WO2001062939A1 - Procede de production d'un derive d'avermectine - Google Patents

Procede de production d'un derive d'avermectine Download PDF

Info

Publication number
WO2001062939A1
WO2001062939A1 PCT/JP2001/001381 JP0101381W WO0162939A1 WO 2001062939 A1 WO2001062939 A1 WO 2001062939A1 JP 0101381 W JP0101381 W JP 0101381W WO 0162939 A1 WO0162939 A1 WO 0162939A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substituted
compound
synthase
dna
modified
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/001381
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Hirofumi Endo
Hiroyuki Yamaguchi
Yutaka Kanda
Shinichi Hashimoto
Satoshi Omura
Haruo Ikeda
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
The Kitasato Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., The Kitasato Institute filed Critical Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority to AU2001234164A priority Critical patent/AU2001234164A1/en
Priority to CA002402398A priority patent/CA2402398A1/en
Priority to DE60127948T priority patent/DE60127948T2/de
Priority to EP01906278A priority patent/EP1270728B1/en
Priority to US10/204,862 priority patent/US20040101936A1/en
Publication of WO2001062939A1 publication Critical patent/WO2001062939A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C327/00—Thiocarboxylic acids
    • C07C327/20—Esters of monothiocarboxylic acids
    • C07C327/30—Esters of monothiocarboxylic acids having sulfur atoms of esterified thiocarboxyl groups bound to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 22,23-dihydroevermectin Bla or a derivative thereof useful as a medicament, a substrate compound used for the production, a modified evermectin aglycone synthase, and a gene encoding the enzyme.
  • the conventional method for producing 22,23-dihydroevermectin Bla consists of extracting an evaporectin mixture from a microorganism that produces a plurality of evaporectins with an organic solvent, purifying evaporectin B1, and then purifying the catalytic amount.
  • a method is known which is obtained by reducing the carbon bond at positions 22 to 23 of avermectin B1 by hydrogen treatment in the presence of the compound of the formula (JP-A-54-61198).
  • a mixture of 22,23-dihydroevermectin Bla and 22,23-dihydroevermectin Bib (22,23-dihydroevermectin B1) has been used as a drug.
  • Evermectin is a polyketide compound and, like other polyketide compounds, is biosynthesized through the process of continuous condensation of lower fatty acids, reduction of the carbonyl group at the 3-position (of the extended acyl group), dehydration or enolization.
  • the various iterative synthesis steps of many of these polyketide compounds are accomplished by macromolecular multifunctional enzyme conjugates having distinct active sites (domains) required for their respective catalytic activities.
  • the general mode of reaction of polyketide biosynthesis is reviewed, for example, in Ann. Rev. Gen., 24, 37 (1990) and Ann. Rev. Microb iol., 47, 875 (1993).
  • the DNA encoding the polyketide synthase generally encodes all the active sites required for polyketide backbone (adadicon) synthesis, and is composed of a repeating unit that includes a condensation step and a modification step after condensation. Be composed.
  • the extension or modification of the acyl group is determined by the genetic information present in each module.
  • the polyketide synthase acts specifically on a specific carboxylic acid structural unit included in each condensation step, or acts on a site that defines a specific post-condensation modification function.
  • eva-mectin aglycone is a constituent unit of lower fatty acids such as acetic acid and propionic acid [J. Antibiot., 39, 541-549 ( 1986)], and it has been reported that polyketide synthases composed of modules also exist in avermectin-producing bacteria [Gene, 115, 119-125 (1992), Ann. New York Acad, of Sci. , 721, 123-132 (1994)].
  • DNA fragments involved in avermectin biosynthesis Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 3-15391
  • domain structures of some modules Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 3-15391
  • 22,23-dihydroevermectin B1 Among the components of 22,23-dihydroevermectin B1, it is known that 22,23-dihydroenomethine Ma has the highest pharmaceutical effect [Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 15, 372-378 (1979), Japanese Patent Publication No. 62-54113].
  • evermectin Bla which is a raw material for synthesizing 22,23-dihydroevermectin Bla, is obtained by culturing a microorganism that produces evermectin Bla and purifying it from the culture solution.
  • Streptomyces evamitilis which produces evamectin, produces eight kinds of evamectins having a similar structure (Japanese Patent Publication No. 17558/1990).
  • An object of the present invention is to provide a method for directly producing only 22,23-dihydroevermectin Bla directly.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, modified the gene encoding avermectin adalicon synthase, and acted on a cell that expresses the modified enzyme gene with a compound serving as a substrate of the modified enzyme. As a result, they found that 22,23-dihydroevermectin Bla or a derivative thereof could be directly produced, thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to the following (1) to (25).
  • Asial carrier protein ACP
  • KS ketoacyl ACP synthase
  • AT acyltransferase
  • KR ketoacyl AC AC reductase
  • Dehydratase DH
  • ER enol reductase
  • TE thioesterase
  • the domain having lost or reduced activity is selected from the group consisting of ATs, ACPS, KS1, ATI, KR1, ACP1, KS2, DH2, and KR2.
  • the modified Eva-Mectin aglycone synthase according to the above (1) characterized in that:
  • N-acetyl cysteamine thioester compound has the following formula (I):
  • RR 2 is the same or different and represents hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocyclic group, or Represents a substituted or unsubstituted cycloalkyl.
  • a substrate compound of the modified avermectin synthase according to any one of the above (1) to (7), and when contacted with the synthase, 22,23-dihydroevermectin Bla or a derivative thereof An N-acetylcysteamine thioester compound, which forms a derivative.
