種した。 10% ゥシ胎児透析血清 (Life Technologie社製) を添加した IMDM培地 (Ufe Technologies社製) を用いて 1週間培養した後、 接着細胞用平 底 6 穴プレート (Greiner社製) へ播種した。 該プレートより公知の方法 [ヌク レイツク ·ァシッド · リサーチ (Nucleic Acids Research) , 3, 2303 (1976) ] に 従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 ΤΕ- RNase 緩衝液 (pH8. 0) (I0mmol/1 Tri s - HC1、 lmmol/1 EDTA、 200 μ g/ml RNase A) 150 μ 1 にー晚溶解し た。

上記で調製したゲノム DNA 12 μ g を NEBuffer for BamHI (New England Biolabs社製) 120 1に溶解し、 20単位の制限酵素 BamHI (New England Biolabs 社製) を加えて 37°Cで一晩消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を 用いて DNA断片を回収した後、 TE緩衝液 (pH8. 0) (lOramol/1 Tri s- HC1、 lmmol/1 EDTA) 20 1 に溶解し、 0. 4% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プ口シーデイングス'ォブ 'ザ'ナショナル 'ァカデミ一'ォブ ·サイェ ンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 3683 (1979) ] に従い、 ナイロン膜へ ゲノム DNAを転写した。 転写終了後、 ナイ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を 行った。

一方、 サザンプロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 参考 例で得た FUT8ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の 配列に結合するプライマー (配列番号 9および配列番号 10) を設計した。 次に、 DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製) を用いて、 参考例 (2) で得たプラスミド pFUT8fgE2-2 4. Ong を含む 20 μ 1 の反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製)、 0. 2賺 ol/l dNTPs、 0· 5 μ ιηο1/1 上記遺伝子特異的プライマー (配列番号 9 および 配列番号 10) ] を調製し、 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行った。 PCR は、 94°C で 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°Cで 1分間からなる反 応を 1 サイクルとした 25 サイクルの条件で行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bp のプローブ DNA断片を精製した。 得られたプロープ DNA溶液 5 μ 1に対し、 [ α - 32P] dCTP 1. 75MBqおよぴ Megaprime DNA Labell ing system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech社製) を用いて放射 線標識した。

ハイブリダィゼーシヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイブリダィゼーシヨン液 (5 X SSPE、 50 X Denhaldt' s 液、 0. 5% (w/v) SDS、 100 μ g/ml サケ精子 DNA) 15ml を加えて 65°Cで 3時間の プレハイプリダィゼーシヨンを行った。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性 してボトルへ投入し、 65°Cで一晚加温した。

ハイプリダイゼーシヨン後、 ナイロン膜を 2 XSSC- 0. 1% (w/v) SDS 50ml に浸 漬し、 65°Cで 15分間加温した。 上記の洗浄操作を 2回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. 1% (w/v) SDS 50ml に浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイ口 ン膜を X線フィルムへ- 80°Cでニ晚暴露し現像した。

前述の制限酵素 BamHI処理により、 野生型 FUT8対立遺伝子から約 25. 5Kb の DNA断片が生じる。 また、 同制限酵素処理により、 ターゲティングベクターとの 相同組換えが起こった対立遺伝子から約 20. 0Kbの DNA断片が生じる。 さらに、 相 同組換えが起こった対立遺伝子からピューロマイシン耐性遺伝子 (約 1. 5Kb) が 除去された場合には、 同処理により約 18. 5Kbの DNA断片が生じる。

本法により、 上記 6クローンのうち 5クローンのゲノム DNAより上記約 25. 5Kb および約 18. 5Kbの特異的断片が見出された。 両断片の量比が 1 : 1であったこと から、 FUT8ゲノム領域を 1 コピー破壌した株よりピュー口—マイシン耐性遺伝子が 除去されたことが示された。 本クローンを以下、 1st. AFUT8 2-46-1株と称す。 尚、 上述の 1st. AFUT8 2-46-1株、 1st. AFUT8 2-46株、 および、 5-03株のゲノ ムサザンの結果を第 12図に示した。 なお 1st. AFUT8 2-46-1株は 2-46-1の株名 で、 平成 13年 9月 26日付けで独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ 一 (日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地中央第 6) に FERM BP- 7755として寄託 されている。

4. FUT8遺伝子破壌株が生産する抗体組成物の精製

本実施例第 3項で得た FUT8対立遺伝子が 1コピー破壌された株 1st. AFUT8 2- 46-1株を、 3 X 105個/ ml の密度で 10% ゥシ胎児透析血清 (Life Technologie社 製) を添加した IMDM培地 (L e Technologies社製) へ懸濁後、 接着細胞培養用 T182 フラスコ (Greiner社製) 2本に計 60ml各々播種した。 3 日間の培養後、 上 清を除去し、 EXCELL301培地 (JRH Biosciences社製) 計 60mlへ交換した。

これらを 37°Cの 5%C02インキュベーター内で 7 日間培養後、 生細胞数をカウン トしてバイアビリティーが同程度 (各々 30%以下) であることを確認した後、 各 細胞懸濁液を回収した。 該細胞懸濁液に対し 3000rPm、 4°Cの条件で 10分間の遠 心分離を行って上清を回収し、 10000rpm、 4°Cの条件で 1時間の遠心分離を行った 後、 0. 22 m孔径 150ml容 PES Filter Unit (NALGENE社製) を用いて濾過した。 0. 8cm径のカラムに Prosep- A HighCapacity (bioPROCESSING社製) を厚さ 2cm で充填し、 0. lmol/1 クェン酸緩衝液 (pH3. 0) 10ml および lmol/1 グリシン /NaOH-0. 15mol/l NaCl 緩衝液 (pH8. 6) 10ml で順次洗浄することによって担体の 平後 ヒを行った。 次に、 上記培養上清各 100mlをカラムに通筒し、 lmol/1 グリシ ン /NaOH- 0. 15mol/l NaCl緩衝液 (pH8. 6) 50mlで洗浄した。 洗浄後、 0. lmol/1 ク ェン酸緩衝液 (pH3. 0) 2. 5ml を用いて Prosep-A に吸着した抗体の溶出を行い、 溶出液を 500 Ai l ずつ分画すると共に、 各画分をそれぞれ 2mol/l Tris-HCl (pH8. 5) 100 と混合して中和した。 BCA法 [アナリティカル 'パイオケミスト リー (Anal. Biochem. ) , 150, 76 (1985) ] を用いて抗体を高濃度で含む 2 画分 (計 1. 2ml) を選択して合一し、 lOmol/1 クェン酸- 0. 15mol/l NaCl 緩衝液 (pH6. 0) を用いて 4°Cで一昼夜透析を行った。 透析後、 抗体溶液を回収し、 0. 22 μ ι 孔径 Millex GV (MILLIP0RE社製) を用いて滅菌濾過した。

5. FUT8遺伝子破壊株が生産する抗体組成物の ADCC活性

本実施例第 4 項で精製した抗 CCR4 抗体の ADCC 活性を評価するため、 W001/6475 に記載の CCR4陽性細胞株 CCR4/EL- 4 を用いた ADCC活性を測定した。

10% ゥシ胎児血清 (Life Technologie 社製) を含む RPMI1640培地 (Life Technologie 社製) (以下、 RPMI1640-FBS (10) と略記する) で継代培養した CCR4/EL- 4株 1 X 106個を RPMI1640- FBS (10) 500 に懸濁し、 Na2 51Cr04 3. 7MBqを 添加して 37°Cで 90 分間培養することにより、 細胞の放射線標識を行った。 1200rpmで 5分間の遠心分離を行った後、 上清を除去し、 標識細胞を RPMI1640- FBS (IO) 5ml に懸濁した。 この洗浄操作を 3 回繰り返した後、 細胞懸濁液を氷上 で 30分間静置して放射性物質を自然解離させた。 再び上記の洗浄操作を 2回繰り 返した後、 RPMI1640-FBS (10) 5ral に懸濁することにより、 2. 0 X 105個/ ml の標的 細胞懸濁液を調製した。

一方、 健常人の静脈血 30ml を採取し、 へパリンナトリゥム (清水製薬社製) 0. 5ml を加えて穏やかに混和した後、 生理的食塩水 (大塚製薬社製) 30ml と混合 した。 混合後、 各 10mlをそれぞれ Lymphoprep (NYC0MED PHARMA AS社製) 4ml上 に穏やかに重層し、 室温下 2000rpmで 30分間の遠心分離を行った。 分離された単 核球画分を各遠心管より集めて合一し、 RPMI1640- FBS (10) 30ml に懸濁した。 室 温下 1200rpm で 15 分間の遠心分離を行った後、 上清を除去し、 該細胞を RPMI1640-FBS (10) 20ml に懸濁した。 この洗浄操作を 2 回繰り返した後、 RPMI1640- FBS(IO) を用いて 2.5X106個/ ralのエフェクター細胞懸濁液を調製した。

96穴 U字底プレート (Falcon社製) の各穴に標的細胞懸濁液を 50μ 1ずつ (1 X104個/穴) 分注した。 続いて各穴にエフヱクタ一細胞懸濁液を ΙΟΟμΙ ずつ (2.5X105個/穴) 分注することにより、 エフヱクタ一細胞と標的細胞の比を 25:1 とした。 次に RPMI1640- FBS(10)を用いて、 本実施例第 4項で得た各抗 CCR4抗体 より 0. liig/ml, 1/ g/ml, 10 g/mlの希釈系列を調製し、 該希釈溶 液を各ゥエルに 50^1 添加することにより、 終濃度 0.0025 μ§/ηι1、 0.025 ig/ml, 0.25 tg/ml、 2.5/_tg/mlとした。 5%C02、 37°Cの条件下で 4時間反応させた後、 プ レートに対し 1200rpmで 5分間の遠心分離を行った。 各穴の上清 75μ 1を 12mm径 RIAチューブ (IWAKI 社製) に分取し、 MINAX-aオートガンマ一カウンター 5550 (PACKRD社製) を用いて解離 51Cr量の測定を行つた。

また、 エフェクター細胞懸濁液おょぴ抗体溶液に代えて RPMI1640- FBS(10) 150 μ 1 を添カ卩した系で上記の反応を行うことにより、 自然解離 51Cr 量の値を求めた。 さらにエフェクター細胞懸濁液および抗体溶液に代えて 1規定塩酸 100 μ1およ ぴ RPMI1640- FBS (10) 50 μ 1を添加した系で上記の反応を行うことにより、 全解離 51Cr量の値を求めた。 これらの値を用いて実施例 2 (3) 記載の式 (I) により、 ADCC活性を求めた。

