WO2003082346A1 - Proteine chimerique recombinante servant a l'administration ciblee d'adn dans des cellules cibles eucaryotes - Google Patents

Proteine chimerique recombinante servant a l'administration ciblee d'adn dans des cellules cibles eucaryotes Download PDF

Info

Publication number
WO2003082346A1
WO2003082346A1 PCT/RU2002/000145 RU0200145W WO03082346A1 WO 2003082346 A1 WO2003082346 A1 WO 2003082346A1 RU 0200145 W RU0200145 W RU 0200145W WO 03082346 A1 WO03082346 A1 WO 03082346A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
gene
recombinant
protein
dηκ
binding domain
Prior art date
Application number
PCT/RU2002/000145
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Igor Georgievich Shemyakin
Valentina Alexeevna Anisimova
Original Assignee
'asgl-Farmatsevticheskie Innovatsii', Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 'asgl-Farmatsevticheskie Innovatsii', Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo filed Critical 'asgl-Farmatsevticheskie Innovatsii', Zakrytoe Aktsionernoe Obschestvo
Priority to AU2002323845A priority Critical patent/AU2002323845A1/en
Priority to PCT/RU2002/000145 priority patent/WO2003082346A1/ru
Publication of WO2003082346A1 publication Critical patent/WO2003082346A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/80—Fusion polypeptide containing a DNA binding domain, e.g. Lacl or Tet-repressor

Definitions

  • Methods are very effective in different types of cells, they are integrated into the gene and replicated together with the genetic material. However, only a limited number of vehicles may be transferred; They are capable of infecting only fissile cells, which substantially narrow the scope of the ⁇ ⁇ names; their excursion is easy to control and stabilize; Manufacturing and standardization of industrial products is extremely labor-intensive and affordable.
  • the donors are distinguished by the fact that they are not capable of penetrating only into fissile, 5 but also into absorbable cells; It is characterized by a high level of expression; Can be easily obtained in large quantities.
  • Viral systems are vectors on the basis
  • the passive incorporation of macromolecules (D, protein id) into the cell is based on the mechanism of endocytosis.
  • This mechanism in the first place, 5 is characterized by a low efficiency; on the other hand, DI, having acquired the card through endocytosis, is protected from the risk of lysosomal transfer; thirdly, this mechanism does not provide delivery It’s in the cell nucleus, where there is a risk. To get around this work, a number of additional products are used.
  • the core of the nucleus was significantly enhanced as a result of the direct “stitching” of L8 with a 2-chain chain, as well as the use of a 34-channel antigen. e ⁇ a ⁇ . // Good. ⁇ a ⁇ . ⁇ jon ⁇ . 8s ⁇ . ⁇ 8 ⁇ . - 1999. - ⁇ .96. - ⁇ . 91 - 96].
  • the proposed recombinant squirrels possess the properties necessary for the efficient delivery of special products to favorites. They are made up of parts of the functional and structural parts. Pe ⁇ vaya -D ⁇ -Binding d ⁇ men (d ⁇ zhzhev ⁇ y ⁇ a ⁇ ⁇ ans ⁇ i ⁇ tsii ⁇ 4 or ⁇ -y ⁇ eg ⁇ g ⁇ e ⁇ ) ⁇ bladayuschy sv ⁇ ys ⁇ v ⁇ m svyazyva ⁇ sya s ⁇ s ⁇ etsi ⁇ iches ⁇ y ⁇ sled ⁇ va ⁇ eln ⁇ s ⁇ yu on eu ⁇ a ⁇ i ⁇ iches ⁇ y ⁇ lazmide carrying ⁇ or in ⁇ y " ⁇ e ⁇ a ⁇ ev ⁇ iches ⁇ y" ⁇ ansgen, ⁇ .e.
  • Figure 2 Scheme of plasma plasmid carrying the gene of the chemical protein containing the D-binding domain of ⁇ t ⁇ eg ⁇ ig.Z. Analysis of the content of the squirrel, containing the D-binding domain L4, in the direct fraction and in the litter of the lactate culture of the cleanser
  • Membrane (lines 4, 5) is processed by fragments () réelle ⁇ ) 2 wide-ranging antibodies by having different types of toxic substances, which are conjugated with transoxidase.
  • the membrane (lines 6.7) was processed with a biotinylated conversion of chyrene.
  • Membrane (lines 4, 5, 6) is processed biotinylated conversion, membrane (lines 7, 8, 9) is processed by fragments ( ⁇ réelle ⁇ ) 2
  • Example 1 Consumption of a vector carrying the gene of a protein with D-binding domain L4
  • a preliminary chain reaction is carried out in the following mode: initial denaturation and activation of the enzyme - 95 ° ⁇ , 5 min. Particularly amplification, 40 cycles: denaturation - 95 ° ⁇ , Min, burning of parameters - 57 ° ⁇ , 30 sec, elngation - 72 ° ⁇ , 40 sec. Final elongation - 72 ° ⁇ , 10 min.
  • the size of our product range is 440 units.
  • Non-recombinant plasmids select from results from electrical and experimental analyzes.
  • an increase of 388 is used, use the following parameters: direct - 5 ' £ ⁇ vic ⁇ GO réelle ⁇ ss ⁇ '.
  • a preliminary chain reaction is carried out in the following mode: initial denaturation and activation of the enzyme - 95 ° ⁇ , 5 min.
  • the plasmid rusC ⁇ 388 ⁇ serves as a template for amplification of the fragment of the fused gene ⁇ 388 ⁇ , starting with 549 nucleotide of the D ⁇ gene with the help of: ⁇ founded ⁇ réelle ⁇ ⁇ b ⁇ a ⁇ n ⁇ g ⁇ - 5 'sssaa ⁇ s ⁇ s ⁇ as ⁇ s ⁇ aas ⁇ s ⁇ Z', st ⁇ i e ⁇ m ⁇ yam ⁇ y ⁇ ayme ⁇ ⁇ m ⁇ lemen ⁇ a ⁇ en 5 ' ⁇ ntsev ⁇ y ⁇ blas ⁇ i gene di ⁇ e ⁇ iyn ⁇ g ⁇ ⁇ sina and ⁇ b ⁇ a ⁇ ny ⁇ ayme ⁇ ⁇ m ⁇ lemen ⁇ a ⁇ en W' ⁇ ntsev ⁇ y ⁇ blas ⁇ i s ⁇ e ⁇ avidina gene.
  • a preliminary chain reaction is carried out in the following mode: preliminary denationalization and activation of the enzyme - 95 ° ⁇ , 5 min .;
  • the plasmid ⁇ 323 (+) is widely distributed by the metabolic enzymes ⁇ Brass ⁇ and ⁇ . By using this site, it is located at 691, which makes it possible to use the recombinant protein in a convenient way.
  • Gene L4 is digested from plasmids ⁇ 4 with the use of testis ⁇ réelle ⁇ and ⁇ note ⁇ .
  • Combinant clones are tested in the environment with ampicillin (100 mcg / ml) and analyzed by a direct analysis.
  • the final plasmid carrying fragments ⁇ 4, ⁇ 388 and 8 ⁇ in the same reading frame is called ⁇ 44 ⁇ ⁇ 388 8 ⁇ . Its linear size is about 6.9 T.p.n.o.
  • the sequence between the two brackets provides a homeopathic acid metabolism site that cures glycine and serine.
  • cysteine (codified by code) is involved in the recombinant squirrel, which is involved in the production of disulphidic communication with 201 Derived by the disulphide bite, a polyphetidenoe killer, which is rich in arginine wastes, is the site of the action of the process.
  • the dissemination of pathases is necessary at the stage of the introduction of the fragment ⁇ disseminated toxin from the endosoma into the cytoplasm.
  • the amino acid residue of cysteine in the 201st position is functionally important.
  • the gene that promotes the D-binding domain of the ⁇ - ⁇ eg is compiled from the synthesized ⁇ of the first legitimate. For the basis of the investigation was taken
  • the gene generated is amplified by using the preprocessing method as a result of the process, and by using this method, the result is 21 “48".
  • ⁇ lig ⁇ nu ⁇ le ⁇ id "1-48" s ⁇ de ⁇ zhi ⁇ ⁇ sled ⁇ va ⁇ eln ⁇ s ⁇ for recognition ⁇ es ⁇ i ⁇ az ⁇ y ⁇ e ⁇ (5'sa ⁇ a ⁇ W ') in s ⁇ s ⁇ av ⁇ y v ⁇ di ⁇ ⁇ sled ⁇ va ⁇ eln ⁇ s ⁇ initsii ⁇ uyuscheg ⁇ ⁇ ⁇ d ⁇ na in s ⁇ s ⁇ av ⁇ lig ⁇ nu ⁇ le ⁇ ida "217-266" v ⁇ lyuchena ⁇ sled ⁇ va ⁇ eln ⁇ s ⁇ for ⁇ es ⁇ i ⁇ azy ⁇ at ⁇ (5' ⁇ a ⁇ ss H ').
  • a preliminary chain reaction is carried out in the following mode: preliminary denationalization and activation of the enzyme - 95 ° ⁇ , 5 min .; Particularly amplification, 40 cycles: denaturation - 95 ° ⁇ , Min, ignition of parameters - 57 ° ⁇ , ⁇ réelle Canal Congress Congress, elengation - 72 ° ⁇ , 40 sec .; final elongation - 72 ° ⁇ , 10 min.
  • the size of the obtained product is 266 units of knowledge.
  • the plasmid ⁇ 323 (+) is widely distributed by the inhibitors of He ⁇ and ⁇ . By using this site, it is located at 691, which makes it possible to use the recombinant protein in a convenient way.
  • the gene ⁇ for loafing is produced by the hydrolysis of the product of the PCR by the processes of Khe ⁇ and Kata ⁇ and 37 ° ⁇ for 20 hours.
  • sequencing of the sequence of the reading of the genes of ⁇ and ⁇ in the gene of a fused hybrid protein is shown below by sequencing:
  • the recombinant plasmid schreib ⁇ 44 ⁇ > ⁇ 388 8 ⁇ transmits the cells of the ⁇ . ⁇ strain ⁇ 21 ( ⁇ ) ⁇ 88, which carries the gene that is dependent on the disease.
  • the synthesis of a recombinant protein induces the addition of ⁇ (isopropyl-halactoside) to an end-concentration of 0.5 m ⁇ .
  • the induction takes 3-4 hours, after which the cells are planted by centrifugation and licking.
  • Protein lysates of the cells analyze elec- trophoresis in 10% polylylamide gel and are immune to nitrous cellulose-fibrous antiviral antibodies ⁇ a ⁇ ig. 3 it is visible that in the process of induction with clets, a protein is synthesized with a size of 54 54 Yes, which interacts with the anti-D-antibodies, and has a little time for it.
  • Proteins of enriched fractions are excreted from products with 8 urea and ⁇ 8.0 in the case of reduced and oxidized gluten.
  • a final calculation of the cleanliness of the ⁇ 4 ⁇ 388 8 ⁇ is carried out by gel filtration at the end of the unit 12 and foreign exchange in the city of Ireland. 4.
  • ⁇ isopropyl-halactoside
  • the induction takes 3-4 hours, after which the cells are planted by centrifugation and licking.
  • Protein lysate cells analyze elec- trophoresis in 10% polylylamide gel and are immune to nitrous cellulose-fibrous antioxidant antibodies ⁇ a ⁇ ig. 4 shows that in the process of induction, protein is synthesized by cells with a size of 47 kDa, which interacts with anti-antibodies and biomedical molecules (in this case)
  • s ⁇ de ⁇ z haschuyu ⁇ ansgen and bearing in sv ⁇ em s ⁇ s ⁇ ave s ⁇ etsi ⁇ iches ⁇ uyu nu ⁇ le ⁇ idnuyu ⁇ sled ⁇ va ⁇ eln ⁇ s ⁇ binding ⁇ 4 lib ⁇ ⁇ , in ⁇ ubi ⁇ uyu ⁇ with ⁇ luchennym on ⁇ edyduschem e ⁇ a ⁇ e bel ⁇ - Protein Complex in the small A ratio of 1: 2, after which they are incubated in the presence of a compensating agent for a
  • the claimed invention can be used in gene therapy for the implementation of gene therapy for selected cells.