  • RR 2 is the same or different and represents hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocyclic group, or Represents a substituted or unsubstituted cycloalkyl.
  • N-acetylcysteamine thioester compound represented by the formula:
  • RR 2 is the same or different and represents hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocyclic group, or Represents a substituted or unsubstituted cycloalkyl.
  • a method for producing an N-acetylcysteamine thioester compound which comprises using a compound represented by the following formula as a starting material and adding N-acetylcysteamine.
  • RR 2 is the same or different and represents hydrogen, substituted or unsubstituted alkyl, substituted or unsubstituted alkenyl, substituted or unsubstituted aryl, substituted or unsubstituted heterocyclic group, or Represents a substituted or unsubstituted cycloalkyl.
  • an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or 'added in the amino acid sequence of the amino acid bacterium glycosynthase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 4, 5, 6, and 7 A modified avermectin aglycone synthase having the sequence and having an activity of producing 22,23-dihydroevermectin Bla or a derivative thereof when contacted with an N-acetylscysteamine thioester compound is , Molecular Cloning, A laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (3 ⁇ 4 below, abbreviated as "Molekiyura--Cloning 2nd Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (Hereinafter abbreviated as Current Protocols 'In' more biology.) Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Pro Natl.
  • SEQ ID NO: 4 It can be obtained by introducing a site-specific mutation into DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence described in 5, 6, or 7.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited, but is preferably one to several tens, particularly preferably one to several amino acids.
  • the polypeptide of the present invention in order for the polypeptide of the present invention to have an activity of producing 22,23-dihydroevermectin Bla or a derivative thereof when brought into contact with an N-acetylcysteamine thioester compound, BLAST When calculated using [J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)], FAS ⁇ A [Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)], etc., the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It is preferable that the homology is at least 60% or more, usually 80% or more, particularly 95% or more.
  • the “DNA that hybridizes under stringent conditions” in the above (11) includes colony hybridization method and plaque hybridization method using a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 as a probe. Or DNA obtained by using the Southern hybridization method.Specifically, 0.7 to 1.0 mol / l NaCl is used by using a filter on which DNA derived from colonies or plaques is immobilized. After hybridization at 65 ° C in the presence of 0.1 X to 2 XSSC (saline-sodium citrate) solution [1 XSSC solution (150 mmol / l NaCl, 15 mmol sodium citrate); n X Indicates an n-fold concentration solution. And DNA that can be identified by washing the filter under 65 ° C conditions.
  • XSSC saline-sodium citrate
  • Hybridization is molecular 'cloning 2nd edition, current.Protocols' in 'molecular' by Gokuchi, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995), etc. Can be carried out according to the method described in the experiment book.
  • a DNA that can be hybridized has a homology of at least 80% or more with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 when calculated using BLAST, FASTA, or the like.
  • DNAs having a homology of 95% or more can be mentioned.
  • the present invention will be described in detail.
  • the chromosome DNA of Streptomyces avermitUis is partially digested with an appropriate restriction enzyme such as Sau3AI.
  • a cosmid vector that can be replicated in E. coli is cut at a unique restriction enzyme site, for example, a ⁇ HI site, and the cut cosmid vector is ligated to the degraded chromosomal DNA.
  • Escherichia coli can be transformed, and a transformant having the avermectin aglycone synthase gene can be selected from the resulting transformants by colony hybridization.
  • DNA obtained by the method include a DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2.
  • the open reading frame (0RF) contained in these sequences is: 0RF1 (nucleotide numbers 1-11916 of SEQ ID NO: 1), 0RF2 (nucleotide numbers 11971-30688 of SEQ ID NO: 1), 0RF3 (nucleotide numbers 1-of SEQ ID NO: 2) 14643) and 0RF4 (nucleotide numbers 14824-31419 of SEQ ID NO: 2).
  • the amino acid sequences of the polypeptides encoded by these sequences include the sequences of SEQ ID NOs: 4, 5, 6, and 7, respectively.
  • FIG. 1 shows a restriction map of the E. lectin glycoside synthase gene regions (aveAI and aveAII) in the genomic DNA of Streptomyces' E. mitilis, together with the expected transcription units (arrows).
  • Modules, domains, and 0RFs related to the gene for the bacterium ectin glycon synthase are sequenced from the three polyketide synthase domains of erythromycin [Nature, 348, 176-178 (1990), Science, 252, 675-679. (1991), Eur. J. Biochem., 204, 39-49 (1992)].
  • the condensation reaction which is the basic reaction in the polyketide synthesis process, is an acyl carrier protein. It requires a variety of catalytic activities, including quality (ACP), / 3 ketoacyl ACP synthase (KS), and acyltransferase (AT).
  • ACP quality
  • KS ketoacyl ACP synthase
  • AT acyltransferase
  • the zero-position luponyl group generated after the condensation reaction is often modified. Depending on the module, it may be used in the next condensation reaction without undergoing these modification reactions.
  • Catalytic activities involved in the modification of the / 3-position carbonyl group involved after the condensation reaction include ⁇ -ketosyl ACP reductase (KR), dehydratase (DH), and enol reductase (E R). Biosynthesis of the polyketide chain is terminated by release of the polyketide synthase by thioesterase (TE) activity. The effect of all or some of these modifying activities on each condensation step determines the structure of the final product.
  • KR ⁇ -ketosyl ACP reductase
  • DH dehydratase
  • E R enol reductase
  • the genes for the avermectin aglycone synthase of Streptomyces evermitilis (aveAI and aveAII), as well as other polyketide biosynthesis genes that have already been identified, contain one or more repetitive units called modules. It is characterized in that there are several transcription / interpretation frames.