第 13図に各種抗 CCR4抗体の ADCC活性を示した。 FUT8対立遺伝子を 1コピー 破壌された 1st. AFUT8 2-46-1株より得た抗体組成物は、 該遺伝子破壊前の CH0 細胞 5-03株が生産する抗体組成物に比べ有意に高い ADCC活性を示した。 また、 これら抗体組成物での抗原結合活性には変化は観察されなかった。 以上の結果よ り、 宿主細胞の FUT8対立遺伝子を破壊することにより、 生産される抗体組成物の ADCC活性を高めることができることが明らかになった。 実施例 4. FUT8遺伝子が 1コピー破壊された CH0細胞からの高薬剤耐性株の取 得

ターゲットベクターを用い相同組換えの方法で取得されたゲノム遺伝子の片方 のァリルが破壊された細胞を、 ターゲットベクター挿入株を選抜する際に用いた ポジティブ選択のための薬剤濃度を 10倍程度高くした培地で培養し、 該薬剤に対 する高耐性株を取得することで、 両方のァリルが破壌された株が取得されること が一般的に知られている (マニピュレイティング'ザ'マウス'ェンブリオ.ァ 'ラボ ラ 卜リー-マ-ユアノレ、 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993)、 E S細胞を用いた変異マウスの作製) 。

そこで、 実施例 3の 2 (3)で得た 1st. AFUT8 2- 46株を用い、 公知の方法 [モレ キュラー ·アンド ·セノレラー · ノィ才ロジー (Molecular and Cellular Biology) , 12, 2391, (1992) ] に従って FUT8遺伝子が 2コピー破壊された形質転換株を以下 のようにして作製した。

(1) 高濃度ピューロマイシン耐性株の取得

10% ゥシ胎児透析血清 (Life Technologies社製) を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製)へ 1st. A FUT8 2-46株 1 X 108個を懸濁し、 接着細胞培養用 10cmディッシュ (Falcon社製) 20枚へ播種した後、 5%C02、 37°Cの条件下で 24時 間培養した。 培養後、 上清を除去し、 150 μ §/ηι1 ピューロマイシン (SIGMA社 製) および 10% ゥシ胎児透析血清 (Life Technologie社製) を添加した IMDM培 地(Life Technologies社製)を 10mlずつ分注した。 この培地交換作業を 3〜4 日 毎に繰り返しながら 12日間の培養を行った。

出現した薬剤耐性コロニー 90個を以下の手順で採取した。 まず、 10cmデイツ シュより培養上清を除去し、 リン酸緩衝液 7ml を注入した後、 実体顕微鏡下に移 した。 次にピペットマン (GILS0N社製) を用いてコロニーを搔き取って吸い込み、 丸底 96 穴プレート (Falcon社製) へ採取した。 トリプシン処理を行った後、 接 着細胞用平底 96穴プレート (岩城硝子社製) へ各クローンを播種し、 150 μ ε/ιη1 Puromycin (SIGMA社製) および 10% ゥシ胎児透析血清 (Life Technologie社 製) を添加した IMDM培地 (Life Technologies社製)を用いて 1週間培養した。 培養後、 上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 2倍量の凍 結培地 [20% DMS0、 40% ゥシ胎児血清、 40% IMDM] と混和した。 このうち半量を 接着細胞用平底 96穴プレート (岩城硝子社製) へ播種してレプリカプレートとす る一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。 レプリカプレ ートは、 15 i g/mlピューロマイシン (SIGMA社製) および 10% ゥシ胎児透析血清

(Life Technologie社製) を添加した IMDM培地(Ufe Technologies社製)を用 いて 1週間培養した。 (2) ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断

本項 (1) で得た全ての薬剤耐性クローンに対し、 以下の手順でゲノムサザンブ ロットによる相同組換えの診断を行った。

本項 (1) で作製したレプリカプレートに対しトリプシン処理を行った後、 全ク ローンを接着細胞用平底 24穴プレート (Greiner社製) へ播種した。 150 /i g/ml ピューロマイ シン (SIGMA 社製) および 10% ゥシ胎児透析血清 (Ufe Technologie社製) を添加した IMDM培地(Idfe Technologies社製)を用いて全ク ローンを 1週間培養した後、 トリプシン処理を行い接着細胞用平底 6穴プレート (Greiner社製) へ播種した。 該プレートより公知の方法 [ヌクレイック 'ァシ ッド ' リサーチ (Nucleic Acids Research) , 3, 2303, (1976) ] に従って各クロ ーンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE - RNase緩衝液(pH8. 0) [10mmol/l Tris - HC1、 lmmol/1 EDTA、 200mg/ml RNase A] 150mlにー晚溶解した。

上記で調製したゲノム DNA 12 ;u gを NEBtrffer for BamHI (New England Biolabs 社製) 120 μ 1に溶解し、 25単位の制限酵素 BaraHI (New England Biolabs社製)を加 えて 37°Cでー晚消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA 断片を回収した後、 TE緩衝液(pH8. 0) [I0mmol/1 Tris-HCl、 lmmol/1 EDTA] 20 μ ΐ に溶解し、 0. 6% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。 電気泳動後、 公知 の方法 [プロシーデイングス'ォプ ·ザ ·ナショナル'アカデミー'ォブ ·サイエンス (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 3683, (1979)に従い、 ナイロン B莫へゲノム DNAを転写した。 転写終了後、 ナイロン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行った。 一方、 サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。 DNA ポリメ ラ一ゼ ExTaq (宝酒造社製)を用いて、 参考例(2)で得たプラスミド pFUT8f gE2- 2 4. Ongを含む 20 の反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製)、 0. 2画 ol/l dNTPs、 0· 5 μ mol/1 上記遺伝子特異的プライマー (配列番号 9および配列番号 10) ]を調製し、 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行った。 PCRは、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°C で 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°Cで 1分間からなる反応を 1サイクルとした 25サ イタルの条件で行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に 供し、 約 230bpのプローブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液 5ml に対し、 [ ct 32P] dCTP 1. 75MBqおよび Megaprime DNA Labelling system, dCTP

(Amersham Pharmacia Biotech社製) を用いて放射標識した。

ハイプリダイゼーシヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイブリダィゼーシヨン液 [5 X SSPE、 50 X Denhaldt' s 液、 0. 5°/。(w/v) SDS、 100 μ g/ml サケ精子 DNA] 15mlを加えて 65°Cで 3時間のプ レハイブリダイゼーションを行つた。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性し てボトルへ投入し、 65°Cで一 Bj&加温した。

ハイブリダィゼーション後、 ナイ口ン膜を 2 X SSC—0. l°/o (w/v) SDS 50mlに浸漬 し、 65°Cで 15分間加温した。 上記の洗浄操作を 2 回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. l°/o (w/v) SDS 50mlに浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン 膜を X線フィルムへ- 80°Cでニ晚暴露し現像した。

前述の制限酵素 BamHI 処理により、 野生型 FUT8対立遺伝子から約 25. 5Kb の DNA断片が生じる。 一方、 同制限酵素処理により、 ターゲティングベクターとの 相同組換えが起こった対立遺伝子から約 20. 0Kbの DNA断片が生じる。

本法により、 相同組換え領域特異的な上記約 14. 0Kbの断片のみを認めるクロー ンが見出された (第 14図) 。 本クローンを 2-46 - H10株と称す。 実施例 5. ゲノム上に存在する全ての FUT8遺伝子を破壊した CH0/DG44細胞の造 成

FUT8両対立遺伝子の翻訳開始コドンを含むゲノム領域を欠失した CH0/DG44細 胞株の造成をおこなった。

1. チャイニーズハムスター FUT8遺伝子ェクソン 2 ターゲティングベクタープラ スミ ド pK0FUT8Neoの構築

実施例 3第 1項で得たターゲティングベクタープラスミド pK0FUT8Puroの保有 するピュー口マイシン耐性遺伝子発現ュニットを以下の手順でネオマイシン耐性 遺伝子発現ユエットに置換することによって、 プラスミド PK0FUT8Neoを構築した

(第 15図) 。

プラス.ミ ド pKOSelectNeo (Lexicon社製) 1· 0 g を NEBuf f er4 (New England Biolabs社) 50 1に溶解し、 制限酵素 Ascl (New England Biolabs社) 16単位を 加えて 37°Cで 2時間消化反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA 断片を回収した後、 100 / g/ml BSA (New England Biolabs 社) を含む NEBuffer4 (New England Biolabs社製) 50 μ 1 に溶解し、 20単位の制限酵素 AeaLKNew England Biolabs社製) を加えて 25°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 該液を 0. 8% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 ネオマイシン耐 性遺伝子発現ュニットを含む約 1. 6Kbの DNA断片を精製した。 一方、 プラスミド pK0FUT8Puro 1. O w g を NEBuf f er4 (New England Biolabs社 製) 50 μ 1に溶解し、 制限酵素 ½£l (New England Biolabs社製) 16単位を加え て 37°Cで 2時間消化反応を行った。 消化反応後、 pH8. 0の lmol/1 Tris- HC1緩衝 液 30 μ 1および大腸菌 C15株由来 Alkaline Phosphatase (宝酒造社製) 3· 0 μ 1 を添加し、 65°Cで 1時間反応させることにより DNA末端の脱リン酸ィヒを行った。 脱リン酸化処理後、 フヱノール /ク口口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行 い、 回収した DNA断片を滅菌水 ΙΟ μ Ιに溶解した。

上記で得たプラスミド pKOSelectNeo由来の Ascl- Ascl断片(約 1. 6Kb) 1. 0 μ 1、 プラスミド pK0FUT8Puro由来の Ascl- Ascl断片(約 10. 1Kb) 1. 0 μ 1、 滅菌水 3. 0 1、 Ligation High (東洋紡社製) 5. 0 ^ 1 を混合し、 16°Cで 30分間反応させる ことにより結合反応を行った。 該反応液を用いて大腸菌 DH5 a株を形質転換し、 得られたアンピシリン耐性クローンより公知の方法に従って各々プラスミ ド DNA を単離した。 本プラスミドを以下、 pK0FUT8Neoと称す。

2. ゲノム上の FUT8遺伝子を 1コピー破壌した CH0/DG44細胞の作製

(1) ターゲティングベクター導入株の取得

ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 (dhfr) を欠損したチャイニーズハムスター卵巣 由来 CH0/DG44 細胞 [Somatic Cel l and Moleculer Genetics, 12, 555 (1986) ] に対し、 本実施例第 1項で構築したチャイニーズハムスター FUT8ゲノム 領域ターゲティングべクタ一 pKOFUTSNeoを導入した。

