WO2003080848A1 - Billes biologiques comportant une substance genetique etrangere immobilisee sur de l'alginate de calcium - Google Patents

Billes biologiques comportant une substance genetique etrangere immobilisee sur de l'alginate de calcium Download PDF

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WO2003080848A1
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biobeads
sodium alginate
cells
viscosity
active substance
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PCT/JP2003/002779
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Inventor
Kiichi Fukui
Akio Kobayashi
Satoshi Harashima
Eiji Nagamori
Takefumi Sone
Original Assignee
Japan As Represented By President Of Osaka University
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin

Definitions

  • the present invention is characterized in that a foreign gel or a bioactive substance is immobilized on a fine gel of calcium alginate prepared using low-viscosity sodium alginate.
  • the new biobeads Further, the present invention relates to a method for efficiently introducing an exogenous genetic material or a physiologically active substance into cells using the biobeads.
  • Methods for introducing a foreign gene into cells include the PEG method, electroporation method, gene gun method, and agrobacterium method.
  • the conventional PEG method has the disadvantages that it is hard to use in practice because the gene transfer by the PEG method is very damaging to the protoplasts and the transformation efficiency is very low compared to the agrobacterium method and the particle gun method.
  • the present inventors have shown in Japanese Patent Application No. 200904494 that fine biobeads can be produced by adding a divalent cation to an alginate containing a foreign gene or the like and gelling it.
  • Biobeads prepared by the method disclosed in Japanese Patent Application No. 200904/1992 can be introduced into cells by the PEG method, which is disclosed in the specification.
  • Japanese Patent Application No. 2001-249043 did not sufficiently conduct studies considering high transformation efficiency that would enable the practical use of gene transfer by the PEG method. Summary of the Invention
  • a first aspect of the present invention is a process for preparing a water-in-oil emulsion having sodium alginate in water, and an aqueous solution containing calcium chloride and at least one of an exogenous genetic substance and a physiologically active substance in the emulsion. Alginate power to form micro beads of alginate, wherein the viscosity of a 10% solution of the sodium alginate is not more than 1000 centipoise at 20 ° C. is there.
  • the second aspect of the present invention relates to a method of preparing a bead of calcium alginate obtained by gelling sodium alginate and calcium chloride having a viscosity of 10 centipoise or less at 20 ° C. at 20 ° C.
  • Biobeads obtained by immobilizing at least one of the active substances.
  • a method for introducing an exogenous genetic material or a physiologically active substance, which comprises introducing the biobeads, is also a further aspect of the present invention.
  • the present invention will be described in detail. However, the description of the preferred embodiments and Examples are not intended to limit or control the effective scope of the present invention.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a method for introducing biobeads into protoplasts by the PEG method.
  • FIG. 2 is a photograph showing the expression of green fluorescent protein (GFP) introduced using biobeads in tobacco BY-2 cells.
  • GFP green fluorescent protein
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between plasmid concentration (DNA amount) and transformation efficiency.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between sodium alginate concentration and transformation efficiency.
  • FIG. 5 is a graph showing the transformation efficiency of biobeads prepared using sodium alginate having various viscosities.
  • FIG. 6 is a photograph comparing the particle size between normal sodium alginate and biobeads prepared using low-viscosity sodium alginate.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing a method for producing biobeads using the vortex method and the sonic method.
  • FIG. 8 is a photograph comparing particle diameters between biobeads prepared using the vortex method and the sonic method.
  • FIG. 9 is a graph comparing the particle size between vortex and biosonic prepared by the sonic method.
  • Figure 10 is a graph showing the effect of the size distribution of biobeads on transformation efficiency. Detailed description of preferred embodiments
  • the present inventors have studied the improvement of biobeads. As a result, a drastically high transformation efficiency was achieved by using low-viscosity sodium alginate. 0.5 ⁇ 3 ⁇ 4 sodium alginate solution 100 ⁇ 1 is added to 900 ⁇ ⁇ of water-insoluble organic solvent, and vibration is applied by ultrasonic crushing to introduce water-in-oil (W / 0) emulsion.
  • the biobead of the present invention is produced by adding 500 u1 of lOOmM calcium chloride solution in which the desired plasmid DNA is suspended, gelling instantaneously, and producing microparticles having a diameter of 5 or less holding the plasmid DNA inside and on the surface. did.
  • biobeads of the present invention prepared using low-viscosity sodium alginate as a carrier for DNA and performing PEG method on tobacco BY2 cells, the PEG method using no biobeads was used as shown in the following example. 40 times higher gene expression efficiency Rate was achieved. In addition, by using the method of the present invention, the efficiency of obtaining a transformed plant was greatly increased.
  • the low-viscosity sodium alginate means 2 (sodium alginate having a viscosity of 1000 centipoise or less when the viscosity of a 10% solution is measured in TC.
  • Sodium alginate exhibits a higher viscosity with a higher degree of polymerization and a higher molecular weight, and the viscosity increases almost logarithmically with increasing concentration, ie, the concentration is doubled.
  • the viscosity will increase by a factor of about 10, and the viscosity is extremely sensitive to water temperature.
  • sodium alginate having a viscosity of 1000 centipoise or less when measuring the viscosity of a 10% solution in TC (2). It is even more preferred to use certain sodium alginate, and even more preferred to use a sodium alginate having a 10% solution viscosity of less than 500 centipoise at 20 ° C. 5 is a 10% solution having a viscosity of 500-600 centipoise (20 ° C.), which is a suitable viscosity for practicing the present invention.
  • the most commonly used sodium alginate is: % Solution has a viscosity of about 300 to 600 centipoise at 20 ° C.
  • the sodium alginate (ULV-5 manufactured by Kimi Riki Co., Ltd.) has low viscosity. That.