  • a module is defined as a gene fragment that encodes one synthesis, that is, one condensation reaction followed by various modifications of the
  • Each module encodes all or some of ACP, KS, AT involved in the condensation reaction of polyketide synthesis, and KR, DH and ER involved in the / 3 carbonyl group modification reaction. Some modules do not have any modification reaction domains.
  • the polypeptide encoded by such a module is called a synthetic enzyme unit (SU).
  • Fig. 2 (b) and (c) show the biosynthetic pathways of 6,8a seco-6,8a deoxy-5-oxoeva-mectin aglycone synthesized by Streptomyces' evermitilis eva-mectin aglycone synthase. Show.
  • the initiation module (SU s) has N-terminal acyltransferase (AT) activity, indicating that PKS-1 is involved in the initial reaction.
  • the presence of the thioesterase (TE) domain in module 9 (SU9) indicates that PKS-3 is involved in the last reaction of the polyketide.
  • the module of the emissmectin synthase gene estimated as described above, the synthetic unit encoded by the module, the domain constituting each synthetic unit, and the subdomain which is the DNA encoding the domain The following sequences are listed.
  • Module A gene fragment that encodes a single condensation reaction followed by various modifications of the 3-position carbonyl group.
  • Synthase unit a polypeptide encoded by a module.
  • Domain a polypeptide having a catalytic activity for each reaction constituting a synthase unit.
  • Subdomain a gene fragment encoding a domain.
  • the module has the following nucleotide numbers in SEQ ID NOs: 1 and 2, i.e.
  • amino acid sequences of the various synthase units (SU) encoded by these modules have the following amino acid numbers, respectively:
  • DNA (subdomain) encoding the avermectin glycosynthase domain has the following nucleotide numbers:
  • ACP 3 97 8-10 5 9, KS 4 10 3-15 2 1, AT 4 16 5 3-19 6 4, KR 4 230 6-24 8 3, AC P 4: 25 7 5-2 6 5 6 KS 5 2 6 8 0-3 1 0 9, AT 5 3 20 3 0-3 5 3 8 R 5 3 87 8-0 56, ACP 5: 4 1 5 9-4 2 40 S 6 427 1-7 03, AT 6 474 1-5048, DH 6 509 5-5 2 3 4, KR 6 5 6 7 9-5 8 5 6 AC P 6: 59 5 5-6 0 3 6 In SEQ ID NO: 6 KS 7 34-46 1,
  • a DNA encoding a modified avermectin glycosynthase having a mutation that abolishes or significantly reduces the activity of at least one or more domains is generated.
  • the domain that abolishes or significantly reduces activity may be any of the domains described above. Preferred are ATs, ACPs, KS1, ATI, KR1, ACP1, KS2, DH2 and KR2.
  • Mutations that eliminate or significantly reduce the activity of these domains are not particularly limited, and include, for example, deletion of an amino acid residue at the active center or substitution with another amino acid.
  • the avermectin glycosynthase protein is translated from two large transcription units. Therefore, if a termination codon or a frameshift mutation is introduced into a domain gene upstream of the transcription unit, transcription may be terminated halfway, and the activity of the downstream domain may not be expressed. In such a case, even if there is no mutation in the downstream domain gene itself, it is considered that the entire mutated transcription unit has been inactivated. In order to minimize the effect on the entire transcription unit, it is desirable to introduce the mutation in a form that avoids the introduction of the frameshift / stop codon.
  • it is a mutation that substitutes a specific amino acid in the active center with another amino acid.
  • mutations include serine, which is the active center of AT, serine, which is the active center of ACP, and cysteine, which is the active center of KS [Eur. J. Biochem., 204, 39-49 (1992) ]
  • serine which is the active center of AT
  • serine which is the active center of ACP
  • cysteine which is the active center of KS [Eur. J. Biochem., 204, 39-49 (1992) ]
  • cysteine residue at amino acid number 657 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is changed to a dalysin residue.
  • cysteine residue at amino acid number 657 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 4 is conserved in other ketosynthases [Eur. J. Biochem., 204, 39-49 (1992)]. Is expected to be essential for the expression of the activity.
  • a method of mutating cells carrying NTG or UV irradiation to cells having MA encoding avermectin aglycone synthase having no mutation, or a method of performing mutation treatment without mutation, Mectinglycone synthase A method of treating the DNA to be treated with a mutagenic agent such as hydroxyperia, and a method of introducing a site-specific mutation based on the nucleotide sequence information of the eva-mectin aglycone synthase gene.
  • the site-directed mutagenesis method based on nucleotide sequence information can be introduced into a large gene such as the avermectin-glycone synthase gene without causing unintended mutations. It is suitable.
  • Molecular 'Clothing 2nd Edition, Current'Protocols' in 'Molecular' Noguchi Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34-315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985), etc. It is possible.
  • a method using the strain having the modified avermectin aglycone synthase described in (1), and a method using the DNA or the mutagen treated with the mutagen described in (1) There is a method in which a DNA into which a site-specific mutation has been introduced is ligated to vector DNA to prepare a recombinant DNA, and a transformed cell having the recombinant DNA introduced into a host cell is used.
  • a host cell used in the latter method any of bacteria, yeast, filamentous fungi, animal cells, plant cells, insect cells, and the like can be used as long as the introduced modified gene can be expressed.
  • a promoter is placed at a position where it can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into a chromosome, and can transcribe the introduced modified gene (hereinafter, referred to as DNA encoding the polypeptide of the present invention). Those containing 1 are used.
