WO2002072615A1 - Methode de purification de proteines - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to a method for purifying a protein, and more particularly to a method for removing DNA as a contaminant from a sample containing a physiologically active protein such as an antibody.
- DNA is generally obtained by treating an aqueous medium containing a bioactive protein obtained from a host cell with anion exchange chromatography, hydroxyapatite chromatography, or a combination thereof. Has been removed.
- bioactive protein when the bioactive protein is an antibody obtained by using a mammalian cell as a host, protein A or protein G can be used by utilizing the property of protein A or protein G to bind to the Fc chain of IgG. After performing the affinity column chromatography, it is purified by various chromatography methods.
- an antibody-containing aqueous medium obtained from mammalian cell culture is applied to protein A or protein G column chromatography to absorb the antibody into the column,
- the antibody is eluted using a solution (concentration of about 0.1 M, citric acid, pH 3.0-3.5), and the resulting acidic eluate is subjected to ion exchange column chromatography and size exclusion column chromatography. It is applied and refined sequentially.
- these various chromatography steps and their combinations are time-consuming, labor-intensive, costly, complicated, and their effects are not stable.
- the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems.As a result, surprisingly, the physiologically active protein-containing sample was made into a low-conductivity acidic aqueous solution, and a buffer was added to adjust the pH to a neutral range.
- the present invention was completed by finding that DNA contaminants can be efficiently removed without performing a complicated one-step chromatography step by raising the concentration and filtering the resulting particles through a filter.
- the present invention provides the following.
- bioactive protein-containing sample is brought into a low-conductivity aqueous solution in a neutral pH range, and 2) The resulting particles are removed.
- a method for removing DNA contaminants in a bioactive protein-containing sample comprising:
- a method for removing DNA contaminants in a sample containing a physiologically active protein comprising:
- a method for removing DNA contaminants in an antibody-containing sample comprising: (4) The method according to the above (2) or (3), wherein the conductivity of the low-conductivity acidic aqueous solution is a molar concentration of 0 to 100 mM.
- the acidic aqueous solution is selected from aqueous solutions of hydrochloric acid, citric acid, and acetic acid;
- the bioactive protein contained in the bioactive protein-containing sample purified by the method of the present invention includes, for example, granulocyte colony stimulating factor (G—CSF), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM—CSF), erythropoietin (EPO ), Hematopoietic factors such as thrombopoietin, interferon ', cytokinin such as IL-1 and IL-6, monoclonal antibodies, tissue plasminogen activator (TPA :), perokinase, serum albumin, blood coagulation Including but not limited to factor VIII, leptin ', insulin, stem cell growth factor (SCF), and the like.
- G—CSF granulocyte colony stimulating factor
- GM—CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
- EPO erythropoietin
- Hematopoietic factors such as thrombopoietin, interferon ', cytokinin such
- a bioactive protein is a protein having substantially the same biological activity as that of a mammal, particularly a human bioactive protein, and includes those derived from nature and those obtained by genetic recombination. Preferred are those obtained by genetic recombination. Proteins obtained by the genetic recombination method have the same amino acid sequence as the natural protein, or have one or more of the amino acid sequences deleted, replaced, or added, and have the biological activity described above. including. Furthermore, the biologically active protein also includes those chemically modified with PEG or the like.
- the origin of the sugar chain is not particularly limited, but a sugar chain added to mammalian cells is preferable.
- Mammalian cells include, for example, Chinese hamster ovary cells (CHO cells), BHK cells, COS cells, human-derived cells, etc. Among them, CHO cells are most preferred.
- EPO may be produced by any method, extracted from human urine by various methods, separated and purified, or obtained by genetic engineering techniques (for example, 6 1- 1 2 2 8 8) to produce Chinese hamster ovary cells (CHO), BHK cells, COS cells, and human-derived cells. For this purpose, those extracted and separated and purified by various methods are used.
- EPO chemically modified with PEG or the like see International Patent Application Publication No. WO 90/12874.
- EPO without sugar chain is also chemically modified with PEG or the like.
- EP ⁇ analogs that have been modified to increase the number of one or more glycosylation sites in the N-linked carbohydrate chain binding site or the 0-linked carbohydrate chain binding site in the amino acid sequence of EPO ( For example, see JP-A-8-151398 and JP-T-8-506023.
- the amount of sugar chains may be increased by increasing the content of sialic acid or the like without changing the number of sugar chain binding sites.
- any G-CSF can be used as long as it is highly purified G-CSF.
- the G-CSF in the present invention may be produced by any method, such as those obtained by culturing a cell line of human tumor cells and extracting and separating and purifying it from various methods, or E. coli by genetic engineering techniques. Bacteria such as yeast, yeast, Chinese hamster ovary (CHO) cells, C127 cells, and cultured cells derived from animals such as COS cells, etc., which are extracted and separated and purified by various methods are used. Preferably, it is produced by a gene recombination method using Escherichia coli, yeast or CH C cells. Most preferably, they are produced by genetic recombination using CHO cells. Furthermore, G-CSF chemically modified with PEG or the like is also included (see International Patent Application Publication No. WO 90/12874). '
- the monoclonal antibody may be produced by any method.
- a monoclonal antibody is basically immunized with a sensitizing antigen according to a usual immunization method using a known technique, and the obtained immunocytes are fused with a known parent cell by a usual cell fusion method, followed by usual screening. It can be prepared by screening monoclonal antibody-producing cells by the method.
- the monoclonal antibody is not limited to the monoclonal antibody produced by the hybridoma, and includes a chimeric antibody artificially modified for the purpose of, for example, reducing the antigenicity against humans. Alternatively, reshaped humanized antibodies can be used in the present invention.
- a reshaped humanized antibody is a humanized anti-IL-16 receptor antibody (hPM-1) (see International Patent Application Publication No. WO92-19759).
- hPM-1 humanized anti-IL-16 receptor antibody
- a humanized anti-HM1.24 antigen monoclonal antibody see International Patent Application Publication No. WO 98-14580
- a humanized antiparathyroid hormone-related peptide antibody anti-PTH1-P antibody
- WO 98-13388 International Patent Application Publication No. WO 98-13388
- humanized anti-tissue factor antibody see International Patent Application Publication No. WO 99-51743 are also preferred antibodies used in the present invention.
- a human antibody produced by a transgenic animal such as a phage display, is also preferable.
- the bioactive protein-containing sample or the antibody-containing sample is preferably a culture medium of a mammalian cell such as a CHO cell containing a bioactive protein or an antibody obtained by culturing, or a part thereof. It is one that has been subjected to certain processing such as purification.
- bioactive protein-containing sample is brought into a low-conductivity aqueous solution in a neutral pH range
- the low-conductivity aqueous solution having a neutral pH range generally means an aqueous solution having a molar concentration of 0 to 100 mM, preferably 0 to 50 mM, more preferably 0 to 30 mM, or an ionic strength of 0 to 30 mM.
- bioactive protein is an antibody, comprising the following steps:
- the DNA contaminants in the antibody-containing sample are removed by a method comprising:
- the sample containing a physiologically active protein is placed in a low-conductivity acidic aqueous solution state, and the low-conductivity is preferably obtained by eluting protein A or protein G affinity chromatography with a low-conductivity acidic aqueous solution.
- Acid aqueous solution The acidic aqueous solution having low conductivity in the present invention is generally an aqueous solution having a molarity of 0 to 100 mM, preferably 0 to 50 mM, more preferably 0 to 30 mM, or an ionic strength of 0 to 0 mM.
- an aqueous solution of 0 to 0.12 or an aqueous solution having a conductivity of 0 to 300 mS / m, preferably 0 to 200 mS / m, more preferably 0 to 150 mS / m, pH 1.5 to 3.9 It preferably refers to an aqueous solution having a pH of 2.0 to 3.9, more preferably a pH of 2.0 to 3.0.
- the acidic aqueous solution may be selected from aqueous solutions of hydrochloric acid, citric acid, acetic acid and the like.
- the type, conductivity, and pH of the low-conductivity acidic aqueous solution to be used vary depending on the type of biologically active protein and antibody to be purified, and those skilled in the art carry out preliminary tests according to the method described in this specification. By doing so, these optimal conditions can be set easily.
- the physiologically active protein-containing sample is brought into a low-conductivity acidic aqueous solution state, and then a buffer is added to the obtained sample to raise the pH to a neutral range.
- a buffer is added to the obtained sample to raise the pH to a neutral range.
- the antibody-containing sample to protein A or protein G affinity chromatography, elute with a low-conductivity acidic aqueous solution, and buffer the resulting eluate.
- the solution is added to raise the pH to a neutral range. Buffer added at this stage, for example, Tris-HCl buffer, and the like phosphate buffer, further Tris solution, Na 2 HP0 4 aqueous solution, but also including aqueous NaOH.
- the neutral region differs depending on the type of physiologically active protein and antibody to be purified, and is generally pH 4 to 8, preferably pH 4.3 to 7.5, and more preferably pH 4.5. ⁇ 7.5.
- the type of buffer solution used and the pH in the neutral region those skilled in the art can easily set the optimal conditions by conducting a preliminary test according to the method described herein.
- the low-conductivity alkaline aqueous solution used in the method of the present invention is usually an aqueous solution having a molar concentration of 0 to 100 mM, preferably 0 to 50 mM, more preferably 0 to 30 mM.
- the pH is 7.5 to 13 (pH varies depending on the bioactive protein to be purified and the type of antibody).
- the solution that has reached the neutral region in the above step produces particles (white turbidity).
- particles white turbidity
- DNA contaminants can be efficiently removed.
- the filter used for filtration for example, a 1.0-0.2 ⁇ Cellulose Acetate Filter System (manufactured by Corning) or TFF can be used, but the filter is not limited thereto.
- a centrifugal separation operation or the like can be considered, and any method capable of efficiently removing the particles may be used, and is not limited to filter filtration.
- this particle is a complex formed by a bioactive protein and DNA. Filtering out the particles results in a small loss of bioactive protein contained in the DNA-bioactive protein complex, but it is a few percent of the total bioactive protein, and is described in the Examples below. Thus, about 90% of the bioactive protein could be recovered.
- the bioactive protein purified by the method of the present invention may be further purified by cation exchange chromatography, anion exchange chromatography, hydroxyapatite chromatography, or a combination thereof, and used in a pharmaceutical preparation. Can be.
- a DNA quantification method measurement is performed by a threshold total DNA quantification method, and a DNA extraction operation is performed prior to the measurement, but is not limited thereto.
- DNA contaminants can be efficiently removed at extremely low DNA concentrations (for example, 22.5 pg / ml) by an extremely simple method, and purification of bioactive proteins, particularly antibodies, can be performed. Became much more effective.
- the cost can be reduced by the method of the present invention, which has a special technical significance.
- Example 1 Investigation of the buffer composition of porcine tin Affinity take mouth chromatography for purification of hPM-1 (humanized anti-IL-16 receptor antibody).
- CM Humanized anti-IL-6 receptor antibody
- CA Cellulose Acetate
- HPLC L-6200 Intelligent Pump (HITACHI) L-4200 UV-VIS Detector (HITACHI)
- h PM-1 quantification method Quantification is performed by reverse-phase HPLC using a PLRP-S column (Polymer Laboratories) by a linear concentration gradient method.
- Threshold total DNA is measured by a DNA quantification method. Perform a DNA extraction procedure (such as DNA extractor kit Kuwako Pure Chemicals) prior to measurement. For the measurement, use a threshold total DNA determination kit (Molecular Devices).
- Turbidity measurement method A measurement sample is supplied to a spectrophotometer U-2000 (HITACHI) to monitor the state of particle formation, and the absorption at 660 nm is measured.
- HITACHI spectrophotometer U-2000
- NaCl was added to the eluate hydrochloric acid in Elution Method 2, and the correlation between the added NaCl concentrations (0 mM, 50 mM, 100 mM) and various factors was determined.
- the Protein A eluted fraction with each addition of NaCl was adjusted to pH 7.0 with a 300 mM Tris solution before filtering, and after adjusting the pH, the sample was 0.22 ⁇ m.
- the sample filtered by m CA Filter was called after filtration. Before and after filtration, the sample after filtration was measured for the recovery of hPM-1 (after filtration only) by the above-described method to determine the amount of residual DNA.
- the hPM-1 recovery rate under each elution condition was measured. As a result, the recovery in elution method 1 was 98.6 ° /. And was good. The recovery rate in the elution method 2 varied from 83.8% to 97.1%, and the recovery rate in the elution method 2 varied from 83.5% to 93.7%. It was presumed to be variation. Therefore, a study with an improved purification scale (elution method 2) confirmed that hPM-1 yield was 90% or more stably. Therefore, even when hydrochloric acid is eluted, h PM The recovery rate of 11 was found to be good.
- Table 2 shows the results of examining the correlation between the added NaCl concentration in the eluate hydrochloric acid and various factors. [Table 2]
- the hPM-1 recovery rate after filtration was 88% for the lOOmM NaCl-added sample, and was 86% for the 50mM NaCl addition and 81% for the OmM NaCl addition in that order.
- the value of OmM NaCl-added kamuna sampnore showed a low value, and in particular, the OmM NaCl-added sample after filtration had an extremely low value of llpg DNA / mg h PM-1.
- Elution fraction adjustment Adjust the pH to various values with a 1M Tris aqueous solution, and remove the DNA by filtration with a 0.2 im Cellulose Acetate (hereinafter abbreviated as CA) filter (examine the conditions in (1) below).
- CA Cellulose Acetate
- the antibody-containing CM was loaded. Subsequently, unbound impurities were washed with 150 mM NaCl in citrate-phosphate buffer pH 7.5, and further washed with citrate-phosphate buffer pH 7.5 in order to lower the conductivity. Elution was performed with an aqueous solution. The elution profile was monitored at A280nm and protein peaks were collected. The following conditions were examined using the protein A elution fraction.
- a sample containing a humanized anti-HM1.24 antigen monoclonal antibody (culture supernatant cultured in CHO cells) was purified by a method using protein A affinity column chromatography under the conditions shown in Table 4 below. .
- the HM1.24 antigen monoclonal antibody was prepared by the method described in International Patent Application Publication No. WO9814580.
- EPO-containing sample composition (1 mM phosphate buffer);
- G-CSF-containing sample cultivated in CHO cells: manufactured by Chugai Pharmaceutical
Description
明細書
タンパク質精製方法 技術分野
本発明はタンパク質の精製方法に関し、 さらに詳しくは抗体などの生理活性タ ンパク質を含有する試料中から夾雑物としての D N Aを除去する方法に関する。 背景技術
遺伝子組換え技術の発達によって、 種々のタンパク質製剤が安定した供給量で 提供されるようになった。 特に、 近年通常の医薬品に比べて選択性の高い様々な 抗体医薬品が遺伝子組換え技術によって開発されており、 臨床試験に入っている。 このような遺伝子組換え技術によつて産生された生理活性タンパク質を含有す る製剤においては、 宿主 D N Aやウィルスの汚染による D N A夾雑物を除去する 必要がある。 現在、 バイオ医薬品における D N Aの許容量は 1 0 0 p g D N A 一投与量以下であることが世界保健機構 （WH O) により示されている。 この基 準を満たすために、 一般には、 宿主細胞から得られる生理活性タンパク質を含有 する水性培地を陰ィオン交換クロマトグラフィ一、 ハイドロキシァパタイ トク口 マトグラフィー、 もしくはこれらの組合せで処理することにより D NAを除去し ている。
特に、 生理活性タンパク質が哺乳動物細胞を宿主として得られた抗体であると きには、 プロテイン Aもしくはプロテイン Gが I g Gの F c鎖に結合する性質を 利用して、 プロテイン Aもしくはプロテイン Gのァフィ二ティカラムクロマトグ ラフィ一処理を行つた後に種々のクロマトグラフィ一で精製している。
例えば、 特表平 5— 5 0 4 5 7 9号では、 哺乳動物細胞培養から得られた抗体 含有水性培地をプロティン Aもしくはプロティン Gカラムクロマトグラフィーに 適用して抗体をカラムに吸収させ、 次いで酸性溶液 （濃度約 0 . 1 Mのクェン酸、 p H 3 . 0 - 3 . 5 ) を用いて抗体を溶出させ、 得られる酸性溶出液をイオン交 換カラムクロマトグラフィー、 サイズ排除力ラムクロマトグラフィ一に順次適用 して精製している。
しかし、 これらの各種クロマトグラフィー工程やその組合せは時間、 労力、 コ ストがかかり、 煩雑であり、 また効果も安定していない。
従って、 より簡単な方法で、 確実に DNA夾雑物を除去でき、 しかも生理活性 タンパク質の損失が少なく、 かつ実施コス トの低い生理活性タンパク質、 特に抗 体の精製方法が求められている。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究した結果、 驚くべきことに、 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性水溶液状態とし、 緩衝液を添加し て pHを中性域に上昇させ、 生じた粒子をフィルター濾過することにより、 煩雑 なクロマトグラフィ一工程を行わずに D N A夾雑物を効率よく除去できることを 見い出してして本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、 以下のものを提供する。
(1) 以下の段階：
1 ) 生理活性タンパク質含有試料を p Hが中性域の低伝導度水溶液状態とし、 2) 生じる粒子を除去する、
を含む、 生理活性タンパク質含有試料中の DN A夾雑物を除去する方法。
(2) 以下の段階：
1) 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアルカリ性水溶液状態 とし、
2) 得られる試料の pHを中性域に調整し、
3) 生じる粒子を除去する、
を含む、 生理活性タンパク質含有試料中の D N A夾雑物を除去する方法。
(3) 以下の段階：
1) 抗体含有試料をプロテイン Aもしくはプロテイン Gのァフィ二テイク口マト グラフィ一に適用して、 低伝導度の酸性水溶液で溶出し、
2) 得られる溶出液に緩衝液を添加して p Hを中性域に上昇させ、
3) 生じる粒子を除去する、
を含む、 抗体含有試料中の DN A夾雑物を除去する方法。
(4)低伝導度の酸性水溶液の伝導度が、 0〜100mMのモル濃度である前記（2) 又は （3) 記載の方法。
(5) 低伝導度の酸性水溶液のイオン強度が、 0〜0.2である前記 （2)又は （3) 記載の方法。
(6)低伝導度の酸性水溶液の導電率が、 0〜300 mS/raである前記（ 2 )又は（ 3 ) 記載の方法。
(7) 酸性水溶液が塩酸、 クェン酸、 酢酸の水溶液から選択される前記 （2) 〜
(6) のいずれかに記載の方法。
(8) 酸性水溶液の pHが 1.5〜3.9である前記 （7) 記載の方法。
(9) 処理後の生理活性タンパク質含有試料中の DNA夾雑物が DNA 濃度 22.5pg/nil以下である前記 （1) 〜 （7) のいずれかに記載の方法。
(10) 緩衝液が T r i s水溶液である前記 （3) 記載の方法。
(1 1) 緩衝液を添カ卩して pHを 4.3〜7.5に上昇させる前記 （3) 記載の方法。
(12) 生理活性タンパク質が抗体である前記 （1) 又は （2) に記載の方法。 (13) 抗体がヒ ト型化モノクローナル抗体である前記 （3) 又は （12) 記載 の方法。
(14) 抗体がヒ ト型化抗 I L一 6レセプター抗体である前記 （13) 記載の方 法。
(15) 抗体がヒ ト型化抗 HM1. 24抗原モノクローナル抗体である前記 （1 3) 記載の方法。
(16) 抗体がヒ ト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体 （抗 PTHr P抗 体） である前記 （13) 記載の方法。
(17) 抗体がヒト型化抗組織因子抗体である前記 （13) 記載の方法。
(18) 粒子をフィルター濾過によって除去する前記 （1) 〜 （3) のいずれか に記載の方法。
(19) 前記 （1) 又は （2) 記載の方法によって得られる精製生理活性タンパ ク質。
(20) 前記 （3) 記載の方法によって得られる精製抗体。
(21) pHが中性域の低伝導度水溶液中で抗体- DNA複合体を実質的に含まな
い精製抗体。
( 2 2 ) 精製抗体中の DNA濃度が 22.5pg/ml以下である精製抗体。 発明を実施するための最良の形態
本発明の方法で精製する生理活性タンパク質含有試料に含まれる生理活性タン パク質は、 例えば、 顆粒球コロニー刺激因子 （G— C S F ) 、 顆粒球マクロファ ージコロニー刺激因子 (GM— C S F)、 エリスロポエチン (E P O)、 トロンボポェ チン等の造血因子、 インターフェロン'、 IL-1や IL-6等のサイ ト力イン、 モノク ローナル抗体、 組織プラスミノーゲン活性化因子 (T P A：)、 ゥロキナーゼ、 血清 アルブミン、 血液凝固第 V I I I因子、 レプチン'、 インシュリン、 幹細胞成長因 子（S C F)などを含むが、 これらに限定されない。 タンパク質の中でも、 E P O、 G— C S F、 モノクロナール抗体等の抗体が好ましく、 さらに好ましくはモノク ローナル抗体である。 プロテイン Aもしくはプロテイン Gァフィ二テイクロマト グラフィーを用いて実施する本発明の態様では、 モノクローナル抗体が好ましい。 生理活性タンパク質とは、 哺乳動物、 特にヒ トの生理活性タンパク質と実質的 に同じ生物学的活性を有するものであり、 天然由来のもの、 および遺伝子組換え 法により得られたものを含むが、 好ましいのは遺伝子組換え法により得られたも のである。 遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とァ ミノ酸配列が同じであるもの、 あるいは該アミノ酸配列の 1又は複数を欠失、 置 換、 付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。 さらには、 生理活性 タンパク質は P E G等により化学修飾されたものも含む。
生理活性タンパク質が糖鎖を有するタンパク質である場合、 糖鎖の由来として は、 特に制限はないが、 哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。 哺乳動物細 胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞 (CHO細胞)、 BHK細胞、 COS 細胞、 ヒ ト由来の細胞等があるが、 この中でも、 CHO細胞が最も好ましい。 生理活性タンパク質が E P〇である場合には、 E P Oはいかなる方法で製造さ れたものでもよく、 ヒ ト尿より種々の方法で抽出し、 分離精製したもの、 遺伝子 工学的手法 （例えば特開昭 6 1— 1 2 2 8 8号） によりチャイニーズハムスター 卵巣細胞 （C H O) 、 B H K細胞、 C O S細胞、 ヒ ト由来の細胞などに産生せし
め、 種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。 さらには、 PEG等に より化学修飾された EPOも含む （国際特許出願公開番号 WO 90/1 2874 参照） 。 さらに、 糖鎖のついていない EPOを PEG等により化学修飾したもの も含む。 また、 E P Oのァミノ酸配列中の N—結合炭水化物鎖結合部位もしくは 0_結合炭水化物鎖結合部位において、 1以上のグリコシルイ匕部位の数を増加さ せるように改変した E P〇類似体も含む （例えば、 特開平 8— 1 51 398号、 特表平 8— 506023号参照） 。 さらには、 糖鎖結合部位の数は変化させずに、 シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであっても よい。
生理活性タンパク質が G— CSFである場合には、 G— CSFは高純度に精製 された G— C S Fであれば全て使用できる。 本発明における G— CS Fは、 いか なる方法で製造されたものでもよく、 ヒ ト腫瘍細胞の細胞株を培養し、 これから 種々の方法で抽出し分離精製したもの、 あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌 などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣 （CHO) 細胞、 C 1 27細胞、 COS細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、 種々の方法 で抽出し分離精製したものが用いられる。 好ましくは大腸菌、 イースト菌又は C H〇細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。 最も好ましく は C H O細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。 さらには、 P E G等により化学修飾された G— CS Fも含む （国際特許出願公開番号 WO 9 0/ 1 2874参照） 。'
生理活性タンパク質がモノクロ一ナル抗体である場合には、 モノクローナル抗 体はいかなる方法で製造されたものでもよい。 モノクローナル抗体は、 基本的に は公知技術を使用し、 感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる 免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリー ニング法により、 モノクローナルな抗体産生細胞をスクリ一ユングすることによ つて作成できる。 さらに、 モノクローナル抗体は、 ハイブリ ドーマが産生するモ ノクローナル抗体に限られるものではなく、 ヒ トに対する異種抗原性を低下させ ること等を目的として人為的に改変されたキメラ抗体を含む。あるいは再構成（r e s h a p e d) したヒ ト型化抗体を本発明に用いることもできる。 これはヒ ト
以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒ ト抗体の相補性 決定領域を置換したものであり、 その一般的な遺伝子組換手法も知られている。 その既知方法を用いて、 再構成ヒト型化抗体を得ることができる。
なお、 必要に応じ、 再構成ヒ ト型化抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部 位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク （FR) 領域のアミノ酸を 置換してもよい （S a t oら、 C a n c e r Re s. 53 : 1— 6, 1 993) 。 このような再構成ヒ ト型化抗体としてヒ ト型化抗 I L一 6レセプター抗体 （h P M— 1 ) が好ましく例示される （国際特許出願公開番号 W〇 92— 1 9759を 参照） 。 また、 ヒ ト型化抗 HM1. 24抗原モノクローナル抗体 （国際特許出願 公開番号 WO 98— 14580を参照） 、 ヒ ト型化抗副甲状腺ホルモン関連ぺプ チド抗体 （抗 P TH 1- P抗体） （国際特許出願公開番号 WO 98— 1 3388を 参照） 、 ヒ ト型化抗組織因子抗体 （国際特許出願公開番号 WO 99- 5 1 743 を参照） なども本発明で使用する好ましい抗体である。
さらに、 トランスジエニック動物ゃファ一ジデイスプレイ等によつて作製され たヒ ト抗体も好ましい。
本発明では、 生理活性タンパク質含有試料もしくは抗体含有試料とは、 .好まし くは、 培養により得られた生理活性タンパク質もしくは抗体を含む CHO細胞な どの哺乳動物細胞の培養培地、 あるいはこれに部分的精製などの一定の処理を施 したものをいう。
本発明の好ましい態様では、 以下の段階：
1 ) 生理活性タンパク質含有試料を p Hが中性域の低伝導度水溶液状態とし、
2) 生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、 生理活性タンパク質含有試料中の DN A夾雑物を除去する。 本発明において、 pHが中性域の低伝導度水溶液とは、 通常、 モル濃度が 0〜 1 00 mM、 好ましくは 0〜 50 mM、 さらに好ましくは 0〜 30 mMの水溶液 または、 イオン強度が 0〜 0.2、好ましくは 0〜0.12の水溶液または、 導電率が 0〜300mS/ni、 好ましくは 0〜200mS/m、 さらに好ましくは 0〜150mS/ni の 水溶液であって、 pH4〜8， 好ましくは pH4. 5〜7. 5の水溶液をいう。 本発明の別の好ましい態様では、 以下の段階：
1 ) 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアル力リ性水溶液状態 とし、
2 ) 得られる試料の p Hを中性域に調整し、
3 ) 生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、 生理活性タンパク質含有試料中の D N A夾雑物を除去する。 本発明の別の好ましい態様では、 生理活性タンパク質が抗体であるときに極め て有用であり、 以下の段階：
1 ) 抗体含有試料をプロテイン Aもしくはプロテイン Gのァフィ二テイクロマト グラフィ一に適用して、 低伝導度の酸性水溶液で溶出し、
2 ) 得られる溶出液に緩衝液を添カ卩して p Hを中性域に上昇させ、
3 ) 生じる粒子を除去する、
を含む方法によって、 抗体含有試料中の D N A夾雑物を除去する。
本発明の方法では、 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性水溶液状態 とし、 好ましくはプロテイン Aもしくはプロテイン Gァフィ二テイクロマトグラ フィーを低伝導度の酸性水溶液で溶出させることによつて低伝導度の酸性水溶液 状態とする。 本発明における低伝導度の酸性水溶液とは、 通常、 モル濃度が 0〜 1 0 0 mM、 好ましくは 0〜 5 0 mM, さらに好ましくは 0〜 3 0 mMの水溶液 または、 イオン強度が 0〜 0. 2、 好ましくは 0〜0.12の水溶液または、 導電率が 0〜300mS/m、 好ましくは 0〜200mS/m、 さらに好ましくは 0〜150mS/m の 水溶液であって、 p H1.5〜3.9、好ましくは p H2.0〜3.9、さらに好ましくは pH2.0 ~3.0 の水溶液をいう。 酸性水溶液は、 塩酸、 クェン酸、 酢酸などの水溶液から 選択してよい。 精製しょうとする生理活性タンパク質、 抗体の種類により、 使用 する低伝導度の酸性水溶液の種類、 伝導度、 p Hはそれぞれ異なっており、 当業 者は本明細書に記載の方法に従って予備試験を行うことにより、 これらの最適条 件を容易に設定できる。
本発明の方法では、 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性水溶液状態 とした後、 得られる試料に緩衝液を添加して p Hを中性域に上昇させる。 あるい は、 抗体含有試料をプロテイン Aもしくはプロテイン Gのァフィ二テイクロマト グラフィ一に適用して、 低伝導度の酸性水溶液で溶出し、 得られる溶出液に緩衝
液を添加して p Hを中性域に上昇させる。 この段階で添加する緩衝液は、 例えば Tris-HCl緩衝液、 リン酸緩衝液などを含み、 更には Tris水溶液、 Na2HP04水溶 液、 NaOH水溶液などをも含むものである。 中性域とは精製しょうとする生理活 性タンパク質、 抗体の種類により、 それぞれ異なっており、 一般的には p H 4〜 8 , 好ましくは p H4.3〜7.5、 さらに好ましくは p H4.5〜7.5である。 使用する緩 衝液の種類、 中性域の p Hについては、 当業者は本明細書に記載の方法に従って 予備試験を行うことにより、 最適条件を容易に設定できる。
また、 本発明の方法で使用する低伝導度のアルカリ性水溶液とは、 通常、 モル 濃度が 0〜： 1 0 0 mM、 好ましくは 0〜 5 0 mM、 さらに好ましくは 0〜 3 0 m Mの水溶液または、ィオン強度が 0〜 0 . 2、好ましくは 0〜0.12の水溶液または、 導電率が 0〜300mS/m、 好ましくは 0〜200mS/m、 さらに好ましくは 0〜150 mS/mの水溶液であつて、 一般には p H 7 . 5〜： 1 3である （ p Hは精製しょう とする生理活性タンパク質、 抗体の種類により、 それぞれ異なっている），。
本発明の方法では、 上記段階で中性域になった溶液は粒子 （白濁） を生じる。 この粒子をフィルタ一濾過によって除去することによって D N A夾雑物を効率よ く除去することができる。 濾過に用いるフィルタ一は、 例えば、 1.0〜0.2 μ ιηの Cellulose Acetate Filter System (Corning製.） もしくは TFFなどを用いること ができるが、 これらに限定されるものではない。
また、 上記粒子を除去するための方法としては遠心分離操作等も考えられ、 粒 子を効率的の除去できる手法であればよく、 フィルター濾過に限定されるもので はない。
本発明者らは特別の理論に拘束されるものではないが、 この粒子は生理活性タ ン'パク質と D NAとによって形成される複合体であると推定している。 粒子をフ ィルタ一除去することによって DNA-生理活性タンパク質複合体中に含まれる生 理活性タンパク質が少量ロスとなるが、 生理活性タンパク質の全体からすると 数％であり、 後述する実施例に記載するように、 生理活性タンパク質の約 9 0 % を回収することができた。
また、 この DNA-生理活性タンパク質複合体が樹脂上で生じるためにプロティ ン Aもしくはプロティン Gカラムクロマトグラフィ一単独では DNA夾雑物とタ
ンパク質の分離が効果的に行えないのではないか、 と推測している。
本発明の方法により精製された生理活性タンパク質は、 さらに陽イオン交換ク 口マトグラフィー、 陰イオン交換クロマトグラフィー、 ハイドロキシアパタイ ト クロマトグラフィー、 もしくはこれらの組合せなどにより精製して医薬製剤に用 いることができる。
DNA定量法としてはスレッシュホールド総 DNA定量法により測定し、測定に 先だって DNA抽出操作を実施するが、 これらに限定されるものではない。
本発明の方法により、 D NA夾雑物を極めて簡単な方法で、 DNA濃度を極め て低濃度まで （例えば 22.5pg/ml) 効率よく除去することが可能となり、 生理活 性タンパク質、 特に抗体の精製がはるかに効果的となった。 また、 本発明の方法 によりコストを低減することができ、 格別の技術的意義を有するものである。 本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、 本発明の範囲はこれ に限定されない。 本発明の記載に基づき種々の変更、 修飾が当業者には可能であ り、 これらの変更、 修飾も本発明に含まれる。 実施例
実施例 1 ： h P M— 1 (ヒ ト型化抗 I L一 6レセプター抗体） 精製におけるプ 口ティン Aァフィ二テイク口マトグラフィ一の緩衝液組成の検討 .
(1)検討材料 （抗体含有試料）
h P M— 1抗体 （ヒ ト型化抗 I L— 6レセプター抗体） 産生 CHO細胞培養上 清液 (以下 CM と略す) (細胞遠心除去済み： -80°C保存） 含有試料は、 上記 CMを 0.22 μ πι Cellulose Acetate(CAと略す) Filter System (CORNING)を用いて濾過 し、 精製検討に使用した。 なお、 h PM— 1抗体は、 国際特許出願公開番号 WO 9 2 / 1 9 7 5 9号公報の実施例 1 0に記載されたヒ トェロンゲーシヨンファタ ター I αプロモーターを利用し、 特開平 8— 9 9 9 0 2号公報の参考例 2に記載 された方法に準じて作成した。
(2)使用機器
塩酸溶出検討時
HPLC： L-6200 Intelligent Pump (HITACHI)
L-4200 UV-VIS Detector(HITACHI)
D-2500 Chromato-Integrator(HITACHI)
カラム： HR5/2(Pharraacia社)， 5mmI.D. X 20mmH
Media： POROS 50A(PerSeptive社), 0.4ml
Lot;A250-039,Code;SPECIAL
粒子検討時
HPLC： Waters PrepLC4000 System(Waters)
Waters2000 System Controller(W aters)
Waters486 Tunable Absorbance Detector(W aters)
Waters741 Data Module (Waters)
分光光度計： U-2000(HITACHI)
カラム ： XK26(Pharmacia社), 26mmI.D. X lOOmmH
Media： POROS 50A(PerSeptive社)， 53ml
Lot;A250-039,Code;SPECIAL
(3)分析、 定量法
h P M- 1定量法：直線濃度勾配法による PLRP-S カラム (ポリマーラボラトリ ーズ社)を用いる逆相 HPLCにより定量する。
DNA量測定法：スレッシュホールド総 DNA定量法により測定する。測定に先だ つて DNA抽出操作 （D N Aエキストラクターキットく和光純薬〉等） を実施す る。 また、 測定にはスレッシュホールド総 D N A定量キット （モレキュラーデバ イス社製） を用いる。
濁度測定法：粒子形成の状況をモニターするために測定サンプルを分光光度計 U-2000(HITACHI)に供し、 660nmにおける吸収を測定する。
( 1 ) 溶出条件の検討
プロテイン Aァフィ二ティークロマトグラフィ一において溶出液として用いる 緩衝液組成を変更した検討を行い、 h P M— 1回収率及び溶出液による DNA除 去状況を確認した。 上記抗体含有試料を以下の表 1に示す条件で力ラムにかけた。 表 1に示す平衡化緩衝液にてプロテイン A樹脂を平衡化し、.続いて上記抗体含有 試料負荷その後、洗浄 1、洗浄 2、溶出と実施する。溶出プロファイルを A280mn
で監視し、 タンパク質のピークを単離した。 なお、表中 C-P Bufferはクェン酸一 リン酸緩衝液を示す。
【表 1】
粒子相関検討として、 溶出法 2における溶出液塩酸中に NaClを添カロし、 添カロ NaCl濃度 (0mM,50mM，100mM)と各種要因との相関を求めた。 添カ卩 NaCl濃度 と各種要因との相関検討として、 それぞれの NaCl添加による Protein A溶出画 分を 300mM Tris溶液で pH7.0に調整したサンプル'を濾過前、その pH調整後サ ンプルを 0.22 μ m CA Filterにて濾過したサンプルを濾過後とした。 濾過前及ぴ 濾過後サンプルを上記測定法で h P M— 1回収率 (濾過後のみ）を測定し、 残存 DNA量を測定した。
回収率
各溶出条件における h PM— 1回収率を測定した。 その結果、 溶出法 1におけ る回収率は 98.6°/。と良好であった。 また溶出法 2における回収率では 83.8%〜 97.1%、 溶出法 2における回収率では 83.5%〜93.7%とばらつきが生じたが、 検 討スケールが小さレ、要因 (樹脂量: 0.4ml)から生じるばらつきであると推測された。 そこで、 精製スケールをアップした検討 （溶出法 2) では安定して h P M— 1回 収率 90%以上を示す事を確認した。 従って、 塩酸溶出の場合であっても、 h P M
一 1の回収率は良好であることが判明した。
溶出液塩酸中の添加 NaCl濃度と各種要因相関
溶出液塩酸中の添加 NaCl濃度と各種要因相関を調べた結果を表 2に示す。 【表 2】
また、 pH調整後サンプノレにおいて濁度の高値なサンプル程、 濾過後の hPM 一 1回収率及び残存 DNA量が低値を示している。 この結果は、 粒子形成に h P M— 1及び DNAが関与している可能性が高い事を示すものである。おそらく pH を 7.0に調整する事により h PM— 1と DNAが相互作用し粒子を生じると推測 される。 h PM— 1回収率を高くするという点からは、 添カ卩 NaCl濃度を増加さ せることが好ましく、 逆に残存 DNA量減少を重視するという点からは、 溶出液 塩酸中に NaClを無添加とすることが望ましい。 実施例 2 ： ヒ ト型化抗 PTHr P抗体の精製
ヒ ト型化抗 P TH r P抗体含有試料 （CHO細胞で培養した培養上清を 0.45+0.2 μηι CA SARTOBRAN Ρフィルタ一 （sartorius) で濾過したもの） を プロテイン Aァフィ二ティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法で以下の条 件により精製した。 なお、 PTHr P抗体は、 国際特許出願公開番号 WO 98/ 13388号公報に記載の方法によって作成した。
実験条件
精製装置： AKTA explorer (Amershain Pharmacia Biotech)
カラム ： HR5/5, CIO, XK-26 (Amersha a Pharmacia Biotech)
樹月旨： I'Pi'otein A Sepharose Fast Flow
負荷：培養上清直接負荷 (pH6.6〜7.5)
溶出画分調整： 1M Tris 水溶液により各種 pH に調整し、 0.2 i m Cellulose Acetate (以下 CAと略す)フィルター濾過により DNAを除去 （以下の （1 ) にお いて条件を検討） 。
プロテイン Aカラムを 150mM NaCl入りタエン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で十 分に平衡化した後、 上記抗体含有 CMを負荷した。 続いて結合していない不純物 を 150mM NaCl入りクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で洗浄、更に導電率を下げる 目的でクェン酸-リン酸緩衝液 pH7.5で洗浄を行い、 その後 20ιηΜクェン酸水溶 液にて溶出を実施した。溶出プロファイルを A280nmで監視し、 タンパク質ピー クを分取した。 このプロテイン A溶出画分を用いて以下の条件検討を実施した。
( 1 ) 溶出後の残存 DNA除去条件検討
残存 DNAを効率的に除去するために、 フィルター濾過時の最適 pH条件を設 定する検討を行った。 プロテイン A溶出画分を、 1.0M Tris 水溶液により以下の 各検討 pH (未調整 (2.7), 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 )に調整した。 その後、 一定時間放置し、 0.22um CAフィルター濾過処理を行った。 その後 1.0M Tris 水溶液により pH7に調整し、 DNA定量を行つた。 表 3に各検討 pH及ぴ放置時 間と残存 DNAの結果示す。
【表 3】
残存 DNA除去検討結果 （単位 ： pg I mL)
(培養上清中の DNA : 6, 637， 200 pg I mし、 フィルタ一未処理中の DNA : 25, 110 pg ' mL)
表から明らかなように、 pH5.5、 6.0における 0,6,24時間放置すべてにおいて'
DNAが検出限界以下となった。 また DNA除去状況に関しては pH5.5、 6.0を中 心として pHが高く、 又は低くなるにつれて DNA除去の効率が悪くなることが 観察された。 ' 実施例 3 ： ヒ ト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体の精製
ヒ ト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体含有試料 （C H O細胞で培養 した培養上清） をプロティン Aァフィ二ティーカラムクロマトグラフィーを用い る方法で以下の表 4に記載の条件により精製した。 なお、 HM 1 . 2 4抗原モノ クローナル抗体は、 国際特許出願公開番号 W〇 9 8 1 4 5 8 0号公報に記載の 方法によって作成した。
実験条件
カラム ： rProtein A FF, 5 inL (16 mmlD x 25 mniH)
流速 ： 5 niL I min (150 cm I h)
サンプル：培養上清直接負荷
【表 4】
【表 5】
残存 DNA除去の検討 （単位： pg/ml)
実験 1
(培養上清中の DNA： 235200 pg/ml)
実験 2
(培養上清中の DNA： 5448000 pg/ml,
一濾過処理を行う前の試料中の DNA： 4330 pg/ml)
【表 6】
フィルター処理によるヒ ト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体回収率
Protein Aァフィ二ティークロマトグラフィー精製した後のサンプルにおいて は大量の DNAが存在していたが、 実験 1では pH 7.5, 6.5, 5.5と pHの低下に従 つて DNA量が減少しており、 また時間は 0時間の方が DNA除去率が高い傾向 があった。 実験 2では pH = 4.5, 5.0, 5.5の条件で同様の実験を行ったが、 この 間においては pHおよび時間に関係なく十分に DNAが同程度に除去されていた。 更に回収量の計算からヒ ト型化抗 HM 1 . 2 4抗原モノクローナル抗体はほとん
ど消失していないことが判明した。 実施例 4 ：エリス口ポェチン (E P O)の精製
EPO含有試料 （CHO細胞で培養：中外製薬製） を用いて以下の条件検討を 実施する。
E P O含有試料組成 （ 1 mMリン酸緩衝液） ；
残存 DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適 pH条件を設定す る検討を行う。 E P O含有試料に低伝導度の酸性溶液 （2.5mM HCl 水溶液） を添 加し、 更に 20%塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、 更に試料 DNAを添 加する。 1.0M Tris水溶液により以下の各検討 pH(pH = 5.0又は 6.6)に調整し、 続いて 0.22um CAフィルター濾過処理を行う。 その後、 ろ過前後の画分の DNA定 量を行う。 以上の検討により DNAを多量に含んだ E P〇含有試料から DNA量が効 率的に減少するのを確認する。 実施例 5 ：顆粒球コロニー刺激因子 （G— CSF) の精製
G— CS F含有試料 （CHO細胞で培養：中外製薬製） を用いて以下の条件検 討を実施する。
G— CS F含有試料組成 （20mM Ti'is-HCl緩衝液） ；
残存 DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適 pH条件を設定する 検討を行う。 E P O含有試料に低伝導度の酸性溶液 （2.5mM HC1 水溶液） を添カロ し、 更に 20%塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、 更に試料 DNAを添加 する。 1.0^1 ¾13水溶液にょり以下の各検討 11( 1^ = 4.3又は6.6)に調整し、 続 いて 0.22um CAフィルター濾過処理を行う。 その後、 ろ過前後の画分の DNA定量 を行う。 以上の検討により DNAを多量に含んだ G— CS F含有試料から DNA量が 効率的に減少するのを確認する。 実施例 6 ： ゥシ血清アルブミン （BSA) の精製
BSA含有試料を用いて以下の条件検討を実施する。
残存 DNAを効率的に除去するために、フィルター濾過時の最適 pH条件を設定する
検討を行う。 B S A含有試料に低伝導度の酸性溶液 （2.5mM HCl 水溶液） を添加 し、 更に 20%塩酸を用いて低伝導度の酸性水溶液状態とし、 更に試料 DNAを添加 する。 1.0M Tris水溶液にょり以下の各検討pH(pH 4.9又は7.5)に調整し、 続 いて 0.22um CAフィルター濾過処理を行う。 その後、 ろ過前後の画分の DNA定量 を行う。 以上の検討により DNAを多量に含んだ BSA含有試料から DNA量が効率 的に減少するのを確認する。
Claims
1 . 以下の段階：
1 ) 生理活性タンパク質含有試料を p Hが中性域の低伝導度水溶液状態とし、 2 ) 生じる粒子を除去する、
を含む、 生理活性タンパク質含有試料中の D N A夾雑物を除去する方法。
2 . 以下の段階：
1 ) 生理活性タンパク質含有試料を低伝導度の酸性またはアル力リ性水溶液状態 とし、
2 ) 得られる試料の p Hを中性域に調整し、
3 ) 生じる粒子を除去する、
を含む、 生理活性タンパク質含有試料中の D N A夾雑物を除去する方法。
3 . 以下の段階：
1 ) 抗体含有試料をプロティン Aもしくはプロティン Gのァフィ二テイク口マト グラフィ一に適用して、 低伝導度の酸性水溶液で溶出し、
2 ) 得られる溶出液に緩衝液を添加して p Hを中性域に上昇させ、
3 ) 生じる粒子を除去する、
を含む、 抗体含有試料中の D N A夾雑物を除去する方法。
4 . 低伝導度の酸性水溶液の伝導度が、 0〜： !OOmMのモル濃度である請求項 2 又は 3記載の方法。
5 . 低伝導度の酸性水溶液のイオン強度が、 0〜0.2である請求項 2又は 3記載 の方法。
6 . 低伝導度の酸性水溶液の導電率が、 0〜300 mS/mである請求項 2又は 3記 載の方法。
7 . 酸性水溶液が塩酸、 クェン酸、 酢酸の水溶液から選択される請求項 2〜 6 のいずれかに記載の方法。
8 . 酸性水溶液の p Hが 1.5〜3.9である請求項 Ί記載の方法。
9 . 処理後の生理活性タンパク質含有試料中の DNA 夾雑物が DNA 濃度 22.5pg/ml以下である請求項 1〜 7のいずれかに記載の方法。
1 0. 緩衝液が T r i s水溶液である請求項 3に記載の方法。
1 1. 緩衝液を添加して p Hを 4.3〜7.5に上昇させる請求項 3に記載の方法。
1 2. 生理活性タンパク質が抗体である請求項 1又は 2に記載の方法。
1 3. 抗体がヒ ト型化モノクローナル抗体である請求項 3又は 1 2記載の方法。
14. 抗体がヒ ト型化抗 I L一 6レセプター抗体である請求項 1 3記載の方法。
1 5. 抗体がヒ ト型化抗 HM 1. 24抗原モノクローナル抗体である請求項 1 3 記載の方法。
1 6.抗体がヒ ト型化抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド抗体（抗 PTHr P抗体） である請求項 1 3記載の方法。
1 7. 抗体がヒ ト型化抗組織因子抗体である請求項 1 3記載の方法。
1 8. 粒子をフィルター濾過によって除去する請求項 1〜 3のいずれかに記載の 方法。
1 9. 請求項 1又は 2記載の方法によって得られる精製生理活性タンパク質。
20. 請求項 3記載の方法によつて得られる精製抗体。
21. p Hが中性域の低伝導度水溶液中で抗体- DNA複合体を実質的に含まない 精製抗体。
22. 精製抗体中の DNA濃度が 22.5pg/ml以下である精製抗体。
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