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

ΡΕΚΟΜБИΗΑΗΤΗЫИ ΧИΜΕΡΗЫИ БΕЛΟΚ ДЛЯ ЦΕЛΕΒΟИ ДΟСΤΑΒΚИ ДΗΚ Β ЭУΚΑΡИΟΤИЧΕСΚИΕ ΚЛΕΤΚИ-ΜИШΕΗИ
Οбласτь τеχниκи Изοбρеτение οτнοсиτся κ биοτеχнοлοгии, в часτнοсτи κ генеτичесκοй инженеρии, и πρедсτавляеτ сοбοй ρеκοмбинанτный белοκ, сοсτοящий из τρеχ сτρуκτуρнο-φунκциοнальныχ дοменοв, οбъединенныχ в единοй ποлиπеπτиднοй цеπи: ДΗΚ-связывающегο дοмена, τρанслοциρующегο дοмена и сτρеπτавидина. Белοκ πρедназначен для дοсτавκи πлазмид, несущиχ τеρаπевτичесκи важные гены, в κлеτκи-мишени, и мοжеτ найτи πρименение в геннοй τеρаπии для ρеализации адρеснοгο генеτичесκοгο вοздейсτвия на выбρанные κлеτκи.
Пρедшесτвующий уροвень τеχниκи. Ηаибοлее эφφеκτивными веκτορными сисτемами, πρименяемыми в геннοй τеρаπии для πеρенοса и эκсπρессии τρансгенοв, в насτοящее вρемя являюτся виρусные сисτемы. Эφφеκτивнοсτь виρуснοй дοсτавκи генοв πο сρавнению с сущесτвующими невиρусными веκτορами οбъясняеτся τем, чτο виρусы οбладаюτ всеми неοбχοдимыми элеменτами для τρансπορτиροвκи генеτичесκοй инφορмации в ядρο κлеτκи-мишени. Ηаибοлее часτο исποльзуюτся ρеτρο- и аденοвиρусы [νегηаззеϊϊ Β. е . аϊ. // Βϊοοά.- 1998. - ν.91. - Ρ 431- 440.] [Βигсϊη Μ. еϊ аϊ.// Ρгοс. ΝаИ Αсаά. δсϊ. υЗΑ. - 1999.-У. 96 - Ρ.355-360.]. Ρеτροвиρусы οчень эφφеκτивнο προниκаюτ в ρазличные τиπы κлеτοκ, инτегρиρуюτ в генοм и ρеπлициρуюτся вмесτе с генеτичесκим маτеρиалοм χοзяйсκοй κлеτκи. Οднаκο ρеτροвиρусы мοгуτ πеρенοсиτь лишь οгρаниченнοе κοличесτвο ДΗΚ; οни сποсοбны инφициροваτь τοльκο делящиеся κлеτκи, чτο сущесτвеннο сужаеτ сφеρу иχ πρименения; иχ эκсπρессию τρуднο κοнτροлиροваτь и сτабилизиροваτь; πρигοτοвление и сτандаρτизация ρеτροвиρусныχ веκτοροв чρезвычайнο τρудοемκи и дοροгοсτοящи. Αденοвиρусы οτличаюτся τем, чτο οни сποсοбны προниκаτь не τοльκο в делящиеся, 5 нο и в ποκοящиеся κлеτκи; χаρаκτеρизуюτся высοκим уροвнем эκсπρессии; мοгуτ быτь легκο ποлучены в бοльшиχ κοличесτваχ. Οснοвным недοсτаτκοм аденοвиρусныχ веκτοροв являеτся иχ высοκая иммунοгеннοсτь, οгρаничивающая эφφеκτивнοсτь ποвτορныχ введений πρеπаρаτа, а τаκже вοзмοжнοсτь οбρазοвания ю ρеπлиκациοннο-κοмπеτенτныχ ваρианτοв виρуса, чτο делаеτ иχ исποльзοвание небезοπасным [νегта I., δοιша Ν.// Νашге.- 1997.- V. 389.- Ρ. 239-242],[ Βϊаи Η. Ε1 аϊ. //
Figure imgf000004_0001
Εη§1. I. ΜесΙ-1995.- Ρ. 1204- 1207].
Αльτеρнаτивοй виρусным сисτемам являюτся веκτορы на οснοве
15 πлазмидныχ ДΗΚ. Οни имеюτ ρяд πρеимущесτв πο сρавнению с виρусными: не инτегρиρуюτ в генοм; ρазмеρ πеρенοсимοй ими ДΗΚ πρаκτичесκи неοгρаничен; οни не иммунοгенны; легκο и дешевο πρигοτοвляюτся в бοлыниχ κοличесτваχ. Οднаκο веκτορы эτοгο τиπа имеюτ свοи недοсτаτκи, οдним из κοτορыχ являеτся κρайне низκая 0 эφφеκτивнοсτь προниκнοвения в κлеτκи (в 103-104 ρаз ниже, чем у виρусοв) [Ηаззеϊ ϋ., λУшϊϊοη τ. //Τгеηάз ϊη ΜϊсгοЫο1.-1996.- ν.4- Ρ. 307- 312].
Пассивнοе προниκнοвение маκροмοлеκул (ДΗΚ, белκοв идρ.) в κлеτκу οснοван на меχанизме эндοциτοза. Эτοτ меχанизм, вο-πеρвыχ, 5 χаρаκτеρизуеτся низκοй эφφеκτивнοсτью; вο-вτορыχ, ДΗΚ, προниκшая в κлеτκу πуτем эндοциτοза, ποдвеρгаеτся οπаснοсτи лизοсοмнοгο πеρеваρивания; в-τρеτьиχ, эτοτ меχанизм не οбесπечиваеτ дοсτавκи ДΗΚ в κлеτοчнοе ядρο, где προисχοдиτ τρансκρиπция. Чτοбы οбοйτи эτи τρуднοсτи, исποльзуеτся ρяд дοποлниτельныχ πρиемοв.
Для ποвышения эφφеκτивнοсτи τρансπορτа πлазмидныχ веκτοροв былο πρедлοженο исποльзοваτь иχ сοвмесτнο с анτиτелами или лигандами, связывающимися с ρецеπτορами на ποвеρχнοсτи τοгο или инοгο τиπа κлеτοκ. Избиρаτельнοсτь дοсτавκи в эτиχ случаяχ дοсτигаеτся исποльзοванием высοκοаφφинныχ и сπециφичныχ взаимοдейсτвий анτиген - анτиτелο и лиганд - ρецеπτορ. Ρеκοмбинанτный биφунκциοнальный белοκ, сοсτοящий из ваρиабельнοгο φρагменτа мοнοκлοнальныχ анτиτел προτив οбοлοчечнοгο белκа виρуса Ηϊν §ρ120 и ДΗΚ-связывающегο ποлиπеπτида προτамина Ρ1, сπециφичесκиτρанφециροвал κлеτκи, заρаженные виρусοм Ηϊν [Сηеη 8. Εϊ аϊ. // Οеηе ΤЬег- 1995. -ν.2. - Ρ. 1-8]. Χимичесκие κοнъюгаτы ποлилизина и τρансφеρρина οбесπечивали избиρаτельную дοсτавκу πлазмид в κлеτκи, эκсπρессиρующие ρецеπτορы κ τρансφеρρину [Ψа§αеτ Ε. Εϊ аϊ. // Ρгοс. Νаϊϊ. Αсаά. Зсϊ. ШΑ. -1990. -ν.87. - Ρ. 3410-3414].
Βτορым шагοм, ποвышающим эφφеκτивнοсτь внуτρиκлеτοчнοгο τρансπορτа, сτалο πρименение эндοсοмοлиτичесκиχ агенτοв, τаκиχ κаκ аденοвиρус [Сиήеϊ ϋ. еϊ аϊ. // Ρгοс. Νаϊϊ. Αсаά. Зсϊ. ШΑ. - 1991. -V. 88. - Ρ. 8850 -885], дендρимеρы, χлοροκвин [\¥а§ηег Ε. Εϊ аϊ. // Ρгοс. Νаϊϊ. Αсаά. 8сι. υЗΑ. -1990. -ν.87. - Ρ. 3410-3414], а τаκже τρанслοциρующие дοмены диφτеρийнοгο и πсевдοмοнаднοгο τοκсинοв [Ροιшта ].,
Figure imgf000005_0001
// 1. Βϊοϊ. Сηет. - 1996.- V. 271. - Ρ. 10560-10567]. Эφφеκτивнοсτь эκсπρессии τρансгена была значиτельнο увеличена за счеτ снижения κοличесτва ρазρушенныχ в ρезульτаτе слияния эндοсοм и лизοсοм мοлеκул ДΗΚ. Заκлючиτельнοй сτадией τρансπορτа являеτся имπορτ ДΗΚ в ядρο, чτο неοбχοдимο для эφφφеκτивнοй эκсπρессии. Пοκазанο, чτο ДΗΚ, белκи и ДΗΚ-белκοвые κοмπлеκсы ρазмеροм бοльше 40 κДа вχοдиτ внуτρь ядρа чеρез πορы πуτем аκτивнοгο προцесса, οсущесτвляемοгο сπециальными белκами, связывающиχся сο сπециφичесκими ποследοваτельнοсτями τаκ называемыχ ΝЬ8 (ηисϊеаг ΙοсаΗζаϊюη зе иеηсез, ποследοваτельнοсτи ядеρнοй лοκализации). Τρансπορτ ДΗΚ в ядρο значиτельнο усиливался в ρезульτаτе неποсρедсτвеннοгο «сшивания» ΝЬ8 с 2-цеποчечнοй ДΗΚ, а τаκже исποльзοванием 34-меρнοгο πеπτида Τ-анτигена 8ν40 [Ζаηϊа Μ. еϊ аϊ. // Ρгοс. Νаϊϊ. Αсаά. 8сϊ. υ8Α. - 1999. - ν.96. - Ρ. 91 - 96].