  • the beads As the concentration of sodium alginate used for preparing, 0.53 ⁇ 4 (w / v) was used. In the following examples, it was shown that when low-viscosity sodium alginate was used, biobeads having a very small particle size were formed. More specifically, the particle size of the biobeads of the present invention is not less than 0.01 01 and not more than 10 / ⁇ . It is more preferable that the particle size of the biobeads of the present invention is 0.01 m or more and 5 m or less.
  • the normal viscosity (the viscosity of the solution is 100 to 150 at 20 ° C).
  • biobeads were prepared using sodium alginate having centipoise), many of them had a particle size of 20 / zm or more.
  • the organic solvent used for suspending sodium alginate is preferably isoamyl alcohol, butanol, and the like.
  • the isoamyl alcohol used in the following examples is particularly preferable.
  • the PEG method is particularly preferred as a method for introducing a gene using the PEG method, in which it is particularly important that the biobead surface comes into contact with cells in a state where DNA is concentrated at a high concentration, so that the particle size is small.
  • the biobeads of the present invention are highly effective, but the biobeads of the present invention can be introduced into cells by a method other than the PEG method. Microinjection, electroporation, etc. are known as gene transfer methods. It has been disclosed that the biobeads were introduced by electroporation using calcium alginate biobeads, so that not only the PEG method but also the electroporation method using micro-injection method were used.
  • Transfection of the biobeads of the present invention into cells is also a preferred embodiment of the present invention.
  • the method of the present invention is particularly excellent for efficiently introducing genes into protoplastized plant cells. Therefore, as a target to which a gene is introduced by the method of the present invention, a plant in which protoplast formation and regeneration are established is particularly preferable. Specific examples of such plants include tomato, tobacco, rice, and arabidopsis. By converting these plants into protoplasts and mixing with beads, foreign genetic materials and bioactive substances are taken up by endocytosis, and the contained foreign genetic substances and bioactive substances are released and act.
  • tobacco BY-2 cells are used to transform the cells, but this is an example of an embodiment of the present invention and is not limited to tobacco BY-2 cells. .
  • various exogenous genetic materials and physiologically active substances can be immobilized, and the range of exogenous genetic substances and bioactive substances to be introduced is not particularly limited.
  • immobilizing an exogenous genetic substance or a physiologically active substance means that those substances are retained inside and on the surface of the formed gel. Only a few genes can be transferred together by plasmid DNA in a solution state that is not immobilized on Noobiads.
  • the biobead method has the advantage that a large number of genes can be introduced at once by immobilizing it on biobeads, and that a gene of a huge size can be introduced.
  • a gene encoding a green fluorescent protein was immobilized on a biobead, introduced into cells, and the expression of the protein was confirmed by fluorescence.
  • the target substance to be introduced into cells is not limited to the gene for green fluorescent protein.
  • various exogenous genetic materials and physiologically active substances that are economically useful can be immobilized on the biobeads of the present invention and introduced into cells, thereby giving the cells desired properties.
  • the exogenous genetic material immobilized on Noobeads and introduced into cells includes mRNA, plasmid DNA, chromosomes, artificial chromosomes, organelle DNA, nuclei, and the like.
  • a plasmid DNA is prepared in which the glucanthione gene is linked to a cauliflower mosaic virus 35S promoter, which is a widely used promoter for the purpose of increasing the transcription amount of mRNA. Then, the plasmid can be taken into beads and introduced into plant cells. As a result, a large amount of dalluthion is produced in the cell, and a plant that can remove heavy metals and toxic substances in the cell by the action of dalluthion is produced. Such plants store toxic substances such as heavy metals in the environment in their cells, and can be used for environmental purification.
  • a chitinase gene capable of degrading chitin which is abundant in cells such as fungi and insects, is linked to a promoter that constantly transcribes mRNA in order to constantly express it in plants.
  • the plasmid DNA By incorporating the plasmid DNA into beads of useful plants, the plants can be made resistant to diseases caused by fungi such as molds, and the productivity can be increased.
  • mRNA of an effective gene into beads and introducing it into cells at a high concentration, it is possible to temporarily express the function of the gene. Since the mRNA is unstable, all of it is eventually degraded and the trait remains.
  • a gene such as the Bt gene, which is useful but toxic and which could be introduced into food crops due to its toxicity, is introduced at a high concentration in the form of mRNA and only for a certain period of time. It can be expressed and safe crop breeding without leaving the product of the gene when the crop is shipped.
  • high-molecular-weight DNA such as artificial chromosomes can be retained in beads in an intact form and introduced into cells.
  • a high-molecular-weight artificial chromosome that encodes a group of enzymes necessary for the metabolic pathway of C1 compounds such as Instead, they can take up the poisoned C1 compounds and create new plants that can be used as carbon sources.
  • genes for diseases, cold damage, drought, and resistance which are not present in wild plants in current crop plants, and QTL (quanti tat ive trai tl oc i) genes that increase useful traits
  • QTL quantitative tat ive trai tl oc i
  • mitochondria and chloroplasts which are eukaryotic organelles, have their own genomic DNA independent of the genome present in the nucleus of the body.
  • genomic DNA independent of the genome present in the nucleus of the body.
  • important genes that determine the characteristics of organisms are located. Techniques for isolating these organelles from cells have been developed in some plants, but techniques for returning these organelles to cells in an intact form are still under development. Therefore, it is useful if the organelles can be trapped in the biobeads of the present invention and introduced into cells.
  • cytoplasmic male sterility in which a gene on mitochondria is altered to produce normal pollen and become sterile, is known.
  • the phenomenon that fertility is restored when the nuclear gene is further mutated There is also.
  • Controlling fertility and sterility by such a nuclear-mitochondrial combination is effective in breeding and breeding.
  • altering these nucleus-organelle combinations usually requires crossing.
