WO2003004641A1 - Procede relatif a l'elaboration de thrombine humaine par modification genique - Google Patents

Procede relatif a l'elaboration de thrombine humaine par modification genique Download PDF

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WO2003004641A1
WO2003004641A1 PCT/JP2002/006771 JP0206771W WO03004641A1 WO 2003004641 A1 WO2003004641 A1 WO 2003004641A1 JP 0206771 W JP0206771 W JP 0206771W WO 03004641 A1 WO03004641 A1 WO 03004641A1
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human thrombin
prethrombin
cells
thrombin
gene
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PCT/JP2002/006771
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Hiroshi Yonemura
Takayuki Imamura
Hiroshi Nakatake
Kenji Soejima
Chikateru Nozaki
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Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)

Definitions

  • the present invention relates to thrombin, which belongs to the field of prescription drugs, and in particular, can be used as a hemostatic agent. More particularly, the present invention relates to a recombinant tombin prepared by making full use of genetic recombination technology and a method for producing the same.
  • Thrombin is a trypsin-like serine protease that has an essential action for the maintenance and progression of life such as formation of hemostatic thrombus and wound healing. Thrombin includes meizothrombin, ⁇ -thrombin, 3-thrombin and ⁇ -thrombin, but physiologically Q! _Thrombin is important.
  • Prothrombin a precursor of thrombin, is biosynthesized in hepatocytes in a vitamin K-dependent manner, and its blood concentration is 100-150 / ig / ml.
  • Vitamin K-dependent coagulation factors have a Gla-containing region (Gla domain) at the N-terminus and have the property of binding to phospholipids via Ca 2+ ions. It has been shown that when this Gla domain binds to Ca 2+ , the conformational change of the whole protein occurs, and it exerts an important function that interacts with the capture factor.
  • Prothrombin is activated by the FXa-FVa complex on the cell membrane phospholipid, and the Arg320-ILe321 bond of prothrombin undergoes limited degradation to form mesothrombin with a Gla domain-kringle domain. Next, the Arg271-Thr272 bond is limited to be degraded to produce monothrombin, which is released from the cell membrane, and to degrade a number of plasma proteins and various cell membrane tombin receptors to exhibit various physiological activities.
  • One thrombin is a double-stranded molecule consisting of A and B chains, but when the B chain, which is important for enzyme activity, is further autolyzed, it becomes 3-thrombin, ⁇ -thrombin, and has the ability to activate fiprinogen and platelets lose.
  • ⁇ -Thrombin is an enzyme that converts fiprinogen to fibrin, and also activates FXIII to crosslink fibrin. In addition, it has a coagulation-promoting function that activates FVIII and FV, which are trapping factors for FIX and FXa, respectively, to promote coagulation.
  • FVIII and FV which are trapping factors for FIX and FXa, respectively, to promote coagulation.
  • thrombin has a hemostatic effect It is an extremely useful protein as a hemostatic agent because it plays an important role in use.
  • thrombin changes its substrate specificity when it binds to tocombomodulin on vascular endothelial cells, and promotes anticoagulation by activating protein C.
  • thrombin By utilizing the enzymatic activity of thrombin, it is a useful protein that is also used as a process enzyme for producing activated protein C, an anticoagulant.
  • ⁇ -thrombin not only strongly aggregates and activates platelets, but also has a mitogenic effect.
  • a-thrombin has various physiological actions, and is therefore used as a reagent in various research fields, and its use is expected to increase further in the future.
  • Thrombin having such a function has been widely used as a hemostatic agent, process enzyme and research reagent.
  • thrombin derived from blood is applied endoscopically to the bleeding affected area or administered orally, and a hemostatic effect has been recognized.
  • fibrin glue which is used as a tissue adhesive, contains thrombin derived from blood along with fibrinogen and FXIII factor.
  • these thrombins are isolated from human blood or pomace blood, they are various factors that are thought to have an adverse effect on humans due to factors derived from the blood from which they are derived. Factor is included. For example, there is a danger that includes viruses that cause hepatitis such as HAV, HBV, HCV, HEV, and TTV, viruses that cause immunodeficiency such as HIV, and abnormal prions that cause CJD and the like. In fact, phytotoxicity caused by blood products containing these risk factors has become a major social problem. Furthermore, since blood derived from humans or pests is a biological material, there is no guarantee that the blood will always be supplied stably. This is a very important and serious problem, especially for pharmaceuticals, and it should be resolved as soon as possible.
  • the conventional method is to activate prothrombin, a precursor of thrombin, with FXa derived from blood to produce thrombin. It uses the enzyme FXa derived from it. Even if the precursor to tombin is made by recombinant technology, it is not possible to escape the danger from blood components by using blood-derived FII as its activating enzyme. Furthermore, in order to produce FXa by recombinant technology, the precursor X must be produced by recombinant technology, and it must be activated and individualized by FIXa. In order to produce FIXa by recombinant technology, the precursor IX must be produced by recombinant technology and activated. Thus, unless the upstream enzyme involved in the cascade reaction of the coagulation reaction is retroactively produced by recombinant technology, it is not possible to obtain tombin which eliminates the danger of blood.
  • thrombin expressed in Escherichia coli forms an aggregate called an inclusion body and is difficult to recover.
  • the efficiency of dissolving the aggregates and reconstituting them as functional proteins (refolding) is extremely low and has no industrial merit (J. Biol. Chem. 270, 163-169, 1995).
  • the expression level of thrombin is low, so that it is not practical (Protein exp. Purif., 10, 214-225, 1997).
  • the expressed thrombin is a precursor, so that an activating enzyme such as FXa must be used to activate it, but since these activating enzymes are not recombinant enzymes, Elimination of components has not yet been realized. Thus, it has been difficult to supply safe human thrombin stably and economically with the conventional technology.
  • a plasmid was constructed in which the human thrombin precursor gene and its activating enzyme gene were linked downstream of the beta-actin promoter, which is a strong promoter, and those genes were introduced into animal cells to develop each high-expression system.
  • FIG. 1 Purification of prethrombin-12 from the culture supernatant of prethrombin-12 produced SP20 No. The fraction at each step was subjected to SDS-PAGE and protein staining.
  • Fig. 2 Ecarin-producing SP2 / 0
  • the ecarin was purified from the culture supernatant, and the fraction in the final step of gel filtration was subjected to SDS-PAGE and protein staining.
  • prothrombin is composed of Gla domain, Talingle domain, and Serimb mouth theasedomin. Post-translational modification occurs in Gla and Clingnoredmein, which may be the rate-limiting factor for protein production.
  • a-thrombin consisting of A-chain and B-chain is an activator of the minimum size, so that single-chain protein consisting of this A-B chain A gene encoding a certain prethrombin 2 (hereinafter sometimes referred to as prethrombin) was used for expression.
  • prethrombin prethrombin gene encoding a certain prethrombin 2
  • cDNA was synthesized using type I mRNA isolated from human liver, and the PCR was used to amplify the prothrombin gene using a primer designed based on the sequence of the prothrombin gene. Further, the amplified prothrombin gene was amplified into type II to amplify the desired prethrombin-12 gene.
  • the high expression vector using animal cells as a host, but as an optimal embodiment, the present inventors' existing expression plasmid pCAGG is used.
  • a plasmid in which the above-described prethrombin gene was inserted into a vector obtained by further improving was constructed.
  • As the leader sequence or the like used here a sequence derived from the original tombin gene or other genes can also be used. Structure
  • Cultured cells derived from hamsters, mice, and humans can be widely used as the animal cells as the host used herein, and preferably, Chinese nomster ovary cells (CHO cells) and mouse serogels are used. Cells, BHK21 cells, 293 cells, COS cells and the like.
  • the inventors of the present invention changed FXa, which has been conventionally used as an activator of tombin, to ecarin having a similar function, and more preferably, the ecarin as a recombinant ecarin, similar to the above-mentioned prethrombin. We succeeded in making it with our high expression system.
  • Ecarin was isolated and purified from Ec-is car 7a "s (T. Morita et al .: J. Biochem. 83, 559-570, 1978). It is a protease from snake venom that can specifically activate prothrombin.
  • the cDNA encoding ecarin has been cloned by S. Nishida et al. (Biochemistry, 34, 1771-1778, 1995) and its structure has been elucidated.This ecarin is a glycoprotein and the mature form is total amino acid. No. of residues 426, including Zn2 + chelate, disintegrin domain and Cys-rich domain, RVV-X
  • Ecarin exerts the action of activating thrombin after its precursor is activated by a protease such as trypsin-plasmin. Therefore, the activity of thrombin requires a reaction from the ecarin precursor to trypsin and the like. The force of our technique is that this activity is not required in the purification process of the recombinant ecarin without using trypsin or the like. It was also possible to do dashi.
  • the ecarin gene was amplified by PCR to construct a plasmid ligated to an expression vector derived from the chicken) 3-actin promoter-based expression plasmid pCAGG.
  • the movement in which those plasmids were introduced The target cells could express a sufficient amount of the desired ecarin.
  • animal cells used here similarly to the case of thrombin, hamster-derived, mouse-derived, human-derived cultured cells and the like can be widely used.
  • the obtained culture supernatant was purified by ion exchange chromatography or gel filtration.
  • ecarin could be separated as an activated protein without using an activating enzyme such as trypsin. That is, ecarin expressed in animal cells can be simultaneously purified and activated by the inventor of the present invention. It is thought that similar techniques and results can be achieved even with activating enzymes other than ecarin.
  • the above-mentioned recombinant prethrombin is activated as a substrate, and then affinity chromatography with a hirudin peptide known to specifically react with thrombin.
  • recombinant ⁇ -thrombin can be highly purified by column chromatography on which hirudin peptide is immobilized.
  • a method for purifying thrombin a method combining other various chromatographies is also possible.
  • the recombinant human thrombin prepared by the present inventors exists in nature. It can be said that the protein is very close to Hiichi Thrombin.
  • pSV2-dhfr-Bgn was digested with the restriction enzyme BglII, blunt-ended with T4 DNA polymerase, and ligated and circularized with T4 DNA ligase to construct pSV2-dhfr-Bgn. Furthermore, after pSV2-dhfr-Bgn was digested with a restriction enzyme PvuII, pSV2-dhfr-BgB was cyclized with T4 DNA ligase in the presence of a phosphorylated BglII linker.
  • pMClneo-polyA aminoglycoside phosphotransferase (neo r) (KR Thomas et . Al., Cell, 51 »503-512p, 1987) was digested with restriction enzymes Xho I and phosphorylated BamH I linker one presence T4 Ligated circularized pMClneo-2B was constructed using DNA ligase. This pMClneo-2B was digested with the restriction enzyme BamHI, and a fragment of about 1.1 kbp was obtained by agarose gel electrophoresis. The above pCAGG-
  • pCAGG-SI (Sal) .dhfr.neo was constructed by cyclizing this approximately 1.1 kbp fragment and ligating it with T4 DNA ligase.