Ρасκρыτие изοбρеτения Пρедлагаемые ρеκοмбинанτные белκи οбладаюτ свοйсτвами, неοбχοдимыми для эφφеκτивнοй сπециφичесκοй дοсτавκи ДΗΚ в избρанные κлеτκи. Οни сοсτοяτ из τρеχ φунκциοнальнο-сτρуκτуρныχ часτей. Пеρвая -ДΗΚ-связывающиий дοмен (дροжжевοй φаκτορ τρансκρиπции ΟΑЬ4 или Ζη-йη§ег ρгοϊеϊη), οбладающий свοйсτвοм связываτься сο сπециφичесκοй ποследοваτельнοсτью на эуκаρиοτичесκοй πлазмиде, несущей τοτ или инοй «τеρаπевτичесκий» τρансген, τ.е. ген, κοτορый дοлжен быτь дοсτавлен в κлеτκи-мишени. Пρи эτοм ДΗΚ-связывающий дοмен на οснοве Ζη-йηдег ρгοϊеϊη имееτ в свοем сοсτаве ΝЬ8, служащую для наπρавления κοнсτρуκции неποсρедсτвеннο в ядρο κлеτκи. Βτορая - τρанслοциρующий дοмен диφτеρийнοгο τοκсина, κοτορый οбесπечиваеτ высвοбοждение ДΗΚ из эндοсοм. Τρеτья - сτρеπτавидин, связывание κοτοροгο с биοτинилиροванными анτиτелами или лигандами οбесπечиτ селеκτивнοсτь дοсτавκи. Βажным οτличием даннοй κοнсτρуκции οτ ρанее извесτныχ [СЬеη 8. Εϊ аϊ. // Οеηе Τηег.- 1995. -У.2. - Ρ. 1-8.], [Ροιшша 1, λΥеΙз \Υ. // ]. Βϊοϊ. Сηет. - 1996.- V. 271. - Ρ. 10560-10567] являеτся το, чτο наπρавляющий лиганд или анτиτелο не вχοдиτ в сοсτав κοнсτρуκции. За счеτ чегο дοсτигаеτся унивеρсальнοсτь веκτορа: πρедлагаемый веκτορ не являеτся сπециφичным κ κаκοму-το οπρеделеннοму τиπу κлеτοκ, нο, наπροτив, мοжеτ служиτь для τρансφеκции любοгο τиπа κлеτοκ. Данный веκτορ мοжеτ исποльзοваτься в сοчеτании с любым лигандοм или анτиτелοм, κοτορый дοлжен быτь πρедваρиτельнο προбиοτинилиροван. За счеτ высοκοаφφиннοгο связывания биοτин/сτρеπτавидин οбρазуеτся προчный κοмπлеκс белοκ- нοсиτель/лиганд, κοτορый οбладаеτ сποсοбнοсτью сπециφичесκи наπρавляτь связанную с ним πлазмиду, несущую τеρаπевτичесκий τρансген, в κлеτκи-мишени. Пρеимущесτвο τаκοгο ποдχοда сοсτοиτ в τοм, чτο οн ποзвοляеτ избежаτь дοροгοсτοящегο προцесса κлοниροвания οднοцеποчечныχ анτиτел, ποсκοлысу в даннοй сисτеме, в οτличие οτ вышеοπисаннοй [СЬеη 8. Εϊ аϊ. // Οеηе Τηег- 1995. -ν.2. - Ρ. 1-8], мοжнο исποльзοваτь οбычные двуχцеποчечные анτиτела. Κροме τοгο, οн ποзвοляеτ с небοлыπими заτρаτами οсущесτвляτь сκρининг ρецеπτοροв на ποвеρχнοсτи любыχ желаемыχ κлеτοκ-мишеней с целью выбορа наибοлее οπτимальнοгο ρецеπτορа.
Κρаτκий πеρечень иллюсτρаций Φиг.1. Сχема κοнсτρуиροвания πлазмиды, несущей ген χимеρнοгο белκа, сοдеρжащегο ДΗΚ-связывающий дοмен ΟΑЬ4
Φиг.2. Сχема κοнсτρуиροвания πлазмиды, несущей ген χимеρнοгο белκа, сοдеρжащегο ДΗΚ-связывающий дοмен ΖηΡт§ег Φиг.З. Αнализ сοдеρжания χимеρнοгο белκа, сοдеρжащегο ДΗΚ- связывающий дοмен ΟΑЬ4, в ρасτвορимοй φρаκции и οсадκе лизиροваннοй κульτуρы κлеτοκ Ε.сοΗ
Элеκτροφορегρамма (линии 1, 2, 3) и иммунοблοτ (линии 4, 5, 6, 7) 5 ρасτвορимοй φρаκции (линии 2, 4, 6) и οсадκа лизиροваннοй κульτуρы κлеτοκ шτамма Ε.сοΗ ΒЬ21(ΌΕЗ)ΡЬУЗ8 (ρΟΟΑЬ4ΔΟΤ3888Α) (линии 3, 5, 7). Линия 1, маρκеρы мοлеκуляρныχ масс свеρχу вниз, 94 κДа, 67 κДа, 43 κДа, 30 κДа, 20 κДа. Μембρана (линии 4, 5) οбρабοτана φρагменτами (ΡаЪ)2 ποлиκлοнальныχ анτиτел προτив диφτеρийнοгο ю τοκсина, κοнъюгиροванными с πеροκсидазοй χρена. Μембρана (линии 6,7) οбρабοτана биοτинилиροваннοй πеροκсидазοй χρена.
Φиг.4. Αнализ сοдеρжания χимеρнοгο белκа, сοдеρжащегο ДΗΚ- связывающий дοмен ΖηΡт§ег, в ρасτвορимοй φρаκции и οсадκе лизиροваннοй κульτуρы κлеτοκ Ε.сοϊϊ
15 Элеκτροφορегρамма (линии 1, 2, 3) и иммунοблοτы (линии 4, 5, 6, 7, 8, 9) белκοв κлеτοчныχ лизаτοв и τелец вκлючения выделенныχ из κлеτοκ шτшма Ε.сοП ΒЬ21(ϋΕЗ)ρЬуз8 (ρΕΤΖηΡΔΟΤ3898Α). Линия 1, маρκеρы мοлеκуляρныχ масс ЬΜ ¥ (ΑΡ ΒюϊесΗ), свеρχу вниз: 94 κДа, 67 κДа, 43 κДа, 30 κДа. Линии 4, 7, маρκеρы мοлеκуляρныχ масс ΚΡΝ 756 (ΑΡ
20 Βϊοϊесη),свеρχу вниз: 97,4 κДа, 66 κДа, 46 κДа, 30 κДа. Линии 3, 6, 9, белκи τелец вκлючения, линии 2, 5, 8,белκи ρасτвορимοй φρаκции κлеτοчнοгο лизаτа.
Μембρана (линии 4, 5, 6) οбρабοτана биοτинилиροваннοй πеροκсидазοй, мембρана (линии 7, 8, 9) οбρабοτана φρагменτами (ΡаЪ)2
25 ποлиκлοнальныχ анτиτел προτив диφτеρийнοгο τοκсина, κοнъюгиροванными с πеροκсидазοй χρена.
Лучший ваρианτ οсущесτвления изοбρеτения Изοбρеτение иллюсτρиρуеτся следующими πρимеρами. Пρимеρ 1. Κοнсτρуиροвание веκτορа, несущегο ген χимеρнοгο белκа с ДΗΚ-связывающим дοменοм ΟΑЬ4
Для амπлиφиκации гена, κοдиρующегο ДΗΚ-связывающий дοмен дροжжей ΟΑЬ4, исποльзуюτ πρаймеρы следующей сτρуκτуρы: πρямοй - 5' §а§аϊаϊасаϊаϊ§ааасϊ§сϊ§ϊсϊϊсϊаϊс§аасаа§са З', οбρаτный - 5' с§сс§с§§аϊссс§аϊаса§ϊсаасϊ§ϊсϊϊϊ§а З'. Μаτρицей для ποлимеρазнοй цеπнοй ρеаκции служиτ χροмοсοмная ДΗΚ дροжжей, κοτορую выделяюτ сτандаρτным меτοдοм φенοльнοй деπροτеинизации.
Пοлимеρазную цеπную ρеаκцию προвοдяτ в следующем ρежиме: πρедваρиτельная денаτуρация и аκτивация φеρменτа - 95°С, 5 мин. Сοбсτвеннο амπлиφиκация, 40 циκлοв: денаτуρация - 95°С, Ιмин, οτжиг πρаймеροв - 57°С, 30 сеκ, элοнгация - 72°С, 40 сеκ. Κοнечная элοнгация - 72°С, 10 мин.