プラスミド pK0FUT8Neoの CH0/DG44細胞への遺伝子導入はエレクトロポレーシ ヨン法 [サイトテクノロジー(Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] に準じて以下の 手順で行った。 まず、 100 /z g/ml BSA (New England Biolabs 社製) を含む NEBuffer for Sail (New England Biolabs社製) 1· 2mlにプラスミド pK0FUT8Neo 280 μ gを溶解し、 400単位の制限酵素 il (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 5時間消化反応を行うことにより線状ィ匕した。 該反応液に対しフエノール / クロ口ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した線状化プラスミ ド を 1 μ 8/ μ 1水溶液とした。 一方、 CH0/DG44細胞を K- PBS緩衝液 [137mmol/l KC1、 2. 7mmol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP04、 1. 5ramol/l KH2P04、 4. 0mmol/l MgCl2] に懸 濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 /x l (1. 6 X 106個) を上記線状化プラ スミ ド 4 1 ( μ Ε) と混和した後、 細胞一 DNA混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2讓)(BIO- RAD 社製) へ移し、 細胞融合装置 Gene Pulser (BI0-RAD社製) を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 ;z F の条件で遺伝 子導入を行った。 遺伝子導入した細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社 製) および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地 (Invitrogen社製) に懸濁し、 接着細胞培養用 10cmデッシュ (Falcon社製) へ 播種した。 5% C02、 37°Cの条件下で 24時間培養した後、 培養上清を除去し、 600 μ g/ml G418 (ナカライテスク社製) 、 1 倍濃度の HT supplement (Invitrogen 社製) および 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen 社製) を添加した IMDM 培地 (Invitrogen社製) を 10ml/穴ずつ分注した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰 り返しながら 15日間の培養を行い、 G418耐性クローンを取得した。

(2) ゲノム PCRによる相同組換えの診断

本項 (1) で取得した G418耐性クローンに対し、 以下の手順でゲノム PCRによ る相同組換えの診断を行った。

96穴プレートに得た G418耐性クローンに対しトリプシン処理を行った後、 2倍 量の凍結培地 [20% DMS0、 40% ゥシ胎児血清、 40% IMDM] と混和した。 このうち 半量を接着細胞用平底 96穴プレート (旭テクノグラス社製) へ播種してレプリカ プレートとする一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。 レプリカプレートに対し、 600 μ g/ml G418 (ナカライテスク社製) 、 1倍濃度 の HT supplement (Invitroge 社製) および 10% ゥシ胎児血清(Invitrogen社 製) を添加した IMDM培地(Invitrogen社製) を用いて 1週間培養した後、 公知の 方法 [アナリティカル ·パイオケミス トリー (Analytical Biochemistry) , 201, 331 (1992) ] に従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE - RNase緩衝液 (pH8. 0) [I0mmol/1 Tris- HC1、 lramol/1 EDTA、 200 μ g/ml RNase A] 30 μ ΐ に一 晚溶解した。

参考例で得た FUT8ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた 部分の配列に結合するプライマー (配列番号 13 または配列番号 15) およびべク ター内配列に結合するプライマー (配列番号 14 または配列番号 16) を用いて、 以下のポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行った。 即ち、 上記で調製したゲノム DNA 溶液を各々 10 1 1含む 25 ^ 1 の反応液 [DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製) 、 ExTaq buffer (宝酒造社製) 、 0. 2mmol/l dNTPs、 0. 5 /x mol/l 上記遺伝子特異的プ ライマー (フォワードプライマーは配列番号 13 または配列番号 15、 リパースプ ライマーは配列番号 14または配列番号 16) ]を調製し、 94°Cで 3分間の加熱の後、 94°Cで 1分間、 60°Cで 1分間、 72°Cで 2分間からなる反応を 1サイクルとした条 件で PCRを行った。

PCR後、 反応液を 0. 8°/。(w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 CH0細胞ゲノム 領域とターグティングベクター相同領域との境界部を含む約 1. 7Kb の特異的増幅 が認められるものを陽性クローン (50-10-104) と判定した。

(3) ゲノムサザンブロットによる相同組換えの診断

本項 (2) で陽性が確認されたクローンに対し、 以下の手順でゲノムサザンプロ ットによる相同糸且換えの診断を行った。 '

本項 (2) で凍結保存したマスタープレートのうち、 本項 (2) で見出された陽 性クローンを含む 96穴プレートを選択し、 5% C02、 37°Cの条件下で 10分間静置 した。 静置後、 陽性クローンに該当するゥヱルから細胞を接着細胞用平底 24穴プ レート (Greiner社製) へ播種した。 600 i g/ml G418 (ナカライテスク社製) 、 1 倍濃度の HT supplement ( Invitrogen 社製) および 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地(Invitrogen社製) を用いて 1週間培養 した後、 接着細胞用平底 6 穴プレート (Greiner社製) へ播種した。 該プレート より公知の方法 [ヌクレイック ·ァシッド · リサーチ(Nucleic Acids Research), 3, 2303, (1976) ] に従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE-RNase緩 衝液(pH8. 0) [10mmol/l Tris— HC1、 lramol/1 EDTAヽ 200 μ g/ml RNase A] 150 1 に一晩溶解した。

100 μ g/ml BSA (New England Biolabs社製) を含む NEBuffer for BamHI (New England Biolabs社製) 120 μ 1に上記で調製したゲノム DNA 12 μ gを溶解し、 25単位の制限酵素 BamHI (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cでー晚消化 反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 TE 緩衝液(pH8. 0) [ 10mmol/l Tris_HCl、 lmmol/1 EDTA] 20 μ 1 に溶解し、 0. 6% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プロシーデ イングス'ォブ 'ザ'ナショナル'ァカデミ一'ォブ'サイエンス(Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 3683, (1979)に従い、 ナイロン膜へゲノム DNAを転写した。 転写 終了後、 ナイ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行つた。

一方、 サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 参考 例で得た FUT8ゲノム領域のうちターグティングベクター相同領域を越えた部分の 配列に結合するプライマー (配列番号 9 および配列番号 10) を用いて、 以下の PCRを行った。 即ち、 参考例 (2) で得たプラスミド PFUT8fgE2- 2 4. Ongを含む 20 μ ΐ の反応液 [DNA ポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製) 、 ExTaq buffer (宝酒造社 製) 、 0. 2腕 ol/l dNTPs、 0. 5 / mol/l 上記遺伝子特異的プライマー (配列番号 9 および配列番号 10) ]を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°C で 30秒間、 74°Cで 1分間からなる反応を 1サイクルとした 25サイクルの条件で PCRを行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bpのプローブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液 5 1に対し、

[ a -32 P ] dCTP 1. 75MBq および Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech社製) を用いて放射標識した。

ハイブリダィゼーシヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイブリダイゼーション液 [5 X SSPE、 50 X Denhaldt ' s 液、 0. 5°/。(w/v) SDS、 100 μ g/ml サケ精子 DNA] 15mlを加えて 65°Cで 3時間のプ レハイブリダイゼーションを行つた。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性し てボトルへ投入し、 65°Cで一晚加温した。

ハイブリダィゼーシヨン後、 ナイ口ン膜を 2 X SSC—0. l% (w/v) SDS 50mlに浸漬 し、 65°Cで 15 分間加温した。 上記の洗浄操作を 2 回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. l% (w/v) SDS 50mlに浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン 膜を X線フィルムへ- 80°Cで暴露し現像した。

前述の制限酵素 BamHI 処理により、 野生型 FUT8 対立遺伝子から約 25. 5Kb の DNA 断片が生じた。 一方、 同制限酵素処理により、 ターゲテイングベクターとの 相同糸且換えが起こった対立遺伝子から約 20. 0Kbの DNA断片が生じた。

本法により、 陽性クローン 50-10-104のゲノム DNAより上記約 25. 5Kbおよび約 20. 0Kbの特異的断片が見出された (第 16図) 。 両断片の量比が 1: 1であったこ と力 ら、 本クローンは FUT8対立遺伝子を 1コピー破壊したへミノックアウトクロ ーンであることが確認された。

3. ゲノム上の FUT8遺伝子をダブルノックアウトした CH0/DG44細胞の作製

(1) ターゲテイングベクター導入株の取得

本実施例第 2項で得た FUT8へミノックアウトクローン 50-10-104に対し、 実施 例 3第 1項で構築したチャイニーズノヽムスター FUT8ゲノム領域ターグティングべ クタ一 pK0FUT8Puroを導入した。 プラスミ ド pK0FUT8Puro の 50-10-104への遺伝子導入はエレク トロポレーショ ン法 [サイトテクノロジー(Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手 順で行った。 まず、 100 /z g/ml BSA (New England Biolabs社製) を含む NEBuf f er for Sal I (New England Biolabs社製) 2. 4ml にプラスミド pK0FUT8Puro U0 μ g を溶解し、 800単位の制限酵素 Sail (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cで 5 時間消化反応を行うことにより線状化した。 該反応液に対しフエノール/ク口口 ホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した線状化プラスミ ドを 1 μ g/ 1 水溶液とした。 一方、 50 - 10- 104 を K-PBS 緩衝液 [ 137mraol/l KC1、 2. 7mraol/l NaCl、 8. lmraol/1 Na2HP04、 1. 5mmol/l KH2P04、 4. 0mraol/l MgClJ に懸 濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 i l (1. 6 X 106個) を上記線状化プラ スミ ド 4 μ 1 (4 z g) と混和した後、 細胞一DNA 混和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2讓) (BI0-RAD 社製) へ移し、 細胞融合装置 Gene Pulser (BIO- RAD社製) を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 の条件で遺伝 子導入を行った。 遺伝子導入した細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社 製) および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地

(Invitrogen社製) に懸濁し、 接着細胞培養用 10cmディッシュ (Falcon社製) へ播種した。 5% C02、 37°Cの条件下で 24 時間培養した後、 培養上清を除去し、 15 μ g/ml ピューロマイシン ( SIGMA 社製) 、 1 倍濃度の HT supplement

(Invitrogen社製) および 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地(Invitrogen社製) を 10mlずつ分注した。 この培地交換作業を 7日毎に 繰り返しながら 15日間の培養を行い、 薬剤耐性クローンを取得した。

(2) ゲノムサザンプロットによる相同組換えの診断

本項 (1) で得た薬剤耐性クローンに対し、 以下の手順でゲノムサザンプロット による相同組換えの診断を行った。

ピューロマイシン耐性クローンが出現した 10cmディッシュより培養上清を除 去し、 リン酸緩衝液 7ml を注入した後、 実体顕微鏡下に移した。 次にピペットマ ン (GILS0N社製) を用いてコロニーを搔き取って吸い込み、 丸底 96穴プレート

(Falcon社製) へ採取した。 トリプシン処理を行った後、 接着細胞用平底 96 穴 プレート (旭テクノグラス社製) へ各クローンを播種し、 lS x g/ml ピュー口マイ シン (SIGMA社製) 、 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製) および 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社製) を添カ卩した IMDM培地(Invitrogen社製) を用い て 1週間培養した。

