WO2002096943A1 - Stat6-activating genes - Google Patents

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WO2002096943A1
WO2002096943A1 PCT/JP2002/004949 JP0204949W WO02096943A1 WO 2002096943 A1 WO2002096943 A1 WO 2002096943A1 JP 0204949 W JP0204949 W JP 0204949W WO 02096943 A1 WO02096943 A1 WO 02096943A1
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activation
disease
stat6
polynucleotide
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PCT/JP2002/004949
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Goichi Honda
Akio Matsuda
Shuji Muramatsu
Kenya Ishizawa
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Asahi Kasei Kabushiki Kaisha
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
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    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
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    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention provides a protein having an activity of promoting the activation of STAT6, a DNA encoding the protein, a method for obtaining the DNA, a recombinant vector containing the DNA, and a recombinant vector containing the recombinant vector. And an antibody that reacts with the protein.
  • the present invention also relates to the use of the protein, DNA or antibody of the present invention in diagnosing, treating or preventing a disease associated with excessive activation or inhibition of STAT6.
  • the present invention also relates to a method for screening a substance that inhibits or promotes STAT6 activation using the protein, DNA, recombinant vector and transformant.
  • Th helper T cells
  • J. Immuno 1. (1 986) 1 36: 2348—2 3 57 They classified them into two types of cells, Th1 and Th2, based on their cytokine production patterns.
  • Th1 cells use interleukin 2 (I
  • Th 2 cells contain interleukin 4 (IL-14), interleukin 5 (IL-5), interleukin 10 (IL-10), and interleukin 13 (IL- 13) and is involved in humoral immunity such as the production of antibodies against infection of intracellular parasitic microorganisms such as parasites and exposure to antigens and allergens.
  • IL-14 interleukin 4
  • IL-5 interleukin 5
  • IL-10 interleukin 10
  • IL- 13 interleukin 13
  • Th 2 produces many cytokines involved in allergic reactions, it is thought that hyperactivity of Th 2 causes allergic diseases such as asthma.
  • IL-14 is an immunomodulatory site secreted by activated T lymphocytes, basophils, and mast cells.
  • IL-4 induces the proliferation of B cells, the production of IgE and IgGl, and also the activation and proliferation of mast cells. It also induces VCAM-1 gene expression, which functions when eosinophils adhere to vascular endothelial cells and invade tissues.
  • IL-14 has been shown to play an important role in Th2 cell differentiation, hematopoietic progenitor cell proliferation and differentiation.
  • IL-13 is a cytokine secreted from activated T lymphocytes, mast cells, basophils, NK cells, and dendritic cells. It has almost 30% sequence homology to IL-14 and shows IL-14-like activity to monocytes, macrophages and B cells. However, IL113 does not act on T cells.
  • STAT 6 is a member of the STAT (SignalTransduccerndActiviatororfTranascrription) family.
  • STAT is a transcription factor that functions depending on the stimulus downstream of various cytokine-growth factor receptors.
  • STAT 1,2,3,4,5a is a transcription factor that functions depending on the stimulus downstream of various cytokine-growth factor receptors.
  • JAK family a receptor-associated tyrosine kinase called JAK family is activated, and the activated JAK phosphorylates the receptor's own tyrosine residue. This causes activation of the STAT molecule. Activated S T
  • the AT molecule forms a dimer and rapidly translocates into the nucleus, inducing gene expression.
  • JAK is activated via IL-14 receptor and IL_13 receptor, and tyrosine on the receptor is phosphorylated.
  • STAT 6 continues SH 2 domain STAT 6 itself is phosphorylated by tyrosine to form a homodimer and translocates into the nucleus.
  • Germ 1 ine epsilon, CD 23, MHC (Major Histocoat atibi 1 ity Complex) class II antigen, STAT 6 gene and the like are known as target genes of STAT 6.
  • STAT6-deficient mice have been generated and their physiological roles have been investigated. All major functions of IL-14 and IL-13 are impaired in STAT6-deficient mice, and STAT6 is an important molecule in IL-4 and IL-13 signaling It was proved. In addition, Th2 response was impaired in STAT6-deficient mice, and production of Th2-type cytokines was hardly observed, indicating that STAT6 is an essential molecule for Th2 cell differentiation. In other words, STAT6 was proved to be an important molecule in inducing an allergic reaction. Against this background, inhibiting the function or activation of STAT 6 specifically suppresses the functions of IL-14 and IL-13, and suppresses allergic diseases, inflammation, and immune diseases May be possible.
  • Proteins associated with STAT6 activation are promising targets for pharmaceuticals against allergic diseases, autoimmune and inflammation-causing and symptomatic diseases (eg, Proc. Natl. Acd. Sci. US A 95, 172–1 77 (1 998), Science 282, 2258-2261 (1 998), Science 282, 226 1–2263 (1 998), J. E. Med. 183 , 1 09—1 17 (1 996), J. Imm uno 1.160, 4004—4009 (1 998), J. I mm uno 1.160, 1 58 8 1-1 5.88 (1 998) )].
  • the information from outside the cell is transformed into some form of signal, passes through the cell membrane, crosses the cytoplasm to the nucleus, regulates the expression of target genes, and triggers cellular responses. Therefore, elucidating the mechanism of intracellular signal transduction from extracellular stimulation to activation of STAT 6 will require the development of new medicines or treatments for allergic diseases, autoimmune diseases and diseases that exhibit inflammatory symptoms. It provides a very important means for development and has extremely important significance.
  • An object of the present invention is to find a novel gene or protein having a function of promoting the activation of STAT6, which is useful as described above, and to provide a method of using the same in the fields of medicine, diagnostics, and medicine. Is to do. That is, a novel protein having an activity of promoting the activation of STAT6, a DNA encoding the protein, a recombinant vector containing the DNA, a transformant containing the recombinant vector, a method for producing the protein, An antibody against the protein or a partial peptide thereof, and a method for producing the antibody are provided.
  • the present invention provides a method for screening a substance that inhibits or promotes STAT6 activation using the protein, DNA, recombinant vector and transformant, the screening kit, the screening method or A substance that inhibits or promotes the activation of STAT6 obtained using a screening kit, a method for producing the substance, a drug that contains a substance that inhibits or promotes the activation of STAT6, etc. I will provide a.
  • the fragment sequence of A is EST (Expressed Sequence Tag, for example,
  • ttp // www.ncbi.nlm.nih.gov / dbEST
  • ESTs contain only sequence information, and it is difficult to estimate their functions.
  • ESTs are maintained by Uni Gene (http // www.ncbi.nlm.nih.gov / UniGene), and approximately 80,000 ESTs have been registered so far. But that Many lack the 5 'end nucleotide sequence and do not include the protein translation start site. Therefore, it cannot be said that this is directly linked to gene function analysis, such as protein function analysis based on the determination of the mRNA coding region and understanding of gene expression regulation by promoter analysis.
  • one of the methods to elucidate the functions of gene products, that is, proteins is a transient expression closing method using animal cells (for example, Experimental Medicine Separate Volume Genetic Engineering Handbook).
  • a cDNA library prepared using an animal cell expression vector is transfected into animal cells to directly express a functional protein, and the biological activity of this protein on cells is used as an index.
  • This is a method for identifying and cloning cDNA. This method does not require chemical information (amino acid sequence and molecular weight) on the target protein product in advance, and detects the specific biological activity of the protein expressed in cells or in the culture medium to detect cDNA. Identification of clones can be performed.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, created a full-length cDNA library using an oligocapping method, and performed gene function by expression cloning using NIH 3T3 cells.
  • Atsushi system is completed, Atsushi system
  • This novel DNA induced enhanced STAT 6 activation by expression in NI H3 T 3 cells.
  • This result indicates that this novel DNA is a signaling molecule involved in promoting the activation of STAT6, and has completed the present invention.
  • a purified and / or isolated protein selected from the following (a) or (b):
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by 478, 480, 482 or 484.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which two amino acids have been deleted, substituted or added, and having an action of promoting STAT6 activation.
  • 3 32 334 336 338 340 342, 344, 346, 348, 3 50 352 354 356 358 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 3S 2, 384,
  • polynucleotide sequence encoding a protein having at least 95% or more identity over its entire length with any of the polynucleotides of (3), and having an activity of promoting STAT6 activation
  • An isolated polynucleotide comprising:
  • polynucleotide sequence encoding a protein having at least 95% or more identity over its entire length with any of the polynucleotides of (4), and having an activity of promoting STAT6 activation
  • An isolated polynucleotide comprising:
  • a method for producing a protein comprising:
  • the disease is diagnosed when it is twice or more normal or 1 / "2 or less.
  • a method for screening a compound for activity as a STAT6 inhibitor or activator comprising the following steps.
  • Allergic disease, inflammation, autoimmune disease, cancer comprising administering a pharmaceutical composition produced by the method described in (14) above to a patient suffering from a disease associated with STAT6 activation. Or how to treat a viral infection.
  • Th1 comprising administering a pharmaceutical composition produced by the method described in (14) to a patient suffering from a disease associated with inhibition of STAT6 activation has an enhanced function
  • Methods for treating diseases for example, organ-specific autoimmune diseases such as multiple sclerosis and insulin-dependent diabetes mellitus.
  • a pharmaceutical composition comprising the monoclonal or polyclonal antibody according to (16) as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition comprising the antisense oligonucleotide according to (18) as an active ingredient.
  • FIG. 1 shows a protein kinase inhibitor, AG18, AG490, and a plasmid, when a plasmid containing a nucleotide encoding a protein having an action of promoting STAT6 activation of SEQ ID NO: 3 was used.
  • FIG. 4 is a graph showing suppression of reporter activity of STAT 6 by rosporin. In the figure, the vertical axis indicates the relative luciferase activity.
  • Figure 2 shows a protein that has the effect of promoting STAT6 activation of SEQ ID NO: 17.
  • FIG. 4 is a graph showing inhibition of reporter activity of STAT6 by protein kinase inhibitors AG18, AG490, and staurosporine when a plasmid containing a nucleotide encoding a protein is used.
  • the vertical axis indicates the relative luciferase activity.
  • FIG. 3 shows that when a plasmid containing a nucleotide encoding a protein having an action of promoting the activation of STAT6 of SEQ ID NO: 19 was used, the protein kinase inhibitor AG18, AG490
  • FIG. 2 is a graph showing suppression of STAT 6 report activity by evening rosporin.
  • the vertical axis indicates the relative luciferase activity.
  • FIG. 4 shows the protein kinase inhibitors AG 18 and AG 490 when using a plasmid containing a nucleotide coding for a protein having an action of promoting the activation of STAT6 of SEQ ID NO: 218.
  • FIG. 2 shows the suppression of STAT 6 reporter activity by staurosporine.
  • the vertical axis indicates relative luciferase activity.
  • FIG. 5 shows that when a plasmid containing a nucleotide encoding a protein having an action of promoting the activation of STAT 6 of SEQ ID NO: 432 was used, the protein kinase inhibitors AG 18, AG 490,
  • FIG. 2 is a graph showing suppression of reporter activity of STAT 6 by staurosporine. In the figure, the vertical axis indicates the relative luciferase activity.
  • FIG. 6 shows that the protein kinase inhibitors AG 18, AG 490, and the plasmids containing a nucleotide encoding a protein having an action of promoting the activation of STAT 6 of SEQ ID NO: 472 were used.
  • FIG. 2 is a diagram showing suppression of repot overnight activity of STAT 6 by staurosporine. In the figure, the vertical axis indicates relative luciferase activity.
  • FIG. 7 is a diagram showing suppression of the repo overnight activity of STAT6 by protein kinase inhibitors AG18, AG490, and staurosporine when a plasmid containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 64 is used.
  • the vertical axis indicates relative luciferase activity.
  • SEQ ID NO: 485 is a primer.
  • SEQ ID NO: 486 is a primer.
  • SEQ ID NO: 487 is a primer.
  • SEQ ID NO: 488 is a primer.
  • a full-length cDNA was prepared from mRNA prepared from human normal lung fibroblasts (purchased from Sanko Junyaku Co., Ltd.) by the oligocabbing method, and the cDNA was transformed into the vector pME18S-FL3. (GenBank Accession AB009864) to prepare a full-length cDNA library.
  • the cDNA library was introduced into Escherichia coli, and a plasmid was prepared for each clone.
  • NIH3T3 cells (Dainippon Pharmaceutical) were placed in a repo overnight plasmid containing a STAT6-responsive sequence upstream of luciferase-encoding DNA [for example, J. Biol. Chem. , 26500-26506 (2000), J. Ep. Med. 190, 183
  • having the action of promoting the activation of STAT6 means that a gene is introduced into an appropriate cell and the protein encoded by the gene is overexpressed. Sometimes, it means that STAT6 is directly or indirectly activated (inducing STAT6 activation) even in the absence of a physiological stimulus. And, after transfection of the gene into the appropriate cells and overexpression of the protein encoded by the gene, when physiological stimuli enter the cells, normal levels of STAT 6 It also means that activation is further directly or indirectly promoted (triggering the promotion of STAT 6 activation) STAT 6 activation is, for example, a STAT6-dependent repo overnight gene.
  • the activity of the repo overnight activity can be detected by measuring the effect of increasing the repo overnight activity as compared to control cells (the cells into which the reporter gene and empty vector have been introduced) by using an assay.
  • the increase is preferably 1.5 times or more, more preferably 3 times or more, and even more preferably 6 times or more.
  • Polynucleotides encoding the protein to be expressed are cloned into an appropriate expression vector, and the expression vector and the STAT6-dependent repo overnight plasmid are co-transfected into appropriate cells (co-transfection). After culturing for a certain period of time, measure the repo overnight activity. Alternatively, after co-introduction and culturing for a certain period of time, a stimulant is added, and the cells are further cultured, and the repo overnight activity is measured.
  • Appropriate expression vectors are well known to those skilled in the art, and include, for example, pMEISS-FL3, pcDNA3.1 (Invitien).
  • the repo overnight gene may be any gene as long as its expression can be easily detected by those skilled in the art, for example, a gene encoding luciferase, clonal ramphenicol acetyltransferase, or 3-galactosidase. . It is most preferable to use a gene encoding luciferase, and examples of STAT6-dependent reporter plasmids include, for example, luciferase-repository plasmid N4X8_1uc having a STAT6 response element.
  • Appropriate cells are cells that show a response such that STAT-6 is activated by stimulation of IL-4 or IL-13, and include, for example, NIH3T3 cells. Cell culture and gene transfer (transfection) into cells can be performed and optimized by those skilled in the art according to conventional methods known in the art. A preferred method is to transfer NIH3T3 cells to a 96-well plate for cell culture at 1X.
  • luciferase reporter plasmid N4X8-luc having a STAT 6 response element and an expression vector are cotransfected into 1 well.
  • the activity of promoting STAT 6 activation is measured by measuring luciferase activity using 0 (Toyo Ink). Luciferase activity can be measured, for example, by measuring Wa11 ac ARVOTMST 1420 MULT from PerkinE1me1 '.
  • the amount of Fu GENE 6 per 1 ⁇ l is preferably 0.3 to 0.51, preferably 0.31, and N 4
  • the amount of the X8-1 uc reporter plasmid is preferably 50 to 100 ng, preferably 100 ng, and the amount of the expression vector is preferably 50 to 100 ng, preferably 100 ng.
  • the effect of promoting the activation of STAT 6 means that the activity of increasing the reporter activity (luciferase activity) is higher than that in a control experiment (cells in which the repo overnight gene and an empty vector have been introduced). It means having.
  • the increase in reporter activity is preferably 1.5 times or more, more preferably 3 times or more, and even more preferably 6 times or more.
  • the present invention provides the following proteins.
  • (d) promotes the activation of STAT 6 and is at least 95%, preferably 97-99, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: over its entire length.
  • a protein comprising an amino acid sequence having the following identity:
  • Identity is a relationship between two or more proteins or two or more polynucleotides, as is known in the art, determined by comparing the sequences.
  • Identity in the art also refers to protein or polynucleotide sequences. It refers to the degree of sequence correlation between protein or polynucleotide sequences, as determined by the match between the sequences, or in some cases, by the match between a series of such sequences.
  • Identity and similarity can be readily determined by known methods. Preferred methods of determining identity are designed to give the longest match between the sequences tested. Methods for determining identity and similarity are codified in publicly available programs.
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool
  • Altschul SF f Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990) Altschul SF, Madden TL, Scaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))
  • Altschul SF Madden TL
  • Scaffer AA Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402
  • the main initial conditions generally used for the BLAST search are as follows, but are not limited thereto.
  • the amino acid substitution matrix is a matrix in which the affinity of each pair of 20 kinds of amino acids is quantified, and the default matrix of BLOSUM62 is usually used.
  • Altschul SF J. Mol. Biol., 219: 555-565 (1991), for the theory of this amino acid substitution matrix, and States DJ, Gis W., Altschul SF, Methods for its application to DNA sequence comparison. , 3: 66-70 (1991).
  • the optimal gearing cost at that time has been empirically determined, and in the case of BL0SUM62, the parameters of Existence 11 and Extension 1 are preferably used.
  • the expected value is the threshold value for statistical significance when matching against a database sequence.
  • the default value is 10.
  • a protein having an identity of, for example, 95 ⁇ or more to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has the amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a protein having at least 95% amino acid identity to a control amino acid sequence has up to 5% of the total amino acid sequences in the control sequence deleted or other amino acids. It may be replaced with an amino acid, or may have up to 5% 'of the total amino acid sequence in the reference sequence inserted into the reference sequence.
  • These changes in the control sequence may be at the amino or carboxy terminal position of the control amino acid sequence, or may be in one or more contiguous groups within the control sequence.
  • the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the like has an activity of promoting the activation of STAT6.
  • a polynucleotide comprising a polynucleotide sequence which encodes a protein having at least 95% identity to the above-mentioned sequence, preferably 97-99, and having an activity of promoting STAT6 activation.
  • (c) has an effect of promoting STAT6 activation and has SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 1, 13, 15, 17, 17, 19, 21, 23, 25, 27 , 29, 3 1, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 5 1, 53, 55, 5
  • Polynucleotides identical or sufficiently identical to the nucleotide sequence contained in the above nucleotide sequence are the full-length cDNA encoding the protein of the present invention and a genomic clone or cDNA or gene of another gene having high homology to the above sequence. It may be used as a hybridization probe for isolating a nome clone or as a primer for a nucleic acid amplification reaction. Typically, these nucleotide sequences are 70% identical, preferably 80% identical, more preferably 90-0 'identical, and most preferably 95% identical to the above sequences. Probes or primers generally contain at least 15 nucleotides, preferably contain 30 nucleotides, and may contain 50 nucleotides. Particularly preferred probes have 30-50 nucleotides. Particularly preferred primers have 20 to 25 nucleotides.
  • the polynucleotides of the present invention may be in the form of DNA (eg, including genomic DNA obtained by cDNA and cloning or synthetically produced) or in the form of RNA (eg, mRNA). You may.
  • the polynucleotide may be double-stranded or single-stranded. In the case of double-stranded, it may be double-stranded DNA, double-stranded RNA or DNA: RNA hybrid. In the case of a single strand, it may be a sense strand (also known as a coding strand) or an antisense strand (also known as a non-coding strand).
  • Those skilled in the art can appropriately substitute amino acids in this protein using a known method, and perform the same procedure as in the case of the protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the like. It is possible to produce a protein having an effect of promoting the activation of STAT6.
  • One method is to use a conventional mutagenesis method on the DNA encoding the protein.
  • Another method is, for example, a site-specific mutagenesis method (for example, Takara Shuzo Co., Ltd.'s Metal Super Press Km kit).
  • Amino acid mutations in proteins can also occur in nature.
  • a protein having an action and a DNA encoding the protein are also included in the present invention.
  • the number of mutations is preferably up to 10, more preferably up to 5, most preferably up to 3.
  • amino acid substitution conservative substitution is preferable, and specifically, substitution in the following groups is mentioned.
  • Glycine, alanine phosphorus, isoleucine, leucine) (aspartic acid, glutamic acid) (asparagine, glutamine) (serine, threonine) (lysine, arginine) (phenylalanine, tyrosine).
  • DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by 482 or 484 for example, a polynucleotide such as SEQ ID NO: 2
  • a DNA having a high similarity to this is isolated based on a part thereof, and the activation of STAT6 is promoted from the DNA in the same manner as the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the like. It is also possible to obtain a protein having an effect.
  • a protein having a high identity to the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the like and having an action of promoting the activation of STAT6 is also included in the protein of the present invention. It is.
  • High identity means at least 90%, preferably at least 97-99, over the entire length of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the like. 1 shows an amino acid sequence having the same identity as the above.
  • the protein of the present invention may be a natural protein derived from any cell or tissue of a human or mammal, a chemically synthesized protein, or a protein obtained by a genetic recombination technique.
  • the protein may or may not have undergone post-translational modifications such as glycosylation and phosphorylation.
  • Examples of the protein of the present invention include secretory proteins (growth factors, cytokins, hormones, etc.), protein modifying enzymes (protein kinases, protein phosphatases, proteases, etc.), nuclear proteins (nuclear receptors) , Transcription factors, etc.) membrane proteins.
  • Membrane proteins, receptors, cell adhesion molecules, ion channels And a transporter When the protein is a membrane protein, the compound selected by the screening described below is expected to be easily transferred into cells, so that it is more useful as a research tool for pharmaceutical compounds.
  • the present invention is a polynucleotide encoding the protein of the present invention shown above.
  • SEQ ID No. 1 3, 5, 7, 9, 9, 11, 13, 15, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 , 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 70, 72, 74, 76, 78, S0, 82, 84, 86 , 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106 108, 110, 1 1 2.114, 116, 118, 120, 122 124 1 26, 1 28, 1 30,
  • Nucleotide sequence represented by 1 or 483 I can do it.
  • DNA includes not only cDNA but also genomic DNA and chemically synthesized DNA. According to the degeneracy of the genetic code, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 11, 13, 15, 17, 17, 19, 21 without changing the amino acid sequence of the protein produced from the gene , 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 4] 43, 45,
  • At least one nucleotide of the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by 482 or 484 Can be replaced with other types of nucleotides.
  • the DNAs of the present invention also contain nucleotide sequences that have been converted by substitutions based on the degeneracy of the genetic code. Such DNA can be synthesized by a known method.
  • the DNA of the present invention encodes a protein that hybridizes with DNA consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like under stringent conditions and has an action of promoting STAT6 activation. DNA is also included. Stringent conditions are well understood by those skilled in the art. 82, 198 9) can be easily implemented.
  • the stringent conditions are as follows: in a hybridization solution containing 30% formamide (5 X SSC (0.75 M NaCl, 75 mM trisodium citrate), 5 X Denhardt's solution, 0.5. Incubate at 37 ° C in b'SDS, 100, "gm 1 modified sheared salmon sperm DNA), and then in 2 XSSC, 0.1 0 'SDS at room temperature. Wash three times for 0 minutes, then wash twice in 1 XSSC, 0.13 ⁇ 4SDS for 10 minutes at 37 ° C (low stringency), more preferably 40 40formamide.
  • the present invention includes polynucleotides having high similarity to the nucleotide sequence of the polynucleotide of (3) or (4) and containing a nucleotide encoding a protein having an activity of promoting STAT6 activation. .
  • these nucleotide sequences are 95% identical over the entire length of the nucleotide sequence of the polynucleotide of (3) or (4), more preferably 97% identical, and most preferably at least 99% identical. is there.
  • the DNA of the present invention described above can be used to produce the aforementioned proteins using recombinant DNA technology.
  • the DNA and the peptide of the present invention can be obtained as follows.
  • a recombinant vector is constructed by incorporating a DNA encoding the entire coding region of the protein or a portion thereof into an expression vector.
  • the obtained cells are cultured to express the protein or an analog thereof, and purified by column chromatography.
  • Amplification can also be performed by Ch ain R e ac t i on (RT-PCR method).
  • Examples of DNA incorporated into an appropriate vector are, for example, commercially available (CLO
  • NT ECH, STRATAGE NE Library can be used.
  • the hybridization method is a method commonly used by those skilled in the art, and can be easily carried out, for example, according to the above-mentioned experimental operation manual of T. Maniatis et al.
  • the cloned DNA encoding the protein of the present invention can be used as it is depending on the purpose, or can be digested with a restriction enzyme or added with a linker if desired.
  • the DNAs obtained as described above are SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 5
  • the DNA to be incorporated into the expression vector in (B) above may be a full-length cDNA encoding the above-described full-length protein, a DNA fragment, or a DNA fragment constructed to express a part thereof. It is good.
  • the present invention is a recombinant vector containing the above-mentioned DNA.
  • the expression vector of the protein of the present invention is produced, for example, by cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the protein of the present invention and ligating the DNA fragment downstream of a promoter in an appropriate expression vector. can do.
  • the expression vector used may be any vector derived from prokaryotes such as Escherichia coli, yeast, fungi, insect viruses, and vertebrate viruses as long as it is replicable, but the microorganism used as a host Or you need to select the right one for your cells. Further, an appropriate combination is selected as a host cell-expression vector system depending on the expression product.
  • plasmid vectors suitable for these microorganisms are generally used as replicable expression vectors for recombinant DNA.
  • Plasmid vectors usually contain an origin of replication, a promoter, and a marker gene that gives the recombinant DNA a phenotype useful for selecting cells transformed with the recombinant DNA.
  • the promoter include a 3-lactamase promoter, a lactose promoter, a tryptophan promoter, and the like.
  • the marker gene include the ampicillin resistance gene and the tetracycline gene.
  • suitable expression vectors include pUC.18, pUC19, etc. in addition to plasmids pBR322 and PBR327.
  • YEP24 can be used as a replicable vector.
  • Plasmid YEp24 contains the URA3 gene, and this URA3 gene can be used as a marker gene. Wear.
  • promoters for expression vectors for yeast cells include promoters for genes such as 3-phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphodehydrogenase, and alcohol dehydrogenase.
  • promoters and promoters used in expression vectors for expressing the DNA of the present invention in fungi include phosphodarycelate kinase (PGK), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPD). ), Actin and other gene promoters and terminators.
  • suitable expression vectors include the plasmids pPGACY2, pBSFAHY83, and the like.
  • promoters used in expression vectors for expressing the DNA of the present invention in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, and the like.
  • Recombinant vectors for expressing the DNA of the present invention in animal cells generally include functional sequences for controlling the gene, such as the origin of replication, a promoter to be located upstream of the DNA of the present invention, and ribosome binding. Site, polyadenylation site and transcription termination sequence.
  • Such functional sequences that can be used to express the DNA of the present invention in eukaryotic cells can be obtained from viruses, viruses, and the like. For example, SR promoter, SV40 promoter, LTR promoter, C
  • Examples include the MV (cytomegalovirus) promoter and the HS V-TK promoter. Among them, it is preferable to use CMV promoter, SRa promoter and the like. In addition, promoters naturally present upstream of the gene encoding the protein of the present invention can also be used provided that they are suitable for use in the above-described host-vector system.
  • the replication origin a replication origin derived from a foreign source, for example, a virus such as adenovirus, polio, SV40, etc. can be used.
  • a vector having the property of being integrated into a host chromosome is used as an expression vector, the origin of replication of the host chromosome can be used. Examples of suitable expression vectors include plasmid pSV2—dhfr (ATCC 3
  • the present invention is a transformed cell containing the above-described recombinant vector.
  • Microorganisms or cells transformed with the replicable recombinant vector are selected from the remaining parent cells that have not been transformed by the at least one phenotype given to the recombinant vector, as described above.
  • the phenotype can be conferred by inserting at least one marker gene into the recombinant vector. Marker genes originally possessed by replicable vectors can also be used. Examples of the marker gene include, for example, a gene encoding a drug resistance gene, such as neomycin resistance, and dihydrofolate reductase.
  • the host used in the above (C.) may be any of prokaryotic organisms such as Escherichia coli, microorganisms such as yeasts and fungi, and cells such as insects and animals, but a host suitable for the expression vector to be used is selected. There is a need.
  • microorganisms include strains of Escherichiacoli, such as E.co1i.
  • Bacillus subtilis such as E. coli C600, E. coli JM109, E. coli B strain, or Bacillus subtilis, or Salmonella typhimurium (Sa1 mone 1 lat yp hi mu ri um) or Serratia mercense
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae (Saccha1a-omycesecserevisiea), Perilla 'Saccharomyces pombe (Schizosocsaccaharomyc e spombec), and Pichia nostrius (Pi a s i s p i s a pi s p i s a p i s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s s
  • Fungi include, for example, Aspergillus nidulans (Aspergii 11 u sniid u1 ans), Acremonium chrysogenum (Acremoniium chrysogeneum) (ATCC 11
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from night larvae of moth larvae (S podopterafrugiperda: S f cells), and High Five cells derived from eggs of T richoplusiani are used.
  • animal cells include HEK 293 cells, COS-1 cells, COS 17 cells, He1a cells, Chinese hamster (CH ⁇ ) cells, and the like. Among these, CHO cells and HEK293 cells are preferred.
  • the combination of the expression vector and the host cell to be used differs depending on the purpose of the experiment, but two types of expression systems, transient expression and constitutive expression, are considered depending on the combination.
  • Transformation of microorganisms and cells in the above (C) means that DNA is incorporated into microorganisms or cells by forced methods or by the phagocytic activity of cells, and transiently transforms the DNA traits in the form of plasmids or chromosomes. Alternatively, it is expressed constitutively.
  • Those skilled in the art can perform transformation by a known method (for example, Handbook of Genetic Engineering, Separate Volume on Experimental Medicine).
  • DNA can be introduced into cells by a method such as the DEAE-dextran method, the calcium phosphate method, the electoral poration method (electroporation method), and the ribofection method.
  • a method for stably expressing the protein of the present invention using animal cells there is a method of selecting, by clonal selection, cells in which the expression vector introduced into the animal cells is integrated into the chromosome. Specifically, a transformant is selected using the above-mentioned selection marker as an index. Furthermore, a stable animal cell line having a high expression ability of the protein of the present invention can be obtained by repeatedly performing clone selection on the animal cells obtained using the selection marker as described above. .
  • the Dihydrofurforate reductase (DHFR) gene is used as a selection marker, the Methhotrexate (MTX) concentration is gradually increased, and culture is performed.
  • the encoding DNA can be amplified intracellularly to obtain higher expression animal cell lines.
  • the protein of the present invention can be produced by culturing the above transformed cells under conditions in which a DNA encoding the protein of the present invention can be expressed, and producing and accumulating the protein of the present invention. That is, the present invention provides a method for culturing a transformed cell containing the isolated polynucleotide according to any one of the above (3) to (6) under conditions to express a protein encoded by the polynucleotide; A method for producing the protein, comprising recovering the protein from a medium. Culture of the above transformed cells can be performed by a method known to those skilled in the art (for example, Biomanual Series 4, Yodosha).
  • various animal cell culturing methods for example, attachment culture such as petri dish culture, multi-tray complete culture, module culture, or attachment to a cell culture carrier (microcarrier) or suspension of the production cells themselves
  • the culture may be performed by a known method such as suspension culture.
  • the medium may be a commonly used medium for animal cells, such as D-MEM or RPMI164.
  • separation and purification methods include methods using solubility such as salting-out and solvent precipitation, methods utilizing the difference in charge such as ion exchange chromatography, dialysis, and ultrafiltration. , Gel filtration, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, etc., mainly utilizing differences in molecular weight, affinity chromatography, etc., methods utilizing specific affinity, reversed-phase high-performance liquid chromatography For example, a method utilizing a difference in hydrophobicity such as isoelectric point electrophoresis and a method utilizing a difference in isoelectric point are used.
  • the protein of the present invention can be prepared by ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphine cellulose chromatography, hydrophobic interaction chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography, and the like. It can be recovered from recombinant cell culture and purified by known methods, including lectin chromatography. Most preferably, high performance liquid chromatography is used for purification. When the polypeptide denatures during intracellular synthesis, isolation or purification, well-known techniques for refolding proteins to regenerate active conformations can be used.
  • the protein of the present invention can be produced as a fusion protein with another protein. These are also included in the present invention.
  • a vector used for expressing the fusion protein any vector can be used as long as it can incorporate the DNA encoding the protein and can express the fusion protein. However, it can be used.
  • Protein that can be fused to the peptide of the present invention examples thereof include dalhithion-1S-transferase (GST), a six-consecutive sequence of histidine residues (6XHis), and the like.
  • GST dalhithion-1S-transferase
  • 6XHis six-consecutive sequence of histidine residues
  • the present invention when produced as a fusion protein with GST, it can be purified by affinity mouth chromatography using dallastion as a ligand.
  • the present invention includes a protein that inhibits the activity of the protein of the above (7).
  • antibodies and other proteins that bind to the active center of the protein of the above (7) and prevent the expression of the activity can be mentioned.
  • the present invention relates to an antibody that reacts with the above-mentioned protein of the present invention or a partial peptide thereof, and a method for producing such an antibody. More preferably, the present invention relates to an antibody that specifically reacts with the protein of the present invention or a partial peptide thereof, and a method for producing such an antibody.
  • the term “specific” as used herein means those having low cross-reactivity and those having less cross-reactivity.
  • the antibody may be any of a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, a fragment of these antibodies, a single-chain antibody, and a humanized antibody, as long as the antibody can recognize the protein of the present invention. Antibody fragments can be produced by known techniques.
  • the antibody fragments include, but are not limited to, F (ab ') 2 fragments, Fab' fragments, Fab fragments, and Fv fragments.
  • a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be obtained by administering the protein described in (1) or (2) above to a non-human animal as an antigen or an epitope-containing fragment.
  • An antibody against the protein of the present invention can be produced by using the protein of the present invention or a peptide thereof as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se. For example, the method described in the Experimental Medicine Separate Volume, New Genetic Engineering Handbook, Third Edition, revised.
  • an antibody to the protein or peptide of the present invention is produced by injecting the protein or peptide of the present invention into an animal such as a egret using the protein of the present invention, and then blood is collected. And then For example, it can be prepared by ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, or by purifying the protein by an immobilized affinity column.