  • PCR reaction was performed as described above.
  • the first PCR reaction was performed using a combination of the primer 1 and the primer 1-2 and a combination of the primer 3 and the primer 4.
  • Primer 2 5, -CGGAGGCCMGGCCTGTCTCCGTTCTTGCCMTCCC [SEQ ID NO: 2]
  • Primer 3 5'-AACGGAGACAGGCCTTGGCCTCCGCTCAGGAACGAG [SEQ ID NO: 3]
  • Primer 4 5 -GGGGATCCTGTTAGTCTTTCTTCTCGTAGAC [SEQ ID NO: 4]
  • Amplification with Pyrobest DNA polymerase was performed for 25 cycles using 5 ng of template and 100 pmol of each primer.
  • the PCR reaction was performed according to the instruction manual of the enzyme.
  • the amplified DNA fragment was purified by 1% agarose gel electrophoresis.
  • about 20 ng of each of the DNA fragments amplified by the primers 1 and 2 and the DNA fragments amplified by the primers 3 and 4 were mixed, and a similar PCR reaction was performed using the primers as primers and primers 4.
  • the nucleotide sequences of the primers are shown below.
  • the plasmid whose nucleotide sequence was confirmed was digested again with the restriction enzyme Hind III-BamHI, and a DNA fragment encoding the mutated DHFR gene of about 0.6 kbp was extracted by agarose gel electrophoresis.
  • a DNA fragment of about 3 kbp was extracted with Agarosugeru electrophoresis, the aforementioned DNA fragment encoding it and mutant DHFR T4 -PSV2-mdhfr ligated and circularized with DNA ligase was constructed.
  • pSV2-mdhfr was digested with the restriction enzyme Pvu II, and pSV2-radhfr-BgB was ligated and circularized with T4-DNA ligase in the presence of phosphorylated Bgl II linker.
  • This plasmid is After digestion with BglII-BamHI, a DNA fragment of about 1.7 kbp encoding the expression cassette of mDHFR was extracted by agarose gel electrophoresis. Prepared in (1)
  • Human liver mEA (Saturday Technology Co., Ltd.) was used to synthesize 1st strand cDNA using reverse transcriptase using oligo dT as a primer (type T-Primed First Strand Kit; Amersham Almacia). Based on this cDNA, the following primers were designed and used for the PCR reaction.
  • the primers are 5'-ATGGCGCACGTCCGAGGCTTGCAGCTGCCT (PT1; SEQ ID NO: 5) as a primer for the gene corresponding to the N-terminal side of the proto-oral bin, and 5'-CTACTCTCCA CTGATCAATGACCTTCT (PT2; SEQ ID NO: 6) as a primer for the gene corresponding to the C-terminal side. ) was used.
  • PCR reaction gene amplification was attempted in 30 cycles using Pyrobest DNA polymerase according to the instruction manual for this enzyme. The following PCR reaction followed the same procedure.
  • a prethrombin-12 gene was prepared.
  • the following primers were synthesized and PCR was performed using prothrombin cDNA as a template.
  • the nucleotide sequences of the primers used are as follows [SEQ ID NOS: 7 to 10].
  • Primer 1 5'-AAGAATTCGTCGACCACCATGGCGCACGTCCGAG [SEQ ID NO: 7]
  • Primer 2 5-TCTTCTCACTCTCTGGAGCAGCGACCG [SEQ ID NO: 8]
  • DNA encoding the preproleader sequence site of prothrombin was amplified.
  • a mutation was made to introduce a Kozak common sequence into the initiation codon site, and recognition sites for restriction enzymes Sal I and EcoR I were introduced further upstream.
  • amplification was performed using primers 3 and 4, whereby the prethrombin-12 gene encoding a serine protease domain corresponding to the C-terminal side of the proto-orbumbin translation region was amplified. Restriction downstream of the stop codon Recognition sites for enzymes Sal I and EcoR I were introduced.
  • Primers 2 and 3 were treated with T4 polynucleotide kinase before the PCR reaction to phosphorylate the 5, -terminal, and the gene was amplified by the PCR reaction. After the amplified fragment was extracted by 1% agarose gel electrophoresis, DNAs encoding the preproleader sequence site and DNA encoding the prethrombin-12 site were mixed in approximately equivalent amounts, and ligated with T4 DNA ligase. Then, using this mixture as a template, perform PCR amplification again with primers 1 and 4, and extract approximately 1.1 kbp of DNA from the amplified DNA by agarose gel electrophoresis.
  • a DNA sequence was obtained in which the DNA sequence encoding the rooster sequence and prethrombin-12 were ligated.
  • the end of this gene was digested with the restriction enzyme EcoRI.
  • the (Pharmacia) with the restriction enzymes Sac I ⁇ Hi st I, blunted by the action of Mung bean nuclease were constructed linking circularized ⁇ ⁇ ⁇ ScPt with T4 DNA ligase.
  • the ⁇ ⁇ ScPt was digested with the restriction enzyme EcoR I, to construct P TZ. ⁇ were ligated to cyclize with the fragment and T4 DNA ligase encoding prethrombin above.
  • the DNA base sequence of this plasmid was confirmed by a conventional method, and it was confirmed that the DNA encoding the prepro leader sequence site and the prethrombin site of prothrombin was translated in the same frame.
  • the pretombin gene into which the prepro leader sequence has been introduced is referred to as a prethrombin structural gene (SEQ ID NO: 11).
  • pCAGG-Sl (Sal), dhfr. Neo, pCAGG-SI (Sal), and radhfr hepreto mouth bin structural genes described in Example 1 were introduced.
  • neo and pCAGG-SI (Sal) .mdhfr were digested with the restriction enzyme SalI, respectively, and then dephosphorylated with anophore phosphatase derived from the small intestine of pups.
  • the above-mentioned pTZ.II was digested with restriction enzyme SalI, and an approximately 1. lkbp fragment encoding a retronbin-12 structural gene was purified by agarose gel electrophoresis.
  • PCAGG-Sl.PL dhfr.neo and pCAGG-SI.PT.mdhfr were constructed by ligating the dephosphorylated plasmid and the fragment encoding the prethrombin-12 structural gene with T4 DNA ligase.
  • CHO DG44 G.
  • pCAGG-SI.PT.mdhfr was used for SP2 / 0 cells. CH0 cells were transformed by the calcium phosphate method (C. Chen et al., Mol. Cell. Biol., 7, 2745-2752p, 1987), and SP2 / 0 cells were transformed by the electroporation method.
  • the expression plasmid used for the transformation was linearized in advance by digestion with the restriction enzyme PvuI.
  • CH0 cells were selected for transformants from transformation as follows.
  • the cells were seeded on a nucleic acid-free MEM alpha medium containing dialyzed FCS and cultured overnight. The next day, the medium was changed to a serum-free YMM medium (nucleic acid-free MEM alpha medium enriched in insulin, transferrin, ethanolamine, aminoacids containing sodium selenite, and vitamins).
  • 37 ° C, 5% C0 2 7 to 10 days after culture in the culture device was measured prethrombin concentration in the supernatant. Prethrombin of 20 // g / raL was confirmed in the supernatant.
  • the cells were seeded on a 96-well plate at the concentration of 0.5 cells / we11 at a concentration of 200 ⁇ L / well in the same medium to perform closing by limiting dilution.
  • the resulting clones were evaluated for productivity for each clone.
  • Each clone was plated with nucleic acid free MEM alpha medium containing 10% dialyzed FCS at a density of 2xl0 5 cells / mL, and cultured overnight. The next day, the medium was replaced with ⁇ medium. 37 ° C, 5% C0 2 culture apparatus 7 to 10 days after cultivation at was measured prethrombin concentration in supernatant.
  • clone # 10 expressed 90 thg / raL of prethrombin-12 in the supernatant
  • clone # 72 expressed 110 / ig / raL of premouth thrombin-12 in the supernatant.
  • SP2 / 0 cells were selected from transformants as described below.
  • Those cells having high productivity were selected from these cells, and cultured for about 14 days in a nucleic acid-free MEM alpha medium containing 10% dialyzed FCS and 1 ⁇ mol / L MTX.
  • the obtained MTX-resistant cells were adapted to a serum-free medium using a YMM medium. After confirming growth by adding 2% of dialyzed FCS to YMM medium, the serum concentration to be added was 0.5% —
  • the culture was performed while reducing the concentration to 0.1%. After confirming that the cell growth was good, the cells were cultured in a serum-free YM medium, and after confirming the growth, the productivity was evaluated using the YMM medium by the method described above.
  • # 32 had a production capacity of 15 ⁇ g / day / 10 6 cells. This # 32 were plated on dishes at a density of 3xl0 5 cells / mL using YMM medium, were cultured for about 7 days was measured prethrombin concentration expressed in the supernatant. # 32 was expressed prethrombin about 0.99 mu g / mL in the supernatant.
  • Pretomouth bin-producing cells # 32 adapted to a serum-free medium shown in Example 4 were cultured in a spinner flask. After cell expansion, and 250 mL culture at a density of 2xl0 5 cells / raL in 250 mL Supinafura score using YMM medium (Techne Co.). The cells were expanded and cultured in a 1 L spinner flask at a density of more than lxlO 6 cells / mL. After confirming the growth of these cells, the cells were expanded to five 1-L spinner-flasks. After culturing the cells for about 73 hours, the concentration of prethrombin expressed in the supernatant was measured. It was confirmed that about 100 ⁇ g / mL of pretombin-12 was expressed.
  • the ecarin cDNA has the sequence reported in the literature (S. Nishida et. Al., Biochemistry, 34, 1771-1778 p, 1995) as a template. Was introduced. After digesting this gene with restriction enzyme XhoI, plTC. EC subcloned into PUC18 was constructed. Using this plasmid, the DNA base sequence of the ecarin cDNA portion was confirmed by a conventional method, and ecarin cDNA having a sequence from the start codon to the stop codon according to the literature was obtained (SEQ ID NO: 12).
  • the ecarin cDNA was introduced into pCAGG-Sl (Sal) and dhfr. Neo described in Example 1. After digesting pCAGG-SI (Sal) .dhfr.neo with the restriction enzyme SalI, it was dephosphorylated with small intestine-derived alhi-lipophosphatase. The above-mentioned pUEC was digested with restriction enzyme XhoI, and a fragment of about 1.8 kbp encoding ecarin cDNA was purified by agarose gel electrophoresis. The dephosphorylated plasmid and a fragment encoding ecarin cDNA were ligated and circularized with T4 DNA ligase to construct pCAGG-SI.EC.dhfr.neo.
  • CHO cells and SP2 / 0 cells were transformed using the ecarin-expressing plasmid pCAGG-SI.EC.dhfr.neo described in Example 7.