培養後、 上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 接着細胞用 平底 24 穴プレート (Greiner社製) へ播種した。 lS ^ g/ml ピューロマイシン (SIGMA社製) 、 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製) および 10% ゥシ 胎児血清 (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地(Invitrogen社製) を用いて 1 週間培養した後、 接着細胞用平底 6穴プレート (Greiner社製) へ播種した。 該 プレートより公知の方法 [ヌクレイック ·ァシッド · リサーチ(Nucleic Acids Research) , 3, 2303, (1976) ] に従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE-RNase緩衝液(pH8. 0) [lOmmol/1 Tris- HC1、 lmmol/1 EDTA、 200 μ g/ml RNase A] 150 μ ΐにー晚溶解した。

100 μ g/ml BSA (New England Biolabs社製) を含む NE Buffer for BamHI (New England Biolabs社製) 120 μ 1に上記で調製したゲノム DNA 12 μ gを溶解し、 25単位の制限酵素 BamHI (New England Biolabs社製) を加えて 37°Cでー晚消化 反応を行った。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 TE 緩衝液(pH8. 0) [ 10mmol/l Tris - HC1、 lmmol/1 EDTA] 20 μ 1 に溶解し、 0. 6% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プロシーデ イングス'ォブ'ザ'ナショナル'アカデミー'ォブ 'サイエンス(Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 3683, (1979)に従い、 ナイロン膜へゲノム DNAを転写した。 転写 終了後、 ナイ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行った。

一方、 サザンブロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 FUT8 ゲノム領域のうちターゲティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合す るプライマー (配列番号 11および配列番号 12) を用いて、 以下の PCRを行った。 即ち、 参考例 (2) で得たプラスミド pFUT8fgE2- 2 4. Ong を含む 20 ^ 1 の反応液 [DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製) 、 ExTaq buffer (宝酒造社製) 、 0. 2匪 ol/l dNTPs、 0. 5 ηιο1/1 上記遺伝子特異的プライマー (配列番号 11 および配列番号 12) ]を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°C で 1分間からなる反応を 1サイクルとした 25 サイクルの条件で PCRを行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bpのプロ一 ブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液 5 μ 1に対し、 [ひ-32 P] dCTP 1. 75MBq ぉょぴ Megaprime DNA Label l ing system, dCTP ^Amershara Pharmacia Biotech社製) を用いて放射標識した。 ハイプリダイゼーシヨンは以下のように行つ こ。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイプリダイゼーシヨン液 [5 X SSPE、 50 XDenhaldt' s 液、 0. 5% (w/v) SDS、 100 t g/ml サケ精子 DNA] 15mlを加えて 65°Cで 3時間のプ レハイブリダイゼーションを行つた。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性し てボトルへ投入し、 65°Cでー晚加温した。

ハイブリダイゼーシヨン後、 ナイ口ン膜を 2 X SSC—0. l% (w/v) SDS 50mlに浸漬 し、 65°Cで 15 分間加温した。 上記の洗浄操作を 2 回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. l% (w/v) SDS 50ml に浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン 膜を X線フィルムへ - 80。Cで暴露し現像した。

前述の制限酵素 BamHI 処理により、 野生型 FUT8 対立遺伝子から約 25. 5Kb の DNA 断片が生じる。 一方、 同制限酵素処理により、 ターゲティングベクターとの 相同組換えが起こった対立遺伝子から約 20. 0Kbの DNA断片が生じる。

本法により、 薬剤耐性クローン WK704 のゲノム DNA より相同組換え領域特異的 な約 20. 0Kbの断片のみが見出された (第 17図) 。 野生型対立遺伝子特異的断片 が消失していたこと (矢印の部分) から、 本クローンはゲノム上に存在する全て の FUT8対立遺伝子を破壊したクローンであることが確認された。

4. FUT8 遺伝子をダブルノックアウトした CH0/DG44細胞からの薬剤耐性遺伝子 の除去

(1) Creリコンビナーゼ発現ベクターの導入

本実施例第 3項で作製した FUT8ダブルノックアウトクローンのうち WK704に対 し、 Cre リコンビナーゼ発現ベクター PBS185 (Life Technologies社製) を導入し た。

プラスミ ド PBS185の各 FUT8ダブルノックァゥトクローンへの遺伝子導入はェ レク トロポレーシヨ ン法 [サイ トテク ノ ロジー(Cytotechnology), 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手順で行った。 まず、 各 FUT8ダブルノックアウトクロー ンを K-PBS 緩衝液 [ 137讓 ol/l KC1、 2. 7蘭 ol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP04、 1. 5ramol/l K¾P04、 4. 0mmol/l MgCl2] に懸濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁 液 200 1 (1. 6 X 106個) をプラスミド PBS185 4 g と混和した後、 細胞一 DNA混 和液の全量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BIO- RAD社製) へ移し、 細 胞融合装置 Gene Pulser (BI0-RAD社製) を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 の条件で遺伝子導入を行った。 導入後、 各細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社製) および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製) を添 加した IMDM培地(Invitrogen社製) 10mlに懸濁し、 さらに同培地を用いて 2万 倍希釈した。 各希釈液を接着細胞培養用 10cmディッシュ (Falcon社製) 7枚へ 播種後、 5% C02、 37°Cの条件下で 10 日間の培養を行い、 コロニーを形成させた。

(2) Creリコンビナーゼ発現ベクター導入株の取得

WK704 に対し遺伝子導入して得たコロニーより任意のクローンを以下の手順で 採取した。 まず、 10cmディッシュより培養上清を除去し、 リン酸緩衝液 7ml を 注入した後、 実体顕微鏡下に移した。 次にピペットマン (GILS0N社製) を用いて コロニーを搔き取って吸い込み、 丸底 96穴プレート (Falcon社製) へ採取した。 トリプシン処理を行った後、 接着細胞用平底 96穴プレート (岩城硝子社製) へ各 クローンを播種し、 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社製) および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地(Invitrogen社製) を用いて 1週間培養した。

培養後、 上記プレートの各クローンに対しトリプシン処理を行い、 2倍量の凍 結培地 [20% DMS0、 40% ゥシ胎児血清、 40% IMDM] と混和した。 このうち半量を 接着細胞用平底 96穴プレート (岩城硝子社製) へ播種してレプリカプレートを作 製する一方、 残りの半量をマスタープレートとして凍結保存に供した。

次に、 レプリカプレートを 600 / g/ml G418 (ナカライテスタ社製) 、 15 μ g/ml ピューロマイシン (SIGMA社製) 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社製) および 1 倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地(Invitrogen 社製) を用いて 7日間培養した。 Creリコンビナーゼの発現により ΙοχΡ配列に挟 まれた両対立遺伝子上の薬剤耐性遺伝子が除去された陽性クローンは、 G418 およ びピューロマイシン存在下で死滅する。 本ネガティブ選択法により陽性クローン を見出した。

(3) ゲノムサザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断

本項 (2) で見出された陽性クローン (4 - 5-C3) に対し、 以下の手順でゲノムサ ザンブロットによる薬剤耐性遺伝子除去の診断を行った。

本項 (2) で凍結保存したマスタープレートのうち、 上記陽性クローンを含む 96穴プレートを選択し、 5% C02、 37°Cの条件下で 10分間静置した。 静置後、 上 記クローンに該当するゥエルから細胞を接着細胞用平底 24 穴プレート (Greiner 社製) へ播種した。 10% ゥシ胎児血清 (Invitrogen社製) および 1 倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地(Invitrogen社製) を用い て 1週間培養した後、 接着細胞用平底 6穴プレート (Greiner社製) へ播種した。 該プレートより公知の方法 [ヌクレイック ·ァシッド · リサーチ(Nucleic Acids Research) , 3, 2303, (1976) ] に従って各クローンのゲノム DNA を調製し、 各々 TE-RNase 緩衝液(pH8. 0) [10mmol/l Tris - HC1、 lmmol/1 EDTA、 200 μ g/ml RNase A] 150 μ ΐにー晚溶解した。

100 μ g/ml BSA (New England Biolabs社製) を含む NE Buffer 2 (New England Biolabs社製) 120 μ 1に上記で調製したゲノム DNA 12 μ gを溶解し、 20単位の 制限酵素 NheI (New England Biolabs 社製) を加えて 37°Cでー晚消化反応を行 つた。 該反応液よりエタノール沈殿法を用いて DNA断片を回収した後、 TE緩衝液 (pH8. 0) [ 10mmol/l Tris- HC1、 lmmol/1 EDTA] 20 μ 1 に溶解し、 0. 6% (w八) ァ ガロースゲル電気泳動に供した。 泳動後、 公知の方法 [プロシーディンダス 'ォ ブ 'ザ 'ナショナノレ'アカデミー'ォブ'サイエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 76, 3683, (1979)に従い、 ナイロン膜へゲノム DNA を転写した。 転写終了後、 ナ ィ口ン膜に対し 80°Cで 2時間の熱処理を行った。

一方、 サザンプロットに用いるプローブを以下のように調製した。 まず、 FUT8 ゲノム領域のうちターグティングベクター相同領域を越えた部分の配列に結合す るプライマー (配列番号 11および配列番号 12) を用いて、 以下の PCRを行った。 即ち、 参考例 (2) で得たプラスミ ド pFUT8fgE2- 2 4. Ong を含む 20 ^ 1 の反応液 [DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製) 、 ExTaq buffer (宝酒造社製) 、 0. 2mmol/l dNTPs、 Ο. Β μ ΐΆθΙ/Ι 上記遺伝子特異的プライマー (配列番号 11 および配列番号 12) ]を調製し、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 74°C で 1分間からなる反応を 1サイクルとした 25サイクルの条件で PCRを行った。 PCR後、 反応液を 1. 75% (w/v) ァガロースゲル電気泳動に供し、 約 230bpのプロ一 ブ DNA断片を精製した。 得られたプローブ DNA溶液 5 μ 1に対し、 [ α -32 P] dCTP 1. 75MBq およひ Megaprime DNA Labell ing system, dCTP (Amersnam Pharmacia Biotech社製) を用いて放射標識した。

ハイブリダィゼーシヨンは以下のように行った。 まず、 上記のナイロン膜を口 一ラーボトルへ封入し、 ハイプリダイゼーション液 [5 X SSPE、 50 X Denhaldt, s 液、 0. 5% (w/v) SDS、 100 μ g/ml サケ精子 DNA] 15mlを加えて 65°Cで 3時間のプ レハイプリダイゼーションを行つた。 次に、 32P標識したプローブ DNAを熱変性し てボトルへ投入し、 65°Cでー晚加温した。

ハイブリダィゼーション後、 ナイ口ン膜を 2 X SSC—0. 1% (W/V) SDS 50mlに浸漬 し、 65°Cで 15分間加温した。 上記の洗浄操作を 2 回繰り返した後、 膜を 0. 2 X SSC-0. 1% (W/V) SDS 50mlに浸漬し、 65°Cで 15分間加温した。 洗浄後、 ナイロン 膜を X線フィルムへ- 80°Cで暴露し現像した。