  • the protein of the present invention can be prepared using a mouse or the like. The animal was immunized, the spleen was extracted from the mouse, and the spleen was crushed into cells.
  • the cells were fused with a mouse such as polyethylene glycol and a reagent such as polyethylene glycol. From the resulting fused cells (hypridoma), A clone producing an antibody against the protein of the present invention is selected. Next, the obtained hybridoma is transplanted into the peritoneal cavity of a mouse, ascites is collected from the mouse, and the obtained monoclonal antibody is subjected to, for example, ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, or affinity purification of the protein. It can be prepared by purification using a tea column or the like. When the obtained antibody is used for administration to humans, a humanized antibody or human antibody may be used to reduce immunogenicity. preferable.
  • humanized antibodies ⁇ humanized antibodies can be produced using transgenic mice or other mammals.
  • a general review of humanized antibodies can be found, for example, in Morrison, S. L. eta 1. CP roc. Nat 1. Ac d. S ci. USA,
  • a humanized chimeric antibody can be prepared by combining the V region of a mouse antibody and the C region of a human antibody by genetic recombination.
  • a humanized antibody can be prepared by substituting a region other than the complementarity determining site (CDR) from a mouse monoclonal antibody with a sequence derived from a human antibody.
  • CDR complementarity determining site
  • a mouse in which the immune system is replaced with a human one can be used to immunize the mouse to directly produce a human antibody in the same manner as a normal monoclonal antibody.
  • These antibodies can be used to isolate and identify clones expressing protein.
  • These antibodies can also be used to purify the protein of the present invention from a cell extract or a transformed cell producing the protein of the present invention.
  • these antibodies can be used for constructing an ELISA or RIA (radioimmunoassay) for detecting the protein of the present invention in cells or tissues, or a Western plot system.
  • a detection system It can be used for diagnostic purposes to detect the abundance of the protein of the present invention in an animal, preferably a body sample such as human tissue or intravascular fluid.
  • these antibodies may cause abnormalities in the expression of the protein of the present invention, such as allergic diseases, inflammation, autoimmune diseases, diabetes, hyperlipidemia, infectious diseases (eg, HIV infection), and cancer. It can be used in the diagnosis of diseases characterized by unwanted activation of STAT6.
  • normal values ie standard values
  • for the expression of the protein of the invention must be established, which are well known to those skilled in the art. That is, under suitable conditions for complex formation, either a human or animal animal, but a body fluid or a cell extract obtained from a normal subject is allowed to bind to an antibody against the protein of the present invention.
  • the amount of the antibody-protein complex is detected by chemical or physical means, and is obtained from a normal sample using a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of the antigen (the protein of the present invention).
  • the calculated standard value is calculated.
  • the standard value is compared to a value obtained from a sample from a subject potentially suffering from the disease associated with the protein of the present invention.
  • the deviation from the standard value can confirm the presence of the disease.
  • these antibodies can also be used as reagents for studying the function of the protein of the present invention.
  • the antibodies of the present invention can be purified and then purified of the proteins of the present invention, such as, for example, allergic diseases, inflammation, autoimmune diseases, diabetes, hyperlipidemia, infectious diseases (eg, HIV infection), cancer, etc. Expression) can be administered to patients with diseases characterized by unwanted activation of STAT6 due to abnormalities. That is, the present invention is a medicine containing the above-described antibody as an active ingredient, and a therapeutic method using the antibody.
  • medicaments may be combined with additional active or inactive ingredients (eg, conventional pharmaceutically acceptable carriers or diluents (eg, immunogenic adjuvants)) for therapeutic use, as well as physiologically non-toxic.
  • additional active or inactive ingredients eg, conventional pharmaceutically acceptable carriers or diluents (eg, immunogenic adjuvants)
  • additional active or inactive ingredients eg, conventional pharmaceutically acceptable carriers or diluents (eg, immunogenic adjuvants)
  • stabilizers and excipients sterilized by filtration, and placed into dosage forms by lyophilization in dosage vials or as storage in stabilized aqueous preparations.
  • the administration can be performed by a method known to those skilled in the art, for example, by intra-arterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, etc.
  • the dosage varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like.
  • the appropriate dose can be appropriately selected if necessary. Inhibits the promotion of ST
  • the DNA of the present invention can also be used to isolate, identify, and clone other proteins involved in intracellular signaling processes.
  • a DNA sequence encoding the protein of the present invention may be obtained by using the encoded protein as “baitJ” to convert a protein capable of binding to the protein of the present invention from a cDNA or genomic DNA library.
  • Other sequences encoding the sequence "prey” can be isolated and used in a yeast two-hybrid system (eg, Nature, 340: 245-246 (198 9)).
  • a method capable of isolating a protein capable of binding to the protein of the present invention from a cell extract by immunoprecipitation using an antibody against the protein of the present invention for example, New Genetic Handbook for Experimental Medicine. Is mentioned.
  • the protein of the present invention is expressed as a fusion protein with another protein, and immunoprecipitation is performed using an antibody against the fusion protein to bind to the protein of the present invention. There is a method for isolating the obtained evening protein.
  • the diagnostic assay provides a method for diagnosing a disease or determining susceptibility to the disease by detecting a mutation in a nucleotide sequence encoding a protein that promotes STAT6 activation by the method described above.
  • diseases may be diagnosed by methods that include measuring an abnormal decrease or increase in protein or mRNA levels in a sample from the individual. Decreasing or increasing expression can be accomplished by methods well known in the art for quantifying polynucleotides at the RNA level, such as nucleic acid amplification such as RT_PCR, RNase protection, and the Northern blot method. And other hybridization methods.
  • Atsay techniques that can be used to determine protein levels in a sample derived from a host are well-known to those of skill in the art.
  • the DNA of the present invention encodes the protein of the present invention or a peptide fragment thereof. Can be used to detect abnormalities in the loaded DNA or mRNA.
  • the present invention relates to a method for diagnosing a disease or a susceptibility to a disease associated with expression of the protein described in (1), (2) or (7) in an individual. The method includes measuring a mutation in a polynucleotide sequence that encodes the protein.
  • the DNA of the present invention can detect abnormalities in DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof by using the DNA of the present invention. It is useful for genetic diagnosis such as damage, mutation or decreased expression, increased expression or overexpression. That is, the present invention provides a method for diagnosing a disease or susceptibility to a disease in an individual, which is related to the expression or activity of the protein in the individual,
  • the mutation when there is a mutation in the nucleotide sequence encoding a protein that promotes STAT6 activation, the mutation may cause a disease related to STAT6 expression or activity.
  • the protein expression level of the above (1), (2) or (7) in a subject is measured and shows a value different from the normal value. Abnormal expression of novel proteins may be responsible for diseases related to STAT6 expression or activity.
  • a method for measuring the presence or absence of a mutation in a nucleotide sequence encoding a protein that promotes the activation of STAT6 in (a) a part of a nucleotide sequence encoding the protein is used as a primer, RT-PCR is performed, and the sequence is then determined by conventional nucleotide sequencing methods to detect the presence or absence of the mutation. Or? Shaku-33? The presence of mutations can also be checked by the method (6111017, 03: 5: 874-87, 1989, New Handbook of Genetic Engineering for Handbook of Experimental Medicine).
  • a method for examining the protein expression level in (b) for example, a method using the antibody described in (16) above can be mentioned.
  • the present invention also relates to a method for screening a compound that inhibits or promotes the activation of STAT6 by the protein of the present invention.
  • the compound that inhibits the activation of STAT6 has the activity as an inhibitor of STAT6 in invivo or invitro.
  • a compound that promotes the activation of STAT6 has an activity as an activator of STAT6 in invivo or invitro as a result of its action. Therefore, the above-mentioned screening method screens for the activity as an inhibitor or activator of STAT6, and the compound has the activity as an inhibitor or activator of STAT6.
  • the above screening method is
  • a compound that increases the signal by a factor of 2 or more than normal is used as an activator, and a compound that reduces the signal to 80 or less is isolated or identified as an inhibitor compound.
  • Components that can provide a detectable signal include, for example, a reporter gene.
  • the reporter gene is used instead of directly detecting the activation of the transcription factor to be tested.
  • the promoter of the gene to be examined is linked to the reporter gene, and the activity of the reporter gene product is measured. In this study, we analyze the transcriptional activity of Promo-Yuichi. (1 994)).
  • any gene encoding any peptide or protein can be used as long as the activity or production amount (including mRNA production amount) of the expression product can be measured by those skilled in the art.
  • it can be used by measuring the activity of chloramphenicolacetyltransferase, 3-galactosidase, luciferase and the like.
  • the reporter plasmid used to evaluate STAT 6 activation may be any that incorporates a STAT 6 recognition sequence upstream of the reporter gene, such as CD23 or germ 1ine C epsilon transcription. Sequences from the start site are available. J. Biol. Chem. 275, 26500 -26 506 (2000), J. Ex p. Med. 190, 1837-1848 (1999), J. Immuno 1.1. 50, 540 S-54 17 (1993) and J. Immunol. 157, 2058-2065 (1996).
  • the host cell may be any cell capable of detecting the promotion of STAT6 activation, and is preferably a mammalian cell.
  • NIH3T3 cells, HepG2 cells and the like are suitably used.
  • the transformation and culture are as described above.
  • Screening for a compound that inhibits or promotes the activation of STAT6 is performed, for example, by adding an arbitrary amount of a test substance to transformed cells cultured for a certain period of time and expressing the cells after a certain period of time.
  • a compound that inhibits or promotes STAT6 activation can be screened by measuring the repo overnight activity and comparing it with the reporter activity of cells to which no test substance is added. At this time, if necessary, an appropriate stimulus, such as addition of IL-14, may be simultaneously performed.
  • the reporter activity can be measured by methods known to those skilled in the art (for example, Biomanual Series 4, Yodosha (19).
  • test substance for screening is not particularly limited, and examples thereof include low molecular weight compounds and peptides.
  • the test compound may be artificially synthesized or naturally occurring. It can be a single substance or a mixture.
  • Detectable signals include STAT in addition to the above reporter gene.
  • L-1 receptor antagonist CD23, MHC class II, STAT6
  • the gene mRNA or protein amount may be measured.
  • Activated STAT 6 can also be quantified by a method for detecting the binding between DNA and protein, such as a gel mobility shift method using a nuclear extract.
  • STAT6 phosphorylation may be quantified using a cell extract.
  • the measurement of the amount of mRNA includes, for example, Northern hybridization ⁇ RT-PCR method.
  • the measurement of the amount of evening protein includes, for example, a method using an antibody.
  • the antibody may be prepared by a known method, or a commercially available antibody (for example, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) may be used.
  • a pharmaceutical composition can be produced by the following steps (a) to (f).
  • the protein of the present invention may be used in a method for designing an agonist, an agonist or an inhibitor of the protein based on the structure by the following steps.
  • the present invention also includes the compounds obtained by the above screening.
  • the screening method of the present invention is not limited to the above method.
  • the present invention also includes a method for producing a pharmaceutical composition by the method described in (14).
  • the candidate compound is not particularly limited, and includes a low molecular compound, a peptide, and the like.
  • the candidate compound may be an artificially synthesized compound or a naturally occurring compound. Since the compound obtained by the above screening has an action of inhibiting or promoting the activation of STAT 6, it is possible to treat or prevent a disease caused by undesirable activation or inactivation of STAT 6. It is useful as a medicament.
  • a method known per se for example, filtration, extraction, washing, drying, concentration, crystallization, various types of chromatography and the like can be appropriately combined.
  • the compound may be purified as it is when the compound is obtained in the form of a salt, and when the compound is obtained in a free form, it may be dissolved or suspended in an appropriate solvent by an ordinary method.
  • a desired acid or base may be added to form a salt, followed by isolation and purification.
  • the step of optimizing a compound or a salt thereof obtained by using the method of the present invention as a pharmaceutical composition includes, for example, formulating a compound by a conventional method as follows.
  • compositions suitable for oral administration include solid forms such as tablets, granules, capsules, pills, and powders, and liquid forms such as solutions, syrups, elixirs, and suspensions.
  • Useful forms for parenteral administration include sterile solutions, emulsions, and suspensions.
  • examples of the carrier include sugars such as gelatin, lactose, and glucose; corn-wheat * rice * starches such as corn starch; fatty acids such as stearic acid; fatty acid salts such as calcium stearate and magnesium stearate; talc; and vegetable oils. And alcohols such as stearin alcohol and benzyl alcohol, gums, polyalkylene glycols and the like.
  • examples of the liquid carrier generally include water, physiological saline, dextrose or a similar sugar solution, and glycols such as ethylene glycol, propylene glycol, and polyethylene glycol.
  • the present invention relates to activity as an inhibitor or activator of STAT 6 activation. It is a kit for screening compounds.
  • the kit is
  • a reagent for measuring the detectable signal which comprises a reagent necessary for screening a compound that inhibits or promotes STAT6 activation.
  • the invention provides:
  • 3 32 334. 336 338 340, 342, 344, 346, 348, 3 50.352.354. 3 56 358, 360, 362, 364, 366, 3 68 370.372- 374. 376, 378, 380, 382 , 384, 386. 388- 390.
  • a protein of the present invention having an amino acid sequence represented by 452, 454, 456, 458, 460, 462, 464, 466, 468, 470, 472, 474, 476, 478, 480, 482 or 484 or a fragment thereof; Or
  • Kits containing at least one of (a) to (d) are useful for diseases such as allergic disease, inflammation, autoimmune disease, diabetes, hyperlipidemia, infectious disease (eg, HIV infection), and cancer. Alternatively, it is useful for diagnosing susceptibility to the disease.
  • STAT 6 is attractive for drug design and therapeutic intervention due to its involvement in a variety of pathological conditions such as allergic diseases, inflammation, autoimmune diseases, diabetes, hyperlipidemia, cancer and viral infections. Target. Numerous experiments have shown that inhibition of STAT 6 activity can have profound physiological effects [e.g., Nature 380, 627-630 (1996), Nature 380, 630-633 (1996). , I mmunity 4, 3 1 3-3 19 (1 996), J.
  • the present invention relates to a method of using a compound that inhibits the function of a protein having the effect of promoting the activation of STAT6 for inhibiting the activation of STAT6.
  • Compounds that inhibit STAT 6 activation obtained by the above screening method include, for example, allergic diseases, inflammation, autoimmune diseases, diabetes, hyperlipidemia, infectious diseases (for example, HIV infection), cancer And the like, are useful as drugs for treating or preventing diseases characterized by unwanted activation of STAT6.
  • activation of STAT 6 promotes differentiation into Th2 cells, diseases in which Thl is hyperactive, for example, organ-specific autoimmunity such as multiple sclerosis and insulin-dependent diabetes mellitus.
  • organ-specific autoimmunity such as multiple sclerosis and insulin-dependent diabetes mellitus.
  • the potential for alleviation and treatment of diseases and rheumatism is also conceivable.
  • a compound that promotes the activation of STAT 6 obtained by the above screening method is useful as a medicament for treating or preventing these diseases.
  • the gene encoding the protein of the present invention is useful for cancer, It is also useful in gene therapy for the treatment of various diseases, including autoimmune diseases, diabetes, hyperlipidemia, allergic diseases, and inflammatory responses.
  • Gene therapy refers to the administration of a gene or cells into which a gene has been introduced into a human body for the purpose of treating a disease.
  • the protein of the present invention—the DNA encoding the protein can also be used for diagnostic purposes.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method of the present invention is used as the above-mentioned pharmaceutical composition, it can be carried out according to a conventional method.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions and the like can be used.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, for example, against humans and mammals (eg, rats, puppies, sheep, bush, bush, cats, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • Administration to a patient can be performed by a method known to those skilled in the art, such as intraarterial injection, intravenous injection, and subcutaneous injection.
  • the dose varies depending on the weight and age of the patient, the administration method, and the like, but those skilled in the art can appropriately select an appropriate dose.
  • the DNA may be incorporated into a vector for gene therapy to perform gene therapy.
  • the dose and administration method vary depending on the patient's weight, age, symptoms, etc., and can be appropriately selected by those skilled in the art. That is, the present invention relates to a medicament containing the above compound as an active ingredient.
  • the compounds are useful for treating or preventing diseases characterized by unwanted activation of STAT6, such as allergic diseases, inflammation, autoimmune diseases, diabetes, hyperlipidemia, viral diseases, infectious diseases, and cancer. It is useful as a medicament. That is, the present invention relates to a medicament containing the above compound, such as an allergic disease, inflammation, autoimmune disease, dysuria, hyperlipidemia, viral disease, and cancer. Specifically, for example, treatment for rheumatoid arthritis, osteoarthritis, systemic lupus erythematosus, diabetes, sepsis, asthma, allergic rhinitis, ischemic heart disease, inflammatory bowel disease, subarachnoid hemorrhage, diarrhea hepatitis, AIDS, etc. And as a prophylactic.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition produced by the method according to the above (14) in the manufacture of a medicament for allergic diseases, inflammation, autoimmune diseases, diabetes, hyperlipidemia, viral diseases, cancer and the like. Including the use of
  • the present invention also includes antisense oligonucleotides to the genes described in (3) to (6).
  • Antisense oligonucleotides use oligonucleotides with sequences complementary to the targeted gene sequence to translate into proteins, transport into the cytoplasm, or perform other activities required for overall biological activity. By inhibiting the function of RNA, expression of the target gene can be suppressed. At this time, RNA or DNA may be used as the antisense oligonucleotide.
  • the DNA sequence of the present invention can be used to prepare an antisense oligonucleotide capable of hybridizing with mRNA transcribed from a gene encoding the protein of the present invention.
  • antisense oligonucleotides generally act repressively on the expression of their genes (for example, Cell Engineering Vol. 13 No. 4 (1994)). Oligonucleotides having an antisense coding sequence for the gene encoding the protein of the present invention can be introduced into cells by standard methods, and the oligonucleotide is used to translate the mRNA of the gene encoding the protein of the present invention. Is effectively blocked, its expression is blocked and undesired effects are inhibited.
  • the oligonucleotide of the present invention may be a modified one in addition to an oligonucleotide found in nature [for example, Murakami & Makino: Cell Engineering ⁇ ol.
  • oligonucleotides One e The phosphodiester bond is replaced by a structure that functions to increase the ability of the composition to penetrate the area of the cell where the RNA whose activity is to be modulated is located.
  • Such substitutions preferably include a phosphorothioate linkage, a phosphoramidate linkage, a methylphosphonate linkage, or a short-chain alkyl or cycloalkyl structure.
  • Oligonucleotides may also include at least some modified nucleotide forms. Thus, purines and pyrimidines other than those normally found in nature may be used. Similarly, the furanosyl portion of the nucleotide subunit may be modified as long as the essential spirit of the invention is practiced. Examples of such modifications are 2,111-alkyl-, and 2'-halogen-substituted nucleotides.
  • modifications at the 2 ′ position of some sugar moieties useful in the present invention are ⁇ H, SH, SCH 3 , OCH 3 , OCN, or O (CH 2 ) n CH 3, where n is 1 to About 10 '), and other substituents having similar properties. All such analogs are encompassed by the present invention as long as they hybridize to the mRNA of the gene of the present invention and function to inhibit the function of the RNA.
  • Oligonucleotides of the invention comprise from about 3 to about 50 nucleotides, preferably from about 8 to about 25 nucleotides, and more preferably from about 12 to about 20 nucleotides.
  • the oligonucleotide of the present invention can be produced by a well-known method, solid phase synthesis. Equipment for such synthesis is sold by several vendors, including Applied Biossystems. The production of other oligonucleotides such as phosphotiates can be made by methods known to those skilled in the art.
  • the oligonucleotide of the present invention is designed so as to be able to hybridize with mRNA transcribed from the gene of the present invention.
  • a person skilled in the art can easily design an antisense oligonucleotide based on the sequence of a given gene [for example, Murakami and Makino: Cell Engineering Vol. 13 No. 4 P259- 266
  • antisense oligonucleotides designed in the 5 'region of the mRNA preferably in the region containing the translation initiation site, have It suggests that it is most effective at inhibiting the present.
  • the length of the antisense oligonucleotide is preferably 15 to 30 nucleotides, more preferably 20 to 25 nucleotides. It is important to confirm by homology search that there is no interaction with other mRNAs and that no secondary structure is taken in the oligonucleotide sequence.
  • the antisense oligonucleotide into the cells, and determining the amount of the target mRNA (for example, By measuring the amount of the target protein (eg, Northern blot or RT-PCR method) (eg, Western blot or fluorescent antibody method), the effect of suppressing the expression can be confirmed.
  • the target protein eg, Northern blot or RT-PCR method
  • the effect of suppressing the expression can be confirmed.
  • triple helix formation is a method of controlling gene expression mainly at the transcriptional stage, targeting nuclear DNA.
  • Oligonucleotides are designed primarily in regions of the gene that are involved in transcription, thereby suppressing transcription and production of the proteins of the invention. These RNAs, DNAs and oligonucleotides can be produced using a known synthesizer or the like.
  • the oligonucleotide of the present invention can be introduced into a cell containing the target nucleic acid sequence by, for example, a DNA transfection method such as a calcium phosphate method, a lipofection method, an electroporation method, a microinjection method, or a gene such as a virus.
  • the gene may be introduced using any of the gene transfer methods including the use of a vector.
  • An antisense oligonucleotide expression vector is prepared using an appropriate retroviral vector, and then the expression vector can be introduced into a cell containing a target nucleic acid sequence by contacting the cell with the cell using inVivo or exVivo.
  • the DNA of the present invention can be used to inhibit the promotion of protein-mediated activation of STAT6 using the antisense RNAz DNA technology or triple helix technology.
  • the antisense oligonucleotide of the gene encoding the protein of the present invention can be used for, for example, STAT such as allergic disease, inflammation, autoimmune disease, diabetes, hyperlipidemia, infectious disease (eg, HIV infection) and cancer. It is useful as a medicament for treating or preventing a disease characterized by the undesirable activation of 6. That is, the present invention relates to a medicine containing the antisense oligonucleotide as an active ingredient. is there. Further, the antisense oligonucleotide of the present invention can also be used for detecting those diseases by using the Northern hybridization method or the PCR method.
  • the present invention also includes ribozymes that inhibit STAT6 activation.
  • Liposomes are RNAs that have the activity of recognizing the nucleotide sequence of a nucleic acid and cleaving the nucleic acid (for example, Hiroshi Yanagawa Experimental Medical Bioscience 12, RNA New Age). Ribozymes can be engineered to cleave selected target RNAs, for example, mRNA encoding a protein of the invention.
  • a ribozyme that specifically cleaves the mRNA of the protein of the present invention can be designed based on the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein of the present invention. Such a ribozyme can be used as the mRNA of the protein of the present invention.
  • Has a complementary sequence to the mRNA complementarily binds to the mRNA, and then the mRNA is cleaved to decrease (or not completely express) the protein of the present invention, and the level of the decreased It depends on the level of ribozyme expression in the cell.
  • hammerhead type There are two types of liposomes that are frequently used: hammerhead type and hairpin type.
  • hammerhead type ribozymes have been well studied for their primary and secondary structures required for cleavage activity. If it is, it is possible to easily design a lipozyme using only the nucleotide sequence information of the DNA encoding the protein of the present invention [for example, Iida et al .: Cell Engineering Vol.16 No.3, P438-445 (1997), Okawa & Tahira: Experimental Medicine Vol.12
  • the hammerhead lipozyme has a structure consisting of two recognition sites (recognition site I and recognition site II) that form a complementary strand with the target RNA and an active site, and after forming a complementary pair with the target RNA, NUX sequence of target RNA
  • a GTC (or GTA) sequence was searched from the DNA sequence of the present invention.
  • the liposome is designed so that a complementary pair of several to over a dozen nucleotides can be created before and after that.
  • the appropriateness of the designed ribozyme can be evaluated, for example, by the method described in the literature of Okawa & Tahira [Experimental Medicine Vol.12 No.12 p83-88 (1994)]. It can be evaluated by checking whether it can be disconnected.
  • Ribozymes are prepared by methods well known in the art for synthesizing RNA molecules.
  • the ribozyme sequence is synthesized on a DNA synthesizer and incorporated into a variety of vectors with appropriate RNA polymerase promoters, such as T7 or SP6, to enzymatically synthesize RNA in vitro. There is a method to make it. These ribozymes can be introduced into cells by a gene introduction method such as a microinjection method. Alternatively, as another method, the ribozyme DNA is incorporated into an appropriate expression vector and introduced into a cell line, cell or tissue.
  • Appropriate vectors can be used to introduce the ribozyme into the selected cells, such as plasmid vectors, animal virus (eg, retrovirus, adenovirus, herpes or vaccinia virus) vectors. These ribozymes usually used for these purposes have an effect of inhibiting the protein-mediated promotion of STAT6 activation of the present invention.
  • animal virus eg, retrovirus, adenovirus, herpes or vaccinia virus
  • the DNA encoding the protein having the action of promoting STAT6 activation according to the present invention is a method for producing a full-length cDNA library using an oligocapping method and its function. And a method using a signal factor indicating the presence of the protein.
  • Signaling factors include, for example, a reporter gene.
  • cDNAs functional genes
  • a library that has a high percentage of full-length clones among all clones is required.
  • Full-length cDNA is a complete copy of mRNA made from a gene.
  • the cDNA library prepared by the oligocabbing method has a percentage of full-length cDNA of 50 to 80%, which is 5 to 10 times that of the cDNA library prepared by the conventional method.
  • c DNA clones are concentrated (Sumino Kanno: Monthly BIO INDUSTRY Vol.16 No.11 ⁇ 19-26).
  • Full-length cDNA is an essential clone for protein expression in gene functional analysis, and the clone of full-length cDNA itself is extremely important as a material for activity measurement. Therefore, cloning of full-length cDNA is an essential requirement when trying to analyze gene functions. Determining the sequence also provides important information for determining the primary sequence of the encoded protein, as well as the sequence of all exons of the gene. In other words, full-length cDNAs also provide valuable information for gene identification, such as the primary sequence of proteins, exon-intron structure, mRNA transcription start site, and promoter position.
  • a reporter gene that indicates the presence of a functional protein consists of an appropriate expression control sequence (one or more) that can bind to a protein factor such as a transcription factor, and a structural gene that can measure activation by that transcription factor.
  • a protein factor such as a transcription factor
  • a structural gene that can measure activation by that transcription factor Become.
  • any gene encoding any peptide or protein can be used as long as the activity or production amount (including mRNA production amount) of the expression product can be measured by those skilled in the art.
  • chloramphenicol-cetyltransferase, 5-galactosidase, luciferase and the like can be used, and can be used by measuring the enzyme activity.
  • the oligocapping method is a method of replacing the cap structure with synthetic oligos using BAP, TAP, and RNA ligase, as described in Suzuki * Sugano Experimental Medicine Supplement, 3rd Edition of the Handbook of Genetic Engineering Revised Edition. .
  • an in vitro system or a cell-based (cel1-based) system can be used. Either method may be used, and a cell-based system is preferable.
  • the cells may be any of prokaryotic organisms such as Escherichia coli, microorganisms such as yeasts and fungi, and cells of insects and animals, and are preferably animal cells.
  • NA cells and NIH3T3 cells can be exemplified.
  • the CREB (cAMP responsive element binding protein) binding sequence has an AP-1 (activator protein-1) binding sequence.
  • Repo-over-one gene in the part For example, if one wants to obtain a gene that has the function of activating CREB, a co-transfected CREB-dependent repo overnight plasmid and a full-length cDNA clone created by the oligo capping method into cells, The objective can be achieved by selecting a plasmid whose activity has increased overnight.
  • a CREB-dependent reporter plasmid and a full-length cDNA clone prepared by the oligocabbing method are co-transfected into cells, and the reporter
  • the objective can be achieved by selecting a plasmid having a reduced activity overnight.
  • the reaction may be performed with some stimulation applied to the cells.
  • Introducing a cDNA clone into cells may be a single clone or multiple clones may be introduced simultaneously.
  • the cDNA of the present invention is a full-length cDNA
  • the sequence at the 5 'end is the transcription start point of mRNA
  • the cDNA sequence is compared with the nucleotide sequence of the genome to promote the gene. It can be used to identify the evening region. If the nucleotide sequence of the genome is registered as a known sequence in a database, that sequence can be used. Alternatively, the nucleotide sequence can be determined by cloning from the genomic library using the cDNA, for example, by hybridization. In this way, by comparing the nucleotide sequence of the cDNA of the present invention with the sequence of the genome, it is possible to identify the promoter region of the gene present upstream thereof.
  • a repo overnight plasmid for examining the expression of the gene can be prepared using the promoter fragment of the gene identified as described above.
  • the reporter plasmid is usually a DNA fragment 2 kb upstream from the transcription start site, preferably 1 kb upstream from the transcription start site. Can be produced by integrating the gene upstream of the reporter gene.
  • the report plasmid can be used for screening for a compound that enhances or attenuates the expression of the gene. Specifically, for example, an appropriate cell is transformed with the repo overnight plasmid, a test substance is added to the transformed cells cultured for a certain period of time, and a reporter expressing the cell after a certain period of time is added. Screening can be performed by measuring the activity and comparing it with the reporter activity of cells to which no test substance is added. These are also included in the present invention.
  • the present invention provides SEQ ID Nos: 24, 6, 8, 1100, 1122, 1144, 16, 18 and 2
  • the present invention relates to a computer-readable medium storing a data set containing at least one of the amino acid sequences represented by 480, 482 or 484. Furthermore, the present invention relates to a method for calculating the homology by comparing the data on the medium described above with the data of another nucleotide sequence. That is, the polynucleotide sequence and the amino acid sequence of the present invention are valuable information sources for determining their two-dimensional and three-dimensional structures and identifying, for example, further highly homologous sequences having similar functions. These sequences are stored on a computer-readable medium and then stored in a known polymer structure program using the data stored in the GCG program.
  • the computer readable medium can be any composition of matter used to store information or data, including, for example, commercially available floppy disks, tapes, chips, hard disks, compact disks, and video disks.
  • the data on this medium enables a method of calculating homology as compared with data of other nucleotide sequences.
  • the method includes providing a first polynucleotide sequence comprising a polynucleotide sequence of the present invention in a computer readable medium, and then converting the first polynucleotide sequence to at least one second polynucleotide or polypeptide sequence. Identifying the homology as compared to The present invention also relates to SEQ ID NOs: 24, 6, 8, 10, 12, 14, 14, 16, 18,
  • a polynucleotide comprising all or part of a nucleotide sequence selected from 1 or 483 For immobilized insoluble substrates.
  • a plurality of various polynucleotides, which are DNA probes, are immobilized on a specially processed substrate such as a slide glass, and then the labeled target polynucleotide is hybridized with the immobilized polynucleotide, and the respective probe Detect the signal. The resulting data is analyzed and gene expression is measured.
  • the present invention also relates to SEQ ID NOs: 1, 3, 57, 9, 11, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 21, 23, 25, 27, 29, 31 1, 33 35, 37 , 39, 41,
  • RNA from human lung fibroblasts (Cryo NHL F) Human lung fibroblasts (Cryo NHL F: purchased from Sanko Junyaku Co., Ltd.) were cultured according to the protocol attached did. After subculturing up to 50 10 cm Petri dishes, the cells were collected with a cell scraper. Next, total RNA was obtained from the collected cells using an RNA extraction reagent ISOGEN (purchased from Futaba Gene). The specific method of acquisition was in accordance with the reagent protocol. Then, poly A + RNA was obtained from the total RNA using an oligo-dT cellulose column. The specific method for obtaining poly A + RNA was in accordance with the above-mentioned test book of Maniatis.
  • a full-length cDNA library was prepared from the above poly A + RNA by an oligocapping method.
  • a specific method for producing a full-length cDNA library by the oligo capping method is described by Sugano et al. [For example, Maruyama, K. & Sugano, S. Gene, 138: 171-174. (1 994), Suzuki. Y. eta 1. Gene, 200: 149-156 (1997), Suzuki-Sugano Experimental Medicine Separate Volume, Genetic Engineering Handbook, Third Edition].
  • the full-length cDNA library prepared in the above example was transformed into the E. coli TOP10 strain by electroporation, and then spread on an LB agar medium containing 100 g'm1 ampicillin, and then incubated at 37 ° C. Incubated overnight at C. Subsequently, plasmids were recovered from the colonies of E. coli grown on LB agar medium containing ampicillin using ⁇ 31 811 196 UltraPIAsmidKit from QIA0 £ 1 ⁇ . The specific method followed the protocol attached to QIAwe1196UltraP1asmidKit.
  • Luciferase Reporter Plasmid N4X 8 luc 100 ng having a STAT 6 response element and the full-length cDNA 2 ⁇ 1 prepared in Example 1. (3) above. Co-introduced to 1 ⁇ L. The method of introduction followed the attached protocol.
  • the luciferase reporter plasmid N4X8-1uc having the STAT6 response element was constructed as follows.
  • C CTGGGAAGAAGAGC—3 ′ (SEQ ID NO: 486) was synthesized.
  • the synthetic oligonucleotides were each dissolved in sterile water so as to have a concentration of 1 ng / a1, mixed with 10 ⁇ l each, and further adjusted to 321 with sterile water. After heating the solution at 90 ° C. for 5 minutes, it was gradually cooled to room temperature to prepare a double-stranded oligonucleotide solution.
  • the solution was reacted using T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) according to the attached manual, and the reaction product was purified according to a conventional method.
  • T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo) according to the attached manual, and the reaction product was purified according to a conventional method.
  • the SV40 promoter region of the pGL3—Promote vector (Promega) was replaced with HindII.
  • a vector tk—1 uc replaced by 50 to +10) was constructed.
  • the double-stranded oligonucleotide fragment at the XhoI site of the tk-1 uc vector was constructed.
  • N4X4-1uc From the N4X4-1uc plasmid, four ligated DNA fragments were excised and purified using the XhoI site and the Bg1II site, followed by purification of pBluescripipt.
  • the long-lasting luciferase assay system Pitkagene LT2.0 (Toyo Ink Co., Ltd.) was used to measure the repot overnight activity (luciferase activity) of STAT6 according to the attached instructions.