  • the recombinant vector containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention can be replicated autonomously in the prokaryote, and at the same time, the promoter, It is preferable that the vector be composed of a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, and a transcription termination sequence. A gene that controls the promoter may be included.
  • expression vectors include pBTrp2, pBTacl, and pBTac2 (all commercially available from Boehringer Mannheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 (Invitrogen Corporation), GEMEX-1 (Promega Corp.), pQE- 8, pQE- 9, pQE- 60, pQE-70 ( all manufactured by QIAGEN Co.), pKYPIO (JP 58- 110600), P KYP200 (Agric. Biol. Chem., 48, 669 (1984)), pLSAl (Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)), pGELl (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • chromosome integration vector examples include a vector derived from actinophage R4 [J. Bacteriol., 173, 4237 (1991)].
  • PKC7 JP-A-6-189774
  • JP-A-6-189774 As a vector for homologous recombination, PKC7 (JP-A-6-189774) and the like can be mentioned.
  • any promoter may be used as long as it functions in the host cell.
  • trp promoter one P trp
  • lac promoter Plac
  • P L promoter - coater P R promoter one
  • T7 promoter a promoter one you derived from E. coli, phage and the like.
  • P trp X 2 two series P trp
  • tac promoter it can also be used artificially designed and modified promoter Chancellor as lacT7 promoter one, the let I promoter.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence immediately below the structural gene.
  • host cells include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Serratia, Bacillus, Brevipacterium, Corynebacterium, Micropacterium, Pseudomonas, Streptomyces, etc., such as Escherichia coli XLl- Blue, Escherichia col i XL2-Blue, Escherichia col i DH1, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JM109, Escherichia coli HB101, Escherichia coli No.49, Escherichia coli3a, Escherichia coli W3 i GI698, Escherichia coli TBI, Serrati afi car ia Serratia fonticola, Serratia 1 iquef aci ens, Serratia raarcescens, Bacillus—subti
  • any method for introducing DNA into the above host cells can be used.
  • a method using calcium ions Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]
  • the protoplast method JP-A-63-248394
  • examples of expression vectors include YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19, and pHS15.
  • promoters for glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, GAP Promoters, A DH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MFal promoter, CUP 1 promoter, etc.
  • promoters for glycolytic genes such as hexose kinase, PH05 promoter, PGK promoter, GAP Promoters, A DH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MFal promoter, CUP 1 promoter, etc.
  • the host cells include microorganisms belonging to the genus Saccharomyces, Schizozocaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Pichiafe, and andidid panyu, for example, Saccharomyces cerevisiae, Syzos, Sychos, Charcoyces lulans, Schwanniomyces alluvius, Candida uti lis and the like.
  • any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • the electroporation method [Methods Enzymol., 194, 182 (1990)]
  • Elastoplast method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)]
  • lithium acetate method [J. Bacteriology, 153, 163 (1983)] Pro Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978).
  • examples of expression vectors include pcDNAI, pcDM8 (manufactured by Funakoshi), AGE107 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 3-22979, Cytotechnology, 3, 133 (1990)), pAS3- 3 (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), pCDM8 (Nature, 329, 840 (1987)), pcDNAI / Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 ( 1987)], pAGE210 and the like.
  • Any promoter can be used as long as it functions in animal cells.
  • a promoter of the IE (immediate early) gene of cytomegalovirus (CMV) an early promoter of SV40, a retrovirus Promoter, meta-mouth thionein promoter, heat shock promoter, SRa promoter and the like.
  • the enhancer of the IE gene of human CMV may be used together with the promoter.
  • Examples of the host cells include Namalwa cells, which are human cells, COS cells, which are monkey cells, CH0 cells, which are Chinese hamster cells, and HBT5637 (Japanese Patent Publication No. 63-299).
  • any method for introducing the recombinant vector into animal cells any method can be used as long as it introduces DNA into animal cells.
  • electroporation method [Cytotechnology, 3, 133 (1990) )]
  • Calcium phosphate method Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075
  • lipofection method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413). (1987)]
  • a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-transfected into insect cells to obtain a recombinant virus in an insect cell culture supernatant, and the recombinant virus is further infected to the insect cells to express the polypeptide. be able to.
  • Examples of the gene transfer vector used in the method include pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (all manufactured by Invitrogen) and the like.
  • Examples of the baculovirus include a virus that infects night insects such as Atographa, Californi, Nuclea, and polynucleosis (Autographa cal if orni ca nuclear polyhedrosis virus). For the power to read, you can.
  • Insect cells include Sf9, Sf21 L Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992)) which are ovarian cells of Spodoptera frugiperda, and High 5 (Invitrogen) which is an ovarian cell of Trichoplusia ni. And the like can be used.
  • Examples of a method for co-transferring the above-described recombinant gene transfer vector and the above baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-227075), the lipofection method [ Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)].
  • examples of the expression vector include T i plasmid and tobacco mosaic virus vector.
  • Any promoter may be used as long as it can be expressed in plant cells, and examples thereof include the 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV) and the geneactin 1 promoter.
  • Host cells include plant cells such as tobacco, potato, tomato, carrot, soybean, abrana, alfa alfa, rice, wheat, oats, etc. Can be.
  • any method for introducing DNA into plant cells can be used.
  • Agrobacterium Agrobacterium JP-A-59-140885, JP-A-60-70080, W094 / 00977
  • Electroporation method JP-A-60-251887
  • a method using a particle gun (gene gun) Patent No. 2606856, Patent No. 2517813
  • the transformant of the present invention obtained as described above is cultured in a medium, the polypeptide of the present invention is produced and accumulated in the culture, and the polypeptide of the present invention is produced by collecting from the culture. can do.