  • Ecarin was quantified using prothrombin conversion activity to thrombin using a commercially available snake venom derived ecarin (Sigma) as a standard. The expression level was expressed in activity units (U / mL).
  • CH0 cells were selected for transformants from transformation as follows. . Cells were plated with nucleic acid-containing MEM Anorefa medium containing 10% ⁇ shea calf serum at a cell density of 5xl0 5 cells / dish lOcra dish the day before the transformation. After overnight culture at 37 ° C., transformation was performed using 2 ng / mL of the linearized expression plasmid pCAGG-SI.EC.dhfr.neo.
  • nucleic acid free MEM alpha medium containing Geneticin 10% dialyzed FCS ⁇ Pi 500 mu g / Ral The medium was changed. Make a selection by continued culturing at 37 ° C, 5% C0 2 culturing apparatus with medium changes every 3-4 days, and boolean appearance transformants KoTsuta evaluation of production capacity.
  • the transformed cells were seeded at a density of 2xl0 5 cells / mL in a nucleic acid-free MEM alpha medium containing 10% dialyzed FCS and cultured overnight. The next day, the medium was replaced with a serum-free YMM medium. 35 ° C, 5 ° / 0 C0 2 after about 14 days of culture in the culture device was measured Ekarin concentration in the supernatant. 10 U / mL ecarin was confirmed in the supernatant.
  • SP2 / 0 cells were selected from transformants as described below. After washing the SP2 / 0 cells twice with cold Dulbecco's PBS (-), 10 7 cells suspended in 0.8 (ra) PBS (-) were capped for electroporation (electrode width 0.4 ctn, BIO- RAD). 40 // g of the above-mentioned linearized expression plasmid was added and mixed with a pipette. Using Gene Pulser II (manufactured by BI0-RAD), once at 0.22 kv, 975 / F. Noreth was added.
  • Gene Pulser II manufactured by BI0-RAD
  • transformants were evaluated for productivity for each well.
  • Cells were seeded with about 3xl0 5 cells / ml density nucleic acid free MEM alpha medium containing 500 mu g / mL of Geneticin and 2% dialyzed FCS at a later cultured for about 14 days, the Ekarin concentration in the supernatant It was measured.
  • Each transformant expressed 2 to 10 U / mL ecarin.
  • transformants having high production ability were seeded in a 96-well plate at a concentration of 0.5 cells / well in 200 17 3 ⁇ 4 3 ⁇ 411 using the same medium to perform clawing by limiting dilution.
  • clone # 1H-8 expressed 15 U / raL ecarin in the supernatant.
  • This clone # 1H_8 was adapted to a serum-free medium using a YMM medium. After confirming the growth by adding 2% of dialyzed FCS to the YMM medium, culture was performed while decreasing the serum concentration to be added to 0.5% -0.1%. After confirming that the cell growth was good, the cells were cultured in a serum-free ⁇ medium, and after confirming the growth, the productivity was evaluated using the YMM medium by the method described above. Clone # 1H-8 adapted to serum-free medium had a production capacity of 20 U / mL.
  • Example 9 Large-scale culture of ecarin-producing cells
  • the ecarin-producing cells # 1H-8 adapted to the serum-free medium shown in Example 8 were subjected to suspension culture using a spinner flask. After cell expansion, and 2Deruta0 mL cultured at a density of 2xl0 5 cells / mL in 250 mL spinner flasks (Techne Co.) using YMM medium. Cells were expanded cultured cells to 1 L spinner one flask at a density of more than lxl0 6 cells / mL. After confirming the growth of the cells, the cells were expanded to five 1-L spinner flasks. After culturing the cells for about 7 days, the concentration of ecarin expressed in the supernatant was measured. Expression of ecarin at about 18 U / mL was confirmed.
  • Hirudin is a specific inhibitor of thrombin isolated from leech.
  • the peptide Lys-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-lie-Pro-Glu-Glu_Tyr-Leu-Glu shown in SEQ ID NO: 13 was converted from the amino acid sequence of this resin / resin to a peptide synthesizer (Applied). And synthesized. 10 mg of this peptide was coupled to formyl cell mouth fine lml manufactured by Chisso Co., Ltd. according to the description of the package insert.
  • the amino acid sequence of ecarin cDNA was revealed to be hydrophilic and hydrophobic according to the hop-and-pad method (TP, Hopp et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 78 3824-3828, 1981). Lys-Asn-Asp-Tyr-Ser-Tyr-Ala-Asp-Glu-Asn-Lys-Gly-lie-Val Glu-Pro- A peptide having the sequence of Gly-Thr-Lys-Cys was synthesized using a peptide synthesizer (Applied).
  • this membrane was reacted with anti-magpie: TgG-HRP-labeled antibody (Bio-Rad) diluted 2000-fold for 1 hour at room temperature, washed, and then washed with Koekaimunostinin HRP1000 (Koni Riki Co., Ltd.) kit. Staining. As a result, it was confirmed that the serum obtained by immunizing the synthetic peptide specifically reacted with ecarin.
  • Dialysis was performed at 4 ° C for 16 hours.
  • the reaction solution after ecarin treatment obtained in (2) was applied to the gel immobilized with the hirudin peptide prepared by the method of Example 10 at a rate of 1 ml / min. After applying the sample, wash it with 50 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 8.5) buffer containing 0.5 M NaCl, then wash it with 1 M Elution was performed with 50 ml of a 20 mM Tris-HCl (pH 8.5) buffer containing potassium cyanate. Through the above steps, ⁇ -thrombin of high purity was obtained with a final activity yield of 40%.
  • Ecalin-producing SP2 / 0 cell culture supernatant (2,000 ml) was diluted with twice the volume of water, adjusted to pH 5.0 with 1M citric acid, and filtered with a 0.45 im filter to obtain a sample. This sample was applied to a Macro-Prep High S Support (20 ml: Bio-Rad Laboratories) column equilibrated with 20 mM citric acid ( ⁇ 50) buffer at a flow rate of 4 ml / min.
  • elution was performed at a flow rate of 4 ral / min with a salt concentration gradient of 210 ml from OmM to lOOOOraM NaCl / 20 mM citrate (pH 5.0).
  • the ecarin-eluting fraction was identified by Western plot using the anti-ecarin antibody obtained in Example 11, and after pooling, the buffer was added to a 20 raM sodium bicarbonate (pH 9.0) buffer containing 50 mM NaCl. Dialysis was performed.
  • the dialyzed product obtained by the cation exchange chromatography in 1) was applied to a sulfated cell mouth fine (2 ml: Seikagaku Corporation) column equilibrated with a 20 mM sodium hydrogen carbonate buffer (pH 9.0) containing 50 mM NaCl. It was applied at a flow rate of 0.5 rnl / min. After washing the column with 11 ⁇ 21 of the above buffer, elution was performed at a flow rate of 0.5 ral / rain with a 20 ml salt gradient of 50 raM to 600 mM NaCl / 20 raM sodium bicarbonate (pH 9.0). Using a part of the fraction, ecarin-eluted fractions were identified by Western blot using the anti-ecarin antibody obtained in Example 11, and then pooled.
  • the fraction containing the recombinant ecarin obtained by the chromatography method shown in 2) was gel-filtered by equilibration with 10 mM phosphate (pH 7.0) buffer containing 100 mM NaCl.
  • the solution was applied to HiLoad 16/60 (Pharmacia) and fractionated at a flow rate of 0.5 ml / min.
  • a marker for Bio-Rad genole filtration was used.
  • Fig. 3 shows a pattern stained with Coomassie brilliant pull after performing SDS-PAGE in the presence of (Fig. 2).
  • thrombin and ecarin activities measured in the above Examples were based on the following description.
  • Thrombin activity was measured by the following method.
  • the activity of ecarin was measured by the following method.
  • ecarin derived from snake venom commercially available from Sigma was diluted with Buffer I to prepare 25 mU / ml, 12.5, 6.25, and 3.125 mU / ml. 20 l of this standard solution was added instead of the sample (trypsin solution was not removed), and the subsequent operations of removing prothrombin were performed in the same manner as described above.
  • the expression level of recombinant thrombin is about 25 / ig / tnl, This time, the expression system of thrombin constructed by the present invention, of about 150 ⁇ ⁇ ⁇ 1, It is an excellent expression system that greatly exceeds the conventional expression level.
  • the present inventors have succeeded in producing recombinant ecarin as an activating enzyme, and thus have established a safe and excellent method for producing human thrombin excluding blood-derived components.