  • the luciferase activity was measured using Wa11acAR VOTMST 1420 MULTI LABEL CUNTER from Perkin E1mer.
  • the above screening was performed for 15,000 clones, and the luciferase activity was compared with that in a control experiment (luciferase activity of cells into which empty vector pME18S-FL3 was introduced instead of full-length cDNA). Plasmids that have increased by a factor of 3 or more are selected. : 5 '-CGACCTGCAGCTCGAGCAC A-3' (SEQ ID NO: 4S8)), a one-pass sequence was performed for each, and the length was determined as long as possible.
  • the data of the luciferase activities of the nucleotide sequences obtained by the above screening are shown in the following table.
  • the numerical values indicate the luciferase activity of the cells into which the nucleotides of each SEQ ID NO were introduced, and the luciferase activity of the cells into which ME18S-FL3 was introduced.
  • the activity value divided by the elastase activity is shown. Luciferase activity can be measured in the same manner for nucleotides having SEQ ID NOs not shown in the table.
  • Example 3 Screening NIH 3 T 3 cell of a compound that inhibits the promotion of activation of S TAT 6 to 9 6 we 1 1 plate for cell culture, 1 X 1 0 4 C e 1 1 s / 1 00 1 'we 1 so that the number of cells 1, plated on I MD M medium 1 0 3 ⁇ 4 FBS presence of 5% C_ ⁇ 2 presence cultured for 24 h in 3 7 ° C.
  • the gene of the present invention is a gene source used for gene therapy. It is also useful. All publications, patents, and patent applications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

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Description

明 細 書
STAT 6活性化遺伝子 技術分野
本発明は、 STAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質、 該タンパ ク質をコードする DNA、 該 DNAの取得方法、 該 DNAを含有する組換えべク 夕一、 該組換えベクターを含有する形質転換体ならびに該タンパク質と反応する 抗体に関する。 また、 本発明は、 STAT 6の過剰な活性化または阻害が関与す る疾患の診断、 治療または予防を行う際の本発明のタンパク質、 DNAまたは抗 体の使用に関する。
また、 本発明は、 該タンパク質、 DNA、 組換えベクターおよび形質転換体を 用いて、 STAT 6の活性化を阻害または促進する物質をスクリ一二ングする方 法に関する。 背景技術
Mo s man nらは、 免疫応答において中心的な役割を担っているヘルパー T 細胞 （以下、 Thと略す） が、 異なる二つのサブセットに分類されることを提唱 した （ J . I mmu n o 1. ( 1 986) 1 36 : 2348— 2 3 57)。彼らは、 サイトカイン産生のパターンに基づき、 Th 1と Th 2の 2種類の細胞に分類し た。 Th 1細胞は、 Th 1タイプサイトカインと称されるインタ一ロイキン 2 ( I
L一 2)、 インターフェロン r (I FN—ァ）、 腫瘍壊死因子 j3 (TNF- j3) 等 を産生し、 ウィルス感染などにおける細胞性免疫を活性化する。 一方 Th 2細胞 は、 Th 2タイプサイトカインと称されるィンターロイキン 4 ( I L一 4)、 イン ターロイキン 5 (I L— 5)、 インターロイキン 10 (I L— 10)、 イン夕一口 ィキン 13 (I L— 13) 等を産生し、 寄生虫などの細胞内寄生微生物の感染や 抗原 ·アレルゲンの暴露に対する抗体産生などの液性免疫に関与する。 このよう に、 生体における種々の免疫応答を Th細胞のタイプにより分類し、 Th lと T h 2細胞のバランスによって病的な免疫反応を理解しょうとする考えが現れて、 Th 1病、 Th 2病という概念も提唱されてきている。
Th 2はアレルギー反応に関わる多くのサイトカインを産生することから、 T h 2の機能亢進が喘息などのアレルギー疾患を引き起こすと考えられている。
I L一 4は、 活性化 Tリンパ球、 好塩基球、 及び肥満細胞によつて分泌される 免疫調節サイ卜力インである。 I L— 4は B細胞の増殖や I gE、 I gG lの産 生を誘導するとともにマスト細胞の活性化、 増殖も誘導する。 また、 好酸球が血 管内皮細胞に接着、 組織浸潤する際に機能する VC AM— 1の遺伝子発現も誘導 する。 さらに、 I L一 4は、 Th 2細胞への分化、 造血前駆細胞の増殖および分 化において重要な役割を果たすことが示されている。
I L— 1 3は、 活性化 Tリンパ球、 マスト細胞、 好塩基球、 NK細胞、 樹状細 胞から分泌されるサイトカインである。 I L一 4に対してほぼ 30 %の配列相同 性を有し、 単球 ·マクロファージ、 B細胞に対して I L一 4様の活性を示す。 し かしながら、 I L一 1 3は T細胞には作用しない。
I L._4、 I L- 1 3がその細胞表面上のそのレセプターに結合すると細胞内 チロシンキナーゼが活性化され、 いくつかの細胞内タンパク質のチロシンリン酸 化を介し細胞内へシグナルが伝達される。 近年の分子生物の発展により、 I L一 4レセプ夕一からのシグナリングの機構が解明され、 主要細胞内伝達分子が同定 されてきた。 その中でも重要な分子として S T AT 6分子が見いだされた。
STAT 6は STAT (S i gn a l T r a n s d u c e r n d Ac t i v a t o r o f T r an s c r i p t i o n)ファミリ一の一員である。
S TATとは種々のサイトカインゃ成長因子レセプ夕一下流で刺激に依存して機 能する転写因子である。 ほ乳類ではこれまでに S T AT 1， 2, 3 , 4, 5 a，
5 b, 6の 7種が同定されている。 サイト力インなどのリガンドがそのレセプ夕 一へ結合すると J AKフアミリーと呼ばれるレセプター会合型チロシンキナーゼ が活性化され、 活性化を受けた J AKがレセプ夕一自身のチロシン残基をリン酸 化することによって STAT分子の活性化が引き起こされる。 活性化された S T
AT分子は二量体を形成してすみやかに核内へ移行し、 遺伝子発現を誘導する。
I L一 4レセプ夕一、 I L_ 13レセプ夕一を介して J AKが活性化され、 レセ プター上のチロシンがリン酸化される。 引き続き STAT 6が SH 2ドメインを 介してレセプターのリン酸化されたチロシン残基に結合し、 STAT 6自身がチ 口シンリン酸化されホモ二量体を形成して核内へ移行する。 S T AT 6の標的遺 伝子としては g e r m 1 i n e ィプシロン、 C D 2 3、 MH C (M a j o r H i s t o c omp a t i b i 1 i t y Comp l e x) クラス I I抗原、 S T A T 6遺伝子等が知られている。
最近になり、 STAT 6の欠損マウスが作製され、 その生理的役割が調べられ ている。 S T AT 6の欠損マウスでは、 I L一 4や I L一 1 3の主要な機能がす ベて障害されており、 S T AT 6が I L— 4ならびに I L一 1 3のシグナル伝達 において重要な分子であることが証明された。 また、 STAT 6欠損マウスでは Th 2反応が障害されており、 Th 2型サイ トカインの産生はほとんど認められ ず、 STAT 6が Th 2細胞分化においても必須な分子であることが示された。 つまりアレルギー反応の誘導に S T AT 6が重要な分子であることが証明された。 このような背景から、 S T A T 6の機能あるいは活性化を阻害することによつ て、 I L一 4ならびに I L一 1 3の機能を特異的に抑制し、 ァレルギ一性疾患 · 炎症 ·免疫疾患を抑制できる可能性がある。 S TAT 6の活性化に関するタンパ ク質はアレルギー性疾患 · 自己免疫や炎症を原因 ·症状とする疾病に対する医薬 の有望な標的である 〔たとえば、 P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . US A 95， 1 72— 1 77 (1 998)、 S c i e n c e 282, 2258 - 2 261 (1 998 ), S c i e n c e 282, 226 1— 2263 (1 998 )、 J . E . Me d. 1 83, 1 09— 1 1 7 (1 996)、 J. I mm u n o 1. 1 60， 4004— 4009 (1 998)、 J . I mm u n o 1. 1 60， 1 5 8 1 - 1 5.88 ( 1 998)〕。
細胞外からの情報は、 何らかのシグナルの形に変えて、 細胞膜を通過し細胞質 をこえて核に到達し、標的遺伝子の発現を調節して細胞の応答が引き起こされる。 そのため、 細胞外の刺激から STAT 6の活性化に至る細胞内におけるシグナル 伝達の仕組みを解明することは、 アレルギー性疾患、 自己免疫疾患や炎症症状を 呈する疾患に対する新たな医薬の開発あるいは治療法の開発に非常に重要な手段 を提供することとなり、 極めて重要な意義を有している。
しかしながら、 細胞が一定の刺激を受けてから S TAT 6の活性化に至るまで のシグナル伝達経路には J AKキナーゼ、 STAT分子以外にこの経路を調節制 御する他の分子の存在が考えられる。従って、より効率的な創薬研究のためには、 主要な役割を果たす伝達分子を明らかにした上でそれらに焦点をしぼつた新しい 薬物スクリーニング方法を確立することが望まれる。 しかし、 STAT6を介し たシグナル伝達経路には J A K ,' S T A Τ分子以外はいまだ不明な点が多く、 新 たなシグナル伝達分子の同定とより進んだ STAT6活性化メ力ニズムの解明が 望まれていた。 発明の開示
本発明の課題は、 上記のように有用な S T AT 6の活性化を促進する作用を有 する新規な遺伝子、 タンパク質を見出し、 これを医薬、 診断薬、 医療の分野で利 用する方法を提供することにある。 即ち、 STAT6の活性化を促進する作用を 有する新規タンパク質、 該タンパク質をコードする DNA、 該 DNAを含有する 組換えベクター、 該組換えべクタ一を含有する形質転換体、 該タンパク質の製造 方法、 該タンパク質またはその部分ペプチドに対する抗体、 該抗体の製造方法を 提供する。
また、 本発明は、 該タンパク質、 DNA、 組換えベクターおよび形質転換体を 用いて、 STAT 6の活性化を阻害または促進する物質をスクリ一ニングする方 法、 該スクリーニング用キット、 該スクリーニング方法もしくはスクリ一ニング 用キッ トを用いて得られる S TAT 6の活性化を阻害または促進する物質、 該物 質の製造方法、 STAT 6の活性化を阻害または促進する物質を含有している医 薬などを提供する。
近年、 生体内で発現している遺伝子を解析する手段として、 cDNAの配列を ランダムに解析する研究が活発に行われており、 このようにして得られた c D N
Aの断片配列が EST (Expressed Sequence Tag、 たとえば
ttp//www. ncbi. nlm. nih. gov/dbEST) として、 データベースに登録され公開され ている。 しかし、 E S Tは配列情報のみであり、 その機能を推定することは困難 である。 また、 ESTは Un i Ge n e (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/UniGene) により整備され、 これまでに約 8万種の ESTが登録されている。 しかし、 その 多くは 5 ' 端ヌクレオチド配列を欠損しており、 タンパク質翻訳開始部位を含ま ない。 そのため、 mRN Aのコード領域の決定を前提とするタンパク質の機能解 析、 プロモーターの解析による遺伝子発現制御の理解といった遺伝子機能の解析 に直結しているとは言いがたい。
一方、 遺伝子の産物、 すなわちタンパク質の機能を解明する方法の一つに、 動 物細胞を用いた一過性発現クロ一エング法がある （たとえば、 実験医学別冊 遺 伝子工学ハンドブック）。 この方法は、動物細胞発現ベクターを用いて作製した c DNAライブラリ一を、 動物細胞にトランスフエクションすることで機能的な夕 ンパク質を直接発現させ、 このタンパク質が細胞に及ぼす生物活性を指標として cDNAを同定、 クロ一ニングする方法である。 この方法では、 目的とするタン パク質産物に関する化学的情報 （アミノ酸配列や分子量） をあらかじめ必要とせ ず、 細胞内や培養液中に発現しているタンパク質の特異的生物活性を検出して c DNAクローンの同定を行うことができる。
この発現クローニングを効率良く行なうためには、 c DNAライブラリーの作 製方法を工夫する必要がある。 なぜなら、 従来より汎用されている c DNAライ ブラリー作製方法には幾つかの方法があるが （たとえば Gub b 1 e r -Ho f f ma nの方法： Ge n e 2 5 ( 1 9 83 )ォカャマーバーグの方法： M o 1. C e l l . B i o l . 2 ( 198 2 ))、 これらの方法によって作製された c DN Aは、 そのほとんどが 5 ' 末端ヌクレオチド配列を欠損したものであり、 完全長 (mRNAの全ヌクレオチド配列を含む） であることは稀であるからである。 そ の理由は、 mRNAから c DNAを作るのに使用する逆転写酵素が、 完全長の c D N Aを作る効率が必ずしも高くないからである。
さらに、 遺伝子の機能解析を試みるに際しては、 完全長 cDNAをクロ一ニン グし、 そこからタンパク質を発現させることが必須の要件である。 従って、 全体 のクロ一ンの中で、 完全長のものの割合が高いライブラリ一を作製することが、 発現クロ一ニングを効率良く行なうために必要であった。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 オリゴキヤ ッピング法を用いて完全長 c DN Aライブラリ一を作製し、 N I H 3 T 3細胞を 用いた発現クローニングによる遺伝子機能アツセィ系を完成し、 該アツセィ系に より S TAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質をコードする新規 D NA (c DNA) を単離することに成功した。 この新規 DNAは、 N I H3 T 3 細胞内で発現させることにより STAT 6の活性化の促進を誘発した。 この結果 は、 この新規 DNAが S TAT 6の活性化の促進に関与するシグナル伝達分子で あることを示しており、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は
(1) 以下の （a) または （b) より選ばれたいずれかの精製され、 及び,ま たは単離されたタンパク質。
(a) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9 、 1 1、 13 1 5 17 、 1 9、 2 1 9 3、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37 39 41、 43、 45 4 7、 49、 51、 53、 55、 57、 59、 61 63 65、 67、 70 7 2、 74、 76、 78、 80、 82、 84、 86 88 90、 92、 94 9 6、 98、 100、 1 02、 1 04- , 106 1 08 1 1 0、 1 12 1 14、 1 1 6、 1 1 8、 120、 1 22、 124、 126、 128、 1 30、 1 32、 1 34、 1 36、 1 38、 140、 142、 144、 146、 148、 1 50、
1 52 1 54 1 56 1 58 160、 1 62、 164、 1 66、 1 68、
1 70 1 72 174 176 17 8、 180、 1 82、 1 84、 1 86、
1 88 1 90 1 92 1 94 1 96、 1 98、 200、 202、 204、 206 208 2 10 21 2 2 14、 21 6、 218、 220、 9 9 9 224 226 228 230 232、 234、 236、 2 3 S , 240、 242 244 246 248 250、 252、 254、 2 56、 2 58、 260 262 264 266 268、 270、 272、 274、 276、 27 8 280 282 284 286、 28 S、 290、 292、 294、
296 298 300 302 304、 306、 308、 3 10、 3 12、 3 14 3 1 6 3 18 320 322、 324、 326、 328、 330、
332 334 336 338 340、 342、 344、 346、 348、 350 352 354 356 358、 360、 362、 364、 366、 368 370 372 374 376、 378、 380、 3 82、 384、 386 388 390 392 394、 396、 398、 400、 402、 404 406、 408、 41 0、 412、 414、 41 6、 418, 420、 422 424, 426、 428、 430、 432、 434、 436、 438、 440 442、 444、 446、 448、 450、 452、 454、 456、 458 460、 462、 464、 466、 468、 470、 472、 474、
476. 478、 480、 482または 484で表されるアミノ酸配列からなる タンパク質。
(b) 配列番号 1 、 3、 5 、 7、 9 1 3, 1 5、 17 、 19、 2 1, 2 3、 25、 27、 29, 3 1, 33 、 35、 3 7、 39, 1、 43、 45、 4 7、 49、 5 1、 53、 55、 57 、 59、 6 1、 63, 65、 67、 70, 7 2、 74、 76、 78、 80、 82 、 84、 86, 88、 90、 92、 94、 9 6、 98、 1 00、 1 02 , 1 04、 1 06 1 08、 1 1 0、 丄 1 1 1 14、 1 16、 1 1 8、 1 20、 1 22、 1 24、 1 26、 1 28、 1 30、 132、 134、 136、 138、 140、 142、 144、 146、 148、 1 50、
1 52、 1 54、 1 56、 1 58、 160、 1 62、 1 64、 1 66、 168、
170、 172、 1 74、 1 76、 178、 1 80、 1 82、 1 84、 186、
188、 190、 192、 1 94、 1 96、 1 98、 200、 202、 204、 206、 208、 2 10、 2 1 2、 2 14、 2 16、 2 18、 220、 222、 224、 226, 228、 230、 232、 234、 236、 238、 240、 242、 244、 246、 248、 250、 252、 254、 256、 258、 260、 262、 264、 266、 268、 270、 272、 274、 276、 278、 280、 282、 284、 286、 288、 290、 292、 294、
296, 298、 300、 302、 304、 306、 308、 3 10、 3 1 2、
314、 31 6、 3 1 8、 320、 322、 324、 326、 328、 330、 332, 334、 336、 338、 340、 342、 344、 346、 348、 350、 352、 354、 356、 358、 360、 362、 364、 366、 368、 370、 37 2、 374、 376、 37 8、 380、 382、 384、
386、 388、 390、 392、 394、 396、 398、 400、 402、
404、 406、 408、 41 0、 41 2、 414、 41 6、 418、 420、 422、 424、 426、 428、 430、 432、 434、 436、 438, 440、 442、 444、 446、 448、 450、 452、 454、 456、 458、 460、 462、 464、 466、 468、 470、 472、 474、 476、 47 S、 480、 482または 484において 1若しくは複数個のアミ ノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ STAT 6の 活性化を促進する作用を有するタンパク質。
(2) 上記 （1) 記載のいずれかのタンパク質とその全長にわたり少なくとも 9 5 °/。のアミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、 かつ STAT 6の活 性化を促進する作用を有する、 精製され、 及び/または単離されたタンパク質。
(3) 以下の （a) または （b) のタンパク質をコードするヌクレオチド配列 を包含する、 単離されたポリヌクレオチド。
( a ) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1133、 1 5、 17、 、 11 99、、 2 1、 2 3、 25、 27、 29、 3 1、 33、 35、 3377、 39、 41、、 4433、、 45、 4 7、 49、 51、 53、 55、 57、 59、 6611、 63、 65、 . 6677、、 70、 7 2、 74、 76、 78、 80、 S 2、 84、 8866、 88、 90、 , 9922、、 94、 9 6、 98、 1 00、 1 0 2、 104、 106、 1 08 1 1 0 1 1 2 1 14、
1 1 6 1 1 S 120 122 1 24 126、 1 28、 1 30、 1 32、 1 34 136 1 38 140 142 144、 146、 148、 1 50、 1 52 1 54 1 56 1 58 1 60 162、 1 64、 1 66、 168、
1 70 17 2 174 176 178 1 80、 1 82、 1 84、 1 86、
1 88 190 192 194 196 198、 200、 2 02、 204、 2 06 208 210 21 2 214 21 6、 2 1 8、 2 20、 9 0 ? 224. 226 228 230 232 234、 236、 2 38、 240、 242 244 246 248 250 252、 2 54、 2 56、 258、 2 60 262 264 266 268 270、 272, 2 74、 276、 278 280 282 284 286 288、 290、 2 92、 294、
2 96 298 300 302 304 306、 308、 3 1 0、 3 12、 3 14 316 318 320 322 324、 326、 328、 330、
3 32 334 336 338 340 342、 344、 346、 348、 3 50 352 354 356 358 360、 362、 364、 366, 368, 370、 372、 374、 376、 378、 380、 3 S 2、 384、
386、 38 8、 390、 392、 394、 396、 398、 400、 402、
404、 406、 408、 410、 412、 414、 416、 41 8、 420、 422、 424、 426、 428、 430、 432、 434、 436、 438、
440 442、 444、 446、 448、 450、 452、 454、 456、 458 460、 462、 464、 466、 468、 470、 472、 474、 476 478、 480、 482または 484で表されるアミノ酸配列からなる 質。
(b) 配列番号 1 、 3、 5 、 7、 9 、 1 1'、 1 3, 1 5, 1 7 、 1 9、 2 1 , 2 3、 25、 27、 29, 3 1, 33、 35、 37, 39、 41、 43、 45、 4 7、 49、 5 1、 53、 55, 57、 59、 61、 63, 65、 67、 70. 7 2、 74、 76、 78, 80, 82、 84、 86、 88, 90、 92、 94、 9 6、 98、 100 、 102 , 104. 106 108、 1 10、 1 1 2' 1 14、 1 1 6、 1 1 8、 1 20、 122、 1 24、 1 26、 128, 1 30、 1 32、
1 34 1 36、 1 38、 140、 142, 144、 146、 148、 1 50、
1 52 1 54、 1 56、 1 5 S、 1 60、 1 62、 1 64、 1 66、 1 68、
1 70 1 72、 1 74、 176、 1 78、 180、 182、 1 84、 1 86、
1 88 190、 1 92、 194、 196、 198、 200、 202、 204、 206 208、 2 10、 21 2、 2 14、 2 16、 21 8、 220、 222、 224 226、 228、 230、 232、 234、 236、 2 38、 240、
244、 246、 248、 250、 、 254、 2 56、 258、
260 262、 264、 266、 268、 270、 272、 2 74、 276、
278 280、 282、 284、 286、 288、 290、 292、 294、
296 298、 300、 302, 304、 306、 308、 3 1 0、 3 1 2、 3 14 3 1 6、 318、 320、 Q 9 9 324、 326、 328、 330、
332 334、 336、 338、 340、 342、 344、 346、 348、 3 50 352、 354、 356、 358、 360、 362、 364、 366、 368 370、 372、 374、 376、 378、 380、 382、 384、 386 388、 390、 392、 394、 396、 398、 400、 402、 4 0 4、 4 0 6、 4 0 8、 4 1 0、 4 1 2、 4 1 4、 4 1 6、 4 1 S、 4 2 0、 4 2 2、 4 2 4、 4 2 6、 4 2 8、 4 3 0、 4 3 2、 4 3 4、 4 3 6、 4 3 8、 44 0、 44 2、 444、 44 6、 44 S、 4 5 0、 4 5 2、 4 5 4、 4 5 6、 4 5 8、 4 6 0、 46 2、 4 6 4、 4 6 6、 4 6 8、 4 7 0、 4 7 2、 4 7 4, 4 7 6、 4 7 8、 4 8 0、 4 8 2または 4 8 4において 1若しくは複数個のアミ ノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ S TAT 6の 活性化を促進する作用を有する夕ンパク質。
(4) 以下の （a) 〜 （c) のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む単離さ れたポリヌクレオチド。
(a) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2 、 1 4、 1 6 1 8 , 2 0 、 2 2、 2 4、 2 6、 2 8、 3 0、 3 2、 3 4、 3 6、 3 8、 4 0 4 2 , 44、 4 6、 4 8、 5 0、 5 2、 5 4、 5 6、 5 8、 6 0、 6 2、 6 4 6 6 , 6 8、 6 9、 7 1、 7 3、 7 5、 7 7、 7 9、 8 1、 8 3、 8 5、 8 7 8 9 9 1、 9 3、 9 5、 9 7、 9 9、 1 0 1、 1 0 3、 1 0 5、 1 0 7 1 0 9 1 1 1、 1 1 3、
1 1 5 1 1 7 1 1 9 1 2 1 1 2 3 1 2 5、 1 2 7、 1 2 9、 1 3 1、
1 3 3 1 3 5 1 3 7 1 3 9 1 4 1 1 4 3、 1 4 5、 1 47、 1 4 9、 1 5 1 1 5 3 1 5 5 1 5 7 1 5 9 1 6 1、 1 6 3、 1 6 5、 1 6 7、
1 6 9 1 7 1 1 7 3 1 7 5 1 7 7 1 7 9, 1 8 1、 1 8 3、 1 8 5、
1 8 7 1 8 9 1 9 1 1 9 3 1 9 5 1 9 7、 1 9 9、 2 0 1、 2 0 3、
2 0 5 2 0 7 2 0 9 2 1 3 2 1 5、 2 1 7、 2 1 9、 2 2 1、
2 2 3 2 2 5 2 2 7 9 9 Q 2 3 1 2 3 3、 2 3 5、 2 3 7、 2 3 9、 2 4 1 2 4 3 2 4 5 2 4 7 2 4 9 2 5 1、 2 5 3、 2 5 5、 2 5 7、
2 5 9 2 6 1 2 6 3 2 6 5 2 6 7 2 6 9、 2 7 1、 2 7 3 , 2 7 5、
2 7 7 2 7 9 2 8 1 2 8 3 2 8 5 2 8 7、 2 8 9、 2 9 1、 2 9 3、
2 9 5 2 9 7 2 9 9 3 0 1 3 0 3 3 0 5、 3 0 7、 3 0 9、 3 1 1、 3 1 3 3 1 5 3 1 7 3 1 9 3 2 1 3 2 3、 3 2 5、 3 2 7、 3 2 9、
3 3 1 3 3 3 3 3 5 3 3 7 3 3 9 3 4 1、 3 4 3、 3 4 5、 3 4 7、 3 4 9 3 5 1 3 5 3 3 5 5 3 5 7 3 5 9、 3 6 1、 3 6 3、 3 6 5、 3 6 7 3 6 9 3 7 1 3 7 3 3 7 5 3 7 7、 3 7 9、 3 8 1、 3 8 3、 385、 387、 389、 39 1、 393、 395、 397、 399、 401、 403、 405、 407、 409、 41 1、 41 3、 41 5、 417、 41 9、 42 1、 423、 425、 427、 429、 43 1、 433、 435、 437、 439、 441、 443'、 445、 447、 449、 451、 453、 455、 457、 459、 46 1、 463、 465、 467、 469、 47 1、 473、 47 5、 477、 479、 48 1または 483で表されるいずれかのポリヌクレ ォチド配列および該単離されたポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド配 列。
(b) (a)のいずれかのポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとスト リンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、 かつ S T AT 6の活性化を促進する 作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
(c) 配列番号 2 4、 6、 8、 1 0、 12、 14、 1 6、 1 8 20 、 22、 24、 26、 28 30、 32、 34、 36、 38、 40, 42 44、 46、 48、 50、 52 , 54, 56、 58、 60、 62、 64、 66 68、 69、 7 1、 73、 75. 77, 79、 8 1、 83、 85、 87, 89 91、 93、 9 5、 97、 99. 1 0 1 1 0 3、 1 05、 1 07 1 09、 ： 1 1 3、 1 1 5、 1 17、 1 1 9、 12 1、 1 23 1 25 1 27、 11 29、 13 1、
1 33 135 137、 139 141 143 145、 1147、 149、 1 51 153 1 55、 1 57 1 59 1 6 1 1 63、 11 65、 167、 1 69 171 173、 17 5 177 1 79 1 83、 185、 1 87 189 1 91、 193 195 1 97 1 99 20 1、 203、 205 207 209、 2 1 1 21 3 2 1 5 2 17 2 1 9、 221、 223 225 9 9 7 229 231 233 235 237、 239、 241 243 245、 247 249 251 253 2 55、 257、 259 261 263、 26 5 267 269 27 1 273、 275、 277 279 28 1、 283 285 287 289 2 91、 293、
295 297 299、 30 1 303 305 307 309、 31 1、 3 1 3 31 5 3 1 7、 31 9 32 1 323 325 327, 329、
33 1 333 335、 337 339 341 343 345、 347、 3 4 9 , 3 5 1、 3 5 3、 3 5 5、 3 5 7、 3 5 9、 3 6 1、 3 6 3、 3 6 5、 3 6 7、 3 6 9、 3 7 1、 3 7 3、 3 7 5、 3 7 7、 3 7 9、 3 8 1、 3 8 3、 3 8 5、 3 8 7、 3 8 9、 3 9 1、 3 9 3、 3 9 5、 3 9 7、 3 9 9、 4 0 1、 4 0 3、 4 0 5、 4 0 7、 4 0 9、 4 1 1、 4 1 3、 4 1 5、 4 1 7、 4 1 9、 4 2 1、 4 2 3、 4 2 5、 4 2 7、 4 2 9、 4 3 1、 4 3 3、 4 3 5、 4 3 7、 4 3 9、 44 1、 4 4 3、 44 5、 44 7、 4 4 9、 4 5 1、 4 5 3、 4 5 5、 4 5 7、 4 5 9、 4 6 1、 4 6 3、 4 6 5、 4 6 7、 4 6 9、 4 7 1、 4 7 3、 4 7 5、 4 7 7、 4 7 9、 48 1または 4 8 3で表されるヌクレオチド配列のい ずれかにおいて、 1若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、 置換若しくは付加さ れたポリヌクレオチド配列からなり、 かつ S T A T 6の活性化を促進する作用を 有する夕ンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
( 5) 上記 （3) 記載のポリヌクレオチドのいずれかと全長にわたり少なくと も 9 5 %以上の同一性を有し、 かつ S T AT 6の活性化を促進する作用を有する タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレ ォチド。
(6) 上記 （4) 記載のポリヌクレオチドのいずれかと全長にわたり少なくと も 9 5 %以上の同一性を有し、 かつ S T AT 6の活性化を促進する作用を有する タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレ ォチド。
(7) 上記 （3) 〜 （6) のいずれか 1つに記載のポリヌクレオチドによりコ 一ドされる精製され、 及び, /または単離されたタンパク質。
( 8) 上記 （3) 〜 （6) のいずれか 1つに記載のポリヌクレオチドを含有す る組換えベクター。
( 9) 上記 （8) に記載の組換えベクターを含む形質転換された細胞。
( 1 0) 上記 （1 ) または （2) に記載のタンパク質が膜タンパク質である場 合における、 上記 （9) 記載の細胞の膜。
( 1 1 ) (a) 上記 （3) 〜 （6) のいずれか 1つに記載の単離されたポリヌ クレオチドのいずれかがコードするタンパク質を発現する条件下で該ポリヌクレ ォチドを含有する形質転換された細胞を培養し、 (b) 培養物からタンパク質を回収する、
ことを含む、 タンパク質の製造方法。
(12) (a) 個体のゲノムにおける上記 （1) または （2) または （7) に 記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列中の変異の存在または不存在を 決定し、 および/または
(b) ,該個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析する、 ことを含む、 該個体における該タンパク質の発現または活性に関連した、 該個体 における疾病または疾病への感受性の診断方法であって、 発現するタンパク質の 量の増減により病気であると診断する方法。
好ましくは、 正常の 2倍以上の場合、 あるいは 1/" 2以下の場合に病気である と診断する。
(13) 以下の工程を含む S T AT 6の阻害剤または活性化剤としての活性に ついて化合物をスクリーニングする方法。