  • the method for culturing the transformant of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing a host.
  • the transformant of the present invention is a transformant obtained using a prokaryote such as Escherichia coli or a eukaryote such as yeast as a host
  • the transformant can be used as a medium for culturing the transformant.
  • Either a natural medium or a synthetic medium may be used as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like, and can efficiently culture the transformant.
  • Any carbon source may be used as long as the transformant can be assimilated, such as glucose, fructose, sucrose, molasses containing these, carbohydrates such as starch or starch hydrolysate, acetic acid, propionic acid, etc.
  • Organic acids, alcohols such as ethanol and propanol, and the like can be used.
  • Nitrogen sources include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate and other inorganic or organic acid ammonium salts, and other nitrogen-containing compounds, as well as peptone, meat extract, yeast extract, and corn steep liquor. , Casein hydrolyzate, soybean meal, soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digests thereof can be used.
  • potassium monophosphate potassium monophosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • the culture is performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration stirring culture.
  • the culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, and the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • During culture Is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH is adjusted using inorganic or organic acids, alkaline solutions, urea, calcium carbonate, ammonia, etc.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium during the culture.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the medium, if necessary.
  • an inducer may be added to the culture medium, such as indacrylic acid.
  • RPMI1640 medium As a medium for culturing transformants obtained using animal cells as a host, a commonly used RPMI1640 medium [The Journal of the American Medical
  • Cultivation is usually performed under conditions such as pH 6 to 8, 30 to 40 ° C, and the presence of 5% CO 2 :! ⁇
  • antibiotics such as kanamycin and penicillin may be added to the medium during the culture.
  • Culture media for transformants obtained using insect cells as hosts include commonly used TNM-FH media (Pharmingen), Sf-900 II SFM media (Life Technologies), ExCell400, ExCell405 ( Both can be used, such as those manufactured by JRH Biosciences), Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) and the like.
  • the cultivation is usually performed under conditions of pH 6 to 7, 25 to 30 ° C, etc. for 1 to 5 days.
  • an antibiotic such as gentamicin may be added to the medium during the culturing.
  • a transformant obtained using a plant cell as a host can be cultured as a cell or after being differentiated into a plant cell or organ.
  • a medium for culturing the transformant It is possible to use commonly used Murashige & Squeak (MS) medium, White medium, or a medium supplemented with plant hormones such as auxin or cytokinin in these mediums. it can.
  • Culture is usually performed at pH 5 to 9, 20 to 40 ° C for 3 to 60 days.
  • antibiotics such as kanamycin and hygromycin may be added to the medium during the culture.
  • a transformant derived from a microorganism, animal cell, or plant cell having a recombinant vector into which DNA encoding the polypeptide of the present invention has been incorporated is cultured according to a conventional culture method.
  • the polypeptide can be produced by accumulating the polypeptide and collecting the polypeptide from the culture to produce the polypeptide.
  • a sugar or a sugar chain-added polypeptide When expressed in yeast, animal cells, insect cells, or plant cells, a sugar or a sugar chain-added polypeptide can be obtained.
  • the method for producing the polypeptide of the present invention includes a method of producing the polypeptide in a host cell, a method of secreting the polypeptide outside the host cell, and a method of producing the polypeptide on the host cell outer membrane.
  • the method can be selected by changing the structure of the polypeptide.
  • the polypeptide of the present invention is produced in a host cell or on the host cell outer membrane, the method of Paulson et al. [J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], the method of Lowe et al. USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)] or JP-A-5-336963, JP-A-6-823021, and the like.
  • the polypeptide can be positively secreted out of the host cell.
  • the polypeptide of the present invention is extracellularly expressed in host cells. It can be actively secreted. Further, according to the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-227075, the production amount can be increased using a gene amplification system using a dihydrofolate reductase gene or the like. Furthermore, by regenerating the cells of the transgenic animal or plant, an individual animal (transgenic non-human animal) or plant (transgenic plant) into which the gene has been introduced is created. The polypeptide of the present invention can also be produced using an individual.
  • the transformant is an animal or plant individual
  • the animal is bred or cultivated in accordance with a usual method
  • the polypeptide is produced and accumulated, and the polypeptide is collected from the animal or plant individual.
  • the polypeptide can be produced.
  • Methods for producing the polypeptide of the present invention using animal individuals include, for example, known methods [American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996), American Journal of Clinical Nutrition, 63.627S (1996), Bio / Technology, 9, 830 (1991)], and producing the polypeptide of the present invention in an animal constructed by introducing a gene.
  • a transgenic non-human animal into which the DNA encoding the polypeptide of the present invention has been introduced is bred, and the polypeptide is produced and accumulated in the animal.
  • the polypeptide can be produced.
  • the place of production and accumulation in the animal include milk of the animal (JP-A-63-309192), eggs and the like.
  • the promoter used in this case any promoter that can be expressed in animals can be used.
  • a casein promoter, / 3 casein promoter, / 3 A lactoglobulin promoter, a whey monoacid protein promoter and the like are preferably used.
  • a transgenic plant into which D ⁇ which encodes the polypeptide of the present invention has been introduced can be prepared by a known method [tissue culture, (1994). ), Tissue culture, (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)], producing and accumulating the polypeptide in the plant, and collecting the polypeptide from the plant.
  • tissue culture (1994).
  • Tissue culture (1995), Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)
  • producing and accumulating the polypeptide in the plant and collecting the polypeptide from the plant.
  • a method for producing the polypeptide can be mentioned.
  • a usual enzyme isolation and purification method can be used.
  • the cells when expressed in a lysed state in the cells, the cells are collected by centrifugation after the completion of the culture, suspended in an aqueous buffer, and then sonicated, a French press, a Menton. The cells are disrupted using a Gaulin homogenizer, Dynomill, etc. to obtain a cell-free extract.
  • a normal enzyme isolation / purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent , Getylaminoethyl (DEAE)-Sepharose, anion exchange chromatography using a resin such as DIAI ON HPA-75 (Mitsubishi Kasei), resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia) Chromatography using cation-exchange chromatography using a resin, hydrophobic chromatography using a resin such as butyl cepharose, phenylcepharose, gel filtration using a molecular sieve, affinity chromatography, chromatography
  • a purified sample can be obtained by using a focusing method, an electrophoresis method such as isoelectric focusing or the like alone or in combination.
  • the cells When the polypeptide is expressed by forming an insoluble form in the cells, the cells are similarly recovered, crushed, and centrifuged to collect the insoluble form of the polypeptide as a precipitate fraction. I do.
  • the recovered insoluble form of the polypeptide is solubilized with a protein denaturant.
  • the polypeptide is returned to a normal three-dimensional structure by diluting or dialyzing the solubilized solution and reducing the concentration of the protein denaturing agent in the solubilized solution. After this operation, a purified preparation of the polypeptide can be obtained by the same isolation and purification method as described above.
  • the polypeptide of the present invention or a derivative such as a polypeptide having a sugar chain added to the polypeptide is secreted extracellularly
  • the polypeptide or the derivative of the polypeptide is added to the culture supernatant.
  • the culture is reprocessed by a method such as centrifugation as described above to obtain a culture supernatant, and from the culture supernatant, by using the same isolation and purification method as described above, A purified sample can be obtained.
  • polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 can be mentioned.
  • polypeptide of the present invention can be used in chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Therefore, it can also be manufactured. Chemical synthesis can also be carried out using a peptide synthesizer such as Advanced ChemTech, Perkin 'Elma Ichitochi, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthece 11-Vega, PerSeptive, Shimadzu.
  • a peptide synthesizer such as Advanced ChemTech, Perkin 'Elma Ichitochi, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthece 11-Vega, PerSeptive, Shimadzu.
  • DNA having a mutation introduced in vitro can be incorporated into chromosomal DNA of a host cell by a method utilizing homologous recombination of DNA.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-189774 discloses such a method. And the like.
  • Cells having a modified avermectin glycosynthase gene into which a mutation has been introduced as described above are not particularly limited as long as they can retain the gene, but prokaryotic cells such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and actinomycetes are used. And microorganisms belonging to Streptomyces averaiti lis, for example.
  • the substrate compound for producing 22,23-dihydroevermectin Bla or a derivative thereof any substance can be used as long as it is a substance serving as a substrate of the above-mentioned modified avermectin-glycone synthase. That is, the substance is a substance that can be used as a substrate for a domain responsible for the subsequent reaction of the modified domain in the process of synthesizing evermectin aglycone, and an N-acetyl cysteamine compound is preferably used.
  • the N-acetyl cysteamine compound for example, when the KS domain of SU1 shown in FIG. 2 is modified, the following formula (I):
  • alkyl is a straight-chain or branched-chain having 1 to 20 carbon atoms, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, sec-butyl, tert-butyl. , Pentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, heptyl, decyl, dodecyl, pentadecyl, eicosyl and the like.
  • alkenyl examples include linear or branched C 2-20 carbon atoms such as vinyl, aryl, 1-propenyl, methacrylic, crotyl, 1-butenyl, 3-butenyl, 2-pentenyl and 4-pentenyl. , 2-hexenyl, 5-hexenyl, heptenyl, decenyl, dodecenyl, pentadecenyl, eicosenyl and the like.
  • aryl examples include phenyl, naphthyl and anthryl having 6 to 14 carbon atoms.
  • Heterocyclic groups include pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, quinolinyl, isoquinolinyl, phthalazinyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, naphthyridinyl, cinnolinyl, pyrrolyl, vilazolyl, imidazolyl, triazolyl, tetrazolyl, tetrazolyl, tetrazolyl, tetrazolyl, tetrazolyl, tetrazolyl, tetrazolyl Aromatic heterocyclic groups such as benzyl, indazolyl, benzoimidazolyl, benzotriazolyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, and prenyl, piperidinyl, piperidino, piperazinyl, morpholino, thiomorpholino, homopiperid
  • cycloalkyl examples include those having 3 to 8 carbon atoms, such as cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl and the like.
  • Examples of the substituent in the substituted alkyl, substituted alkenyl, and substituted cycloalkyl include the same or different and substituted with 1 to 3 hydroxy, substituted or unsubstituted alkoxy, and the like.
  • the alkyl part of the alkoxy has the same meaning as the above-mentioned alkyl, and examples of the substituent of the substituted alkoxy include hydroxy having 1 to 3 substituents.
  • Examples of the substituent in the substituted aryl or the substituted heterocyclic group include the same or different and substituted with 1 to 3 hydroxy, substituted or unsubstituted lower alkyl, and substituted or unsubstituted lower alkoxy.
  • the lower alkyl and the lower alkoxy have the same meanings as described above, respectively, and examples of the substituent of the substituted lower alkyl and the substituted lower alkoxy include hydroxy having 1 to 3 substituents.
  • Such a compound include, in the above formula, a compound in which R 1 is methyl and R 2 is sec-butyl (compound 4 in the following table).
  • the compound is, for example, a compound A shown in the following table. It can be chemically synthesized as the starting material through the compounds 1 to 3 shown in the following table.
  • compound A was used as a starting material, and after ozone oxidation, compound 1 was obtained by enriching carbon by the Zuttig reaction.After deprotecting the t-butyldimethylsilyl group of compound 1, the compound 1 was again used with chloroethyltrisilane.
  • Compound 2 is obtained by introducing a protecting group.
  • the ester is hydrolyzed with potassium hydroxide and neutralized, and then ⁇ -acetyl is added in the presence of a condensing agent. Addition of cysteamine gives compound 3 which is a thioester compound.
  • the protecting group is removed by adding acetic acid to compound 3 to give compound 4.
  • the transformed host cells may be cultured in a cell culture, if the modified gene-bearing cells obtained in [2] -2 and the modified Eva-mectin aglycone expressed in the transformed cells are in a functional state. Either cells or processed cells can be used for the reaction with the substrate compound.
  • Cell processed products include dried cells, freeze-dried products, surfactant or organic solvent processed products, enzyme processed products, ultrasonically processed products, mechanically ground products, cell protein fractions, cells and cell processing Immobilized material.
  • the method of causing the above-described substrate compound to act on the transformed host cells may be any method as long as it does not hinder the synthesis of avermectin aglycone. Specifically, a method of reacting a culture of the cell or a processed product thereof with the substrate in an appropriate medium, or culturing by adding the substrate for the first time or during the culturing of the cell Method.
  • the medium used for the reaction includes buffers such as water, phosphates, carbonates, acetates, borates, citrates, and tris; alcohols such as methanol and ethanol; and esters such as ethyl acetate.
  • Aqueous solution containing an organic solvent such as amides, ketones such as acetone, and amides such as acetate amide.
  • Triton X- 100 Nacalai Tesque
  • Ya nonionic HS204 (NOF Corporation) 0.5 1 added about 20 [delta] lambda organic solvents such as surfactant or toluene Ya xylene, etc. May be.
  • the reaction is carried out in the above aqueous medium at pH 5 to 10, preferably pH 6 to 8, at 20 to 50 ° C for 1 to 96 hours.
  • culturing when culturing the host cell in a medium can be performed in the same manner as culture for obtaining the polypeptide.
  • Isolation of 22,23-dihydroloxacin pectin Mectin Bla or a derivative thereof from the reaction product or culture obtained by any of the above methods can be performed by a conventional isolation method.
  • the cultured cells are treated with acetone or methanol to extract 22,23-dihydroeva-mectin Bla or a derivative thereof, and after removing the residue, are concentrated.
  • the concentrate is treated with methylene chloride, the methylene chloride layer is separated, and concentrated under reduced pressure to obtain the desired compound.
  • Fig. 1 shows the restriction enzyme map of ⁇ HI, BgllL Clal, EcoRI, Knl, Mlul, Pstl, Stul and ⁇ I sites of Streptomyces ⁇ Eva methin aglycone synthase genes aveAI and aveAII.
  • FIG. Arrows indicate the expected transcription direction of each gene.
  • FIG. 2 shows (a) the chromosomal location of the avermectin glycosynthase gene group and the domain sequence of the synthase unit, and (b) and (c) the expected eva-mectin aglycone synthesis process.
  • FIG. (D) is synthesized by a group of polyketide synthases, which are gene products of the aveA and aveAII gene synthase genes aveAI and aveAII. Indicates the position of the lower fatty acid.
  • FIG. 3 is a diagram showing a method for constructing a plasmid used for transformation of Streptomyces ′ evermitilis.
  • (I) encodes KS1 which is a clone of KS1 containing DNA encoding the amino acid residue in the active center, and
  • (II) encodes KS1 in which the amino acid residue in the active center has been substituted.
  • the plasmid pKSmut from which the DNA was cloned, represents plasmid pKSmutRL, which was prepared by adding and substituting the DNA fragment shown in (IV) to pKSmut.
  • (IV) is a restriction map of DNA encoding K S1 used in constructing P K Smut R L.
  • ⁇ indicates the position of the base subjected to base substitution
  • Hind! II, Pstl, BamHI, Kpnl, and EcoRI indicate the cleavage positions of each DNA fragment by each restriction enzyme.
  • Example 1 Determination of nucleotide sequence and structure of avermectin aglycone synthase gene
  • the nucleotide sequence of DNA coding for the bacterium ectomectin aglycone synthase derived from Streptomyces .evermitilis K2033 was determined as follows.
  • aveAI had the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
  • aveAII had the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the plasmid shown in Fig. 3 was prepared by the following method and used for transformation of Streptomyces eva-Michiris.
  • Plasmid PUC118 (Takara Shuzo) was digested with HI and dephosphorylated with Alkaline Phosphatase (Calf intestine) (Takara Shuzo). Ligation High (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) is used to ligate OkbDNA fragment and ⁇ UC-digested pUC118 about 16 ⁇ g each at 16 ° C for 16 hours. I let it. This DNA ligation product 101 was brought into contact with a competent cell of Escherichia coli DH5 ⁇ (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), and transformation was carried out according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition.
  • an LB agar medium containing 50 tg / ml ampicillin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • IPTG manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • a portion of the obtained recombinant plasmid is digested with restriction enzyme l, and a DNA fragment containing the KS1 gene is inserted in the same direction as 1acZ encoded in pUC118. It was confirmed that the plasmid pKS1 was obtained.