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Description

明 細 書
遺伝子組換え技術によるヒ トトロンビンの製造方法
技術分野
本願発明は、 医療用医薬品の分野に属し、 詳細には止血剤として使用され得る トロンビンに関する。 さらに詳細には、 遺伝子組換え技術を駆使して調製される 遺伝子組換えト口ンビン及びその製造方法に関する。
背景技術
トロンビンは止血血栓の形成や創傷治癒などの生命の維持進展に不可欠な作用 を有するトリプシン様セリンプロテアーゼである。 トロンビンにはメイゾトロン ビン、 α—トロンビン、 3—トロンビン、 γ—トロンビンが存在するが生理的に は Q! _トロンビンが重要である。 トロンビンの前駆体であるプロトロンビンはビ タミン K依存的に肝細胞で生合成され、 その血中濃度は 100 - 150 /i g/mlである。 ビタミン K依存性凝固因子は N末に Glaを含む領域 （Glaドメイン） を有し、 Ca2 + イオンを介してリン脂質と結合する性質を有する。 この Glaドメィンが Ca2 +と結 合するとタンパク全体の高次構造の変化が起こり、 捕助因子と相互作用する重要 な機能を発現することがわかっている。
プロトロンビンは細胞膜リン脂質上での FXa-FVa複合体により活性化反応を受 け、 プロトロンビンの Arg320- ILe321結合が限定分解を受け、 Glaドメィンゃクリ ングルドメインをもったメゾトロンビンが形成される。 次いで Arg271-Thr272結 合が限定分解され 一トロンビンが生成され細胞膜から遊離し、 多くの血漿タン パクや種々の細胞膜のト口ンビン受容体を限定分解して多様な生理活性を示す。
一トロンビンは A鎖と B鎖からなる 2本鎖分子であるが、 酵素活性に重要な B鎖 がさらに自己消化されると ]3—トロンビン、 γ—トロンビンとなりフィプリノー ゲンや血小板の活性化能を失う。
生成されたト口ンビンの多くはフイブリン血栓に結合して局所におけるより大 きな血栓の形成に関わる。 α—トロンビンはフィプリノーゲンをフイブリンに変 換させる酵素であるとともに、 FXIIIを活性化してブイブリンを架橋結合させる 引き金でもある。 さらに、 それぞれ FIXや FXaの捕助因子である FVIIIや FVを活性 化して凝固を進行させる凝固促進機能をもつ。 このように、 トロンビンは止血作 用においては重要な役割を果たすことから止血剤としては極めて有用なタンパク である。
一方、 トロンビンは血管内皮細胞上のト口ンボモジュリンと結合するとその基 質特異性が変化して、 プロティン Cを活性化することにより抗凝固を促進するよ うになる。 このトロンビンの酵素活性を利用して、 抗凝固剤である活性化プロテ イン Cをつくるためのプロセスェンザィムとしても利用されている有用なタンパ クである。 さらに、 α—トロンビンは強力に血小板を凝集、 活性ィ匕させるほか、 マイトジェン作用も有する。 このように a—トロンビンは多彩な生理作用を有す ることから、 種々の研究分野の試薬としても利用されており、 今後もその利用度 は一層増加していくものと考えられる。
このような機能を有するトロンビンは止血剤、 プロセスェンザィム、 研究用試 薬としてこれまで広く利用されている。 例えば、 上部消化管出血に対しては血液 由来のトロンビンが內視鏡的に出血患部に散布されたり、 経口的に投与されて止 血効果が認めれている。 さらに、 組織の接着剤として使用されているフィプリン 糊には、 フイブリノ一ゲンや FXIII因子とともに血液由来のトロンビンが含まれ ている。
発明の開示
(発明が解決しようとする技術的課題）
し力 しながら、 これらのトロンビンはヒト血液またはゥシ血液から分離された トロンビンであるため、 それらの原料となる血液中に由来する因子で、 ヒ トに悪 影響を及ぼすと考えられる様々な危険因子が含まれている。 例えば、 HAV, HBV, HCV, HEV, TTVなどの肝炎を引き起こすウィルス、 HIVなどの免疫不全症を引き起 こすウィルス、 CJD などを引き起こす異常プリオンなどが含まれる危険性が存在 する。 事実、 これらの危険因子が混入した血液製剤による薬害は大きな社会問題 となった。 更にこれらヒトまたはゥシ由来の血液は生体材料であることから、 常 に安定に供給される保証はない。 このことは、 特に医薬品としては極めて重要で 深刻な問題であり、 早急に解決すべき課題と考えられる。
また、 従来の方法はトロンビンの前駆体であるプロトロンビンを血液由来の FXaで活性化してト口ンビンをつくる方法であるため、 この活性化の過程で血液 由来の酵素 FXaを使用している。 ト口ンビンの前駆体を組換え技術でつくっても、 その活性化酵素に血液由来の F¾を使っては、 血液成分から危険性を逃れること は出来ない。 更に FXaを組換え技術でつくるためには、 その前駆体である Xを耝換 え技術でつくり、 それを FIXaで活个生化しなければならない。 その FIXaを組換え技 術でつくるには、 その前駆体である IXを組換え技術でつくり、 それを活性化しな ければならない。 このように凝固反応のカスケ一ド反応に関わる上流の酵素まで 遡って組換え技術で作製しなければ、 血液由来の危険性を排除したト口ンビンは 得ることが出来ない。
これら従来のトロンビンおよびその活性化酵素の原料となる血液に由来する危 険性と限界とを考慮すれば、 より安全で安定な供給が可能な原料や方法が期待さ れる。 そのような背景を下に、 これまでに微生物や動物細胞を宿主としたトロン ビンの発現が報告されて ヽる。
しかしながら、 それら従来の方法では、 例えば、 大腸菌では発現されたトロン ビンはインクルーションボディという凝集体を形成してしまい回収が困難である。 つまり、 凝集体を可溶ィ匕させ、 それを機能的なタンパクとして再構成 （リフォー ルディング） させる効率は極めて低く、 産業上のメリットはない （J. Biol. Chem. 270， 163-169, 1995) 。 又、 ハムスターの培養細胞を利用した発現系では、 トロ ンビンの発現量が低いため実用的ではない （Protein exp. purif. , 10, 214-225， 1997) 。 しかも、 いずれの場合も発現されたトロンビンは前駆体であるため、 そ の活性化には FXaなどの活性化酵素を利用しなければならないが、 それらの活性 化酵素は組換え酵素ではないため血液成分の排除は未だ実現されていない。 この ように従来の技術では安全なヒトトロンビンを安定にしかも経済的なコストで供 給することは困難であった。
(その解決方法）
そこで、 本願発明者は上述の諸問題を鑑み鋭意検討した結果、 安全で経済的な ヒトトロンビンの製造方法をもたらす本願発明を完成することに成功した。 つま り、 ヒトトロンビン前駆体遺伝子やその活性化酵素遺伝子を強力なプロモーター であるベータァクチンプロモーター下流に結合させたプラスミドを構築し、 それ ら遺伝子を動物細胞に導入してそれぞれの高発現系を組み立てることによって、 従来技術では達成出来なかった大量かつ安定なトロンビンとその活性化酵素の供 給し、 それらを糸且み合わせることによって従来にはない安全で大量の活性化した ト口ンビンを供給することに成功した。
図面の簡単な説明
図 1 プレトロンビン一 2産生 S P 2ノ0培養上清からのプレトロンビン一 2 の精製各ステップにおけるフラクションについて S D S— P AG Eを行い、 タン パク染色を行ったものである。
図 2 ェカリン産生 S P 2 / 0培養上清からェカリンの精製を行い、 最終ステ ップのゲルろ過におけるフラクションについて S D S— P AG Eを行い、 タンパ ク染色を行ったものである。
発明を実施するための最良の形態
前述のようにプロトロンビンは Glaドメイン、 タリングルドメイン、 セリンブ 口テアーゼドメィンから成り、 その Gla、 クリングノレドメィンでは翻訳後の修飾 が起こり、 これがタンパク産生の律速となる可能性がある。 又、 トロンビンが生 物学的活性を発揮するには、 A鎖、 B鎖から成る a—トロンビンが最小サイズの活 性化体であることから、 この A- B鎖から成る一本鎖タンパクであるプレトロンビ ンー 2 (以下、 プレトロンビンと称することがある） をコードする遺伝子を発現 に用いた。 このプレトロンビン遺伝子を用いることで raRNAサイズがプロトロンビ ンの場合より小さくなることから、 プロトロンビンよりも効率的な転写 ·翻訳が 期待できる。
具体的には、 ヒト肝臓から分離された mRNAを铸型として cDNAを合成し、 プロト 口ンビン遺伝子の配列をもとに設計したプラィマーを利用して、 PCR法によりプ 口トロンビン遺伝子を増幅した。 更にその増幅されたプロトロンビン遺伝子を铸 型にして、 目的とするプレトロンビン一 2遺伝子を増幅した。 動物細胞を宿主と した高発現べクターとしては、 特段の制約はないが、 最適実施態様として本願発 明者等が既有するュヮトリ ァクチンプロモーター系発現プラスミド pCAGG
(特開平 3— 1 6 8 0 S 7 ) を更に改良したベクターに、 上記プレトロンビン遺 伝子を挿入したプラスミドを構築した。 ここで用いるリーダー配列等は本来のト 口ンビン遺伝子やそれ以外の遺伝子由来の配列を利用することも可能である。 構 築された発現プラスミドを動物細胞に導入した結果、 従来の報告にはない高い発 現量を示す動物細胞を得ることが可能となった。 ここで用いる宿主としての動物 細胞としては、 ハムスター由来、 マウス由来、 ヒ ト由来等の培養細胞を広く利用 することができ、 好適にはチャイニーズノヽムスター卵巣細胞（C HO細胞）、 マウ スミエロ一マ細胞、 B HK 2 1細胞、 2 9 3細胞または C O S細胞等が例示され る。
更に、 本願発明者等はト口ンビンの活性化酵素として従来から使用されている FXaを同様の機能を有するェカリンに換え、 しかも好適にはそのェカリンを組換 ぇェカリンとして、 上記プレトロンビンと同様に我々の高発現系でつくることに 成功した。
ェカリンは Ec ?is car 7a "sより単離精製された （T. Morita等： J. Biochem. 83, 559-570, 1978) 蛇毒由来のプロテアーゼで、 プロトロンビンを特異的に活 性化することが知られている。 ェカリンをコードする cDNAは S. Nishida等により クローユングされ (Biochemistry , 34, 1771-1778, 1995) その構造が明らかと なつた。 このェカリンは糖タンパク質で、 成熟型は総ァミノ酸残基数 426、 Zn2+ キレ-トのほか、 disintegrinドメインや Cys-richドメインを含み、 RVV- X
(Russell's viper venom X ァクチべ一ター） の H鎖との間に 61°/。の相同配列を 持つモザイク構造からなる金属プロテアーゼである。 また、 その酵素活性は EDTA で失活し、 アンチトロンビン IIIで阻害を受けないことから、 FXaとは全く異なる 酵素である。 同じように FXaと同様の作用を示す活性化酵素はェカリン以外にも 利用することは可能であると考えられる。
ェカリンはその前駆体がトリプシンゃプラスミン等のプロテアーゼによって活 性化された後に、 トロンビンを活性化する作用を発揮する。 従って、 トロンビン の活性ィ匕にはェカリン前駆体からトリプシン等の活性ィヒ反応が必要とされている 力 我々の今回の技術によってトリプシン等を用いることなく糸且換えェカリンの 精製過程でこの活性ィ匕も可能とした。
具体的には、 プレトロンビンの場合と同様にェカリン遺伝子を PCR法により増 幅して、 ニヮトリ）3—ァクチンプロモーター系発現プラスミド pCAGG由来の発現 ベクターに結合したプラスミドを構築した。 それらのプラスミドを導入された動 物細胞は目的のェカリンを充分量発現することが可能であった。 ここで用いる動 物細胞としては、 トロンビンの場合と同様に、 ハムスター由来、 マウス由来、 ヒ ト由来等の培養細胞を広く利用することが可能である。
得られた培養上清をイオン交換クロマトグラフィーやゲル濾過方法により精製 した結果、 トリプシン等の活性化酵素を用いることなく、 ェカリンは活性化した タンパクとして分離されることが可能となった。 つまり、 動物細胞で発現された ェカリンは、 本願発明者等の工夫によって精製と活性化の両過程を同時に行うこ とが可能となった。 ェカリン以外の活性化酵素の場合でも、 その工夫によって同 様の技術と成果が可能と考えられる。
このようにして得られた組換えェカリンを利用して、 上記の組換えプレトロン ビンを基質として活性化した後、 トロンビンに特異的に反応することが知られて いるヒルジンペプチドとの親和性クロマトグラフィー、 好適にはヒルジンべプチ ドを固定化したカラムクロマトグラフィーによつて組換え α—トロンビンを高純 度に精製することができる。 トロンビンの精製法としては、 その他種々のクロマ トグラフィーを組合せた方法も可能である。
精製された組換え α—トロンビンを血液由来の天然型 α—トロンビンと比較し た結果、 両者は同様の性質を示すことから、 本願発明者が作製した組換えひ一ト ロンビンは天然に存在するひ一トロンビンに極めて近いタンパクと言うことが出 来る。
以上の如く、 トロンビンとェカリンの双方の前駆体だけを組換え技術で作製す ることによって、 その他の酵素を必要とせずに活性化されたヒトトロンビンを製 造することに成功した。
以下に、 実施例を挙げて本願発明を具体的に説明する力 本願発明はこれらの 例に何ら限定されるものではない。 なお、 以下に示す調製例及び実施例では、 特 に断りのない限り、 フアルマシア、 バイオラッド、 和光純薬、 宝酒造、 東洋紡お よび New England BioLabs社製の試薬を使用した。
実施例 1
(発現プラスミドの構築）
( 1 ) 発現プラスミド pCAGG- Sl (Sal)の構築 ニヮトリ 一ァクチンプロモーター系発現プラスミド pCAGG (特開平 3—1 6 8 0 8 7 ) を制限酵素 EcoR Iで消化し、 T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した後、 リン酸化 Xho Iリンカ一存在下、 T4 DNAリガーゼで連結環状ィ匕した pCAGG (Xho)を 構築した。 この pCAGG (Xho)を制限酵素 Sal Iで消化し、 T4 DNAポリメラ一ゼで平 滑末端化した後、 T4 DNAリガーゼで連結環状化した pCAGG- Pv2を構築した。 この pCAGG- Pv2を制限酵素 Xho Iで消化した後、 S1ヌクレアーゼ処理を行うことで Xho I認識配列近傍の塩基を若干削り込んだ。 ヌクレアーゼ処理の後、 dNTP存在下、 T4 DNAポリメラーゼで一本鎖部位を修飾した後、 リン酸化 Sal Iリンカー存在下、 T4 DNAリガーゼで連結環状化した pCAGG- SI (Sal)を構築した。
( 2 ) 発現プラスミド pCAGG- SI (Sal) · dhfrの構築
DHFR遺伝子を持つ発現プラスミド pSV2_dhfr (S. Subramani et. al. , Mol.