(a) S T AT 6の活性化を促進するタンパク質をコ一ドする遺伝子および S T AT 6の活性化に対応した、 検出可能シグナルを提供しうる成分を細胞に提供す る工程、
(b) 該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で該形質転換さ れた細胞を培養するェ.程、
(c) 該形質転換された細胞と 1あるいは複数個の候補化合物とを接触させるェ 程、
(d) 検出可能なシグナルを測定する工程、 および
( e ) 該検出可能なシグナルにより活性化剤化合物および/'または阻害剤化合物 を単離もしくは同定する工程。
(14) 以下の工程を含む、 医薬組成物を製造する方法。
(a) STAT6の活性化を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝 子、 および検出可能なシグナルを提供しうる成分を細胞に提供する工程、
(b) 該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で該形質転換さ れた宿主細胞を培養する工程、
(c) 該形質転換された宿主細胞と 1あるいは複数個の候補化合物とを接触させ る工程、
(d) 検出可能なシグナルを測定する工程、
(e) 該検出可能なシグナルにより活性化剤化合物および/または阻害剤化合物 を単離もしくは同定する工程、 および
( f ) 単離または同定された化合物を医薬組成物として最適化する工程。
(1 5) S T A T 6の阻害剤または活性化剤としての活性について化合物をス クリーニングするためのキッ卜であって、
(a) STAT 6の活性化を促進するタンパク質をコードする遺伝子および ST AT 6の活性化後、 検出可能なシグナルを提供しうる成分により形質転換された 細胞、 および
(b) 検出可能なシグナルを測定するための試薬
を含むキット。
(16) 上記 （1)、 （2) または （7) に記載のタンパク質に反応するモノク ローナルあるいはポリクローナル抗体。
(17) 上記 （1)、 (2) または （7) に記載のタンパク質を抗原あるいはェ ピト一プ含有フラグメントととして非ヒト動物に投与することからなる、 上記
(1)、 (2) または （7) に記載のタンパク質に反応するモノクローナルまたは ポリクローナル抗体の製造方法。
(1 8) S T A T 6の活性化を促進するタンパク質の発現を阻害する、上記（ 3 ) 〜 （6) のいずれか 1つに記載のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリ ゴヌクレオチド。
(1 9) 上記 （1)、 (2) または （7) 記載のタンパク質をコードする RNA の開裂、 または S T A T 6の活性化へ導く経路のタンパク質をコードする R N A の開裂により、 STAT 6の活性化を阻害するリボザィム。
(20) アレルギー性疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高脂血症、 感染症 および癌疾患からなる群から選択される疾患の治療に有効な量の上記 （13) 記 載の方法でスクリーニングされた化合物および/または上記 （1 6) 記載のモノ クローナルまたはポリクローナル抗体およびノまたは上記 （1 8) 記載のアンチ センスオリゴヌクレオチドおよび/''または上記 （1 9) 記載のリボザィムを個体 に投与することを含む疾患の治療法。
(2 1) STAT6の活性化を阻害または促進するものとして上記 （14) に記 載の方法により製造された医薬組成物。
(22) アレルギー性疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 癌およびウィルス性感染の 治療のための上記 （21) 記載の医薬組成物。
(23) S TAT 6活性化に関連する疾患を患っている患者に上記 （14) 記 載の方法により製造された医薬組成物を投与することからなるアレルギー性疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 癌またはウィルス性感染を治療する方法。
(24) Th 1が機能亢進している疾患、 例えば、 多発性硬化症やインシユリ ン依存型糖尿病などの臓器特異的自己免疫疾患ゃリュ一マチの治療の治療のため の上記 （2 1) 記載の医薬組成物。
(25) S TAT 6活性化の阻害に関連する疾患を患っている患者に上記 （1 4) 記載の方法により製造された医薬組成物を投与することからなる Th 1が機 能亢進している疾患、 例えば、 多発性硬化症やインシュリン依存型糖尿病などの 臓器特異的自己免疫疾患ゃリユーマチを治療する方法。
(26) 上記 （16) 記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を有効 成分として含有する医薬組成物。
(27) 上記 （18) 記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分とし て含有する医薬組成物。
(28) 対象疾患がアレルギー性疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高脂血 症、 感染症および癌疾患からなる群から選択される、 上記 （26) または （27) に記載の医薬組成物。
(29) 配列番号 2、 4、 6、 8 、 1 0、 1 2 14 1 6 , 1 8 20 2 , 24 26、 28、 30、 32、 34、 36 38 40 . 42 44 4 6, 48 50、 52 54、 56、 58、 60 62 64 , 6 (5、 68 6 9, 7 1 73, 75 77、 79、 8 1、 83 85 87 , 89、 9 1 9 3, 95 97、 99 101、 103、 105 107、 1 09、 1 1 1 1 1 3, 1 5, 1 17 1 19、 9 23 125、 1 27、 1 29 1
3 33、 1 35 37、 1 39 14 143、 145、 1 47 1 49、 151、 1 53、 1 55、 1 57、 1 59 1 6 1、 163、 1 65
67、 169、 1 73、 175、 1 77 1 79、 1 81、 1 83
85、 187、 1 89、 1 9 1、 193、 1 95 1 97、 1 99、 20 1 、 2 03、 205、 207、 209、 21 1、 2 1 3 2 1 5、 217、 2 1 9、 2 丄 1 、 o 9 Q 、 22 5、 227、 229、 23 1 233、 235、 237 、 9
39、 241、 243、 245、 247、 249 25 1、 253、 255 、 2
57、 259, 26 1、 263、 265、 267 269、 271、 273、 2
75、 277、 279、 281、 283、 285 287、 289、 29 1、 2
93、 295、 297、 299、 301、 303 305、 307、 309、 3 1 1、 31 3、 31 5、 3 17、 319、 321 323、 325、 327、 3
29、 331、 333、 335、 337、 339 341、 343、 345、 3
47、 349、 35 1、 353、 355、 357. 3 59、 36 1、 363ゝ 3
65、 367, 369、 37 1、 373、 375- 377、 379、 381、 3
83、 385、 387、 389、 391、 393- 395、 397、 399、 4
0 1、 403、 405、 407、 409、 41 1. 41 3、 415、 41 7ゝ 4 1 9、 42 1、 423、 425、 427、 429. 43 1、 433、 435、 4
37、 439、 441、 443、 445、 447. 449、 451、 453、 4
55、 457、 459、 461、 463、 446655. 467、 469、 47 1、 4
73、 475、 477、 479 481または 483で表されるヌクレオチド配 列のうち少なくとも 1以上を含むデータセッ 卜および,'' 'または配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1 3、 1 5、 7、 1 9、 2 1、 23 25、 27、 2 9、 3 1、 33、 3 5、 37、 39、 41 43、 45、 47 49 、 51、 5 3、 55、 57、 59、 61、 63、 65 67、 70、 72 74、 76、 78、
80、 82、 84、 86、 88、 90 92、 94、 96 98、 100、 10
2、 104、 106、 108、 1 10 1 1 2 14 1 16、 1 1 8、 1 つ
0 1 22、 1 24 126 128 1 30 .32 1 34、 136、 1 3 8 140、 142 144 1 6 1 8 1 50 1 52、 1 54、 1 5 6 1 58、 1 60 162 164 166 1 68 1 70、 172、 1 7 4 1 76, 1 78 180 182 184 1 86 1 88、 190、 1 9 2 1 94 1 9 6 1 9 8 20 0 2 0 2 2 04 2 0 6 20 8 2 1 0 2 1 2 2 14 2 1 6 2 1 8 220 2 2 2 2 24 2 2 6 22 8 230 2 3 2 2 34 2 3 6 2 3 8 240 9 244 24 6 248 2 50 2 5 2 2 54 2 56 2 5 8 2 6 0 26 2 2 6 4 266 2 6 8 27 0 9 7 9 2 74 2 7 6 2 7 8 2 8 0 28
284 2 8 6 2 8 8 2 90 292 2 94 2 9 6 2 98 30
0 302 304 306 3 0 8 3 1 0 3 1 2 3 1 4. 3 1 6 3 1 8 320 3 22 324 32 6 32 8 3 30 3 3 2. 334 33 6 33 S 340 342 344 346 348 3 50- 3 52 3 5 4 3 56 3 58 360 36 2 364 3 66 3 6 8- 3 7 0 37 2 374 3 76 37 8 380 3 8 2 3 84 3 8 6 3 8 8 3 9 0 392 3 94 3 96. 3 9 S . 400 40 2. 404. 40 6. 40 8. 4 1 0 4 1 2 41 4. 4 1 6- 4 1 8. 42 0- 42 2. 424- 42 6 42 8 430 43 2. 434. 436. 43 8- 440. 442- 44 4 446 448 450. 452. 454· 456- 45 8. 460. 46 2 464· 466 46 8- 47 0. 47 2- 474- 47 6. 47 8. 48 0 482または 484で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも 1以上を含む デー夕セットを保存したコンピュー夕読み込み可能媒体。
(3 0) 上記 （29) に記載の媒体上のデータと他のヌクレオチド配列および/' または他のアミノ酸配列のデ一夕を比較して他のポリヌクレオチド配列および Z またはアミノ酸配列との同一性の算出を行う方法。
(3 1) 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4 1 6、 1 8、 2 0、 2 2, 24、 26、 28、 3 0、 3 2、 34、 3 6、 3 8、 40、 42、 44、 46、 48、 50、 52、 54、 5 6、 5 8、 6 0、 6 2、 64、 6 6、 68、 6 9、 7 1、 7 3、 7 5、 7 7、 7 9、 8 1、 8 3、 8 5、 87、 S 9、 9 1、 9 3、 9 5、 9 7、 9 9、 1 0 1、 1 0 3、 1 0 5、 1 0 7 1 0 9、 1 1 1、 1 1 3、 1 1 5、 1 1 7、 1 1 9、 1 2 1、 1 2 3、 1 2 5、 1 2 7、 1 2 9、 1 3 1、 1 3 3、 1 3 5、 1 3 7、 1 3 9、 141、 1 43、 145、 1 47、 149、
1 5 1、 1 53、 1 5 5、 1 57、 59、 6 1 6 3、 1 6 5、 1 6 7、 169、 17 1、 1 73、 1 75 1 77 1 79 1 81 1 S 3 1 85、 1 87、 1 89、 1 9 1、 1 93 1 95 1 97 1 99 20 1 203、 205、 207、 209、 2 1 1 21 3 2 1 5 217 2 1 9 021、 223、 225、 227、 229 231 233 235 237 9 39、 241、 243、 245、 247 249 251 253 255 2 57、
259、 26 1、 263, 265 267 269 271 273 2 75、 277、 279、 28 1、 283 285 287 289 29 1 2 93、 295、 297、 299、 30 303 305 307 309 3 3 1 3、 31 5、 3 1 7、 3 1 9 321 323 325 327 3 29、 331、 333、 335、 337 339 341 343 345 3 47、
349, 35 1、 353、 355 357 359 361 363 3 65、 367、 369、 37 1、 373 375 377 379 38 1 3 83、 385、 387、 389、 39 393 395 397 399 401、 403、 405、 407、 40 9 41 1 413 41 5 41 7 419、 421、 423、 425、 427 429 431 433 435 4 37、 439、 441、 443、 445 447 449 451 453 4 55、 457、 459、 46 1、 463 465 467. 469 47 1. 4 73、 475、 477、 479、 48 1または 483から選択されるヌクレオチド配列 の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが固定されている不溶性基質。
(32) 配列番号 1、 3、 5. , 7、 9、 1、 1 3、 1 5、 1 7 1 9、 2 1、 23、 25、 27、 29、 3 1 、 33 35、 37、 39、 41、 43、 45、 47、 49、 51、 53、 55 、 57 59、 61、 63、 6 5、 67、 70、 72、 74、 76、 7 8、 80 、 82 84、 86、 88、 90、 92、 94、 96、 98、 100、 102、 104 106 1 08 1 1 0 1 1 、 1 1 4、 1 16、 1 18、 120、 1 9 9 124 1 26 1 28 1 30、 13 2、 1 34、 1 36、 138、 1 0 142 144 146 148、 15 0、 1 52、 154, 1 56、 1 58 160 162 1 64 166、 16 8、 1 70、 172、 174、 1 76 178 1 80 1 82 1 84、 18 6、 1 88、 190、 192、 1 94 196 1 98 200 202、 20 4、 206、 208 2 10 2 1 2 214、 2 1 6 2 1 S 220 22
2、 224、 2 26 228 230 232、 234 236 23 S 24
0、 242、 2 44 246 248 250 252 2 54 256 25
8、 260、 2 62 264 266 268 270 272 274 27
6、 278、 2 80 282 284 286 288 290 292 29
4、 296、 2 98 300 302 304 306 308 31 0 3 1
2、 3 14、 316 3 18 320 322 324 3 26 328 33
0、 332、 3 34 336 338 340 342 344 346 34
8、 350、 3 52 354 356 358 360 362 364. 36
6、 368、 3 70 372 374 376 378 380 382. 38
4、 386、 3 88 390 392 394 396 39 8 400. 40
2、 404、 406 408 410 412 414 41 6 41 8. 42
0、 422、 424 426 428 430 432 43 436. 43
8、 440、 4 42 444 446 44 S 450 452 454. 45
6、 458、 4 60 462 464 466. 468. 470- 472. 47
4、 476、 4 78 480 482または 484で表されるァミノ酸配列から 選択されるアミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリべプチドが固定されている 不溶性基質。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 20(Π-157043号、
2001-260681号及び 200卜 313175号、並びに、米国仮出願 60/293172号、 60/316031 号及び 60/328403号の明細書及び, κまたは図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 配列番号 3の S T A T 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質 をコードするヌクレオチドを含有するプラスミドを用いた場合の、 プロティンキ ナ一ゼ阻害剤 AG 1 8, AG 490 , ス夕ゥロスポリンによる S T A T 6のレポ 一ター活性抑制を示す図である。 図中で縦軸は相対ルシフェラーゼ活性を示す。 図 2は、 配列番号 1 7の STAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク 質をコードするヌクレオチドを含有するプラスミドを用いた場合の、 プロティン キナーゼ阻害剤 AG 1 8， AG 490 , スタウロスポリンによる S TAT 6のレ ポー夕一活性抑制を示す図である。図中で縦軸は相対ルシフェラーゼ活性を示す。 図 3は、 配列番号 1 9の S T AT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク 質をコードするヌクレオチドを含有するプラスミ ドを用いた場合の、 プロテイン キナーゼ阻害剤 AG 1 8, AG 490, ス夕ゥロスポリンによる S T A T 6のレ ポー夕一活性抑制を示す図である。図中で縦軸は相対ルシフェラーゼ活性を示す。 図 4は、 配列番号 2 18の STAT6の活性化を促進する作用を有するタンパ ク質をコ'一ドするヌクレオチドを含有するプラスミ ドを用いた場合の、 プロティ ンキナーゼ阻害剤 AG 1 8 , AG 490 , スタウロスポリンによる S T A T 6の レポーター活性抑制を示す図である。 図中で縦軸は相対ルシフェラ一ゼ活性を示 す。
図 5は、 配列番号 432の STAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパ ク質をコードするヌクレオチドを含有するプラスミ ドを用いた場合の、 プロティ ンキナ一ゼ阻害剤 AG 1 8 , AG 490 , スタウロスポリンによる STAT 6の レポーター活性抑制を示す図である。 図中で縦軸は相対ルシフェラーゼ活性を示 す。
図 6は、 配列番号 472の S T AT 6の活性化を促進する作用を有するタンパ ク質をコードするヌクレオチドを含有するプラスミドを用いた場合の、 プロティ ンキナ一ゼ阻害剤 AG 1 8 , AG 490 , スタウロスポリンによる S T A T 6の レポ一夕一活性抑制を示す図である。 図中で縦軸は相対ルシフェラ一ゼ活性を示 す。
図 7は、 配列番号 64のヌクレオチドを含有するプラスミドを用いた場合の、 プロテインキナーゼ阻害剤 AG 1 8 , AG 490, スタウロスポリンによる S T AT 6のレポ一夕一活性抑制を示す図である。 図中で縦軸は相対ルシフェラ一ゼ 活性を示す。 配列表の説明
配列番号 485はプライマーである。 配列番号 486はプライマーである。
配列番号 487はプライマーである。
配列番号 488はプライマーである。 発明を実施するための形態
まず、 本発明の基本的特徴を更に明らかにするために、 本発明の完成に至る経 緯を追いながら、 本発明について説明する。 S TAT 6の活性化を促進する作用 を有する新規遺伝子を取得する目的で、 実施例に示すように、 以下の実験を実行 した。 まずヒト正常肺線維芽細胞 （三光純薬株式会社より購入） より調製した m RNAより、 オリゴキヤッビング法によって完全長 c DNAを作製し、 該 c DN Aをベクター pME 1 8 S— FL 3 (GenBank Accession AB009864) に組み込ん だ完全長 c DNAライブラリ一を作製した。 次に、 該 c DNAライブラリーを大 腸菌に導入し、 1クローンずつプラスミドを調製した。 次に、 N I H3 T 3細胞 (大日本製薬） に、 ルシフェラーゼをコードする DNAの上流に S T AT 6応答性 配列を含有するレポ一夕一プラスミド 〔例えば、 J . B i o l . Ch em. 27 5， 26500 - 26506 (2000)、 J . E p. Me d. 1 90， 1 83
7 - 1 848 (1999)、 J . I mm u n o l . 1 50, 5408- 541 7 (1 993 )、 J . I mmu n o 1. 157， 2058 - 2065 (1 996)〕 と上 記の完全長 c DNAプラスミドとを共導入した。 そして、 48時間培養後、 続い て微弱なマウス I L— 4刺激を行い 6時間後のルシフェラーゼ活性を測定した。 ルシフェラーゼ活性が対照実験 （完全長 c DNAの代わりに、 ベクター pME l
8 S— FL 3を入れた細胞） と比べて有意に上昇している （対照実験と比べてル シフェラ一ゼ活性が 3倍以上の値を示した） プラスミ ドを選抜し、 該プラスミ ド にクローニングされている c DNAの全ヌクレオチド配列を決定した。 このよう にして得られた c DNAによりコードされるタンパク質は、 該タンパク質が S T AT 6の活性化の促進に関与するシグナル伝達分子であることを示している。 次に、 以下に本発明について詳細に説明する。
本発明において S T AT 6の活性化を促進する作用を有するとは、 適切な細胞 内に遺伝子を導入し、 該遺伝子にコードされているタンパク質を過剰発現させた 時、 生理的な刺激が無い状態でも、 STAT 6が直接的あるいは間接的に活性化 される （STAT6の活性化を誘発する） ことをいう。 及び,"'または、 適切な細 胞-内に遺伝子を導入し、 該遺伝子にコードされているタンパク質を過剰発現させ た後、 生理的な刺激が細胞に入った場合、 正常レベルの STAT 6の活性化がさ らに直接的あるいは間接的に促進される（STAT 6の活性化の促進を誘発する） ことをもいう。 STAT 6の活性化は、 例えば、 S TAT 6依存レポ一夕一遺伝 子を用いたアツセィにより、 該レポ一夕一活性を対照細胞 （該レポーター遺伝子 と空べクタ一を導入した細胞） に比し上昇させる作用を測定することにより検出 できる。レポ一夕一活性の上昇は、好ましくは、 1. 5倍以上、さらに好ましくは、 3倍以上、 さらに好ましくは 6倍以上である。
発現させたいタンパク質をコードするボリヌクレオチド （例えば cDNA) を 適切な発現ベクター内にクローニングし、 該発現べクタ一と S TAT 6依存レポ 一夕一プラスミドを適切な細胞に共導入 （コ · トランスフエクシヨン） し、 一定 時間培養後、 レポ一夕一活性を測定する。 あるいは、 共導入し一定時間培養後、 刺激剤を添加しさらに培養しレポ一夕一活性を測定する。 適切な発現ベクターは 当業者にはよく知られており、 例えば、 pME I S S— FL 3、 p c DNA 3. 1 ( I n v i t i- o g e n社） などが挙げられる。 レポ一夕一遺伝子は、 当業者 がその発現を容易に検出できるものであればよく、 例えば、 ルシフェラーゼ、 ク 口ラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ、 3—ガラク トシダ一ゼをコ一 ドする遺伝子である。 ルシフェラーゼをコードする遺伝子を使用することが最も 好ましく、 S T AT 6依存レポ一タープラスミ ドとしては、 例えば、 STAT 6 応答配列を有するルシフェラ一ゼレポ一タープラスミ ド N 4 X 8 _ 1 u cが例示 される。 適切な細胞とは、 I L— 4あるいは I L一 1 3などの刺激により S TA T 6が活性化されるような応答を示すような細胞であり、 例えば、 N I H 3 T 3 細胞が挙げられる。細胞培養および細胞への遺伝子導入（トランスフエクシヨン） は、当業者であれば当該技術分野で公知の慣用方法により実施でき最適化できる。 好ましい方法としては、 N I H 3 T 3細胞を細胞培養用 96穴プレートに 1 X
1 04C e 1 1 s /we 1 1となるように、 1 0 %FB S (Fetal Bovine Derum) 存在下の I MDM培地にまき、 5 ? C〇2存在下、 37°Cで 24時間培養した後、 F u GENE 6 (R o c h e社より購入） を用いて、 STAT 6応答配列を有す るルシフェラーゼレポータープラスミド N4 X 8— l u cと、 発現べクタ一を 1 ゥエルに共導入する。 5%C02存在下、 37°Cで 4 S時間培養後、 さらに最終 濃度 0. 5 n g/m 1のマウス I L一 4 (免疫生物研究所） を添加し 6時間培養 した後、 ロングタームルシフェラ一ゼアツセィシステム、 ピツカジーン L T 2.
0 (東洋インキ社） を用いてルシフェラーゼ活性を測定することにより STAT 6活性化の促進活性を測定する。 ルシフェラ一ゼ活性の測定は、 例えば、 P e r k i n E 1 me 1'社の Wa 1 1 a c ARVOTMST 1420 MULT
1 LABEL COUNTERを用いて測定できる。 FuGENE Sによる遺伝 子導入の方法及びピツカジーン L T 2. 0によるルシフェラ一ゼ活性測定は、 そ れぞれに添付されているプロトコールに従い実施できる。 F u GENE 6を用い た 96穴プレートでの遺伝子導入の方法は、 1ゥエルあたり、 Fu GENE 6の 量は 0. 3〜 0. 5 1が良く、 好ましくは 0. 3 1であり、 N 4 X 8— 1 u cレポ一タープラスミドの量は 50〜1 00 n gが良く、 好ましくは 1 00 n g であり、 発現ベクターの量は、 50〜1 00 n gが良く、 好ましくは 1 00 n g である。 STAT 6の活性化を促進する作用とは、 該レポ一ター活性 （ルシフエ ラーゼ活性） を対照実験 （該レポ一夕一遺伝子と空のベクタ一を導入した細胞） に比し、 上昇させる作用を有することをいう。 レポーター活性の上昇は、 好まし くは、 1. 5倍以上、 さらに好ましくは、 3倍以上、 さらに好ましくは 6倍以上で ある。
配列番号 1、 3 、 5、 7、 9 1 1 1 3 1 5 . 17 1 9、 2 1 23、
25、 27、 29、 31、 33 3 5 37 39、 41 43、 45 47、
49、 5 1、 53、 55、 57 59 6 1 63 , 65 67、 70 72、 74、 76、 78、 S 0、 82 84 86 88 . 90 92、 94 96、 98、 1 00、 1 02、 1 04 1 06 1 08、 1 10 1 1 2 1 14 1 6、 1 1 8、 1120 122 1 24 1 26、 1 28 1 30 1 32
34、 1 36、 11 38 140 142 144、 146 148 1 50
52、 1 54、 11 56 158 1 60 1 62、 164 1 66 1 6 S
70、 1 72 1 74 176 1 78 1 80、 1 82 1 84 1 86 88 190 192 1 94 1 96 1 98 200 202 204 2 06 208 210 2 1 2 2 14 2 1 6 2 1 8 220 222 2
24 226 228 230 232 234 236 238 240 2
42 244 246 248 250 252 2 54 256 258 2
60 262 264 266 268 270 272 274 276 2
78 280 282 284 286 288 290 292 294 2
96 298 300 302 304 306 308 3 10 31 2 3 14 316 31 S 320 322. 324 326 328 330 3
32 334 336 338 340 342 344 346 348 3
50 352 354 356 358 360 362 364 366 3
68 370 37 2 374 376. 37 8 380 382 384 3
86 388 390 392 394- 396 39 S. 400. 402. 4 04 406 408 41 0 41 2. 414. 41 6. 41 8. 420. 4 22 424 426 428 430. 432 434. 436. 438. 4
40 442 44 446. 448. 450. 452- 454- 456- 4
5 S 460 462 464. 466. 468. 470. 472. 474. 4
76 47 S 480 482または 484で表されるアミノ酸配列 （以下、 場 合により配列番号 1等で表されるアミノ酸配列という） に関連して、 本発明は、 以下のタンパク質を提供する。
(a) 上記アミノ酸配列を含むタンパク質。
(b) 上記アミノ酸配列の 1つを有するペプチド。
(c) STAT 6の活性化を促進し、 かつ上記アミノ酸配列において、 1以上の アミノ酸の削除、 置換または付加を有するタンパク質。
(d) STAT 6の活性化を促進し、 かつその全長にわたり上記の配列番号のァ ミノ酸配列に少なくとも 95 %、 好ましくは 97〜 99 。の同一性を有するアミ ノ酸配列を含むタンパク質。
"同一性" とは、 当該技術で知られているとおり、 配列を比較することにより 決定される、 2以上のタンパク質あるいは 2以上のポリヌクレオチドの間の関係 である。 当該技術で "同一性" とは、 またタンパク質またはポリヌクレオチド配 列の間の適合によって、 あるいは場合によっては、 一続きのそのような配列間の 適合によって決定されるような、 タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の 配列相関性の程度を意味する。 "同一性"および "類似性" は、 既知の方法により 容易に決定できる。 同一性を決定する好ましい方法は、 試験する配列間で最も長 く適合するように設計される。 同一性および類似性を決定するための方法は、 公 に利用可能なプログラムにコードされている。 相同性決定には、 例えば、 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム （例えば、 Altschul SFf Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. , J. Mol. Biol. , 215: p403-410 (1990), Altschul SF, Madden TL, Sc affer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ. , Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997) )を利用し決定することができるが、 これに限 定されない。 BLASTのようなソフトウェアを用いる場合、 デフォルト値を用いる のが好ましい。
BLAST検索に一般的に用いられる主な初期条件は、 以下の通りであるが、 これ に限定されない。 アミノ酸置換行列とは 20種類のアミノ酸の各々のペアの類縁 性を数値化した行列であり、通常 BLOSUM62のデフォルトマトリックスが用いられ る。 このアミノ酸置換行列の理論については、 Altschul S. F. , J. Mol. Biol. , 219:555-565 (1991)に、 DNA配列の比較への適用については、 States D. J. , Gis W. , Altschul S. F. , Methods, 3 : 66- 70 (1991)に示されている。 その際の最適なギヤッ プコストは経験的に決定されており、 BL0SUM62の場合は好ましくは、 Existence 11、 Extension 1のパラメーターが用いられる。
期待値 （EXPECT) とは、 データベース配列に対してマッチする際の統計的有意 性に関する閾値であり、 デフォルト値は 10である。
一例として、 配列番号 1のアミノ酸配列に対して例えば 9 5 ?ό以上の同一性を 有するタンパク質は、 そのアミノ酸配列が配列番号 1のアミノ酸配列のアミノ酸
1 00個あたり 5個までのアミノ酸の変化を含んでよいことを意味する。 言い換 えれば、 対照アミノ酸配列に対して 95 %以上のアミノ酸の同一性を有するタン パク質は、 対照配列中の全アミノ酸配列のうち 5 %までの数のアミノ酸が欠失ま たは他のアミノ酸と置換していてもよく、 あるいは、 対照配列中の全アミノ酸配 列のうち 5 %'までの数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであってもよレ^ 対照配列におけるこれらの変化は、 対照アミノ酸配列のァミノ末端または、 カル ボキシ末端位置に存在していてもよく、 あるいは対照配列内で 1個またはそれ以 上の一連の群をなしていてもよい。
上記した配列番号 1等で表されるァミノ酸配列からなる夕ンパク質が S T A T 6の活性化を促進する作用を有することは、 本願明細書実施例に記載の通りであ る。
配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0 2 2、 24、
2 6、 2 S 30 32、 34、 3 6、 3 8、 40、 42、 44、 46、 4 S、
5 0、 5 2 54、 56、 58、 60 6 2、 64、 66、 6 8、 6 9、 7 1、
7 3、 7 5 7 7、 79、 8 1、 8 3 8 5、 8 7、 8 9、 9 1、 9 3、 9 5、
9 7、 9 9 1 0 1 , 1 03、 1 0 5 1 07、 1 09、 1 1 1、 1 1 3、 1 1
5 1 1 7 1 1 9 1 2 1 1 2 3 1 2 5 1 7 1 2 9 1 3 1 1 3 3 1 3 5 1 3 7 1 39 1 4 1 1 3 1 45 147 149 1 5 1 1 5 3 1 5 5 1 57 1 5 9 1 6 1 1 6 3 1 6 5 1 6 7 1 6 9 1 7 1 1 7 3 1 7 5 1 7 7 1 7 9 1 8 1 1 8 3 1 8 5 1 8 7 1 8 9 1 9 1 1 9 3 1 9 5 1 9 7 1 99 20 1 20 3 20 5 2 0 7 209 2 1 1 2 1 5 2 1 7 2 1 9 2 2 1 2 2 3 9 9 R 9 9 7 2 29 2 3 1 2 3 3 2 35 23 7 2 3 9 24 1 243 245 247 249 2 5 1 2 53 2 5 5 2 5 7 2 5 9 2 6 1 263 26 5 2 67 26 9 2 7 1 2 7 3 2 7 5 2 7 7 2 7 9 28 1 283 2 8 5 2 8 7 2 89 2 9 1 2 9 3 2 9 5 2 9 7 2 99 30 1 3 03 30 5 307 3 0 9 3 1 1 3 1 3 3 1 5 3 1 7 3 1 9 3 2 1 3 2 3 3 2 5 3 2 7 32 9 3 3 1 3 3 3 3 3 5 3 37 3 3 9 34 1 343 345 347 34 9 3 5 1 3 5 3 3 55 3 57 3 5 9 3 6 1 3 6 3 36 5 36 7 36 9 3 7 1 3 73 3 7 5 3 7 7 3 7 9 3 8 1 38 3 3 8 5 3 8 7 38 9 39 1 3 9 3 3 9 5 3 97 3 9 9 40 1 40 3 40 5 407 409 4 1 1 4 1 3 41 5 41 7 41 9 42 1 42 3 42 5 427 429 43 1 433 43 5 43 7 43 9、 441、 443、 445、 447、 449、 45 1、 453、 455、 45 7、 459、 46 1、 463、 465、 467、 469、 47 1、 473、 47 5、 477、 479、 48 1または 483 (以下、 場合により配列番号 2等とい う） のポリヌクレオチドに関連して、 本発明は、 また以下の単離されたポリヌク レオチドを提供する。
(a) 上記配列のポリヌクレオチド。
( b ) 上記配列に少なくとも 95 ¾；、 好ましくは 97— 99 の同一性を有し、 かつ STAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質をコ一ドするポリヌ クレオチド配列を包含するポリヌクレオチド。
(c) STAT6の活性化を促進する作用を有し、 かつ配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 19、 2 1、 23、 25、 27、 29、 3 1、 3 3、 35、 37、 39、 4 1、 43、 45、 47、 49、 5 1、 53、 55、 5
59、 6 1、 63、 65 67、 7700、、 7722、、 7744 76、 7 8、 80、 8 S 4、 86、 88、 90 92、 9944、、 9966、、 9988 100、 102、 10
106、 108、 1 10、 1 12、 , 11 1144、、 11 11 66 1 1 8、 120、 124, 126、 1 28、 130 1 32、 1 34 1 36、 138、 142、 144、 146、 148 1 50、 1 52 1 54、 156、