前述の制限酵素 Nhel処理により、 野生型 FUT8対立遺伝子から約 8. 0Kbの DNA 断片が生じる。 また、 同制限酵素処理により、 ターゲテイングベクターとの相同 組換えが起こった対立遺伝子から約 9. 5Kbの DNA断片が生じた。 さらに、 相同組 換えが起こった対立遺伝子からネオマイシン耐性遺伝子 (約 1. 6Kb) またはピュ 一口マイシン耐性遺伝子 (約 1. 5Kb) が除去された場合には、 同処理により約 8. 0Kbの DNA断片が生じた。

本法により、 供試した陽性クローン 4 - 5- C3 (実施例 5 の 4 (3)陽性クローン)の ゲノム DNA より、 薬剤耐性遺伝子が除去された相同組換え領域特異的な約

8. 0Kb断片のみが見出された (第 18図) 。 実施例 6. FUT8対立遺伝子をダブルノックアウトした CH0/DG44細胞における抗 体分子の発現

1. 抗 CD20キメラ抗体発現ベクターの作製

(1) 抗 CD20マウスモノクローナル抗体の VLをコードする cDNAの構築

W094/11026に記載されている抗 CD20マウスモノクローナル抗体 2B8の VLのァ ミノ酸配列をコードする cDNA (配列番号 17)を PCR法を用いて以下の様にして構築 した。

まず、 W094/11026記載の VLの塩基配列の 5'末端と 3'末端に PCR反応時の增幅 用プライマーの結合塩基配列 (ヒト化抗体発現用ベクターへクロー-ングするた めの制限酵素認識配列も含む) を付加した。 設計した塩基配列を 5'末端側から約 100塩基ずつ計 6本の塩基配列に分け (隣り合う塩基配列は、 その末端に約 20塩 基の重複配列を有する様にする) 、 それらをセンス鎖、 アンチセンス鎖の交互の 順で、 実際には、 配列番号 19、 20、 21、 22、 23、 および 24の 6本の合成 DNAを 作製 (GENSET社製へ委託)した。

各オリゴヌクレオチドを最終濃度が 0. 1 / M となる様に、 50 し の反応液 [K0D DNA Polymerase添付 PCR Buffer #1 (東洋紡績社製) 、 0. 2raM dNTPs、 IraM塩ィ匕マ グネシゥム、 0. 5 μ Μ M13 primer M4 (宝酒造社製) 、 0. 5 / M M13 primer RV (宝 酒造社製) ]に添加し、 DNA サーマルサイクラ一 GeneAmp PGR System 9600

(Perkin Elmer社製) を用いて、 94°Cにて 3分間加熱した後、 2. 5 単位の K0D DNA Polymerase (東洋紡績社製) を添加し、 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 30秒間、 74°Cにて 1分間のサイクルを 25サイクル行ない、 更に 72°Cにて 10分間反応させ た。 該反応液 25 /z Lをァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製) を用いて、 約 0. 44kbの VLの PCR産物を回収した。

次に、 プラスミド pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製) を制限酵素 Sma I

(宝酒造社製) して得られた DNA0. 1 gと、 上記で得られた PCR産物約 0. 1 ^ gを 滅菌水に加えて 7. 5 Lとし、 TAKARA ligation kit ver. 2の solution I (宝酒造 社製) 7· 5 μレ 制限酵素 ^ I (宝酒造社製) 0. 3 μ Ιを加えて 22°Cで 2時間反 応させた。 この様にして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 α株 (東洋紡績社製) を形質転換した。 形質転換株のクローンより各プラスミ ド DNA を し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0

(Applied Biosystems社製) を用いて添付の説明書に従って反応後、 同社の DNA シーケンサ ABI PRISM 377 により塩基配列を解析した。 こうして目的の塩基配列 を有する第 19図に示したプラスミ ド pBS- 2B8Lを得た。

(2) 抗 CD20マウスモノク口ーナル抗体の VHをコードする cDNAの構築

W094/11026に記載されている抗 CD20マウスモノクローナル抗体 2B8の VHのァ ミノ酸配列をコードする cDNA (配列番号 18) を PCR法を用いて以下の様にして構 築した。

まず、 TO94/11026記載の VHの塩基配列の 5'末端と 3'末端に PCR反応時の増幅 用プライマーの結合塩基配列 (ヒ ト化抗体発現用ベクターへクローニングするた めの制限酵素認識配列も含む) を付加した。 設計した塩基配列を 5'末端側から約 100塩基ずつ計 6本の塩基配列に分け (隣り合う塩基配列は、 その末端に約 20塩 基の重複配列を有する様にする) 、 それらをセンス鎖、 アンチセンス鎖の交互の 順で、 実際には、 配列番号 25、 26、 27、 28、 29、 および 30の 6本の合成 DNAを 作製 (GENSET社製へ委託)した。

各オリゴヌクレオチドを最終濃度が 0. 1 となる様に、 δθ μ ί の反応液 [K0D DNA Polymerase添付 PCR Buffer #1 (東洋紡績社製) 、 0. 2mM dNTPs、 ImM塩化マ グネシゥム、 0. 5 ^ Μ M13 primer M4 (宝酒造社製) 、 0. 5 μ Μ M13 primer RV (宝 酒造社製) ]に添加し、 DNA サーマルサイクラ一 GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer社製) を用いて、 94°Cにて 3分間加熱した後、 2. 5 単位の K0D DNA Polymerase (東洋紡績社製) を添加し、 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 30秒間、 74°Cにて 1分間のサイクルを 25サイクル行い、 更に 72°Cにて 10分間反応させた。 該反応液 25 i Lをァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製) を用いて、 約 0. 49 k bの VHの PCR産物を回収した。

次に、 プラスミド pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製) を制限酵素 Sma I (宝酒造社製) して得られた DNA0. 1 ^ gと、 上記で得られた PCR産物約 0. 1 μ gを 滅菌水に加えて 7. 5 μ ίとし、 TAKARA ligation kit ver. 2の solution I (宝酒造 社製) 7. 5 x L, 制限酵素 ^ I (宝酒造社製) 0. 3 z L を加えて 22°Cで一晩反応 させた。

この様にして得られた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a株 (東 洋紡績社製) を形質転換した。 形質転換株のクローンより各プラスミド DNA を調 製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0 (Applied Biosystems社製) を用いて添付の説明書に従って反応後、 同社の DNAシーケンサ ABI PRISM 377 により塩基配列を解析した。 こうして目的の塩基配列を有する第 20図に示したプラスミド pBS- 2B8Hを得た。

次に、 14番目のアミノ酸残基を Alaから Pro へ置換するために、 配列番号 31 で示した合成 DNA を設計し、 LA PCR in vitro Mutagenesis Primer Set for pBluescriptll (宝酒造社製) を用いた PCR法により、 以下の様に塩基の置換を行 つた。 上記のプラスミド pBS- 2B8H を lng含む 50 μ L の反応液 [LA PCR Buffer II (宝酒造社製)、 2. 5 単位の TaKaRa LA Taq、 0. 4mM dNTPs、 2. 5mM塩化マグネシ ゥム、 50nM T3 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社製) 、 50nM上記の変異導 入用プライマー (配列番号 31、 GENSET社製) ]を調製し、 DNAサーマルサイクラ — GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer社製) を用いて、 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 2分間、 72°Cにて 1分 30秒間のサイクルを 25サイクル行なった。 該反 応液 30 をァガロースゲル電気泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit

(QIAGEN社製) を用いて、 約 0. 44kbの PCR産物を回収し、 30 μ Lの水溶液とした。 また、 同様に、 上記のプラスミド pBS- 2Β8Η を lng含む 50 L の反応液 [LA PCR Buffer II (宝酒造社製)、 2. 5単位の TaKaRa LA Taq、 0. 4mM dNTPs、 2. 5mM塩ィ匕マ グネシゥム、 50nM T7 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社製) 、 50nM MUT Bl primer (宝酒造社製) ]の PCR反応を行つた。 該反応液 30 をァガロースゲル電気 泳動した後、 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN社製) を用いて、 約 0. 63kb の PCR産物を回収し、 30 ;u Lの水溶液とした。 続いて、 上記で得られた 0. 44kbの PCR産物と 0. 63kb の PCR産物を 0. 5 しずつ 47· 5 μ ί の反応液 [LA PCR Buffer II (宝酒造社製)、 0. 4mM dNTPs、 2. 5raM塩化マグネシゥム]に添加し、 DNAサーマル サイクラ一 GeneAmp PCR System 9600 (Perkin Elmer社製) を用いて、 90°Cにて 10分間加熱した後、 60分間かけて 37°Cまで冷却した後、 37°Cで 15分間保持する ことによって DNA をアニーリングさせた。 2, 5 単位の TaKaRa LA Taq (宝酒造社 製) を添加して 72°Cにて 3 分間反応させた後、 lOpmol ずつの T3 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社製) と T7 BcaBEST Sequencing primer (宝酒造社 製) を添カ卩して反応液を 50 とし、 94°Cにて 30秒間、 55°Cにて 2分間、 72°Cに て 1分 30秒間のサイクルを 10サイクル行った。 該反応液 25 // Lを QIA quick PCR purification kit (QIAGEN社製) にて精製した後、 半量を 10単位の制限酵 素 ¾Πΐ (宝酒造社製) と 10単位の制限酵素^ I (宝酒造社製) を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 59kbの Kpnl-Sacl断片を回収した。

次に、 pBluescriptll SK (-) (Stratagene社製) 1 w gを 10単位の制限酵素 Kpn I (宝酒造社製) と 10単位の^ I (宝酒造社製) を用いて 37°Cで 1時間反応さ せた後、 該反応液をァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 2. 9kb の Kpnl-Sacl 断片を回収した。

上記で得られた PCR産物由来の Kpnl-Sacl 断片とプラスミ ド pBluescriptll SK (-)由来の Kpnl-Sacl 断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製) の Solution I を用いて添付の説明書に従って連結した。 この様にして得られた組換 えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a 株 (東洋紡績社製) を形質転換し、 形質転換株のクローンより各プラスミド DNAを調製し、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0 (Applied Biosystems社製) を用いて添付 の説明書に従って反応後、 同社の DNAシーケンサ ABI PRISM 377により塩基配列 を解析した。

こうして目的の塩基配列を有する第 20図に示したプラスミド pBS-2B8Hmを得た。

(3) 抗 CD20ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築

ヒト化抗体発現用ベクター PKANTEX93 (Mol. Immunol. , 37, 1035, 2000) と本 項 (1) および (2) で得られたプラスミド PBS-2B8Lおよび PBS-2B8Hmを用いて抗 CD20 ヒト型キメラ抗体(以下、 抗 CD20 キメラ抗体と表記する)の発現ベクター PKANTEX2B8Pを以下の様にして構築した。