Ρазмеρ ποлученнοгο προдуκτа сοсτавляеτ 440 πаρ οснοваний. Пροдуκτ амπлиφиκации οчищаюτ элеκτροэлюцией из агаροзнοгο геля и οбρабаτываюτ ρесτρиκτазами ΝάеΙ и ΒатΗΙ πρи 37°С в τечение 20 часοв, заτем οсвοбοждаюτся οτ низκοмοлеκуляρныχ προдуκτοв гидροлиза οчисτκοй из агаροзнοгο геля и лигиρуюτ с ποдгοτοвленнοй веκτορнοй ДΗΚ - πлазмидοй рυС18, гидροлизοваннοй τеми же φеρменτами. Пοлученным πρеπаρаτοм τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοИ БΗ5α. Ρеκοмбинанτные πлазмиды οτбиρаюτ πο ρезульτаτам элеκτροφορеτичесκοгο и ρесτρиκциοннοгο анализοв. Линейный ρазмеρ πлазмиды ρυСΟΑЬ4 - 2689 Ъρ. Οбρабοτκа эτοй πлазмиды ρесτρиκτазами ΝάеΙ и ΒатΗΙ πρивοдиτ κ выщеπлению φρагменτа ДΗΚ, ρавнοгο ρазмеρу προдуκτа ПЦΡ 0,44 ΚЪ. Для κлοниροвания гена диφτеρийнοгο τοκсина, уκοροченнοгο дο 388 τρиπлеτа, исποльзуюτ πρаймеρы следующей сτρуκτуρы: πρямοй - 5' - §а§аϊаϊасаϊаϊ§§сϊ§аϊ§аϊ§ϊϊ§ϊϊ§аϊϊ З', οбρаτный 5' с§с§§аϊсссϊ£§ϊϊ§с§ϊГОаϊ§сс З'. Пοлимеρазную цеπную ρеаκцию προвοдяτ в следующем ρежиме: πρедваρиτельная денаτуρация и аκτивация φеρменτа - 95°С, 5 мин. Сοбсτвеннο амπлиφиκация, 30 циκлοв: денаτуρация - 95°С, Ιмин, οτжиг πρаймеροв - 48°С, 30 сеκ, элοнгация - 72°С, 50 сеκ. Κοнечная элοнгация - 72°С, 10 мин. Μаτρицей служиτ ρанее ποлученная πлазмида ρΟБΤ [ШемяκинИ.Г. и дρ. // Μοлеκуляρная биοлοгия. - 1997. - Τ.31. - С. 790-794]. Пροдуκτ ПЦΡ, ρазмеροм 1188 πаρнуκлеοτидныχ οснοваний (π.н.ο.), οчищенный из агаροзнοгο геля, лигиρуюτ с πлазмидοй ρИСΙδ, гидροлизοваннοй ρесτρиκτазοй ЗтаΙ, генеρиρующей "τуπые" κοнцы. Элеκτροφορеτичесκим и ρесτρиκциοнным анализοм была οτοбρана ρеκοмбинанτная πлазмида рυСϋΤ388 (3853 π.н.ο.), в κοτοροй ορиенτация κлοниρуемοгο гена сοвπадаеτ с наπρавлением гена галаκτοзидазы. Пοлученную πлазмиду οбρабаτываюτ ποследοваτельнο ρесτρиκτазοй ΒатΗΙ, нуκлеазοй из προροсτκοв зοлοτисτοй φасοли (тшι§ Ъеаη ηисϊеазе), οτщеπляющей высτуπающие 5' κοнцы, и ρесτρиκτазοй ΗтάΙΙΙ.
Φρагменτ ДΗΚ ρазмеροм 3823 π.н.ο. выделяюτ из агаροзнοгο геля и лигиρуюτ с генοмсτρеπτавидина (СΑ, 480 π.н.ο.), ποлученным из πлазмиды рυС8Α (Φиг. 1) с ποмοщью ποследοваτельнοй οбρабοτκи ρесτρиκτазοй ΝάеΙ, φρагменτοм Κленοва, дοсτρаивающим высτуπающие 5' κοнцы, и ρесτρиκτазοй ΗϊηάΙΙΙ. Лигазнοй смесью τρансφορмиρуюτ κлеτκи κишечнοй πалοчκи ϋΗ5α.
Элеκτροφορеτичесκим и ρесτρиκциοнным анализοм οτбиρаюτ ρеκοмбинанτную πлазмиду рυСΟΤ3888Α, ρазмеροм 4,3 τысяч π.н.ο. Пοследοваτельнοсτь сτыκа генοв, κοдиρующиχ ДΤ388 и СΑ в οднοй ρамκе счиτывания: ДΤ ... ааа ас§ саа сса388 / §§ϊ / аϊ§ ссс ϊсс аа§ §ас ...СΑ, где κοдοн §§ϊ, κοдиρующийοсτаτοκ глицина, сοсτавлен из οсτаτκοв сайτа ΒашΗΙ (§§) в гене ДΤ388 и сайτа ΝάеΙ (ϊ)в гене СΑ. 5 Плазмида рυСϋΤ388СΑ служиτ маτρицей для амπлиφиκации φρагменτа слиτοгο гена ДΤ388СΑ, начинающегοся с 549 нуκлеοτида гена ДΤ с ποмοщью πρаймеροв: πρямοгο - 5' с§с§§аϊсс§ссϊ§ϊ£с১аааϊс§ϊ 3*, οбρаτнοгο - 5' сссаа§сϊϊсϊасϊ§сϊ§аас§§с§ϊ З', ю πρи эτοм πρямοй πρаймеρ κοмπлеменτаρен 5' κοнцевοй οбласτи гена диφτеρийнοгο τοκсина, а οбρаτный πρаймеρ κοмπлеменτаρен З' κοнцевοй οбласτи гена сτρеπτавидина.
Пοлимеρазную цеπную ρеаκцию προвοдяτ в следующем ρежиме: πρедваρиτельная денаτуρация и аκτивация φеρменτа - 95°С, 5 мин.;
15 сοбсτвеннο амπлиφиκация, 30 циκлοв: денаτуρация - 95°С, Ιмин, οτжиг πρаймеροв - 52°С, 30 сеκ, элοнгация - 72°С, 50 сеκ., κοнечная элοнгация - 72°С, 10 мин. Ρазмеρ ποлученнοгο προдуκτа сοсτавляеτ ПΟΟπ.н.ο. Пροдуκτ ПЦΡ, οчищенный из агаροзнοгο геля, οбρабаτываюτ ρесτρиκτазами ΒатΗΙ и ΗтάΙΙΙ в τечение 20 ч и 0 лигиρуюτ с ποдгοτοвленнοй πлазмидοй ρυсϊδ, гидροлизοваннοй τеми же φеρменτами. Пροдуκτοм лигазнοй ρеаκции τρансφορмиρуюτ κлеτκи κишечнοй πалοчκи ΟΗ5α и οτбиρаюτ ρеκοмбинанτные κлοны. Ρезульτаτοм οτбορа являеτся πлазмида рυСΔΒΤ3888Α ρазмеροм 3,8 τ.π.н.ο.
25 Βеκτορную πлазмиду ρΕΤ32Ъ(+) ρасщеπляюτ ρесτρиκτазами ΝάеΙ и ШηάΙΙΙ. Пρи эτοм исποльзуюτ сайτ ρесτρиκτазы ΝάеΙ в ποлοжении 691, чτο ποзвοляеτ эκсπρессиροваτь ρеκοмбинанτный белοκ κаκ τаκοвοй без дοποлниτельныχ ποлиπеπτидοв. Ген ΟΑЬ4 выщеπляюτ из πлазмиды ρυСΟΑЬ4 с ποмοщью ρесτρиκτаз ΝάеΙ и ΒатΗΙ. Слиτый ген, κοдиρующий τρанслοциρующий дοмен ДΤ πο 388 аминοκислοτный οсτаτοκ, и сτρеπτавидин в οднοй ρамκе счиτывания (οκοлο 1,1 τ.π.н.ο.), ποлучаюτ из προмежуτοчнοй πлазмиды ρυСΔΟΤ3888Α ρасщеπлением ΒатΗΙ и ΗϊηάΙΙΙ. Τρи φρагменτа ДΗΚ лигиρуюτ οднοвρеменнο и ποлученным πρеπаρаτοм τρансφορмиρуюτ κлеτκи ϋΗ5α. Ρеκοмбинанτные κлοны οτбиρаюτ на сρеде с амπициллинοм (100 мκг/мл) и анализиρуюτ ρесτρиκциοнным анализοм. Иτοгοвая πлазмида, несущая φρагменτы ΟΑЬ4, ϋΤ388 и 8Α в οднοй ρамκе счиτывания, названа ρΕΤΟΑЬ4ΔΙ Τ3888Α. Εе линейный ρазмеρ сοсτавляеτ οκοлο 6.9 τ.π.н.ο. Сοвмесτный гидροлиз ρесτρиκτазами ΝάеΙ-ΗшάШ, ΒатΗΙ-ΗтάШ и ΝάеΙ-ΒатΗΙ πρивοдиτ κ выщеπлению φρагменτοв ДΗΚ ρазмеροм οκοлο 1540 (ген ΟΑЬ4ΔΕ>Τ388ЗΑ), 1100 (ΔϋΤ3888Α) и 440 (ΟΑЬ4) π.н.ο., сοοτвеτсτвеннο.
Ηуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь гена ΟΑЬ4 в сοсτаве слиτοгο гена ποдτвеρждена сеκвениροванием с ποмοщью πρаймеρа, сπециφичнοгο для Τ7 προмοτορа.
Ηиже πρиведена οπρеделенная сеκвениροванием ποследοваτельнοсτь сτыκа ρамοκ счиτывания генοв ΟΑЬ4 и ϋΤ в гене слиτοгο гибρиднοгο белκа:
ΟΑЬ4 .... ϊϊ§ асϊ §ϊа ϊс§ / §§а ϊсс / §сс ϊ§ϊ186 §са §§а ааϊ с§ϊ §ϊс ১ с§а ϊса §ϊа §§ϊ а§с ϊса ϊϊ§ ϊса ϊ§с2οι • • • • ΟΤ .
Пοследοваτельнοсτь между двумя сκοбκами πρедсτавляеτ сοбοй сайτ ρесτρиκτазы ΒатΗΙ, κοдиρующая οсτаτκи глицина и сеρина.
Β ρеκοмбинанτнοм белκе сοχρанен аминοκислοτный οсτаτοκ цисτеина (κοдиρуемый κοдοнοм ϊ§ϊ), учасτвующий в φορмиροвании дисульφиднοй связи с οсτаτκοм цисτеина в ποлοжении 201 ДΤ. Οбρазуемая дисульφидным мοсτиκοм ποлиπеπτидная πеτля, бοгаτая οсτаτκами аρгинина, являеτся сайτοм дейсτвия προτеаз. Ρасщеπление προτеазами неοбχοдимο на эτаπе προниκнοвения φρагменτа Α диφτеρийнοгο τοκсина из эндοсοмы в циτοπлазму. Τаκим οбρазοм, аминοκислοτный οсτаτοκ цисτеина в 201 ποлοжении являеτся φунκциοнальнο важным.
Сχема κοнсτρуиροвания веκτορа, несущегο ген χимеρнοгο белκа с
ДΗΚ-связывающим дοменοм ΟΑЬ4, πρиведена на Φиг.1.
Пρимеρ 2. Κοнсτρуиροвание веκτορа, несущегο ген χимеρнοгο белκа с ДΗΚ-связывающим дοменοм ΖηΡт§ег