160、 162、 1 64、 166 1 68、 1 70 1 72、 174、 223333322211 111
1 78、 180、 182、 184 186、 1 88 1 90、 192、 1 96、 1 98、 200、 202 204、 206 208、 21 0、 214、 21 6、 21 8、 220 222、 224 226、 228、 232、 234、 236、 238 240、 242 244、 246、 250、 252、 254、 256 258、 260 262、 264、 268、 270、 272、 274 276、 278 280、 282、
286、 288、 290、 292 294 , 296 298、 300、
304、 306、 308、 31 0 31 2、 3 14 31 6、 31 8、 322、 324、 326、 328 330、 332 334、 336、 340、 342、 344, 346 348、 350 352、 354、 358 , 360、 362、 364 366、 368 370、 372、
Figure imgf000029_0001
4 376 378 380 382 384 386 388 390 39 2 394 396 398 400 402 404 406 408 41
0 41 2 414 41 6 41 8 420 424 426 42
8. 430 432 434 436 438 440 442 444 44 6. 448 450 452 454 456 458 460 462 46 4. 466 468 470 472 474. 476 478 480 4 S
2または 484のアミノ酸配列に少なくとも 95 °/0、 好ましくは 97〜99 %の 同一性を有するァミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列 を有するポリヌクレオチド。
上記ヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチド配列に同一または十分に同一な ポリヌクレオチドは、 本発明の夕ンパク質をコードする全長 c D N Aおよびゲノ ムクローンまたは上記配列に対する相同性の高い他の遺伝子の c DNAまたはゲ ノムクローンを単離するためのハイブリダィゼーシヨンプローブとして、 または 核酸増幅反応のためのプライマーとして使用してもよい。 代表的には、 これらの ヌクレオチド配列は、 上記配列に 70%同一であり、 好ましくは、 80 %同一で あり、 より好ましくは 90 ?0'同一であり、 最も好ましくは、 95 %同一である。 プローブまたはプライマ一は、一般的には少なくとも 1 5ヌクレオチドを含有し、 好ましくは 30ヌクレオチドを含有し、 50ヌクレオチドを含有してもよい。 特 に好ましいプローブは、 30〜50ヌクレオチドを有する。 特に好ましいプライ マーは、 20〜 25ヌクレオチドを有する。
本発明のポリヌクレオチドは、 DNAの形態（たとえば、 cDNAおよびクロー 二ングによって得られるか、 あるいは合成的に生成されるゲノム D N Aを含む） であってもよく、 RNA (たとえば mRNA) の形態であってもよい。 該ポリヌ クレオチドは、 二本鎖であっても、 一本鎖であってもよい。 二本鎖の場合は、 二 本鎖 DNA、二本鎖 RNAまたは DNA:RNAのハイブリッ ドであってもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （コード鎖としても知られる） であっても、 アンチセ ンス鎖 （非コード鎖としても知られる） であってもよい。
当業者であれば、 公知の方法を用いてこのタンパク質中のアミノ酸の置換など を適宜行い、 配列番号 1等で表されるァミノ酸配列を有する夕ンパク質と同様に STAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質を作製することが可能で ある。 一つの方法としては、 該タンパク質をコードする DNAに対して、 慣用の 突然変異誘発法を使用する方法がある。 別の方法としてはたとえば部位特異的変 異法 （たとえば宝酒造株式会社の Mu t a n-S u p e r Ex p r e s s K m キッ ト） が挙げられる。 また、 タンパク質のアミノ酸の変異は自然界におい ても生じうる。 このようにアミノ酸の欠失、 置換、 付加により配列番号 1等で表 されるァミノ酸配列を有する夕ンパク質に対してアミノ酸配列が変異した変異体 であって、 S T A T 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質及び該タンパ ク質をコードする DNAも本発明に含まれる。変異の数は、好ましくは 1 0まで、 より好ましくは 5まで、 最も好ましくは 3までが好ましい。
アミノ酸置換の例としては、 保存的置換が好ましく、 具体的には以下のグルー プ内での置換が挙げられる。 （グリシン、ァラニン） ひ リン、 イソロイシン、 ロイ シン） （ァスパラギン酸、 グルタミン酸） （ァスパラギン、 グルタミン） （セリン、 卜レオニン） （リジン、 アルギニン） （フエ二ルァラニン、 チロシン）。
当業者であれば、 ハイブリダィゼーシヨン技術などを用いて配列番号 1 3 5 7 9 1 1 13 1 5 1 7 19 21 23 25 27 29
31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 5 1 53 55 57 59 61 63 65 67 70 72 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 98 1 00 1 0 2 1 04 1 06 108 1 0 1 1 1 14 1 1 6 1 1 8 1 1 22, 124 1 26 128 130 132 1 34 1 36 1 3
140 142 144 146 148 150 1 52 1 54 1 5
1 58 1 60 162 1 64 166 168 1 70 1 72 1 7 1 76 178 180 182 184 186 1 88 1 90 1 9 1 94 196 198 200 202 204 206 208 2 1 2 1 2 214 216 2 1 8 220 222 224 226 22 230 232 234 236 238 240 242 244 24 248 250 252 254 256 258 260 262 26 266 26 S 270 272 27 276 278 280 28 2 284 286 288 290 292 294 296 298 30 0 302 304 306 308 3 10 3 12 314 31 6 3 1 8 320 322 324 326 328 330 332 334 33 6 338 340 342 344 346 348 350 352 35 4 356 358 360 362 364 366 368 370 37 2 374 376 378 380 382 384 386 388 39 0 392 394 396 39 S 400 402 404 406 40 8 410 41 2 414 416 41 8 420 422. 424 42 6 428 430 432 434 436 438 440. 442 44 4 446 448 450 452 454 456 458. 460 46 2 464 466 468 470. 472 474 476. 478 48 0 482または 484で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードす る DNA (たとえば配列番号 2等のポリヌクレオチド） またはその一部を基に、 これと類似性の高い D N Aを単離して、 該 D N Aから配列番号 1等で表されるァ ミノ酸配列からなるタンパク質と同様に S T AT 6の活性化を促進する作用を有 するタンパク質を得ることも通常行い得ることである。 このように上記した配列 番号 1等で表されるアミノ酸配列のタンパク質と高い同一性を有するタンパク質 であって、 S TAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質も本発明の夕 ンパク質に含まれる。 高い同一性とは、 上記配列番号 1等で表されるアミノ酸配 列の全長にわたり少なくとも 90 %、 好ましくは、 少なくとも 97— 99 。の同 一性を有するアミノ酸配列を示す。
本発明のタンパク質としては、 ヒ卜や哺乳動物のあらゆる細胞や組織に由来す る天然のタンパク質でもよく、 化学合成タンパク質であってもよく、 また遺伝子 組換え技術によって得られたタンパク質でもよい。 タンパク質は糖鎖ゃリン酸化 などの翻訳後修飾は受けていても受けていなくても良い。
本発明のタンパク質としては、 例えば、 分泌タンパク質 （増殖因子、 サイ トカイ ン、 ホルモン等）、 タンパク質修飾酵素 （タンパク質リン酸化酵素、 タンパク質脱 リン酸化酵素、 プロテアーゼ等）、 核内タンパク質 （核内受容体、 転写因子等） 膜 タンパク質が挙げられる。 膜タンパク質は、 受容体、 細胞接着分子、 イオンチヤ ンネル、 トランスポーター等が挙げられる。 タンパク質が膜タンパク質である場 合、 後述するスクリーニングにより選択された化合物は、 細胞内へ容易に移行す ることが予想されるため、 医薬化合物のリサーチツールとしては、 より有用であ る。
本発明は、 上記で示される本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド である。 上記の配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 23、 25、 27、 29、 3 1、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 47、 49、 5 1、 53、 55、 57、 59、 6 1, 6 3, 65 、 67、 70、 72、 74、 76、 78、 S 0、 82、 84、 86, 88、 90、 92、 94、 96、 98、 1 00、 1 02、 1 04、 1 06 1 08、 1 1 0、 1 1 2. 1 14、 1 16、 1 1 8、 1 20、 122 124 1 26、 1 28、 1 30、
1 32 134 136 1 38 140、 142 144、 146、 148、
1 50 1 52 1 54 1 56 1 58、 1 60 1 62、 1 64、 1 66、
1 68 1 70 1 72 1 74 1 76、 1 78 1 80、 1 82、 1 84、 1 86 188 1 90 1 92 194、 196 1 98、 200、 202、 204 206 208 2 10 2 12、 2 14 216、 2 1 S、 220、 222 224 226 228 230、 232 234、 236, 238、 240 242 244 246 248、 250 252、 254, 256, 258 260 262 264 266、 268 270、 272、 274、 276 278 280 282 284、 286 288、 290、 292、
294 296 298 300 302、 304 306、 30 S、 3 10、 3 1 314 3 1 6 3 1 8 320、 322 324、 326、 328、
330 332 334 336 338、 340 342、 344、 346、 348 350 352 354 356、 358 360、 362、 364、 366 368 370 372 374、 376 378、 380、 382 ,
384 386 388 390 392、 394 396、 39 S、 400、
40 404 406 408 410、 41 2 414、 416、 41 8、 420 422 424、 426 428、 430 432、 434、 436、 438 440 442、 444 446、 448 450、 452、 454、 456、 458、 460、 462、 464、 466、 468、 470、 472、 474、 476、 478、 480、 482または 484で表されるアミノ酸配列 からなるタンパク質をコ—ドするヌクレオチド配列としてより具体的には、 たと えば配列番号 2 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 14、 16、 1 8、 20、 22, 2 4、 26、 28 30、 32、 34、 36 38、 40、 42、 44 46, 4 8、 50、 52 54、 56、 58、 60 62、 64、 66、 68 69, 7 1、 7 3、 75 77、 79、 8 1、 83 85、 87、 89、 91. 93、 9 5、 97、 99 101 、 1 03、 1 05 107、 1 09、 1 1 1. 1 1 3、 1 1 5、 1 1 7 1 19 1 2 1 1 23 125 1 27 1 29 1 3 1、
1 33 1 35 137 1 39 141 143 145 147 149、 1 51 153 155 1 57 1 59 1 6 1 163 1 65 1 67、
1 69 1 71 1 73 1 75 1 77 1 79 1 S 1 1 83 1 85、
1 87 189 191 193 1 95 197 1 99 201 203、
205 207 209 21 1 1 3 2 1 5 2 17 2 1 9 22 1、
223 225 227 229 23 1 233 235 237 239、
241 243 245 247 249 25 1 253 255 2 57、
2 59 26 1 263 265 267 269 271 273 275、
277 279 281 283 285 287 289 29 1 293、
2 95 297 299 30 1 303 305 307 309 3 1 1、 3 13 31 5 31 7 3 1 9 32 1 323. 325 327. 329、
3 31 333 335 337 339 341. 343 345. 347、 349 351 353 355 357. 359- 361 363. 365、 3 67 369 371 37 3 375 377- 379 381. 383、
3 S 5 3 S 7 389 39 1 393 395 397 399. 40 1、
403 405 407 409 41 1. 41 3. 41 5. 4 1 7. 41 9、 4 1 423 425 427 429. 43 1. 433 435. 437、 439 441 443 445 447. 449. 451. 453. 455, 457 459 461 463 465. 467' 469. 471. 473、 475 477 479 48 1または 483で表されるヌクレオチド配列が挙 げられる。 DNAは c DNAのほか、ゲノム DNA、化学合成 D N Aも含まれる。 遺伝暗号の縮重に従い、 遺伝子から生産されるタンパク質のアミノ酸配列を変え ることなく配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 4 ] 43、 45、
47、 49、 51、 53、 5 5, 57 59、 6 1、 63、 65 67、 70、 72、 74、 76、 78、 80, 82 84、 86、 88、 90 92、 94、 96、 98、 100、 1 02、 104 1 06、 1 08、 1 10
4、 1 1 6、 1 1 8、 1 20、 1 22 1 24、 1 26、 128 130 1 3 2、 134、 136、 1 38、 140 142、 144、 146 148 1 5
0 1 52、 1 54、 1 56、 1 58 1 60、 162、 164 166 1 6
8 170、 1 72、 174、 176 1 78、 1 80、 182 1 84 1 8
6 188、 1 90、 192、 194 1 96、 1 98、 200 202 20
4 206、 208、 210、 2 1 2 2 14、 2 16、 2 1 8 220 22
2 224、 226、 228、 230 232、 234、 236 238 24
0■ 242、 244、 246、 248 250、 252 254、 256 2 5
8 260、 262, 264、 266 268、 270 272、 274 27
6 278、 280、 282、 284 286、 288、 290 292 29
296、 298、 300、 302 304、 306、 308 31 0 3 1
2 3 14、 3 1 6、 31 8、 320 322、 324、 326 328 33
0 332、 334、 336、 338 340、 342、 344 346 34
8 350、 352, 354、 356 358、 360、 362 364 36
6 368、 370、 372、 374 376、 378、 380 382 38
4 386, 388、 390、 392 394、 396、 398 400 40
9 404、 406、 408、 410 41 2、 414、 416 41 8 42
0 422、 424、 426、 428 430、 432、 434 436 43 8 440、 442、 444、 446 448、 450、 452 454 45 6 458、 460, 462、 464 466、 46 S、 470 472 47 4 476, 47 8、 480 482または 484で表されるアミノ酸配列から なる夕ンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも 1つのヌクレオチド を他の種類のヌクレオチドに置換することができる。 従って、 本発明の DN Aは また、 遺伝暗号の縮重に基づく置換によって変換されたヌクレオチド配列も含有 する。 このような DNAは、 公知の方法により合成することができる。
本発明の DNAは、 配列番号 2等で表されるヌクレオチド配列からなる DN A とストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、 かつ S T AT 6の活性化を促 進する作用を有するタンパク質をコードする DNAも含まれる。 ス卜リンジェン 卜な条件とは、 当業者には十分理解できることであり、 たとえば、 T. Ma n i a t i s らの実験操作書 （Mo l e c u l a r C l o n i n g A L a b o r a t o r y Ma n u a l , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y 1 9 82、 1 9 8 9) に従えば容易に実施できる。
すなわち、 ストリンジェントな条件とは、 30 %ホルムアミドを含むハイプリ ダイゼ―シヨン溶液中 （5 X S S C (0. 7 5MのN a C l、 7 5mMのクェン 酸三ナ卜リゥム）、 5 Xデンハルト溶液、 0. 5。b' S D S、 1 0 0 ," g m 1の変 性せん断サケ精子 DNA) で 3 7°Cのインキュベーションをー晚行い、 その後 2 X S S C、 0. 1 ¾' S D S中、 室温で 1 0分の洗浄を 3回行い、 次いで 1 X S S C、 0. 1 ¾SD S中、 37 °Cで 1 0分の洗浄を 2回行う条件である （低ストリ ンジエンシー）。 より好ましい条件は、 40 ¾ホルムアミドを含むハイブリダィゼ —ション溶液中で 42°Cのィンキュベーションをー晚行い、 その後 2 X S S C、 0. 1 % S D S中、 室温で 1 0分の洗浄を 3回行い、 次いで 0. 2 X S S C、 1 % SDS中、 42°Cで 1 0分の洗浄を 2回行う条件である（中ストリンジエンシー）。 最も好ましい条件は、 50.%ホルムアミドを含むハイブリダィゼ一シヨン溶液中 で 42°Cのインキュベーションをー晚行い、 その後 2 X S S C、 0. 1 % S D S 中、 室温で 1 0分の洗浄を 3回行い、 次いで 0. 2 X S S C、 0. 1 %SD S中、 5 0°Cで 1 0分の洗浄を 2回行う条件である （高ストリンジエンシー）。 この際、 得られた DN Aは、 STAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質をコ 一ドすることが必須である。
本発明は、 上記 （3) あるいは （4) のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列 と高い類似性を有し、 かつ STAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク 質をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。 代表的には、 これ らのヌクレオチド配列は、 上記 （3) または （4) のポリヌクレオチドのヌクレ ォチド配列の全長にわたり 9 5 %同一であり、より好ましくは 9 7 %同一であり、 最も好ましくは少なくとも 9 9 %同一である。
上記の本発明の DNAは、 前述のタンパク質を、 組換え DNA技術を用いて製 造するのに用いることができる。 本発明の DNA及びペプチドは、 概略以下のよ うにして得ることができる。
(A) 本発明のタンパク質をコードする DNAをクロ一ニングする。
(B) 夕ンパク質の全コード領域あるいはその一部をコードする DN Aを発現用 ベクターに組み込んで、 組換えベクターを構築する。
(C) 構築した組換えベクターにより、 宿主細胞を形質転換する。
(D) 得られた細胞を培養し、 該タンパク質、 またはその類縁体を発現させ、 力 ラムクロマトグラフィーにより精製する。
上記の工程中で D N A、 組換え体宿主としての大腸菌等の取り扱いに必要な一 般的な操作は、 当業者間で通常行われているものであり、 たとえば、 上記 T. M a n i a t i sらの実験操作書に従えば容易に実施できる。 使用する酵素、 試薬 類も全て市販の製品を用いることができ、 特に断らない限り、 製品で指定されて いる使用条件に従えば、 完全にそれらの目的を達成することができる。 以下に上 記 （A) 〜 （D) の工程について更に詳しく説明する。
上記 （A) における本発明のタンパク質をコードする DNAのクローニングの 手段としては、 本願明細書実施例に記載した方法の他に、 本発明のヌクレオチド 配列 （たとえば配列番号 2等） の一部を有する合成 DNAをプライマーとした P
CR法によって増幅する方法、 あるいは、 適当なベクターに組み込んだ DNAを 本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードする DN A断片もしくは合成
DN Aを標識したものとのハイプリダイゼーシヨンによって選別すること、 など が挙げられる。 細胞、 組織より全 RNAまたは mRNA画分を調製したものを用 レ て Ik接 R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e P o l yme r a s e
Ch a i n R e a c t i o n (R T- P C R法）によって増幅することもできる。 適当なベクターに組み込んだ DNAとしては、 たとえば市販されている （CLO
NT EC H社、 STRAT AGE NE社）ライブラリ一を使用することができる。 ハイブリダィゼーシヨンの方法は、 当業者間で通常行われているものであり、 た とえば、 上記 T. M a n i a t i sらの実験操作書に従えば容易に実施できる。 クローン化された本発明のタンパク質をコードする DN Aは目的によりそのまま. または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用するこ とができる。 上記のようにして得られる DN Aは、 配列番号 2、 4、 6、 8、 1 0、 1 2、 14、 16、 18、 20、 22, 24、 26、 28、 30、 32、 3 4、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 48、 50、 52、 54、 56、 5
8、 60、 6 2 64、 66、 68、 69、 7 1, 73 75, 7 7 79, 8 1、 83、 85. 87、 89、 9 1、 93、 95、 97 , 99、 1 0 1 1 03、 105、 107 09、 1 1 3、 1 1 5, 1 1 7 1 1 9 1 2 1、
1 23、 1 2 5、 1 27、 1 29、 1 31、 133、 1 35 137 1 39、
141、 143、 145、 147、 149、 1 5 1, 1 53 1 55 1 57、
1 59、 16 1、 163、 165、 1 67、 1 69、 1 7 1 1 73 1 75、 1 77、 1 79、 1 S 1、 183、 1 85、 1 87、 1 89 1 9 1 1 93、 195、 1 97、 199、 20 1、 203、 205 07 209 2 1 1、 2 1 3、 2 1 5、 217、 2 1 9、 221、 223 25 227 229、 23 1、 233、 235、 237 , 239、 241 43 245 247、 249、 25 1、 253、 255、 257、 259 6 1 263 265、 267、 269、 271、 273、 275、 277 79 28 1 283、
285、 2 S 7、 289、 29 1、 293、 295 97 299 30 1、
303、 305、 307、 309、 3 1 1、 3 1 3 1 5 3 1 7 3 1 9、 32 1、 323, 325、 327、 329、 33 1 33 335 337、 339、 341、 343、 345、 347、 349 51 353 355、 357、 359、 361、 363、 365、 367 69 37 1 373、 375、 377、 379、 38 1、 383, 385 87 389 39 1、
393、 395、 397、 399, 401、 403 05 407 409、
41 1、 41 3、 415、 41 7、 41 9、 421 23 425 427、 429、 43 1、 433、 435、 437、 439 41 443. 445、 447、 449、 451、 453、 455、 457 59 46 1. 463、 46 5、 467、 46 9、 47 1、 47 3、 47 5、 47 7、 47 9、 48 1ま たは 48 3に記載のヌクレオチド配列を有する遺伝子であるか、 あるいは前述の (3) 〜 (6) のポリヌクレオチドであればよい。 上記 （B) において発現べク 夕一に組み込む DN Aは、 上述のタンパク質の全長をコ一ドする全長 c DNAで も、 DNA断片でも良いし、 その一部分を発現する様に構築された DNA断片で も良い。
すなわち、 本発明は、 上記の DN Aを含有する組換えベクターである。
本発明のタンパク質の発現べクタ一は、 たとえば、 本発明のタンパク質をコー ドする D N Aから目的とする D N A断片を切り出し、 該 D N A断片を適当な発現 ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。 用いる発現ベクターとしては、 複製可能であれば、 大腸菌をはじめとする原核 生物由来、 酵母由来、 真菌由来、 昆虫ウィルス由来、 脊椎動物ウィルス由来いず れのベクタ一でも良いが、 宿主として使用する微生物または細胞に適したものを 選択する必要がある。 また、 発現物に応じて、 宿主細胞一発現ベクター系として は、 適切な組み合わせが選択される。
微生物を宿主として使用する場合、 これら微生物に適したプラスミ ドベクター が組み換え体 D N Aの複製可能な発現べクターとして一般に用いられる。
たとえば、 大腸菌を形質転換するためのプラスミ ドベクターとしては、 プラス ミド p BR 3 2 2や pBR 3 2 7などを用いることができる。 プラスミドベクタ 一は通常複製起源、 プロモータ一、 及び組換え体 DN Aで形質転換した細胞を選 別するのに有用な表現型を組換え体 D N Aに与えるマーカ一遺伝子等を含んでい る。 プロモーターの例としては、 3—ラクタマーゼプロモータ、 ラクトースプロ モータ一、 トリプトファンプロモータ一等が挙げられる。 マーカー遺伝子の例と しては、 アンピシリン耐性遺伝子ゃテトラサイクリン遺伝子などが挙げられる。 適した発現べクタ一の例としては、 プラスミ ド pBR 322、 P BR 3 2 7の他 に、 pUC.1 8、 pUC 1 9等が挙げられる。
酵母で本発明の DNAを発現するためには、 複製可能なベクタ一として、 たと えば YE P 24を用いることができる。 プラスミ ド YE p 24は UR A 3遺伝子 を含有しており、 この UR A 3遺伝子をマーカ一遺伝子として利用することがで きる。 酵母細胞用の発現ベクターのプロモーターの例としては、 3—ホスホグリ セレ一卜キナーゼ、 グリセルアルデヒドー 3—ホスフエ一卜デヒドロゲナーゼ、 アルコールデヒドロゲナーゼなどの遺伝子のプロモーター等が挙げられる。
真菌で本発明の D N Aを発現するための発現ベクターに用いられるプロモ一夕 一及び夕一ミナ一ターの例としては、 ホスホダリセレートキナーゼ（PGK)、 グ リセルアルデヒドー 3—ホスフェートデヒドロゲナーゼ（GAPD)、 ァクチン等 の遺伝子プロモーター及びターミネータ一が挙げられる。 適した発現べクタ一の 例としては、 プラスミ ド p P GAC Y 2、 p B S F AHY 83等が挙げられる。 昆虫細胞で本発明の D N Aを発現させるための発現ベクターに用いられるプロ モータ一の例としては、 ポリヘドリンプロモ一夕一、 P 10プロモー夕一などが 挙げられる。
動物細胞で本発明の D N Aを発現させるための組換えべクタ一は、 一般に遺伝 子を制御するための機能配列、 たとえば、 複製起源、 本発明の DNAの上流に位 置すべきプロモーター、 リボソーム結合部位、 ポリアデニル化部位や転写終止配 列を含有している。 本発明の DNAを真核細胞内で発現させるのに用いることが できるそのような機能配列はウィルスやウイ,)レス性物質から得ることができる。 例えば、 SRひプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプロモーター、 C
MV (サイトメガロウィルス） プロモーター、 HS V-TKプロモーターなどがあ げられる。 これらのうち、 CMVプロモータ一、 S R αプロモーターなどを用い るのが好ましい。 また、 本発明のタンパク質をコードする遺伝子の上流位置に本 来存在するプロモーターも、 上述の宿主一ベクター系で使用するのに適している ならば使用することができる。 複製起源については、 外来性の起源、 たとえばァ デノウィルス、 ポリオ一マ、 S V40等のウィルス由来の複製起点を用いること ができる。 また、 発現べクタ一として宿主染色体に組み込まれるような性質を有 するベクターを用いる場合、 宿主染色体の複製起源を利用することができる。 適 した発現ベクターの例としては、 プラスミド p S V 2— d h f r (ATCC 3
7 146)、 pBPV - 1 (9— 1) (ATCC 37 1 1 1)、 p c DNA 3. 1
( I NV I TROGEN社）、 pME 1 8 S— FL 3等が挙げられる。
本発明は、 上記の組換えベクターを含む形質転換された細胞である。 本発明の 複製可能な組換えベクターで形質転換された微生物または細胞は、 前述の通り、 組換えべクタ一に与えられた少なくとも 1種の表現型によって形質転換されずに 残った親細胞から選別される。 表現型は少なくとも 1種のマーカー遺伝子を組換 えベクターに揷入することによって与えることができる。 また複製可能なべクタ 一が本来有しているマ一カー遺伝子を利用することもできる。 マーカー遺伝子の 例としては、 たとえば、 ネオマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子ゃジヒドロ葉酸 レダクターゼをコードする遺伝子などが挙げられる。 上記 （C.) において用いる宿主としては、 大腸菌をはじめとする原核生物、 酵 母、 真菌等の微生物、 及び昆虫や動物等の細胞のいずれでも良いが、 用いる発現 ベクターに適したものを選択する必要がある。 微生物の例としては、 エシュリヒ ァ コリ （E s c h e r i c h i a c o l i ) の菌株、 たとえば E. c o 1 i
K 1 2株 294 (ATCC 3 1446)、 E. c o l i X 1 776 (ATCC
3 1 5 37)、 E. c o l i C 600、 E. c o l i J M 1 09、 E. c o l i B株、 あるいはバチラス サブチリス （B a c i l l u s s u b t i l i s )の如き B a c i 1 1 u s属の菌株、あるいはサルモネラ チフィムリウム（S a 1 m o n e 1 l a t yp h i mu r i um) またはセラチア マーセサンス
(S e r r a t i a ma r c e s a n s) 等の大腸菌以外の腸内菌、 あるいは シュ一ドモナス （P s e ud omo n a s) 属の種々の菌株が挙げられる。 酵母 としては、 たとえば、 サッカロミセス セレピシェ （S a c c h a 1- omy c e s c e r e v i s i a e)、 シソ 'サッカロマイセス ポンべ (S c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e )、 ピキア ノ ス卜リス ( P i c h i a p a s t o r i s ) などが用いられる。 真菌としては、 たとえば、 ァスペルギルス ニドランス （A s p e r g i 1 1 u s n i d u 1 a n s )、 アクレモニゥム ク リソゲナム (Ac r emon i um c h r y s o g e n um) (ATCC 1 1
550 ) 等が挙げられる。
昆虫細胞としては、 たとえば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫 由来株化細胞 （S p o d o p t e r a f r u g i p e r d a : S f 細胞）、 T r i c h o p l u s i a n iの卵由来の H i g h F i v e TM細胞、 などが用 いられる。 動物細胞の例としては、 HEK 293細胞、 COS— 1細胞、 COS 一 7細胞、 He 1 a細胞、 チャイニーズハムスター （CH〇） 細胞等が挙げられ る。 これらの中でも、 CHO細胞および HEK 29 3細胞が好ましい。
細胞を宿主とする場合、 用いられる発現ベクターと宿主細胞の組合せは実験の 目的により異なるが、 その組合せにより、 一過的発現、 構成的発現の 2種類の発 現方式が考えられる。
上記 （C) における微生物及び細胞の形質転換とは、 DNAを強制的方法や、 細胞の貪食能により微生物や細胞に取り込ませ、 プラスミド状態あるいは染色体 に組み込まれた状態で DNAの形質を一過的あるいは構成的に発現させることで ある。 当業者であれば公知の方法によって形質転換できる （たとえば実験医学別 冊遺伝子工学ハンドブック）。たとえば動物細胞の場合、 DEAE—デキス卜ラン 法、 リン酸カルシウム法、 エレクト口ポレーシヨン法 （電気穿孔法）、 リボフェク ション法などの方法で D N Aを細胞に導入することができる。動物細胞を用いて、 本発明のタンパク質を安定に発現させる方法としては、 上記の動物細胞に導入さ れた発現べクタ一が染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する 方法がある。 具体的には、 上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択す る。 さらに、 このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、 繰り 返しクロ一ン選択を行なうことにより本発明のタンパク質の高発現能を有する安 定な動物細胞株を得ることができる。 また、 D i h yd r o f o r a t e r e d u c t a s e (DHFR) 遺伝子を選択マーカ一として用いた場合 M e t h o t r e x a t e (MTX) 濃度を徐々に上げて培養し、 耐性株を選択することに より、 DHFR遺伝子とともに、 本発明のタンパク質をコードする DNAを細胞 内で増幅させて、 さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換された細胞を本発明のタンパク質をコードする D N Aが発現可 能な条件下で培養し、 本発明のタンパク質を生成、 蓄積せしめることによって、 本発明のタンパク質を製造することができる。 すなわち、 本発明は、 上記 （3) 〜 （6) に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む形質転換された細胞を、 該 ポリヌクレオチドによりコードされているタンパク質を発現させる条件下培養し、 次いで培地から該タンパク質を回収することを含む該タンパク質の製造方法であ 上記の形質転換された細胞の培養は、 当業者に公知の方法で行なうことができ る （たとえばバイオマニュアルシリーズ 4、 羊土社）。 たとえば動物細胞の場合、 各種の動物細胞培養法、 たとえば、 シャーレ培養、 マルチトレ一式培養、 モジュ ール培養などの付着培養、 または細胞培養用担体 （マイクロキャリアー） に付着 させるか生産細胞自体を浮遊化させ浮遊培養等の公知の方法により培養を行なえ ば良い。 培地は通常良く用いられる動物細胞用の培地、 たとえば D— M E Mや R P M I 1 6 4 0等を用いれば良い。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 自体公知の分離 ·精 製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法と しては、' 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、 イオン交換クロマトグ ラフィ一などの荷電の差を利用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 お よび S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利 用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する 方法、 逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、 等電 点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。 たとえば、 本 発明のタンパク質は、 硫安またはエタノール沈殿、 酸抽出、 ァニオンまたはカチ オン交換クロマトグラフィー、 ホスフ才セルロースクロマトグラフィー、 疎水性 相互作用クロマトグラフィー、 ァフィ二ティクロマトグラフィー、 ヒドロキシァ パタイ トクロマトグラフィーおよびレクチンクロマ卜グラフィーを含む既知の方 法により組換え細胞培養物から回収し、精製することができる。最も好ましくは、 高性能液体クロマトグラフィ一が精製に使用される。ポリぺプチドが細胞内合成、 単離または精製の間に変性するときには、 活性なコンフォーメシヨンを再生する ために夕ンパク質をリフォールデイングするためのよく知られた技術を使用でき る。
本発明のタンパク質を他の夕ンパク質との融合夕ンパク質として製造すること ができる。 これらも、 本発明に含まれる。 この融合タンパク質を発現する際に用 いられるベクタ一としては、 該夕ンパク質をコードする D N Aを組み込むことが でき、 かつ該融合タンパク質を発現することができるベクタ一であれば、 いかな るベクターでも用いることができる。 本発明のペプチドに融合できる夕ンパク質 としては、 たとえばダル夕チオン一 S —トランスフェラーゼ （G S T )、 ヒスチジ ン残基の 6個の連続配列 （6 X H i s ) 等が挙げられる。 本発明のタンパク質を 他の夕ンパク質と融合した夕ンパク質として発現させた場合には、 融合したタン パク質に親和性をもつ物質を用いたァフィ二ティ一クロマトグラフィーを用いて 精製することができ、 有利である。 例えば、 G S Tとの融合タンパク質として生 産した場合は、 ダル夕チオンをリガンドとするァフィ二ティーク口マトグラフィ 一により精製することができる。 ' 本発明は、 上記 （7 ) のタンパク質の活性を阻害するタンパク質を含む。 たと えば、 抗体や上記 （7 ) のタンパク質の活性中心等に結合し、 活性の発現を妨げ る他のタンパク質が挙げられる。
本発明は、 前記の本発明のタンパク質あるいはその部分べプチドに反応する抗 体ならびにそのような抗体の製造方法に関する。 さらに好ましくは、 前記の本発 明のタンパク質あるいはその部分ペプチドに特異的に反応する抗体、 並びにその ような抗体の製造方法に関する。 ここでいう 「特異的」 とは、 交差反応性が少な いもの、 より好ましくはないものを意味する。 抗体は、 本発明のタンパク質を認 識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体、 ならびにこ れらの抗体のフラグメント、 一本鎖抗体、 ヒト化抗体の何れであってもよい。 抗 体フラグメントは、 公知の技術によって作製することができる。 たとえば、 該抗 体フラグメントには、 限定されるものではないが、 F ( a b ' ) 2フラグメント、 F a b ' フラグメント、 F a bフラグメント及び F vフラグメントが含まれる。 たとえば、 モノクローナル抗体またはポリクロ一ナル抗体は、 上記 （1 ) または ( 2 ) に記載のタンパク質を抗原またはェピトープ含有フラグメントとして非ヒ ト動物に投与することにより得られる。 本発明のタンパク質に対する抗体は、 本 発明のタンパク質あるいはそのペプチドを抗原として用い、 自体公知の抗体また は抗血清の製造法に従って製造することができる。 たとえば実験医学別冊 新遺 伝子工学ハンドブック 改訂第 3版に記載の方法が挙げられる。
ポリクローナル抗体の場合であれば、 たとえば、 本発明のタンパク質をゥサギ などの動物に本発明の夕ンパク質あるいはペプチドを注射することにより該タン パク質あるいはべプチドに対する抗体を産生させ、次いで血液を採取し、これを、 たとえば硫安沈殿、 イオン交換クロマトグラフィー、 あるいは該タンパク質を固 定化したァフィ二ティ一カラム等によって精製することで調製することができる, モノクローナル抗体の場合は、 たとえば、 本発明のタンパク質をマウスなどの 動物に免疫し、 同マウスから脾臓を抽出し、 これをすりつぶして細胞にし、 マウ スミエロ一マ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、 これに よりできた融合細胞 （ハイプリ ドーマ） の中から、 本発明のタンパク質に対する 抗体を産生するクローンを選択する。 次いで、 得られたハイプリ ドーマをマウス 腹腔内に移植し、同マウス内より腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、 たとえば硫安沈殿、 イオン交換クロマトグラフィー、 あるいは該タンパク質を固 定化したァフィ二ティーカラム等によって精製することで調製することができる, 得られた抗体をヒトに投与する目的で使用する場合は、 免疫原性を低下させる ために、 ヒト型化抗体あるいはヒト抗体を用いることが好ましい。 これらのヒト 型化抗体ゃヒト化抗体は、 トランスジエニックマウスまたは他の哺乳動物を用い て作製することができる。 ヒト型化抗体の一般的概説は、 たとえば、 Mo r r i s o n, S . L. e t a 1. CP r o c . Na t 1. Ac d. S c i . USA,
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56 ( 1 9 98)] によって供されている。 ヒト化キメラ抗体は、 マウス抗体の V 領域とヒト抗体の C領域を遺伝子組換えにより結合し、 作製することができる。 ヒト化抗体は、 マウスのモノクローナル抗体から相補性決定部位 （CDR) 以外 の領域をヒト抗体由来の配列に置換することによって作製できる。 また、 免疫系 をヒトのものと入れ換えたマウス用いて、 該マウスを免疫して、 通常のモノクロ ーナル抗体と同様に直接ヒト抗体を作製することもできる。 これらの抗体は、 夕 ンパク質を発現するクローンを単離したり同定するのに使用できる。 また、 これ らの抗体は、 本発明のタンパク質を細胞抽出液、 または本発明のタンパク質を産 生する形質転換細胞から精製するのに使用できる。 更にこれらの抗体は、 細胞や 組織中の本発明のタンパク質を検出する EL I S Aや R I A (ラジオィムノアツ セィ）、 またはウエスタンプロット系の構築に使用できる。 このような検出系は、 動物、 好ましくは、 ヒ卜の組織または血管内流体などの身体サンプル中に存在す る本発明のタンパク質の存在量を検出する診断目的に使用することができる。 た とえば、 これらの抗体は、 アレルギー性疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高 脂血症、 感染症 （一例として H I V感染）、 癌などの、 本発明のタンパク質の（発 現）異常に起因する S T A T 6の望ましくない活性化によって特徴付けられる疾 患の診断に使用できる。 疾患の診断の基礎を提供するために、 本発明のタンパク 質の発現についての通常の値、 すなわち標準値が確立されなければならないが、 これは当業者においては周知の技術である。 すなわち、 複合体形成のための適切 な条件下で、 ヒトあるいは動物のどちらでもよいが、 正常の被験者から得られた 体液あるいは細胞抽出物と、 本発明のタンパク質に対する抗体とを結合させ、 こ の抗体一タンパク複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既 知量の抗原 （本発明のタンパク質） を含む標準液を用いて作成した標準曲線を用 いて、 正常サンプルから得られた標準値を算出する。 標準値と本発明のタンパク 質が関係する疾患を潜在的に患う被験者からのサンプルから得られた値と比較し. 標準値との偏差によって疾病の存在を確認することができる。 また、 これらの抗 体は、 本発明のタンパク質の機能を研究する試薬としても用いることができる。 本発明の抗体は精製され得、 次いで、 たとえば、 アレルギー性疾患、 炎症、 自 己免疫疾患、 糖尿病、 高脂血症、 感染症 （一例として H I V感染）、 癌などの、 本 発明のタンパク質の（発現）異常に起因する S T A T 6の望ましくない活性化によ つて特徴付けられる疾患の患者に投与され得る。 すなわち本発明は、 上記に記載 の抗体を有効成分として含有する医薬、 および抗体を用いた治療方法である。 こ れらの医薬は治療的使用のためにさらなる有効成分または不活性成分（たとえば、 従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤 （たとえば、 免疫原性アジュバ ント） と、 生理学的に無毒の安定化剤および賦形剤とともに組み合わされ得る。 これらの組み合わせは、濾過滅菌され、そして凍結乾燥により投薬バイアル中に、 または安定化水性調製物中の貯蔵物として投薬形態にされ得る。患者への投与は、 たとえば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射などの当業者に公知の方法により 行い得る。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当業 者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 これらの抗体は、 本 発明のタンパク質で仲介される S T AT 6の活性化の促進を阻害し、 治療効果を 示す。
本発明の DN Aは、 細胞内シグナリングプロセスに関与する他のタンパク質を 単離、 同定、 クローン化することにも使用できる。 たとえば、 本発明のタンパク 質をコードする DNA配列は、 コードされたタンパク質を 「バイ ト （b a i t)J として用いて、 c DNAまたはゲノム DNAライブラリーから、 本発明のタンパ ク質に結合できるタンパク質をコードする他の配列 「プレイ （p r e y)」 を単離 し、 クローン化する酵母ツーハイブリッドシステム （たとえば Na t u r e, 3 40 : 245— 246 (198 9)) に用いることができる。 同様の方式で、 本発 明のタンパク質が、 他の細胞タンパク質 （たとえば STAT 6, J AK 1) に結 合できるかどうかも決定することができる。 あるいは別の方法として、 本発明の タンパク質の抗体を用いた免疫沈降法 （たとえば、 実験医学別冊新遺伝子工学ハ ンドブック） によって、 本発明のタンパク質に結合し得るタンパク質を細胞抽出 物から単離する方法が挙げられる。さらに別の方法として、上記に記載のように、 本発明のタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として発現させ、 融合 タンパク質に対する抗体を用いて免疫沈降法を行ない、 本発明のタンパク質に結 合し得る夕ンパク質を単離する方法が挙げられる。
診断アツセィは、 上記した方法により、 STAT6の活性化を促進するタンパ ク質をコードするヌクレオチド配列中の変異を検出することにより疾患の診断や 該疾患への感受性を決定するための方法を提供する。さらに、このような疾患は、 個体に由来するサンプル中のタンパク質または m R N Aレベルの異常な減少また は増加を測定することを含む方法によって診断してもよい。 発現の減少または増 加は、当該技術で R N Aレべルでのポリヌクレオチドの定量によく知られた方法、 たとえば、 R T _ P C Rなどの核酸増幅、 R N a s e保護法、 ノ一ザンブ口ッ卜 法およびその他のハイブリダィゼーション法などを使用して測定できる。 宿主に 由来するサンプル中のタンパク質レべルの測定に使用され得るアツセィ技術は、 当業者によく知られている。 そのような方法には、 ラジオィムノアツセィ、 競合 的結合測定法、 ウエスタンプロット分析および E L I S Aアツセィが含まれる。 本発明の D N Aは、 本発明の夕ンパク質またはそのべプチドフラグメントをコー ドする DN Aまたは mRN Aにおける異常を検出するのに使用できる。本発明は、 個体における上記 （1)、 (2) または （7) に記載のタンパク質の発現に関連し た疾患または疾患への感受性を診断する方法に関する。 該方法は、 タンパク質を コードするポリヌクレオチド配列における変異を、 測定することを含む。
本発明の DN Aは、 本発明の DN Aを用いることによって、 本発明の夕ンパク 質またはその部分ペプチドをコードする DNAまたは mRNAの異常を検出する ことができるので、 たとえば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるい は発現低下や、 増加あるいは発現過多などの遺伝子診断に有用である。 すなわち 本発明は、 個体における該タンパク質の発現または活性に関連した、 該個体にお ける疾病または疾病への感受性の診断方法であって、
(a) 個体のゲノムにおける上記 （1)、 (2) または （7) に記載のタンパク質 をコードするヌクレオチド配列中の変異の存在または不存在を決定し、 および Z または
( b ) 該個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析する、 ことを含む診断方法であって、 発現するタンパク質の量が正常の 2倍以上あるい は 1 ,' 2以下の場合に病気であると診断する方法に関する。
上記 （a) により、 S T AT 6の活性化を促進するタンパク質をコードするヌ クレオチド配列に変異がある場合は、 該変異が S T AT 6の発現または活性に関 連した疾病を引き起こす可能性がある。 あるいは、 （b) により、 被験者における 前記 （1)、 (2) または （7) のタンパク発現量を測定し正常値と異なる値を示 す場合は、 STAT 6の活性化を促進する本発明の新規タンパク質の発現量異常 が S TAT 6の発現または活性に関連した疾病の原因である可能性がある。 ここ で、 （a) の S TAT 6の活性化を促進するタンパク質をコ一ドするヌクレオチド 配列の変異の有無を測定する方法としては、 該タンパク質をコードするヌクレオ チド配列の一部をプライマーとして、 RT— PCRを行い、 その後通常のヌクレ ォチド配列決定方法によって配列を決定し、変異の有無を検出できる。あるいは、 ? 尺ー33じ？法 （ 611017 1 0 3、 5 : 8 74— 8 7 9、 1 98 9年、 実 験医学別冊新遺伝子工学ハンドブック） によっても変異の有無を調べることがで さる。 また、 （b) のタンパク発現量を調べる方法としては、 たとえば、 前記 （ 1 6) に記載の抗体を利用する方法が挙げられる。
また、 本発明は、 本発明のタンパク質による S TAT 6の活性化を阻害または 促進する化合物のスクリーニング方法に関する。
尚、 S T AT 6の活性化を阻害する化合物は、 その作用の結果、 i n v i v oまたは i n v i t r oにおいて ST AT 6の阻害剤としての活性を有するこ ととなる。 一方、 STAT 6の活性化を促進する化合物は、 その作用の結果、 i n v i v oまたは i n v i t r oにおいて S TAT 6の活性化剤としての活 性を有することとなる。 従って、 上記スクリーニング方法は、 STAT 6の阻害 剤または活性化剤としての活性についてスクリ一二ングするものであり、 上記化 合物は、 S TAT 6の阻害剤または活性化剤としての活性を有する化合物である。 上記スクリ一ニング方法は、
(a) S TAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝 子および検出可能なシグナルを提供し得る成分を細胞に提供する工程、
(b) 該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で形質転換され た宿主細胞を培養する工程、
(c) 該形質転換された細胞と 1あるいは複数個の被検化合物とを接触させるェ 程、
(d) 検出可能なシグナルを検出する工程、 および、
(e) 該検出可能なシグナルにより活性化剤化合物および,''または阻害剤化合物 を単離または同定する工程、
を含む。
好ましくは、シグナルを正常より 2倍以上に増加させる化合物を活性化剤とし、 8 0 以下に減少させる化合物を阻害剤化合物として単離または同定する。
検出可能なシグナルを提供し得る成分としては、 たとえばレポーター遺伝子が 挙げられる。 レポ一ター遺伝子は、 テストを行なう転写因子の活性化を直接検出 するかわりに用いられるもので、 調べたい遺伝子のプロモータ一をレポ一ター遺 伝子につなぎ、 レポーター遺伝子の産物の活性を測定することによってプロモ一 夕一の転写活性の解析を行なうものである （バイオマニュアルシリーズ 4、 羊土 社 （ 1 994))。
レポ一夕一遺伝子としては、 その発現産物の活性または生産量 （mRNAの生 産量も含まれる） を当業者が測定可能なものであれば、 いかなるペプチド、 タン パク質をコードする遺伝子も用いることができる。 たとえば、 クロラムフエニコ ールァセチルトランスフェラーゼ、 3—ガラクトシダーゼ、 ルシフェラーゼ等の 酵素活性を測定することで利用できる。 STAT 6の活性化を評価するのに用い るレポータープラスミ ドとしては、 S T AT 6認識配列をレポーター遺伝子の上 流に組み込んだものであればよく、 たとえば CD 23や g e r m 1 i n e Cィプ シロン転写開始部位由来の配列が利用できる。 あるいは、 J . B i o l . Ch e m. 275, 26500 -26 506 (2000)、 J. Ex p. Me d. 1 90， 1 837 - 1 848 (1 999)、 J . I mm u n o 1. 1 50, 540 S - 54 1 7 (1993)、 J . I mmu n o l . 1 57， 20 58- 2065 (1996) に記載のレポ一夕一プラスミドが例示される。
宿主細胞としては、 S TAT 6の活性化の促進を検出し得る細胞であればよく、 好ましくは、 哺乳動物細胞であり、 たとえば N I H 3 T 3細胞、 He pG2細胞 等が好適に用いられる。形質転換及び培養に関しては、上記に記載の通りである。
S TAT 6の活性化を阻害または促進する化合物のスクリーニングは、 具体的 には、たとえば、一定時間培養した形質転換細胞に、被験物質を任意の量添加し、 一定時間後の該細胞が発現するレポ一夕一活性を測定し、 被験物質を添加しない 細胞のレポ一タ一活性と比較することにより、 S T A T 6の活性化を阻害または 促進する化合物をスクリーニングすることができる。 この際、 必要に応じて適切 な刺激、 例えば I L一 4添加等、 を同時に行っても良い。 レポーター活性の測定 は、 当業者に公知の方法 （たとえばバイオマニュアルシリーズ 4、 羊土社 （1 9
94)) で行なうことができる。 スクリーニングの被検物質には特に制限はなく、 低分子化合物、 ペプチドなどが挙げられる。 被検化合物は、 人工的に合成したも のであっても、 天然に存在するものであっても良い。 また単一物質でも、 混合物 でもい。 検出可能なシグナルとしては、 上記レポーター遺伝子の他に、 STAT
6の活性化によつて結果的に発現が誘導されることが知られている、 たとえば I
L一 1レセプターアンタゴニスト、 CD 23、 MHCクラス I I、 STAT 6の 遺伝子の mRNA量あるいはタンパク量を測定しても良い。 また、 核抽出物を用 いたゲル移動度シフト法等の DN Aとタンパク質の結合を検出する手法により、 活性化 STAT 6の定量を行うこともできる。 あるいは、 細胞抽出液を用いた S TAT 6のリン酸化の定量を行っても良い。
mRNA量の測定は、 たとえばノーザンハイブリダィゼ一ションゃ RT— PC R法などが挙げられる'。 夕ンパク量の測定はたとえば抗体を用いる方法が挙げら れる。 抗体は公知の方法によって作製しても良いし、 市販のもの （たとえば和光 純薬工業株式会社） を使用することもできる。
また、 以下の （a) 〜 （f) の工程により医薬組成物を製造することも可能で ある。
(a) STAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝 子および検出可能なシグナルを与えることができる成分を細胞に提供する工程、
( b ) 該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で形質転換され た宿主細胞を培養する工程、
(c) 該形質転換された宿主細胞と 1あるいは複数個の化合物とを接触させるェ 程、
(d) 検出可能なシグナルを測定する工程、
(e) 該検出可能なシグナルにより活性化剤化合物および/または阻害剤化合物 を単離または同定する工程、 および
(f ) 単離または同定された化合物を医薬組成物として最適化する工程。
本発明のタンパク質は、 以下の工程により、 該タンパク質のァゴニスト、 アン 夕ゴニストまたは阻害剤を、 構造を基礎にして設計する方法に使用してもよい。
(a) まず、 タンパク質の三次元構造を決定する工程、
(b) ァゴニスト、 アンタゴニス卜または阻害剤の反応性部位または結合部位と 思われる部位の三次元構造を推論する工程、
( c ) 推論した結合部位または反応性部位に結合するかあるいは結合すると予測 される候補化合物を合成する工程、 および
(d) 該候補化合物が本当にァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは阻害,剤であるか 否かを試験する工程。 また本発明は、 上記スクリーニングによって得られた化合物を含む。 しかしな がら、 本発明のスクリーニング方法は、 上記の方法に限定されるものではない。 さらに、 上記 （1 4 ) に記載の方法により医薬組成物を製造する方法も含む。 該候補化合物には特に制限はなく、 低分子化合物、 ペプチドなどが挙げられ、 また、 人工的に合成したものであっても、 天然に存在するものであっても良い。 上記スクリ一二ングによって得られた化合物は、 S T A T 6の活性化を阻害また は促進する作用を有しているので、 S T A T 6の望ましくない活性化あるいは不 活性化に起因する疾患を治療または予防するための医薬として有用である。 混合 物から目的化合物を単離、 精製するには、 自体公知の方法、 例えば濾過、 抽出、 洗浄、 乾燥、 濃縮、 結晶化、 各種クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて行な うことができる。 化合物の塩を取得したい時は、 化合物が塩の形で得られる場合 にはそのまま精製すれば良く、 また遊離の形で得られる場合には、 通常の方法に より適当な溶媒に溶解または懸濁し、 所望の酸または塩基を添加し、 塩を形成さ せて単離精製すれば良い。 本発明の方法を用いて得られる化合物またはその塩を 医薬組成物として最適化する工程としては、 例えば以下のように常法により製剤 化することが挙げられる。 すなわち活性成分として有効な量の上記化合物または その薬理的に許容される塩と、 薬理的に許容される担体とを混合すれば良い。 ま た製剤化は選択された投与様式に適した形態が選ばれる。 経口投与に適した組成 物としては、 錠剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 丸剤、 および散剤などの固体形態、 溶 液剤、シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁液剤などの液体形態が挙げられる。 非経口投与に有用な形態としては、 無菌溶液剤、 乳剤、 および懸濁液剤が挙げら れる。 上記の担体としては、 例えばゼラチン、 乳糖、 グルコース等の糖類、 コー ン -小麦 *米 * とうもろこし澱粉等の澱粉類、 ステアリン酸等の脂肪酸、 ステア リン酸カルシウム ·ステアリン酸マグネシウム等の脂肪酸塩、 タルク、 植物油、 ステアリンアルコール ·ベンジルアルコール等のアルコール、 ガム、 ポリアルキ レングリコール等が挙げられる。これらのうち液状担体の例としては、一般に水、 生理食塩水、 デキストロースまたは類似の糖溶液、 エチレングリコール、 プロピ レングリコ一ル、 ポリェチレングリコール等のグリコール類が挙げられる。
本発明は、 S T A T 6の活性化の阻害剤または活性化剤としての活性について 化合物をスクリーニングするためのキットである。 該キッ 卜は、
(a) STAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質をコードする遺伝 子、 および STAT 6の活性化後、 その活性化が検出可能なシグナルを提供する 成分を含有する細胞、 .
(b) 該検出可能なシグナルを測定するための試薬、 から成り、 STAT6の活 性化を阻害または促進する化合物をスクリーニングするために必要な試薬類 を含む。
別の側面において、 本発明は、
(a) 配列番号 2 4、 6、 8、 1 0 1丄 9 、 14、 16 1 8 20 、 22、 24、 26、 28 30、 32、 34 36、 38、 40 42 44、 46、 48、 50、 52 54、 56、 58 60、 62、 64 66 68、 69、 7 1、 73、 7 5 77、 79、 8 1 83、 85、 87 89 91、 93、 9 5、 97、 99- 1 01、 1 03、 05、 1 07 1 09 1 1 1 1 1 3、 1 1 5、 1 17,、 1 19、 1 2 1、 1 13、 1 25、 127、 1 29 13 1、
133、 135、 1 37、 1 39、 11 1 143、 145、 147 149、
1 5 1、 1 53、 1 55、 1 57、 11 59 1 6 1、 163、 1 65 167、
169、 17 1、 1 73、 1 75、 11 77 1 79、 1 8 1、 1 83 1 85、 1 87、 1 89、 1 9 1、 1 93 195 1 97、 1 99、 20 1 203、
205、 207、 209、 2 1 1 2 1 3 2 1 5、 21 7、 2 1 9 22 1、
223、 225、 227、 229 231 235、 237 239、
241、 2' 43、 245、 247 249 251、 " リ 、 255 257、
259、 26 1、 263、 265 267 269、 27 1、 273 275、 277、 279、 28 1、 283 285 287、 289、 29 1 293、
295、 297、 299、 30 1 303 305、 307、 309 31 1、
3 1 3、 31 5、 3 17、 3 1 9 321 323、 325, 327 329、
33 1、 333、 335、 337 339 341、 343、 345 347、
349、 351、 353、 355 357 359、 36 1、 363 365、 367、 369、 37 1、 373 375 377、 379、 38 1 383、
3 S 5、 387、 389、 39 1 393 39 5, 397、 399 401、 403、 405、 407、 409、 41 1、 41 3、 41 5、 41 7、 41 9、 42 1、 423、 425、 427、 429、 43 1、 433、 435、 437、 439、 441、 443、 445、 447、 449、 451、 453、 455、 457, 459, 461、 463、 465、 467、 469、 471、 473、 47 5、 477、 479、 481または 483で表されるヌクレオチド配列を有 する本発明のポリヌクレオチド ；
(b) (a)のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレ ォチド ；
(c) 配列番号 1、 3 、 5、 7、 9 1 3 1 5 1 7 、 1 9、 0 丄 1 2 3、 25、 27、 29、 31、 33 35、 37 39 41、 43、 45 4 7、 49、 5 1、 53、 55、 57、 59、 6 1 63 65、 67、 70 7 2、 74、 76、 78、 80、 82、 84、 86 88 90、 92、 94 9 6、 98、 1 00、 1 02、 1 04、 , 1 06 1 08 1 1 0、 1 1 2 1 1 4、
1 1 6 1 1 8 120 1 22 1 24、 1 26、 1 28、 1 30、 1 32、 1 34 1 36 138 140 142、 144、 146、 148、 150、 1 52 1 54 156 1 58 1 60、 162、 1 64、 166、 168、
1 70 1 72 174 1 76 1 78、 1 80、 1 82、 1 8.4、 186、
1 88 1 90 192 1 94 1 96、 1 98、 200、 202、 204、 206 208 210 2 1 2 2 14、 21 6、 2 1 8、 220、 222、 224 226 228 230 232、 234、 236、 238、 240、 242 244 246 248 250、 252、 254、 256, 258、 260 262 264 266 268、 270、 272、 274、 276、 278 280 282 284 286、 288、 290、 292、 294、
2 96 298. 300 302 304、 306、 308、 3 1 0、 3 1 2、 3 14 316 31 8. 320 322、 324、 326、 328, 330、
3 32 334. 336 338 340、 342、 344、 346, 348、 3 50. 352. 354. 3 56 358、 360、 362、 364、 366、 3 68 370. 372- 374. 376、 378、 380、 382、 384、 386. 388- 390. 392 394、 396、 398、 400、 402、 404、 406、 408、 410、 41 2、 414、 416、 41 8、 420、 422、 424、 426, 428、 430、 432、 434、 436, 438、 440、 442、 444、 446、 448、 450、 452、 454、 456、 458、 460、 462、 464、 466、 468、 470、 472、 474、 476、 478、 480、 482または 484で表されるアミノ酸配列を有する 本発明のタンパク質またはそれらの断片； または
(d) (c) の本発明のタンパク質に対する抗体；
を含む診断キッ卜に関する。
少なくとも （a) 〜· (d) のいずれかを含むキットは、 アレルギー性疾患、 炎 症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高脂血症、 感染性疾患 （たとえば H I V感染） およ び癌などの疾患または該疾患への感受性を診断するのに有用である。
STAT 6は、 アレルギー性疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高脂血症、 ガン及びウィルス感染などの多種の病理学的状態におけるその関与のため、 薬物 デザィン及び治療介在のための魅力的な標的である。 多数の実験が、 STAT 6 活性の阻害が深い生理学的作用を有し得ることを示している 〔たとえば、 Na t u r e 380, 627— 630 (1 996)、 N a t u r e 380, 630 - 633 ( 19 96), I mmun i t y 4, 3 1 3 - 3 19 (1 996)、 J .
1 mm u n o 1.1 57, 3220— 3222 (1 996 )、 I mm u n i t y 8 ,
25 5 - 264 (1 998)、 J. E . Me d. 1 87, 939 - 948 (1 998 )、 J. E . Me d. 1 87, 1 537- 1 542 (1 998)〕。 本明細書中に報告する S TAT 6の活性化を促進する作用を有する新規タンパ ク質の発見により、 異常な S TAT 6機能を阻害する新しい方法が提供された。 さらなる具体例において、 本発明は、 S TAT 6の活性化を阻害するための前記 の S T A T 6の活性化を促進する作用を有する夕ンパク質の機能を阻害する化合 物を用いる方法に関する。 上記スクリーニング方法によって得られた、 STAT 6の活性化を阻害する化合物は、 たとえばアレルギー性疾患、 炎症、 自己免疫疾 患、 糖尿病、 高脂血症、 感染症 （1例として H I V感染症）、 ガンなどの、 S TA T 6の望ましくない活性化によつて特徴つけられる疾患を治療または予防する医 薬として有用である。 逆に、 S T A T 6の活性化が T h 2細胞への分化を促進することから、 T h l が機能亢進している疾患、 例えば、 多発性硬化症やインシュリン依存型糖尿病な どの臓器特異的自己免疫疾患やリューマチの症状軽減や治療の可能性も考えられ る。 よって、 上記スクリーニング方法によって得られた、 S T A T 6の活性化を 促進する化合物はこれらの疾患の治療または予防のための医薬として有用である, 更に、本発明のタンパク質をコードする遺伝子は、癌、 自己免疫疾患、糖尿病、 高脂血症、 アレルギー性疾患、 および炎症性応答を初めとする様々な疾患の治療 を目的とした遺伝子治療にも有用である。 遺伝子治療とは、 疾病の治療を目的と して、 遺伝子または遺伝子を導入した細胞をヒ卜の体内に投与することを意味す る。 本発明のタンパク質ゃ該タンパク質をコードする DNAは、 診断目的にも使用 できる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を上述の医 薬組成物として使用する場合、 常套手段に従って実施することができる。 たとえ ば、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁 液剤などとすることができる。 このようにして得られる製剤は安全で低毒性であ るので、 たとえば、 ヒ卜や哺乳動物 （たとえば、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。 患者への投与は、 たとえば、 動脈内注射、 静脈内注射、 皮下注射など当業者に公知の方法により行 いうる。 投与量は、 患者の体重や年齢、 投与方法などにより変動するが、 当業者 であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。 また、 該化合物が DNA によりコードされうるものであれば、 該 DNAを遺伝子治療用べクタ一に組込み、 遺伝子治療を行うことも考えられる。 投与量、 投与方法は、 患者の体重や年齢、 症状などにより変動するが、 当業者であれば適宜選択することが可能である。 す なわち本発明は、 上記化合物を有効成分として含有する医薬に関する。
さらに、 上記化合物は、 アレルギー性疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高 脂血症、 ウィルス性疾患、 感染症、 ガンなどの、 S T A T 6の望ましくない活性 化によって特徴つけられる疾患の治療または予防する医薬として有用である。 す なわち本発明は、 上記化合物を含むアレルギー性疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 糖 尿病、 高脂血症、 ウィルス性疾患、 ガンなどの医薬に関する。 具体的には、 例え ば、 慢性関節リウマチ、 変形性関節症、 全身性エリテマトーデス、 糖尿病、 敗血 症、 喘息、 アレルギー性鼻炎、 虚血性心疾患、 炎症性腸疾患、 くも膜下出血、 ゥ ィルス肝炎、 エイズ、 などに対する治療及び予防薬として有用である。
さらにまた、 本発明は、 アレルギー性疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高 脂血症、 ウィルス性疾患、 ガンなどの医薬の製造における上記 （14) 記載の方 法により製造された医薬組成物の使用も含む。
また本発明は、 上記 （3) 〜 （6) に記載の遺伝子に対するアンチセンスオリ ゴヌクレオチドも含む。 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 標的とした遺伝子 配列に対して相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドを用いて、 タンパク質への 翻訳、 細胞質への輸送、 あるいは全体的な生物活性機能に必要な他の活性等の R N Aの機能を阻害することによって、標的遺伝子の発現を抑制することができる。 この際、 アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、 RNAを用いても良いし、 DNAを用いても良い。 本発明の DNA配列は、 本発明のタンパク質をコードす る遺伝子から転写された mRNAとハイプリダイズし得るアンチセンスオリゴヌ クレオチドを作製するために使用できる。 一般にアンチセンスオリゴヌクレオチ ドが、その遺伝子の発現に対して抑制的に作用す'ることは公知での事実である（た とえば、 細胞工学 Vo l . 1 3 No. 4 ( 1994))。 本発明のタンパク質 をコードする遺伝子に対するアンチセンスコード配列を有するオリゴヌクレオチ ドは、 標準の方法で細胞内に導入することができ、 該オリゴヌクレオチドは、 本 発明のタンパク質をコードする遺伝子の mRNAの翻訳を効果的に遮断して、 そ の発現を遮断して、 望ましくない作用が阻害される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、天然に見出されるオリゴヌクレオチドの他に、 修飾されたものであっても良い 〔たとえば、 村上&牧野：細胞工学 λ o l . 1
3 No. 4 p 259— 266 ( 1 994)、村上章：蛋白質核酸酵素 Vo l .
40 No. 10 ι〕 1 364— 1 370 (1 995)、竹内恒成ら：実験医学 V o 1. 14 No. 4 p 85 - 95 (1996〕。 従って、 オリゴヌクレオチド は変化した糖部分あるいは糖間部分を有していても良い。 これらの例は、 当該技 術分野において使用が知られているホスホチォエート及び他のィォゥ含有種であ る。 幾つかの好ましい態様に従えば、 オリゴヌクレオチドの少なくとも一つのホ スホジエステル結合が、 その活性が調節されるべき R N Aが位置する細胞の領域 に浸透する組成物の能力を高める機能を有する構造により置換される。
このような置換は、 ホスホロチォェ一卜結合、 ホスホロアミデート結合、 メチ ルホスホネ一ト結合または短鎖アルキルもしくはシクロアルキル構造を含むこと が好ましい。 オリゴヌクレオチドはまた、 少なくとも幾つかの修飾されたヌクレ ォチド型を含んでいても良い。 従って、 天然に通常見いだされるもの以外のプリ ン及びピリミジンを使用していても良い。 同様に本発明の本質的な意図が実行さ れる限り、ヌクレオチドサブユニッ トのフラノシル部分を修飾することもできる。 このような修飾の例は、 2， 一〇一アルキル—、 及び 2 ' —ハロゲン置換ヌクレ ォチドである。 本発明において有用な幾つかの糖部分の 2 ' 位の修飾の例は、 〇 H、 SH、 S CH3、 OCH3、 OCN、 または O (CH2) nCH3 (ここで nは 1から約 1 0'である）、及び同様の特性を有する他の置換基である。全てのこのよ うな類似体は、 本発明の遺伝子の m R N Aとハイブリダィズしてその R N Aの機 能を阻害する機能を果たす限り、 本発明に包含される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、 約 3から約 50ヌクレオチドを含み、 約 8か ら約 25ヌクレオチドを含むことが好ましく、 約 12から約 20ヌクレオチドを 含むことがさらに好ましい。 本発明のオリゴヌクレオチドは、 周知の方法である 固相合成法により作製することができる。 このような合成のための装置は、 Ap p l i e d B i o s y s t emsを含む幾つかの業者により販売されている。 ホスホチォェ一ト等の他のオリゴヌクレオチドの製造も当業者に公知の方法で作 製できる。
本発明のォリゴヌクレオチドは、 本発明の遺伝子から転写される m R N Aとハ ィブリダイズできるように設計される。 与えられた遺伝子の配列に基づいてアン チセンスオリゴヌクレオチドを設計する方法は、 当業者であれば容易である 〔た とえば、 村上および牧野：細胞工学 Vo l . 13 No. 4 P 2 59 - 266
( 1 994)、 村上章：蛋白質核酸酵素 Vo し 40 No. 1 0 p 1 364
- 1 370 (1 995)、 竹内恒成ら ：実験医学 Vo 14 No. 4 p 8
5 - 95 ( 1 996)〕。 最近の研究は、 mRNAの 5 ' 領域、 好ましくは翻訳開 始部位を含む領域に設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが、 遺伝子の発 現の阻害に最も効果的であることを示唆している。 アンチセンスオリゴヌクレオ チドの長さは、 1 5から 30ヌクレオチドが好ましく、 20から 25ヌクレオチ ドがより好ましい。 ホモロジ一検索で他の mRNAとの相互作用がないこと、 ォ リゴヌクレオチド配列内で二次構造を取らないことを確認しておくことは重要で ある。 設計したアンチセンス分子が機能したかどうかの評価は、 適当な細胞を用 いて、 該細胞にアンチセンス才リゴヌクレオチドを導入し、 当業者には公知の方 法で、 対象 mRNAの量 （たとえば、 ノーザンブロッ トまたは RT— PC R法）、 あるいは対象タンパク質の量（たとえば、 ウエスタンブロッ卜または蛍光抗体法） を測定することにより、 発現抑制の効果を確認できる。
一方、 三重らせん形成 （トリプル ·ヘリックス技術） は、 核内の DN Aを標的 とした、主に転写の段階での遺伝子発現制御方法である。ォリゴヌクレオチドは、 主に転写に関与する遺伝子領域に設計され、 それにより、 転写及び本発明のタン パク質の産生を抑える。 これらの RNA、 DNA、 オリゴヌクレオチドは、 公知 の合成装置などを用いて製造することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、 標的核酸配列を含む細胞に、 たとえばリン酸 カルシウム法、 リポフエクシヨン法、 エレクトロボレ一シヨン法、 マイクロイン ジェクション法などの DNAトランスフエクション法、 またはウィルスなどの遺伝 子導入ベクターの使用を含む遺伝子導入法のいずれを用いて導入してもよい。 適 切なレトロウイルスベクターを用いてアンチセンスオリゴヌクレオチド発現べク タ一を作製し、 その後、 該発現ベクターを細胞と i n V i v oまたは e x v i v oで接触させることにより、 標的核酸配列を含む細胞に導入できる。
本発明の DN Aは、 アンチセンス RNAz DNA技術またはトリプル ·ヘリッ クス技術を用いて、 本発明のタンパクを介する S TAT 6の活性化の促進を阻害 するのに使用できる。
本発明のタンパク質をコードする遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 たとえばアレルギー性疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高脂血症、 感染症 （た とえば、 H I V感染症）、 ガンなどの、 STAT 6の望ましくない活性化によって 特徴つけられる疾患を治療または予防する医薬として有用である。 すなわち、 本 発明は、 上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含有する医薬で ある。 また、 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 ノーザンハイブリダ ィゼ一シヨン法または P C R法を用いてそれらの疾病の検出に利用することもで きる。
本発明は、 STAT 6の活性化を阻害するリボザィムも含む。 リポザィムは、 核酸のヌクレオチド配列を認識して、核酸を切断する活性を持つ RN Aである（た とえば、 柳川弘志 実験医学バイオサイエンス 1 2、 RNAのニューエイジ）。 リ ボザィムは、 選択された標的 RNA、 たとえば本発明のタンパク質をコードする mRN Aを開裂するように製造することができる。 本発明のタンパク質をコード する DNAのヌクレオチド配列を基に、 本発明のタンパク質の mRNAを特異的 に切断するリボザィムを設計することができ、 かようなリボザィムは本発明の夕 ンパク質の m R N Aに対して相補的な配列を有し、 該 m R N Aと相補的結合し、 ついで該 mRN Aが開裂され本発明のタンパク質の発現が減少し （または完全に 発現せず）、発現減少のレベルは標的細胞内でのリボザィム発現のレベルに依存し ている。
よく用いられるリポザィムには、 ハンマーヘッド型とヘアピン型の 2種類があ り、 特にハンマ一へッ卜型リボザィムは切断活性に必要な一次構造や二次構造が よく調べられており、 当業者であれば、 本発明のタンパク質をコードする DNA のヌクレオチド配列情報のみで容易にリポザィムの設計が可能である〔たとえば、 飯田ら：細胞工学 Vol.16 No.3, P438-445 (1997)、 大川&多比良：実験医学 Vol.12
No.12 p83- 88(1994)〕。 ハンマ一ヘッドリポザィムは、 標的 RN Aと相補鎖を形成 する 2ケ所の認識部位 （認識部位 I と認識部位 I I ) と活性部位からなる構造を なし、 標的 RNAと認識部位で相補対を形成した後、 標的 RNAの NUXの配列
(N ： Aまたは Gまたは Cまたは U、 ：八または〇または11) の 3 ' 末端側で 切断することが知られており、 特に GUC (あるいは GUA) が一番高い活性を 持つことが知られている 〔たとえば Koizumi, Mら： Nucl. Acids
Res.17, 7059-7071 (1989) , 飯田ら ：細胞工学 Vol.16 No.3, ρ438- 445 (1997)、 大 川 &多比良：実験医学 Vol.12 No.12 p83- 88 (1994)、 川崎 &多比良：実験医学
Vol.18 No.3p381-386 (2000)〕。
そこでまず、 本発明の DNA配列の中から GTC (または GTA) の配列を探 し出し、 その前後で数ヌクレオチドから十数ヌクレオチドの相補対をつくること ができるようにリポザィムを設計する。 設計したリボザィムの適切性の評価は、 たとえば、 大川&多比良の文献 〔実験医学 Vol.12 No.12 p83- 88 (1994) 〕 に記載 の方法によって、 作製したリボザィムが、 イン ビトロで標的 mRNAを切断で きるかどうかを調べることで評価できる。 リボザィムの調製は、 RNA分子を合 成するのための当分野で周知の方法により調製する。
別法としては、 リボザィムの配列を DNA合成機で合成し、 たとえば T 7或い は S P 6のような適切な RNAポリメラーゼプロモー夕を有する多種のベクター に組み込み、 イン ビトロで酵素的に RNAを合成させる方法が挙げられる。 こ れらのリボザィムは、 たとえばマイクロインジェクション法などの遺伝子導入方 法によって細胞内に導入できる。 あるいは別の方法として、 リボザィム DN Aを 適当な発現べクタ一に組み込んで、 株細胞、 細胞或いは組織内に導入する。 選択 された細胞中にリボザィムを導'入するのに、 適切なベクタ一を使用することがで き、 たとえばプラスミドベクター、 動物ウィルス （たとえばレトロウイルス、 ァ デノウィルス、 ヘルぺスあるいはワクシニアウィルス） ベクターがこれらの目的 に通常用いられるこれらのリボザィムは、 本発明の夕ンパク質で仲介される S T AT 6の活性化の促進を阻害する作用を有する。
本発明である S T AT 6の活性化を促進する作用を有する夕ンパク質をコ一ド する D N Aは、 オリゴキヤッピング法を用いて完全長 c D N Aライブラリーを作 製する方法および該機能を有するタンパク質の存在を示すシグナル因子を用いる 方法からなる取得方法により取得された。シグナル因子には >たとえばレポーター 遺伝子が挙げられる。
機能を有する遺伝子 （cDNA) を多数取得するためには、 不完全長のものが 多い c DNAライブラリ一を用いると効率が悪い。 したがって、 全体のクローン の中で、 完全長のものの割合が高いライブラリーが必要となる。 完全長 c DNA は遺伝子から出来る mRNAの完全なコピーのことである。 オリゴキヤッビング 法で作製した c DNAライブラリ一は、 完全長 cDNAの割合が 50〜80 %で あり、 従来の方法で作製された c DNAライブラリ一と比べて、 5〜1 0倍の完 全長 c DNAクローンの濃縮になっている（菅野純夫：月刊 BIO INDUSTRY Vol.16 No.11ρ19- 26)。 完全長 c DNAは、 遺伝子の機能解析においては、 タンパク質発 現のために必須なクロ一ンであり、 完全長 c DNAのクロ一ンそのものが活性測 定のための材料として極めて重要なものであるため、 遺伝子の機能解析を試みる に際して、 完全長 cDNAのクローニングは必須の要件である。 さらにその配列 を決定することで、 それがコ一ドする夕ンパク質の一次配列を確定するための重 要な情報となると同時に、 遺伝子の全ェクソンの配列も分かる。 すなわち、 完全 長 cDNAは、 遺伝子を同定する上で貴重な情報、 たとえばタンパク質の一次配 列、 ェクソン一イントロン構造、 mRNAの転写開始点、 プロモーターの位置な どを決めるための情報をも与える。
オリゴキヤッビング法による完全長 c DNAライブラリー作製は、 たとえば実 験医学別冊新遺伝子工学八ンドブック改訂第 3版 （1 999年） に記載の方法に 従い行うことができる。 機能を有するタンパク質の存在を示すレポーター遺伝子 は、 転写因子等のタンパク質因子が結合できる適切な発現制御配列部分 （1つま たは複数） と、 その転写因子等による活性化を測定できる構造遺伝子部分からな る。 構造遺伝子部分は、 その発現産物の活性または生産量 （mRNAの生産量も 含まれる） を当業者が測定可能なものであれば、 いかなるペプチド、 タンパク質 をコードする遺伝子も用いることができる。 たとえば、 クロラムフエニコ一ルァ セチルトランスフェラ一ゼ、 5—ガラクトシダ一ゼ、 ルシフェラーゼ等を用いる ことができ、 その酵素活性を測定することで利用できる。
オリゴキヤッピング法とは、 鈴木 *菅野 実験医学別冊 遺伝子工学ハンドブ ック改訂第 3版に記載のように、 BAP, TAP, RNAリガーゼにより、 キヤ ップ構造を合成オリゴに置換する方法である。
本発明の S TAT 6の活性化を有するタンパク質をコ一ドする DNAを取得す るためには、 イン ビトロ （ i n V i t r o) の系、 あるいは細胞を用いて （c e l 1— b a s e d) の系のどちらの方法でも良く、 好ましくは細胞を用いた系 である。 細胞は、 大腸菌をはじめとする原核生物、 酵母、 真菌等の微生物、 及び 昆虫や動物等の細胞のいずれでも良く、 好ましくは動物細胞であり、 2 93 EB
NA細胞、 N I H 3 T 3細胞が例示できる。
機能を有するタンパク質の存在を示すレポーター遺伝子としては、 本願明細書 に示した S TAT 6のレポ一ター遺伝子の他に、 たとえば CREB (cAMP responsive element binding protein) 結合配列あるレ は A P— 1 (activator protein- 1)結合配列をレポ一夕一遺伝子の発現制御配列部分に有するレポ一夕一 遺伝子が挙げられる。 たとえば、 CREBを活性化する機能を有する遺伝子を取 得したい場合は、 C R E B依存レポ一夕一プラスミ ドとォリゴキャッピング法で 作製した完全長 c D N Aクローンを細胞に共導入し、 その中からレポ一夕一活性 が上昇したプラスミ ドを選ぶことによって、 該目的を達成することができる。 ま た、 CREBを抑制する機能を有する遺伝子を取得したい場合は、 CREB依存 レポ一タープラスミドとオリゴキヤッビング法で作製した完全長 c DNAクロ一 ンを細胞に共導入し、 その中からレポ一夕一活性が減少したプラスミドを選ぶこ とによって、 該目的を達成することができる。 この場合、 細胞に何らかの刺激を 加えた状態で行なっても良い。 c DN Aクローンの細胞への導入は、 1クローン でも良いし、 複数のクローンを同時に導入しても良い。 あるいは、 完全長 cDN Aとレポーター遺伝子を細胞に導入した後、 細胞を I L一 4あるいは I L一 13 などで刺激し、 レポ一夕一活性の上昇の弱いクローンを選ぶことによって、 ST A T 6の活性化を抑制する機能を有する遺伝子を取得するためのスクリー二ング 系を構築することもできる。
また、 本発明の cDNAは、 完全長 c DNAであるため、 その 5 ' 末端の配列 が mRNAの転写開始点であり、 該 c DNA配列をゲノムのヌクレオチド配列と 比較することにより、該遺伝子のプロモー夕一領域を同定することに利用できる。 ゲノムのヌクレオチド配列は、 データベースに公知の配列として登録されている 場合はその配列を利用できる。 あるいは、 該 c DNAを用いてたとえばハイプリ ダイゼ一シヨンによつてゲノムライブラリ一からクローニングし、 ヌクレオチド 配列を決めることもできる。 このようにして、 本発明の c DNAのヌクレオチド 配列をゲノムの配列と比較することによって、 その上流に存在する該遺伝子のプ 口モータ—領域を同定することが可能である。 さらに、 このようにして同定した 該遺伝子のプロモーター断片を用いて該遺伝子の発現を調べるレポ一夕一プラス ミドを作製することができる。 レポータープラスミ ドは、 大方の場合、 転写開始 点からその上流 2 kb、 好ましくは転写開始点からその上流 1 kbの DNA断片 をレポーター遺伝子の上流に組み込むことによって作製できる。 さらに該レポー 夕一プラスミ ドは、 該遺伝子の発現を増強あるいは減弱させる化合物のスクリー ニングに利用できる。 具体的には例えば、 該レポ一夕一プラスミ ドで適当な細胞 を形質転換し、 一定時間培養した形質転換細胞に、 被験物質を任意の量添加し、 一定時間後の該細胞が発現するレポーター活性を測定し、 被験物質を添加しない 細胞のレポーター活性と比較することによりスクリー二ングすることができる。 これらも本発明に含まれる。
また本発明は、 配列番号 2 4、 6、 8、 1100、 、 1122、 1144、、 1 6、 1 8、 2
0 22， 24、 26、 28 30、 32、 3344、、 3366、 3388、、 40、 42、 4 4 46、 48、 50、 54、 56、 5588、 、 6600、 6622、、 64、 66、 6 8 69、 7 1、 73、 75 77、 79、 8811、 、 8833、 8855、、 87、 89、 9 1 93、 9 5、 97、 99 10 1、 103、 105 1 07 1 09 1 1 1 3 1 1 5 1 1 7 1 1 9 1 21、 1 3 1 25 1 27 丄 1 9 1 3 1 133 135 137 1 39、 141 143 145 14 7 1 9 1 51 153 1 55 1 57、 159 1 6 1 1 63 1 6 5 167 169 17 1 1 7 3 1 75、 177 1 79 1 8 1 1 8 3 1 55 1 87 189 1 9 1 1 93、 195 1 97 1 99 20 203 205 207 209 2 1 1、 21 3 2 1 5 2 1 7 2 1
9 22 1 223 225 227 229、 23 1 233 235 23 7 239 241 243 245 247、 249 251 253 25 5 257 259 26 1 26 3 265、 267 269 27 1 27 3 275 277 279 28 1 283、 285 2 S 7 289 29 1 293 295 297 299 30 1、 303 305 307 30 9 3 1 1 313 31 5 3 1 7 3 19、 321 323 32 5 32 7 329 331 333 33 5 337、 339 341 343 34 5 347 349 351 353 355、 357 359 361 36 3 365 367 369 37 1 373、 375 377 379 38 1 383 385 387 38 9 391、 393 395 397 39 9 40 1 403 405 407 409、 41 1 41 3 41 5 1 7、 4 1 9、 4 2 1、 423、 425、 42 7、 42 9、 43 1、 43 3、 43 5、 4 3 7、 439、 441、 443、 44 5、 447、 449、 45 1、 45 3、 45 5、 457, 459、 46 1、 46 3、 46 5、 46 7、 46 9、 47 1、 47 3、 47 5、 47 7、 479、 48 1または 48 3で表されるヌクレオ チド配列のうち少なくとも 1以上を含むデー夕セットおよび zまたは配列番号 1 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 2 3、 2 5、 2 7、 2
9、 3 1、 3 3、 35、 37、 3 9、 4 1、 43、 45、 47、 49 5 1、 5 3、 5 5、 5 7、 59、 6 1、 63、 6 5、 6 7、 7 0、 72、 74 7 6、 7
8、 8 0、 8 2、 84、 86、 88、 9 0、 9 2、 94、 9 6、 98 1 00、
1 0 2、 1 04、 1 06、 1 0 8、 1 1 0、 1 1 2 1 14 1 1 6 1 1 8、
1 2 0、 1 ° 2ヽ 1 24、 1 2 6、 1 2 8、 1 30 1 3 2 1 34 1 36、
1 3 8、 1 40、 142、 1 44、 1 46、 1 48 1 50 1 52 1 54、 1 56、 1 5 8、 1 60、 1 6 2、 1 64、 1 66 1 6 8 1 70 1 7 2、 1 74、 1 7 6、 1 7 8、 1 8 0、 1 8 2、 1 84 1 8 6 1 88 1 90、 1 9 2、 1 94、 1 96、 1 9 8、 2 0 0、 2 0 2 204 2 06 2 0 S、 2 1 0、 2 1 2、 2 14、 2 1 6、 2 1 8、 2 20 2 2 2 2 24 2 26、 2 2 8、 2 3 0、 23 2、 2 34、 2 36、 2 38 240 242 244、 246、 248、 250、 2 5 2、 2 54、 2 56 25 8 260 262、 2 64、 26 6、 26 8、 2 7 0、 2 7 2 2 74 27 6 2 7 8 2 80、
2 8 2、 284、 286、 2 8 8、 2 90、 29 2 2 94 2 96 2 98、
3 0 0、 3 0 2、 304、 30 6、 3 0 8、 3 1 0 3 1 2 3 14 3 1 6、 3 1 8、 3 2 0、 322、 3 24、 3 2 6、 3 28 3 3 0 3 3 2 3 34、 3 3 6、 3 3 8、 340、 3 42、 344、 346 348 3 50 3 52、 3 54、 3 5 6、 358、 3 6 0、 3 6 2、 3 64 36 6 36 8 3 70、 3 7 2、 3 74、 376、 3 7 8、 3 80、 3 82 384 3 86 3 8 8,
3 9 0、 39 2、 394、 3 9 6、 3 98、 400 40 2 404 406、
40 8、 41 0、 41 2、 41 4、 4 1 6、 4 1 S 42 0 42 2 424、 42 6、 42 8、 430、 4 3 2、 434、 43 6 43 8 440 442、 444、 446、 448、 4 50 4 52、 454' 456 458 460、 462、 464、 466、 468, 47 0、 47 2、 474、 47 6、 478、
48 0、 48 2または 484で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも 1以上を 含むデ—夕セッ トを保存したコンピュー夕読み込み可能媒体に関する。 さらに本発明は、 上記に記載の媒体上のデータと他のヌクレオチド配列のデー 夕を比較して相同性の算出を行う方法に関する。 すなわち、 本発明のポリヌクレ ォチド配列およびアミノ酸配列は、 その 2次元および 3次元構造を決定し、 たと えば同様の機能を有する相同性の高いさらなる配列を同定するための貴重な情報 源となる。 これらの配列をコンピュータ読み込み可能媒体に保存し、 ついで既知 の高分子構造プログラムにおいて保存し 6たデータを用いて、 G C Gプログラムパ
4
ッケージ （Devereux, J. ら、 Nucleic Acids Research 12 (1) :387 (1984) ) のよう な既知検索ツールを用いてデータベースを検索すれば、 データベース中の、 ある 相同性を有する配列を見出すことは容易である。
コンピュータ読み取り可能媒体は情報またはデータを保存するのに用いる物体 のいずれの組成物であってもよく、 たとえば、 市販フッロッピーディスク、 テー プ、 チップ、 ハードディスク、 コンパクトディスク、 およびビデオディスク等が ある。 また、 本媒体上のデータは、 他のヌクレオチド配列のデ一夕と比較して相 同性の算出を行なう方法を可能にする。 この方法には、 本発明ポリヌクレオチド 配列を含む第一のポリヌクレオチド配列をコンピュータ読み込み可能媒体中に提 供し、 次いで、 該第一のポリヌクレオチド配列を少なくとも一つの第二のポリヌ クレオチドまたはポリペプチド配列と比較して相同性を同定する工程を含む。 本発明はまた、 配列番号 2 4、 6、 8、 1 0、 1 2 14、 1 6、 1 8 、 2
0、 2 2， 24、 2 (3、 28 30、 3 2、 34、 3 6 38、 40、 42、 4
4、 46、 48、 50、 52 54、 56、 5 8、 6 0 6 2、 64、 66 , 6
8、 6 9、 7 1、 7 3、 7 5 7 7、 7 9、 8 1、 8 3 8 5、 8 7、 8 9、 9
1、 9 3、 9 5、 9 7、 9 9 1 0 1 1 0 3 1 0 5 1 0 7、 1 0 9、 1 1 1、 1 1 3、 1 1 5、 1 1 7 1 1 9 1 2 1 1 2 3 1 2 5 2 7 1 2
9、 1 3 1、 1 3 3、 1 3 5 1 3 7 1 39 1 4 1 1 43 4 5 1 4 7、 1 49、 1 5 1、 1 53 1 5 5 1 57 1 5 9 1 6 1 6 3 1 6
5、 1 6 7、 1 6 9、 1 7 1 1 7 3 1 7 5 1 7 7 1 7 9 8 1 1 8 3 1 85 1 87 1 89 19 1 1 93 1 95 197 1 99 20 1 203 20 5 207 209 1 1 2 1 3 2 1 5 2 1 7 2 1 9 221 223 9 9 c; 227 229 23 1 233 235 23 7 239 241 243 245 247 249 251 253 25 5 257 259 26 1 263 265 267 269 27 1 27 3 275 277 279 281 283 285 28 7 28 9 29
293 29 5 297 299 30 1 303 305 307 30
9 3 1 1 31 3 3 1 5 31 7 3 1 9 32 1 323 325 32 7 329 33 1 333 335 337 339 341 343 34 5 347 349 351 353 355 357 359 36 1. 36 3 365 367 369 37 1 373 375 377 37 9 38 1 383 385 387 389 39 1 393 395 397- 39 9 40 1 403 405 407 409 41 1 41 3 41 5. 41 7 41 9 42 1 423 425 427 429. 43 1 433. 43 5 437 439 441 443 445 4, 47 449 45 1. 45 3 455 457 459 46 1 463 465. 467. 469. 47 473 47 5 477 479 48 1または 483から選択されるヌク レオチド配列の全てまたは一部を含むポリヌクレオチドが固定されている不溶性 基質に関する。 DNAプローブである複数の各種ポリヌクレオチドがスライドガ ラス等の特別に加工された基質上に固定され、 次いで標識された標的ポリヌクレ ォチドを、 固定化されたポリヌクレオチドとハイブリダィズさせ、 それぞれのプ ローブからのシグナルを検出する。 得られるデ一夕は、 解析され、 遺伝子発現が 測定される。
本発明はさらにまた、 配列番号 1、 3、 5 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 23、 25、 27、 29、 3 1、 33 35、 37、 39、 41、
43、 45、 47、 49 51、 53、 55、 57 59、 6 1、 63、 65、 67、 70、 72、 74 76、 7 S、 80、 82 84、 S 6、 88、 90、 92、 94、 96、 98 00、 1 02、 104 1 06、 1 08、 1 10、 1 12、 1 14、 1 16 1 18、 1 20、 122 124、 1 26、 1 28、 1 3 0、 1 3 2、 1 34、 1 3 6、 1 3 8、 1 40、 1 42、 1 44、 1 46、
1 48、 1 50、 1 5 2、 1 54、 1 56、 1 58、 1 60、 1 62、 1 64、
1 66、 1 6 8、 1 7 0、 1 7 2、 1 74、 1 7 6、 1 78、 1 80、 1 8 2、
1 84、 1 8 6、 1 8 8、 1 9 0、 1 9 2、 1 94、 1 96、 1 98、 20 0、
2 02、 204、 20 6、 2 0 8、 2 1 0、 2 1 2、 2 1 4、 2 1 6、 2 1 8、
2 2 0、 22 2、 2 24、 2 2 6、 2 2 8、 2 3 0、 23 2、 2 34、 2 3 6、
2 3 8、 240、 242、 244、 246、 248、 2 50、 2 52、 2 54、 2 56、 258、 26 0、 2 6 2、 2 6 4, 266、 26 8、 2 70、 27 2、 2 74、 27 6、 2 7 8、 2 8 0、 2 8 2、 284, 286、 2 8 8、 2 90、 2 9 2、 294、 2 9 6、 2 9 8、 30 0、 30 2、 304、 3 06、 30 8、 3 1 0、 31 2、 3 1 4、 3 1 6、 3 1 8、 320、 32 2、 3 24、 326、
3 2 8、 330、 3 3 2、 3 34、 3 36、 3 3 8、 340、 342、 344、 346、 348、 3 5 0、 3 5 2、 3 54、 3 56、 358、 3 60、 36 2、 3 64、 366、 36 8、 3 7 0、 372、 374、 3 76、 3 7 8、 38 0、 3 8 2、 384, 3 8 6、 3 8 8、 39 0、 39 2、 394、 3 96、 39 8、 400、 40 2、 404、 406、 40 8、 41 0、 41 2、 4 14、 41 6、 4 1 8、 420、 42 2、 424、 426、 42 8、 43 0、 43 2、 434、 43 6、 43 8、 440、 442、 444、 446、 448、 450、 45 2、 4 54、 456、 458、 46 0、 46 2、 464、 46 6、 46 8、 47 0、 47 2、 474、 47 6、 47 8、 48 0 48 2または 484で表されるアミ ノ酸配列から選択されるァミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリぺプチドが固 定されている不溶性基質に関する。 このタンパク質を固定した不溶性基質と生物 由来の細胞抽出液とを混合し、 不溶性基質上に捕獲された診断あるいは新薬開発 のために有効であることが期待される物質を単離あるいは同定することができる, 以下に、 実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、 本発明は、 これらの例に 何ら限定されるものではない。
(実施例 1 ) オリゴキヤッピング法を用いた完全長 c D N Aライブラリ一の作 (1 ) ヒト肺線維芽細胞 （C r yo NHL F) からの RNA調製 ヒ卜肺線維芽細胞 （C r yo NHL F ：三光純薬株式会社より購入） を、 添 付のプロトコ一ルに従って培養した。 1 0 cmシャーレ 50枚まで継代培養した 後、 セルスクレーパーで細胞を回収した。 次いで、 回収した細胞から RNA抽出 用試薬 I SOGEN (二ツボンジーンより購入） を用いて全 RNAを取得した。 取得の具体的方法は、 試薬のプロ卜コールに従った。 次いで、 オリゴ— dT セ ルロース カラムを用いて、 全 RNAからポリ A + RNAを取得した。 ポリ A + RNA取得の具体的方法は、 上記 Ma n i a t i sの実験書に従った。
(2) オリゴキヤッピング法による完全長 c DNAライブラリー作製
上記ポリ A + R N Aから、 オリゴキヤッピング法により完全長 c D N Aライブ ラリーを作製した。 ォリゴキヤッピング法による完全長 c D N Aライブラリ一作 製の具体的方法は、 菅野らの方法 〔たとえば、 Ma r uy ama, K. & S u g a n o, S . Ge n e, 1 38 : 1 71 - 174 (1 994)、 S u z u k i . Y. e t a 1. Ge n e, 200 : 1 49 - 1 56 (1 997)、 鈴木 ·菅野 実 験医学別冊 遺伝子工学ハンドブック改訂第 3版〕 に従って作製した。
(3 ) プラスミ ド DNAの調製
上記実施例で作製した完全長 c DN Aライブラリ一を、 エレクトロポレーショ ン法によって大腸菌 TOP 10株に形質転換した後、 100 g 'm 1アンピシ リンを含有する L B寒天培地に塗布し、 37°Cで一晩インキュベートした。 続い て、 アンピシリン含有 LB寒天培地上で生育した大腸菌のコロニーから、 Q I A 0£1^社の<31八 6 1 1 96 U l t r a P I a sm i d K i tを用い てプラスミドを回収した。具体的方法は、 Q I Awe 1 1 96 U l t r a P 1 a s m i d K i tに添付のプロトコールに従った。
(実施例 2) STAT 6の活性化を促進する作用を有する DN Aのクローニン グ
(1) STAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質をコードする c
DNAのスクリーニング
N I H3 T 3細胞 （大日本製薬より購入） を細胞培養用 96穴プレートに 1 X
104C e 1 1 sZwe 1 1 となるように、 10 % F B S存在下の I MDM培地 を用い、 24時間 37 °Cで培養した （5%C〇2存在下）。 次いで、 FuGENE
6 (R o c h e社より購入） を用いて、 STAT 6応答配列を有するルシフェラ ーゼレポータープラスミ ド N4X 8— l u c 1 00 n gと、上記実施例 1. (3) で調製した完全長 cDNA2 ^ 1を 1ゥエルに共導入した。 導入の方法は添付の プロ.トコールに従った。 S T A T 6応答配列を有するルシフェラーゼレポーター プラスミ ド N4 X 8— 1 u cは以下の通りに構築した。
大森ら 〔 J . I mmu n o し 1 57， 20 58 - 2065 (1996 )〕 が 見出した活性化した S TAT 6が特異的に結合するオリゴヌクレオチド配列を参 考に、 オリゴヌクレオチド （5' -TCGAGCTCTTCTTCCCAGGA
ACTCAATG— 3 ' (配列番号 485)、 5 ' 一 T C G A C A T T G A G T T
C CTGGGAAGAAGAGC— 3 ' (配列番号 486)) を合成した。 合成ォ リゴヌクレオチドを各々 1 n g / a 1 となるように滅菌水で溶解し、 1 0 μ 1ず つ混ぜ、 さらに滅菌水で 32 1に容量を合わせた。 その溶液を 90 °Cで 5分間 加熱後、 .徐々に室温まで冷却し二本鎖オリゴヌクレオチド溶液を調製した。 その 溶液を T 4ポリヌクレオチドキナーゼ （宝酒造） を使用して、 添付のマニュアル に従い反応を行った後、 常法に従い反応産物を精製した。 一方、 pGL 3— P r omo t e rベクター （プロメガ） の S V40プロモーター領域を H i n d I I
I部位と B g l I I部位を用いて、 HS Vチミジンキナ一ゼプロモーター配列（一
50から + 10) に入れ替えたベクター t k— 1 u cを構築した。 この t k一 1 u cベクタ一の X h o I部位へ先の二本鎖オリゴヌクレオチド断片を T 4 DN
Aリガ一ゼ （G I BCOz'BRL) を使用して挿入した。 得られたクローンを常 法に従い塩基配列を決定し、 ォリゴヌクレオチド断片が複数挿入されたクローン を選択した。 最大 4個の断片が挿入されたクローンが得られ、 N4X4— 1 u c. と命名した。 N 4 X 4— 1 u cプラスミ ドから、 X h o I部位と B g 1 I I部位 を用いて、 4個連結した DNA断片を切り出し精製後、 pB l u e s c r i p t
I I KS + (S t r a t a g e n e) の B amH I部位と X h o I部位へ挿入 した。 このプラスミドより、 Kp n Iと S p e Iを用いて 4個連結した DNA断 片を切り出し、 N4X4— 1 u cプラスミドの Kp n I部位と Nh e I部位に挿 入し、 最終的に N4\ 8— 1 u cを得た。 プラスミ ド N4 X 8— 1 u cおよび上記完全長 c DNAを共導入し、 48時間 37 °Cで培養後、 さらに最終濃度 0. 5 n g/m 1のマウス I L一 4 (免疫生物 研究所） を添加し 6時間培養した。 ロング夕一ムルシフェラーゼアツセイシステ ム、 ピツカジーン LT2. 0 (東洋インキ社） を用いて添付されている説明書に 従い、 S TAT 6のレポ一夕一活性 （ルシフェラ一ゼ活性） を測定した。 なおル シフェラ一ゼ活性は、 P e r k i n E 1 m e r社の W a 1 1 a c AR VOT MS T 1420 MULT I LABEL C〇 UN T E Rを用いて行った。
(2) ヌクレオチド配列の決定
上記スクリーニングを 1 1 5、 000クローン行い、 ルシフェラーゼ活性が対 照実験 （完全長 c DN Aの代わりに、 空べクタ一 pME 1 8 S— FL 3を導入し た細胞のルシフェラーゼ活性） と比べて 3倍以上上昇しているプラスミ ドを選抜 し、 まず、 クローニングされている c DNAの 5 ' 側 （シークェンスプライマ一 ： 5，— CTTCTGCTCTAAAAGCTGCG— 3，（配列番号 487)と 3， 側 （シークェンスプライマ一 ： 5 ' — CGACCTGCAGCTCGAGCAC A— 3 ' (配列番号 4 S 8 ) ) からそれぞれ o n e— p a s sシークェンスを行な い、 できる限り長く決定した。 なお、 ヌクレオチド配列決定のための試薬や方法 は、 Th e rmo S e q u e n a s e I I Dy e Te rm i n a t o r Cy c l e S e q u e n c i n g K i t (アマシャム フアルマシア社）、 あ るいは B i gDy e Te rm i n a t o r Cy c l e S e qu e n c i n g F S Re a dy R e a c t i o n K i t (アプライ ドバイオシステム ズ社） を用い、 AB I PR I SM 377シークェンサ一、 あるいは、 AB I PR I SM 31 00シ一クェンサーを用い、 各々キッ卜に添付されている説明 書に従って行なった。
(3) 得られたクローンのデータベース解析
得られたヌクレオチド配列について、 G e n B a n kに対する B LAS T (Basic local alignment search tool) 〔S. F. Al tschul et al. , J. ol. Biol. , 215: 403-410 (1990) 〕 検索を行なった。 その結果、 242クローンが STAT 6の活性化を促進する作用を有する新規のタンパク質をコードする 1 1 2種類の 遺伝子であった。 (4) 全長シークェンス
22 5クローンの新規のクローンについて全長ヌクレオチド配列（配列番号 2
4、 6、 8、 1 0. 12 14、 1 6 1 8、 20 22, 24、 26、 28、
30、 32、 34, 36 38、 40 42、 44 46、 48、 50、 52、
54、 56、 58, 60 62、 64 66、 68 69、 7 1、 73、 75、
77、 79、 8 1、 83 85、 87 89、 91 93、 95、 97、 99、
10 1、 103、 105 1 07 1 09 1 1 1 1 1 3、 1 1 5、 1 1 7、
1 1 9 1 2 1、 123 1 25 1 27 129 1 31、 1 33、 1 35、 1 37 139、 141 143 145 147 149、 1 51、 1 53、 1 55 157、 1 59 16 1 1 63 1 65 167、 169、 1 7 1、 1 73 1 75、 1 77 1 79 1 8 1 1 83 1 S 5、 1 87、 1 89、 1 9 1 193、 195 1 97 1 99 201 203、 205、 207、 209 91 1、 21 3 2 1 5 2 1 7 2 19 221、 223、 225、
9 9 V 229、 23 1 233 235 237 239、 241、 243、
245 247、 249 25 1 253 255 257、 259、 26 1、 263 265、 267 269 271 273 275, 277、 279、
28 1 283、 285 287 289 291 293、 295、 297、
299 30 1、 303 305 307 309 31 1、 3 1 3、 31 5、 3 1 7 31 9、 321 323 3 25 327 329、 331、 333、
33 5 337、 339 341. 343. 345. 347、 349、 35 1、 353 355、 357 359 36 1 363. 365、 367、 369、 37 1 373 , 375 377. 379 381 383、 385、 387、
389 391、 393 395- 397. 399- 401、 403、 405、
407 409、 41 1 41 3 41 5. 41 7. 41 9、 421、 423、 42 5 427、 429 43 1. 433. 435- 437、 439, 441、 443 445、 447 449- 45 1. 453- 455、 457、 459、 46 1 463、 465 467- 469 47 1. 473、 475、 477、 479 48 1または 483) を決定し、 タンパク質をコードする部分 （オーブ ンリーディングフレーム） のアミノ酸配列 （配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 19 21、 23、 25、 27、 29、 3 1、 33、 35、
37、 39、 41、 43 45、 47、 49、 5 1、 53、 55、 57、 59、
6 1、 63、 6 5、 67 70、 72、 74、 76、 78、 80、 82、 S 4、
86、 88、 90、 92、 94、 96、 98 1 00 1 02、 1 04、 06
1 08 1 1 0 1 12 1 14、 1 1 6、 1 1 8、 1 20 1 22 1 24、
1 26 123 130、 132、 1 34 1 36、 1 38 140 142、
144 146 148、 150、 1 52 1 54、 1 56 1 58 160、
1 62 164 166、 168、 1 70 1 72、 1 74 1 76 1 78、
1 80 1 82 184、 186、 1 88 1 90、 1 92 1 94 1 96、
1 98 200 202、 204、 206 208, 2 10 2 12 214、 2 1 6 2 1 8 9 9 0 9 9 "? ? 9 4 226、 228 230 232、 234 236 238, 240、 2 244、 246 248 250、 252 254 256、 258、 260 262、 264 266 268、 270 272 274、 276、 278 280、 282 284 286、
288 290 292、 294、 296 29 S、 300 302 304、