  • male-sterilized strains can only be given to mothers, progeny always have male-sterile mitochondria due to maternal inheritance. If it becomes possible to trap wild-type normal mitochondria in the beads of the present invention and introduce them into cells, fertility will be restored, and this situation will be overcome.
  • examples of the physiologically active substance used here include plant hormones. More specifically, auxins such as indole acetic acid and naphthylene acetic acid, cytokinins such as zeatin and forceinine, abscisic acid, gibberellin, and peptide sex hormones are introduced by the method of the present invention to control growth. It is possible to do. It is also possible to increase the resistance to pathogenic bacteria by introducing antibacterial substances such as phytoalexin, more specifically, pisatin, phaseoline, medicarpine, ricitin, ricinol, and the like. It is also possible to create individuals with improved resistance to stresses such as UV, light, and heavy metals by adding active oxygen scavengers such as phytokeratin and dal thione.
  • auxins such as indole acetic acid and naphthylene acetic acid
  • cytokinins such as zeatin and forceinine
  • abscisic acid gibberellin
  • the protoplasts of BY-2 cells which are tobacco culture cells, are used as plant cells into which a foreign gene is to be introduced, and SpUCsGFP, which is a basic vector of green fluorescent protein (GEF), is used as a plasmid used for gene transfer.
  • the SpUCsGFP used here was obtained by inserting the CaMV35S promoter + sGFP gene into pUC19.
  • the PEG method was used for transformation of plant cells.
  • Figure 1 shows the operating means of the PEG method.
  • the PEG concentration in the PEG reaction solution used is 24%, and the treatment time with the PEG reaction solution is 30 minutes.
  • BY-2 cells are treated with enzymes (protoplasts), centrifuged (700 rpm, 5 min), and the supernatant is replaced with a 0.4 M mannitol solution.
  • step 4 Place 0.5 ml of the protoplasts from step 4 and plasmid 50/1 in a 35-band sterile petri dish and gently mix.
  • PEG solution 403 ⁇ 4 PEG 6000, 0.4 Man'ni 1 le, 0.1M Ca (N0 3) 2 4H 2 0 pH7-9 ( filter sterilized -20 ° C storage)
  • FIG. 3 shows the relationship between the amount of plasmid and the number of transformants. As a result, as shown in FIG. 3, it was found that the larger the amount of DNA used, the more transformed individuals were obtained. This indicates that the concentration of DNA immobilized on the biobead surface is important for transformation efficiency.
  • FIG. 4 shows the relationship between the amount of sodium alginate and the number of transformants. As shown in FIG. 4, it was found that when the sodium alginate concentration was low, more expression individuals were obtained. 0.5% (W / V) is the lowest concentration at which a calcium alginate gel is formed under these conditions, and this value was used as the optimum concentration.
  • Fig. 6 is a photograph of biobeads prepared using ordinary sodium alginate (sodium alginate A in Fig. 5), and the lower part of Fig. 6 is one using low-viscosity sodium alginate (sodium alginate D in Fig. 5). This is a photograph of the biobeads produced by the method.
  • Figure 9 shows the results of a comparison of the particle size distribution of biobeads produced by the two methods.
  • the particle size of the biobeads produced by the sonic method is distributed below 10 m, but many of the biobeads produced by the portex method have a particle diameter of 20 m or more.
  • the GFP gene was introduced into BY2 protoplasts by the PEG method using the two types of biobeads produced by these methods.
  • the control system without biobeads, the system transformed with biobeads prepared using a test tube mixer, and the biobeads prepared using an ultrasonic crusher were used.
  • the transformed cells were compared.
  • the expression of GFP when using bioparticles with a large particle size prepared by the vortex method was only about half that when using biobiz prepared by the sonic method (Fig. 10).
  • novel biobeads are provided, in which an exogenous genetic substance or a biologically active substance is immobilized on a fine gel of alginic acid potassium prepared using low-viscosity sodium alginate. . Further, according to the present invention, exogenous genetic material or bioactive substance is efficiently introduced into cells using the biobeads. Given the way.
  • the particle size of the biobeads of the present invention prepared using low-viscosity sodium alginate is small, and there is a possibility that the chance of contact between the biobeads of the present invention and cells is increased. Using the biobeads of the present invention, high efficiency cell transformation was achieved.