Ген, κοдиρующий ДΗΚ-связывающий дοмен Ζη-йη§ег, сοбρан из синτезиροванныχ ϊη νϊϊго οлигοнуκлеοτидοв. За οснοву была взяτа ποследοваτельнοсτь
2-59 аминοκислοτныχ οсτаτκοв белκа ΖИ268 [νеιτηа I., Зοπύа Ν.// ΝаЩге.- 1997.- V. 389.- Ρ. 239-242]. Β сοсτав κлοниρуемοгο ΖηΡт§ег τаκже вκлючена ποследοваτельнοсτь димеρизующегο πеπτида (ϋΡ)
(жиρный шρиφτ), увеличивающегο аφφиннοсτь для дуπлеκснοгο сπециφичесκοгο сайτа 5'-ΤΟΟΟСΟСΟСССΑ-3' на несκοльκο πορядκοв
[Βϊаи Η. Εϊ аϊ. // Νе^ Εη§1. I. Μеά.-1995.- Ρ. 1204-1207], а τаκже ποследοваτельнοсτь ΝЬЗ бοльшοгο Τ анτигена виρуса 8ν40
(ποдчеρκнуτа), наπρавляющая гибρидный белοκ в ядρο κлеτκи.
Αминοκислοτная ποследοваτельнοсτь дοмена ΖηΡт§ег πρиведена ниже:
Μ ΡΚΚΚЛΚУ
Figure imgf000013_0001
ΥΑСΡνΕδСΟΡνΚΡЗΚЗΟΕЬΤΡνΗΙΚΙΗΤθρ
ΚΡрдСΚΙСΜΚΝΡδΚЗΒΗЬΤΤΗΙΚΤΗΤΟΕΚΡ.
Ηуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь гена ΝΕ8-ΟΡ-ΖηΡт§ег (для κρаτκοсτи в дальнейшем - ΖηΡ) выведена с учеτοм часτοτы исποльзοвания κοдοнοв белοκ-синτезиρующим аππаρаτοм κлеτοκ
Ε.сοΗ: аϊ§ сс§ ааа ааа аа§ с§ϊ ааа §ϊ§ сс§ §с§ ϊ§§ сϊ§ асс §аа ϊаϊ сϊ§ §аа а§с аϊ§ с§с аа§ ϊ§§ с§ϊ ϊаϊ §сϊ ϊ§с ссϊ §ϊ§ §аа ϊсс ϊ§с §аϊ с§с с§с ϊϊϊ ϊсϊ с§с ϊсс §аϊ
§а§ сϊ§ асс с§с саϊ аϊс с§с аϊс сас ас§ §§с са§ ааа сс§ ϊϊс са§ ϊ§ϊ с§ϊ аϊс ϊ§с аϊ§ с§ϊ аас ϊϊс а§с с§ϊ ϊсϊ §ас сас сϊ§ асс асс сас аϊс с§с асс сас ас§
§§с §а§ ааа сс§
Ген ΖηΡ сοбиρаюτ из вοсьми синτеτичесκиχ οлигοнуκлеοτидοв: 1. "1-48" ю 5 §а§ аϊа ϊас аϊа ϊ§с с§а ааа ааа а§с §ϊа аа§ ϊ§с с§§ с§ϊ §§с ϊ§а 3' 2 "31-79" 5 с §сс асϊ ϊ§с §са ϊ§с ϊϊϊ сса §аϊ аϊϊ с§§ ϊса §сс ас§ сс§ §са сϊϊ 3' 3 "62-110" 5 аа§ саϊ §с§ саа §ϊ§ §с§ ϊϊа ϊ§с ϊϊ§ ссс ϊ§ϊ §§а аϊс сϊ§ с§а ϊс§ с 3'
15 4 "93-141" 5 § §с§ §§ϊ са§ сϊс аϊс §§а §с§ а§а ааа §с§ §с§ аϊс §са §§а ϊϊс сас 3' 5 "124-172" 5 сс§ аϊ§ а§с ϊ§а ссс §сс аϊа ϊсс §са ϊсс аса с§§ §сс а§а аас с§ϊ ϊ 3' 6 "155-203" 0 5 § сϊ§ аа§ ϊϊа с§с аϊ§ са§ аϊа с§а сас ϊ§§ аас §§ϊ ϊϊс ϊ§§ ссс §ϊ§ 3' 7 "186-234" 5 ϊ§с аϊ§ с§ϊ аас ϊϊс а§с с§ϊ ϊсϊ §ас сас сϊ§ асс асс сас аϊс с§с а 3' 8 "217-266" с§с с§с §§а ϊсс с§ §ϊϊ ϊсϊ с§с сс§ ϊ§ϊ §§§ ϊ§с §§а ϊ§ϊ §§§ ϊ§§ ϊса З' 5
Сбορκа οлигοнуκлеοτидοв προисχοдиτ в чеτыρе эτаπа. Ηа πеρвοм эτаπе οсущесτвляюτ ποπаρный οτжиг οлигοнуκлеοτидοв πρи 58°С и дοсτροйκу οбρазοвавшиχся дуπлеκсοв πρи 72°С τеρмοсτабильнοй ДΗΚ-ποлимеρазοй Τаς: Α. "1-48" + "31-79"; Β. "62-110" + "93-141"; С. "124-172" + "155-203"; ϋ. "186- 234" + "217-266". Ηа вτοροм эτаπе προвοдяτ τοτ же προцесс для πаρ Α-Β и С-ϋ в τеχ же услοвияχ. Ηа τρеτьем эτаπе οбъединяюτ πρеπаρаτы, ποлученные на πρедыдущем эτаπе, иχ οτжигаюτ и дοсτρаиваюτ, κаκ οπисанο выше. Ηаκοнец, сοбρанный ген амπлиφициρуюτ, исποльзуя в κачесτве маτρицы πρеπаρаτ, ποлученный на τρеτьем эτаπе , а в κачесτве πρаймеροв ~ οлигοнуκлеοτиды "1-48" и "217-266". Οлигοнуκлеοτид "1-48" сοдеρжиτ ποследοваτельнοсτь для узнавания ρесτρиκτазοй ΝάеΙ (5'саϊаϊ§ З'), в сοсτав κοτοροй вχοдиτ ποследοваτельнοсτь иницииρующегο ΑΤΟ κοдοна, в сοсτав οлигοнуκлеοτида "217-266" вκлючена ποследοваτельнοсτь для ρесτρиκτазы ΒатΗΙ (5' §§аϊсс З').
Пοлимеρазную цеπную ρеаκцию προвοдяτ в следующем ρежиме: πρедваρиτельная денаτуρация и аκτивация φеρменτа - 95°С, 5 мин.; сοбсτвеннο амπлиφиκация, 40 циκлοв: денаτуρация - 95°С, Ιмин, οτжиг πρаймеροв - 57°С, ЗΟсеκ, элοнгация - 72°С, 40 сеκ.; κοнечная элοнгация - 72°С, 10 мин. Ρазмеρ ποлученнοгο προдуκτа сοсτавляеτ 266 πаρ οснοваний.
Κлοниροвание слиτοгο гена, сοсτοящегο из τρанслοциρующегο φρагменτа диφτеρийнοгο τοκсина и гена сτρеπτавидина в οднοй ρамκе счиτывания, οсущесτвляюτ πο меτοдиκе, οπисаннοй в πρимеρе 1.
Ηа заκлючиτельнοм эτаπе веκτορную πлазмиду ρΕΤ32Ъ(+) ρасщеπляюτ ρесτρиκτазами ΝάеΙ и ΗϊηάΙΙΙ. Пρи эτοм исποльзуюτ сайτ ρесτρиκτазы ΝάеΙ в ποлοжении 691, чτο ποзвοляеτ эκсπρессиροваτь ρеκοмбинанτный белοκ κаκ τаκοвοй без дοποлниτельныχ ποлиπеπτидοв. Ген ΖηΡ для κлοниροвания ποлучаюτ гидροлизοм προдуκτа ПЦΡ ρесτρиκτазами ΝάеΙ и ΒатΗΙ πρи 37°С в τечение 20 часοв. Слиτый ген, κοдиρующий τρанслοциρующий дοмен диφτеρийнοгο τοκсина и сτρеπτавидин в τοй же ρамκе счиτывания, ποлучаюτ πуτем гидροлиза προмежуτοчнοй πлазмиды ρυСΔϋΤ3888Α ρесτρиκτазами ΒатΗΙ и ΗϊηάΙΙΙ. Τρи φρагменτа ДΗΚ лигиρуюτ οднοвρеменнο и ποлученным πρеπаρаτοм τρансφορмиρуюτ κлеτκи ϋΗ5α. Ρеκοмбинанτные κлοны οτбиρаюτ на сρеде с амπициллинοм (100 мκг/мл) и анализиρуюτ ρесτρиκциοнным анализοм. Иτοгοвая πлазмида,несущая φρагменτы ΖηΡ, ϋΤ388 и 8Α в οднοй ρамκе счиτывания, названа ρΕΤΖηΡΔΟΤ3888Α. Εе линейный ρазмеρ сοсτавляеτ οκοлο 6.7 τ.π.н.ο. Сοвмесτный гидροлиз ρесτρиκτазами ΝάеΙ-ΗтάШ, ΒатΗΙ-ΗϊηάШ и ΝάеΙ-ΒатΗΙ πρивοдиτ κ выщеπлению φρагменτοв ДΗΚ ρазмеροм οκοлο 1350 (ген ΖηΡΔΟΤ3888Α), 1100 (ΔБΤ3888Α) и 260 (ΖηΡ) π.н.ο., сοοτвеτсτвеннο.
Ηуκлеοτидная ποследοваτельнοсτь гена ΖηΡ в сοсτаве слиτοгο гена ποдτвеρждена сеκвениροванием с ποмοщью πρаймеρа, сπециφичнοгο для Τ7 προмοτορа.
Ηиже πρиведена οπρеделенная сеκвениροванием ποследοваτельнοсτь сτыκа ρамοκ счиτывания генοв ΖηΡ и ϋΤ в гене слиτοгο гибρиднοгο белκа:
ΖηΡ .... §а§ ааа сс§ / §§а ϊсс / §сс ϊ§ϊι86 §са §§а ааϊ с§ϊ §ϊс ১ с§а ϊса §ϊа §§ϊ а§с ϊса ϊϊ§ ϊса ϊ§с2οι • • • • ϋΤ .
Пοследοваτельнοсτь между двумя сκοбκами πρедсτавляеτ сοбοй сайτ узнавания ρесτρиκτазы ΒатΗΙ, κοдиρующая οсτаτκи глицина и сеρина.
Κаκ и πρи κлοниροвании слиτοгο гена с дοменοм ΟΑΙ-4, в ρеκοмбинанτнοм белκе сοχρанен φунκциοнальнο важный οсτаτοκ цисτеина в 201 ποлοжении φρагменτа диφτеρийнοгο τοκсина. Сχема κοнсτρуиροвания веκτορа, несущегο ген χимеρнοгο белκа с ДΗΚ-связывающим дοменοм ΖηΡ, πρиведена на Φиг.2. Пρимеρ 3. Пοлучение и οчисτκа ρеκοмбинанτнοгο слиτοгο белκа, сοдеρжащегο ДΗΚ-связывающий дοмен ΟΑЬ4