Cell. Biol. , 1, 854- 864p， 1981) を制限酵素 Bgl IIで消化した後、 T4 DNAポリ メラーゼで平滑末端化し、 T4 DNAリガーゼで連結環状化した pSV2 - dhfr- Bgnを構 築した。 さらにこの pSV2- dhfr - Bgnを制限酵素 Pvu IIで消化した後、 リン酸化 Bgl IIリンカー存在下、 T4 DNAリガーゼで連結環状化した pSV2- dhfr- BgBを構築した。 この pSV2- dhfr- BgBを制限酵素 Bgl II及ぴ BamH Iで消化した後、 ァガロースゲル 電気泳動により約 1. 7 kbpの断片を取得した。 上述の pCAGG- SI (Sal)を制限酵素 BamH Iで消化した後、 この 1. 7 kbp断片と T4 DNAリガーゼで連結環状化した pCAGG-Sl (Sal) . dhfr を構築した。
( 3 ) 発現プラスミド pCAGG- SI (Sal) . dhfr. neoの構築
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ （neor) の発現プラスミド pMClneo-polyA (K. R. Thomas et. al. , Cell, 51» 503-512p, 1987) を制限酵素 Xho Iで消化した後、 リン酸化 BamH Iリンカ一存在下 T4 DNAリガーゼを用い連結 環状化した pMClneo- 2Bを構築した。 この pMClneo- 2Bを制限酵素 BamH Iで消化し、 ァガロースゲル電気泳動により約 1. 1 kbpの断片を取得した。 上述の pCAGG -
SI (Sal) , dhfrを制限酵素 BamH Iで消化した後、 この約 1. 1 kbpの断片と T4 DNAリ ガーゼで連結環状化した pCAGG- SI (Sal) . dhfr. neoを構築した。
( 4 ) 改良型 DHFRの発現プラスミド pSV2- mdhfrの構築
DHFRの cDNAをコードする発現プラスミ ド pSV2- dhfrをテンプレートにして下記 の様な PCR反応を行つた。 プライマー 1及びブライマ一 2の組合せ、 及ぴプラィ マー 3及びプラィマー 4の組合せで 1回目の PCR反応を行った。
プライマーの配列は以下に示した [配列番号 1〜4 ] 。
プライマー 1 ： 5，- AAAAGCTTGCCATCATGGTTCGACC [配列番号 1 ]
プライマー 2 ： 5， - CGGAGGCCMGGCCTGTCTCCGTTCTTGCCMTCCC [配列番号 2 ] プラィマー 3 ： 5'-AACGGAGACAGGCCTTGGCCTCCGCTCAGGAACGAG [配列番号 3 ] プライマー 4 ： 5 -GGGGATCCTGTTAGTCTTTCTTCTCGTAGAC [配列番号 4 ]
5 ngのテンプレートとそれぞれ 100 pmolのプライマーを用いて Pyrobest DNA polymeraseによる増幅を 25サイクル行った。 PCR反応は酵素の取扱説明書に準じ て行った。 増幅した DNAフラグメントを 1%ァガロースゲル電気泳動により精製を 行った。 次に、 プライマー 1、 2で増幅した DNAフラグメントとプライマー 3、 4で増幅した DNAフラグメントを約 20 ngずつを混合し、 これをテンプレートにし てプライマー 1及びプライマー 4を用いて同様の PCR反応を行った。 プライマー の塩基配列は以下に示した。 この PCRにより、 DHFRのアミノ酸の 23番目の口イシ ンをアルギニンに変換する核酸変異を導入した。 増幅した DNAフラグメントを制 限酵素 Hind III-BamH Iで消化した後、 1%ァガロースゲル電気泳動により約 0. 6 kbpの DNAフラグメントを抽出した。 この DNAフラグメントとサブク口一二ングプ ラスミ ド pUC19を制限酵素 Hind III-BaraH Iで消化したものとを T4- DNAリガーゼ で連結環状化した PUC- raDHFRを構築した。 このプラスミドについて DNA塩基配列の 確認を実施して、 目的の変異が正確に導入されていることと他の塩基配列に誤り がないことを確認した。 塩基配列を確認したプラスミドに関し、 制限酵素 Hind III-BamH Iで再度消化し、 ァガロースゲル電気泳動により約 0. 6 kbpの変異導入 DHFR遺伝子をコードする DNAフラグメントを抽出した。 前述の PSV2- dhf rを制限酵 素 Hind III-Bgl IIで消化した後、 約 3 kbpの DNAフラグメントをァガロースゲル 電気泳動により抽出し、 これと変異型 DHFRをコードする前述の DNAフラグメント とを T4 - DNAリガーゼで連結環状化した pSV2 - mdhfrを構築した。
( 5 ) pCAGG-Sl (Sal) . mdhfrの構築
pSV2- mdhfrを制限酵素 Pvu IIで消化し、 リン酸化 Bgl IIリンカ一存在下 T4 - DNA リガーゼで連結環状化した pSV2-radhfr- BgBを構築した。 このプラスミ ドを制限酵 素 Bgl II-BamH Iで消化し、 mDHFRの発現カセットをコードする約 1. 7 kbpの DNAフ ラグメントをァガロースゲル電気泳動で抽出した。 （1 ) で調製した
pCAGGSl (Sal)を制限酵素 BamH Iで消化した後、 この 1. 7 kbp断片と T4 DNAリガー ゼで連結環状化した pCAGG- SI (Sal) . mdhfrを構築した。
実施例 2
(ヒ トプレトロンビン一 2遺伝子の調製）
ヒ ト肝臓 mE A (サヮデーテクノロジ一社） を铸型に常法によりオリゴ dTをプラ イマ一として逆転写酵素を用いた 1st strand cDNA合成を行った （T- Primed First Strand Kit；アマシャムフアルマシア社製） 。 この cDNAをもとに以下のプ ライマーを設計し PCR反応に用いた。 プライマーは以下のプロト口ンビン N末端側 に相当する遺伝子のプライマーとして 5' - ATGGCGCACGTCCGAGGCTTGCAGCTGCCT (PT1 ; 配列番号 5 )、 C末端側に相当する遺伝子のプライマーとして 5' - CTACTCTCCA CTGATCAATGACCTTCT (PT2; 配列番号 6 ) を用いた。 PCR反応は Pyrobest DNA polymeraseを用い、 本酵素の取扱い説明書に準じた方法で 30サイ クルで遺伝子増幅を試みた。 以下の PCR反応も同様の手技に準じた。
このプロトロンビン cDNAをもとにプレトロンビン一 2の遺伝子を調製した。 以 下にあげた様なプライマーを合成し、 プロトロンビン cDNAをテンプレートとして PCR反応を行った。 使用したプライマーの塩基配列は以下の通りである [配列番 号 7〜1 0 ]。
プライマー 1； 5'-AAGAATTCGTCGACCACCATGGCGCACGTCCGAG [配列番号 7 ] プライマー 2； 5， - TCTTCTCACTCTCTGGAGCAGCGACCG [配列番号 8 ]
プラィマー 3； 5 -ACCGCCACAAGTGAGTAC [配列番号 9 ]
プライマー 4； 5 -AAGAATTCGTCGACCTACTCTCCAMCTG [配列番号 1 0 ]
プライマー 1及び 2を用いて増幅を行うことで、 プロトロンビンのプレプロリ ーダー配列部位をコードする DNAを増幅した。 この際に開始コドン部位へ Kozakの 共通配列が導入されるような変異を施し、 さらに上流に制限酵素 Sal I及び EcoR Iの認識部位を導入した。 さらに、 プライマー 3及ぴ 4を用いて増幅を行うこと でプロト口ンビン翻訳領域の C末端側にあたるセリンプロテアーゼドメインをコ 一ドするプレトロンビン一 2遺伝子を増幅した。 この際に終止コドン下流に制限 酵素 Sal I及び EcoR Iの認識部位を導入した。 プライマー 2及び 3は PCR反応の前 に T4ポリヌクレオチドキナーゼ処理を行い、 5，-末端をリン酸化し、 PCR反応にて 遺伝子の増幅を行った。 増幅されたフラグメントを 1%ァガロースゲル電気泳動で 抽出した後、 プレプロリーダー配列部位をコードする DNA及ぴプレトロンビン一 2部位をコードする DNAをほぼ当量混合し、 T4 DNAリガーゼで結合させた。 この 後、 この混合物をテンプレートにして、 プライマー 1とプライマー 4で PCR増幅 を再度行い、 増幅した DNAのうちァガロースゲル電気泳動で約 1. 1 kbpの DNAを抽 出することでプレプロリーダーをコードする DNA酉己列とプレトロンビン一 2をコ 一ドする DNA配列が結合されたものを取得した。 この遺伝子の末端を制限酵素 EcoR Iで消化した。 サブクローユングプラスミド PTZ18R (フアルマシア） を制限 酵素 Sac I及ひ st Iで消化した後、 Mung bean nucleaseを作用させ平滑末端とし、 T4 DNAリガーゼで連結環状化した ΡΤΖ Δ ScPtを構築した。 この ρΤΖ Δ ScPtを制限酵 素 EcoR Iで消化し、 前述のプレトロンビンをコードするフラグメントと T4 DNAリ ガーゼで連結環状化した PTZ. ΡΤを構築した。 このプラスミドを常法により DNA塩 基配列を確認し、 プロトロンビンのプレプロリーダー配列部位とプレトロンビン 部位とをコードする DNAが同一フレームで翻訳されることを確認した。 以下、 こ のプレプロリーダー配列を導入したプレト口ンビン遺伝子をプレトロンビン構造 遺伝子 （配列番号 1 1 ) と呼ぶ。
実施例 3
(ヒ トプレトロンビン一 2発現プラスミ ドの構築）
実施例 1にあげた pCAGG-Sl (Sal) , dhfr. neo及び pCAGG- SI (Sal) , radhfrヘプレト 口ンビン構造遺伝子を導入した。 pCAGG- SI (Sal) . dhfr. neo及び pCAGG- SI (Sal) . mdhfrをそれぞれ制限酵素 Sal Iで消化した後、 仔ゥシ小腸由来ァノレ力リ ホスファタ一ゼで脱リン酸化した。 前述の pTZ. ΡΤを制限酵素 Sal Iで消化し、 プ レトロンビン一 2構造遺伝子をコードする約 1. lkbpの断片をァガロースゲル電気 泳動により精製した。 脱リン酸化したプラスミドとプレトロンビン一 2構造遺伝 子をコードする断片とを T4 DNAリガーゼで連結環状化した pCAGG-Sl. PL dhfr. neo と pCAGG - SI. PT. mdhfrを構築した。
害施例 4 (動物細胞を用いたヒ トプレトロンビンの発現）
実施例 3にあげたプレト口ンビン発現プラスミドを用いて CHO DG44 (G.