本項 (1) で得られたプラスミド pBS- 2B8Lの を 10単位の制限酵素 WI (New England Biolabs社製) を用いて 55°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位 の制限酵素^ RI (宝酒造社製) を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液を ァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 41kbの BsiWI-EcoRI断片を回収した。 次に、 ヒト化抗体発現用べクター pKANTEX93の 2 μ gを 10単位の制限酵素 BsiWI (New England Biolabs社製) を用いて 55°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位 の制限酵素 (宝酒造社製) を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液を ァガロースゲル電気泳動にて分画し、 約 12. 75kb の BsiWI-EcoRI断片を回収した。 次に、 上記で得られたプラスミド pBS_2B8L由来 BsiWI- EcoRI断片とプラスミド PKANTEX93由来の BsiWI-EcoRI断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社製) の Solution I を用いて添付の説明書に従って連結した。 この様にして得られた組換 えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a 株 (東洋紡績社製) を形質転換し、 第 21図に示したプラスミド PKANTEX2B8- Lを得た。

次に、 本項 (2) で得られたプラスミド pBS - 2B8Hmの 2 μ §を 10単位の制限酵 素^ I (宝酒造社製) を用いて 37°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位の制限 酵素 l (宝酒造社製) を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロー スゲル電気泳動にて分画し、 約 0. 45kbの Apal-Notl断片を回収した。

次に、 上記で得られたプラスミド pKANTEX2B8 - Lの 3 // gを 10単位の制限酵素 Aeal (宝酒造社製) を用いて 37°Cで 1時間反応させた後、 更に 10単位の制限酵 素 l (宝酒造社製) を用いて 37°Cで 1時間反応させた。 該反応液をァガロース ゲル電気泳動にて分画し、 約 13. 16kbの Apal-Notl断片を回収した。

次に、 上記で得られたプラスミド pBS_2B8Hm由来の Apal-Notl断片とプラスミ ド PKANTEX2B8- L 由来の Apal-Notl 断片を DNA Ligation Kit Ver. 2 (宝酒造社 製) の Solution Iを用いて、 添付の説明書に従って連結した。 この様にして得ら れた組換えプラスミド DNA溶液を用いて大腸菌 DH5 a 株 (東洋紡績社製) を形質 転換し、 形質転換株のクローンより各プラスミド DNAを調製した。

导られ 7こフフスミ トを用レヽ、 BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2. 0 (Applied Biosystems社製) を同社の DNAシークェンサ一 377 を用いて塩基配列の角科斤を行った結果、 目的の DNAがクローニングされている第 21図に示したプラスミド PKANTEX2B8Pが得られたことを確認した。 2. 抗 CD20キメラ抗体の発現

実施例 5第 3項で作製した FUT8遺伝子ダブルノックアウトクローン WK704に対 し、 本実施例第 1項で得た抗 CD20抗体発現べクタ一 pKANTEX2B8Pを導入した。 プラスミ ド PKANTEX2B8Pの WK704への遺伝子導入はエレク トロポレーション法

[サイトテクノロジー(Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手順で 行った。 まず、 プラスミ ド pKANTEX2B8P 10 μ g を NEBuffer 4 (New England Biolabs社製) 100 μ 1に溶解し、 40単位の制限酵素 Aatll (New England Biolabs 社製) を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行うことにより線状化した。 該反応液に 対しフエノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した線 状化プラスミ ドを l i g/ μ Ι 水溶液とした。 一方、 WK704 を K - PBS 緩衝液

[ 137mraol/l KC1、 2. 7nimol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP04、 1. 5蘭 ol/l K P04、 4. 0mmol/l MgCl2] に懸濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 1 (1. 6 X 106 個) を上記線状化プラスミド 4 z l (4/i g) と混和した後、 細胞一 DNA混和液の全 量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BI0-RAD社製) へ移し、 細胞融合装 置 Gene Pulser (BI 0-RAD社製) を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 μ Ρの条 件で遺伝子導入を行った。 遺伝子導入後、 細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血淸

(Invitrogen社製) および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製) を添 加した IMDM培地 (Invitrogen社製) に懸濁し、 接着細胞培養用 T75 フラスコ

(Greiner社製) へ播種した。 5% C02、 37°Cの条件下で 24時間培養した後、 培養 上清を除去し、 10% ゥシ胎児透析血清 (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地 (Invitrogen社製) 10ml を注入した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰り返し ながら 15 日間の培養を行い、 形質転換株 WK704 - 2B8Pを取得した。 なお、 WK704- 2B8P株は WK704- 2B8Pの株名で、 平成 15年 3月 20 日付けで独立法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番地中央第 6) に FERM BP - 8337として寄託されている。

3. 抗ガングリオシド GD3キメラ抗体の発現

実施例 5第 3項で作製した FUT8遺伝子ダブルノックアウトクローン WK704に対 し、 抗ガングリオシド GD3キメラ抗体発現ベクタープラスミド pKANTEX641を導入 し、 抗 GD3キメラ抗体の安定的発現株を作製した。 PKANTEX641は、 TO00/61739記 載の抗 GD3キメラ抗体発現ベクタープラスミド pChi641LHGM4およびヒト化抗体発 現用ベクター PKANTEX93 [モレキュラー ' ィムノロジー (Mol. Immunol. ) , 37, 1035 (2000) ] より構成された誘導体であり、 pChi641LHGM4 より得たタンデム 型抗体発現ュ-ットを含む EcoRI-HindHI断片を PKANTEX93より得た複製起点を 含む EcoRI- Hindlll断片へ連結したものである。

プラスミ ド pKANTEX641 の WK704 への遺伝子導入はエレク トロポレーシヨン法

[サイトテクノロジー(Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手順で 行った。 まず、 プラスミ ド pKANTEX641 10 g を NEBuJffer 4 (New England Biolabs社製) 100 μ 1に溶解し、 40単位の制限酵素 Aatll (New England Biolabs 社製) を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行うことにより線状ィ匕した。 該反応液に 対しフエノール/クロロホルム抽出処理おょぴエタノール沈殿を行い、 回収した線 状化プラスミ ドを 水溶液とした。 一方、 WK704 を K - PBS 緩衝液

[ 137mmol/l KC1、 2. 7mmol/l NaCl、 8. lmmol/1 Na2HP0い 1. 5mmol/l KH2P04、 4. 0mmol/l MgCl2] に懸濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 // 1 (1. 6 X 106 個) を上記線状化プラスミド 4 μ 1 (4 ^ g) と混和した後、 細胞一DNA混和液の全 量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2ram) (BI0-RAD社製) へ移し、 細胞融合装 置 Gene Pulser (BIO- RAD社製) を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 ^i Fの条 件で遺伝子導入を行った。 遺伝子導入後、 細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清

(Invitrogen社製) および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製) を添 加した IMDM培地 (Invitrogen社製) に懸濁し、 接着細胞培養用 T75 フラスコ

(Greiner社製) へ播種した。 5% C02、 37°Cの条件下で 24時間培養した後、 培養 上清を除去し、 10% ゥシ胎児透析血清 (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地 (Invitrogen社製) 10mlを注入した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰り返し ながら 15 日間の培養を行い、 形質転換株 WK704- 2871 を取得した。 なお、 WK704- 2871株は WK704-2871 の株名で、 平成 15年 3月 20 日付けで独立法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番地中央第 6) に FERM BP- 8336として寄託されている。

4. 抗 CCR4キメラ抗体の発現

実施例 5第 3項で作製した FUT8遺伝子ダブルノックアウトクローン WK704に対 し、 TO01/64754記載の抗 CCR4キメラ抗体発現ベクター pKANTEX2160を導入し、 抗 CCR キメラ抗体の安定的発現株を作製した。 プラスミ ド pKANTEX2B8P の WK704への遺伝子導入はエレク トロポレーション法 [サイトテクノロジー(Cytotechnology) , 3, 133 (1990) ] に準じて以下の手順で 行った。 まず、 プラスミ ド pKANTEX2160 15 g を NEBuffer 4 (New England Biolabs社製) 100 μ 1に溶解し、 40単位の制限酵素 Aatll (New England Biolabs 社製) を加えて 37°Cで 2時間消化反応を行うことにより線状ィヒした。 該反応液に 対しフエノール/クロロホルム抽出処理およびエタノール沈殿を行い、 回収した線 状化プラスミ ドを l i g/ μ Ι 水溶液とした。 一方、 WK704 を K- PBS 緩衝液

[ 137藤 ol/l KC1 、 2. 7mmol/l NaCl 、 8. lmmol/1 Na2HP04、 1. 5mmol/l KH2P04

4. Ommol/1 MgCl2] に懸濁して 8 X 107個/ ml とした。 細胞懸濁液 200 / 1 (l. 6 X 106 個) を上記線状化プラスミド 4 μ 1 ( iu ) と混和した後、 細胞一 DNA混和液の全 量を Gene Pulser Cuvette (電極間距離 2mm) (BI0-RAD社製) へ移し、 細胞融合装 置 Gene Pulser (BIO- RAD社製) を用いてパルス電圧 350V、 電気容量 250 Fの条 件で遺伝子導入を行った。 遺伝子導入後、 細胞懸濁液を 10% ゥシ胎児血清

(Invitrogen社製) および 1倍濃度の HT supplement (Invitrogen社製) を添 加した IMDM培地 (Invitrogen社製) に懸濁し、 接着細胞培養用 T75 フラスコ

(Greiner社製) へ播種した。 5% C02、 37°Cの条件下で 24時間培養した後、 培養 上清を除去し、 10% ゥシ胎児透析血清 (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地 (Invitrogen社製) 10ml を注入した。 この培地交換作業を 3〜4 日毎に繰り返し ながら 15 日間の培養を行い、 形質転換株 WK704- 2760を取得した。 なお、 WK704 - 2760株は WK704- 2760の株名で、 平成 15年 3月 20 日付けで独立法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば市東 1 丁目 1番地中央第 6) に FERM BP - 8335として寄託されている。

5. 抗体分子の精製

本実施例第 2項で得た抗 CD20抗体発現株 WK704-2B8Pを、 10% ゥシ胎児透析血 清 (Invitrogen社製) を添加した IMDM培地(Invitrogen社製) へ 3 X 105個/ mlの 密度で懸濁後、 接着細胞培養用 T182フラスコ (Greiner社製) 10本へ計 300ml播 種した。 同様にして、 本実施例第 3項で得た抗 GD3抗体発現株 WK704-2871および 本実施例第 4項で得た抗 CCR4抗体発現株 WK704-2760を播種した。 3 日間の培養 後、 各株の上清全量を除去し、 EXCELL301培地 (JRH Biosciences社製) へ交換し た。 これらを 37°Cの 5% C02インキュベーター内で 7 日間培養後、 各細胞懸濁液 を回収した。 回収した各細胞懸濁液に対し 3000rpm、 4°Cの条件で 10分間の遠心 分離を行って上清を回収した後、 0. 22 μ πι孔径 500ml容 PES Membrane (旭テクノ グラス社製) を用いて濾過した。