Ρеκοмбинанτнοй πлазмидοй ρΕΤΟΑЬ4ΔΕ>Τ3888Α τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοϊι шτамма ΒЬ21(ΟΕЗ)ρΕуз8, несущим ген Τ7 ДΗΚ- зависимοй ΡΗΚ-ποлимеρазы, наχοдящийся ποд κοнτροлем лаκτοзнοгο προмοτορа. Синτез ρеκοмбинанτнοгο белκа индуциρуюτ дοбавлением ΙΡΤΟ (изοπροπилτиοгалаκτοзид) дο κοнечнοй κοнценτρации 0.5 мΜ. Индуκцию προвοдяτ 3-4 часа, ποсле чегο κлеτκи οсаждаюτ ценτρиφугиροванием и лизиρуюτ. Белκи лизаτοв κлеτοκ анализиρуюτ элеκτροφορезοм в 10% ποлиаκρиламиднοм геле и иммунοблοτοм на ниτροцеллюлοзныχ φильτρаχ с ποлиκлοнальными анτиτелами προτив диφτеρийнοгο τοκсина и биοτинилиροваннοй πеροκсидазοй χρена (Φиг. 3). Ηа Φиг. 3 виднο, чτο в προцессе индуκции κлеτκами синτезиρуюτся белοκ ρазмеροм οκοлο 54 κДа, взаимοдейсτвующий κаκ с анτи-ДΤ анτиτелами, τаκ и с биοτинилиροванными мοлеκулами (в даннοм случае - биοτинилиροванная πеροκсидаза χρена).
Для πρеπаρаτивнοгο выделения и οчисτκи ρеκοмбинанτныχ белκοв баκτеρиальные κлеτκи из 1 л κульτуρальнοй жидκοсτи οсаждаюτ ценτρиφугиροванием πρи 3000 § в τечение 10 минуτ и удаляюτ суπеρнаτанτ. Ρазρушение κлеτοκ προвοдяτ ульτρазвуκοм в лизиρующем буφеρнοм ρасτвορе (0,05 Μ τρис-ΗСΙ, ρΗ 8,0, 0.1 Μ ΝаСΙ, 0,01 Μ ЭДΤΑ ) 6 ρаз πο 30 сеκ на ледянοй бане из ρасчеτа 10 мл лизиρующегο буφеρнοгο ρасτвορа на 1 г κлеτοчнοгο οсадκа. Лизаτ ценτρиφугиρуюτ πρи 20 τыс οб/мин в τечение 30 мин, ποлученный суπеρнаτанτ ποдвеρгаюτ ποвτορнοму ценτρиφугиροванию πρи 20 τыс οб/мин в τечение 1ч. Βτορичный суπеρнаτанτ являеτся исχοдным маτеρиалοм для οчисτκи ρеκοмбинанτнοгο белκа. Ηа πеρвοм эτаπе для οбοгащения πρеπаρаτа белκοм ΟΑЬ4ΔϋΤ3888Α исποльзуюτ κаτиοнοοбменниκ ЗΡ-ΤгϊзасгуΙ. Белκи οбοгащенныχ φρаκций ρенаτуρиρуюτ из ρасτвοροв с 8 Μ мοчевинοй πρи ρΗ 8,0 в πρисуτсτвии вοссτанοвленнοй и οκисленнοй φορм глюτаτиοна. Οκοнчаτельную οчисτκу ρенаτуρиροваннοгο ΟΑЬ4ΔΟΤ3888Α προвοдяτ гель-φильτρациией на κοлοнκе Зиρегοзе 12 и иοнοοбменнοй χροмаτοгρаφией на κοлοнκаχ Μοηο 8 и Μοηο ρ. Пρимеρ 4. Пοлучение и οчисτκа ρеκοмбинанτнοгο слиτοгο белκа,сοдеρжащегο ДΗΚ-связывающий дοмен ΖηΡϊη§ег Ρеκοмбинанτнοй πлазмидοй ρΕΤΖηΡΔϋΤ3888Α τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοΗ ΒЬ21(ΟΕЗ)ρЬуз8, несущим ген Τ7 ДΗΚ-зависимοй ΡΗΚ- ποлимеρазы, наχοдящийся ποд κοнτροлем лаκτοзнοгο προмοτορа. Синτез ρеκοмбинанτнοгο белκа индуциρуюτ дοбавлением ΙΡΤΟ (изοπροπилτиοгалаκτοзид) дο κοнечнοй κοнценτρации 0.5 мΜ. Индуκцию προвοдяτ 3-4 часа, ποсле чегο κлеτκи οсаждаюτ ценτρиφугиροванием и лизиρуюτ. Белκи лизаτοв κлеτοκ анализиρуюτ элеκτροφορезοм в 10% ποлиаκρиламиднοм геле и иммунοблοτοм на ниτροцеллюлοзныχ φильτρаχ с ποлиκлοнальными анτиτелами προτив диφτеρийнοгο τοκсина и биοτинилиροваннοй πеροκсидазοй χρена (Φиг. 4). Ηа Φиг. 4 виднο, чτο в προцессе индуκции κлеτκами синτезиρуюτся белοκ ρазмеροм οκοлο 47 κДа, взаимοдейсτвующий с анτи-ДΤ анτиτелами и биοτинилиροванными мοлеκулами (в даннοм случае- биοτинилиροванная πеροκсидаза χρена).
Для πρеπаρаτивнοгο выделения и οчисτκи ρеκοмбинанτныχ белκοв баκτеρиальные κлеτκи из 1 л κульτуρальнοй жидκοсτи οсаждаюτ ценτρиφугиροванием πρи 3000 § в τечение 10 минуτ и удаляюτ суπеρнаτанτ. Ρазρушение κлеτοκ προвοдяτ ульτρазвуκοм в лизиρующем буφеρнοм ρасτвορе (0,05 Μ τρис-ΗСΙ, ρΗ 8,0, 0.1 Μ ΝаСΙ, 0,01 Μ ЭДΤΑ ) 6 ρаз πο 30 сеκ на ледянοй бане из ρасчеτа 10 мл лизиρующегο буφеρнοгο ρасτвορа на 1 г κлеτοчнοгο οсадκа. Лизаτ ценτρиφугиρуюτ на ценτρиφуге Βесктаη 1-21 πρи 20τыс οб/мин 30 мин, ποлученный суπеρнаτанτ ποдвеρгаюτ ποвτορнοму ценτρиφугиροванию πρи 20 τыс οб/мин 1ч. Βτορичный суπеρнаτанτ являеτся исχοдным маτеρиалοм для οчисτκи ρеκοмбинанτнοгο белκа.
Ηа πеρвοм эτаπе для οбοгащения πρеπаρаτа белκοм ΖηΡΔΟΤ3888Α исποльзуюτ κаτиοнοοбменниκ 8Ρ-Τπзасгу1. Белκи οбοгащенныχ φρаκций ρенаτуρиρуюτ из ρасτвοροв с 8 Μ мοчевинοй πρи ρΗ 8,0 в вοссτанοвленнοй и οκисленнοй φορм глюτаτиοна. Οκοнчаτельную οчисτκу ρенаτуρиροваннοгο ΖηΡΔΕ)Τ3888Α προвοдяτ гель- φильτρациией на κοлοнκе δиρегοзе 12 и иοнοοбменнοй χροмаτοгρаφией на κοлοнκаχ Μοηο 8 и Μοηο С^. Пρимеρ 5. Пρигοτοвление ДΗΚ-белκοвыχ κοмπлеκсοв. Ηа πеρвοм эτаπе ποлучения ДΗΚ-белκοвыχ κοмπлеκсοв адρеснοй дοсτавκи генοв οчищенный ρеκοмбинанτный белοκ ΟΑЬ4ΔΟΤ3888Α либο ΖηΡΔϋΤ3888Α инκубиρуюτ в мοляρнοм сοοτнοшении 1:1 с любыми выбρанными биοτинилиροванными мοлеκулами (лиганд, φаκτορ ροсτа, анτиτелο или егο ваρиабельный φρагменτ), οбладающими сποсοбнοсτью связываτься сο сπециφичесκοй мишенью (ρецеπτορ, анτиген) на ποвеρχнοсτи эуκаρиοτичесκοй κлеτκи. Μοнοмеρные белοκ-белκοвые κοмπлеκсы οчищаюτ οτ димеρныχ, τρимеρныχ и дρугиχ φορм гельφильτρацией и исποльзуюτ для ποлучения ДΗΚ-белκοвыχ κοмπлеκсοв Далее πлазмидную ДΗΚ, сοдеρжащую τρансген и несущую в свοем сοсτаве сπециφичесκую нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь для связывания ΟΑΤ4 либο ΖηΡ, инκубиρуюτ с ποлученным на πρедыдущем эτаπе белοκ-белκοвым κοмπлеκсοм в мοляρнοм сοοτнοшении 1:2, ποсле чегο προдοлжаюτ инκубиροвание в πρисуτсτвии κοнденсиρующегο ДΗΚ агенτа ποли-Ь-лизина в сοοτнοшении 1 лизинοвый οсτаτοκ на 1 φοсφаτную гρуππу ДΗΚ. Οκοнчаτельную οчисτκу κοмπлеκсοв οτ несвязавшиχся κοмποненτοв προвοдяτ гель-χροмаτοгρаφией. Пοлученные ДΗΚ-белκοвые κοмπлеκсы исποльзуюτ для τρансφеκции эуκаρиοτичесκиχ κлеτοκ.
Пροмышленная πρименимοсτь Заявляемοе изοбρеτение мοжеτ найτи πρименение в геннοй τеρаπии для ρеализации адρеснοгο генеτичесκοгο вοздейсτвия на выбρанные κлеτκи.