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Description

明 次に示すように国際調査機関が作成した。
アルギン酸カルシウムに外来清遺伝物質を固定化したバイオビーズ 発明の背景
1 . 本技術の分野
本発明は、 低粘度のアルギン酸ナトリゥムを用いて調製したアルギン酸カルシ ゥムの微細なゲルに、 外来性遺伝物質又糸は生理活性物質を固定化させたことを特 田
徵とする、 新規なバイオビーズに関する。 更に本発明は、 そのバイオビーズを用 いて外来性遺伝物質又は生理活性物質を効率的に細胞内へ導入するための方法に 関する。
2 . 背景技術
外来遺伝子を細胞に導入するための方法には、 PEG 法、 電気穿孔法、 遺伝子銃 法、 ァグロパクテリゥム法などがある。 しかし従来の PEG法による遺伝子導入は プロ卜プラス卜に対するダメージが大きく、 形質転換効率もァグロパクテリゥム 法やパーティクルガン法に比べて非常に低いために実際には利用されにくいとい う欠点を有していた。 ところで本発明者らは、 外来遺伝子等を含むアルギン酸塩 に 2価カチオンを添加してゲル化させることにより、 微小なバイオビーズを作製 できることを特願平 200卜 249043において示した。 特願平 200卜 249043において 開示されている方法により作製されたバイオビーズを PEG法によって細胞内に導 入することが可能であり、 それは当該明細書において開示されている。 しかし、 特願平 2001-249043においては、 PEG法による遺伝子導入の実用化を可能とする 様な高い形質転換効率を意識した検討は十分には行われていなかった。 発明の概要
そのために、 PEG 法によるバイオビーズの導入を実用化するには更なる改善が 求められていた。 そこで、 アルギン酸カルシウムの微細ゲルを用いたバイオビー ズの技術を更に改良して形質転換効率を向上させることにより、 特に PEG法を用 いたバイオビーズによる遺伝子導入技術を完成させること力本発明の課題である。 本発明の第一の観点は、 アルギン酸ナトリウムを水中に有している油中水型ェ マルジョンを作製する過程、 及び前記ェマルジョンに塩化カルシウム及び外来性 遺伝物質と生理活性物質の少なくとも一方を含む水溶液を添加してアルギン酸力 ルシゥムの微小ビーズを形成する過程からなり、 かつ前記アルギン酸ナトリウム の 10% 溶液の粘度が 20°Cにおいて 1000センチポアズ以下であることを特徴とす る、 バイオビーズの作製方法である。
本発明の第二の観点は、 10% 溶液の粘度が 20°Cにおいて 1000センチポアズ以 下であるアルギン酸ナトリウムと塩化カルシウムとをゲルイ匕してなるアルギン酸 カルシウムの微小ビーズに、 外来性遺伝物質と生理活性物質の少なくとも一方を 固定化してなるバイオビーズである。そのバイオビーズを導入することからなる、 外来性遺伝物質又は生理活性物質の導入方法もまた本発明の更なる観点である。 以下、 本発明を詳しく説明するが、 これら好適形態の説明および実施例は本発 明の有効範囲を限定または制御することを何ら意味するものではない。
図面の簡単な説明
図 1は、 PEG法によるバイオビーズのプロトプラストへの導入方法の概略と示 す模式図である。
図 2は、 タバコ BY- 2細胞において、バイオビーズを用いて導入した緑色蛍光蛋 白質 (GFP) の発現を示す写真である。
図 3は、 プラスミド濃度 (DNA量） と形質転換効率との間の関係を示すグラフで ある。 図 4は、 アルギン酸ナトリゥムの濃度と形質転換効率との間の関係を示すダラ フである。
図 5は、 種々の粘度のアルギン酸ナトリゥムを用いて調製したバイオビーズの 形質転換効率を示したグラフである。
図 6は、 通常のアルギン酸ナトリゥムと低粘度のアルギン酸ナトリゥムを用い て調製したバイオビーズの間で粒径を比較した写真である。
図 7は、 ボルテックス法とソニック法を用いた、 バイオビーズの作製方法を示 す模式図である。
図 8は、 ボルテックス法とソニック法を用いて調製したバイォビーズの間で粒 径を比較した写真である。
図 9は、 ボルテックス法とソニック法により調製したバイォビ一ズの間で粒径 を比較したグラフである。
図 1 0は、 バイオビーズの粒径分布が形質転換効率に与える影響を示したダラ フである。 好適形態の詳細な説明
本発明者らがバイオビーズの改良について検討を行ったところ、 低粘度のアル ギン酸ナトリウムを用いることにより、飛躍的に高い形質転換効率が達成された。 非水溶性有機溶媒 900 ιι \ 中に 0. 5〜¾のアルギン酸ナトリゥム溶液 100 ^ 1 を 加え、 超音波破碎により振動を加え油中水型 （W/0 ) ェマルジヨンを形成させた ものに、 導入したいプラスミド DNAを懸濁した lOOmM塩化カルシウム溶液 500 u 1 を加えて瞬時にゲル化させ、 内部および表面にプラスミド DNAを保持した直径 5 以下の微粒子を製造することにより、 本発明のバイオビーズを作製した。 低粘度アルギン酸ナトリゥムを用いて作製した本発明のバイオビーズを DNAのキ ャリア一として、 タバコ BY2細胞への PEG法を行うと、 下記の実施例で示すよう にバイォビーズを使用しない従来の PEG法と比較して、 40倍も高い遺伝子発現効 率が達成された。 また、 本発明の手法を用いることで、 形質転換植物体の取得効 率も大幅に上昇した。
粘度が低いアルギン酸溶液を用いると、 W/0 ェマルジヨン化させた時に生じる 微小な水滴 （水相） が更に微小になり、 出来上がるバイオビーズの直径も微小に なる。 ビーズ直径が小さくなることで単位アルギン酸量あたりに作製されるバイ ォビーズの比面積が上昇し、 遺伝子導入操作時に細胞とバイオビーズが接触する 頻度も増え、 これが形質転換効率の向上に直接寄与している。 本発明のバイオビ 一ズの比面積が形質転換効率に与える影響についても調査したところ、 高い形質 転換効率が裏付けられた。
なお本願明細書において低粘度アルギン酸ナトリウムとは、 2(TCにおいて 10% 溶液の粘度を測定した際に、粘度が 1000センチポアズ以下であるアルギン酸ナト リウムを意味する。 一般的にアルギン酸ナトリウムは、 ニュートン流動に近い粘 性を示す。 そして、 アルギン酸ナトリウムは重合度が高くて分子量が大きい程高 い粘度を示し、また濃度の増加に対して粘度はほぼ対数的に増加する。すなわち、 濃度が 2倍になれば粘度は大体十倍になる。 また粘度は水温に対して極めて敏感 である。
本発明において、 2(TCにおいて 10%溶液の粘度を測定した際に粘度が 1000セ ンチポアズ以下であるアルギン酸ナトリウムを使用することは好ましく、 20でに おいて 10%溶液の粘度が 700センチポアズ以下であるアルギン酸ナトリゥムを使 用することは更に好ましく、 20°Cにおいて 10%溶液の粘度が 500センチポアズ以 下であるアルギン酸ナトリゥムを使用することはなお更に好ましい。 下記の実施 例においてキミ力社製 ULV-5は 10%溶液の粘度が 500-600センチポアズ （20°C) であり、 本発明を実施するにあたり好適な粘度を有している。 最も一般的に用い られているアルギン酸ナ卜リゥムは、 1%溶液の粘度が 20°Cにおいて 300から 600 センチポアズ程度であり、 それを考えると、 上記のアルギン酸ナトリウム （キミ 力社製 ULV-5 ) は低粘度であるといえる。 なお、 下記の実施例において、 ビーズ を作製する際のアルギン酸ナトリウム濃度としては、 0. 5¾ (w/v) を使用している。 下記の実施例において、 低粘度アルギン酸ナトリウムを用いた場合には、 非常 に小さな粒径を有するバイオビーズが形成されていることが示された。 より詳し くは、 本発明のバイオビーズの粒径は 0. 01 ΙΏ以上 10 /ιηι以下である。 なお、 本 発明のバイオビーズの粒径が 0. 01 m以上 5 m以下であることは、 更に好まし レ^ 下記の実施例において、 通常の粘度 （ 溶液の粘度が 20°Cにおいて 100から 150 センチポアズ） を有するアルギン酸ナトリウムを使用してバイオビーズを作 製したところ、 20 /zm以上の粒径を有するものが多く存在していた。
なお、 本発明において使用する低粘度アルギン酸ナトリゥムを有機溶媒に懸濁 する際に、 超音波法 （ソニック法） により懸濁することは特に好ましい。 試験管 ミキサーにより懸濁する方法 （ポルテックス法） との比較を行ったところ、 ポル テックス法と比較して、 ソニック法により懸濁を行うことによりより微細なバイ オビ一ズを作製できるという知見が得られた。 なおアルギン酸ナトリウムを懸濁 するのに使用する有機溶媒としてはイソアミルアルコールゃブ夕ノール等が好ま しく、 下記の実施例で使用しているイソアミルアルコールは特に ί(子ましい。 本発明のビーズを用いて遺伝子を導入する方法として、 PEG法は特に好ましい。 PEG法においては、 DNAが高濃度に濃縮された状態でバイオビーズ表面が細胞に 接触することが特に重要であるので、 粒径が小さいことを特徴とする本発明のバ ィォビーズの効果は大きい。 しかし本発明のバイオビーズは、 PEG 法以外の方法 によっても細胞内へ導入することが可能である。 本技術分野において汎用されて いるその他に遺伝子導入法としては、 マイクロインジェクション法やエレクトロ ポレーシヨン法等が知られている。 なお特願平 200卜 249043において、 アルギン 酸カルシウムのバイオビーズを用いて、 エレクトロポレーション法によりバイオ ビーズを導入したことが開示されている。 よって PEG法のみならず、 エレクト口 ポレーション法ゃマイクロインジェクション法の手段を用いて本発明のバイオビ ーズを細胞内へ導入することもまた本発明の好適な態様の一つである。 本発明の方法は、 プロトプラスト化した植物細胞において効率的に遺伝子を導 入するのにとりわけ優れている。 よって本発明の方法により遺伝子を導入する対 象として、 プロトプラスト化と再分化が確立している植物は特に好ましい。 その 様な植物の例として具体的には、 トマト、 タバコ、 イネ、 ァラビドプシスなどを 用いることができる。 これらの植物をプロトプラスト化し、 ビーズと混和するこ とによりエンドサイト一シスにより外来遺伝物質や生理活性物質が取り込まれて、 含有する外来遺伝物質や生理活性物質が放出されて作用する。 なお、 下記の実施 例においてはタバコ BY-2細胞を使用してその細胞を形質転換しているが、それは 本発明の態様の一例であって、 タバコ BY- 2細胞に限定されるものではない。 なお、 本発明のバイオビーズにおいて、 種々の外来性遺伝物質や生理活性物質 を固定化させることが可能であり、 導入するべき外来性遺伝物質や生理活性物質 の範囲は特に限定されるものではない。 なお、 本願明細書において外来性遺伝物 質や生理活性物質を固定化させるとは、 形成したゲルの内部及び表面にそれらの 物質を保持させることを意味する。 ノ ィォビーズに固定ィヒしていない溶液状態の プラスミド DNA によってまとめて導入できる遺伝子はせいぜい数個程度である。 しかしバイオビーズに固定化することにより、 大量の遺伝子を一度に導入するこ とができること、 また巨大なサイズの遺伝子を導入することが可能である点が、 バイォビーズ法の利点である。