0. 8cm径のカラムに Mab Select (Araersham Pharmacia Biotech社製) 0. 5ml を 充填し、 精製水 3. 0ml および 0. 2mol/l ホウ酸一 0. 15mol/l NaCl 緩衝液

(pH7. 5) 3. 0ml を順次通筒した。 さらに、 0. lmol/1 クェン酸緩衝液 (pH3. 5) 2. 0mlおよび 0, 2mol/l ホウ酸一 0. 15mol/l NaCl緩衝液 (pH7. 5) 1. 5mlで順次洗 浄することによって担体の平衡化を行った。 次に、 上記培養上清 300ml をカラム に通筒した後、 0. 2mol/l ホウ酸一 0. 15mol/l NaCl緩衝液 (pH7. 5) 3. 0ml で洗浄 した。 洗浄後、 0. lmol/1 クェン酸緩衝液 (pH3. 5) 1. 25ml を用いて担体に吸着し た抗体の溶出を行った。 初めに溶出する 250 μ 1の画分を廃棄し、 次に得られる溶 出画分 1ml を回収して 2mol/l Tris-HCl (pH8. 5) 200 ^ 1 と混合して中和した。 取 得した溶出液に対し、 lOmol/1 クェン酸一 0. 15mol/l NaCl 緩衝液 (pH6. 0) を用 いて 4 °Cで一昼夜透析を行った。 透析後、 抗体溶液を回収し、 0. 22 μ m 孔径 Millex GV (MILLIP0RE社製) を用いて滅菌濾過した。 実施例 7. FUT8対立遺伝子をダブルノックアウトした CH0/DG44細胞が産生する 抗体組成物の in vitro細胞障害活性 (ADCC活性)

実施例 6で精製した抗 CD20抗体の in vitro細胞障害活性を評価するため、 以 下の記述に従い ADCC活性を測定した。

(1) 標的細胞溶液の調製

RPMI1640- FCS (10) 培地(FCSを 10%含む RPMI1640培地(GIBC0 BRL社製))で培 養したヒト Bリンパ球培養細胞株 Raji細胞 (JCRB9012)を遠心分離操作および懸濁 により RPMI1640- FCS (5)培地 (FCSを 5%含む RPMI1640培地(GIBC0 BRL社製)) で 洗浄した後、 RPMI1640- FCS (5) 培地によって、 2 X 105細胞/ mL に調製し、 標的細 胞溶液とした。

(2) エフェクター細胞溶液の調製

健常人静脈血 50mLを採取し、 へパリンナトリウム (清水製薬社製) 0. 5mLを加 え穏やかに混ぜた。 これを Lymphoprep (AXIS SHIELD社製) を用いて使用説明書 に従い、 遠心分離 (800g、 20分間) して単核球層を分離した。 RPMI1640-FCS (5) 培地で 3回遠心分離して洗浄後、 同培地を用いて 4 X 106細胞/ mLの濃度で再懸濁 し、 ェフエクタ一細胞溶液とした。

(3) ADCC活性の測定

96 ゥヱル U字底プレート (Falcon社製) の各ゥエルに上記 (1) で調製した 標的細胞溶液の 50 W L (1 X 104細胞/ゥエル) を分注した。 次いで上記 (2) で調 製したエフェクター細胞溶液を 50 (2 X 105細胞/ゥエル、 エフェクター細胞と 標的細胞の比は 20 : 1 となる) 添加した。 更に、 各種抗 CD20キメラ抗体を各最終 濃度 0. 3〜3000ng/mLとなるように加えて全量を 150 z Lとし、 37°Cで 4時間反応 させた。 反応後、 プレートを遠心分離し、 上清中の乳酸デヒドロゲナーゼ (LDH)活 性を、 CytoTox96 NoN- Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega社製) を用い て測定した。 標的細胞自然遊離 LDH量は、 エフェクター細胞溶液、 抗体溶液の代 わりに培地のみを用いて上記と同様の操作を行い、 上清の LDH活性を測定するこ とにより求めた。 エフェクター細胞自然遊離の吸光度データは、 標的細胞溶液、 抗体溶液の代わりに培地のみを用いて、 上記と同様の操作を行うことで取得した。 全標的細胞破壊にともなう全遊離 LDH量は、 抗体溶液、 ェフエクタ一細胞溶液の 代わりに培地を用い、 反応終了 45分前に の 9% Triton X- 100溶液を添加 し、 上記と同様の操作を行い、 上清の LDH活性を測定することにより求めた。 こ れらの値を用いて下式 (II) により、 ADCC活性を求めた。

(検体上清中の LDH量) 一 (自然遊離 LDH量)

ADCC活性(%) = X 100 (II)

(全遊離 LDH量) 一 (自然遊離 LDH量) 第 22図に各抗 CD20抗体の ADCC活性を示した。 FUT8遺伝子ダブルノックァゥ トクローン WK704-2B8P より得た抗体は、 いずれの抗体濃度においても市販 Rituxan™より高い ADCC活性を示し、 最高細胞障害活性値も高かった。 Rituxan™ は、 FUT8遺伝子が破壊されていない CH0細胞を宿主細胞として製造された抗 CD20 キメラ抗体である。 また、 FUT8遺伝子ダブルノックアウトクローン WK704-2871 株、 WK704- 2760株より得たそれぞれの抗体に関して ADCC活性を測定したところ、 抗 CD20抗体の場合と同様に、 FUT8遺伝子が破壊されてない通常の CH0細胞株が 産生する抗体に比べて高い細胞障害活性を示した。 以上の結果より、 FUT8対立遺 伝子を破壊した宿主細胞を用いることにより、 FUT8遺伝子が破壊されていない宿 主細胞を用いた場合より、 細胞障害活性の高い抗体の生産が可能となることが分 かった。 実施例 8. FUT8対立遺伝子をダブルノックアウトした CH0/DG44細胞が産生する 抗体組成物の糖鎖解析

実施例 6 で取得した、 FUT8遺伝子ダブルノックァゥトクローンが生産した抗 CD20抗体、 抗 GD3抗体おょぴ抗 CCR4抗体の糖鎖解析を実施例 2. (4) に記載の 方法に従って行った。 また、 これら抗体の糖鎖の組成に関して単糖組成分析を、 公知の方法 [ジャーナル ·ォブ · リキッド 'クロマトグラフィー(Journal of Liquid Chromatography) , 6, 1577, (1983) ] に従って行った。 その結果、 FUT8 遺伝子ダブルノックアウトクローン WK704 より得たいずれの抗体においても、 フ コースを含有する糖鎖構造は確認されなかった。 以上の結果より、 宿主細胞の FUT8対立遺伝子を破壌することにより、 Ν -グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1位が α結合する機能を完全に欠失 させることが可能であることを明らかとなった。 参考例 CH0細胞 FUT8遺伝子の取得

(1) CH0細胞 FUT8 cDNA配列の取得

000/61739の実施例 8 (1) の記載に基づき、 培養 2 日目の CH0/DG44細胞より 調製した一本鎖 cDNAより、 以下の手順でチャイニーズハムスター FUT8 cDNAを取 得した (第 23図)。

まず、 マウス FUT8の cDNA配列 (GenBank, AB025198) より、 5'側非翻訳領域に 特異的なフォワードプライマー (配列番号 7に示す) および 3'側非翻訳領域に特 異的なリバースプライマー (配列番号 8に示す)を設計した。

次に DNAポリメラーゼ ExTaq (宝酒造社製) を用いて、 前述の CH0/DG44細胞由 来 cDNA 1 μ 1 を含む 25 μ 1 の反応液 [ExTaq buffer (宝酒造社製)、 0. 2mmol/l dNTPs、 4%DMS0、 0. 5 μ ηιο1/1 上記特異的プライマー (配列番号 7および配列番号 8) ] を調製し、 PCRを行った。 PCRは、 94°Cで 1分間の加熱の後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 30秒間、 72°Cで 2分間からなる反応を 1サイクルとして 30サイクルの後、 さらに 72°Cで 10分間加熱する条件で行った。

PCR後、 反応液を 0. 8%ァガロースゲル電気泳動に供し、 特異的増幅断片約 2Kb を精製した。 この DNA断片 4 μ 1を、 T0P0 TA cloning Kit (Invitrogen社製) の 細 07 説明書に従ってプラスミド PCR2. 1へ揷入し、 該反応液を用いて大腸菌 DH5ひ株を 形質転換した。 得られたカナマイシン耐性コロニーのうち cDNAが組み込まれた 8 クローンから、 公知の方法に従って各々プラスミド DNAを単離した。

各プラスミ ドに揷入された cDNA の塩基配列は、 DNA シークェンサ一 377 (Parkin Elmer 社製) ぉょぴ BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer社製) を使用して決定し、 方法は添付マニュアルに 従った。 本法により、 全ての挿入 cDNA力 CH0細胞 FUT8の 0RF全長を含む配列 をコードすることを確認した。 このうち PCR に伴う塩基の読み誤りを該配列内に 全く含まないプラスミド DNAを選択した。 以下、 本プラスミドを CHfFUT8- pCR2. 1 と称す。 決定した CH0細胞 FUT8 cDNAの塩基配列を配列番号 1に示した。 また、 そのアミノ酸配列を配列番号 4に示した。

(2) CH0細胞 FUT8ゲノム配列の取得

本項 (1) で取得した CH0細胞 FUT8 0RF全長 cDNA断片をプローブとして用い、 CH0-K1 細胞由来 λ -ファージゲノムライプラリー (STRATEGENE社製) よりモレキ ユラ一 ·クローニング第 2版、 力レント ·プロトコ一ルス、 'イン 'モレキユラ 一 ·バイオロジー、 A Laboratory Manual, 2 nd Ed. (1989) 等に記載の公知のゲ ノムスクリーユングの方法に従い CH0細胞 FUT8ゲノムクローンを取得した。 次に、 取得したゲノムクローンを各種制限酵素を用いて消化後、 CH0細胞 FUT8 cDNAの 開始コドンを含む AfaI-Sau3AI 断片 (約 280bp) をプローブとしてサザンハイブ リダィゼーシヨンを行い、 陽性を示した制限酵素断片のうち 断片 (約 2. 5Kb) および Sacト Sacl 断片 (約 6. 5Kb) を選択して pBluescriptll KS (+) (Strategene社製) へ各々挿入した。

取得した各ゲノム断片の塩基配列は、 DNAシークェンサ一 377 (Parkin Elmer社 製) および BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Parkin Elmer社製) を用いて決定し、 方法は添付マニュアルに従った。 本法に より、 Xbal- Xbal 断片は CH0細胞 FUT8 のェクソン 2 を含む上流ィントロン約 2. 5Kbの配列を、 Sacl-Sacl断片は CH0細胞 FUT8のェクソン 2を含む下流ィント ロン約 6. 5Kb の配列を各々コードすることを確認した。 以下、 Xbal-Xbal 断片を 含むプラスミドを PFUT8fgE2- 2、 Sacl-Sacl断片を含むプラスミドを pFUT8fgE2- 4 と称す。 決定した CH0細胞 FUT8のェクソン 2を含むゲノム領域の塩基配列 (約 9. 0Kb) を配列番号 3に示した。 産業上の利用可能性

本発明は、 N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位にフコースの 1 位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が低下または 欠失するようにゲノムが改変された細胞、 該細胞を用いた抗体組成物の製造方法、 該細胞を用いて作製されたトランスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 該製造 方法により製造された抗体組成物およぴ抗体組成物を含有する医薬を提供するこ とができる。 配列表フリーテキスト

配列番号 7—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 8—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 9一人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 10—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 11一人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 12—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 13—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 14一人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 15—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 16—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 19一人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 20—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 21—人工配列の説明 合成腿

配列番号 22—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 23—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 24—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 25—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 26—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 27—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 28—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 29—人工配列の説明 合成 DNA

配列番号 30—人工配列の説明 合成 DNA 配列番号 31—人工配列の説明:合成 DNA

Claims

請 求 の 範 囲
1. N-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位 にフコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素の活性が親株細胞よりも 低下または欠失するようにゲノムが改変された細胞。
2. N-グリコシド結合複合型糠鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に フコースの 1位が a結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム遺伝子がノックァ ゥトされた、 請求の範囲 1記載の細胞。
3. Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位に フコースの 1位が α結合する糖鎖修飾に関与する酵素のゲノム上の対立遺伝子の すべてがノックアウトされた請求の範囲 1または 2に記載の細胞。
4. Ν-グリコシド結合複合型糠鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位に フコースの 1位がひ結合する糖鎖修飾に関与する酵素が、 oi l, 6 -フコシルトラン スフエラーゼである、 請求の範囲 1〜3のいずれか 1項に記載の細胞。
5. α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼが、 以下の (a)、 (b)ヽ (c)および (d)か らなる群から選ばれる DNAがコードする蛋白質である、 請求の範囲 4に記載の細 胞。
(a) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA;
(b) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA;
(c) 配列番号 1で表される塩基配列からなる DNA とストリンジヱントな条件 でハイブリダイズし、 かつ α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白 質をコードする DNA;
(d) 配列番号 2で表される塩基配列からなる DNA とストリンジェントな条件 でハイブリダイズし、 かつ a l, 6 -フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白 質をコードする DNA。
6. a l, 6-フコシルトランスフェラーゼが、 以下の (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e) および (f) からなる群から選ばれる蛋白質である、 請求の範囲 4に記載の細胞。
(a) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(b) 配列番号 5で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質;
(c) 配列番号 4 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ《1, 6 -フコシ ルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質; (d) 配列番号 5 で表されるアミノ酸配列において、 1 以上のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ a l,6 -フコシ ルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質;
(e) 配列番号 4で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質;
(f) 配列番号 5で表されるアミノ酸配列と 80%以上の相同性を有するァミノ 酸配列からなり、 かつ α 1, 6-フコシルトランスフェラーゼ活性を有する蛋白質。
7. Ν-グリコシド結合複合型糖鎖還元末端の Ν-ァセチルダルコサミンの 6位 とフコースの 1位がひ結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である、 請求 の範囲 1〜6のいずれか 1項に記載の細胞。
8. 少なくとも、 以下の(a)、 (b)、 (c)および (d)からなる群から選ばれるレク チンの一つに耐性である、 請求の範囲 7記載の細胞。
(a) レンズマメレクチン;
(b) ェンドウマメレクチン;
(c) ソラマメレクチン;
(d) ヒィロチャワンタケレクチン。
9. 細胞が、 下記の (a)〜(j) からなる群から選ばれる細胞である、 請求の範 囲 1〜8のいずれか 1項に記載の細胞。
(a) チャイニーズハムスター卵巣組織由来 CH0細胞;
(b) ラットミエロ一マ細胞株 YB2/3HL. P2. Gil. 16Ag. 20細胞;
(c) マウスミエ口一マ細胞株 NS0細胞;
(d) マウスミエ口一マ細胞株 SP2/0- Agl4細胞;
(e) シリアンハムスター腎臓組織由来 BHK細胞;
(f) 抗体を生産するハイプリ ドーマ細胞;
(g) ヒト白血病細胞株ナマルバ細胞;
(h) 胚性幹細胞;
(i) 受精卵細胞;
(j) 植物細胞。
10. 抗体分子をコードする遺伝子を含む請求の範囲 1〜9のいずれか 1項に記 載の細胞。
11. 抗体分子が、 以下の(a)、 (b)、 (c)および (d)からなる群から選ばれる抗 体分子である、 請求の範囲 10に記載の細胞。 (a) ヒト抗体;
(b) ヒト化抗体;
(c) (a)または (b)の Fc領域を含む抗体断片;
(d) (a)または (b)の Fc領域を有する融合蛋白質。
12. 抗体分子のクラスが IgGである、 請求の範囲 10または 11に記載の細胞。
13. 親株細胞が生産する抗体組成物より、 抗体依存性細胞障害活性が高い抗 体組成物を生産する能力を有する、 請求の範囲 1〜12のいずれか 1項に記載の細 胞。
14. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糠鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞が生産 する抗体組成物よりも高いことを特徴とする、 請求の範囲 13に記載の細胞。
15. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N-ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 14に記載の細胞。
16. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である抗 体組成物である、 請求の範囲 13〜: 15のいずれか 1項に記載の細胞。
17. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルダルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しなレ、抗体組成物である、 請 求の範囲 13〜16いずれか 1項に記載の細胞。
18. 請求の範囲 10〜17のいずれか 1項に記載の細胞を用いること特徴とする、 抗体組成物を製造する方法。
19. 請求の範囲 10〜18のいずれか 1項に記載の細胞を培地に培養し、 培養物 中に抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物から抗体組成物を採取する工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
20. 抗体組成物が親株細胞が生産する抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障 害活性が高い抗体組成物である、 請求の範囲 18または 19に記載の方法。
21. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -ダリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、 親株細胞が生産 する抗体組成物より高いことを特徴とする、 請求の範囲 20に記載の方法。
22. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N-グリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N -ァセチルダルコサミンの 6位にひ結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 21に記載の方法。
23. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N -グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が 20%以上である抗 体組成物である、 請求の範囲 20〜22のいずれか 1項に記載の方法。
24. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルダルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しない抗体組成物である、 請 求の範囲 20〜23いずれか 1項に記載の方法。
25. 請求の範囲 1〜9のいずれかに記載の細胞を用いて作製された、 トランス ジェニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
26. トランスジヱニック非ヒ ト動物が、 ゥシ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥマ、 マウス、 ラット、 ニヮトリ、 サルおよびゥサギからなる群から選ばれる動物であ る、 請求の範囲 24に記載のトランスジヱニック非ヒト動物、 またはその子孫。
27. 抗体分子をコードする遺伝子を導入した請求の範囲 25または 26に記載 のトランスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
28. 抗体分子が、 以下の(a)、 (b)、 (c)および(d)からなる群から選ばれる抗 体分子である、 請求の範囲 27に記載のトランスジヱニック非ヒト動物あるいは植 物、 またはその子孫。
(a) ヒト抗体;
(b) ヒト化抗体;
(c) (a)または (b)の Fc領域を含む抗体断片;
(d) (a)または (b)の Fc領域を有する融合蛋白質。
29. ■ 抗体分子のクラスが IgGである、 請求の範囲 27または 28に記載のトラ ンスジエニック非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫。
30. 請求の範囲 27〜29のいずれか 1項に記載のトランスジヱニック非ヒト動 物あるいは植物を飼育し、 飼育した動物あるいは植物から導入した抗体組成物を 含む組織あるいは体液を取得し、 該組織あるいは体液から抗体組成物を採取する 工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
31. 請求の範囲 26〜29のいずれか 1項に記載のトランスジエニック非ヒト動 物あるいは植物、 またはその子孫の抗体生産細胞を取得し、 取得した抗体生産細 胞を培地に培養し、 培養物中に抗体組成物を生成蓄積させ、 該培養物から抗体組 成物を採取する工程を含む、 抗体組成物を製造する方法。
32. 抗体組成物が、 ゲノムが改変されていない非ヒト動物あるいは植物、 ま たはその子孫から得られる抗体組成物よりも、 抗体依存性細胞障害活性が高い抗 体組成物である、 請求の範囲 30または 31に記載の方法。
33. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンとフコースが結合していない糖鎖の割合が、 ゲノムが改変さ れていない非ヒト動物あるいは植物、 またはその子孫から得られる抗体組成物よ り高いことを特徴とする、 請求の範囲 32に記載の方法。
34. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N -ダリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に a結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 33に記載の方法。
35. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全 N-グリコシド結合複合型糠鎖のうち、 糖鎖還元末端の N -ァ セチルダルコサミンにフコースが結合していない糠鎖の割合が 20%以上である抗 体組成物である、 請求の範囲 32〜34のいずれか 1項に記載の方法。
36. 抗体依存性細胞障害活性が高い抗体組成物が、 糖鎖還元末端の N-ァセチ ルダルコサミンとフコースが結合している糖鎖を有しなレ、抗体組成物である、 請 求の範囲 32〜35いずれか 1項に記載の方法。
37. N -ダリコシド結合型糖鎖を Fc領域に有する抗体分子からなる抗体組成物 であって、 該抗体組成物中に含まれる Fc領域に結合する全ダリコシド結合複合型 糖鎖のうち、 糖鎖還元末端の N-ァセチルダリコサミンにフコースが結合していな V、糖鎖を有する抗体組成物。
38. フコースが結合していない糖鎖が、 該フコースの 1位が N-グリコシド結 合複合型糖鎖還元末端の N-ァセチルダルコサミンの 6位に α結合していない糖鎖 である、 請求の範囲 37記載の抗体組成物。
39. 請求の範囲 18〜24のいずれか 1項に記載の方法を用いて製造される抗体 組成物。
40. 請求の範囲 27〜36のいずれか 1項に記載の方法を用いて製造される抗体 組成物。
41. 請求の範囲 37〜40のいずれか 1項に記載の記載の抗体組成物を有効成分 として含有する医薬。
42. 医薬が、 腫瘍を伴う疾患、 アレルギーを伴う疾患、 炎症を伴う疾患、 自 己免疫疾患、 循環器疾患、 ウィルス感染を伴う疾患または細菌感染を伴う疾患に 対する診断薬、 予防薬または治療薬である、 請求の範囲 41に記載の医薬。
43. 請求の範囲 41または 42に記載の医薬を製造するための、 請求の範囲 37 〜40のいずれか 1項に記載の抗体組成物の使用。
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