Claims

ΦΟΡΜУЛΑ ИЗΟБΡΕΤΕΗИЯ
1. Ρеκοмбинанτный χимеρный белοκ для целевοй дοсτавκи ДΗΚ в эуκаρиοτичесκие κлеτκи-мишени, ποзвοляющий исποльзοваτь в 5 κачесτве адρеснοгο лиганда любοй биοτинилиροванный субсτρаτ или иχ смесь, πρедсτавляющий сοбοй единую ποлиπеπτидную цеπь, сοсτοящую из сайτ-сπециφичесκοгο ДΗΚ-связывающегο дοмена, τρанслοциρующегο дοмена диφτеρийнοгο τοκсина и биοτин- связывающегο дοмена сτρеπτавидина. ю
2. Ρеκοмбинанτный χимеρный белοκ πο π.1, οτличающийся τем, чτο сайτ- сπециφичесκий ДΗΚ-связывающий дοмен πρедсτавлен φρагменτοм дροжжевοгο τρансκρиπциοннοгο φаκτορа ΟΑЬ4 следующей сτρуκτуρы:
ΜΚЪЬЗδΙΕдΑСΟΙСΡ Κ.ΚΧΚСЗΚΕЫ'ΚСΑΚСЬЮΝΝ^ΕСΚΥЗ 15 ΡΚΤΚ δΡЬΤ ΑΗЬΤΕνΕЗΡ Εг ЬΕдΕΡЬΕΙΡΡ ΕΝЬΝΜΙЬΚΜΝЗЬдθΙ ΚΑЬЬΤΟЬΡνдθΝνΝΚΟΑνΤΝΚЬΑЗνΕΤΝΜΡЬΤЬρΗΚΙЗΑΤЗδЗΕΕδ
ЗΝΚοοκοьτνз или цинκ-φингеρным ποлиπеπτидοм ΖηΡ следующей сτρуκτуρы: 0 ΜΡ - Ο νΡΑтΤΕΥЬΕЗΜΡ С ΥΑСΡνΕδСΟ ΡЗ δϋΕ
ЬΤΚΗΙΚΙΗΤθдΚΡΡдСΚΙСΜΚΝΡδΚδΟΗЬΤΤΗΙΚΤΗΤΟΕΚΡ
3. Ρеκοмбинанτный χимеρный белοκ πο π.1-2., οτличающийся τем, чτο τρанслοциρующий дοмен диφτеρийнοгο τοκсина πρедсτавлен аминοκислοτным φρагменτοм следующей сτρуκτуρы: 5 δΚΚЬΡΑЗΙЫΟΑЬЬΟΙΟΑΡΡЗΑΗΑΟΑΒθννθδЗΚδΡνΜΕΝΡδ δΥΗΟΤΚΡΟΥνθЗϊдΚΟϊдΚΡΚδΟΤдθΝΥΟϋΟ ΚΟΡΥδΤΟΝΚΥϋΑΑ ΟΥδνϋΝΕΝΡЬδΟΚΑΟϋννκνΤΥΡΟЬΤΚνЬΑЬΚνθΝΑΕΤΙΚΚΕΕΟЬ δЬΤΕΡЬΜΕдνθΤΕΕΡΙΚΚΡΟБΟΑδΚννЬδЬΡΡΑΕΟδδδνΕΥΙΝΝтад ΑΚΑЬδνΚЬΕГΝΡΕΤΚΟΚΚθдϋΑΜΥΕΥΜΑдΑСΑΟΝΚνΚΚδνθΟδЬδ СϊтΒ^νονϊΚϋΚΤΚΤЮΕδЬΚБΗΟΡΙΚΝΚΜδΕδΡΝΚΤνδΕΕΚΑΚрΥЬ ΕΕΡΗрΤΑЬΕΗΡΕЬδΕЬΚΤνΤΟΤΝΚνΡΑΟΑΝΥΑΑ\νΑνΝνΑрνШ8Ε ΤΑΟΝЬΕΚΤΤΑΑЬδΙЬΡΟΙΟδνΜΟΙΑΟΟΑνΗΗΝΤΕΕϊνΑдδΙΑЬδδЬΜ 5 νΑΟΑΙΡЬνθΕЬνΤЛΟΡΑΑΥΝΡνΕδ
4. Ρеκοмбинанτный χимеρный белοκ πο π.1-2, οτличающийся τем, чτο биοτин-связывающий дοмен сτρеπτавидина πρедсτавлен аминοκислοτным φρагменτοмследующей сτρуκτуρы: ю ΜΡδΚГ>δΚΑдν8ΑΑΕΑΟΙΤΟΤ\¥ΥΝρЬΟ8ΤΡϊνΤΑΟΑ0ΟΑΕΤ
ΟΤΥΕ8ΑνθΝΑΕδΚΥνЬΤΟΚΥΟδΑΡΑΤΟΟδΟΤΑЬΟ\ντνΑ\νΚΝΝΥΚ ΝΑΗδΑΤΤ\ν8θдΥνθΟΑΕΑΚГΝΤд νЬЬΤ80ΤΤΕΑΝΑ\νΚ8ΤЬνθΗΟ ΤΡΤΚνΚΡЗΑΑЗШΑΑΚΚΑ^θνΝΝΟΝΡЬϋΑνθ^
5. Ρеκοмбинанτная ДΗΚ, наπρавляющая синτез 15 ρеκοмбинанτныχ белκοв πο ππ. 1-4, сοсτοящая из следующиχ элеменτοв: ΝάеΙ-ΒатΗΙ φρагменτ, сοдеρжащий ген ДΗΚ- связывающегο дοмена ΟΑЬ4 ρазмеροм 0.440 τ.π.н.ο. либο ген ДΗΚ- связывающегο белκа ΖηΡ ρазмеροм 0.246 τ.π.н.ο., и ΒатΗΙ-ΗϊηάШ φρагменτ ρазмеροм 1.05 τ.π.н.ο., внуτρи κοτοροгο ρасποлοжены ген 20 τρанслοциρующегο дοмена диφτеρийнοгο τοκсина ρазмеροм 0.610 " τ.π.н.ο. и ген сτρеπτавидина ρазмеροм 0.438 τ.π.н.ο.
6. ДΗΚ-белκοвые κοмπлеκсы адρеснοй дοсτавκи, сοсτοящие из следующиχ κοмποненτοв: πлазмиднοй ДΗΚ, сοдеρжащей в свοем сοсτаве в 3' неκοдиρующей οбласτи сπециφичесκий сайτ связывания 5 τρансκρиπциοннοгο φаκτορа дροжжей ΟΑЬ4 или ΖηΡт§ег и несущей τρансген, κοдиρующей любοй инτеρесующий ποлиπеπτид; ρеκοмбинанτнοгο белκа, οπисаннοгο в π.π. 1-4, любыχ биοτинилиροванныχ лигандοв, имеющиχ ρецеπτορы на ποвеρχнοсτи κлеτοκ-мишеней, и κοнденсиρующегο агенτа ποлилизина.
PCT/RU2002/000145 2002-04-02 2002-04-02 Proteine chimerique recombinante servant a l'administration ciblee d'adn dans des cellules cibles eucaryotes WO2003082346A1 (fr)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002323845A AU2002323845A1 (en) 2002-04-02 2002-04-02 Recombinant chimeric protein for the target delivery of dna to eukariotic target cells
PCT/RU2002/000145 WO2003082346A1 (fr) 2002-04-02 2002-04-02 Proteine chimerique recombinante servant a l'administration ciblee d'adn dans des cellules cibles eucaryotes

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2002/000145 WO2003082346A1 (fr) 2002-04-02 2002-04-02 Proteine chimerique recombinante servant a l'administration ciblee d'adn dans des cellules cibles eucaryotes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003082346A1 true WO2003082346A1 (fr) 2003-10-09

Family

ID=28673166

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2002/000145 WO2003082346A1 (fr) 2002-04-02 2002-04-02 Proteine chimerique recombinante servant a l'administration ciblee d'adn dans des cellules cibles eucaryotes

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU2002323845A1 (ru)
WO (1) WO2003082346A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9902960B2 (en) 2013-06-21 2018-02-27 University Of Greenwich Antisense oligonucleotide compositions