下記の実施例においては緑色蛍光蛋白質 (GEF) をコードする遺伝子をバイオビ ーズに固定化して細胞内に導入して蛍光によりその蛋白質の発現を確認している。 しかし、 それは本発明の態様の一つであり、 細胞内に導入するべき目的物質は緑 色蛍光蛋白質の遺伝子に限定されるものではない。 そして経済的に有用である 種々の外来性遺伝物質や生理活性物質を本発明のバイオビーズに固定化して細胞 内へ導入し、 その細胞に望ましい性質を与えることができる。 ノ ォビーズに固 定化して細胞内へ導入される外来性遺伝物質として、 mRNA、 プラスミド DNA、 染 色体、 人工染色体、 オルガネラ DNA及び核等を挙げることができる。 本発明の態様の一つとして、 例えば、 mRNAの転写量を増大させる目的で汎用さ れているプロモーターである、 カリフラワーモザイクウィルス 35Sプロモータ一 などに、 グル夕チオン遺伝子を結合させたプラスミド DNAを作製して、 当該ブラ スミドをビーズに取りこませて植物細胞に導入することができる。 すると細胞内 に多くのダル夕チオンが作られダル夕チオンの働きで細胞内の重金属や毒物の除 去ができる植物が作られる。 このような植物は環境中の重金属などの毒物を細胞 内に蓄えてくれるので、 環境浄化に用いることができる。 また、 真菌類や昆虫な どの細胞に多く含まれるキチンを分解することのできるキチナ一ゼ遺伝子を、 植 物で恒常的に発現させるために、恒常的に mRNAを転写するようなプロモーターと 結合させたプラスミド DNAをビーズに取り込ませて有用植物の細胞に導入するこ とで、 カビなどの真菌が原因となる病気に耐性のある植物をつくり、 生産性を高 上させることができる。
また、有効な遺伝子の mRNAをビーズに取り込ませて細胞内に高濃度に導入する ことで、 一時的にその遺伝子の機能を発現させることが可能である。 mRNAは不安 定であるためにやがて全てが分解されしまい、 その形質は残らない。 これを利用 して、例えば Bt遺伝子などの有用ではあるが毒性があるために、食用作物などへ の導入が危惧されるような遺伝子を mRNAの形で高濃度に導入して、一定の期間だ け発現させ、 作物の出荷時にはその遺伝子の産物は残らない安全な作物育種を行 うことができる。
また、 プラスミド DNAによってまとめて導入できる遺伝子はせいぜい数種類程 度である。 しかし、 酵母人工染色体 （YAC )、 細菌人工染色体 (BAC ) などの人工 染色体を用いることで数十〜数百種類の遺伝子を保持した人工染色体を構築する ことが可能である。 先行するいくつかのエマルジョン化によるビーズ作製技術の 問題点として、 ェマルジョン化にともなう剪断力により人工染色体のような高分 子量の 丽 は分解されてしまう危険性が非常に高いという点が指摘されている。 しかし本発明によるピーズ作製技術では、 ェマルジヨン化後に DNAを取り込ませ るため人工染色体のような高分子量の DNAでも無傷な形でビーズに保持させ、 細 胞に導入することが可能である。 例えば、 従来は植物などがもたないメタンゃメ 夕ノールなどの C1 化合物の代謝経路に必要な酵素群をまとめてコードしたよう な高分子量の人工染色体を導入することにより、 従来植物が資化できず、 むしろ 毒となっていた C1 化合物を取り込んで炭素源として利用できるような新しい植 物を作り出すことができる。
また、野生植物には現在の作物植物には存在しないような、病気や冷害、乾燥、 抵抗性に対する遺伝子や、有用な形質が増大するような QTL (quant i tat ive t rai t l oc i ) 遺伝子をもつものがある。 これらの有用な遺伝子をもつ植物の遺伝子地図 を作成して遺伝子の座上する位置を決定しクローニングして作物植物に導入する ということが、 世界的に進められているが、 このような遺伝子を一つ一つ見つけ てクロ一ニングするという作業は非常に多大な労力を伴うものである。 それに比 ベて多くの場合、 遺伝解析からその遺伝子が座上している染色体までは比較的容 易に知ることができる。 そこで、 そのような遺伝子を保持している染色体を野生 植物から単離して、 無傷の形で本発明のビーズに取り込ませて導入することで、 その遺伝子をクローニングせずとも、 その形質を導入することが可能となる。 また、 真核生物のオルガネラであるミトコンドリアや葉緑体は、 本体の核に存 在するゲノムとは独立した独自のゲノム DNAを有している。 これらのオルガネラ のゲノムにも、 核ゲノムと同様に生物の形質を決定する重要な遺伝子が座上して いる。 これらのオルガネラを細胞から単離する技術はいくつかの植物で開発され ているが、 これらのオルガネラを無傷な形で再び細胞に戻す技術はまだ開発途上 にあるといえる。 そのために、 本発明のバイオビーズにオルガネラをトラップし て、 細胞内へ導入することが可能になれば有用である。
また、 例えばイネやテンサイなどの植物では、 ミトコンドリア上の遺伝子が変 異することにより正常な花粉ができず不稔になる細胞質雄性不稔という現象が知 られている。 しかし、 核の遺伝子がさらに変異すると稔性が回復するという現象 もある。 このような核- ミトコンドリアの組み合わせによる稔性、 不稔性をコン トロールする事は、 品種改良や品種保存において有効である。 ただし、 これら核 - オルガネラの組み合わせを改変するには、 通常交雑を経る必要がある。 特に、 雄 性不稔化した株は母親にしかなれないため、 母性遺伝により後代は必ず雄性不稔 のミトコンドリアをもつことになる。 本発明のビーズに野生型の正常なミトコン ドリアをトラップして、 細胞内へ導入することが可能になれば稔性が回復し、 こ の状況を打破することが可能になる。
またここで使用される生理活性物質として植物ホルモン等を挙げることができ る。 より具体的には、 インドール酢酸、 ナフ夕レン酢酸などのオーキシン、 ゼァ チン、 力イネチンなどのサイトカイニン、 アブシジン酸、 ジベレリン、 ペプチド 性ホルモン、 などを本発明の方法により導入して、 成長を制御することが可能で ある。また、 フアイトァレキシンなどの抗菌性物質、より具体的には、 ピサチン、 ファゼォリン、 メジカルピン、 リシチン、 リシチノールなどを導入することで病 原菌への耐性を高めることもまた可能である。 ファイトケラチン、 ダル夕チオン などの活性酸素除去剤を加えることで UVや光、重金属などのストレスに対する耐 性を向上させた個体を作成することもまた可能である。 実施例
( 1 ) BY- 2プロトプラストの PEG法による遺伝子導入
本発明において、 外来遺伝子を導入する対象の植物細胞としてはタバコ培養細 胞である BY-2細胞のプロトプラストを、遺伝子導入に用いるプラスミドとしては 緑色蛍光蛋白質 (GEF)の基本ベクターである SpUCsGFPを使用した。 ここで用いた SpUCsGFPは、 pUC19に CaMV35Sプロモーター +sGFP遺伝子が挿入されたものであ る。 植物細胞の形質転換には PEG法を用いた。 PEG法の操作手段を図 1に示す。 用いる PEG反応液中の PEG濃度は 24% であり、 PEG反応溶液による処理時間は 30分である。プロトプラストの調製及び PEG法による遺伝子導入は、 Negrut iu e t al. Plant Mol.Biol. (1987) 8:363-373、 及び Mathur et al. "PEG-mediated protoplast transformation with naled DNA" , Methods in Molecular Biology 82:Arabidopsis Protocolsに記載された方法に従った。 PEG法のプロトコ一ルを 以下に示す。
1. 継代後 3〜 5日目の BY-2 細胞を酵素処理 （プロトプラスト化） し遠心分離 (700rpm, 5min) した後、 上清を 0.4Mマンニトール溶液に置換する。
2. 細胞 （プロトプラスト） の濃度を 1.0 X 106 /ml に合わせる。
3. 2を 5mlずつ 15ml遠心チューブへ移し、 遠心分離 （700rpm， 5m in) する。
4. 遠心分離後の上清を除き、 同量の MaMg溶液を加える。
5. 4のプロトプラスト 0.5ml とプラスミド 50/ 1 を 35匪滅菌シャーレに入れ て軽く攪拌する。
6. 5min後、 PEG液 788 1 を 35mm滅菌シャーレへ入れて軽く攪拌し、 30min静 置。
7. 0.2M CaCl2溶液 815ml を 35imn滅菌シャーレへ入れて軽く攪拌する。
8.2min後、 0.2MCaCl2溶液 1630mlを 35mm滅菌シャーレに入れて軽く攪拌する。
9. さらに 2min後、 0.2M CaCl2溶液 1630mlを 35mm滅菌シャーレに入れて軽く攪 拌する。
10. 9を遠心チューブへ移し、 遠心分離 （700rpm, 5min) を行う。
1 1. 遠心分離後の上清を除き、 培養液 lml を加えて軽く攪拌する。
12. 1 1を 35mm滅菌シャーレへ移し、 シールとして 27°C暗所にて 24時間培養 する。
MaMg 溶 液 ： 15mM MgCl2, 0.4M マ ン ニ ト ー ル ， 0. MES L2-(N-Morphol ino)ethanesulp onic acid] , ρΗ5.6
PEG液： 40¾ PEG 6000, 0.4 マンニ 1 ル， 0.1M Ca(N03)2 4H20 pH7-9 (フィル ター滅菌 -20 °C保存）
0.2M CaCl2溶液： 0.2M CaCl2 2H20, 0.4M マンニ 1 ^一ル ρΗ5·8 その結果、 BYプラスミドにおいて GFPの発現が観察され、 また溶液のプラスミ ドを用いた従来の PEG法に比べてバイオビーズを使用した場合においてより多く の発現個体が得られた。 図 2に、 タバコ BY-2細胞における導入された GFP の蛍 光を示す。
( 2 ) バイオビーズを作製する条件の最適化
この系を用いて、 作製条件やアルギニン酸ナトリウムの種類等について、 バイ ォビーズの最適ィ匕を検討した。 まずバイオビーズ作製時に使用するプラスミド量 について検討を行った。 図 3において、 プラスミドの量と形質転換体数との間の 関係を示す。 その結果、 図 3に示される様に、 用いる DNA量が多い程多くの形質 転換個体が得られることが判つた。 これはバイオビーズ表面に固定されている DNA濃度が形質転換効率に重要であることを示す。 次にバイオビーズ作製時に使 用するアルギン酸溶液の濃度について検討を行った。 図 4において、 アルギン酸 ナトリウムの量と形質転換体数との間の関係を示す。 図 4に示される様に、 アル ギン酸ナトリゥム濃度が低い時のほうがより多くの発現個体が得られることが分 かった。 0. 5% (W/V) は本条件下でアルギン酸カルシウムゲルが形成される最低濃 度であり、 この値を最適濃度とした。
( 3 ) アルギン酸ナトリウムの粘度と形質転換効率
さらにバイオビーズ作製時に使用するアルギン酸ナトリゥムの種類について検 討した。国内数社で生産販売されている 8種類のアルギン酸ナトリウムを入手し、 0. 5¾ (w/v) 溶液を用いてバイオビーズを作製して実験に用いた。 種々の粘度を有 するアルギン酸ナトリゥム （各々のアルギン酸ナトリゥムの粘度は下記の表 1を 参照） を材料としてバイオピーズを作製し、 形質転換効率を比較した結果を図 5 に示す。 その結果、 図 5の Dにおいて示される様に、 低粘度アルギン酸ナトリウ ムを材料としたバイオビーズにおいて最も多くの発現個体が得られた。 図 5の D において使用したアルギン酸ナトリウム （キミ力社製、 ULV-5 ) は、 その 10%溶 液の粘度を 20°Cにおいて測定した時に、 500- 600センチポアズの粘度を示す。 他 のアルギン酸ナトリゥムはその 1%溶液が数百センチポアズの粘度を示す。
Figure imgf000013_0001
アルギン酸ナ卜リゥムの粘度の減少に応じて段階的に発現個体が増えることか ら、 低粘度のアルギン酸ナトリウムの使用が好ましいことが明らかになった。 作 製されたバイオビーズを顕微鏡下で観察した結果、 図 6のように低粘度アルギン 酸を使った場合に非常に小さなバイオビーズが形成されていることが明らかにな つた。図 6の上は通常のアルギン酸ナトリウム（図 5のアルギン酸ナトリウム A) を用いて作製したバイオビーズの写真であり、 図 6の下は低粘度のアルギン酸ナ トリウム （図 5のアルギン酸ナトリウム D ) を用いて作製したバイオビーズの写 真である。 通常のアルギン酸ナトリゥムを用いた場合には 20 111以上のビーズが 多く認められるが、 低粘度のアルギン酸ナトリウムを用いた場合には、 ほとんど のビーズは 10 w m以下であった。 この結果から、 バイオビーズの粒径、 即ちバイ ォビーズと細胞が接触する表面積が、 遺伝子導入効率に影響している可能性が示 唆された。 粘度が低いアルギン酸溶液を用いると、 W/0 ェマルジヨン化させた時 に微小な水滴が調製され、 それによつて出来上がるバイオビーズの直径も微小に なる、 という可能性が考えられる。 ( 4 ) バイオビーズの粒径分布と形質転換効率
そこで、 ノ ォビーズの大きさが形質転換個体数に直接影響するかを確認する ために、 粒径が異なる 2種類のバイオビーズを用いた実験を行った。 超音波発信 機を用いて振動を加えてェマルジョン化を行ってバイオビーズを作製した場合 (ソニック法） と、 試験管ミキサーを利用してェマルジヨン化を行った場合 （ポ ルテックス法） とを比較した。 ソニック法においては細かい粒径を有するバイオ ビーズが調製されるが、 一方、 ポルテックス法においては穏やかな振動が加えら れるために粒径が大きなバイオビーズが調製される。 2種類のバイオビーズの作 製方法の概略を図 7に示す。 また、 それらの方法によって作製されたバイオビー ズの写真を図 8に示す。 また、 2種類の方法により作製されたバイオビーズの粒 径分布の比較を行った結果を図 9に示す。 図 9において、 ソニック法により作製 されたバイオビーズの粒径は l O m以下に分布しているが、 ポルテックス法によ り作製されたバイォビーズには 20 m以上のものが多く認められた。
これらの方法で作製された 2種類のバイオビーズを使って、 PEG法により BY2 プロトプラストに GFP遺伝子を導入した。 図 1 0において、 バイオビーズを使用 しないコントロールの系、 試験管ミキサーを用いて調製されたバイオビーズによ り形質転換を行った系、 及び超音波破碎機を用いて調製されたバイオビーズによ り形質転換を行った系の比較を行った。 その結果、 ボルテックス法で調製された 粒径の大きなバイオビーズを用いた際の GFP発現は、 ソニック法で調製されたバ ィオビ一ズを用いた場合の約半分にとどまった （図 1 0 )。 これらの結果は、 バイ オビ一ズが細胞に接触する比面積が形質転換効率に影響を及ぼすことを示してい る。
本発明により、 低粘度のアルギン酸ナトリゥムを用いて調製したアルギン酸力 ルシゥムの微細なゲルに、 外来性遺伝物質又は生理活性物質を固定化させたこと を特徴とする、 新規なバイオビーズが与えられた。 更に本発明により、 そのバイ ォビーズを用いて外来性遺伝物質又は生理活性物質を効率的に細胞内へ導入する ための方法が与えられた。 低粘度のアルギン酸ナトリゥムを用いて調製した本発 明のバイオビーズの粒径は小さく、 本発明のバイオビーズと細胞が接触する機会 は多くなる可能性がある。 本発明のバイオビーズを用いたところ、 高い効率での 細胞の形質転換が達成された。

Claims

請 求 の 範 囲 . アルギン酸ナトリゥムを水中に有している油中水型ェマルジョンを作製する 過程、 及び前記ェマルジョンに塩化カルシウム及び外来性遺伝物質と生理活性 物質の少なくとも一方を含む水溶液を添加してアルギン酸カルシウムの微小ビ
—ズを形成する過程からなり、 かつ前記アルギン酸ナトリウムの 10%溶液の粘 度が 20 において 1000センチポアズ以下であることを特徴とする、 バイオビ ーズの作製方法。
.前記ビーズの粒径が 0. 01 ^ m以上 10 jw m以下であることを特徴とする、請求 項 1記載のバイオビーズの作製方法。
. 超音波処理を行うことにより前記アルギン酸ナトリゥムをェマルジョン化す ることを特徴とする、 請求項 1記載のバイオビーズの作製方法。
. 前記外来性遺伝物質が mRNA、 プラスミド DNA、 染色体、 人工染色体、 オルガ ネラ DNA又は核である、 請求項 1ないし請求項 3のいずれか一つの請求項に記 載のバイォビーズの作製方法。
. 前記生理活性物質が植物ホルモンである、 請求項 1ないし請求項 3のいずれ か一つの請求項に記載のバイオビーズの作製方法。
. 請求項 1ないし請求項 5のいずれか一つの請求項に記載の方法により作製さ れたバイオビーズ。
. 10%溶液の粘度が 2(TCにおいて 1000センチポアズ以下であるアルギン酸ナ トリウムと、 塩化カルシウムとをゲルイ匕してなるアルギン酸カルシウムの微小 ビーズに、外来性遺伝物質と生理活性物質の少なくとも一方を固定化してなる、 バイオビーズ。
. 前記外来性遺伝物質が mRNA、 プラスミド DNA、 染色体、 人工染色体、 オルガ ネラ DNA又は核である、 請求項 7記載のバイオビーズ。
. 前記生理活性物質が植物ホルモンである、 請求項 7記載のバイオビーズ。 0. 請求項 6ないし請求項 9のいづれか一つの請求項に記載のバイオビーズを 細胞中に導入する過程からなる、外来性遺伝物質又は生理活性物質の導入方法。 1 . PEG法を用いてバイオビーズを植物プロトプラスト中に導入することを特 徴とする、 請求項 1 0記載の方法。
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