306 308 310、 312、 3 14 3 1 6、 3 18 320 " 、 324 326 328、 330、 332 334、 336 338 340、 342 344 346、 348、 350 3 52、 354 356 358、 360 362 364、 366、 368 37 0、 372 374 376、 378 380 382、 384、 386 388、 390 392 394、
396 398 400、 402、 404 406、 408 410 412、 414 41 6 41 S、 420、 422 424、 426 428. 430、
432 434 436、 438、 440 442、 444 446 448、 450 452 454、 456、 458 460、 462 464 466、 468 470 472、 474、 476 478、 480 482または 48 4) を予想した。
上記スクリ一ニングによって得られたヌクレオチド配列について、 それぞれの ルシフェラーゼ活性のデータを以下の表に示す。 数値は各配列番号のヌクレオチ ドを導入した細胞のルシフェラ一ゼ活性を ME18S-FL3を導入した細胞のルシフ エラ一ゼ活性で割った活性値を示す。 表中に示さない配列番号のヌクレオチド ついても、 同様の方法でルシフェラーゼ活性を測定することができる。
西 万 1 县 ('ΠΜΔ'ΐ m I lla. τ ) 西; 3 |¾:·& DM厶、 ixiia ノ
4 7.1 181 4.7
6 127.5 183 92.3
8 4.2 185 43.1
10 10.0 189 3.4
12 9.7 1 93 92.5
14 3.5 203 5.6
18 183.1 205 3.5
20 50.1 207 3.0
26 33.5 209 9.6
30 20.2 21 1 5.3
32 5.0 217 1521.5
34 21.1 219 12.7
36 21.1 223 580.4
38 3.1 231 4.0
42 7.2 237 105.1
50 18.5 241 54.3
56 4.7 261 14.7
58 3.8 263 12.5
62 20.3 273 16.6
64 3.2 275 1 7.0
66 15.1 279 28.5
69 11.7 281 3.9
71 7.9 283 16.7
73 5.6 291 13.0
75 3.1 293 25.8
77 7.1 295 31.0
79 15.3 303 22.5
85 1 1.5 317 5.1
87 13.1 323 12.3
89 10.2 325 6.1
93 5.7 327 5.3
95 8.9 343 26.7
97 13.1 345 3.7
101 8.0 349 24.3
105 6.3 353 155.4
107 3.1 355 66.1
109 7.1 357 15.6
1 1 1 3.7 371 12.3
113 4.3 373 10.2
115 8.6 375 8.9
1 17 10.1 377 38.6
121 4.5 383 34.1
125 9.2 397 32.6
127 5.0 399 10.5
129 14.8 413 3.4
131 13.5 415 18.4
133 12.7 41 7 13.4
137 20.3 423 4.8
139 4.1 425 1 1.4
141 11.7 429 3.2
149 9.9 431 3.8
151 104.7 433 8.8
159 19.1 435 5.1
163 3.5 441 4.5
165 3.5 455 3.3
167 3.0 465 13.3
171 4.8 469 6.5
175 17.7 471 147.7
177 22.6 481 6.4
*〉活性値- (各配列番号の遺伝子のルシフェラ一ゼ活性）,'' (PME18S- FL3のルシフェラ一ゼ活性） (実施例 3) S TAT 6の活性化の促進を阻害する化合物のスクリーニング N I H 3 T 3細胞を細胞培養用 9 6 w e 1 1プレートに、 1 X 1 04 C e 1 1 s / 1 00 1 'w e 1 1の細胞数になるように、 1 0 ¾ F B S存在下の I MD M培地にまき、 5 %C〇2存在下、 3 7°Cで 24時間培養した。 次いで、 F uG ENE 6を用いて、 上記実施例 2で得た、 配列番号 3、 1 7、 1 9、 2 1 8、 4 32若しくは 47 2の STAT 6の活性化を促進する作用を有するタンパク質を コードするヌクレオチド、 または配列番号 64のヌクレオチドを含有するプラス ミド 3 0 n gと、 S TAT 6応答配列を有するルシフェラ一ゼレポータープラス ミ ド l O O n gを lwe l 1 に共導入した。 48時間後、 プロテインキナーゼ阻 害剤であることが知られている AG 1 8、 AG490、 あるいはスタウロスポリ ン （ C A L B I O C H E Mより購入） をそれぞれ終濃度 2 0 iM, 2 0 tMf 3 0 Mになるように培養液中に加えた。 37 °Cで 30分培養後、 さらにマウス I L— 4を最終濃度 1 n g , m 1になるように添加し 6時間培養し、 ピツカジーン LT 2. 0を用いてレポーター活性を測定した。 その結果、 AG 1 8, AG 49 0, スタウロスポリンはコント口一ルプラスミ ド p c DNA3. 1 (+ ) (インビ トロジェン社） 導入ゥエルには全くレポーター遺伝子の発現を抑制しないが、 酉己 列番号 3、 1 7、 1 9、 2 1 8、 43 2若しくは 47 2の S TAT 6の活性化を 促進する作用を有するタンパク質をコードするヌクレオチド、 または配列番号 6 4のヌクレオチドを含有するプラスミ ドを導入したゥエルにおいてはレボー夕一 遺伝子の発現を抑制した （図 1〜 7 )。
同様に、 他のアミノ酸配列をコードする遺伝子でも、 同様の方法によりレポ一 ター遺伝子の発現の抑制を確認できる。 産業上の利用の可能性
本発明により、 産業上有用性の高い STAT 6の活性化を促進する作用を有す るタンパク質やそれらの遺伝子が提供された。 本発明のタンパク質やそれらの遺 伝子により、 STAT 6の過剰な活性化、 又は阻害が関与する疾患の治療や予防 に有用な化合物のスクリーニング、 さらにそのような疾患の診断薬を作製するこ とが可能である。 更に本発明の遺伝子は、 遺伝子治療に用いられる遺伝子ソース としても有用である。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

求 の 範 囲
1. 以下の （a) または （b) より選ばれたいずれかの精製された夕ンパク 質。
(a) 配列番号 1 3 5 7 9 1 1 1 3, 1 5 1 7 1 9 2 1 , 2 3 2 5 27 29 3 1 3 3 3 5 3 7 3 9, 4 1 43 45, 4 7 49 5 1 53 5 5 5 7 59 6 1 , 6 3, 6 5 6 7 7 0, 7 青
2 74 76 78 8 0 8 2 84 8 6, 8 8 90 92 94 9 6 9 8 1 00 1 0 2 1 04, , 1 0 6 1 0 8 1 1 0 1 1 2- 1 1 4
1 1 6 1 1 8 1 20 1 22 1 24 1 26 1 2 8 1 3 0 1 3 2
1 34 1 36 1 38 140 1 42 1 44 1 46 1 48 1 50
1 5 2 1 54 1 56 1 58 1 60 1 6 2 1 64 1 66 1 68
1 7 0 1 72 1 74 1 76 1 7 8 1 80 1 8 2 1 84, 1 86
1 8 8 1 90 1 92 1 94 1 96 1 98 2 0 0 2 02 2 04 2 0 6 208 2 1 0 2 1 2 2 1 4 2 1 6 2 1 8 2 2 0 9 0 9 2 24 2 26 o o o
o 2 30 2 3 2 2 34, 2 3 6 2 3 8 240 2 42 244 246 248 2 50 2 5 2 2 54 2 5 6 2 5 8 2 6 0 2 62 264 266 2 6 8 2 7 0 2 7 2 2 74 2 76 2 7 8 2 80 282 2 84, 2 86 2 8 8 2 90 2 9 2 2 94
2 9 6 2 98 300 3 02 304 3 06 3 0 8 3 1 0 3 1 2
3 1 4 3 1 6 3 1 8 320 3 2 2 3 24 3 2 6, 3 2 8 3 30 3 3 2 3 34 336 3 38 340 342 344 346 348 3 50 3 52 3 54 3 56 3 58, 3 60 3 6 2 3 64 3 66 3 6 8 3 70 372 3 74、 3 76 3 78, 3 8 0 3 8 2, 3 84
3 8 6 3 8 8 390 3 92 3 94 3 9 6 3 9 8 40 0 40 2
404 406 408 41 0 4 1 2 414 4 1 6 4 1 8 42 0 42 2 424 426 428 430 43 2 434 4 3 6 43 8 440 442 444 446 448 450 4 5 2 4 54 456 4 5 8 460 462 464 466 46 8 47 0 472 474 476、 47 8、 480、 482または 484で表されるアミノ酸配列からなる タンパク質。
(b) 配列番号 1、 3 、 5、 7、 9、 1 1、 1 3, 1 5 1 7 1 9 2 1 3、 2 5、 27、 29、 31、 33、 35、 37, 39 41 43 45 4 7、 49、 5 1、 53、 55、 57、 59、 6 1, 63 65 67 70 7 2、 74、 76、 78、 80、 82、 84、 86, 88 90 92 94 9 6、 98、 1 00、 1 02、 1 04、 1 06 1 08 1 1 0、 1 1 4、
1 1 6 1 1 8 1 20 122、 1 24、 1 26、 1 28、 1 30 1 32、
1 34 136 1 38 140、 142、 144、 146、 148 1 50、
1 52 154 1 56 158、 1 60、 1 62、 1 64、 1 66 168、
1 70 17 2 1 74 176、 1 78、 1 80、 1 82、 1 84 1 86、
1 88 190 1 92 194、 1 96, 1 98、 200、 202 204、 206 208 21 0 212、 2 14、 2 1 6、 2 1 8、 220 9 9 9、 224 226 228 230、 232、 2 34、 236、 23 S 240、
9 _ ヮ 244 246 248、 2 50、 2 52、 2 54、 256 258、
260 262 264 266、 268、 270、 272、 274 276,
278 280. 282 284、 286、 288、 290、 292 294、
296 298. 300 302、 304、 306、 308、 3 1 0 3 1 2、 3 14 31 6 31 8 320、 322、 324、 326, 328 330、
332 334 336 338、 340、 342、 344、 346 348、 350 352 354 356、 358、 360、 362、 364· 366、 368 370 372 374、 376、 3 78、 380、 382 384、
386 388 390 392、 394、 396、 398、 400 402、
404 406 408· 410、 41 2、 414、 416、 41 8. 420、 422 424 426 428、 430、 432、 434、 436 438、 440 442 444 446、 44 S、 450、 452、 454. 456、 458 460 462 464、 466、 468、 470、 47 2. 474、 476 478 480. 482または 484において 1若しくは複数個のアミ ノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ STAT 6の 活性化を促進する作用を有するタンパク質。
2. 請求項 1記載のいずれかのタンパク質とその全長にわたり 9 5 %以上の ァミノ酸配列の同一性を有するタンパク質であり、 かつ S T A T 6の活性化を促 進する作用を有する精製されたタンパク質。
3. 以下の （a) または （b) のタンパク質をコードするヌクレオチド配列 を包含する単離されたポリヌクレオチド。
( a ) 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1 2 3、 2 5、 2 7、 29、 3 1、 3 3、 3 5、 3 7、 3 9、 4 1、 43、 45 4 7、 49、 5 1、 53、 5 5、 5 7、 5 9、 6 1、 6 3、 6 5、 67、 70 7 2、 74、 7 6、 7 8、 8 0、 8 2、 84、 8 6、 8 8、 9 0、 92、 94 9 6、 9 8、 1 0 0、 1 0 2、 1 04、 1 0 6、 1 0 8、 1 1 0、 1 1 2 1 1 4、 1 1 6、 1 1 8、 1 2 0、 1 2 2、 1 24、 1 26、 1 2 8 1 30 1 3 2、 1 34、 1 3 6、 1 3 8、 1 40、 142、 1 44、 1 46 1 48 1 50、
1 52 1 54 1 5 6、 1 5 8、 1 60、 1 6 2、 1 64 1 66 1 6 8、
1 70 1 7 2 1 74、 1 7 6、 1 7 8、 1 8 0、 1 8 2 1 84 1 8 6、
1 8 8 1 9 0 1 9 2、 1 94、 1 96、 1 9 8、 2 0 0 2 02 204、 2 06 20 8 2 1 0、 2 1 2、 2 1 4、 2 1 6、 2 1 8 2 20 22 2, 2 24 2 2 6 22 8、 230、 2 3 2、 2 34、 2 36 2 38 240, 242 244 246-, 248 2 50、 2 5 2、 2 54 2 56 2 5 8、260 26 2 264、 26 6 2 6 8、 2 7 0、 2 7 2 2 74. 27 6、 2 7 8 2 80 2 S 2 2 84、 2 8 6、 2 8 8、 2 9 0 2 92. 2 94、
2 96 29 8 30 0 30 2、 304、 3 06、 3 0 8 3 1 0. 3 1 2、 3 1 4 3 1 6 3 1 8 320、 322、 324、 32 6 3 2 8· 3 3 0、
3 32 3 34 33 6 3 3 8、 340、 342、 344 346. 348、 3 50 3 52 354 3 5 6、 3 58、 3 6 0、 3 6 2 3 64. 36 6、 368 3 7 0. 3 7 2 3 74、 3 76、 3 7 8、 3 8 0 3 82- 3 84、
386 3 8 8. 3 9 0 3 9 2、 3 94、 3 9 6、 3 98 400, 40 2、
404 406 40 8 4 1 0、 4 1 2 4 1 4、 4 1 6 4 1 8, 42 0、 422 424 42 6 42 8 43 0 43 2、 434 436, 43 8、 440、 442、 444、 44.6、 448、 450、 45 2, 4 54、 456、 4 58、 460、 462、 464、 46 6、 46 8、 47 0、 47 2、 474、 4 7 6、 478、 4 S 0、 48 2または 484で表されるアミノ酸配列からなる タンパク質。
(b) 配列番号 1 、 3、 5 、 7、 9 、 1 1、 1 3, 1 5 1 7、 1 9、 2 1 , 2 3、 2 5、 2 7、 29, 3 1 , 3 3、 3 5、 3 7, 39 4 1、 43、 45, 4 7、 49、 5 1、 53, 5 5, 5 7、 5 9、 6 1 , 6 3 6 5、 67、 7 0, 7 2、 7 4、 76、 7 8 , 8 0、 8 2、 84、 86, 8 8 90、 9 2、 94、 9 6、 9 8、 1 00、 1 02. 1 04' 1 0 6 , 1 08、 ： 0、 1 1 2, 1 1 4、 1 1 6、 1 1 8、 1 20、 1 2 2、 1 24、 1 26、 1 28 1 30、 1 3 2、
1 34 1 3 6、 1 38、 1 40、 1 42、 1 44、 1 46 1 48、 1 50、
1 5 2 1 54、 1 56、 1 5 8、 1 60、 1 6 2、 1 64 1 66、 1 6 8、
1 7 0 1 7 2、 1 74、 1 7 6、 1 7 8、 1 8 0、 1 8 2 1 84、 1 86、
1 8 8 1 90、 1 92、 1 94、 1 96、 1 9 8, 2 0 0 2 02, 204、 2 0 6 20 8、 2 1 0、 2 1 2、 2 1 4、 2 1 6 1 8 2 20、 22 2、 2 24 2 26、 228、 230、 2 3 2、 2 34 36 2 38、 240、 242 244、 246, 248、 2 50、 2 5 2 54 2 56、 2 5 8、 2 6 0 2 62、 264、 26 6、 2 6 8、 27 0 7 2 2 74、 2 7 6、 2 7 8 280、 28 2、 284、 2 86、 2 8 8 9 0 2 9 2、 294、
2 9 6 2 9 8、 300、 30 2、 304、 30 6 0 8 3 1 0、 3 1 2、 3 1 4 3 1 6、 3 1 8、 32 0、 Q 9 9、 3 24 2 6 3 28、 3 3 0、
3 3 2 3 34、 336、 33 8、 340, 342 44 346、 348、 3 5 0 3 52、 354、 356、 3 58、 36 0 6 2 3 64、 3 6 6、 36 8 370、 37 2、 374、 3 76、 37 8 80 3 82、 3 84,
3 8 6 3 88、 390、 39 2、 3 94、 3 96 9 8 400、 40 2、
404 406、 40 8、 41 0、 4 1 2、 41 4 1 6 4 1 8、 42 0、 42 2 424、 426、 42 8、 43 0、 43 2 34 436、 43 8、 440 442、 444、 446、 448、 450 5 2 454、 456、 45 8 460、 46 2、 464、 466、 46 8 7 0 47 2、 474、 4 7 6、 4 7 8、 4 8 0、 4 8 2または 4 8 4において 1若しくは複数個のアミ ノ酸が欠失、 置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ S TAT 6の 活性化を促進する作用を有するタンパク質。
4. 以下の （a) 〜 (c) のいずれかのポリヌクレオチド配列を含む単離さ れたポリヌクレオチド。
(a) 配列番号 2 4、 6、 8 、 1 0 1 2 、 1 4、 1 6 1 8 2 0 、 2 2、 2 4、 2 6、 2 8 3 0、 3 2、 3 4 3 6、 3 8、 4 0 4 2 44、 4 6、 4 8、 5 0、 5 2 5 4、 5 6、 5 8 6 0、 6 2、 6 4 6 6 6 8、 6 9、 7 1、 7 3、 7 5 7 7、 7 9、 8 1 8 3、 8 5、 8 7 8 9 9 1、 9 3、 9 5、 9 7、 9 9 0 3、 ] 0 5、 1 0 7 , 1 0 9 1 1 3、 1 1 5、 1 1 7、 1 1 9 1 2 1 1 2 3 1 2 5、 1 2 7、 1 2 9 1 3 1、
1 3 3 1 3 5 1 3 7 1 3 9 1 4 1 1 4 3、 1 4 5、 1 4 7 1 4 9、 1 5 1 1 5 3 1 5 5 1 5 7 1 5 9 1 6 1、 1 6 3、 1 6 5 1 6 7、
1 6 9 1 7 1 1 7 3 1 7 5 1 7 7 1 7 9、 1 8 1、 1 8 3 1 8 5、
1 8 7 1 8 9 1 9 1 1 9 3 1 9 5 1 9 7、 1 9 9、 2 0 1 2 0 3、
2 0 5 2 0 7 2 0 9 2 1 1 2 1 3 2 1 5、 2 1 7、 2 1 9 2 2 1、
2 2 3 2 2 5 0 9 7 2 2 9 2 3 1 2 3 3、 2 3 5、 2 3 7 2 3 9、
2 4 1 2 4 3 2 4 5 2 4 7 2 4 9 2 5 1、 2 5 3、 2 5 5 2 5 7、
2 5 9 2 6 1 2 6 3 2 6 5 2 6 7 2 6 9、 2 7 1、 2 7 3 2 7 5、
2 7 7 2 7 9 2 8 1 2 8 3 2 8 5 2 8 7、 2 8 9、 2 9 1 2 9 3、
2 9 5 2 9 7 2 9 9 3 0 1 3 0 3 3 0 5、 3 0 7、 3 0 9 3 1 1、 3 1 3 3 1 5 3 1 7 3 1 9 3 2 1 3 2 3、 3 2 5、 3 2 7. 3 2 9、
3 3 1 3 3 3 3 3 5 3 3 7 3 3 9 3 4 1、 3 4 3、 3 4 5. 3 4 7、 3 4 9 3 5 1 3 5 3 3 5 5 3 5 7 3 5 9、 3 6 1、 3 6 3- 3 6 5、 3 6 7 3 6 9 3 7 1 3 7 3 3 7 5. 3 7 7、 3 7 9、 3 8 1. 3 8 3、
3 8 5 3 8 7 3 8 9 3 9 1 3 9 3. 3 9 5、 3 9 7、 3 9 9. 4 0 1、
4 0 3 4 0 5 4 0 7 40 9 4 1 1. 4 1 3、 4 1 5、 4 1 7. 4 1 9、 4 2 1 4 2 3 4 2 5 4 2 7 4 2 9. 4 3 1、 4 3 3、 4 3 5. 4 3 7、 4 3 9 44 1 44 3 44 5 44 7. 44 9、 4 5 1、 4 5 3. 4 5 5、 457、 459、 46 1、 463、 465、 467、 469、 471、 473、 475、 477、 479、 48 1または 48 3で表されるいずれかのポリヌクレ ォチド配列および該ポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列。 (b) (a)のいずれかのポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとスト リンジェントな条件下でハイプリダイズし、 かつ S T AT 6の活性化を促進する 作用を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
(c) 配列番号 2 4、 6、 8、 10、 1 2、 14、 1 6、 1 8 20 、 22、 24、 26、 28 30、 32、 34、 36、 38、 40, 42 44、 46、 48、 50、 52 54、 56、 5 S、 60、 62、 64、 66 68、 69、 7 1、 73、 7 5 7 7、 79、 81、 83、 85、 87、 89 91、 93、 95、 97、 99. 1 0 1、 1 03、 1 05、 1 07 1 09 1 1 1、 1 1 3、 1 15、 1 1 7、 1 1 9 "1 つ 1 1 23 1 25 1 27、 1 29、 1 3 1、
1 33 1 35 1 37 1 39 141 143 145、 147、 149、 1 51 1 53 1 55 1 57 1 59 1 61 163、 165、 167、
1 69 1 7 1 1 7 3 1 75 1 77 1 79 1 81、 1 83、 185、
187 1 89 1 9 1 1 93 1 95 1 97 1 99、 201、 203、
205 207 209 2 1 1 2 13 2 1 5 2 17、 2 19、 22 1、
223 225 227 9 9 Q 23 1 233 235、 237、 239、
241 243 245 247 249 2 51 253、 2 55、 257、
259 26 1 263 265 267 269 27 1、 273, 27 5、
277 279 28 1 283 285 287 289、 29 1、 293、
295 297 299 301 303 305 307、 309、 3 1 1、 3 1 3 31 5 3 1 7 3 19 32 1 323 325、 327、
33 1 333 335 337 339 341 343、 345、 347、 349 35 1 353 355 357 359 361、 363、 36 5、 367 369 37 1 373 375 377 379、 381、 383,
385 387 389 391 393 395 397、 399、 40 1、
403 405 407 409 41 1 13 41 5、 417、 41 9、 42 1 423 425 427 429 43 1 433、 435、 437、 439、 441、 443、 445、 447、 449、 451、 453、 455、 457、 459、 461 , 463、 465、 467、 469、 47 1、 473、 47 5、 477、 479、 48 1または 483で表されるヌクレオチド配列のい ずれかにおいて、 1若しくは複数個のヌクレオチドが欠失、 置換若しくは付加さ れたボリヌクレオチド配列からなり、 かつ S TAT 6の活性化を促進する作用を 有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
5. 請求項 3記載のポリヌクレオチドのいずれかと全長にわたり少なくとも 95%以上の同一性を有し、 かつ S T AT 6の活性化を促進する作用を有する夕 ンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオ チド。
6. 請求項 4記載のポリヌクレオチドのいずれかと全長にわたり少なくとも 95%以上の同一性を有し、 かつ S TAT 6の活性化を促進する作用を有する夕 ンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を包含する単離されたポリヌクレオ チド。
7. 請求項 3〜 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドによりコードさ れる精製されたタンパク質。
8. 請求項 3〜 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換 えべクタ一。
9. 請求項 8に記載の組換えベクターを含む形質転換された細胞。
1 0. 請求項 1または 2に記載のタンパク質が膜タンパク質である場合にお ける、 請求項 9記載の細胞の膜。
1 1. (a) 請求項 3〜6のいずれか 1項に記載の単離されたポリヌクレオ チドのいずれかがコードするタンパク質を発現する条件下で該ポリヌクレオチド を含有する形質転換された細胞を培養し、
(b) 培養物からタンパク質を回収する、
ことを含むタンパク質の製造方法。
1 2. (a) 個体のゲノムにおける請求項 1、 2または 7に記載のタンパク 質をコードするヌクレオチド配列中の変異の存在または不存在を決定し、 および /または (b) 該個体に由来するサンプル中での該タンパク質の発現量を分析する、 ことを含む、 該個体における該タンパク質の発現または活性に関連した、 該個体 における疾病または疾病への感受性の診断方法であって、 発現するタンパク質の 量の増減により病気であると診断する方法。
1 3. 以下の工程を含む S TAT 6の阻害剤または活性化剤としての活性に ついて化合物をスクリ一ニングする方法。
(a) STAT 6の活性化を促進するタンパク質をコードする遺伝子、 および S TAT 6の活性化に対応した、 検出可能シグナルを提供しうる成分を細胞に提供 する工程、
(b) 該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で該形質転換さ れた細胞を培養する工程、
(c) 該形質転換された細胞と 1あるいは複数個の候補化合物とを接触させるェ 程、
(d) 検出可能なシグナルを測定する工程、 および
( e ) 該検出可能なシグナルにより活性化剤化合物および/または阻害剤化合物 を単離もしくは同定する工程。
14. 以下の工程を含む、 医薬組成物を製造する方法。
(a) S T A T 6の活性化を促進する作用を有する夕ンパク質をコ一ドする遺伝 子、 および検出可能なシグナルを提供しうる成分を細胞に提供する工程、
(b) 該遺伝子が形質転換された細胞内で発現可能となる条件下で該形質転換さ れた宿主細胞を培養する工程、
(c) 該形質転換された宿主細胞と 1あるいは複数個の候補化合物とを接触させ る工程、
(d) 検出可能なシグナルを測定する工程、
( e ) 該検出可能なシグナルにより活性化剤化合物および， 'または阻害剤化合物 を単離もしくは同定する工程、 および
( f ) 単離または同定された化合物を医薬組成物として最適化する工程。
1 5. STAT 6の阻害剤または活性化剤としての活性について化合物をス クリーニングするためのキッ卜であって、 (a) STAT 6の活性化を促進するタンパク質をコードする遺伝子、 および S TAT6の活性化後、 検出可能なシグナルを提供しうる成分により形質転換され た細胞、 および
(b) 検出可能なシグナルを測定するための試薬
を含むキッ卜。
16. 請求項 1、 2または 7に記載のタンパク質に反応するモノクローナル あるいはポリク口一ナル抗体。
17. 請求項 1、 2または 7に記載のタンパク質を抗原あるいはェピトープ 含有フラグメントとして非ヒト動物に投与することからなる、 請求項 1、 2また は 7記載のタンパク質に反応するモノクローナルまたはポリクロ一ナル抗体の製 造方法。
18. STAT6の活性化を促進するタンパク質の発現を阻害する、 請求項 3〜 6のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴ ヌクレオチド。
19. 請求項 1、 2または 7記載のタンパク質をコードする RNAの開裂、 または S TAT 6の活性化へ導く経路のタンパク質をコードする RN Aの開裂に より、 STAT 6の活性化を阻害するリボザィム。
20. アレルギー疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高脂血症、 感染症お よび癌疾患からなる群から選択される疾患の治療に有効な量の請求項 1 3記載の 方法でスクリーニングされた化合物および, または請求項 1 6記載のモノクロ一 ナルまたはポリクローナル抗体および, /または請求項 1 8記載のアンチセンスォ リゴヌクレオチドおよび/または請求項 1 9記載のリボザィムを個体に投与する ことを含む疾患の治療法。
21. STAT 6の活性化を阻害または促進するものとして請求項 14に記 載の方法により製造された医薬組成物。
22. アレルギー疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高脂血症、 感染症ま たは癌疾患の治療のための請求項 2 1記載の医薬組成物。
23. STAT 6活性化に関連する疾患を患っている患者に請求項 14記載 の方法により製造された医薬組成物を投与することからなるアレルギー疾患、 炎 症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高脂血症、 感染症または癌疾患を治療する方法。
24. Th 1が機能亢進している疾患の治療のための請求項 2 1記載の医薬 組成物。
25. S T AT 6活性化の阻害に関連する疾患を患っている患者に請求項 1 4記載の方法により製造された医薬組成物を投与することからなる、 Th 1が機 能亢進している疾患を治療する方法。
26. 請求項 16記載のモノクローナルまたはポリクロ一ナル抗体を有効成 分として含有する医薬組成物。
27. 請求項 1 S記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として 含有する医薬組成物。
28. 対象疾患がアレルギー疾患、 炎症、 自己免疫疾患、 糖尿病、 高脂血症、 感染症および癌疾患からなる群から選択される、 請求項 26または 27に記載の 医薬組成物。
29. 配列番号 2 4、 6、 8 10、 11 22、 1144、、 1 6、 1188、 、 2200、 2
2 , 24 26、 28 30、 32 34、 3366、 338S、、 40、 4422、、 4444、 4 6、 48 50、 52 54、 56、 5 S、 6600、 6622、、 64、 6666、 、 6688、 6 9, 7 1 73, 75 77、 79、 81、、 8833、 8855、、 87、 8899、、 9911、 9
3、 95 97、 99 1 0 1、 103、 1 05 1 07 1 09、 1 1 1 13、 1 5、 1 17 1 ο 1. 1 23 1 25 1 27、 129
31 1 33 1 35 1 37、 1139 141 143 145、 147
49 1 51 1 53 1 55 1 57 1 59 1 6 1 1 63、 165 1
67 169 1 71 1 73 175 1 77 1 79 1 8 1、 183 1
85 187 1 89 1 9 1 193 1 95 1 97 1 99、 201 2 03 205 207 209 21 1 2 1 3 2 1 5 2 1 7、 21 9 9 2 1 223 225 227 ？ 0 q 23 1 233 235、 237 2 39 241 243 245 247 249 25 1 2 53、 255 2
57 259 261 263 265 267 269 27 1、 273 9
75 277 279 28 1 283 285 287 289、 291 9
93 295 297 299 301 303 305 307、 309 3 1 1、 31 3、 315、 3 1 7、 3 1 32 1、 323、 32 5 327, 3
29、 33 1、 333、 335、 33 339、 341、 343 345、 3
47、 349、 351、 353、 3 5 357、 359、 36 1 363、 3
6 5、 367、 369、 37 1、 37 37 5、 37 7、 37 9 38 1、 3 83、 385、 387、 389、 3 9 393、 39 5、 397 399、 4
0 1、 403、 405、 407、 40 41 1、 41 3、 41 5 41 7、 4 1 9、 42 1、 423、 425、 42 429, 43 1、 433 435、 4
37、 439、 441、 443、 44 447、 449、 45 1 453、 4
5 5、 457、 459、 46 1、 6 465、 467、 46 9 47 1、 4
73、 475、 477、 479、 4 8 1または 483で表されるヌクレオチド配 列のうち少なくとも 1以上を含むデ一夕セットおよび/または配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 19、 2 1、 23、 25、 27、 29、 3 1、 33、 3 5、 37、 39、 41 43、 45、 47、 49 51、 53、
5 5、 57、 59、 61、 63、 65 67、 70、 72、 74 76、 7 8、
80、 82、 84、 86、 88、 90 92、 94、 96、 98 100、 1 0 2、 104、 1 06 108 1 10 11 11 22、、 11 1144、 11 1166、 1 8、 1 2 0、 1 22、 1 24 1 26 1 28 11 3300、、 11 3322、 11 3344、 36、 1 3 8、 140、 1 42 144 146 148、 1 50 152、 54、 1 5
6、 1 58、 1 60 1 62 1 64 166、 168 170、 72、 1 7
4、 176、 1 78 1 80 1 82 184、 1 86 188、 90、 1 9 2、 1 94、 196 1 98 200 202、 204 206、 08、 2 1 0、 2 1 2、 214 2 1 6 2 1 8 220、 222 224、 26、 22 8、 230、 2 32 234 2 36 238、 240 242、 44、 24 6、 248、 2 50 9 C: 9 254 256、 258 260、 62、 26 4、 266、 2 68 270 272 274、 276 278、 80、 28
2、 284、 2 86 288 290 292、 294 296、 98、 30 0、 302、 304 306 30 8 3 10、 31 2 314、 1 6、 3 1 8、 320、 322 324 326 328、 330 332、 34、 33 6、 338、 3 40 342 344 346、 348 350、 52、 35 4、 356、 358、 360、 362、 364、 366、 368、 370、 37 o、 374、 376、 378、 380、 382、 384、 386、 388、 39
0、 392、 394、 396、 398、 400、 402、 404、 406、 40 8、 410、 41 2、 414、 41 6、 41 8、 420、 422、 424、 42 6、 428、 430、 432、 434、 43 6、 438、 440、 442、 44
4、 446、 448、 450、 452、 454、 456、 458、 460、 46
2、 464、 466、 468、 470、 47 2、 474、 476、 478、 48
0、 482または 484で表されるアミノ酸配列のうち少なくとも 1以上を含む
■ _~■、、
ァー夕セットを保存したコンピュー夕読み込み可能媒体。
3 0. 請求項 29に記載の媒体上のデータと他のヌクレオチド配列および/ または他のアミノ酸配列のデ一夕を比較して他のポリヌクレオチド配列および,ノ またはアミノ酸配列との同一性の算出を行う方法。
3 1. 配列番号 2 4、 6、 8、 10、 1 2 14、 1 6 1 8 、 20 9
9 24、 26、 28 30、 32、 34、 36 38、 40 42 、 44 4
6、 4 S、 50、 52 54、 56、 58、 60 62、 64 66ゝ 68 6 9、 7 1、 73、 75 77、 79、 8 1、 S 3 85、 87 89、 9 1 9
3、 95、 97、 99 101 103 1 0 5 1 07 109
1 3、 1 1 5、 1 1 7 1 1 9 1 2 1 1 23 1 25 1 2 7 1 29 3 1 1 33 1 35 137 1 39 141 143 145 147
49 1 51 1 53 1 55 1 57 1 59 1 6 1 163 1 65
6 7 169 1 7 1 1 73 1 75 1 77 1 79 1 8 1 1 83
8 5 1 87 1 89 1 91 1 93 1 95 1 97 1 99 201 2 0 3 205 207 209 2 1 1 2 1 3 2 1 5 2 1 7 2 1 9 2 1 223 225 227 229 23 1 233 23 5 237 2 3 9 241 243 245 247 249 251 253 255 9
57 259 261 263 265 267 269 27 1 273 9
7 5 277 279 281 283 285 287 28 9 29 1 2
93 295 297 299 30 1 303 305 30 7 309 3 31 3 31 5 317 3 1 9 32 1 323 32 5 327 3 29、 33 1、 3 3 3 33 5 337 3 3 9 34 1 343 345 3
47、 349、 3 5 1 35 3 3 5 5 3 5 7 3 5 9 3 6 1 3 6 3 3
65、 36 7、 3 6 9 37 1 37 3 3 7 5 3 7 7 3 7 9 3 S 1 3
83、 38 5、 3 87 38 9 3 9 1 3 9 3 3 9 5 3 9 7 3 99 4
0 1、 40 3、 40 5 407 40 9 4 1 1 4 1 3 1 5 4 1 7 4 1 9、 42 1、 42 3 42 5 427 42 9 4 3 1 43 3 43 5 4
3 7、 43 9、 44 1 443 4 45 447 449 45 1 453 4
55、 45 7、 459 46 1 4 6 3 46 5 46 7 46 9 47 1 4
7 3、 47 5、 47 7 47 9 4 8 1または 48 3から選択されるヌクレオチ ド配列の全てまたは
Figure imgf000090_0001
を含むポリヌクレオチドが固定されている不溶性基質。
32. 配列番号 1、 3、 5、 7、 9、 1 1、 1 3、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 23、 25、 2 7、 2 9, 3 1 , 33 3 5、 3 7, 3 9、 4 1 43、 45、 7、 49、 5 1、 5 3, 5 5、 57 5 9、 6 1 , 6 3、 6 5 67、 7 0、
72、 74、 7 6、 7 8, 8 0, 8 2 8 4、 8 6, 8 8 9 0 9 2、 94、
96、 98、 1 0 0 1 02、 1 04 1 0 6、 1 0 8、 1 1 0 1 1 2、 1 1 、 1 1 6、 1 1 8 1 20、 1 22 1 24、 1 2 6、 1 2 8 1 3 0 1 3 2、 1 34、 1 3 6 1 3 8、 1 40 142、 1 44、 1 46 1 48 1 5 0、 1 52、 1 54 1 56、 1 58 1 6 0、 1 6 2、 1 64 1 66 1 6
8、 1 70、 1 7 2 1 74、 1 76 1 7 8、 1 8 0、 1 8 2 1 84 1 8 6、 1 88、 1 9 0 1 92、 1 94 1 9 6、 1 98、 200 202 20 、 206、 2 0 S 2 1 0、 2 1 2 2 1 4、 2 1 6、 2 1 8 220 2 2
2、 2 24、 2 2 6 2 28、 2 30 2 3 2、 2 34、 2 3 6 2 38 24 0、 242、 244 246、 248 2 5 0、 2 5 2、 2 54 2 56 2 5 8、 260、 2 6 2 2 64、 266 26 8、 2 7 0 , 2 7 2 274 2 7
6、 27 8、 2 8 0 2 82 , 2 84 28 6、 2 8 8、 2 9 0 29 2 2 9 、 2 96、 2 9 8 3 00、 30 2 304、 3 0 6、 30 8 3 1 0 3 1 2、 3 14、 3 1 6 3 1 8、 3 20 3 2 2、 3 24、 3 2 6 3 2 8 3 3 0、 3 32、 3 34 3 36、 3 3 8 340、 342、 344 346 34
5、 3 50、 3 52 3 54、 3 56 3 5 8、 3 6 0、 36 2 364 3 6 6 3 6 8 3 7 0 3 7 2 3 7 4 3 7 6 3 8 0 3 8 2 3 S 4 3 8 6 3 8 8 3 9 0 3 9 2 3 9 4 3 9 8 4 0 0 4 0 2 4 0 4 4 0 6 4 0 8 4 1 0 4 1 2 4 1 6 4 1 8 4 2 0 4 2 2 4 2 4 4 2 6 4 2 8 4 3 0 4 3 4 4 3 6 4 3 8 4 4 0 4 4 2 4 4 4 4 4 6 4 4 8 4 5 2 4 5 4 4 5 6 4 5 8 4 6 0 4 6 2 4 6 4 4 6 6
Figure imgf000091_0001
4 7 0 4 7 2 4 7 4 4 7 6 4 7 8 4 8 0 4 8 2または 4 8 4で表されるアミノ酸配列から 選択されるァミノ酸配列の全てまたは一部を含むポリペプチドが固定されている 不溶性基質。
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