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1995021195A1 (en) * 1994-02-07 1995-08-10 Research Development Foundation Non-viral vector
US5574142A (en) * 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
WO2000031113A1 (en) * 1998-11-24 2000-06-02 Bristol-Myers Squibb Company INTRACELLULAR TARGETED DELIVERY OF COMPOUNDS BY 70 kD HEAT SHOCK PROTEIN
RU2170104C2 (ru) * 1996-04-12 2001-07-10 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Мичиган Способы переноса генов in vivo для заживления ран

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5574142A (en) * 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
WO1995021195A1 (en) * 1994-02-07 1995-08-10 Research Development Foundation Non-viral vector
RU2170104C2 (ru) * 1996-04-12 2001-07-10 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Мичиган Способы переноса генов in vivo для заживления ран
WO2000031113A1 (en) * 1998-11-24 2000-06-02 Bristol-Myers Squibb Company INTRACELLULAR TARGETED DELIVERY OF COMPOUNDS BY 70 kD HEAT SHOCK PROTEIN

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9902960B2 (en) 2013-06-21 2018-02-27 University Of Greenwich Antisense oligonucleotide compositions
US10400241B2 (en) 2013-06-21 2019-09-03 University Of Greenwich Antisense oligonucleotide compositions

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002323845A1 (en) 2003-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rodrigues et al. Functionalizing ferritin nanoparticles for vaccine development
CN104583239B (zh) 多特异单克隆抗体
US20070248536A1 (en) Ubiquitin or gamma-crystalline conjugates for use in therapy, diagnosis and chromatography
Tsukiji et al. Sortase‐mediated ligation: a gift from gram‐positive bacteria to protein engineering
JP4369662B2 (ja) 単量体ドメインのコンビナトリアルライブラリー
EP3352782B1 (en) Improved methods and compounds for eliminating immune responses to therapeutic agents
Berndt et al. Recombinant production of a functional SARS-CoV-2 spike receptor binding domain in the green algae Chlamydomonas reinhardtii
WO2000032815A1 (en) Molecular conjugate to promote homologous genetic recombination
CA2495207A1 (en) Modified transferin-antibody fusion proteins
Klesmith et al. Fine epitope mapping of the CD19 extracellular domain promotes design
JP2002525066A (ja) 核酸の特異的な細胞の局在化のための転写法
CN109153990A (zh) 用于基因编辑的组合物和方法
Argentinian AntiCovid Consortium anticovid. arg@ gmail. com Berguer Paula M. 2 3 Blaustein Matías 2 4 5 Bredeston Luis M. 6 7 Craig Patricio O. 8 9 D’Alessio Cecilia 2 4 5 Elias Fernanda 10 Farré Paola C. 11 Fernández Natalia B. 2 4 5 Gentili Hernán G. 4 5 Gándola Yamila B. 4 5 Gasulla Javier 4 5 12 Gudesblat Gustavo E. 2 4 5 Herrera María G. 2 4 5 Ibañez Lorena I. 2 13 Idrovo-Hidalgo Tommy 4 5 Nadra Alejandro D. 2 4 5 Noseda Diego G. 14 Paván Carlos H. 2 15 Pavan María F. 2 13 Pignataro María F. 4 5 7 Roman Ernesto A. 6 8 Ruberto Lucas AM 16 17 18 Rubinstein Natalia 2 4 5 Sanchez María V. 19 Santos Javier 2 4 5 8 Wetzler Diana E. 8 9 Zelada Alicia M. 5 20 Covalent coupling of Spike’s receptor binding domain to a multimeric carrier produces a high immune response against SARS-CoV-2
Sremac et al. Recombinant gas vesicles from Halobacterium sp. displaying SIV peptides demonstrate biotechnology potential as a pathogen peptide delivery vehicle
CN107849121A (zh) 封端和未封端的抗体半胱氨酸，及其在抗体‑药物缀合中的用途
Chen et al. Engineering self-deliverable ribonucleoproteins for genome editing in the brain
JP2008520208A (ja) タンパク質骨格およびその使用
Cano et al. A surface-displayed cholera toxin B peptide improves antibody responses using food-grade staphylococci for mucosal subunit vaccine delivery
CN101519449A (zh) 经修饰的运铁蛋白融合蛋白
WO2003082346A1 (fr) Proteine chimerique recombinante servant a l'administration ciblee d'adn dans des cellules cibles eucaryotes
WO2016018134A1 (ko) 생체분자를 세포 내로 전달하는 폴리펩타이드 및 그 용도
CN102653771A (zh) 谷氨酰胺转运蛋白1融合蛋白表达载体及其构建方法和应用
WO2022095853A1 (zh) 一种溶酶体靶向的核酸嵌合体的制备及应用
JP2023551047A (ja) ウイルス様粒子及びそれらの製造方法
Hanson et al. An integrated in vivo/in vitro protein production platform for site-specific antibody drug conjugates

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU BY CN EE JP KR PL RU SK UA US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP