WO2002077224A1 - Nouvelle sonde d'acide nucleique et nouveau procede d'essai d'acides nucleiques faisant appel a ladite sonde - Google Patents

Nouvelle sonde d'acide nucleique et nouveau procede d'essai d'acides nucleiques faisant appel a ladite sonde Download PDF

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WO2002077224A1
WO2002077224A1 PCT/JP2002/003013 JP0203013W WO02077224A1 WO 2002077224 A1 WO2002077224 A1 WO 2002077224A1 JP 0203013 W JP0203013 W JP 0203013W WO 02077224 A1 WO02077224 A1 WO 02077224A1
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nucleic acid
probe
dye
measurement
target nucleic
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Application number
PCT/JP2002/003013
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ryuichiro Kurane
Takahiro Kanagawa
Yoichi Kamagata
Masaki Torimura
Shinya Kurata
Kazutaka Yamada
Toyokazu Yokomaku
Original Assignee
Japan Bioindustry Association
National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Kankyo Engineering Co., Ltd.
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Definitions

  • the present invention measures a target nucleic acid present in a system using a simple device when at least one or more (i.e., one or more) target nucleic acids are present in a measurement system (when a plurality of target nucleic acids are present).
  • a new nucleic acid probe for simultaneous measurement if present and a new nucleic acid measurement method using the probe.
  • a fluorescent dye pair that causes a Forster (or fluorescence) resonance energy transfer (hereinafter referred to as FRET) phenomenon is a fluorescent dye that can be a dye (hereinafter, referred to as a donor dye) and a fluorescent dye that can be a dye.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • a novel nucleic acid nucleic acid probe for measuring single-stranded nucleic acids which is labeled with a plurality of fluorescent dyes so as to form at least one pair of fluorescent dyes (hereinafter referred to as “acceptable dyes”);
  • a nucleic acid measurement method using the nucleic acid probe a nucleic acid measurement reagent kit used in the method, a method for analyzing or measuring polymorphism or / and mutation (mutation) of a target nucleic acid, and use for the method Measurement kit, etc.
  • Nucleic acid probes in which a single-stranded oligonucleotide is linked to a fluorescent dye base that causes the FRET phenomenon ie, fluorescein, which is a donor dye, and X-rhodamine, which is a dye
  • FRET phenomenon ie, fluorescein, which is a donor dye
  • X-rhodamine which is a dye
  • this nucleic acid probe is used for monitoring a PCR method, and is not intended to directly measure a nucleic acid. In some cases, it has been used to detect target nucleic acids (Biochemistry, 34, 285-292, 1995).
  • the fluorescence intensity of the nucleic acid probe itself is at a low level due to the FRET phenomenon. That is, the emission of fluorescein is suppressed, and the fluorescence intensity is at a low level.
  • the fluorescence intensity of X-rhodamine is high, but not as high as that of fluorescein.
  • the three-dimensional structure of the probe changes, and the FRET phenomenon is eliminated. As a result, the emission of fluorescein increases, and the fluorescence intensity of the reaction system increases.
  • the fluorescence intensity does not change, and the fluorescence intensity was not suitable for measuring nucleic acid.
  • the present inventors have developed a nucleic acid probe that is a fluorescence quenching probe that reduces fluorescence after hybridization when hybridized with a target nucleic acid without the intervention of another nucleic acid probe (Nuc1eic). Acid, Vol. 29, No. 6e34, 2001; EP1 046 717 A9; JP-A-200-286300 (P200-28686A)
  • This nucleic acid probe has a single-stranded oligonucleotide labeled with a fluorescent dye at the end. However, the fluorescent dye and base sequence are designed so that the fluorescence intensity decreases when hybridized to the target nucleic acid.
  • This nucleic acid probe can measure the target nucleic acid in a very small amount, accurately and easily.
  • the method is based on the interaction between a base pair complex (hydrogen bond) of G (guanine) and C (cytosine) during the formation of a double-stranded oligonucleotide and fluorescence quenching due to the interaction of a fluorescent dye (Quenching due to energy transfer)
  • This phenomenon is used, and the number of fluorescent dyes that can be quenched by this phenomenon is relatively small, so the available fluorescent emission colors are limited.
  • simultaneous measurement of all of these requires the same number of fluorescent emission colors as the target nucleic acid, in other words, requires the same number of nucleic acid probes with different fluorescent emission colors as the target nucleic acid species. I do.
  • an object of the present invention is to provide a single-stranded oligonucleotide with a fluorescent dye pair that causes a FRET phenomenon, i.e., a nucleic acid probe in which a donor dye and an xylose dye are combined, using a simple measurement device,
  • a new nucleic acid probe for nucleic acid measurement (hereinafter referred to as a new nucleic acid probe for nucleic acid measurement) capable of simultaneously measuring at least one or more (i.e., one or more) target nucleic acids and capable of measuring a small amount, in a short time, simply, and accurately.
  • nucleic acid probe Is sometimes simply referred to as a nucleic acid probe.
  • nucleic acid measurement method a novel nucleic acid measurement method using it (hereinafter sometimes simply referred to as nucleic acid measurement method), a reagent kit thereof, a method for measuring polymorphism / mutation of a target nucleic acid, and a measurement kit thereof. It is to be. Disclosure of the invention
  • the present inventors based on the above-described fluorescence quenching probe, label single-stranded oligonucleotides at various positions with various fluorescent dyes by trial and error.
  • the various nucleic acid probes prepared in the above were compared in detail.
  • a specific position of the oligonucleotide is labeled with a specific donor dye and its companion dye Axcept, when the nucleic acid probe hybridizes to the target nucleic acid, it will be pro- and post-hybridization.
  • a small number of fluorescent dye pairs that cause the FRET phenomenon that is, a pair of a fluorescent dye that can be a donor dye (hereinafter referred to as a donor dye) and a fluorescent dye that can be a receptor dye (hereinafter referred to as an axeptic dye).
  • a donor dye a fluorescent dye that can be a donor dye
  • an axeptic dye a fluorescent dye that can be a receptor dye
  • the nucleotide sequence is set so that the fluorescent intensity of the acceptor dye decreases when the probe hybridizes to the target nucleic acid. Is designed, and the dye is labeled, a nucleic acid probe,
  • nucleic acid probe having a dye pair of a donor dye and an acceptor dye;
  • nucleic acid probe When the nucleic acid probe is labeled with a donor dye at its end, and when the nucleic acid probe hybridizes to the target nucleic acid at the end, 1 to 3 from the terminal base of the target nucleic acid hybridized to the probe. 5.
  • the multiple base pairs of the probe-nucleic acid hybrid form at least one G (guanine) and (cytosine) pair at the donor-dye labeling site.
  • nucleic acid probe according to any one of 1 to 6 above wherein the donor dye labels the 5 ′ end (including the 5 ′ end) of the nucleic acid probe;
  • nucleic acid probe according to the above 8 wherein the 3 ′ terminal base of the nucleic acid probe is G or C, and the 3 ′ terminal is labeled with a donor dye,
  • a nucleic acid probe is prepared by hybridizing a nucleic acid probe and a target nucleic acid by allowing nucleic acid probes of at least as many species as the number of nucleic acids (hereinafter simply referred to as species) and having different fluorescent colors to be present. At the same number of wavelengths as the number of species (hereinafter simply referred to as species) and at least the same number of species (hereinafter simply referred to as species).
  • a method for measuring nucleic acid characterized by measuring the amount of decrease;
  • a method for analyzing or measuring polymorphism or Z and mutation of a target nucleic acid in a measurement system in which at least one or more target nucleic acids are present at least one of the aforementioned 1 to 10
  • a nucleic acid probe having at least the same number of species as the target nucleic acid and having a different fluorescent color is present in the measurement system.
  • the target nucleic acid and the nucleic acid probe are hybridized eight times, and the fluorescence intensity of the measured wavelength before and after hybridization at the wavelength of at least as many species as the number of species of the nucleic acid probe is obtained.
  • a method for analyzing or measuring a polymorphism and / or mutation of a target nucleic acid which comprises measuring the amount of decrease; and
  • a measurement kit for analyzing or measuring a polymorphism or mutation of a target nucleic acid in a measurement system in which at least one or more target nucleic acids are present the nucleic acid probe according to at least any one of the above 1 to 10 is used.
  • the first invention of the present invention relates to a fluorescent dye pair that causes a FRET phenomenon, i.e., a dye labeled with a plurality of fluorescent dyes to form at least one pair of a donor dye and an acceptor dye.
  • a fluorescent dye pair that causes a FRET phenomenon
  • the fluorescent dye is labeled such that when the probe hybridizes to the target nucleic acid, the fluorescent intensity of the excipient dye of the probe nucleic acid hybrid complex decreases.
  • the nucleic acid probe has a base sequence designed. Among them, preferred nucleic acid probes are those designed so that the fluorescence intensity of both the donor and the AXEP dye is reduced.
  • the probe-nucleic acid hybrid complex is the present invention.
  • the nucleic acid probe is hybridized with the target nucleic acid (complex).
  • the target nucleic acid complex
  • it is abbreviated as a nucleic acid hybrid complex.
  • nucleic acid measurement refers to quantification or quantitative detection of a target nucleic acid, or simply detection.
  • the target nucleic acid refers to a nucleic acid or a gene for measuring a nucleic acid. With or without purification. It does not matter what the concentration is.
  • Various nucleic acids other than the target nucleic acid may be mixed.
  • the target nucleic acid needs to be purified, it can be performed by a conventionally known method.
  • the purification can be performed using a commercially available purification kit or the like.
  • the nucleic acid include DNA, RNA, PNA, oligodeoxy liponucleotides (oligodeo xyribonucleotides), oligoribonucleotides, and oligoribonucleotides).
  • Examples of chemically modified nucleic acids include 2 ′ methyl (Me) RNA.
  • the donor dye which can be a donor dye in the FRET phenomenon in the present invention is at least a. Excited at a specific wavelength and emits light at a specific wavelength, b. Transfer of luminescence energy to a specific dye (a dye which can be an acceptor dye) C.
  • a specific dye a dye which can be an acceptor dye
  • C A complex of GC base pairs generated when the nucleic acid probe hybridizes with the target nucleic acid (hereinafter sometimes referred to as GC hydrogen bond for convenience). ), And can be transferred to the base pair when present in the vicinity of Donna monochromate. That is, any dye that satisfies this condition may be used.
  • a dye that can be a donor dye in FRET phenomena and that reduces the fluorescence intensity of the probe-nucleic acid hybrid complex when a nucleic acid probe that is itself labeled alone hybridizes to a target nucleic acid is preferable. Used (Nucleic Acid, Vol. 29, No. 6e34, 2001).
  • the donor dye examples include B0DIPY FL (trade name; manufactured by Molecular Probes, USA), BOD IPY 493/503 (trade name: manufactured by Molecular Probes, USA), 5-FAM, Tetramethylr odamine> 6-TAMRA, fluorescein or derivatives thereof (for example, fluorescein isothiocyanate (FITC) or derivatives thereof, Mexa 488 , Al exa 532, cy3> cy5, EDANS (5- (2 '-ami noe t hy 1) am i no-1 -nap t ha 1 en e sulfonic acid)), rhodamine 6G (R6G) or derivatives thereof (eg, tetramethyl thylrhodamine is soihi thiocyana ⁇ e) (TMRITC)> BODIPY ) FL / C3 (trade name; Molecular: Probes, USA), PODPI (B0DIPY) FL / C6
  • BODIPY FL (trade name; manufactured by Molecular Probes, USA) and BODIPY FL dye (trade name: manufactured by Molecular Probes) , USA), BODIPY 493/503 (trade name; Molecular Probes, USA), 5-FAM, podpy (BODIPY) 5-FAM (trade name; Molecular Probes) BODIPY FL (trade name; Molecular Probes, USA), B0 DIPY 493/503, trade names such as Tetrameiylrhodamine, 6-TAMRA, etc. Molecular probes (Molecular Probes, USA), 5-FAM, Tetramethylrhodamine ⁇ 6-TAMRA, and the like.
  • the present invention is not limited to these examples.
  • Axep Yuichi dyes generally interact with donor dyes in the FRET phenomenon.
  • any dye that can be an axepye dye that is, a dye that can undergo energy transfer from a donor dye (in other words, has a quenching effect on the donor dye) May be. It depends on the type of donor dye that forms the pair.
  • BODIPY FL (trade name; Molecular Probes, USA), BODIPY FL dye (trade name; Molecular Probes, USA) B0DIPY 493/503 (trade name; Molecular Probes, USA), 5-FAM, podpy (BODIPY) 5-FAM (trade name, Molecular 'Probe, USA)
  • BODIPY BODIPY FL
  • BODIPY FL dye (trade name; Molecular Probes, USA)
  • B0DIPY 493/503 (trade name; Molecular Probes, USA)
  • 5-FAM podpy
  • podpy (BODIPY) 5-FAM (trade name, Molecular 'Probe, USA)
  • Tetramethylrhodamine> 6-TAMRA is used as a donor dye
  • B0DIPY 581-591 (trade name; manufactured by Molecular Probes, USA), etc.
  • the present invention is not limited to these examples.
  • the nucleic acid probe of the present invention to be hybridized to a target nucleic acid may be composed of oligodeoxyliponucleotides or oligoribonucleotides. Alternatively, chimeric oligonucleotides containing both of them may be used. These oligonucleotides may be chemically modified. The chemically modified oligonucleotide may be interposed in the chain of the chimeric oligonucleotide.
  • Modification sites of the chemically modified oligonucleotide include a terminal hydroxyl group or a phosphate group at the terminal of the oligonucleotide, an internucleoside phosphate site, a carbon at the 5-position of the pyrimidine ring, and a nucleoside sugar (report or Deoxylipis) site.
  • a preferred example is a report or dexoxy report site.
  • 2'-alkyloligoribonucleotides hereinafter, 2'-0- is abbreviated as 2-0-).
  • Examples thereof include 2-0-alkylene oligoribonucleotides (2-0-alkyleneoligor ibonuc leotides) and 2-0-benzyloligoliponucleotides (2-0_benzy 1 oI igor ibonucleotides).
  • 2-0-alkyl oligoribonucleotides preferably, among the 2-0-alkyl oligoribonucleotides, 2-0-methyl oligoribonucleotide, 2-0-ethyl oligoribonucleotide, 2-0-butyl oligoliponucleotide Nucleotides, 2-0-benzyloligoliponucleotides, among 2-0-alkylene oligoliponucleotides, 2-0-ethylene oligoliponucleotides, and 2-0-benzyloligoliponucleotides are particularly preferably And 2-0-methyl oligoliponucleotides (hereinafter simply referred to as 2-0-Me oligoliponucleotides).
  • 2-0-Me oligoliponucleotides preferably, among the 2-0-alkyl oligoribonucleotides, 2-0-methyl oligoribonucleotide, 2-0-e
  • the affinity for the target nucleic acid is increased, and the hybridization efficiency of the nucleic acid probe of the present invention is improved.
  • the hybridization efficiency is increased, the decrease rate of the fluorescence intensity of the fluorescent dye of the nucleic acid probe of the present invention is further improved, so that the measurement accuracy of the concentration of the target nucleic acid is further improved.
  • oligonucleotide refers to oligodoxyliponucleotides, oligoliponucleotides, or both, and is to be generically referred to.
  • 2-0-alkyl oligoliponucleotides, 2-0-alkylene oligoliponucleotides, and 2-0-benzyl oligoliponucleotides can be prepared by known methods (Nucleic Acids Research, Vol. 26, pp. 222-222). , 1989).
  • GENSET (Ltd.) (France) conducts commissioned synthesis, so it can be easily obtained. The present inventors commissioned the synthesis of the compound to the company and conducted experiments to complete the present invention.
  • 2-0-methyl oligo liponucleotide hereinafter simply referred to as 2-0-Me oligo It is called a liponucleotide.
  • the nucleic acid probe of the present invention in which a modified RNA such as) is interposed in oligodeoxy liponucleotide can give favorable results when used mainly for measurement of RNA, particularly rRNA.
  • the RNA solution as a sample is subjected to a temperature of 80 to 100 ° C., preferably 90 to 100 ° C .; For 9 to 97 minutes, heat treatment is performed for 1 to 15 minutes, preferably 2 to 10 minutes, and optimally for 3 to 7 minutes. It is suitable for improving the efficiency of the application.
  • a helper probe is added to the hybridization reaction solution. It is preferable to do so.
  • the oligonucleotide of the helper probe may be an oligodoxyliponucleotide or an oligoliponucleotide, or may be an oligonucleotide subjected to the same chemical modification as described above.
  • the above-mentioned oligonucleotide in the PCR method, (5 ') TCCTTTGAGT TCCCGGCCGG A (3
  • oligonucleotides include 2-0-alkyl oligoliponucleotides, especially 2
  • nucleotide chain of the nucleic acid probe of the present invention is 35 bases or less, the use of a helper probe is particularly effective.
  • a nucleic acid probe of the present invention having more than 35 base chains is used, it may be sufficient to simply heat denature the target RNA.
  • RNA when the nucleic acid probe of the present invention is hybridized to RNA, the hybridization efficiency is increased.
  • the fluorescence intensity decreases with the amount of NA, and RNA can be measured up to a final RNA concentration of about 150 pM.
  • the present invention measures the concentration of at least one or more (i.e., one or more) target nucleic acids containing or accompanying at least as many nucleic acid probes of the present invention as the number of target nucleic acid species. It is also a measurement kit containing at least one of the above-mentioned helper probes in a measurement kit for measuring the concentration of at least one or more (ie, one or more) target nucleic acids.
  • RNA In the measurement of RNA by a conventional hybridization method using a nucleic acid probe, an oligodeoxyliponutide or oligoribonucleotide has been used as a nucleic acid probe. Since RNA itself has a strong higher-order structure, the hybridization efficiency between the probe and target RNA is poor, and the quantitativeness is poor.
  • the conventional method has the complexity of denaturing RNA, fixing it to a membrane, and then performing a hybridization reaction.
  • the method of the present invention uses a reporter-modified nucleic acid probe having a high affinity for a specific structural portion of RNA, so that the hybridization reaction can be performed at a higher temperature than in the conventional method. It can be carried out.
  • the above-mentioned adverse effects of the higher-order structure of RNA can be overcome only by using a heat denaturation treatment as a pretreatment and a helper probe in combination.
  • the hybridization efficiency becomes substantially 100%, and the quantitativeness is improved. Also, it is much simpler than the conventional method.
  • the number of bases of the probe of the present invention is 5 to 60, preferably 10 to 35, particularly preferably 15 to 20. If it exceeds 60, the permeability of the cell membrane will be poor when used in the FISH method, and the scope of the present invention will be narrowed. If it is less than 5, non-specific hybridization is likely to occur, and the measurement error increases.
  • the structure is such that the nucleic acid probe is labeled with a donor dye at its end.
  • the nucleic acid probe hybridizes to the target nucleic acid at the end portion, the base sequence of the target nucleic acid is separated from the terminal base by 1 to 3 bases from the terminal nucleic acid hybridized to the probe, and C (cytosine) is added.
  • the nucleotide sequence of the probe is designed so that G (guanine) has at least one base.
  • the nucleic acid probe when the nucleic acid probe has hybridized to the target nucleic acid, at least one G (guanine) and C (cytosine) base in the donor dye-labeled portion has a plurality of base pairs of the probe nucleic acid hybrid. That is, the nucleotide sequence of the probe is designed so as to form a probe.
  • the donor-dye labeling site is a G (guanine) or C (cytosine) base, or a phosphate group of a nucleotide having the base, or a ⁇ H group of a report.
  • the dye When the donor dye labels a base, a phosphoric acid portion, or a report portion at the 5 ′ end of the nucleic acid probe, the dye is labeled with the nucleic acid protein. At the 3'-end (including the 3'-terminal base) in the chain. When the donor dye labels the base, phosphate or ribose at the 3 ′ end of the nucleic acid probe, the receptor dye may be in the nucleic acid probe chain or at the 5 ′ end (3 ′ end base). ) Is included. When labeling the terminal portion, the label may be labeled with both dyes.
  • one of the two may be labeled with a phosphoric acid portion, and the other may be labeled with a report portion or a base portion (for example, when the distance between the base of the labeled portion of the donor dye and that of the dye is zero).
  • both may be bonded to one spacer using a spacer having a side chain.
  • both the donor dye and the acceptor dye may be labeled in the chain as long as the above conditions are satisfied.
  • the binding position of the fluorescent dye at each of the above sites may be OH group or amino. It is preferred to bond to the group via a spacer.
  • the distance between the base of the labeled portion of the donor dye and the dye of the dye is essentially dependent on the kind of the dye pair of the dye and the dye, but is generally from 0 to 50 bases, preferably from 0 to 50 bases. To 40 bases, more preferably 0 to 35 bases, and particularly preferably 0 to 15 bases. Beyond 50 bases, the FRET phenomenon becomes unstable. With 15 to 50 bases, the fluorescence intensity of the dye alone decreases, but the fluorescence intensity of the donor dye may increase. That is, when the nucleic acid probe hybridizes to the target nucleic acid, the three-dimensional structure of the nucleic acid probe may change. The change may eliminate the FRET phenomenon between the dyes of the nucleic acid probe.
  • the fluorescence intensity of the donor dye increases or decreases before hybridization depending on the quenching effect (quenching effect) of the acceptor dye on the donor dye and the magnitude of the effect of the hydrogen bond of GC on the donor dye. Or It decreases when the quenching effect of the hydrogen bond of GC is larger, but increases when it is smaller.
  • the number of bases is less than 15 bases, both the fluorescence intensity of the donor dye and the fluorescence intensity of the axep dye decrease after hybridization. The amount of reduction does not depend on the three-dimensional structure of the nucleic acid probe after hybridization, but only on the concentration of the target nucleic acid in the measurement reaction system.
  • the number of bases is particularly preferably 0 to 10 bases.
  • a particularly preferred form of the probe of the present invention has a distance between the bases of the labeled portion of the donor dye and the dye, and the donor dye is B0DIPY FL, B0DIPY 493/503, 5-FAM, Tetramet. hy 1 rhod amine, or 6-TAMR A, the receptor dye is B0DIPY 581/591, X-rhodamine, the 5 'end base is G or C, and the 5' end is labeled with a donor dye. Or the nucleic acid probe is labeled at the 3, terminal base with G or C, and at the 3, terminal with a donor dye.
  • the structure of the novel nucleic acid probe for nucleic acid measurement of the present invention is as described above.
  • the excited donor dye energy when the excited donor dye energy is not hybridized to the target nucleic acid, it is transferred to the acceptor dye, so that the acceptor dye emits light and has fluorescence intensity. are doing. Therefore, since the emission of the donor dye is also suppressed, the fluorescence intensity is kept at a low level.
  • the nucleic acid probe hybridizes to the target nucleic acid, the energy of the donor dye is transferred to the GC hydrogen bond formed by the probe-nucleic acid hybrid complex. In some cases, the three-dimensional structure of the nucleic acid probe changes to eliminate the FRET phenomenon. Thus, the emission of the acceptor dye is reduced.
  • the oligonucleotide of the nucleic acid probe of the present invention can be produced by a general method for producing an ordinary oligonucleotide.
  • it can be produced by a chemical synthesis method, a microbial method using a plasmid vector, a phage vector, or the like (Tetrahedron letters, 22, 1859-1862, 1981; Nucleic acids Research, 14, 6227-6245). 1986). It is preferable to use a commercially available nucleic acid synthesizer (for example, ABI 394 (manufactured by Perkin Elmer, USA)).
  • any of the conventionally known labeling methods can be used (Nature Biotechnology, 14, 303-308, 1996; Applied and Environmental Microbiology, 63). Vol., 1143-U47, 1997; Nucleic acids Research, 24, 4532-4535, 1996).
  • a fluorescent dye molecule to the 5 'end, first, for example,-(CH 2 ) n -SH is introduced as a spacer into the phosphoric acid group at the 5' end according to a conventional method. I do.
  • These transductants are commercially available and may be purchased commercially (Medland Certified Reagent Company). In this case, n is 3 to 8, preferably 6.
  • a labeled oligonucleotide By attaching a fluorescent dye having SH group reactivity or its derivative to this spacer, A labeled oligonucleotide can be synthesized.
  • the thus synthesized oligonucleotide labeled with a fluorescent dye can be purified by a reversed phase chromatography or the like to obtain the nucleic acid probe of the present invention.
  • the 3 ′ terminal base of the oligonucleotide can be labeled.
  • -(CH 2 ) n -book 2 is introduced as a spacer to the OH group at the 3'-position C of the report or deoxylipose. Since these introducers are also commercially available in the same manner as described above, commercially available products may be purchased (Medland, Certified, Regent, Campaign (Midi and Certifed Reagent Company)). Further, a phosphoric acid group is introduced, and for example,-(CH 2 ) n -SH is introduced as a spacer to the 0 H group of the phosphoric acid group. In these cases, n is 3-8, preferably 4-7.
  • a labeled oligonucleotide can be synthesized by binding a fluorescent dye or a derivative thereof reactive to an amino group or SH group to the spacer.
  • bases in the oligonucleotide nucleotides can be labeled.
  • the amino group or OH group of the base may be labeled with the dye of the present invention in the same manner as in the method for the 5 'or 3' end (ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 225, pp. 32-38 (1998)).
  • kits reagent for example, Uni-link aminomo dier (manufactured by CL0NTECH, USA)
  • Fluo * Repo Kit FluoReporter Kit
  • F-6082, F-6083, F-6084 , F-10220 all manufactured by Molecular Probes, Inc., Molecular Probes, USA.
  • a fluorescent dye molecule can be bound to the oligoliponucleotide according to a conventional method.
  • the oligonucleotide synthesized as described above can be purified to obtain the nucleic acid probe of the present invention by chromatography such as reverse phase chromatography, etc. As described above, the nucleic acid probe of the present invention can be produced.
  • the prepared nucleic acid probe for nucleic acid measurement of the present invention has a fluorescence intensity of luminescence of the probe-nucleic acid hybrid complex when the nucleic acid is hybridized eight times to the target nucleic acid. It is significantly reduced as compared to before forming the complex.
  • nucleic acid probes of the number of combinations can be obtained. It also has the above properties.
  • the decrease in the fluorescence intensity of the acceptor dye is measured, so that one nucleic acid probe can be used simultaneously at one excitation wavelength.
  • a second invention of the present invention is a method for measuring a target nucleic acid using the nucleic acid probe prepared as described above.
  • the nucleic acid probe for nucleic acid measurement according to at least any one of the above items 1 to 10 of the present invention, wherein the nucleic acid probe hybridizes to the target nucleic acid in a measurement system in which at least one or more target nucleic acids are present.
  • This is a nucleic acid measuring method characterized by measuring the amount of decrease in fluorescence intensity at a measurement wavelength before and after hybridization at least at the same number of wavelengths as the number of species of the probe for use.
  • the present invention is a computer-readable recording medium in which a measurement kit, a data analysis method for the measurement, a measurement device, and a procedure for causing a computer to execute the data analysis process are recorded as a program. .
  • the “measurement system in which at least one or more target nucleic acids are present” means that one or more target nucleic acids are present in the measurement system.
  • nucleus according to at least one of the above 1 to 10 of the present invention.
  • the “acid probe for acid measurement” has the following meaning.
  • the type of the nucleic acid probe for nucleic acid measurement to be present in the measurement system may be one or more.
  • the phrase “a plurality may be used” means that a plurality of nucleic acid measuring nucleic acid probes that hybridize to a single target nucleic acid at a plurality of sites having different base sequences may be used.
  • the number of the types is at least the same as that of the target nucleic acid type.
  • the “at least the same number” means that a plurality of nucleic acid measurement probes are set in a base sequence site for one kind of target nucleic acid, and a plurality of kinds of nucleic acid measurement probes for one kind of target nucleic acid. This means that the probe may be present in the measurement system.
  • the “probe for measuring a plurality of nucleic acids” in the case where the single and plural kinds of target nucleic acids are present in a measurement system has the following meaning. That is, (1) a plurality of probes of different types in the nucleic acid measurement nucleic acid probe according to any one of the items 1 to 10 of the present invention. For example, probes having the same form or structure but different dyes for labeling each other can be exemplified. (2) A combination of probes for nucleic acid measurement having different probe forms or structures, but a plurality of types of nucleic acid measurement probes having mutually different labeling dyes. That is, it means that a nucleic acid probe extending over each of the above items 1 to 10 may be used.
  • the third invention of the present invention relates to a method for analyzing or measuring a polymorphism or polymorphism and mutation of a target nucleic acid in a measurement system in which at least one or more target nucleic acids are present, wherein 10.A nucleic acid probe according to at least any one of the above, wherein a probe for nucleic acid measurement having at least the same number of species as the target nucleic acid and having a different fluorescent color is present in the measurement system. Then, the target nucleic acid and the probe for nucleic acid measurement are hybridized, and the fluorescence intensity at the measurement wavelength before and after hybridization at least as many as the number of species of the nucleic acid measurement probe.
  • a method for analyzing or measuring polymorphisms or mutations and mutations of a target nucleic acid characterized by measuring the amount of decrease in the amount of the target nucleic acid, a measurement kit thereof, a data analysis method for the measurement, a measurement device thereof, And a duo Yu evening readable recording medium which procedure was recorded as a program for executing a data analysis process in con Pugh evening.
  • the nucleic acid probe of the present invention can be suitably used not only for nucleic acid measurement but also for a method for analyzing or measuring polymorphism or mutation of a target nucleic acid.
  • the target nucleic acid may be an amplified product amplified by one of various nucleic acid amplification methods, or may be an extracted product.
  • the target nucleic acid may be of any type.
  • guanine base or cytosine base may be present in the chain or at the terminal. Guanine base or cytosine salt in the chain or at the end If no group is present, the fluorescence intensity does not decrease. Therefore, according to the method of the present invention,
  • polymorphisms such as single nucleotide polymorp ism (SNP)
  • SNP single nucleotide polymorp ism
  • nucleic acid probe of the present invention in a measurement kit for analyzing or measuring polymorphisffl and mutation of a target nucleic acid, polymorphism or Z and mutation of the target nucleic acid can be obtained. It can be suitably used as a measurement kit for analyzing or measuring mutations.
  • the target nucleic acid hybridized with the nucleic acid probe of the present invention. If a process is provided to correct the fluorescence intensity value of the reaction system at that time with the fluorescence intensity value of the reaction system when the above-mentioned one is not hybridized, the processed data will have high reliability.
  • the third invention provides a data analysis method for analyzing or measuring polymorphism or Z and mutation (mutation) of a target nucleic acid.
  • a third invention is a measuring device for analyzing or measuring polymorphism or Z and mutation of a target nucleic acid, wherein the reaction system has a fluorescent system when the target nucleic acid is hybridized with the nucleic acid probe of the present invention.
  • the third invention provides a method for analyzing a target nucleic acid, which comprises analyzing a protein obtained by a method for analyzing or measuring a polymorphism (po morphisni) and / or a mutation (mutation) of the target nucleic acid.
  • Procedure for causing a computer to execute a process of correcting the fluorescence intensity value of the reaction system when hybridized with the nucleic acid probe of the above with the fluorescence intensity value of the reaction system when the above-mentioned nucleic acid probe is not hybridized It is a recording medium that can be read by a combi-user, in which is recorded as a program.
  • the third invention is characterized in that a plurality of nucleic acid probes for nucleic acid measurement of the present invention are bound to the surface of a solid support, and the target nucleic acid is hybridized thereto so that the target nucleic acid can be measured.
  • at least one temperature sensor and heater are installed on the opposite surface, and the temperature is adjusted so that the nucleic acid probe binding region has the optimal temperature condition. It is a device to get.
  • the nucleic acid probe of the present invention can be immobilized on the surface of a solid (support layer), for example, the surface of a slide glass.
  • a DNA chip This format is now referred to as a DNA chip.
  • Polymorphism analysis such as single nucleotide polymorphism (SNP) ) Can be used. Of course, it can also be used as a device (chip) for nucleic acid measurement.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • a slide glass coated with a polycation such as polylysine, polyethyleneimine, or polyalkylamine
  • a slide glass into which an aldehyde group is introduced, or an amino group is introduced.
  • a probe glass on the polycation-coated slide glass Ii
  • the slide glass into which the aldehyde group has been introduced is reacted with the probe into which the amino group has been introduced, and iii)
  • the slide glass into which the amino group has been introduced is PDC (pyridinium dichromat).
  • a device in which the nucleic acid probes for nucleic acid measurement of the present invention are arranged and bound in an array on a solid surface makes nucleic acid measurement more convenient.
  • many types of target nucleic acids can be simultaneously measured by creating a device in which many nucleic acid probes having different base sequences are individually bonded on the same solid surface.
  • At least one temperature sensor and a heater are provided on the surface opposite to the surface to which the solid nucleic acid probe of the present invention is bonded, and the region of the solid to which the probe is bonded is the optimum temperature. It is particularly preferred that the design is such that the temperature can be adjusted to a temperature condition.
  • the basic operation of the measurement method using the device of the present invention is only to place a solution containing a target nucleic acid on a solid surface to which a nucleic acid probe has been bound and hybridize the solution.
  • the amount of fluorescence changes according to the amount of the target nucleic acid, and the target nucleic acid can be measured from the amount of change in the fluorescence.
  • the concentration of many target nucleic acids can be measured at one time. Therefore, it is a new DNA chip because it can be used for the measurement of target nucleic acid in exactly the same application as the DNA chip.
  • nucleic acids other than the target nucleic acid do not change the amount of fluorescence emission, No washing operation is required.
  • the temperature of each nucleic acid probe of the present invention with a micro heater, it is possible to control the reaction conditions to the optimum for each probe, so that accurate measurement of the concentration is possible.
  • the dissociation curve between the nucleic acid probe of the present invention and the target nucleic acid can be analyzed by measuring the amount of fluorescence during that time. From the difference in the dissociation curves, the properties of the hybridized nucleic acid can be determined and the SNP can be detected.
  • a conventional device for measuring the concentration of target nucleic acid binds (fixes) a nucleic acid probe that has not been modified with a fluorescent dye to a solid surface, and then hybridizes the target nucleic acid labeled with the fluorescent dye after eight hybridizations. Unremoved target nucleic acid was washed away, and the fluorescence intensity of the remaining fluorescent dye was measured.
  • steps To label a target nucleic acid with a fluorescent dye, for example, if a specific mRNA is targeted, take the following steps (steps): (1) Extract all of the mRNA isolated from the cells. (2) Then, cDNA is synthesized using reverse transcriptase while incorporating a nucleoside modified with a fluorescent dye. Such an operation is not necessary in the present invention.
  • the optimal hybridization conditions for nucleic acids hybridizing to each probe such as temperature
  • the hybridization reaction and the washing operation under optimal conditions for each probe (for each spot).
  • the nucleic acid expected to be hybridized does not hybridize, or has a drawback such that the hybridized nucleic acid is easily washed away because the hybridized nucleic acid is not strong. . like that Quantitative properties of nucleic acids were low due to the cause.
  • the present invention does not have such a disadvantage because this washing operation is not required.
  • a hybridization reaction can be performed at an optimum temperature for each probe of the present invention.
  • the present invention has significantly improved the quantitativeness.
  • a target nucleic acid can be easily and simply prepared in a measurement system in which at least one or more target nucleic acids are present. It can be measured specifically. The measurement method is described below.
  • a nucleic acid probe corresponding to the target nucleic acid for nucleic acid measurement of the present invention is added to the measurement system at least as many as the number of species of the target nucleic acid. Let it hybridize.
  • the method can be carried out by a commonly known method (Analytical Biochemistry, vol. 183, pp. 231-244, 1989; Nature Biotechno 1 ogy> vol. 14, p. 303-308, 1996; Applied and Environmental Microbiology> Vol. 63, pp. 1143-1147, 1997).
  • the conditions for hybridization are a salt concentration of 0 to 2 molar, preferably 0.1 to 1.0 molar, and a pH of 6 to 8, preferably 6.5 to 7.5. .
  • the reaction temperature is preferably within the range of the Tm value of the nucleic acid hybrid complex obtained by hybridizing the nucleic acid probe for nucleic acid measurement of the present invention to a specific site of the target nucleic acid ⁇ 10 ° C. By doing so, non-specific hybridization can be prevented. When the temperature is lower than Tm-10 ° C, non-specific hybridization occurs. When the temperature exceeds Tm + 10 ° C, no hybridization occurs. Incidentally, the Tm value can be determined in the same manner as in the experiment necessary for designing the nucleic acid probe for nucleic acid measurement of the present invention.
  • the oligonucleotide having the complementary nucleotide sequence is chemically synthesized using the above-described nucleic acid synthesizer or the like, and the Tm value of the nucleic acid probe and the nucleic acid probe is measured by an ordinary method.
  • the average value of a plurality of nucleic acid hybrid complexes may be employed, or the target nucleic acid of the highest priority may be employed.
  • the reaction time is 1 second to 180 minutes, preferably 5 seconds to 90 minutes. When the time is less than 1 second, the number of unreacted nucleic acid probes of the present invention in hybridization increases. There is no point in making the reaction time too long. The reaction time is greatly affected by the nucleic acid species, that is, the length of the nucleic acid or the base sequence.
  • the nucleic acid probe for nucleic acid measurement of the present invention is hybridized to a target nucleic acid.
  • the fluorescence intensity of the hybridization reaction system was measured with a fluorometer at a wavelength of at least the same number of species as the number of the added nucleic acid measurement probes. Calculate the amount of decrease at each wavelength. Since the magnitude of the decrease is proportional to the concentration of the target nucleic acid, the concentration of the target nucleic acid can be determined.
  • the concentration of the target nucleic acid in the reaction solution preferably 0.1 to 10OnM.
  • the concentration of the nucleic acid probe of the present invention in the reaction solution is preferably from 1.0 to 25OnM.
  • a calibration curve When preparing a calibration curve, it is desirable to use the nucleic acid probe of the present invention at a ratio of 1.0 to 2.5 with respect to the target nucleic acid.
  • a calibration curve is first prepared under the above conditions. When there are a plurality of target nucleic acids, a calibration curve is created for each measurement wavelength of each nucleic acid probe of the present invention corresponding to the target nucleic acid. Then, the nucleic acid probe of the present invention corresponding to a plurality of concentrations is added to the sample, and the decrease in the fluorescence intensity value is measured.
  • the fourth invention of the present invention is an invention applied to various nucleic acid measuring methods, for example, a FISH method, a PCR method, an LCR method, an SD method, a competitive hybridization method, a TAS method, and the like.
  • the present invention relates to a microorganism system in which various types of microorganisms are mixed or one or more types of microorganisms are mixed with cells derived from animals or plants and cannot be isolated from each other (complex microbial system, symbiotic microbial system) It can be suitably applied to the measurement of nucleic acids such as intracellular or homogenate cells.
  • the microorganism here is a microorganism generally referred to, and is not particularly limited. For example, eukaryotic microorganisms, prokaryotic microorganisms, and others, mycoplasmas, viruses, rickets, and the like can be mentioned.
  • the target nucleic acid in this system is, for example, a nucleic acid having a base sequence specific to cells of a bacterial strain to be examined for its activity in these microorganism systems.
  • a nucleic acid having a base sequence specific to cells of a bacterial strain to be examined for its activity in these microorganism systems is a specific sequence of 5S rRNA, 16S rRNA or 23S rRNA of a specific strain, or the DNA of the gene thereof.
  • the nucleic acid probe of the present invention is added to a complex microbial system or a symbiotic microbial system to measure the amount of 5 S r RNA, 16 S r RNA or 23 S r RNA of a specific strain or their gene DNA. As a result, the amount of the specific strain in the system can be measured.
  • a method of adding the nucleic acid probe to a complex microbial or symbiotic microbial homogenate, measuring the amount of decrease in the emission of fluorescent dye before and after hybridization, and measuring the abundance of a specific strain within the technical scope of the present invention.
  • the above measuring method is, for example, as follows. That is, before adding the nucleic acid probe of the present invention, the temperature, salt concentration, and PH of the complex microorganism system or symbiotic microorganism system are adjusted to the above conditions. Particular strains in a composite microbial or probiotic microorganism system, 1 0 7 to 1 0 12 as number of cells / m 1, preferred Is properly it is preferable to adjust the 1 0 9 ⁇ 1 0 1Q pieces / m 1. It can be performed by dilution or concentration by centrifugation or the like. When the number of cells is less than 1 0 7 Zm 1, the fluorescence intensity is weak, the measurement error becomes large. When the number exceeds 10 12 Zm 1, the fluorescence intensity of the complex microbial system or the symbiotic microbial system is too strong, and the abundance of the specific microorganism cannot be quantitatively measured.
  • the concentration of the nucleic acid probe of the present invention to be added depends on the number of cells of a specific strain in a complex or symbiotic microorganism system.
  • the concentration is 0.1 to 10 OnM concentration, preferably 0.5 to 5 nM concentration, and more preferably 1.
  • OnM concentration per 1 X 10 Vm1 cell number If the value is less than 0. InM, it will not be a time that accurately reflects the abundance of the specified microorganism. However, the optimal amount of the nucleic acid probe of the present invention cannot be determined unconditionally because it depends on the amount of the target nucleic acid in the cell.
  • reaction temperature when hybridizing to 16 S rRNA or 23 S rRNA or its gene DNA is the same as that described above. Also, the reaction time is the same as the above conditions.
  • the nucleic acid probe of the present invention was used to transform 5 SrRNA, 16 SrRNA or 23 SrRNA of a specific strain or its gene DN.
  • A is hybridized, and the amount of decrease in luminescence of the fluorescent dye of the complex microorganism or the symbiotic microorganism before and after hybridization is measured.
  • the amount of decrease in emission of the fluorescent dye measured as described above is proportional to the abundance of the specific strain in the complex microorganism system or the symbiotic microorganism system. This is because the amount of 5 S rRNA, 16 S rRNA or 23 S rRNA or a gene thereof; the amount of DNA is proportional to the abundance of a specific strain.
  • the components other than the microorganisms in the complex microbial system or the symbiotic microbial system are the nucleic acid probe of the present invention and the 5S rRN of the specific strain.
  • KH 2 P0 4, K 2 HP0 4, NaH 2 P0 4, Na 2 HP0 Li down salt 4 such as, ammonium sulfate ammonium nitrate, inorganic nitrogen such as urea, magnesium, sodium, mosquito potassium, and calcium ion metal
  • metal ions such as manganese, zinc, iron and cobalt ions, various salts such as sulfates, hydrochlorides and carbonates, and vitamins may be appropriately contained.
  • cells may be separated from a cell line in which a plurality of microorganisms are mixed by an operation such as centrifugation and suspended again in a buffer system or the like.
  • a buffer various buffers such as a phosphate buffer, a carbonate buffer, a Tris * HCl buffer, a Tris * glycine buffer, a citrate buffer, a Dutt buffer and the like can also be used.
  • the concentration of the buffer solution is a concentration that does not inhibit hybridization, FRET phenomenon, and emission of fluorescent dye. Its concentration depends on the type of buffer.
  • the pH of the buffer is between 4 and 12, preferably between 5 and 9.
  • any method can be applied as long as it is a PCR method, the following describes the case where it is applied to a real-time quantitative PCR method.
  • PCR is performed using the nucleic acid probe for nucleic acid measurement of the present invention, and the decrease in the fluorescence intensity of the reaction system before and after the reaction is measured in real time.
  • the PCR of the present invention means PCR by various methods. Examples include RT-PCR, RNA-primed PCR, Stretch PCR, reverse PCR, PCR using an Alu sequence, multiplex PCR, PCR using mixed primers, and PCR using PN.
  • Quantitative means the quantitative measurement of the degree of detection in addition to the original quantitative measurement, as described above.
  • the target nucleic acid refers to a nucleic acid whose abundance is to be measured. With or without purification. Also, the magnitude of the concentration does not matter. Various nucleic acids may be mixed.
  • identification of amplification objectives in complex microbial systems mixture of multiple microbial RNAs or gene DNAs
  • symbiotic microbial systems multiple microbial and / or Z or mixed RNA or gene DNA of multiple microbes
  • the target nucleic acid can be performed by a conventionally known method.
  • the purification can be performed using a commercially available purification kit or the like.
  • PCR methods include dATP, dGTP, dCTP, dTTP or dUTP, target nucleic acid (DNA or RNA), Taq polymerase, primers, and nucleic acid probes labeled with fluorescent dyes.
  • the target nucleic acids when amplifying at least one or more target nucleic acids, are amplified using the nucleic acid probes of the present invention having at least the same number of species as the number of target nucleic acid species. Then, in the amplification process, the amount of decrease in the fluorescence intensity of the reaction system is measured at a wavelength of at least the same number as the number of species of the nucleic acid probe.
  • any of the nucleic acid probes for nucleic acid measurement of the present invention can be suitably used, but the number of bases is 5 to 50, preferably 10 to 25, particularly preferably Anything from 15 to 20 that hybridizes with the amplification product of the target nucleic acid during the PCR cycle may be used. Also, it may be designed as either a forward type or a reverse type.
  • the nucleic acid probe hybridizes to the target nucleic acid.
  • the base sequence of the probe is designed so that the probe-nucleic acid hybrid forms at least one G (guanine) -binding (cytosine) pair at the donor-dye labeling site. That is.
  • the donor dye labeling site is a G (guanine) or C (cytosine) base, or a phosphate group of a nucleotide having the base, or an OH group of ribose. Group.
  • the acceptor dye is at the 3 'end or in the chain without the 3' terminal base.
  • the acceptor dye is a nucleic acid probe that is labeled even closer to the donor-dye labeling site in the chain.
  • the dye dye is in the nucleic acid probe chain or 3 ′.
  • the nucleic acid probe that labels the base at the terminal is designed to be used as a primer.
  • the oligonucleotide which is a primer designed from the nucleotide sequence of the target nucleic acid
  • the object of the present invention can be suitably achieved. Even if 5′-guanylic acid or 5′-cytidylic acid is added to the 3 ′ end, the object of the present invention can be suitably achieved.
  • a nucleic acid probe designed so that the base at the 3 ′ or 5 ′ end is G or C is not only a probe designed from the base sequence of a target nucleic acid, but also a 5 ′ 5'-Guanylic acid or guanosine or 5'-Cytidylic acid or cytidine-added probe and 5'-terminal 5'-guanylic acid or 5'-cyclic acid or cytidine It is defined as including a probe obtained by adding tidylic acid.
  • the donor dye labels the 3 ′ terminal base (including the 3 ′ terminal base) or the 3 ′ terminal report or deoxylipose of the nucleic acid probe.
  • a nucleic acid probe in which the dye is labeled in the base of the nucleic acid probe or at the 5 'end of the nucleic acid probe is designed so as not to be used as a primer.
  • PCR is performed using one nucleic acid probe of the present invention instead of two probes (labeled with a fluorescent dye) used in a real-time quantitative PCR method using the FRET phenomenon. Add the probe to the PCR reaction system and perform PCR.
  • the probe hybridized to the target nucleic acid or amplified target nucleic acid is decomposed by polymerase and decomposed and removed from the nucleic acid hybrid complex.
  • the fluorescence intensity value of the reaction system or the reaction system in which the nucleic acid denaturation reaction is completed is measured.
  • a reaction system in which the target nucleic acid or the amplified target nucleic acid is hybridized with the probe an annealing reaction or a nucleic acid extension reaction until the probe is removed from the nucleic acid hybrid complex by a polymerase). Measure the fluorescence intensity of the reaction system.
  • the amplified nucleic acid is measured by calculating the reduction rate of the fluorescence intensity value from the former.
  • the probe is completely dissociated from the target nucleic acid or amplified target nucleic acid by a nucleic acid denaturation reaction, or decomposed and removed from the nucleic acid hybrid complex of the probe and the target nucleic acid or amplified target nucleic acid by polymerase during nucleic acid extension When this is done, the fluorescence intensity value is large.
  • the probe is sufficiently hybridized to the target nucleic acid or the amplified target nucleic acid.
  • the fluorescence intensity of the reaction system until it is decomposed and removed from the hybrid complex is smaller than the former.
  • the decrease in the fluorescence intensity value is proportional to the amount of the amplified nucleic acid.
  • the Tm of the nucleic acid hybrid complex when the probe hybridizes with the target nucleic acid is ⁇ 15 ° C, preferably ⁇ 5 ° C of the Tm value of the primer nucleic acid hybrid complex.
  • the nucleotide sequence of the probe of (2) be designed so as to fall within the range of (2). If the Tm value of the probe is less than 15 ° C, especially less than 15 ° C of the primer, the fluorescence of the fluorescent dye does not decrease because the probe does not hybridize. Conversely, if the Tm value of the primer exceeds + 5 ° C, especially + 15 ° C, the probe loses its specificity because it hybridizes with nucleic acids other than the target nucleic acid.
  • Probes other than the above (2), particularly the probe (1), are added to the PCR reaction system as primers.
  • the PCR method using a primer labeled with a fluorescent dye has not yet been known except for the present invention.
  • the amplified nucleic acid is secondarily labeled with a fluorescent dye useful in the practice of the present invention. Therefore, the fluorescence intensity value of the reaction system in which the nucleic acid denaturing reaction is completed is large, but the annealing system may have completed the annealing reaction. Decreases from strength.
  • the PCR reaction can be carried out under the same reaction conditions as in the ordinary PCR method.
  • the target nucleic acid can be amplified in a reaction system having a low Mg ion concentration (1 to 2 mM).
  • the present invention can also be carried out in a reaction system in the presence of a high concentration (2 to 4 mM) of Mg ions used in a conventionally known quantitative PCR.
  • the PCR of the present invention is performed, and the melting curve of the nucleic acid is analyzed for the amplified product at the wavelength of at least the same number of species as the used probe of the present invention.
  • This method is a novel method for analyzing melting curves of nucleic acids.
  • the nucleic acid probe used in the PCR method of the present invention or the nucleic acid probe of the present invention used as a primer can be suitably used.
  • the nucleic acid probe of the present invention by making the nucleotide sequence of the nucleic acid probe of the present invention a sequence complementary to the region containing SNP (snip; single nucleotide substitution polymorphism), after completion of PCR, the nucleic acid probe of the nucleic acid of the present invention can be used.
  • SNP By analyzing the dissociation curve, SNP can be detected from the difference in the dissociation curve. If a nucleotide sequence complementary to the sequence containing SNP is used as the sequence of the nucleic acid probe of the present invention, the Tm value obtained from the dissociation curve between the probe sequence and the sequence containing SNP indicates the dissociation between the probe sequence and the sequence not containing SNP. It is higher than the Tm value obtained from the curve.
  • the fifth invention of the present invention is an invention of a method for analyzing data obtained by the real-time quantitative PCR method.
  • the real-time quantitative PCR method is currently a computer that records and records the reaction equipment that performs PCR, the equipment that detects the emission of fluorescent dye, the user interface, that is, the data analysis method. It is a device that consists of a recording medium that can be read in the evening (also called the Sequence Detection Software System) and a computer that controls and analyzes the data, and is measured in real time. Thus, the measurement according to the invention is also performed with such a device.
  • the device used in the present invention may be any device as long as it can monitor PCR in real time.
  • an ABI PRISM TM 7700 base sequence detection system Sequence Detection System SDS 7700
  • SDS 7700 Sequence Detection System
  • LightCycler System Renishaw Diagnostics, Germany
  • the above-mentioned PCR reaction apparatus is an apparatus that repeatedly performs a thermal denaturation reaction, an annealing reaction, and a nucleic acid extension reaction of a target nucleic acid (for example, a temperature of 95 ° C., 60 ° C., and 72 ° C.). Can be done. Also detect The system consists of an argon laser for fluorescence excitation, a spectrograph, and a CCD camera. Furthermore, a computer-readable recording medium on which each procedure of the data analysis method is programmed and recorded is used by being installed in a computer, controlling the above system via the computer, and controlling the detection system from the detection system. It records a program that analyzes the output data.
  • a data analysis program recorded on a computer-readable recording medium uses a process of measuring the fluorescence intensity for each cycle, and measures the measured fluorescence intensity as a function of the cycle, that is, as a PCR amplification plot of the computer.
  • a process for displaying the top line a process for calculating the PCR cycle number (threshold cycle number: Ct) at which the fluorescence intensity starts to be detected, a process for creating a calibration curve for obtaining the copy number of the sample nucleic acid from the Ct value, It consists of process data and the process of printing plot values.
  • a calibration curve is created using a known number of copies of the target nucleic acid, and the Ct of the sample containing the unknown number of target nucleic acids is detected to calculate the copy number of the target nucleic acid at the start of PCR. it can.
  • a PCR-related invention such as a data analysis method is a method for analyzing data obtained by the real-time quantitative PCR method as described above. The features are described below.
  • the first characteristic is that in the method for analyzing data obtained by real-time quantitative PCR, when the amplified nucleic acid in each cycle binds to a fluorescent dye, or when the amplified nucleic acid is combined with the nucleic acid probe of the present invention,
  • This is a calculation process for correcting with the fluorescence intensity value, that is, a correction calculation process.
  • reaction system when the amplified target nucleic acid binds to the fluorescent dye or when the amplified target nucleic acid hybridizes with the nucleic acid probe of the present invention is specifically exemplified by 40 to 8 in each cycle of PCR.
  • the reaction system may be a nucleic acid extension reaction having a reaction temperature of 50 ° C., preferably 50 to 80 ° C., or a reaction system for a ring. And, it means a reaction system in which the reaction is completed. The actual temperature depends on the length of the amplified nucleic acid.
  • the reaction system when the above-mentioned fluorescent dye-nucleic acid complex or the above-mentioned nucleic acid hybrid complex is dissociated is a reaction system for heat denaturation of nucleic acid in each cycle of PCR, specifically, Is at a reaction temperature of 90 to 100 ° C. (preferably, 94 to 96 ° C.).
  • the correction calculation process in the correction calculation process may be any process as long as it meets the object of the present invention.
  • the correction calculation process includes a process according to the following [Equation 1] or [Equation 2]. Can be exemplified.
  • f den n the fluorescence intensity value of the reaction system when the photodye-nucleic acid complex or the nucleic acid hybrid complex dissociates in the nth cycle] It includes a sub-step of displaying the corrected calculation processing value on a computer display and displaying the Z or the value in the form of a graph in the same manner as a function of the number of cycles.
  • the second feature is that the correction calculation processing value obtained by [Equation 1] or [Equation 2] in each cycle is substituted into the following [Equation 3] or [Equation 4], and the fluorescence change rate or fluorescence change rate between each sample is obtained. Is a data analysis method that calculates and compares them.
  • f a a correction operation processing value according to [Equation 1] or [Equation 2], which is an arbitrary number of cycles before a change in f n is observed. Usually, for example, 10 to 40 cycles , Preferably 15 to 30 cycles, more preferably 20 to 30 cycles.
  • the calculated value obtained in the above process is displayed and printed or printed on a computer display, or the comparison value or the value is similarly displayed and / or graphed as a function of the number of cycles.
  • it includes a sub-step for printing, but the above-described sub-step may or may not be applied to the correction operation processing value obtained by [Equation 1] or [Equation 2].
  • the third feature is
  • A, b Any numerical value, preferably an integer value, more preferably a natural number.
  • the operation value obtained in each process is displayed on a computer display, and Z or the corresponding value is plotted as a function of each cycle number in the form of a graph. And may include a sub-step of displaying and / or printing as described above. Since the processed value obtained in the process of (3.4) needs to be printed at least, the process includes a sub-step of printing. In (3.4) above The obtained operation processing value may be further displayed on a display of a computer.
  • correction calculation processing value obtained by (Equation 1) or (Equation 2) and the calculation processing value obtained by (Equation 3) or (Equation 4) are displayed on a computer display in the form of a graph as a function of the number of cycles. Since they may or may not be displayed and / or printed, their display and / or substeps may be added as needed.
  • the data analysis method is particularly effective when the real-time quantitative PCR method measures the amount of decrease in the emission of a fluorescent dye.
  • a specific example thereof is the above-mentioned “real-time quantitative PCR method of the present invention”.
  • a fourth feature is that, in the real-time quantitative PCR analysis apparatus, the real-time quantitative PCR measurement and calculation means for executing the data analysis method for the real-time quantitative PCR method of the present invention are provided. And / or an analyzer.
  • a fifth feature is that a computer-readable recording medium that programs each procedure of a data analysis method for analyzing PCR using a real-time quantitative PCR analyzer and records the program is provided by the present invention.
  • This is a recording medium that can be read by a computer in which a program that enables a computer to execute each procedure of the data analysis method described above is readable.
  • a sixth feature is a method for analyzing a melting curve of a nucleic acid of the present invention, that is, a method for analyzing data obtained by a method of obtaining a Tm value of a nucleic acid by performing a PCR method of the present invention.
  • a step of gradually raising the temperature from a low temperature until the nucleic acid is completely denatured for example, 50 to 95 ° C.
  • Measuring the fluorescence intensity for example, at intervals corresponding to a temperature rise of 0.2 to 0.5 ° C.
  • displaying the measurement results on the display as a function of time The process of displaying the melting curve of an acid, the process of differentiating this melting curve to obtain a differential value (one dF / dT, F: fluorescence intensity, T: time), and using that value as a differential value on the display
  • the fluorescence intensity increases as the temperature increases.
  • a process of performing an arithmetic process of dividing the fluorescence intensity value at the end of the nucleic acid extension reaction in each cycle, preferably at the end of the PCR reaction by using the fluorescence intensity value at the time of the thermal denaturation reaction is added to the above process. A more favorable result is obtained.
  • the data analysis method of the novel PCR method of the present invention and the method of analyzing the melting curve of a nucleic acid of the present invention are added to the data analysis method of the present invention.
  • a seventh feature is that a computer-readable recording medium that records a program that enables a computer to execute each step of the method for analyzing a melting curve of a nucleic acid of the present invention;
  • This is a computer-readable recording medium in which a program that allows a computer to execute each of the steps is added and recorded.
  • the data analysis method, device, and recording medium of the present invention are used in various fields such as medicine, forensic medicine, anthropology, ancient biology, biology, genetic engineering, molecular biology, agriculture, and plant breeding. it can. Also referred to as a complex microbial system or a symbiotic microbial system, a microorganism in which various types of microorganisms are mixed or at least one type of microorganism is mixed with cells derived from other animals or plants and cannot be isolated from each other. It can be suitably used for systems and the like.
  • the microorganisms referred to here are generally referred to as microorganisms, and are not particularly limited. For example, eukaryotic microorganisms, prokaryotic microorganisms, other mycoplasmas, and microorganisms. Luz, rickshaw and the like.
  • 5 S rRNA, 16 S r RNA or 23 S rRNA of a specific strain in a complex microbial system or a symbiotic microbial system is used.
  • the abundance of the specific strain in the system can be measured. This is because the number of copies of the 5S rRNA, 16SrRNA or 23SrRNA gene DNA is constant depending on the strain.
  • Example 1 Example 1
  • the nucleic acid probe of the present invention was synthesized in the following order, assuming that the base sequence of the target nucleic acid A was (5 ′) tgc cat ccc etc aat gg (3 ′) composed of oligodeoxyliponucleotide.
  • the base sequence of the nucleic acid probe could be simply designed as (5 ') cca ttg agg g gga tgg ca (3') comprising oligodeoxyliponucleotide. Further, the nucleic acid probe of the present invention was designed as follows. Dona dye BODIPY FL (Molecular Probes, USA) was added to the phosphoric acid at the 5 'end, and axe dye B0DIPY 581 was added to the C-H group at position 6 of the 4th thymine base ring from the 5' end.
  • Dona dye BODIPY FL Molecular Probes, USA
  • an oligonucleotide having the following nucleotide sequence was synthesized using a DNA synthesizer (ABI 394) (Pakkin Elmer Japan Applied Co., Ltd.).
  • the phosphate group is the linker 1- (CH 2 ) 6 -SH
  • the ⁇ H group at the 6-position C of the base ring of the fifth and fourth terminal thymine is linker 1- (CH 2 ) 7 -NH 2
  • the synthesis of DNA was carried out at the 5'-terminal Tr ON by the / 3-cyanoethyl phosphoramidite (2_cyanoethyl phosphoramidite) method. After the synthesis, the protecting group was removed with 28% aqueous ammonia at 55 ° C for 5 hours.
  • the synthetic oligonucleotide obtained above was dried to obtain a dried product.
  • the lysate was subjected to gel filtration using an AP-10 column (Pharmacia) to remove unreacted substances.
  • reaction product was subjected to gel filtration with NAP-25 (Pharmacia) to remove unreacted substances. Then, the protecting group was eliminated with 2% TFA.
  • SEP-PAC C 1 S force By reverse phase HPLC using a ram, the oligonucleotide linker one - (CH) 7 - to the fractionated the desired product which was bound to Akuseputa dye B0DIPY 581/591 min. The fraction was subjected to gel filtration with NAP-10 (Pharmacia).
  • the gel filtrate was dried and dissolved in 150 L of sterilized water (oligonucleotide B solution).
  • BODIPY FL-Chlor ide (Molecular Probes Inc., USA) of lmg was dissolved in DMF and 100 L, the oligonucleotide B solution, 1 3 ⁇ 41 11 (: 0 3 / ⁇ 2 (; 0 3 Buffers one 150 1 ⁇ pressurized ⁇ After stirring, the mixture was reacted at room temperature for 1 ⁇ , and the donor dye BODIPY FL was bound to the linker 1- (CH 2 ) 6 -SH at the 5 'end.
  • the reaction product was subjected to gel filtration with NAP-25 (manufactured by Pharmacia) to remove unreacted substances.
  • the same reverse-phase HPLC was performed as described above, and the oligonucleotide was obtained by binding the above-mentioned dye BODIPY 581/591 to the fourth thymine base from the 5 ′ end, and the donor dye BODIPY FL was added to the 5 ′ end.
  • the nucleic acid probe of the present invention that is, the nucleic acid probe 1 of the present invention labeled with a donor dye and an acceptor dye was obtained.
  • the nucleic acid probe of the present invention was eluted later than the oligonucleotide to which the receptor dye was bound.
  • Quantification of the nucleic acid probe of the present invention was performed by measuring a value of 260 nm with a spectrophotometer.
  • the probe was subjected to scanning with an absorbance of 650 to 220 nm using a spectrophotometer, and as a result, it was confirmed that B0 DIPY FL> BODIPY 581/59 KDNA was absorbed.
  • the purity of the purified product was determined using the same reverse-phase HPLC as described above, and as a result, it was confirmed that the purified product was a syndal peak.
  • Elution solvent B (Gradient '(gradient)): 0.05N TEAA 40% CH 3 CN
  • nucleic acid was synthesized by the same procedure as for nucleic acid probe 1, except that the 5'-terminal phosphoric acid group was labeled with the donor dye BODIPY FL.
  • the synthesis was carried out in the same manner as for nucleic acid probe 1, except that the phosphoric acid group at the 5 'end was labeled with the receptor dye BODIPY 581/591.
  • oligonucleotide having a base sequence of (5 ′) tgc cat ccc etc aat gg (3 ′) was synthesized in the same manner as in the synthesis of the above-described oligonucleotide, and used as a target nucleic acid of the present invention.
  • nucleic acid probe 1 or nucleic acid probe 2 (IOM) solution of the present invention was added thereto, and the mixture was stirred (nucleic acid probe final concentration: 40 nM) and kept at 30 ° C to reduce the fluorescence wavelength. Scanned (encouraging Emission wavelength: 49 Qnm (8 nm width)), measured fluorescence wavelength: 58 Gnm (8 nm width). Then, after controlling the reaction system to 60 ° C., 32.
  • reaction temperature The temperature of the cell (reaction temperature) was controlled using a low temperature circulator PCC-7000, a crystallization program manufactured by Tokyo Scientific Instruments, as a constant temperature cell holder.
  • the fluorescence was measured using a Fluorometer LS50B manufactured by PerkinElmer Inc. Table 1: Change in fluorescence intensity at 580 nm before and after hybridization (HYB)
  • Fluorescence intensity decrease Fluorescence intensity value before HYB — Fluorescence intensity value after HYB
  • Fluorescence intensity decrease Fluorescence intensity value before HY B-fluorescence intensity value after HY B
  • Reduction rate Fluorescence intensity reduction amount Fluorescence intensity value before ZHYB Table 1 shows the measurement of the fluorescence intensity of Axep-Yuichi dye BOD I PY 581/591, and Table 2 shows the measurement of the fluorescence intensity of the donor dye. is there.
  • the fluorescence intensity of the receptor dye before hybridization is extremely high in the experimental system of nucleic acid probe 1 + target nucleic acid compared to that in the experimental system of nucleic acid probe 2 + target nucleic acid. Understand. This is because in nucleic acid probe 1, FRET occurred between the donor dye BOD I PY FL and the excipient dye B0D I PY 581/591, causing the exciter dye to emit light. Things. On the other hand, since nucleic acid probe 2 does not have a donor dye in the molecule, no FRET phenomenon occurred and no fluorescence was emitted.
  • nucleic acid probe 1 + target nucleic acid experimental system After eight hybridizations, there was a significant decrease in the nucleic acid probe 1 + target nucleic acid experimental system.
  • the experimental system of the fluorescence intensity of the nucleic acid probe 2 + target nucleic acid hardly changed. This is a nucleic acid probe 1 This is because the energy was transferred to the GC hydrogen bond because the donor dye approached the GC hydrogen bond due to the hybridization of the target nucleic acid and the target nucleic acid.
  • the fluorescence intensity of the donor dye before hybridization is extremely higher in the experimental system of nucleic acid probe 1 + target nucleic acid than in the experimental system of nucleic acid probe 2 + target nucleic acid. This is because in the nucleic acid probe 1, the FRET phenomenon occurred between the donor dye BODIPY FL and the receptor dye B0DIPY 581/591, and the energy of the donor dye was transferred to the receptor dye. Things. On the other hand, since nucleic acid probe 3 does not have an acceptor dye in the molecule, the FRET phenomenon did not occur and fluorescence was emitted.
  • the nucleic acid probe of the present invention was designed such that when hybridized to the target nucleic acid, the fluorescence intensity of both the donor dye and the dye was reduced.
  • an oligodeoxyliponutide having a base sequence of target nucleic acid B (5 ′) aacgat gcca tggatttgg (3 ′) was synthesized.
  • X-dipamine was labeled as a dye
  • BODIPY FL was labeled as a donor dye, to prepare a nucleic acid probe 4 of the present invention that hybridizes to the target nucleic acid B.
  • Nucleic acid probe 4 had the following structure: BODIPY FL- (5 ') ccaaat (X-Rhod amine) ccat ggcatca 11 (3).
  • the fluorescence intensity was measured while keeping the temperature at 45 ° C. (Probe 1: fluorescence measurement wavelength,
  • Probe Measurement wavelength, 610 nm (5 nm width); Excitation wavelength (common): 490 nm (8 nm width)).
  • 32.0 iL of each solution of target nucleic acids A and B was added to each concentration shown in Table 3 and stirred. Then, the fluorescence intensity was measured. Table 3 shows the results.
  • Table 3 Fluorescence intensity change at 58 Onm before and after hybridization (HYB) and at 610 nm (excitation for the former 49 OMJ excitation for the latter 49 Onm)
  • Fluorescence intensity decrease Fluorescence intensity value before HYB minus fluorescence intensity value after HYB
  • the fluorescence intensity at 580 nm and 610 nm decreases according to the concentration of the added target nucleic acid after hybridization.
  • the excitation light at 490 nm and the fluorescence intensity at 58 O nm are those of the probe 1 of the present invention, and those at 61 O nm are those of the probe 4 of the present invention.
  • the nucleic acid probe of the present invention when hybridized to the target nucleic acid, the fluorescence intensity before and after the hybridization is reduced, and the fluorescence intensity of both the donor dye and the receptor dye is significantly reduced. A small amount of target nucleic acid can be measured accurately, conveniently and in a short time.
  • the type of the donor dye is limited because the energy can be transferred to the GC hydrogen bond, but the type of the acceptor dye does not need to have such a property.
  • Various dyes can be used as long as they have the above. This means that in the present invention, nucleic acid probes (different fluorescent wavelengths) that emit various fluorescent colors with one donor dye (one excitation wavelength) can be produced. This simplifies the optical system for excitation, since a nucleic acid measuring apparatus for measuring various types of nucleic acids may be provided with an excitation laser—the type. In other words, the design and manufacture of the nucleic acid measurement device become easy.
  • nucleic acid probes can be used even with a simple nucleic acid measuring device having only a single excitation laser having a single wavelength, multiple types of target nucleic acids can be measured simultaneously.

Description

明細書 新規核酸プローブおよびそれを用いる新規核酸測定方法 技術分野
本発明は、 測定系に少なく とも一種以上 （すなわち、 単数または複 数の） の標的核酸が存在する場合に、 単純な装置で系内に存在する標 的核酸を測定する（複数の標的核酸が存在する場合は同時に測定する） ための新規核酸プローブ、 そのプローブを用いた新規核酸測定方法な どに関する。
詳しくは Fors ter (または f luorescence) resonance energy transfe r (以下 FRETという。 ) 現象を引き起こす蛍光色素ペア一すなわち ドナ —色素になり得る蛍光色素 （以下、 ドナー色素という。 ） とァクセプ 夕一色素になり得る蛍光色素 （以下、 ァクセプ夕一色素という。 ） の ペア一を少なく とも一ペア一を形成するように複数の蛍光色素で標識 された一本鎖の核酸測定用の新規核酸核酸プロ一ブ、 当該核酸プロ一 ブを用いる核酸測定方法、 その方法に用いる核酸測定用試薬キッ ト、 および標的核酸の多型 （polymorphism) または/および変異 （mutati on) を解析もしくは測定する方法、 ならびにそれに利用する測定キッ ト、 などに関する。 背景技術
一本鎖のオリゴヌクレオチドに、 FRET現象を引き起こす蛍光色素べ ァ一すなわち ドナ一色素であるフルォレセインとァクセプ夕一色素で ある X—ローダミンを結合した核酸プローブは知られている （実験医 学、 1 5巻 （N o . 7、 増刊号） 、 7 2 8〜 7 3 3、 1 9 9 7年） 。 しかしこの核酸プローブは、 P C R方法のモニタリ ングに使用するも のであり、 直接核酸を測定することを目的としたものではない。 標的核酸の検出に利用された例もある （Biochemistry, 34巻、 285 〜292頁、 1995年） 。 この場合においては、 核酸プローブが標的核酸に ハイブリダィズしていないときは、 FRET現象により当該核酸プロ一ブ 自体の蛍光強度は低いレベルにある。 すなわち、 フルォレセインの発 光は抑制されて、 蛍光強度は低いレベルにある。 一方、 X—ローダミ ンの蛍光強度は高いが、フルォレセインの抑制された発光程ではない。 しかし、 この核酸プローブが標的核酸にハイブリダィズすると、 プロ ーブの立体構造が変化し、 FRET現象が解消する。 その結果として、 フ ルォレセインの発光が増加して、 反応系の蛍光強度が増加する。 しか しながら、 ハイブリダィゼ一シヨ ン後、 核酸プローブの立体構造が変 化しない場合は蛍光強度に変化が生じないこと'になり、 蛍光強度は核 酸測定に適したものではなかった。
本発明者らは、 他の核酸プローブの介在なしに、 標的核酸とハイブ リダイズしたときに当該ハイブリダイゼーショ ン後蛍光発色が減少す る蛍光消光プローブなる核酸プロ一ブを開発してきた（ Nuc 1 e i c Acid, 29卷、 Nol.6e34、 2001年 ； EP1 046 717 A9； 特開 200卜 286300 (P200卜 2 86300A) 。 この核酸プローブは一本鎖のオリゴヌクレオチドの末端部 に蛍光色素が標識されていて、 標的核酸にハイブリダィズすると、 蛍 光強度が減少するように蛍光色素と塩基配列が設計されている。 こ の核酸プロ一プは標的核酸を微量で正確、 簡便に測定できる。 しかし ながら、 本従来方法は、 二本鎖オリゴヌクレオチド形成時における G (グァニン） と C (シトシン） の塩基対複合体 （水素結合体） と蛍光 色素の相互作用による蛍光消光 （当該複合体への発光エネルギー転移 による消光） 現象を利用したものであり、 本現象により消光するよう な蛍光色素は比較的少ないために使用可能な蛍光発光色が限定される。 測定系に多種類の標的核酸が存在する場合、 これらを全て同時測定 するためには、 標的核酸と同数の蛍光発光色を必要とする。 言い換え ると、 標的核酸種と同数の蛍光発光色の異なる核酸プローブを必要と する。 本従来方法において、 蛍光発光色を増やすためには、 前記 G C の_水素結合体と蛍光色素の相互作用が発生しかつ蛍光発光色の異なる 蛍光色素を増やすことが必要となるが、 使用可能な蛍光発光色が限ら れるため、 これまで複数 （特に 3種以上） の標的核酸種を同時検出す るには限界があった。 さらに、 蛍光色素が異なるということは、 励起 波長も異なるという ことを意味し、 それらの蛍光色素を全て励起する ためには、 励起光源が多数必要になることを意味し、 装置が大掛かり となるために.非経済的であった。
本発明の課題は、 前記の状況に鑑み、 一本鎖のオリゴヌクレオチド に FRE T現象を引き起こす蛍光色素ペア一すなわち ドナー色素とァクセ プ夕一色素を結合した核酸プローブにおいて、 簡単な測定装置で、 少 なく とも一種以上 （すなわち、 単数または複数） の標的核酸を同時に 測定でき、 かつ微量で、 短時間、 簡便、 正確に測定できる核酸測定用 の新規核酸プローブ （以下、 核酸測定用の新規核酸プローブを単に核 酸プローブという場合がある。 ） を提供することである。 さらに、 そ れを用いた新規核酸測定方法 （以下、 単に核酸測定方法という場合が ある。 ） ならびにその試薬キッ ト、 および標的核酸の多型 · 変異の測 定方法ならびにその測定キッ トなどを提供することである。 発明の開示
本発明者らは、 前記課題を解決するにあたり、 前記蛍光消光プロ一 ブを基本に、 試行錯誤的に一本鎖オリゴヌクレオチドを種々の蛍光色 素を用いて、 オリゴヌクレオチドの 2箇所を標識して作製した種々の 核酸プローブについて詳しく比較検討した。 その結果、 特定の ドナー 色素とそれと対をなすァクセプ夕一色素を用いてオリ ゴヌク レオチド の特定の位置を標識すると、 その核酸プローブが標的核酸にハイプリ ダイズすると、 ハイブリダィゼーシヨ ン前後でプロ一ブ · 核酸'複合体 (核酸プローブが標的核酸に八ィブリダィズしたもの） におけるァク セプ夕一色素の蛍光強度が著しく減少するか、 またはドナーおよびァ クセプター色素の蛍光強度が共に著しく減少するということを知見し た。 本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。
すなわち、 本発明は、
1. FRET現象を引き起こす蛍光色素ペア一すなわち ドナー色素になり 得る蛍光色素 （以下、 ドナー色素という。 ） とァクセプター色素にな り得る蛍光色素 （以下、 ァクセプ夕一色素という。 ） のペア一を少な く とも一ペア一を形成するように複数の蛍光色素で標識された一本鎖 の核酸プローブにおいて、 当該プローブが標的核酸にハイブリダイズ したときに、 ァクセプター色素の蛍光強度が減少するように塩基配列 が設計され、 かつ前記色素が標識されていることを特徴とする核酸プ ローブ、 また、
2. ドナ一色素およびァクセプ夕一色素の蛍光強度が共に減少する前 記 1 に記載の核酸プローブ、 また、
3. ドナ一色素となり得る蛍光色素が BODIPY FL> B0DIPY 493/503, 5- FAM、 Teiramethylrhodamine,または 6-TAMRAである前記 1 または 2 に記 載の核酸プローブ、 また、
4. ドナ一色素とァクセプター色素の一対の色素ペア一を有する前記 ；！〜 3のいずれか一に記載の核酸プローブ、 また、
5. 核酸プローブが、 その末端部においてドナー色素で標識されてお り、 当該核酸プローブが当該末端部において標的核酸にハイプリダイ ズしたとき、 当該プローブに Λイブリダイズした標的核酸の末端塩基 から 1ないし 3塩基離れて、 標的核酸の塩基配列に G (グァニン） が 少なく とも 1塩基存在するように、 当該プロ一ブの塩基配列が設計さ れている前記 1〜 4のいずれか一に記載の核酸プロ一ブ、 また、
6. 核酸プローブが、 標的核酸にハイブリダィゼ一シヨ ンしたとき、 ドナ一色素標識部においてプローブ一核酸ハイブリ ツ ドの複数塩基対 が少なく とも一つの G (グァニン） と （シトシン） のペア一を形成 するように、 当該プロ一ブの塩基配列が設計されている前記 1〜 5 の いずれか一に記載の核酸プローブ、 また、
7. ドナー色素が核酸プローブの 5 ' 末端部 （ 5 ' 末端を含む。 ） を 標識している前記 1〜 6のいずれ.か一に記載の核酸プローブ、 また、 8. ドナー色素が核酸プローブの 3 ' 末端部 （ 3 ' 末端を含む。 ） を 標識している前記 1〜 7のいずれか一に記載の核酸プローブ、 また、
9. 核酸プローブの 5 ' 末端塩基が Gまたは Cで、 かつ 5 ' 末端がド ナ一色素で標識されている前記 7に記載の核酸プローブ、 また、
1 0. 核酸プローブの 3 ' 末端塩基が Gまたは Cで、 かつ 3 ' 末端が ドナ一色素で標識されている前記 8に記載の核酸プローブ、 また、
1 1 . 少なく とも一種以上の標的核酸が存在する測定系に、 前記 1〜 1 0の少なく ともいずれか一に記載の核酸プローブであって、 当該標 的核酸にハイブリダィズする核酸プローブで、かつ標的核酸の種類（以 下、 単に種ともいう。 ） の数と少なく とも同数の種の数でかつ発光蛍 光色の異なる核酸プローブを存在させ、 核酸プローブと標的核酸をハ イブリダィズさせて、 核酸プローブの種類 （以下、 単に種ともいう。 ） の数と少なく とも同数の種類 （以下、 単に種ともいう。 ） の数の波長 で、 ハイブリダィゼーシ.ヨ ン前後における測定波長の蛍光強度の減少 量を測定することを特徴とする核酸測定方法、 また、
1 2. 少なく とも一種以上の標的核酸が存在する測定系における標的 核酸の濃度を測定するキッ トにおいて、 前記 1〜 1 0の少なく ともい ずれか一に記載の核酸プローブを含有または付帯することを特徴とす る核酸測定用キッ ト、 また、
1 3. 少なく とも一種以上の標的核酸が存在する測定系における標的 核酸の多型 （polymorphism) または Zおよび変異 （mutation) を解析 もしくは測定する方法において、 前記 1〜 1 0の少なく ともいずれか 一に記載の核酸プローブであって、 標的核酸の種の数と少なく とも同 数の種の数で、 かつ発光蛍光色の異なる核酸プローブを測定系に存在 させ、 標的核酸と核酸プロ一ブを八イブリダィズさせて、 核酸プロ一 ブの種の数と少なく とも同数の種の数の波長で、 ハイブリダィゼーシ ョン前後における測定波長の蛍光強度の減少量を測定することを特徴 とする標的核酸の多型または/および変異を解析もしくは測定する方 法、 また、
1 4 . 少なく とも一種以上の標的核酸が存在する測定系の標的核酸の 多型または および変異を解析もしくは測定する測定キッ トにおいて 前記 1〜 1 0の少なく ともいずれか一に記載の核酸プローブを含有ま たは付帯することを特徴とする標的核酸の多型または Zおよび変異を 解析もしくは測定するための測定キッ ト、 また、
1 5 . 前記 1 1 または 1 3 に記載の核酸測定方法において、 標的核酸 が、 純粋分離して得た微生物由来、 または動物由来であることを特徴 とする核酸測定方法。 1 6 . 標的核酸が、 複合微生物系、 または共生 微生物系の細胞内もしくは細胞のホモジネートに含まれる核酸である 前記 1 1 または 1 3 に記載の核酸測定方法、 を提供する。 発明を実施するための最良の形態
次に好ましい実施の形態を挙げて本発明を更に詳細に説明する。 本発明の第 1発明は、 FRET現象を引き起こす蛍光色素ペア一すなわ ち ドナ一色素とァクセプター色素のペア一を少なく とも一ペア一を形 成するように複数の蛍光色素で標識された一本鎖の核酸プローブにお いて、 当該プローブが標的核酸にハイブリダィズしたときに、 プロ一 ブー核酸ハイブリ ツ ド複合体のァクセプ夕一色素の蛍光強度が減少す るように、 前記蛍光色素が標識され、 かつ塩基配列が設計されている ことを特徴とする核酸プローブである。 その中でも好ましい核酸プロ ーブは、 ドナーおよびァクセプ夕一色素の蛍光強度が共に減少するよ うに設計されたものである。
本発明において、 プローブ一核酸ハイブリ ッ ド複合体とは、 本発明 の核酸プローブが標的核酸とハイブリダィズした状態のもの（複合体） のことを云う。 そして簡便化のために、 以下、 核酸ハイプリ ッ ド複合 体と略称する。
また、 本発明において、 D NA、 R NA、 c D N A、 mR N A、 r R NA、 X T P s 、 d X T P s 、 NT P s 、 d.N T P s 、 核酸プロ一 ブ、 ヘルパー核酸プロ一ブ （または核酸へルパープ口一ブ、 または単 にヘルパープローブ） 、 ハイブリダイズ、 ハイブリダィゼーシヨ ン、 インターカレー夕一、 プライマー、 アニーリ ング、 伸長反応、 熱変性 反応、 核酸融解曲線、 P C R、 R T— P C R、 R N A - primed P C R， Stretch P C R、 逆 P C R、 A l u配列を利用した P C R、 多重 P C R、 混合プライマ一を用いた P C R、 P NAを用いた P C R法、 ハイ ブリダィゼーショ ンアツセィ方法 （hybridization assays) > F I S H (fluorescent in situ hybridization ass.ays)方法、 P C R方法 (poly mer ase chain assays ) 、 L C R方法 ( 1 igase chain r eac t i on) > S D方法（strand displacement as s ay s)、競合的ハイブリダィゼーショ ン方法（ competi tive hybr i d i za t i on)、 D N Aチップ、 核酸検出用 （遺 伝子検出用） デバイス、 S N P (スエップ ： 一塩基置換多型） 、 複合 微生物系等の用語は、 現在、 分子生物学、 遺伝子工学、 微生物工学等 で一般的に使用されている用語と同じ意味である。
本発明において核酸測定とは、 標的核酸を定量をすることもしく は 定量的検出をすること、 または単なる検出をすることを云う。
本発明において標的核酸とは、 核酸測定を目的とする核酸もしく は 遺伝子のことをいう。 精製の有無を問わない。 また、 濃度の大小も問 わない。 標的核酸以外の各種の核酸が混在していてもよい。 そして、 測定系には、 少なく とも一種以上の標的核酸が存在する。 例えば、 複 合微生物系 （複数微生物の R NAもしくは遺伝子 D N Aの混在系） ま たは共生微生物系 （複数の動植物および Zまたは複数の微生物の R N Aもしくは遺伝子 D N Aの混在系） における測定を目的とする少なく とも一種以上の特定核酸である。 尚、 標的核酸の精製が必要な場合は 従来公知の方法で行う ことができる。 例えば、 市販されている精製キ ッ ト等を使用して行う ことができる。 上記の核酸の具体例として、 D NA、 R NA、 P NA、 オリゴデォキシリポヌクレオチド （oligodeo xyribonucleot ides),ォリ ゴリホヌクレオチド、oligoribonucleotide s) 等、 また、 前記核酸の化学的修飾核酸を挙げることができる。 化学 的修飾核酸として 2' メチル （M e ) R N A等を例示することができ る。
本発明における FRET現象においてドナー色素となり得る ドナー色素 とは、 少なく とも、 a . 特定波長で励起され、 特定波長で発光する、 b . 発光エネルギーを特定の色素 （ァクセプター色素になり得る色素） に転移することができる、 c . 核酸プローブが標的核酸とハイブリダ ィズしたときに生ずる G C塩基対の複合体（G C塩基対の水素結合体） (以下簡便のため、 G C水素結合体という場合もある。 ) 、 ドナ一色 素の近旁に存在するときは当該塩基対の方へエネルギーを転移するこ とができる、 などの条件を充たすものと定義される。 すなわち、 この 条件を充たす色素であればどのようなものでもよい。 一般に、 FRET現 象においてドナー色素となり得る色素で、 それ自体を単独で標識した 核酸プロ一ブが標的核酸にハイブリダィズしたときにプローブ一核酸 ハイブリ ッ ド複合体の蛍光強度が減少するものが好適に用いられる（N ucleic Acid, 29巻、 Nol.6e34、 2001年） 。
例えば、 ドナー色素としては、 B0DIPY FL (商標名 ； モレキュラー · プローブ（Molecular Probes)社製、 米国） 、 BOD IPY 493/503 (商標名 ； モレキュラー · プロ一ブ （Molecular Probes)社製、 米国） 、 5- FAM、 T etramethylr odamine> 6-TAMRA, フルォレセイ ン （fluorescein) また はその誘導体類 （例えば、 フルォレセインイソチオシァネ一ト （fluo rescein isothiocyanate) (FITC) もしくはその誘導体等、 Mexa 488、 Al exa 532、 cy3> cy5、 EDANS(5-(2' -ami noe t hy 1) am i no-1 -nap t ha 1 en e sulfonic acid)) , ローダミン （ rhodamine) 6G (R6G)またはその誘導 体 （例えば、 テトラメチル口一ダミンイソチオシァネート（ t e t r ame t h ylrhodamine i so ih i ocyana ί e) (TMRITC) > ポデピー（BODIPY) FL/C3 (商 標名 ； モレキュラー · プローブ（Molecular ： Probes)社製、 米国） 、 ポ デピ一（B0DIPY)FL/C6 (商標名 ； モレキュラー · プロ一ブ（Mo 1 ecul ar Probes)社製、 米国） 、 ポデピー（BODIPY) 5-FAM (商標名 ； モレキユラ — · プローブ（Molecular Probes)社製、 米国） 、 ポデピー（BOD I PY) TM R (商標名 ； モレキュラー ' プローブ（Molecular Probes)社製、 米国） . またはその誘導体 （例えば、 ポデピー（BODIM)TR (商標名 ； モレキュ ラー · プロ一ブ（Molecular Probes)社製、 米国） 、 ポデピー（BODIPY) R6G (商標名 ； モレキュラー · プローブ （Molecular Probes)社製、 米 国） 、 ポデビ一 （BODIPY) 564 (商標名 ； モレキュラー · プローブ（Mo 1 ecular Probes)社製、 米国） 、 ポデピー（BODIPY) 581/591 (商標名 ； モ レキユラ一， プローブ（Molecular Probes)社製、 米国） 等を挙げるこ とができる。
前記の中でも好適なドナー色素として、 BODIPY FL (商標名 ； モレキ ユラ一 · プローブ（Molecular Probes)社製、 米国） 、 BODIPY FL系の前 記色素 （商標名 ； モレキュラー · プローブ （Molecular Probes)社製、 米国） 、 BODIPY 493/503 (商標名 ； モレキュラー · プローブ （Molecu lar Probes)社製、 米国） 、 5-FAM、ポデピー（BODIPY) 5- FAM (商標名；モ レキユラ一 · プローブ（Molecular Probes)社製、米国）、 Tetramei ylr hodamine, 6- TAMRAなどを、 より好適なものとして、 BODIPY FL (商標 名 ； モレキュラー · プロ一ブ （Molecular Probes) 社製、 米国） 、 B0 DIPY 493/503 商標名 ； モレキュラー · プローブ （Molecular Probes) 社製、 米国） 、 5- FAM、 Tetramethylrhodamine^ 6- TAMRAなどを挙げる ことができる。 しかしながら、 本発明において、 これらの例示に限定 されるものではない。
またァクセプ夕一色素は一般に FRET現象において、 ドナー色素との 対.において、 ァクセプ夕一色素となり得る色素、 すなわち、 ドナー色 素からエネルギー転移を受け得る （言葉を換えると ドナー色素に対し てクェンチング （消光作用） 作用をする） 色素であればどのようなも のでもよい。 そして、 対を形成する ドナー色素の種類に依存する。 強 いて例示するならば、 BODIPY FL (商標名 ； モレキユラ一 · プローブ （M olecular Probes) 社製、 米国） 、 BODIPY FL系の前記色素 （商標名 ； モレキュラー · プローブ （Molecular Probes)社製、 米国） 、 B0DIPY 493/503 (商標名 ； モレキユラ一 · プローブ （Molecular Probes) 社製、 米国） 、 5- FAM、 ポデピー （BODIPY) 5-FAM (商標名 ； モレキュラー ' プ ローブ （Molecular Probes) 社製、 米国） 、 Tetramethylrhodamine> 6 - TAMRAなどを ドナ一色素とするならば、 X—ローダミン（rhodamine)、 B0DIPY 581ノ591 (商標名；モレキュラー ·プローブ（Molecular Probes) 社製、米国）などをァクセプター色素とすることができる。 しかしなが ら、 本発明において、 これらの例示に限定されるものではない。
標的核酸にハイブリダィズさせる本発明の核酸プローブは、 オリゴ デォキシリポヌクレオチドで構成されていてもよいし、 オリゴリボヌ クレオチドで構成されていてもよい。 また、 それらの両方を含むキメ リ ックオリゴヌクレオチド (chimeric ol igonucleodi te) でもよレ 。 それらのオリゴヌクレオチドは化学的修飾を受けたものでもよい。 化 学的修飾を受けたオリゴヌクレオチドをキメリ ックオリゴヌクレオチ ドの鎖中に介在させてもよい。
前記の化学的修飾を受けたオリゴヌクレオチドの修飾部位として、 オリゴヌクレオチド末端部の末端水酸基もしくは末端リン酸基、 イン ターヌクレオシドリン酸部位、 ピリミジン環の 5位の炭素、 ヌクレオ シドの糖 （リポースもしくはデォキシリポ一ス） 部位を挙げることが できる。 好適にはリポースもしくはデォキシリポース部位を挙げるこ とができる。 具体的には、 2' アルキルオリゴリポヌクレオチド（2' -O-alkyloligoribonucleotides) (以下、 2' -0-を 2-0-に略記する。 ） . 2 - 0-アルキレンオリゴリボヌクレオチド （2- 0- alkyleneoligor ibonuc leotides)、 2-0-ベンジルォリゴリポヌクレオチド（2- 0_benzy 1 o I i gor i bonucleotides)を例示することができる。当該オリゴヌクレオチドは、 オリゴリポヌクレオチドの任意の位置の単数もしく は複数のリボース の 2 ' 位炭素の O H基がアルキル基、 アルキレン基もしくはベンジル 基で修飾 （ェ一テル結合で） されているものである。 本発明において は、 好適には、 2-0-アルキルオリゴリポヌク レオチドのなかでも、 2 - 0-メチルオリ ゴリボヌクレオチド、 2-0 -エヂルオリゴリボヌク レオチ ド、 2-0-ブチルオリゴリポヌクレオチド、 2-0-ベンジルォリ ゴリポヌ クレオチドが、 2-0-アルキレンオリゴリポヌクレオチドの中では、 2 - 0 -ェチレンオリゴリポクレオチドが、 および 2-0-ベンジルォリゴリポ ヌクレオチドが、 特に好適には、 2-0-メチルオリゴリポヌクレオチド (以下、 単に 2- 0-Meオリゴリポヌクレオチドと略記する。 ） が用いら れる。 このような化学的修飾を、 オリゴヌクレオチドに施すことによ り、 標的核酸との親和性が高まり、 本発明の核酸プローブのハイプリ ダイゼーショ ン効率が向上する。 ハイブリダィゼーシヨン効率が高ま ると、 本発明の核酸プローブの蛍光色素の蛍光強度の減少率が更に向 上するので、 標的核酸の濃度の測定精度が更に向上する。
なお、 本発明において、 オリゴヌクレオチドなる用語は、 オリ ゴデ ォキシリポヌクレオチドまたはオリゴリポヌクレオチドもしくはその 双方を意味するもので、 それらを総称するものとする。
2 - 0-アルキルオリゴリポヌクレオチド、 2-0-アルキレンオリゴリポ ヌクレオチド、 2-0-ベンジルオリゴリポヌクレオチドは、 公知の方法 (Nucleic Acids Research, 2 6巻、 2 2 2 4〜 2 2 2 9ページ、 1 9 9 8年） で合成できる。 また、 GENSET (株式会社） （フランス） が委 託合成を行っているので、 容易に入手できる。 本発明者らは当該会社 に当該化合物の合成を委託して実験を行って、 本発明を完成した。 尚、 2-0-メチルオリゴリポヌクレオチド （以下、 単に 2-0- Meオリゴ リポヌクレオチドという。 ） のような修飾された R NAをオリ ゴデォ キシリポヌク レオチドの中に介在させた本発明の核酸プローブは主に R N A特に r R N Aの測定に用いると好ましい結果が得られる。
本発明の核酸プローブを使用して R N Aを測定する場合、 当該プロ ーブとハイブリダィズさせる前に、 試料である R N A溶液を、 8 0〜 1 0 0 °C、 好ましくは 9 0〜： L O O 、 最適には 9 3〜 9 7 で、 1 〜 1 5分間、 好ましく は 2〜 1 0分間、 最適には 3〜 7分間、 加熱処 理して R N Aの高次構造を破壊することがハイプリダイゼーシヨ ン効 率を向上させるのに好適である。
更に、 本発明の核酸プローブの、 ハイプリダイゼーシヨ ン塩基配列 領域へのハイブリダィゼーシヨ ン効率を更に上げるためにヘルパ一プ 口一ブ （helper probe) をハイブリダィゼ一シヨ ン反応溶液に添加す ることが好適である。 この場合、 ヘルパープローブのオリゴヌク レオ チドはオリ ゴデォキシリポヌクレオチド、 オリゴリポヌクレオチドで も、 また、 前記と同様な化学的修飾を受けたオリゴヌクレオチドでも よい。 前記のオリゴヌクレオチドの一例として、 P C R方法において はフォワー ド （forward) 型として （ 5' ) TCCTTTGAGT TCCCGGCCGG A (3
' )、 ノ ックワー ド （back ward) 型もしくはリバース（reverse ward) 型として （5' )CCCTGGTCGT AAGGGCCATG ATGACTTGAC GT(3' )なる塩基配 列のものを挙げることができる。 化学的修飾を受けたオリゴヌクレオ チドの好適な例として、 2-0-アルキルオリゴリポヌクレオチド、 特に 2
- O-Meォリゴリボヌク レオチドを例示できる。
本発明の核酸プローブの塩基鎖が 3 5塩基以下の場合、 へルパープ ローブの利用は、 特に効果的である。 3 5塩基鎖を超える本発明の核 酸プロ一プを使用する場合は、 標的の R NAを熱変性するだけでよい 場合もある。
前記のようにして、 本発明の核酸プローブを R N Aにハイブリダィ ズさせると、 ハイブリダィゼ一シヨ ン効率が高まるので反応液中の R N Aの量に応じて蛍光強度が減少し、 最終 R N A濃度が約 1 5 0 pMま で R N Aを測定できるようになる。
かく して、 本発明は、 標的核酸の種の数と少なく とも同数以上の本 発明の核酸プローブを含有もしくは付帯する、少なく とも一種以上（す なわち単数または複数） の標的核酸の濃度を測定する測定キッ トに前 記のへルパープローブを含有、 付帯させてなる、 少なく とも一種以上 (すなわち単数または複数） の標的核酸の濃度を測定する測定キッ ト でもある。
核酸プローブを用いる従来のハイブリダィゼ一ショ ン方法による R N Aの測定において、 核酸プロ一ブとしてオリゴデォキシリポヌク レ ォチド体またはオリゴリボヌクレオチド体が用いられてきた。 R N A はそれ自体が強固な高次構造をとるため、 プローブと標的 R N Aとの ハイブリダィゼ一シヨ ン効率が悪く、 定量性に乏しかった。 そのため に、 R N Aを変性させた後、 メンブランに固定してからハイブリダィ ゼ一シヨ ン反応を行う という繁雑性を従来方法は有していた。 これに 対して、 前記の本発明方法は、 R N Aの特定構造部と高い親和性を有 するリポース部修飾核酸プローブを用いているので、 従来方法に較べ て高い温度でハイブリダィゼーシヨン反応を行う ことができる。 それ で、 R N Aの高次構造の前記悪影響は、 前処理としての加熱変性処理、 ヘルパープローブの併用だけで克服可能である。 これにより本発明方 法においてハイブリダィゼ一シヨ ン効率は実質的に 1 0 0 %になり、 定量性が向上する。 また、 従来方法に較べて格段に簡便になる。
本発明のプローブの塩基数は 5〜 6 0であり、 好ましくは 1 0〜 3 5、 特に好ましく は 1 5〜 2 0である。 6 0 を超える場合は、 F I SH方 法に用いたとき細胞膜の透過性が悪くなり、 本発明の適用範囲を狭め ることになる。 5未満の場合は、 非特異的ハイブリダィゼ一シヨ ンが 惹起し易くなり、 測定誤差が大きくなる。
その構造は、 核酸プローブが、 その末端部においてドナ一色素で標 識されており、 当該核酸プローブが当該末端部において標的核酸にハ イブリダィズしたとき、 当該プローブにハイブリダィズした標的核酸 の末端塩基から 1ないし 3塩基離れて、 標的核酸の塩基配列に C (シ トシン） または G (グァニン） が少なく とも 1塩基存在するように、 当該プローブの塩基配列が設計されていることである。
好ましくは、 核酸プローブが、 標的核酸にハイブリダィゼ一シヨ ン したとき、 ドナー色素標識部においてプロ一ブー核酸ハイプリ ッ ドの 複数塩基対が少なく とも一つの G (グァニン） と C (シトシン） のべ ァーを形成するように、 当該プローブの塩基配列が設計されているこ とである。
より好ましくは、 ドナ一色素標識部位は G (グァニン） または C (シ トシン） 塩基か、 またはその塩基を有するヌクレオチドのリ ン酸基、 またはリポースの〇H基である。
ドナー色素およびァクセプ夕一色素の標識部位は、 ドナー色素が核 酸プローブの 5 ' 末端部において、 塩基、 リ ン酸部またはリポース部 を標識しているときに、 ァクセプ夕一色素が核酸プロ一ブの鎖中もし くは 3 ' 末端部 （ 3 ' ·末端塩基を含む。 ） である。 また、 ドナ一色素 が核酸プローブの 3 ' 末端部において、 塩基、 リン酸部またはリボー ス部を標識しているときに、 ァクセプター色素が核酸プローブの鎖中 もしくは 5 ' 末端部 （ 3 ' 末端塩基を含む。 ） である。 末端部を標識 する場合には、 両者の色素で、 標識してもよい。 すなわち、 例えば、 両者の一方で、 リ ン酸部を標識し、 他方でリポース部、 または塩基部 を標識してもよい （例えばドナー色素とァクセプ夕一色素の標識部塩 基間距離が 0 の場合 （下記に記述した。 ） ） 。 また、 側鎖を有するス ぺサーを用いて、 一本のスぺサ一に両者を結合させてもよい。 本発明 においてはドナー色素、 ァクセプター色素共に鎖中を標識しておいて も前記の条件さえ充たせばよいことは勿論である。
前記各部位における蛍光色素の結合位置は、 O H基、 またはァミノ 基にスぺサ一を介して結合させるのが好適である。
ドナー色素とァクセプ夕一色素の標識部塩基間距離は、 本質的には ドナ一色素とァクセプター色素の色素ペア一の種類に依存するが、 一 般的には 0〜 5 0塩基、 好ましくは 0〜 4 0塩基、 より好ましく は 0 〜 3 5塩基、 特に好ましくは 0〜 1 5塩基である。 5 0塩基を越える と、 FRET現象が不安定になる。 1 5〜 5 0塩基では、 ァクセプ夕一色 素の蛍光強度は減少するが、 ドナ一色素の蛍光強度は増加する場合が ある。 すなわち、 核酸プローブが標的核酸にハイブリダィズしたとき、 核酸プローブの立体構造が変化する場合がある。 そしてその変化によ り核酸プローブの色素間の F R E T現象が解消する場合が出てくる。 ドナ 一色素に対するァクセプター色素のクェンチング作用 （消光作用） と ドナ一色素に対する G Cの水素結合体の当該作用の大小に依存して、 ドナー色素の蛍光強度がハイブリダィゼ一シヨ ン前より増加したり、 減少したりする。 G Cの水素結合体のクェンチング作用の方が大きい ときは減少するが、 小さいときは増加する。 1 5塩基未満の場合は、 ハイブリダイゼーショ ン後において、 ドナ一色素およびァクセプ夕一 色素の蛍光強度は共に減少する。 そして減少量はハイブリダィゼーシ ョ ン後の核酸プローブの立体構造に依存しなくなり、 測定反応系の標 的核酸の濃度だけに依存するようになる。 ハイブリダイゼーシヨ ン後 において、 ドナ一色素およびァクセプター色素の蛍光強度は共に減少 させる場合、 特に好ましい塩基数は 0〜 1 0塩基である。
それで、 本発明のプローブの特に好ましい形態は、 ドナー色素とァ クセプ夕一色素の前記標識部塩基間距離を有し、 ドナー色素が B0DIPY FL、 B0DIPY 493/503、 5- FAM、 Te t r ame t hy 1 rhod ami ne , または 6-TAMR Aで、 またァクセプター色素が B0DIPY 581 /591、 X—ローダミ ンで、 5 ' 末端塩基が Gまたは Cで、 かつ 5 ' 末端がドナ一色素で標識され ているものか、 または、 核酸プローブの 3 ， 末端塩基が Gまたは Cで、 かつ 3 ， 末端がドナー色素で標識されているものである。 本発明の核酸測定用の新規な核酸プローブの構造は上記の通りであ る。 このような構造になっていると、 励起されたドナ一色素のェネル ギ一は標的核酸にハイブリダィズしていないときは、 ァクセプタ一色 素に転移するので、 ァクセプター色素が発光して、 蛍光強度を有して いる。 それで、 ドナー色素も発光が抑制されているので、 蛍光強度も 低いレベルに保たれている。 ところが、 核酸プローブが標的核酸にハ イブリダィズすると、 ドナー色素のエネルギーはプローブ一核酸ハイ プリ ッ ド複合体により生ずる G Cの水素結合体の方に転移する。また、 核酸プローブの立体構造が変化して F R E T現象が解消する場合も出 てく る。 それで、 ァクセプター色素の発光が減少する。
本発明の核酸プローブのオリゴヌクレオチドは、 通常の一般的オリ ゴヌク レオチドの製造方法で製造できる。 例えば、 化学合成法、 ブラ スミ ドベクター、 ファージベクタ一等を使用する微生物法等で製造で きる （Tetrahedron letters, 22巻、 1859〜1862頁、 1981年； Nucleic acids Research, 14巻， 6227〜 6245頁， 1986年） 。 尚、 現在、 市販され ている核酸合成機を使用するのが好適である （例えば、 ABI 394 (Perki n Elmer社製、 USA)) 。
オリゴヌク レオチドに蛍光色素を標識するには、 従来公知の標識法 のうちの所望のものを利用することができる（Nature Biotechnology, 14巻、 303〜308頁、 1996年； Applied and Environmental Microbiol ogy、 63巻、 1143〜 U47頁， 1997年； Nucleic acids Research, 24巻, 4532〜 4535頁、 1996年） 。 例えば、 5 '末端に蛍光色素分子を結合さ せる場合は、 先ず、 常法に従って 5 '末端のリ ン酸基にスぺーサ一と して、 例えば、 -（CH2) n- SHを導入する。 これらの導入体は市販されて いるので市販品を購入してもよい （メ ドランド · サ一ティファイ ド · レ一ジント ' カンパニー （Midland Certif ied Reagent Company) ) 。 この場合、 nは 3 〜 8、 好ましくは 6である。 このスぺ一サ一に S H 基反応性を有する蛍光色素またはその誘導体を結合させることにより 標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。 このようにして合成され た蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドは、 逆相等のクロマ トグ ラフィ一等で精製して本発明の核酸プローブとすることができる。 また、 オリゴヌクレオチドの 3 ' 末端塩基も標識できる。
この場合は、 リポースまたはデォキシリポースの 3 ' 位 Cの O H基 にスぺ一サ一として、 例えば、 -（CH2) n-冊2を導入する。 これらの導 入体も前記と同様にして市販されているので市販品を購入してもよい (メ ドランド · サーティファイフ ド · レージント · カンパ二一 （Midi and Certif ied Reagent Company) ) 。 また、 リ ン酸基を導入して、 リ ン酸基の 0 H基にスぺサ一として、 例えば、 -（CH2) n-SHを導入する。 これらの場合、 nは 3〜 8、 好ましくは 4〜 7である。 このスぺーサ —にァミノ基、 S H基に反応性を有する蛍光色素またはその誘導体を 結合させることにより標識したオリゴヌクレオチドを合成できる。
また、 オリ ゴヌクレオチドの鎖中塩基も標識できる。
塩基のアミ ノ基または O H基を 5 ' または 3 ' 末端の方法と同様に して本発明の色素で標識すればよい （ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 225, 32 - 38頁 （ 1998年） ） 。
アミノ基を導入する場合、 キッ ト試薬 （例えば、 Uni - link aminomo di er (CL0NTECH社製、 米国） 、 フルォ * リポ夕一キッ ト （FluoRepor ter Kit) F-6082, F- 6083、 F-6084, F-10220 (いずれもモレクキユラ ― · プロ一べ （Molecular Probes) 社製、 米国） ） を用いるのが便利 である。 そして、 常法に従って当該オリゴリポヌクレオチドに蛍光色 素分子を結合させることができる。
このようにして合成されたオリ ゴヌクレオチドは、 逆相等のクロマ トグラフィ一等で精製して本発明の核酸プローブとすることができる 以上のようにして、 本発明の核酸プローブは作製できる。 作製され た本発明の核酸測定用核酸プローブは、 標的核酸に八イブリダイズし たときに、 プローブ一核酸ハイプリ ッ ド複合体の発光の蛍光強度が、 複合体を形成する前に較べて著しく減少する。
そして、 一種類の ドナー色素に複数のァクセプ夕一色素の組み合わ せができるので、 その組み合わせの数の核酸プローブができる。 しか も前記性質を有している。
実際の核酸測定においては、 ァクセプター色素の蛍光強度の減少を 測定することになるので、 一つの励起波長で多種類の核酸プローブを 同時に使用できることになる。 そのことは、 同一測定系内に多種類の 標的核酸が存在する場合に、 このような核酸プローブを同時に添加す れば、一つの励起波長で多種類の核酸を同時に測定できることになる。 すなわち、単純な装置で多種類の核酸を同時に測定できることになる。
本発明の第 2発明は、 上記のようにして作製された核酸プロ一ブを 使用して、 標的核酸を測定する方法である。
すなわち、 少なく とも一種以上の標的核酸が存在する測定系に、 本 発明の前記 1 〜 1 0の少なく ともいずれか一に記載の核酸測定用核酸 プローブであって、 当該標的核酸にハイブリダィズする核酸測定用の 核酸プローブで、 かつ標的核酸の種の数と少なく とも同数の種の数で かつ発光蛍光色の異なる核酸測定用プローブを存在させ、 核酸測定用 プローブと標的核酸をハイブリダィズさせて、 核酸測定用プローブの 種の数と少なく とも同数の種の数の波長で、 ハイブリダィゼ一ショ ン 前後における測定波長の蛍光強度の減少量を測定することを特徴とす る核酸測定方法である。 また、 その測定キッ ト、 その測定のためのデ 一夕解析方法、 その測定装置、 およびデ一夕解析過程をコンピュータ に実行させるための手順をプログラムとして記録したコンピュータ読 取可能な記録媒体である。
本発明において、 前記の 「少なく とも一種以上の標的核酸が存在す る測定系」 とは、 単数種または複数種の標的核酸が測定系に存在する という意味である。
また、 「本発明の前記 1 〜 1 0の少なく ともいずれか一に記載の核 酸測定用核酸プローブ」 とは、 次のような意味である。
本発明において、 測定系に単数種の標的核酸が存在する場合に、 測 定系に存在させる核酸測定用核酸プローブの種は単数種でも複数種で もよい。 この 「複数でもよい」 とは、 一種の標的核酸に塩基配列の異 なつた複数部位にハイブリダイズする複数の種の核酸測定用核酸プロ ーブを使用してもよいという意味である。
本発明において、 複数種の標的核酸が存在する場合は、 少なく とも 複数種の核酸測定用核酸プローブを存在させることを特徴としている そしてその種類の数は標的核酸種と少なく とも同数である。 そして、 この 「少なく とも同数」 とは、 一種の標的核酸に、 複数種の核酸測定 用プローブが八ィプリダイズする塩基配列部位を設定して、 一種の標 的核酸に対して複数種の核酸測定用プローブを測定系に存在させても よいという意味である。
また、 前記単数種および複数種の標的核酸が測定系に存在する場合 における 「複数種の核酸測定用プローブ」 とは、 次のような意味であ る。 すなわち、 （ 1 ) 本発明の前記 1 〜 1 0のいずれか一に記載の核 酸測定用核酸プローブの中の種類の異なった複数のプローブである。 例えば、 プローブの形態若しくは構造は同じであるが、 互いに標識す る色素が単に異なったプロ一ブを例に挙げることができる。 （ 2 ) プ ローブの形態若しくは構造が異なった核酸測定用プローブの組合せで あるが、 互いに標識色素が異なった複数種の核酸測定用プローブであ る。 すなわち、 前記 1 〜 1 0の各項にまたがった核酸プローブでもよ いという意味である。 例えば前記 5 に記載のプローブの種類の中の一 種のプローブ、 前記 6 に記載のプローブの種類の中の一種のプローブ と前記 1 0に記載のプローブの種類の中の一種のプローブの組合せで. 互いに標識色素が異なった複数種の核酸測定用プローブなどのことい う （なお、 この例示により本発明は何ら限定されるものではない。 ） 。 前記の定義は以下の記載事項においても同様であるものとする。 本発明の第 3発明は、 少なく とも一種以上の標的核酸が存在する測 定系における標的核酸の多型 （polymorphism) またはノおよび変異 （m utat ion) を解析もしくは測定する方法において、 前記 1〜 1 0 の少な く ともいずれか一に記載の核酸プローブであって、 標的核酸の種の数 と少なく とも同数の種の数で、 かつ発光蛍光色の異なる核酸測定用プ ローブを測定系に存在させ、 標的核酸と核酸測定用プローブを八ィブ リダィズさせて、 核酸測定用プローブの種の数と少なく とも同数の種 の数の波長で、 ハイブリダィゼーショ ン前後における測定波長の蛍光 強度の減少量を測定することを特徴とする標的核酸の多型またはノお よび変異を解析もしくは測定する方法、 その測定キッ ト、 その測定の ためのデータ解析方法、 その測定装置、 およびデータ解析過程をコン ピュー夕に実行させるための手順をプログラムとして記録したコンビ ユー夕読取可能な記録媒体である。
すなわち、 本発明の核酸プローブは、 単に核酸測定だけでなく、 標 的核酸の多型 （polymorphism) または および変異 （mutation) を解 析もしくは測定する方法に好適に利用できる。
特に下記に述べる D NAチップ （蛋白質 核酸 酵素、 4 3巻、 2 0 0 4〜 2 0 1 1 ページ、 1 9 9 8年） と併用することにより便利な 方法を提供する。 すなわち、 本発明の核酸プローブとのハイブリダィ ゼーシヨ ンにおいて、 G Cペア一を形成するかどうかにより、 蛍光強 度が変化する。 それで、 本発明の核酸プロ一ブを標的核酸にハイプリ ダイズさせ、 発光強度を測定することにより、 標的核酸の多型 （poly morphism) または および変異 （mutation) を解析もしくは測定する ことができる。 具体的方法は、 実施例に記した。 この場合、 標的核酸 は各種の核酸増幅方法のうちの一つの方法により増幅された増幅物で もよいし、 抽出されたものでもよい。 また標的核酸はその種類を問わ ない。 ただ、 鎖中または末端にグァニン塩基またはシトシン塩基が存 在しておればよい。 鎖中または末端にグァニン塩基またはシトシン塩 基が存在しないと蛍光強度が減少しない。 よって、 本発明方法により、
G→A、 G— A、 C→T、 C T、 G→C、 G— Cの変異、 または置 換、 すなわち、 1塩基多型 （single nucleotide polymorp ism (SNP) ) などの多型 （polymorphism ) 等を解析もしくは測定することができる, なお、 現在、 多型分析は、 マキサム ' ギルバート （Maxam- Gi lber t)法、 ジデォキシ （dideoxy) 法を用いて標的核酸の塩基配列を決定すること により行われているのが現状である。
それで、 本発明の核酸プローブを標的核酸の多型 （polymorphisffl) および変異 （mutation) を解析もしく は測定する測定キッ トに含有さ せることにより、 標的核酸の多型 （polymorphism) または Zおよび変 異 （mutation) を解析もしくは測定する測定キッ トとして好適に使用 することができる。
本発明の標的核酸の多型 （polymorphism) または/および変異 （mu tat ion) を解析もしくは測定する方法により得られるデ一夕を解析す る場合に、 標的核酸が本発明の核酸プローブとハイブリダィズしたと きの反応系の蛍光強度値を、 前記のものがハイブリダィズしていない ときの反応系の蛍光強度値により補正する処理過程を設けると、 処理 されたデータは信頼性の高いものになる。
それで第 3発明は、 標的核酸の多型 （polymorphism) または Zおよ び変異（ mu t a t i on)を解析もしく ま測定する方法のためのデータ解析方 法を提供する。
また、 第 3発明は、 標的核酸の多型 （polymorphism) または Zおよ び変異 （mutation) を解析もしくは測定する測定装置において、 標的 核酸が本発明の核酸プローブとハイブリダィズしたときの反応系の蛍 光強度値を、 前記のものがハイブリダィズしていないときの反応系の 蛍光強度値により補正処理する手段を有することを特徴とする標的核 酸の多型 （polymorphism) またはノおよび変異 （mutation) を解析も しくは測定する測定装置である。 また、 第 3発明は、 標的核酸の多型 （po morphisni) または/およ び変異 （ mu t a t i on) を解析もしくは測定する方法により得られるデ一 夕を解析する場合に、 標的核酸が本発明の核酸プローブと八ィブリダ ィズしたときの反応系の蛍光強度値を、 前記のものがハイブリダィズ していないときの反応系の蛍光強度値により補正する処理過程をコン ピュー夕に実行させるための手順をプログラムとして記録したコンビ ユ ータ読取可能な記録媒体である。
また、 第 3発明は、 本発明の核酸測定用核酸プローブを複数個固体 支持体表面に結合させ、 それに標的核酸をハイブリダィズさせて標的 核酸を測定することができるようにしたことを特徴とする複数の核酸 の濃度をそれぞれ測定するためのデバィス、 そのデバィスにおいて、 核酸プローブが固体支持体表面にアレー状に配列、 結合させた複数核 酸をそれぞれ測定するためのデバイス （チップ） であり、 また、 固体 支持体表面に結合させられた核酸プローブ毎に、 反対側の表面に少な く とも一つの温度センサ一とヒーターが設置され、 核酸プロ一ブ結合 領域が最適温度条件になるように温度調節され得るデバイスである。
すなわち、 本発明の核酸プローブは固体 （支持層） 表面、 例えばス ライ ドガラスの表面に固定することができる。 この形式は現在 D NA チップと言われる。 遺伝子発現 （gene express ion) のモニタ リ ング、 塩基配列 (base sequence) の決定、 変異解析 （mutation analysis) . 1塩基多型 （single nucleot ide polymorphism (SNP) ) などの多型解 析 （polymorphism analysis) 等に使用できる。 勿論、 核酸測定用デバ イス （チップ） として使用することもできる。
本発明の核酸プローブを例えばスライ ドガラスの表面に結合させる には、 ポリ リジン、 ポリエチレンィミン、 ポリアルキルァミ ンなどの ポリ陽イオンをコートしたスライ ドガラス、 アルデヒ ド基を導入した スライ ドガラス、アミノ基を導入したスライ ドガラスを先ず用意する。 そして、 i )ポリ陽イオンをコートしたスライ ドガラスには、 プローブ のリ ン酸基を反応させる、 ii)アルデヒ ド基を導入したスライ ドガラス には、 アミノ基を導入したプローブを反応させる、 iii)アミノ基を導 入したスライ ドガラスには、 P D C (pyridinium d i chromat e) 導入、 アミノ基またはアルデヒ ド基導入したプロ一ブを反応させる、 などに より達成できる（Fodor，P. A.， et al. , Science, 251, 767-773 (1991 )； Sc hena, M.， et a 1. , Pr oc . Na 11. Ac ad. Sc i . , U. S . A. , 93, 10614-10619 (199 6) ;McGal, G. , et a 1. , Pr oc . Na ί 1. Acad. Sc i . , U. S. A. , 93, 13555-13560 (1 996)； Bl anchad, A. P. , e t al. ,Biosens.Bioelectron. , 11, 687-690(199 6))。
本発明の核酸測定用核酸プローブを固体表面にアレー状に配列、 結 合させたデバイスは核酸測定がより便利になる。
この場合、 塩基配列の異なる多くの本発明の核酸プローブを、 個別 に同一固体表面上に結合しているデバイスをつくることによ り、 同時 に多種類の標的核酸を測定できる。
このデバイスにおいては、 プローブ毎に、 前記固体の本発明の核酸 プローブを結合した面と反対側の面に少なく とも一つの温度センサー とヒーターを設け、 そのプローブを結合した前記固体の領域が最適温 度条件になるように温度調節され得るように設計されているのが特に 好適である。
本発明のデバイスを用いる測定方法の基本的操作は、 核酸プローブ を結合した固体表面上に標的核酸を含む溶液をのせ、 八ィブリダイズ させるだけである。 これにより、 標的核酸量に応じて蛍光量の変化が おこり、 その蛍光変化量から標的核酸の測定が可能となる。 また、 一 つの固体表面上に塩基配列の異なる本発明の核酸プローブを多数種結 合させることにより、 一度に多くの標的核酸の濃度を測定することが できる。 それで、 D N Aチップと全く同じ用途で標的核酸の測定に使 用できるので新規の D N Aチップである。 最適の反応条件では標的核 酸以外の核酸は蛍光の発光量を変化させないために、 未反応な核酸を 洗浄する操作は必要がない。 更に、 微小ヒーターにて本発明の核酸プ ローブ毎に温度コントロールすることにより、 当該プローブ毎に最適 反応条件にコントロールできるために正確な濃度の測定が可能となる また、 微小ヒーターにて温度を連続的に変化させ、 その間、 蛍光量を 測定することにより、 本発明の核酸プローブと標的核酸との解離曲線 を解析することができる。 その解離曲線の違いからハイブリダィズし た核酸の性質の判定や、 S N Pの検出ができる。
従来の標的核酸の濃度測定用デバイスは、 蛍光色素で修飾ざれてい ない核酸プローブを固体表面に結合 （固定 ： fix) し、 それに蛍光色素 で標識した標的核酸を八イブリダィズさせた後、 ハイブリダィズして いない標的核酸を洗い流して、 残存している蛍光色素の蛍光強度を測 定していた。
蛍光色素で標的核酸を標識するには、 例えば、 特定 mR NAを標的 とした場合、 次のステップ （ s t eps) を取る ： （ 1 ) 細胞から抽出され た mR N A全部を抽出する。 （ 2 ) それから、 逆転写酵素 （reverse transcriptase) を用いて、 蛍光色素で修飾されヌクレオサイ ドをとり 込ませながら c D NAを合成する。 本発明ではこのような操作は必要 がない。
当該デバイスには各種のプローブが多数スポッ トしてあるが、 その 各々のプローブにハイブリダィズする核酸の最適ハイブリダィゼーシ ヨ ン条件、 例えば、 温度等は各々異なる。 よって本来であれば、 プロ —ブ毎 （スポッ ト毎） に、 ハイブリダィゼーシヨ ン反応、 洗浄操作を 最適な条件で行う必要がある。 しかし、 それは物理的に不可能である ので、 すべてのプローブ毎に同一の温度でハイブリダィゼ一ショ ンを 行い、 また、 洗浄も同一温度で同一洗浄液で行われている。 それで、 ハイブリダィゼーシヨ ンが期待されている核酸がハイブリダイズしな かったり、 ハイブリダィズしてもハイブリダィゼ一シヨ ンが強固でな いので容易に洗い流されてしまう等の欠点を有していた。 そのような 原因で核酸の定量性が低いものであった。 本発明ではこの洗浄操作が 必要ないのでこのような欠点を有しない。 また、 スポッ トの底に微小 ヒ一夕を設け、 ハイブリダィゼーシヨ ン温度をコントロールすること で、 本発明のプローブ毎に最適温度でハイプリダイゼーショ ン反応を 行わせることができる。 それで、 本発明は定量性が格段に向上したも のである。
本発明においては、 前記した本発明の核酸測定用の核酸プローブま たはデバイスを使用することで、 少なく とも一種以上の標的核酸が存 在する測定系において、 標的核酸を短時間で、 簡便かつ特異的に測定 することができる。 以下に測定法を述べる。
本発明の測定方法において、 先ず、 測定系に本発明の核酸測定用の 標的核酸に対応する核酸プローブを標的核酸の種の数と少なく とも同 数の種の数あて添加し、 標的核酸に八イブリダィズさせる。 その方法 は、 通常の既知方法で行なう ことができる （Analytical Biochemistr y, 183卷> 231〜244頁、 1989年； Na t ur e B i o t e c hno 1 ogy> 14卷、 303 〜 308頁、 1996年； Applied and Environmental Microbiol ogy> 63卷， 1143-1147頁、 1997年） 。 例えば、 ハイプリダイゼーショ ンの条件は、 塩濃度が 0〜 2モル濃度、 好ましくは 0 . 1 〜 1 . 0モル濃度、 p H は 6〜 8、 好ましくは 6. 5〜 7 . 5である。
反応温度は、 本発明の核酸測定用の核酸プローブが標的核酸の特異 的部位にハイブリダィズして得られる核酸ハィブリ ッ ド複合体の T m 値 ± 1 0 °Cの範囲内であるのが好ましい。 このようにすることにより 非特異的なハイブリダィゼ一ショ ンを防止することができる。 T m— 1 0 °C未満のときは、 非特異的ハイブリダィゼーシヨ ンが起こり、 T m + 1 0 °Cを越えるときは、 ハイブリダィゼ一シヨ ンが起こらない。 尚、 Tm値は本発明の核酸測定用の核酸プローブを設計するのに必要 な実験と同様にして求めることができる。 すなわち、 本発明の核酸測 定用の核酸プローブとハイプリダイズする （当該核酸プローブに対し て相補する塩基配列の） オリゴヌクレオチドを前記の核酸合成機等で 化学合成し、 当該核酸プロ一ブとの核酸八ィプリ ッ ド複合体の T m値 を通常の方法で測定する。 測定系に複数の標的核酸が存在するときは 複数の核酸ハイブリ ッ ト複合体の平均値を採用してもよいし、 最も重 要視している標的核酸のものを採用してもよい。
また、 その反応時間は 1秒間〜 1 8 0分間、 好ましくは 5秒間〜 9 0分間である。 1秒間未満のときは、 ハイブリダィゼ一ショ ンにおい て未反応の本発明の核酸プローブが多くなる。 また、 反応時間を余り 長く しても特に意味がない。 なお、 反応時間は核酸種、 すなわち、 核 酸の長さ、 あるいは塩基配列によって大きく影響を受ける。
前記のようにして、 本発明の核酸測定用の核酸プローブを標的核酸 にハイブリダィズさせる。 そして、 ハイブリダィゼーシヨ ンの前後で、 ハイブリダイゼーショ ン反応系の蛍光強度を、 添加した核酸測定用プ ローブの種の数と少なく とも同数の種の数の波長で蛍光光度計で測定 し、 各波長におけるその減少量を計算する。 その減少量の大きさは標 的核酸の濃度と比例するので、標的核酸の濃度を求めることができる。 反応液中の標的核酸の濃度 ： 0 . 1 〜 1 0 . O n Mであるのが好ま しい。 反応液中の本発明の核酸プローブの濃度 ： 1 . 0 〜 2 5 . O n Mであるが好ましい。 検量線を作成する場合は、 標的核酸に対して、 本発明の核酸プロ一ブを 1 . 0 〜 2 . 5の比率で用いるのが望ましい。 実際、 試料中の未知濃度の標的核酸を測定する場合、 上記の条件で 先ず、 検量線を作成する。 標的核酸が複数の場合は、 標的核酸に対応 した本発明の各核酸プローブの各測定波長ついて検量線を作成する。 そして、 複数の濃度に対応する本発明の核酸プローブを試料に添加し て、 それぞれ蛍光強度値の減少を測定する。 そして、 測定された蛍光 強度の減少値のうちの最大なものに対応するプローブ濃度を好ましい プロ一ブ濃度とする。 好ましい濃度のプローブで測定された蛍光強度 の減少値をもって、検量線から標的核酸の定量値を求めることになる。 本発明の第 4発明は、 本発明は各種の核酸測定方法、 例えば、 F I S H方法、 P C R方法、 L C R方法、 S D方法， 競合的ハイブリダィゼ ーシヨ ン方法、 T A S方法、 などに適用する発明である。
以下にその例を記す。
a ) F I S H方法に適用した場合
即ち、 本発明は色々の種類の微生物が混在するか、 もしくは一種類 以上の微生物が動物や植物由来の細胞と共に混在していて、 相互に単 離できない微生物系 （複合微生物系、 共生微生物系） の細胞内もしく は細胞のホモジネー ト等の核酸測定に好適に適用できる。 こ こでいう 微生物とは一般的にいう微生物のことで、 特に限定されるものではな い。 例えば、 真核微生物、 原核微生物、 その他、 マイコプラズマ、 ゥ ィルス、 リ ツケチヤ等を挙げることができる。 そして、 この系でいう 標的核酸とは、 これらの微生物系において、 例えば、 どのように活躍 しているのか調べたい菌株の細胞に特異性を有する塩基配列をもつ核 酸のことである。 例えば、 特定菌株の 5 S r R NA、 1 6 S r R N A もしくは 2 3 S r R NAまたはそれらの遺伝子 D N Aの特定配列であ る。
本発明の核酸プロ一ブを複合微生物系または共生微生物系に添加し 特定菌株の 5 S r R NA, 1 6 S r R NAもしくは 2 3 S r R N Aま たはそれらの遺伝子 D N Aの量を測定することにより、 当該系におけ る特定菌株の存在量を測定することできる。 尚、 複合微生物系または 共生微生物系のホモジネートに前記核酸プローブを添加して、 ハイブ リダィゼ一シヨ ン前後における蛍光色素の発光の減少量を測定して特 定菌株の存在量を測定する方法も、 本発明の技術的範囲内とする。
前記の測定方法は、 例えば、 以下の如くである。 即ち、 本発明の核 酸プローブを添加する前に、複合微生物系または共生微生物系の温度、 塩濃度、 P Hを前記の条件に調整する。 複合微生物系または共生微生 物系における特定菌株は、 細胞数として 1 0 7〜 1 012個/ m 1 、 好ま しくは 1 0 9〜 1 01Q個/ m 1 に調整することが好適である。 それは希 釈、 または遠心分離等による濃縮等で行う ことができる。 細胞数が 1 07個 Zm 1 未満のときは、 蛍光強度が弱く、 測定誤差が大きくなる。 1 012個 Zm 1 を超えるときは、 複合微生物系または共生微生物系の 蛍光強度が強すぎるため、 特定微生物の存在量を定量的に測定するこ とができなくなる。
【 0 0 6 6】
添加する本発明の核酸プローブの濃度は、 複合微生物系または共生 微生物系における特定菌株の細胞数に依存する。 細胞数 1 X 1 0 Vm 1 に対して 0. 1〜 1 0. O n M濃度、 好ましくは 0. 5〜 5 n M濃 度、 より好ましくは 1. O n M濃度である。 0. I n M未満のときは、 特定微生物の存在量を正確に反映したデ一夕にならない。 しかし、 最 適な本発明の核酸プローブの量は、 細胞内の標的核酸量に依存するた めに一概にはいえない。
次に本発明において前記核酸プロ一ブと特定菌株の 5 S r R NA、
1 6 S r R NAもしくは 2 3 S r RNAまたはその遺伝子 D NAにハ イブリダィズさせるときの反応温度は、 前記した条件と同様である。 また、 その反応時間も前記の条件と同様である。
前記のような条件で本発明の核酸プローブを特定菌株の 5 S r R N A、 1 6 S r R NAもしくは 2 3 S r R N Aまたはそれの遺伝子 D N
Aにハイブリダィズさせ、 ハイブリダィゼーシヨ ン前後の複合微生物 系または共生微生物系の蛍光色素の発光の減少量を測定する。
前記のようにして測定された蛍光色素の発光の減少量は、 複合微生 物系または共生微生物系における特定菌株の存在量と比例する。 それ は 5 S r R N A、 1 6 S r R NAもしくは 2 3 S r R NAまたはそれ らの遺伝子; D N Aの量と特定菌株の存在量とが比例するからである。 なお、 本発明において、 複合微生物系または共生微生物系における 微生物以外の成分は、 本発明の核酸プローブと特定菌株の 5 S r R N A、 1 6 S r R NAもしくは 2 3 S r RN Aまたはそれらの遺伝子 D N Aとのハイブリダィゼ一シヨンを阻害しない限り、 また、 本発明の 核酸プローブの蛍光色素の発光を阻害をしない限り、 特に限定されな レ 。 例えば、 KH2P04、 K2HP04、 NaH2P04、 Na2HP04等のリ ン酸塩、 硫安 硝安、 尿素等の無機窒素類、 マグネシウム、 ナトリウム、 カ リウム、 カルシウムイオン等の金属イオンの各種塩類、 マンガン、 亜鉛、 鉄、 コバルトイオン等の微量金属イオンの硫酸塩、 塩酸塩、 炭酸塩等の各 種塩類、 更にビタミン類等が適当に含まれていてもよい。 もし、 上記 の阻害が観察される場合は、 遠心分離等の操作で複数の微生物が混在 する細胞系から細胞を分離し、 再び緩衝液系等に懸濁すればよい。 上記の緩衝液としては、 リ ン酸緩衝液、 炭酸緩衝液、 トリス * 塩酸 緩衝液、 トリス * グリ シン緩衝液、 クェン酸緩衝液、 ダッ ト緩衝液等 の各種緩衝液をも用いることができる。 緩衝液の濃度は、 ハイブリダ ィゼーシヨ ン、 FRET現象、 蛍光色素の発光を阻害しない濃度である。 その濃度は緩衝液の種類に依存する。 緩衝液の p Hは 4〜 1 2、 好ま しくは 5〜 9である。
b ) P C R方法に適用する場合
P C R方法であればどのような方法でも適用できるのであるが、 リ アルタイム定量的 P C R方法に適用する場合を以下に記す。
即ち、 リアルタイム定量的 P C R方法において、 本発明の核酸測定 用の核酸プローブを用いて P C Rを行い、 反応前後の反応系の蛍光強 度の減少をリアルタイムで測定するものである。
本発明の P C Rとは各種方法の P C Rを意味するものである。 例え ば、 R T— P C R、 R N A -primed P C R、 Stretch P C R、 逆 P C R、 A l u配列を利用した P C R、 多重 P C R、 混合プライマーを用 いた P C R、 P NAを用いた P C R法等をも含む。 また、 定量的とは、 本来の定量測定の他に、 検出程度の定量測定をも意味するのは前記同 様である。 前記のとおり、 標的核酸とは、 存在量を測定する核酸のことを云う。 精製の有無を問わない。 また、 濃度の大小も問わない。 各種の核酸が 混在していてもよい。 例えば、 複合微生物系 （複数微生物の R NAも しくは遺伝子 D NAの混在系） または共生微生物系 （複数の動植物お よび Zまたは複数微生物の R N Aもしくは遺伝子 D N Aの混在系） に おける増幅目的の特定核酸である。 尚、 標的核酸の精製が必要な場合 は従来公知の方法で行う ことができる。 例えば、 市販されている精製 キッ ト等を使用して行う ことができる。
従来公知の定量的 P C R方法は d A T P、 d G T P、 d C T P、 d T T Pもしくは d U T P、 標的核酸 （D NAまたは R NA) 、 T a q ポリ メラーゼ、 プライマ一、 ならびに蛍光色素で標識した核酸プロ一 ブもしくはインタ一カレー夕一を用いて M gイオンの存在下に、 温度 を低温、 高温を繰り返しつつ標的核酸を増幅し、 増幅過程の蛍光色素 の発光の増加量をリアルタイムでモニタリ ングするものである （実験 医学、 1 5巻、 7号、 4 6〜 5 1ページ、 1 9 9 7年、 羊土社） 。 本発明の定量的 P C R方法は、 少なく とも一種以上の標的核酸を増 幅させるに当たり、 標的核酸の種の数と、 少なく とも同数の種の数の 本発明の核酸プローブを用いて標的核酸を増幅させ、 増幅過程におい て、 核酸プローブの種の数と少なく とも同数の種の数の波長で反応系 の蛍光強度の減少量を測定することを特徴とするものである。 本発明 の定量的 P C Rにおいて、 本発明の核酸測定用の核酸プローブは、 ど れでも好適に利用できるが、 その塩基数は 5〜 5 0であり、 好ましく は 1 0〜 2 5、 特に好ましくは 1 5〜 2 0で、 P C Rサイクル中に標 的核酸の増幅産物とハイブリダィズするものであれば、 どのようなも のでもよい。 また、 フォワード （forward) 型、 リバース （reverse) 型のどちらに設計してもよい。
そして、 好ましい核酸プローブとしては、 以下のものを挙げること ができる。 （ 1 ) 核酸プローブが、 標的核酸にハイブリダィゼーショ ンしたとき、 ドナ一色素標識部においてプローブ—核酸ハイブリ ッ ド の複数塩基対が少なく とも一つの G (グァニン） とじ （シトシン） の ペア一を形成するように、 当該プローブの塩基配列が設計されている ことである。
より好ましく は、 （ 2 ) 前記 （ 1 ) のうち、 ドナー色素標識部位は G (グァニン） または C (シトシン） 塩基か、 またはその塩基を有す るヌクレオチ ドのリ ン酸基、 またはリボースの OH基である。 そして、 ァクセプター色素は 3 ' 末端塩基を含まない 3 ' 末端部もしくは鎖中 である。
( 3 ) 前記 （ 2 ) のうち、 ァクセプター色素は鎖中でも、 ドナ一色素 標識部位に近い方に標識されている核酸プローブである。
本発明の核酸プローブのうち、 （ 1 ) ドナ一色素が核酸プローブの 5 ' 末端部塩基もしくは 5 ' 末端塩基を標識しているときに、 ァクセ プ夕一色素が核酸プローブの鎖中もしくは 3 ' 末端部の塩基を標識し ている核酸プローブはプライマーとして利用できるようにしてあるも のである。
このプライマーとして利用するとき、 標的核酸の塩基配列から、 ど う しても 3 ' もしくは 5 ' 末端が Gまたは Cに設計できない場合は、 標的核酸の塩基配列から設計したプライマーであるオリゴヌクレオチ ドの 5 ' 末端に、 5 ' —グァニル酸もしくはグアノシンまたは 5 ' - シチジル酸もしくはシチジンを付加しても、 本発明の目的は好適に達 成できる。 3 ' 末端に 5 ' —グァニル酸または 5 ' —シチジル酸を付 加しても、 本発明の目的は好適に達成できる。 よって、 本発明におい て、 3 ' または 5 ' 末端の塩基が Gまたは Cになるように設計した核 酸プローブとは、 標的核酸の塩基配列から設計したプローブの他に、 当該のプローブの 5 ' 末端に 5 ' —グァニル酸もしくはグアノシンま たは 5 ' —シチジル酸もしくはシチジンを付加してなるプローブ、 な らびに当該のプローブの 5 ， 末端に 5 ， ーグァニル酸または 5 ' —シ チジル酸を付加してなるプロ一ブを含むものと定義する。
また、 本発明の核酸プローブのうち、 （ 2 ) ドナ一色素が核酸プロ ーブの 3 ' 末端部塩基 （ 3 ' 末端塩基を含む。 ） または 3 ' 末端のリ ポース若しくはデォキシリポースを標識しているときに、 ァクセプ夕 一色素が核酸プローブの鎖中もしくは 5 ' 末端部の塩基を標識してい る核酸プローブはプライマーとして利用されないように設計したもの である。 FRET現象を用いるリアルタイム定量的 P C R方法において使 用する （蛍光色素で標識した） 二つのプローブの代わりに、 一つの本 発明の核酸プローブを用いて P C Rを行うものである。 P C Rの反応 系に当該プローブを添加し、 P C Rを行う。 核酸伸長反応時、 標的核 酸もしくは増幅標的核酸にハイブリダィズしていた当該プロ一ブがポ リメラーゼにより分解され、 核酸ハイプリ ッ ド複合体から分解除去さ れる。 このときの反応系または核酸変性反応が完了した反応系の蛍光 強度値を測定する。 また、 標的核酸もしくは増幅した増幅標的核酸が 当該プロ一ブとハイブリダィズしている反応系 （アニーリ ング反応、 もしくはポリ メラ一ゼにより当該プローブが核酸ハイブリ ツ ド複合体 から除かれるまでの核酸伸長反応時の反応系） の蛍光強度値を測定す る。 そして、 前者からの蛍光強度値の減少率を算出することにより増 幅された核酸を測定する。 当該プローブが標的核酸もしくは増幅標的 核酸から、 核酸変性反応により完全に解離するか、 または核酸伸長時 にポリメラ一ゼにより当該プローブと標的核酸もしくは増幅標的核酸 との核酸ハイブリ ッ ド複合体から分解除去されたときは蛍光強度値は 大きい。 しかし、 当該プローブが標的核酸もしくは増幅標的核酸に十 分にハイブリダィズしているアニーリ ング反応が完了している反応系 もしくは核酸伸長反応時にポリ メラーゼにより当該プローブと標的核 酸もしくは増幅標的核酸との核酸ハイプリ ッ ド複合体から分解除去さ れるまでの反応系の蛍光強度値は前者より減少している。 蛍光強度値 の減少は増幅された核酸量に比例する。 この場合、 当該プローブが標的核酸とハイブリダィズしたときのそ の核酸ハイブリ ッ ド複合体の Tmが、 プライマーの核酸ハイブリ ッ ド 複合体の T m値の ± 1 5 °C、 好ましくは ± 5 °Cの範囲になるように、 ( 2 ) のプローブの塩基配列が設計されることが望ましい。 プローブ の T m値が、 プライマーの T m値一 5 °C、 特に一 1 5 °C未満であると、 プローブがハイブリダイズしないために、 蛍光色素の発光の減少は起 こらない。 反対にプライマーの T m値 + 5 °C、 特に + 1 5 °Cを超える と、 プローブが標的核酸以外の核酸とも八イブリダィズするので、 プ ローブの特異性が失われる。
上記 （ 2 ) 以外のプローブ、 特に （ 1 ) のプローブは、 プライマー として P C Rの反応系に添加するものである。 蛍光色素で標識された プライマ一を用いる P C R方法は本発明以外未だ知られていない。 P C Rの反応が進むに従い、 増幅された核酸は本発明の実施に有用な蛍 光色素で 2次標識される。 それで、 核酸変性反応が完了している反応 系の蛍光強度値は大きいが、 アニーリ ング反応が完了しているかもし くは核酸伸長反応時の反応系においては、 反応系の蛍光強度は前者の 蛍光強度よ り減少する。
P C Rの反応は通常の P C R方法と同様の反応条件で行う ことがで きる。 それで、 M gイオン濃度が低濃度 （ l〜 2 mM) である反応系 で標的核酸の増幅を行うことができる。 勿論、 従来公知の定量的 P C Rにおいて使用されている高濃度 （ 2〜 4 mM) の M gイオン存在下 の反応系でも本発明は実施できる。
尚、 本発明の P C R方法において、 本発明の P C Rを行い、 使用し た本発明プローブの種の数と少なく とも同数の種の数の波長でその増 幅産物について核酸の融解曲線を分析を行って標的核酸の Tm値を求 めることができる。 この方法は新規な核酸の融解曲線の分析方法であ る。 本方法において本発明の P C R方法に用いた核酸プローブまたは プライマ一として用いた本発明の核酸プローブが好適に利用できる。 この場合、 本発明の核酸プローブの塩基配列を、 S N P (スニップ ； 一塩基置換多型） を含む領域と相補的な配列にすることで、 P C R終 了後、 その核酸の本発明の核酸プローブから解離曲線を解析すること により、 その解離曲線の違いから S N Pの検出ができる。 本発明の核 酸プローブの配列として S N Pを含む配列と相補的な塩基配列を使用 すれば、 プローブ配列と S N Pを含む配列との解離曲線より得られる Tm値は、 S N Pを含まない配列との解離曲線から得られる Tm値よ り高くなる。
本発明の第 5発明は、 前記のリアルタイム定量的 P C R方法ので得 られるデ一夕を解析する方法の発明である。
リアルタイム定量的 P C R方法は、 現在、 P C Rを行わせる反応装 置、 蛍光色素の発光を検出する装置、 ユーザ一インターフェース、 即 ち、 データ解析方法の各手順をプログラム化して、 それを記録したコ ンピュー夕読み取り可能な記録媒体 （別称 ： Sequence Detection Sof tware Sys tem) 、 およびそれらを制御し、 デ一夕解析するコンピュー 夕から構成される装置で、 リアルタイムで測定されている。 それで、 本発明の測定もこのような装置で行われる。
以下に、 先ず、 リアルタイム定量的 P C Rの解析装置から説明する。 本発明において用いる装置は、 P C Rをリアルタイムでモニタ リ ング できる装置であればどのような装置でもよいが、 例えば、 ABI PRISM™ 7700 塩基配列検出システム（Sequence Detection System SDS 7700) (パーキン · エルマ一 · アプライ ド · バイォシステム社（Perkin Elmer Appl ied Biosytems社、 USA))、ライ トサイクラ一 システム （ロシ ュ · ダイァグノスティ ックス株式会社、 ドイツ） 等を特に好適なもの として挙げることができる。
尚、 前記の P C R反応装置は、 標的核酸の熱変性反応、 ァニーリ ン グ反応、 核酸の伸長反応を繰り返し行う装置 （例えば、 温度を 9 5 °C, 6 0 °C、 7 2 °Cに繰り返し行う ことができる。 ） である。 また、 検出 システムは、 蛍光励起用アルゴンレーザー、 スペク トログラフならび に C C Dカメラからなっている。 更に、 データ解析方法の各手順をプ ログラム化して、 それを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒 体は、 コンピュータにインス トールされて使用され、 コンピュータを 介して上記のシステムを制御し、 検出システムから出力されたデータ を解析処理するプログラムを記録したものである。
コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されているデータ解析 用プログラムは、 サイクルごとの蛍光強度を測定する過程、 測定され た蛍光強度を、 サイクルの関数として、 すなわち P C Rの ampli cai ion plotとしてコンピュータのデスプレ一上に表示する過程、 蛍光強 度が検出され始める P C Rサイクル数 （threshold cycle number :Ct) を算出する過程、 C t値から試料核酸のコピー数を求める検量線を作 成する過程、 前記各過程のデータ、 プロッ ト値を印字する過程、 から なっている。 P C Rが指数的に進行している場合、 P C R開始時の標 的核酸のコピ一数の L o g値と、 C t との間には直線関係が成り立つ。 従って標的核酸の既知量のコピ一数を用いて検量線を作成し、 未知コ ピー数の標的核酸を含有するサンプルの C t を検出することにより、 標的核酸の P C R開始時のコピー数を計算できる。
c ) 前記 P C R方法で得られるデータを解析する方法、 解析装置およ びその解析をコンピュータに実行させるための解析手順をプログラム として記録したコンピュータ読取可能な記録媒体など
デ一夕解析方法等の P C R関連発明は、 前記のようなリアルタイム 定量的 P C R方法で得られたデータを解析する方法である。 以下に各 特徴について記す。
第一の特徴は、 リアルタイム定量的 P C R方法で得られたデ一夕を 解析する方法において、 各サイクルにおける増幅した核酸が蛍光色素 と結合したとき、 あるいは増幅した核酸が本発明の核酸プローブとハ イブリダィズしたときの反応系の蛍光強度値を、 各サイクルにおける 前記の蛍光色素と核酸が結合したもの、 すなわち蛍光色素一核酸複合 体、 あるいは前記本発明の核酸プローブと標的核酸がハイブリダイズ したもの、 すなわち核酸ハイプリ ッ ド複合体が解離したときの反応系 の蛍光強度値により補正する演算処理過程、 即ち、 補正演算処理過程 である。
「増幅した標的核酸が蛍光色素と結合したとき、 あるいは増幅した 標的核酸が本発明の核酸プローブとハイブリダィズしたときの反応 系」 とは、 具体的に例示すると、 P C Rの各サイクルにおける 4 0〜 8 °C , 好ましくは 5 0〜 8 0 °Cの反応温度を有する核酸伸長反応あ るいはァ二一リ ングのときの反応系を挙げることができる。 そして、 反応が完了した反応系を意味する。 実際の温度は増幅した核酸の長さ に依存する。
また、 「前記の蛍光色素一核酸複合体、 あるいは前記の核酸ハイブ リ ツ ド複合体が解離したときの反応系」 とは、 P C Rの各サイクルに おける核酸の熱変性の反応系、 具体的には、 反応温度 9 0〜 1 0 0 ° ( 、 好ましくは 9 4〜 9 6 °Cのときのもので、 反応が完了した系を例示で さる。
補正演算処理過程の補正演算処理としては本発明の目的に合致する ものであればどのようなものでもよいが、 具体的には、 次の 〔数式 1〕 あるいは 〔数式 2〕 による処理過程を含むものを例示することができ る。
ί η= f hyb,ノ f den,n 〔数式 1〕
f n= f den,ノ f hyb,n 〔数式 2〕
〔式中、
f n： 〔数式 1〕 あるいは 〔数式 2〕 により算出された n次サイクルに おける補正演算処理値、
f hyb,n： n次サイクルにおける、 増幅した核酸が赏光色素と結合したと き、 あるいは増幅した核酸が本発明の核酸プローブとハイプリダイズ したときの反応系の蛍光強度値、
f den n： n次サイクルにおける、 前記の 光色素一核酸複合体、 あるい は核酸ハイプリッ ド複合体が解離したときの反応系の蛍光強度値〕 尚、 本過程においては、 上記の処理で得られた補正演算処理値をコ ンピュ一夕のデスプレー上に表示および Zまたは当該値を各サイクル 数の関数としてグラフの形で同様に表示および Zまたは印字するサブ ステップを含むものである。
第二の特徴は、 各サイクルにおける 〔数式 1〕 あるいは 〔数式 2〕 による補正演算処理値を次の 〔数式 3〕 あるいは 〔数式 4〕 に代入し、 各サンプル間の蛍光変化割合あるいは蛍光変化率を算出し、 それらを 比較するデータ解析方法である。
F η= ί ί a 〔数式 3〕
F n= f a/ f n 〔数式 4〕
〔式中、
F n : n次サイクルにおける、 〔数式 3〕 あるいは 〔数式 4〕 により算 出された蛍光変化割合あるいは蛍光変化率、
f n : n次サイクルにおける 〔数式 1〕 あるいは 〔数式 2〕 による補正 演算処理値
f a： 〔数式 1〕 あるいは 〔数式 2〕 による補正演算処理値で、 f nの 変化が観察される以前の任意のサイクル数のものであるが、 通常は、 例えば、 1 0〜 4 0サイクルのもの、 好適には 1 5〜 3 0サイクルの もの、 より好適には 2 0〜 3 0サイクルのものが採用される。 〕 尚、 本過程においては、 上記処理で得られた算出値コンピュータの デスプレー上に表示およびノまたは印字する、 または比較値もしくは 当該値を各サイクル数の関数としてグラフの形で同様に表示および/ または印字するサブステップを含むものであるが、 〔数式 1〕 あるい は 〔数式 2〕 による補正演算処理値については、 上記サブステップを 適用しても、 しなく ともよい。 第三の特徴は、
( 3. 1 ) 〔数式 3〕 あるいは 〔数式 4〕 により算出された蛍光変化 割合あるいは蛍光変化率のデータを用いて、 〔数式 5〕 、 〔数式 6〕 あるいは 〔数式 7〕 による演算処理する過程、
1 o g b(F n)、 1 n (F n) 〔数式 5〕
1 o gb{(l — Fn)X A}、 1 n {(1 - Fn)X A} 〔数式 6〕 1 o gb{(F n- 1 )X A}, 1 n {(Fn- 1 )X A} 〔数式 7〕 〔式中、
A、 b ： 任意の数値、 好ましくは整数値、 より好ましくは自然数であ る。 そして、 A = 1 0 0、 b = 1 0のときは、 {(F—— 1 )XA}は百分 率 （％) で表わされる。
Fn： 〔数式 3〕 あるいは 〔数式 4〕 により算出された nサイクルにお ける蛍
光変化割合あるいは蛍光変化率〕 、
( 3. 2 ) 前記 （ 3. 1 ) の演算処理値が一定値に達したサイクル数 を求める演算処理過程、
( 3. 3 ) 既知濃度の核酸試料におけるサイクル数と反応開始時の標 的核酸のコピー数の関係式を計算する演算処理過程、
( 3. 4 ) 未知試料における P C R開始時の標的核酸のコピー数を求 める演算処理過程、
を有するデータ解析方法である。 そして、 （ 3. 1 ) → ( 3. 2 ) → ( 3. 3 ) → ( 3. 4 ) の順からなる過程が好適である。
前記 （ 3. 1 ) 〜 （ 3. 3 ) の各過程は、 それぞれの処理で得られ た演算処理値をコンピュータのデスプレー上に表示および Zまたは当 該値を各サイクル数の関数としてグラフの形で前記同様に表示および /または印字するサブステップを含むものであってもよい。 前記 （ 3. 4 ) の過程で得られた演算処理値は、 少なく とも印字される必要があ るので、 当該過程は印字するサブステップを含む。 前記 （ 3. 4 ) で 得られた演算処理値を更にコンピュータのデスプレイ上に表示しても よい。
尚、 〔数式 1〕 あるいは 〔数式 2〕 による補正演算処理値、 〔数式 3〕 あるいは 〔数式 4〕 による算出処理値を、 各サイクル数の関数と してグラフの形でコンピュータのデスプレ一上に表示および/または 印字しても、 しなくてもよいので、 それらの表示およびノまたは印字 のサブステップは必要に応じて追加すればよい。
前記データ解析方法は、 リアルタイム定量的 P C R方法が蛍光色素 の発光の減少量を測定するものである場合に特に有効である。 その具 体例として、 前記の'本発明のリアルタイム定量的 P C R方法である。 第四の特徴は、 リアルタイム定量的 P C Rの解析装置において、 前 記本発明のリアルタイム定量的 P C R方法のためのデ一夕解析方法を 実行する演算および記憶手段を有するリアルタイム定量的 P C Rの測 定および/または解析装置である。
第五の特徴は、 リアルタイム定量的 P C Rの解析装置を用いて P C Rを解析するデータ解析方法の各手順をプログラム化して、 そのプロ グラムを記録したコンピュ一夕読取可能な記録媒体において、 前記本 発明のデ一夕解析方法の各手順をコンピュータに実行させることがで きるようにしたプログラムを記録したコンビュ一夕読取可能な記録媒 体である。
第六の特徴は、 前記の本発明の核酸の融解曲線の分析方法、 即ち、 本発明の P C R方法を行って核酸の T m値を求める方法によって得ら れるデータを解析する方法である。
即ち、 本発明の P C R法により増幅された核酸について、 低い温度 から核酸が完全に変性するまで、 温度を徐々に上げる過程 （例えば、 5 0〜 9 5 °C ) 、 この過程において、 短い時間間隔 （例えば、 0 . 2 〜 0 . 5 °Cの温度上昇に相当する間隔） で蛍光強度を測定する過程、 測定結果を時間の関数としてデスプレー上に表示する過程、 即ち、 核 酸の融解曲線を表示する過程、 この融解曲線を微分して微分値 （一 d F / d T、 F ： 蛍光強度、 T ： 時間） を得る過程、 その値を微分値と してデスプレー上に表示する過程、 その微分値から変曲点を求める過 程からなる、 解析方法である。 本発明においては、 蛍光強度は温度が 上がるごとに増加する。 本発明においては、 各サイクルにおける核酸 伸長反応時、 好ましくは P C R反応終了時の蛍光強度値を熱変性反応 時の蛍光強度値を用いて割る演算処理する過程を上記の過程に追加す ることにより、 より好ましい結果が得られる。
前記の本発明の新規な P C R方法のデータ解析方法に、 本発明の核 酸の融解曲線の分析をする方法を追加してなる本発明のリアルタイム 定量的 P C Rの測定および Zまたは解析装置も本発明の技術的範囲内 である。
更に、 第七の'特徴は、 本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法の 各手順をコンピュ一夕に実行させることができるようにしたプロダラ ムを記録したコンピュータ読取可能な記録媒体、 また、 前記本発明の P C R方法のデータ解析方法の各手順をコンピュータに実行させるこ とができるようにしたプログラムを記録したコンピュータ読取可能な 記録媒体において、 本発明の核酸の融解曲線の分析をする方法の各手 順をコンピュータに実行させることができるようにしたプログラムを 追加して記録したコンピュータ読取可能な記録媒体である。
本発明の前記のデータ解析方法、 装置、 および記録媒体は、 医学、 法医学、 人類学、 古代生物学、 生物学、 遺伝子工学、 分子生物学、 農 学、 植物育種学等の各種の分野で利用できる。 また、 複合微生物系、 共生微生物系と云われ、 色々の種類の微生物が混在するかもしくは少 なく とも一種類の微生物が他の動物、 植物由来の細胞と共に混在して いて相互に単離できない微生物系等に好適に利用できる。 こ こで云う 微生物とは一般的に云う微生物のことで、 特に限定されるものではな レ 例えば、 真核微生物、 原核微生物、 その他マイコプラズマ、 ウイ ルス、 リ ツケチヤ等を挙げることができる。
また、 本発明の前記データ解析方法、 装置および記録媒体の一つま たはそれ以上を用いて、 複合微生物系または共生微生物系における特 定菌株の 5 S r R N A、 1 6 S r R N Aもしくは 2 3 S r R N Aまた はそれらの遺伝子 D N Aのコピー数を定量することにより、 当該系に おける特定菌株の存在量を測定することができる。 それは、 5 S r R N A、 1 6 S r R N Aもしくは 2 3 S r R N Aの遺伝子 D N Aのコピ 一数は菌株よつて一定であるからである。 本発明においては、 複合微 生物系または共生微生物系のホモジネートを用いて、 本発明のリアル タイム定量的 P C Rを行い、 特定菌株の存在量を測定することが可能 である。 この方法も、 本発明の技術的範囲内とする。 実施例
次に実施例および比較例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。 実施例 1
核酸プローブの合成 ：
標的核酸 Aの塩基配列をオリゴデォキシリポヌクレオチドからなる (5' ) tgc cat ccc etc aat gg(3' )として、 本発明の核酸プローブの合 成を次の順序で行った。
核酸プロ一ブのデザィン ：
標的核酸の塩基配列が前記の通りであるから核酸プローブの塩基配 列は簡単にオリゴデォキシリポヌクレオチドからなる（5' )cca ttg ag g gga tgg ca(3' )と設計できた。 また本発明の核酸プローブを以下の ようにデザインした。 5 ' 末端のリ ン酸にドナ一色素 BODIPY FL (Mole cular Probes社、 USA)を、 5 ' 末端から 4番目のチミ ンの塩基環の 6位 Cの〇 H基にァクセプ夕一色素 B0DIPY 581 /591 (Molecular Probes社、 D - 2228、 USA) を標識するものとした（BOD IPY FL-(5' ) cca (BODIPY 581 /590 ttg agg gga tgg ca(3')なるデザィン ： 核酸プローブ 1 ) 。 5' Amino-Modi f ier C6キッ ト （Glen Research社、 米国） を用いてチ ミジル酸のリ ン酸基をリ ンカ—— （CH2) 6- SHで修飾した。 Amino- Modi fier C2dTキッ ト （Glen Research社、 米国） を用いてチミジンの塩基 環の 6位 Cの O H基をリ ンカー- (CH2) 7 -NH2で修飾した。これらの修飾 チミジル酸およびチミジンを用いて、 D NA合成機 （ABI 394) (株式 会社パ一キンエルマ一ジャパンアプライ ド） を用いて、 次の塩基配列 を有するオリゴヌクレオチドを合成した。 すなわち、 HS- (CH2) 6-(5' ) cca (H2N-(CH2) 7 -) ttg agg gga tgg ca (3' )の塩基配列をもつデォキ シリポオリゴヌク レオチドで、 5 ' 末端のリン酸基が前記リ ンカ一-（C H2) 6- SHで、 また 5 ， 末端から 4番目チミンの塩基環の 6位 Cの〇 H 基がリ ンカ一-（CH2) 7- NH2で修飾されている。 なお、 D NAの合成は /3—シァノエチルフォスフォアミダイ ト （2_cyano ethyl phosphor am id ite) 法で 5 ' 末端 T r O Nで行った。 合成した後、 保護基の脱離は 2 8 %アンモニア水で 5 5 °C、 5時間で行った。
合成物の精製 ：
前記で得られた合成オリゴヌクレオチドを乾固し乾固物を得た。 そ れを 0.5M NaHC03/Na2C03緩衝液 （ρΗ9· 0) に溶解した。 当該溶解物を Ν AP-10カラム （フアルマシア社製） でゲルろ過を行い、 未反応物を除去 した。
ァクセプター色素の標識 ：
前記濾過物を乾固し、 O Lの滅菌水に溶解した （オリゴヌクレオ チド A溶液） 。 lmgの BODIPY 581 /591 -NHS (Molecular Probes社、 USA) を 100 Lの DMF (ジメチルホルムアミ ド） に溶解し、 前記オリゴヌク レ ォチド A溶液、 1M NaHC03/Na2C03バファ一 150 x Lを加え、 撹拌後、 室 温で 1晚反応させた。 .
合成物の精製 ：
前記反応物を NAP-25 (フアルマシア社製） でゲルろ過を行い、 未反 応物を除去した。 次いで、 2%TFAで保護基を脱離した。 SEP- PAC C1 S力 ラムを用いる逆相 HPLCを行い、前記オリゴヌクレオチドのリ ンカ一-（C H ） 7- にァクセプター色素 B0DIPY 581 /591を結合せた目的物を分 画した。 分画物を NAP-10 (フアルマシア社製） でゲル濾過した。
ドナー色素の標識 ：
前記ゲル濾過物を乾固し、 150 Lの滅菌水に溶解した （オリゴヌク レオチド B溶液） 。 l m gの BODIPY FL-Chlor ide (Molecular Probes 社、 USA) を 100 Lの DMFに溶解し、 前記オリゴヌクレオチド B溶液、 1 ¾1 11(：03/^2(；03バファ一150 1^を加ぇ、 撹拌後、 室温で 1晚反応 させ、 5 ' 末端のリ ンカ一-（CH2) 6- SHにドナ一色素 BODIPY FLを結合 させた。 '
合成物の精製 ：
前記反応物を NAP- 25 (フアルマシア社製） でゲルろ過を行い、 未反 応物を除去した。 前記同様の逆相 HPLCを行い、 5 ' 末端より 4番目の チミン塩基に前記ァクセプ夕一色素 BODIPY 581/591を結合させたオリ ゴヌクレオチドで、 かつ 5 ' 末端にドナー色素 BODIPY FLを付加した本 発明の核酸プローブ、 すなわち、 ドナ一色素とァクセプター色素で標 識された本発明の核酸プローブ 1 を得た。 なお、 本発明の核酸プロ一 ブは前記ァクセプター色素を結合させたオリゴヌクレオチドより遅れ て溶出された。
本発明の核酸プローブの定量は、 分光光度計で 2 6 0 n mの値を測 定することにより行った。 また、 当該プローブについて、 分光光度計 を用いて 6 5 0〜 2 2 0 nmの吸光度のスカンニグを行った結果、 B0 DIPY FL> BODIPY 581/59 K D N Aの吸収があることを確認した。 さら に、 前記同様の逆相 H P L Cで精製物の純度検定を行った結果、 シン ダルピークであることを確認した。
なお、 上記の逆相クロマトグラフィーの条件は次の通りである ： 溶出ソルべント A ： 0.05N TEAA 5%CH3CN
溶出ソルベント B (グラジェント ' (gradient) 用） ： 0.05N TEAA 40%CH3CN
カラム ： SEP- PAK C18;6 X 250mm
溶出速度 ： 1. Oml/min
温度 ： 4 0 °C
検出 ： 2 5 4 nui
実施例 2
ァクセプ夕一色素 BODIPY 581/591のみ標識したプロ一ブ （ （5' )cca (B 0DIPY 581/591 ) t tg agg gga tgg ca(3' )) (核酸プロ一ブ 2 ) の合成：
5 '末端のリ ン酸基に ドナー色素 BODIPY FLで標識する操作を除く以 外は核酸プロ一ブ 1 と同様な操作で合成した。
実施例 3
ドナ一色素 BODIPY FLのみ標識したプロ一ブ （ （BODIPY FL) (5' ) cca t tg agg gga tgg ca(3' )) (核酸プロ一プ 3 ) の合成 ：
5 ' 末端のリ ン酸基にァクセプター色素 BODIPY 581/591で標識する 操作を除く以外は核酸プロ一ブ 1 と同様な操作で合成した。
実施例 4 - 標的核酸の合成 ：
前記のオリゴヌクレオチドの合成と同様にして、 (5' ) tgc cat ccc etc aat gg(3' )なる塩基配列のオリゴヌクレオチドを合成して、本発 明の標的核酸とした。
実施例 5
標的核酸に本発明のプローブをハイブリダィズさせた反応系の蛍光強 度測定 ：
石英セル UOmmX lOmm) (容量 4mL) に 500 L緩衝液 （120mM NaCl (終 濃度 30mM)、 ΠΟπιΜ Tris- HC1 (終濃度 30mM;pH=7.2) を添加し、 次に 1460 Lの滅菌蒸留水を添加し撹拌した。 そこに、 の本発明の核酸プ ローブ 1 または核酸プローブ 2 ( IO M) 溶液を添加して （核酸プロ一 ブ終濃度 40nM)撹拌した。 30°Cに保温して蛍光波長をスキヤンした（励 起波長 ： 49Qnm (8nm幅） ） 、 測定蛍光波長 ： 58Gnm (8nm幅） 。 ついで、 反応系を 60°Cに制御した後、 10 x M濃度の標的核酸溶液 32. Oix Lを添加 し （標的核酸終濃度 160ηΜ) 、 撹拌した。 そして蛍光波長をスキャンし た。 ついで、 温度を 3 0 °Cに制御して核酸プローブと標的核酸をハイ ブリダィズさせ、 蛍光波長をスキャンした。 その結果を表 1および 2 に した。
なお、 恒温セルホルダーとして、 東京理科機器 （株） 製晶析用プロ グラム低温循環装置 PCC-7000を使用してセルの温度 （反応温度） を制 御した。 また、 蛍光測定はパーキンエルマ一社製蛍光光度計 LS50Bを使 用した。 表 1 ：ハイブリダイゼーション （HYB) 前後の 580 nmにおける蛍光強度変ィ匕
(励起 49 Onm)
HYB ：ハイブリダイゼ一シヨン
蛍光強度減少量： HYB前蛍光強度値— HYB後蛍光強度値
減少率：蛍光強度減少量/ HYB前蛍光強度値 表 2：ハイブリダィゼーシヨン （HYB) 前後の 5 1 0 nmにおける蛍光強度変化
(励起 4 9 O nm)
HY B ：ハイプリダイゼ一シヨン
蛍光強度減少量： HY B前蛍光強度値一 HY B後蛍光強度値
減少率：蛍光強度減少量 ZHYB前蛍光強度値 表 1 においてはァクセプ夕一色素 BOD I PY 581 / 591の蛍光強度を測定 したものであり、 表 2 においてはドナー色素の蛍光強度を測定したも のである。
表 1から次のことが分かる ：
すなわち、 ハイブリ ダィゼ一シヨ ン前のァクセプター色素の蛍光強 度は、 核酸プローブ 1 +標的核酸の実験系において、 核酸プロ一ブ 2 +標的核酸の実験系のものに比較して極端に高いことがわかる。 これ は、 核酸プロ一ブ 1 においては、 ドナー色素である BOD I PY FLとァクセ プ夕一色素である B0D I PY 581 /591の間で FRET現象がおこり、 ァクセプ タ一色素が発光したことによるものである。 一方核酸プロ一ブ 2では 分子内にドナ一色素を有さないために、 FRET現象が発生せず、 蛍光を 発することがなかった。
八イブリダィゼーシヨ ン後において、 核酸プローブ 1 +標的核酸の 実験系において、 大きく減少した。 核酸プローブ 2 +標的核酸の蛍光 強度の実験系のものは、 殆ど変化なかった。 これは、 核酸プローブ 1 と標的核酸がハイブリダィズしたことにより、 ドナ一色素が G C水素 結合体に接近したために、 エネルギーが G C水素結合体の方に転移し たためである。
表 2からは次のことが分かる ：
ハイブリダィゼーシヨ ン前のドナー色素の蛍光強度は、 核酸プロ一 ブ 1 +標的核酸の実験系において、 核酸プローブ 2 +標的核酸の実験 系のものに比較して極端に高いことがわかる。 これは、 核酸プローブ 1 においては、 ドナ一色素である BODIPY FLとァクセプタ一色素である B0DIPY 581 /591の間で FRET現象がおこり、 ドナー色素のエネルギーが ァクセプ夕一色素の方へ転移したことによるものである。 一方核酸プ ローブ 3では分子内にァクセプター色素を有さないために、 FRET現象 が発生せず、 蛍光を発したことによる。
ハイブリダィゼ一シヨ ン後において、 核酸プローブ 1 +標的核酸の 実験系において、 僅かに減少したのみである。 これは、 標的核酸にハ イブリダィズしたことにより、 ドナー色素が G C水素結合体に接近し たために、 そのエネルギーがァクセプター色素から G C水素結合体の 方に転移したためである。 一方、 核酸プローブ 3 +標的核酸の蛍光強 度の実験系のものは、 著しく減少した。 これは、 標的核酸にハイプリ ダイズしたことにより、 ドナー色素が G C水素結合体に接近したため に、 発光に費やしていたエネルギーが G C水素結合体の方に転移した ためである。
表 1および 2から分かるように、 本発明の核酸プロ一ブは、 標的核 酸にハイブリダィズすると ドナー色素おょぴァクセプ夕一色素の蛍光 強度が共に減少するように設計されたものである。
実施例 6
実施例 1、 2 、 3および 4と同様にして、 標的核酸 B ： (5' )aacgat gcca tggatttgg(3' )なる塩基配列のオリゴデォキシリポヌク レオチド を合成した。 また、 前記実施例と同様にして、 ァクセプ夕一色素として X— 口一 ダミンを、 ドナー色素として BODIPY FLを標識し、 前記標的核酸 Bにハ イブリダィズする本発明の核酸プローブ 4を作製した。 核酸プローブ 4は下記の構造を有した ： BODIPY FL-(5' ) ccaaat (X-Rhod amine) ccat ggcatca 11 (3 )。
標的核酸 Aおよび Bが存在する測定系にに本発明の核酸プローブ 1 および 4を添加し標的核酸 Aと核酸プローブ 1 を、 および標的核酸 B と核酸プローブ 4を八イブリダィズさせた反応系の蛍光強度測定 ： 石英セル （ 1 0 mmx 1 0 mm) (容量 4 mL) に 5 0 0 L緩衝液 （ 1 2 0 MM NaCl (終濃度 3 0 mM) 、 1 2 0 mM Tr is-HCl (終濃度 3 0 mM ; p H= 7 - 2 ) を添加し、 次に 1 4 6 0 Lの滅菌蒸留水を添加し撹拌し た。 そこに、 8 . 0 〃 Lの本発明の核酸プローブ 1および核酸プローブ 4 ( 1 0 M) 溶液を添加して （核酸プローブ終濃度 4 O nM) 撹拌した,
4 5 °Cに保温して蛍光強度を測定した。 （プローブ 1 ： 蛍光測定波長、
5 8 0 nm ( 5 nm幅） ； プローブ 4 : 測定波長、 6 1 0 nm ( 5 nm幅） ； 励起波長 （共通） ： 4 9 0 nm ( 8 nm幅） ） 。 ついで、 表 3 に示した 各濃度について標的核酸 Aおよび Bの各溶液 3 2. 0 i Lを添加し、 撹 拌した。 そして蛍光強度を測定した。 その結果を表 3 に示した。
なお、 恒温セルホルダー、 蛍光測定装置等は前記実施例と同様なも のを使用し、 方法も前記実施例と同様に行った。
表 3 ：ハイブリダィゼーシヨン （HYB) 前後の 58 Onmおよび 610nmにおける 蛍光強度変ィ匕 （前者の励起 49 OMJ 後者の励起 49 Onm)
H Y B：ハイブリダィゼーシヨン
蛍光強度減少量： HYB前蛍光強度値一 HYB後蛍光強度値
減少率：蛍光強度減少量/ HYB前蛍光強度値
表 3から分かるように、 5 8 0 nmおよび 6 1 0 nmにおける蛍光強度 は、 ハイブリダイゼ一ショ ン後は添加した標的核酸濃度に応じて減少 している。 励起光 4 9 0 nmの塲合、 5 8 O n mの蛍光強度は本発明の プローブ 1 のものであり、 6 1 O nmのものは本発明のプロ一ブ 4のも のである。 このように、 測定系に複数の標的核酸が存在していても、 本発明の核酸プローブとそれを用いた核酸測定方法を用いることによ り、 複数の標的核酸を同時にかつ簡便に測定できることが分かる。 産業上の利用可能性
前記のように本発明の核酸プローブは構成されているので、 標的核 酸にハイブリダィズすると、 蛍光強度がハイブリダィゼ一ショ ン前後 で、 ドナー色素およびァクセプタ一色素の蛍光強度が共に顕著に減少 するので、 標的核酸を微量でしかも、 正確かつ簡便、 短時間に測定で きる。
また、 ドナー色素は、 エネルギーが G C水素結合体の方に転移でき るものであるので、 その種類が限定されるが、 ァクセプター色素はそ のような性質がなく ともよいので、 エネルギー転移を受ける性質を有 していれば、 種々の色素が利用できる。 ということは、 本発明におい て一つのドナー色素 （一つの励起波長） で種々の蛍光色を発する （蛍 光波長の異なる） 核酸プロ一ブを製作できることになる。 このことは、 多種類の核酸を測定する核酸測定装置において、 励起用レーザ——種 類を備えておればよいので、 励起するための光学系を単純にする。 す なわち核酸測定装置の設計 · 製作も容易になる。
また、 励起用レ一ザ一がー波長しかない単純な核酸測定装置でも多 種類の核酸プローブを使用できるので、 多種類の標的核酸を同時に測 定できる。

Claims

請求の範囲
1 . FRET現象を引き起こす蛍光色素ペア一すなわち ドナー色素にな り得る蛍光色素 （ドナー色素） とァクセプ夕一色素になり得る蛍光色 素 （ァクセプ夕一色素） のペア一を少なく とも一ペア一を形成するよ うに複数の蛍光色素で標識された一本鎖の核酸プローブにおいて、 当 該プローブが標的核酸にハイブリダィズしたときに、 ァクセプター色 素の蛍光強度が減少するように塩基配列が設計され、 かつ前記色素が 標識されていることを特徴とする核酸測定用の新規核酸プローブ。
2. ドナー色素およびァクセプ夕一色素の蛍光強度が共に減少する 請求の範囲第 1項に記載の核酸測定用の新規核酸プローブ。
3 . ドナ一色素となり得る蛍光色素が BODIPY FL、 B0DIPY 493/503, 5 - FAM、 Tetramet ylr odamine,または 6- TAMRAである請求の範囲第 1項 または第 2項に記載の核酸測定用の新規核酸プローブ。
4. ドナー色素とァクセプ夕一色素の一対の色素ペア一を有する請 求の範囲第 1項〜第 3項のいずれか一項に記載の核酸測定用の新規核 酸プローブ。
5. 核酸プローブが、 その末端部において ドナー色素で標識されて おり、 当該核酸プローブが当該末端部において標的核酸にハイプリダ ィズしたとき、 当該プローブにハイブリダィズした標的核酸の末端塩 基から 1ないし 3塩基離れて、 標的核酸の塩基配列に G (グァニン） が少なく とも 1塩基存在するように、 当該プローブの塩基配列が設計 されている請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれか一項に記載の核酸測 定用の新規核酸プローブ。
6. 核酸プローブが、 標的核酸にハイブリダィゼーシヨ ンしたとき、 ドナ一色素標識部においてプローブ一核酸八イブリ ツ ドの複数塩基対 が少なく とも一つの G (グァニン） と （シ トシン） のペア一を形成 するように、 当該プローブの塩基配列が設計されている請求の範囲第 1項〜第 5項のいずれか一項に記載の核酸測定用の新規核酸プローブ,
7. ドナ一色素が核酸プローブの 5 ' 末端部 （ 5 ' 末端を含む。 ） を標識している請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれか一項に記載の核 酸測定用の新規核酸プローブ。
8. ドナー色素が核酸プローブの 3 ' 末端部 （ 3 ' 末端を含む。 ） を標識している請求の範囲第 1項〜第 7項のいずれか一項に記載の核 酸測定用の新規核酸プローブ。
9. 核酸プローブの 5 ' 末端塩基が Gまたは Cで、 かつ 5 ' 末端が ドナ一色素で標識されている請求の範囲第 7項に記載の核酸測定用の 新規核酸プロ一ブ。
1 0. 核酸プローブの 3 ' 末端塩基が Gまたは Cで、 かつ 3 ' 末端 がドナー色素で標識されている請求の範囲第 8項に記載の核酸測定用 の新規核酸プロ一ブ。
1 1. 少なく とも一種以上の標的核酸が存在する測定系に、 請求の 範囲第 1項〜第 1 0項の少なく ともいずれか一項に記載の核酸測定用 の新規核酸プロ一ブであって、 当該標的核酸にハイブリダィズする核 酸測定用の新規核酸プローブで、 かつ標的核酸の種の数と少なく とも 同数の種の数でかつ発光蛍光色の異なる核酸測定用の新規核酸プロ一 ブを存在させ、 核酸測定用の新規核酸プローブと標的核酸を八イブリ ダイズさせて、 核酸測定用の新規核酸プローブの種の数と少なく とも 同数の種の数の波長で、 ハイブリダィゼ一シヨ ン前後における測定波 長の蛍光強度の減少量を測定することを特徴とする新規核酸測定方法
1 2. 少なく とも一種以上の標的核酸が存在する測定系における標 的核酸の濃度を測定するキッ トにおいて、 請求の範囲第 1項〜第 1 0 項の少なく ともいずれか一項に記載の核酸プローブを含有または付帯 することを特徴とする核酸測定用キッ ト。
1 3. 少なく とも一種以上の標的核酸が存在する測定系における標 的核酸の多型 （polymorphism) または Zおよび変異 （mutation) を解 析もしくは測定する方法において、 請求の範囲第 1項〜第 1 0項の少 なく ともいずれか一項に記載の核酸測定用の新規核酸プローブであつ て、 標的核酸の種の数と少なく とも同数の種の数で、 かつ発光蛍光色 の異なる核酸測定用の新規核酸プローブを測定系に存在させ、 標的核 酸と核酸測定用の新規核酸プローブをハイブリダィズさせて、 核酸測 定用の新規核酸プローブの種の数と少なく とも同数の種の数の波長で ハイブリダイゼーショ ン前後における測定波長の蛍光強度の減少量を 測定することを特徴とする標的核酸の多型または Zおよび変異を解析 もしくは測定する方法。
1 4 . 少なく とも一種以上の標的核酸が存在する測定系の標的核酸 の多型または Zおよび変異を解析もしくは測定する測定キッ トにおい て、 請求の範囲第 1項〜第 1 0項の少なく ともいずれか一項に記載の 核酸測定用の新規核酸プローブを含有または付帯することを特徴とす る標的核酸の多型または/および変異を解析もしくは測定するための 測定キッ ト。
1 5 . 請求の範囲第 1 1項または第 1 3項に記載の核酸測定方法に おいて、 標的核酸が、 純粋分離して得た微生物由来、 または動物由来 であることを特徴とする核酸測定方法。
1 6 . 標的核酸が、 複合微生物系、 または共生微生物系の細胞内も しくは細胞のホモジネートに含まれる核酸である請求の範囲第 1 1項 または第 1 3項に記載の核酸測定方法。
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