Urlaub et al. , Somatic cell. Mol. Genet. , 12, 555— 566p， 1986、 以下 CHO) 細胞及ぴ SP2/0 Agl4 (M. Shulraan et al. , Nature, 16, 269- 270p， 1978、 以下 SP2/0) 細胞を形質転換した。 CHO細胞に関して、 pCAGG- Sl. PT. dhfr. neoを、
SP2/0細胞に関して pCAGG- SI. PT. mdhfrを用いた。 CH0細胞はリン酸カルシウム法 変法 (C. Chen et al. , Mol. Cell. Biol. , 7, 2745- 2752p, 1987) で、 SP2/0細 胞は Electroporation法で形質転換を行った。
形質転換に用いた発現プラスミドは制限酵素 Pvu Iで消化することであらかじ め線状化した。
また、 ここでのプレトロンビンの定量は抗ヒ ト -トロンビン抗体を用いたサン ドィツチ ELISA法で行った。
( 1 ) CH0細胞を用いた産生能評価
CH0細胞は以下のようにして形質転換から形質転換体の選択を行った。
形質転換の前日に細胞を 10cmディッシュに 5xl05 cells/ディッシュの細胞密度 で 10。/。ゥシ胎児血清 （FCS、 GIBC0-BRL社製） を含む核酸含有 MEMアルファ培地
(GIBC0-BRL社製） を用い播種した。 37°Cで一夜培養の後、 20 /x g/mLの線状化し た発現プラスミドじ 66-31. ?1\ 0111 . 060を用ぃ形質転換を行った。 35°C、 3 C02 培養装置で一夜培養した後、 ダルベッコ PBS (―) で細胞を洗浄した後、 10%透析 FCS及ぴ 500 μ g/raLの Geneticin (GIBCO- BRL社製） を含む核酸不含 MEMアルファ培 地に培地交換した。 3〜4日毎に培地を交換しながら 37°C、 5 %∞2培養装置で培 養を続けることで選択を行い、 出現した形質転換体をプールし産生能の評価を行 つた。
形質転換細胞を 2x 105 eel 1 s/mLの密度で 10°/。透析 FCSを含む核酸不含 MEMアルフ ァ培地で播種し、 一夜培養した。 翌日培地を、 血清を含まない YMM培地 （インシ ュリン ' トランスフェリン ·エタノールァミン■亜セレン酸ナトリゥムを含むァ ミノ酸■ビタミンを強化した核酸不含 MEMアルファ培地） に交換した。 37°C、 5 %C02培養装置で 7日〜10日間培養後、 上清中のプレトロンビン濃度を測定した。 上清中に 20 // g/raLのプレトロンビンが確認できた。 この細胞を 100 nmol/Lのメ ト トレキセート （MT X、 和光純薬工業製） ■ 10%透析 FCS及び 500 μ g/mLの Geneticinを含む核酸不含 MEMアルファ培地を用い、 3〜4日間おきに培地交換を行 いながら約 14日間培養を行った。 その後、 細胞を希釈継代し、 500 nraol/Lの ΜΤΧ · 10%透析 FCS及ぴ 500 μ g/raLの Geneticinを含む核酸不含 MEMアルファ培地に 培地交換してさらに約 14日間培養を行うことで遺伝子増幅を行った。 得られた細 胞をプールした後、 同じ培地で 96wellプレートに 0. 5個/ we 11の濃度で 200 μ L/wellずつ播種することで限界希釈によるクロー二ングを行った。 得られたクロ ーンをクローン毎に産生能評価を行った。 各クローンを 2xl05 cells/mLの密度で 10%透析 FCSを含む核酸不含 MEMアルファ培地を用い播種し、 一夜培養した。 翌日 培地を、 丽培地に交換した。 37°C、 5 %C02培養装置で 7日〜 10日間培養後、 上 清中のプレトロンビン濃度を測定した。 得られたクローンのうち、 クローン # 10 は上清中に 90 ^ g/raLのプレトロンビン一 2を、 クローン # 72は 110 /i g/raLのプレ ト口ンビン一 2を発現していた。
( 2 ) SP2/0細胞を用いた産生能評価
SP2/0細胞は以下のようにして形質転換体から形質転換体の選択を行った。
SP2/0細胞を冷却したダルベッコ PBS (―) で 2回洗浄した後、 PBS (—） 0. 8 mL に懸濁した 107個の細胞を Electroporation用キュベット （電極幅 0. 4 cra、 BIO- RAD社製） に入れた。 前述の線状化した発現プラスミド 40 を加えピペットで 混合した。 Gene Pulser II (BIO- RAD社製） を用い、 0. 22 kv、 975 /^で1回パル スを加えた。 キュベットを氷上 10分間冷却した後、 細胞懸濁液を 10%ゥシ胎児血 清 （FCS) を含む核酸含有 MEMアルファ培地で約 5, 000個 /δθ Lとなるように希釈 し、 wellプレート 5枚に 50 /x L/wellずつ播種し、 35°C、 3%C02培養装置で一夜 培養した。 翌 0 10%透析 FCSを含む核酸不含 MEMアルファ培地を 50 μ L/well添加し さらに一夜培養した。 翌日 10%透析 FCS及び 100 nmol/L または 200 nmol/Lの MT Xを含む核酸不含 MEMアルファ培地を 100 z L/well添加した。 10日〜 14日間培養 の後、 出現した形質転換体を well毎に産生能評価を行った。 細胞を約 4xl05 cells/mlの密度で 2%透析 FCSを含む核酸不含 MEMアルファ培地を用い播種し、 24時 間培養後、 上清中のプレトロンビン一 2濃度と細胞密度を測定し、 単位細胞あた り単位時間あたりのプレトロンビン産生能で評価した。 各形質転換体は 2〜 10 μ g/day/106 cellsの産生能を持っていた。
これらの細胞のうち産生能が高かつたものを選び、 10%透析 FCS及び 1 μ mol/L の MTXを含む核酸不含 MEMアルファ培地で約 14日間培養を行つた。
得られた MTX耐性細胞について、 YMM培地を用レ、無血清培地への順応化を行つた。 YMM培地に透析 FCSを 2%添加し増殖を確認した後、 添加する血清濃度を 0. 5%—
0. 1%と低下させながら培養を行った。 細胞の増殖性が良好であることを確認した 後、 血清を全く含まない Y M培地で培養を行い、 増殖を確認したうえで、 YMM培地 を用い上述の方法で産生能評価を行った。 得られた形質転換体のうち # 32は 15 μ g/day/106 cellsの産生能を持っていた。 この # 32について YMM培地を用い 3xl05 cells/mLの密度でディッシュに播種し、 約 7日間培養を行い、 上清中に発現した プレトロンビン濃度を測定した。 # 32は約 150 μ g/mLのプレトロンビンを上清中 に発現していた。
実施例 5
(プレトロンビン産生細胞の大量培養）
実施例 4に示した、 無血清培地に順応化したプレト口ンビン産生細胞 # 32をス ピナ一フラスコ培養した。 細胞を拡張の後、 YMM培地を用い 250 mLスピナーフラ スコ （Techne社製） に 2xl05 cells/raLの密度で 250 mL培養した。 細胞が lxlO6 cells/mLを超える密度で細胞を 1 Lスピナ一フラスコに拡張培養した。 さらにこ の細胞の増殖を確認した後、 細胞を 1 Lスピナ一フラスコ 5本に拡張した。 細胞を 約 7 3間培養した後、 上清に発現したプレトロンビン濃度を測定した。 約 100 μ g/mLのプレト口ンビン一 2の発現が確^ ^できた。
実施例 6
(蛇毒ェカリン cDNAの調製）
ェカリン cDNAは文献 （S. Nishida et. al.， Biochemistry, 34, 1771-1778 p, 1995) に報告されている配列のものをテンプレートに用い、 PCRを用いて両端に 制限酵素 Xho Iの認識部位を導入した。 この遺伝子を制限酵素 Xho Iで消化した後、 PUC18にサブクローユングした plTC. ECを構築した。 このプラスミドを常法により ェカリン cDNA部分の DNA塩基配列を確認した、 開始コドンから終止コドンまでが 文献通りの配列を持ったェカリン cDNAを取得できた （配列番号 1 2 ) 。 実施例 7
(ェカリン発現プラスミ ドの構築）
実施例 1にあげた pCAGG-Sl (Sal) , dhfr. neoへェカリン cDNAを導入した。 pCAGG - SI (Sal) . dhfr. neoを制限酵素 Sal Iで消化した後、 仔ゥシ小腸由来アル力リホス ファタ一ゼで脱リン酸化した。 前述の pU ECを制限酵素 Xho Iで消化し、 ェカリ ン cDNAをコードする約 1. 8 kbpの断片をァガロースゲル電気泳動により精製した。 脱リン酸化したプラスミドとェカリン cDNAをコードする断片とを T4 DNAリガーゼ で連結環状化した pCAGG- SI. EC. dhfr. neoを構築した。
実施例 8
(動物細胞を用いたェカリンの発現）
実施例 7にあげたェカリン発現ブラスミド pCAGG- SI. EC. dhfr. neoを用いて CHO 細胞及び SP2/0細胞を形質転換した。 ェカリンの定量は、 プロトロンビンのトロ ンビンへの変換活性を、 市販の蛇毒由来ェカリン （Sigma社製） を標準品に用い て行った。 発現量は活性単位 (U/mL) で表した。
( 1 ) CH0細胞を用いた産生能評価
CH0細胞は以下のようにして形質転換から形質転換体の選択を行つた。 . 形質転換の前日に細胞を lOcraディッシュに 5xl05 cells/ディッシュの細胞密度 で 10%ゥシ胎児血清を含む核酸含有 MEMァノレファ培地を用い播種した。 37°Cで一 夜培養の後、 2ひ n g/mLの線状化した発現プラスミド pCAGG- SI. EC. dhfr. neoを用 い形質転換を行った。 35°C、 3%C02培養装置で一夜培養した後、 ダルベッコ PBS (―) で細胞を洗浄した後、 10%透析 FCS及ぴ 500 μ g/raLの Geneticinを含む核酸 不含 MEMアルファ培地に培地交換した。 3〜4日間毎に培地を交換しながら 37°C、 5 %C02培養装置で培養を続けることで選択を行い、 出現した形質転換体をブー ルし産生能の評価を行つた。
形質転換細胞を 2xl05 cells/mLの密度で 10%透析 FCSを含む核酸不含 MEMアルフ ァ培地で播種し、 一夜培養した。 翌日培地を、 血清を含まない YMM培地に交換し た。 35°C、 5 °/0C02培養装置で約 14日間培養後、 上清中のェカリン濃度を測定し た。 上清中に 10 U/mLのェカリンが確認できた。
( 2 ) SP2/0細胞を用いた産生能評価 SP2/0細胞は以下のようにして形質転換体から形質転換体の選択を行った。 SP2/0細胞を冷却したダルベッコ PBS (―) で 2回洗浄した後、 PBS (—） 0. 8 raL に懸濁した 107個の細胞を Electroporation用キュベット （電極幅 0. 4 ctn、 BIO- RAD社製） に入れた。 前述の線状化した発現プラスミド 40 // gを加えピペットで 混合した。 Gene Pulser II (BI0-RAD社製） を用い、 0. 22 kv、 975 / Fで 1回ノヽ。ノレ スを加えた。 キュベットを氷上 10分間冷却した後、 細胞懸濁液を 10%ゥシ胎児血 清 （FCS) を含む核酸含有 MEMアルファ培地で約 5, 000個 /50 Lとなるように希釈 し、 96wellプレート 5枚に 50 μ L/vrellずつ播種し、 35°C、 3°/。C02培養装置で一夜 培養した。 翌日 10%透析 FCSを含む核酸不含 MEMアルファ培地を 50 μ L/well添加し さらに一夜培養した。 翌日 1 mg/mLの Geneticin及び 10%透析 FCSを含む核酸不含 MEMアルファ培地を 100 L/well添加した。 10日〜 14日間培養の後、 出現した形 質転換体を well毎に産生能評価を行った。 細胞を約 3xl05 cells/mlの密度で 500 μ g/mLの Geneticin及び 2%透析 FCSを含む核酸不含 MEMアルファ培地を用い播種し た、 約 14日間培養後、 上清中のェカリン濃度を測定した。 各形質転換体は 2〜10 U/mLのェカリンを発現していた。 この中で産生能が高かった形質転換体を、 同じ 培地を用いて 96wellプレートに 0. 5個/ wellの濃度で 200 17«¾11ずつ播種するこ とで限界希釈によるクローユングを行った。 得られたクローンについてクローン 毎に産生能評価を行った。 各クローンを 3xl05 eel ls/mLの密度で核酸不含 MEMァ ルファ培地を用い播種し、 一夜培養した。 翌日培地を、 2%透析 FCSを含む YMM培地 に交換した。 35°C、 5 %C02培養装置で約 14日間培養後、 上清中のェカリン濃度 を測定した。 得られたクローンのうち、 クローン # 1H- 8は上清中に 15 U/raLのェ カリンを発現していた。
このクローン # 1H_8について、 YMM培地を用い無血清培地への順応化を行った。 YMM培地に透析 FCSを 2%添加し増殖を確認した後、 、添加する血清濃度を 0. 5%- 0. 1%と低下させながら培養を行った。 細胞の増殖性が良好であることを確認した 後、 血清を全く含まない丽培地で培養を行い、 増殖を確認したうえで、 YMM培地 を用い上述の方法で産生能評価を行った。 無血清培地に順応化したクローン # 1H - 8は 20 U/mLの産生能を持っていた。
実施例 9 (ェカリン産生細胞の大量培養）
実施例 8に示した、 無血清培地に順応化したェカリン産生細胞 # 1H- 8をスピナ 一フラスコを用いて浮遊培養した。 細胞を拡張の後、 YMM培地を用い 250 mLスピ ナーフラスコ （Techne社） に 2xl05 cells/mLの密度で 2δ0 mL培養した。 細胞が lxl06 cells/mLを超える密度で細胞を 1 Lスピナ一フラスコに拡張培養した。 さ らにこの細胞の増殖を確認した後、 細胞を 1 Lスピナ一フラスコ 5本に拡張した。 細胞を約 7日間培養した後、 上清に発現したェカリン濃度を測定した。 約 18 U/mL のェカリンの発現が確^ «できた。
実施例 1 0
(ヒルジンぺプチド固定化力ラムの作製）
ヒルジンはヒルより単離されたトロンビンの特異的なインヒビターである。 こ のヒ /レジンのァミノ酸配列から配列番号 1 3に示すぺプチド Lys- Gly- Asp- Phe - Glu-Glu- lie - Pro- Glu- Glu_Tyr- Leu- Gluをペプチド合成機 （アプライド社） を用 いて合成した。 このぺプチド 10mgをチッソ社製のホルミルセル口ファイン lmlに 対して、 添付文書の記載に従ってカップリングを行った。
実施例 1 1
(ェカリン部分ぺプチドに対する抗体の作製）
ェカリンの cDNAのァミノ酸配列をホップとゥッドの方法 （T. P, Hopp et al. Proc. Natl. Acad. Sci. Vol. 78 3824-3828, 1981) に従って親水性及ぴ疎水性の領域 を明らかにした後、 親水性の高い領域について配列表の配列番号 1 4に示す Lys- Asn-Asp - Tyr - Ser - Tyr - Ala- Asp-Glu- Asn - Lys- Gly - lie - Val Glu- Pro - Gly - Thr - Lys - Cysの配列を持つペプチドをペプチド合成機 （アプライド社製） を用いて合成し た。 このペプチド 500 μ §をフロイントの完全アジュバント存在下 目、 14日目 及ぴ 28日目にフロイント不完全アジュバント存在下、 ゥサギの皮内に接種するこ とで、 ェカリンぺプチドに対するポリクローナル抗体を作製した。 得られた抗体 がェカリンを認識するかどうかをウェスタンプロット法により確認した。 天然の ェカリンを 2—メルカプトエタノール非存在下 SDS- PAGEを行い、 泳動終了後、 ゲ ルをトランスファーバッファー（10mM N -サイク口へキシル -3-ァミノプロパンス ルホン酸、 10%メタノール、 pHll)に 5分間浸し、 あらかじめ 100%メタノールおよ びトランスファーバッファ一の順に浸しておいた PVDF膜（Imraovilon: Millipore 社）上に重ね、 TRANS- BL0TCELL (BI0- RAD社）を用いて 160mA、 I6時間転写を行った。 この膜を 5 %スキムミルクを含む 50mM Tris-HCl (pH8. 0) , 150mM NaCl, 0. 05% Tween 20 (TBST)でマスキングの後、 TBSTで 500倍希釈した合成ペプチド投与ゥサ ギの血清を室温で 1時間ィンキュベーション後 TBSTで膜を洗浄した。 次にこの 膜を 2000倍に希釈した抗ゥサギ: TgG-HRP標識抗体 （Bio- Rad社）と室温で 1時間反 応させ、 洗浄後コェカイムノスティニン HRP1000 (コニ力株式会社） キットを用い て染色を行った。 その結果、 この合成ペプチドを免役して得られた血清は、 ェカ リンに対して特異的に反応することが確認できた。
実施例 1 2
(組換えトロンビンの精製）
( 1 )陽イオン交換クロマトグラフィー
プレトロンビン一 2産生 SP2/0細胞の培養上清 2000mlを、 1Mクェン酸で PH6. 0に 合わせ 0. 45 μ ιηフィルター濾過したものを試料とした。 この試料を 20mMクェン酸 + 0. 05% PLUR0NIC F- 68 (pH6. 0)のバッファ一で平衡化した SPトョパール 550C
(20ml ： 東ソ一）カラムに 2ml/min.の流速でアプライした。 100mlの上記バッファ 一でカラムを洗浄後、 50raMから lOOOmMの NaCl/20raMクェン酸 (pH6. 0) 210mlの塩濃 度勾配で 2ml/rain.の流速で溶出を行った。 フラクションの一部を用いて、 シグマ 社の抗トロンビン抗体を用いたウェスタンプロットによりトロンビン溶出画分を 同定、 プール後， 0. 1M NaClを含む 20mM Tris- HC1 (pH8. 5)バッファーに対して
4°Cで 16時間透析した。
( 2 ) トロンビンの活性ィ匕
透析した SPトョパール 550Cプールフラタション 40mlに 1Mベンズァミジンを 25ml 加え、 さらに精製組換えェカリンを最終濃度 6. 5U/mlになるように添加し、 37°C で 16時間反応させた。
( 3 ) ヒルジンペプチド固定化カラムを用いた精製
( 2 )で得られたェカリン処理後の反応液を実施例 10の方法で作製したヒルジン ペプチドを固定化したゲル 10mlに対して、 lml/minでアプライした。 試料のァプ ライ後に 0. 5M NaClを含む 20mM Tris-HCl (pH8. 5)バッファー 50mlで洗浄後 1Mチォ シァン酸カリウムを含む 20mM Tris-HCl (pH8. 5)バッファ一 50mlで溶出を行つた。 以上のステップを経ることで、 最終活性収率 4 0 %で高純度の α—トロンビンを 得た。
これらの精製ステップで得られたフラクションについて 2 -メルカプトエタノー ル存在下で SDS- PAGEを行い、 ク一マシーブリ リアントブルー染色を行つた結果を 図 1に示す。
実施例 1 3
(ェカリンの精製）
1 )陽イオン交換クロマトグラフィー
ェカリン産生 SP2/0細胞の培養上清 2000mlを 2倍量の水で希釈後、 1Mクェン酸で pH5. 0に合わせ 0. 45 i mフィルター濾過したものを試料とした。 この試料を 20mMク ェン酸 （ρΗ5· 0)バッファーで平衡化した Macro-Prep High S Support (20ml : Bio-Rad Laboratories)カラムに 4ml/min.の流速でかけた。 150mlの上記バッファ 一でカラムを洗浄後、 OmMから lOOOraMの NaCl/20mMクェン酸 (pH5. 0) 210mlの塩濃度 勾配で 4ral/min.の流速で溶出を行った。 フラクションの一部を用いて、 実施例 11 で得られた抗ェカリン抗体を用いたウェスタンプロットによりェカリン溶出画分 を同定、 プール後， 50mM NaClを含む 20raM炭酸水素ナトリウム（pH9. 0)バッファ 一に対して透析した。
2 )陽イオン交換クロマトグラフィー
1 ) の陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた透析産物を、 50mMNaClを含 む 20mM炭酸水素ナトリウムノ ッファー（pH9. 0)で平衡化した硫酸セル口ファイン (2ml：生化学工業株式会社）カラムに 0. 5rnl/min.の流速でアプライした。 1½1の 上記バッファーでカラムを洗浄後、 50raMから 600mMの NaCl/20raM炭酸水素ナトリウ ム（pH9. 0) 20mlの塩濃度勾配で 0. 5ral/rain.の流速で溶出を行つた。 フラクション の一部を用いて、 実施例 11で得られた抗ェカリン抗体を用いたウェスタンプロッ トによりェカリン溶出画分を同定後、 プールした。
3 )ゲル濾過
2 ) に示したクロマトグラフィ一で得られた耝換えェカリンを含むフラクショ ンを、 lOOmMNaClを含む 10mMリン酸 (pH7. 0)バッファ一で平衡化したゲル濾過力ラ ム HiLoad 16/60 (Pharmacia)にアプライし、 0. 5ml/min.の流速で分画を行った。 分子量のスタンダードとして Bio Radのゲノレ濾過用のマーカーを用いた。 各フラ クションのプロトロンビン活' I"生化能を測定したところ、 分子量 80， 000付近の画分 に活性のピークが認められた（図 3)。 得られた精製ェカリンを 2 -メルカプトエタ ノ一/レ存在下で SDS- PAGEを行つた後にク一マシーブリ リアントプル一で染色した パターンを示す （図 2 ) 。
以上述べた 3ステップの精製により、 最終活性収率 13%で、 比活性で培養上清と 比べて 12， 000倍の組換えェカリンを得た。
実施例 1 4
(組換え α—トロンビンの酵素化学的性質) - 実施例 1 2に示した方法で得られた精製組換えひートロンビンについて、 その 酵素化学的性質について、 フイブリノ一ゲンのフイブリンへの変換活性、 トロン ボモジュリンとの解離常数、 ト口ンボモジュリン存在下、 非存在下でのプロティ ン Cの活性化およびアンチトロンビン IIIによる活性阻害について測定を行った。 陽性コントロールとして、 プラズマ由来の精製 α—トロンビン （へマトロジック インスティチュート社から購入） を用いた。 その結果、 精製組換え 0!—トロンビ ンは表 1に示すようにそれぞれの酵素化学的パラメータにおいて、 プラズマ由来 の精製 α—トロンビンと同等の値を示した。
&1. 組換え α-卜ロンビンと血液由来ひ-トロンビンの酵素学的パラメーター比較 組換え α-トロンビン プラズマ由来 α-トロンピン
S-2238加水分解活性
k cat (sec-1) 160土 5 174 ±19
Km (μΜ) 6.9 ± 1·5 8.3 ±1.5 kcat/ m (μΜ-lsec-l) 23.3 ±2.5 21.2±2.7 フイブリノ一ゲンのフイブリンへの変換
kcal/Kra (μΜ-l sec-1) forFpA 10.9土 0.6 10.6±0.8 卜ロンボモジュリンとの解離常数
K dapp (nM) 1.3士 0.1 1.4土 0.2 プロテイン Cの活性化（TM—）
k cat (min-l) 9.1 ±0.1 8.5 ±0.2
Km (μΜ) 15.7±0.3 16.3土 0.3 kcat Km (μΜ-lmin-l) 0·58±0.01 0.52 ±0.02 プロティン Cの活性化（TM+)
k cat (rain-1) 86.6±1.7 85.8 ±3.5
Km (μΜ) 6.2±0.5 5.5±0·1 kcat/Km (μΜ-lmin-l) 14.0 ±1.5 15.5土 0.5
ΑΤΙΠによる活性阻害
2次反応常数 (μΜ-lmin-l) 0.57士 0.01 0.65 ±0.01
なお、 上記実施例で実施したトロンビン及ぴェカリンの活性測定は各々下記の 記載に拠った。
1 ) トロンビンの活†生漁 i定
トロンビンの活性は以下の方法で測定した。
フアルコン社製 2008チューブに試料 20 1と 50mM Tris-HCl (pH8. 5) + 50mM
NaClバッファー 60 /i l、 0. 1% PLURONIC F 68を 20μ 1加え、 37。Cで 3分間インキュ ベーシヨンした。 標準品としてヒトプラズマ由来精製 α—トロンビン （へマト口 ジックテクノロジ一社から購入： HCT- 0020) を同バッファーで 5、 2. 5、 1. 25、 0. 625、 03125 μ g/mlに希釈したものを用いた。 その反応液にテストチーム発色 基質 S- 2238 (IraM ：第一化学薬品工業） を 100 /ι 1添加し攪拌混合し、 37°Cで 5分 間の反応後 0. 1Mクェン酸溶液を 800 μ 1加えて反応を停止した。 反応液 200 μ 1を 96 ゥエルプレートに移し、 OD405/650を測定した。
2 ) ェカリンの活性測定
ェカリンの活性は以下の方法で測定した。
フアルコン社製 2008チューブに試料 20 μ 1と 50mM Tris-HCl (pH8. 5) + 50raM
NaCl + 0. 01% PLURONIC F- 68バッファー （バッファー①） 60 を力 [Iえ、 更に 0. 01%トリプシンを 2 μ Γ添加して攪拌混合後、 37°Cで 10分間ィンキュベートした。 試料は濃度に応じてバッファー①で希釈を行った。 その反応液に、 0. 4mg/mlのプ ロトロンビン （へマトロジックテクノロジ一社から購入） を 10 μ 1添加し 37°Cで 5 分間反応させ、 10mM EDTAを ΙΟμ Ιとテストチーム発色基質 S-2238 (lmM) を 100 μ
1添加し攪拌混合し、 37°Cで 5分間の反応後 0. 1Mクェン酸溶液を 800 μ 1加えて反応 を停止した。 反応液 200 1を 96ゥエルプレートに移し、 0D405/650を測定した。 ェカリンの活性を定量するために、 シグマ社から市販されている蛇毒由来のェカ リンをバッファー①で希釈し 25mU/ml、 12. 5、 6. 25、 3. 125mU/mlを調製した。 こ のスタンダード溶液を試料の代わりに 20 i l加え （トリプシン溶液はカ卩えない） 、 プロトロンビンをカ卩える以降の操作は、 上記と同様に行った。
(従来技術より有効な効果）
これまで報告されている組換えトロンビンの発現量は約 25 /i g/tnlであるが、 今 回、 本願発明によって構築されたトロンビンの発現系は、 約 150 μ §Αι1という、 従来の発現量を大きく上回る優れた発現系である。 しかも、 本願発明者等は活性 化酵素としても組換えェカリンをつくることに成功したことによって、 ヒトトロ ンビンの製造方法として、 血液由来の成分を排除した安全で優れた方法を確立し た。 このように本発明によって、 従来技術では達成できなかった血液由来成分の 関与を極力排除した安全かつ低コストのヒトトロンビンを大量に供給することが 可能となり、 本発明の医療及び研究分野への貢献は極めて大きいものと考える。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の工程を含むことを特徴とする遺伝子組換え技術によるヒ ト トロンビン の製造方法：
1 )プロモーターの下流にヒ トプレトロンビンをコードする遺伝子を組み込んだ 発現ベクターにより形質転換された動物細胞からなる形質転換体を培養し、 培養 液中にヒ トプレトロンビンを生成蓄積せしめこれを採取する工程、
2 )採取'回収されたヒトプレトロンビン含有溶液を、 ェカリンを作用させて活 性化してヒトトロンビンに変換させる工程、
3 )前記活性化工程を経た反応液より、 純化されたヒトトロンビンを得る精製ェ 程。
2 . プロモーターが、 S V 4 0初期プロモーター、 S V 4 0後期プロモーター、 サイトメガロウィルスプロモーター及びニヮトリ j3—ァクチンプロモーターより 選択される請求項 1記載のヒトトロンビンの製造方法。
3 . プロモーターがニヮトリ |3—ァクチンプロモーターである請求項 2記載のヒ ト トロンビンの製造方法。
4. 発現ベクターが、 プレトロンビンをコードする遺伝子の上流にシグナル配列 を有するものである請求項 1から請求項 3のいずれかに記載のヒトトロンビンの 製造方法。
5 . シグナル配列が、 ィムノグロブリンのシグナノレ S G - 1及び C 2 5のシグナ ルより選択される請求項 4記載のヒ ト トロンビンの製造方法。
6 . 発現ベクターが、 さらに遺伝子増幅遺伝子を有し、 さらに形質転換体の培養 を遺伝子増幅条件下に実施する請求項 1から 5のいずれかに記載のヒ ト トロンビ ンの製造方法。
7. 遺伝子増幅遺伝子が、 ジヒドロ葉酸レダクターゼをコ一ドする遺伝子である 請求項 6記載のヒ トトロンビンの製造方法。
8 . ヒ トプレトロンビンをコードする遺伝子が配列番号 1 1に記載の塩基配列で 示される遺伝子断片である請求項 1から 7のいずれかに記載のヒ トトロンビンの 製造方法。
9 . 形質転換体がチャイニーズノ、ムスター卵巣細胞（C HO細胞）、 マウスミエ口 一マ細胞、 B HK 2 1細胞、 2 9 3細胞または C O S細胞より選択される動物細 胞である、 請求項 1カ ら 8のいずれかに記載のヒ トトロンビンの製造方法。
1 0 . ヒ トプレトロンビンの活性ィ匕に使用されるェカリンが遺伝子組換え技術を 用いて調製されたものである、 請求項 1記載のヒトトロンビンの製造方法。
1 1 . ヒトトロンビンの精製工程が、 ヒルジンぺプチドとの親和性クロマトグラ フィーを実施することより構成される請求項 1記載のヒトトロンビンの製造方法。
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