  • the Takara LA PCR in vitro Mutagenesis Kit (Takara Shuzo) was used for the introduction of base substitution.
  • the base substitution was introduced according to the protocol attached to the kit.
  • the recombinant plasmid containing the KS1 gene prepared in (1) above was used as the type I DNA used for the 1st PCR.
  • the primer of the 1st PCR— (a) includes 5′-AC CGT GGACAC GG GGGGC T CGGCAT CGCTCGT-3 ′ described in SEQ ID NO: 9 as a primer for mutation introduction (from 1954 to 19 (Corresponding to No. 85, replacing T in No. 196 9 with G) and Ml3 M4 primer
  • the mixture was kept at 72 ° C for 3 minutes to blunt the ends of the hetero double-stranded DNA.
  • the second PCR to be performed thereafter was performed 30 cycles at a cycle of 94 ° C for 20 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 3 minutes.
  • a portion of the 2nd PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and it was confirmed that a fragment of about 2.0 kb was amplified.
  • the supernatant was precipitated with ethanol according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition, dried, and then redissolved in water.
  • the DNA solution was digested with Hindlll and Eco I (both manufactured by Takara Shuzo), followed by agarose gel electrophoresis to separate and purify a 2.0 kb DNA fragment.
  • plasmid vector pUC19 (Takara Shuzo) was digested with Hindlll and ⁇ RI, followed by separation and purification of a 2.7 kb fragment by agarose gel electrophoresis. 2.0 kb D digested with ⁇ ⁇
  • ABI PRISM DNA Sequencing Kits-Dye primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kits with AmliTaqR DNA Polymerase, FS-21M13-1 (manufactured by PE Applied Biosystems) and ABI373A were used.
  • the KS1 having the nucleotide substitution introduced in step (2) obtained above was transformed into a recombinant plasmid plasmid DNA, which is more likely, and subjected to PCR according to the protocol attached to the above Sequencing Kits.
  • a quenching sample was prepared. The sample was electrophoresed using ABI373A, and the obtained data was analyzed using gene analysis software Genetyx (manufactured by Software Development Company).
  • SEQ ID NO: 3 has a nucleotide sequence in which thymine at position 1969 is substituted with guanine in the 1st to 11916th nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1.
  • agarose gel electrophoresis was performed to separate and purify a 4.1 kb DNA fragment.
  • pKS1 was digested with ⁇ II and Sail, electrophoresed, and a 1.57 kb Pstl and Sail digested fragment was separated and purified.
  • Each of the recovered DNA fragments was ligated using Ligation High, and then contacted with a competent cell of Escherichia coli DH5 ⁇ to perform transformation. Transformants were selected on LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin.
  • pKS1mutR was digested with restriction enzyme ⁇ l (Takara Shuzo) and treated with Alkaline phosphatase.
  • a cosmid containing the £ l region of nucleotide numbers 817 to 18787 of SEQ ID NO: 1 was digested with ⁇ 2HI, and electrophoresed to isolate and purify a Kpnl fragment of about l.lkb.
  • Each of the purified DNA fragments was ligated using Ligation High, and then contacted with a competent cell of Escherichia coli DH5 ⁇ to perform transformation. Transformants were selected on LB agar medium containing 50 tg / ml of ampicillin.
  • plasmid vector PKC7 Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-189774 was also digested with HindllllEcoRI and purified by agarose gel electrophoresis. These two DNAs The fragments were ligated at 16 ° C. for 16 hours using Ligation High, and then contacted with Escherichia coli DH5 competent cells for transformation. Transformants were selected on LB agar medium containing 50 g / ml ampicillin.
  • KS1 was added to the KS1 region of the chromosome of Streptomyces ′ The mut fragment was incorporated by homologous recombination.
  • chromosomal DNA of the recombinant strain obtained as described above was prepared by the method described in JP-A-6-189774, and the chromosomal DNA was purified.
  • Synthetic DNA described in SEQ ID NO: 10 (5′-ATAAGC TTAA TC GATC CGCT GT CCGGTA-3 ′, including a sequence corresponding to nucleotide numbers 1758 to 1776 described in SEQ ID NO: 1) and a synthetic DNA described in SEQ ID NO: 11 PCR was performed using DNA (5′-AT GAAT TCCCTC CAAAAT C ACAT GCG CAT T-3 ′, including a sequence corresponding to nucleotide numbers 2710 to 2729 described in SEQ ID NO: 1) as a primer set. After the amplified DNA fragment of about 1. Okb was digested with restriction enzymes Hindlll and ⁇ RI, the amplified fragment of about 1.
  • the nucleotide sequence was determined by the method described in (3) above. As a result, it was confirmed that the desired recombinant Streptomyces ′ Escherichia coli KSlnrnt strain was obtained.
  • 22,23-dihydroevermectin Bla useful as a medicament, an animal drug and an agricultural chemical can be directly produced. Therefore, the complicated and difficult purification process of avermectin Bla at the industrial level and the chemical modification process of avermectin Bla, which had been performed so far, can be omitted, and the 22,23-dihydroevermectin Bla can be eliminated. The cost and time of industrial manufacturing methods are greatly reduced. In addition, as a pharmaceutical This makes it possible to produce a formulation containing only 22,23-dihydroevermectin Bla, which is highly effective.
  • SEQ ID NO: 9 This is a synthetic DNA based on the sequence between base numbers 1954 and 1985 of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 10 This is a synthetic DNA having a sequence between base numbers 1758 and 1776 of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 11 This is a synthetic DNA having a sequence between base numbers 2710 and 2729 of SEQ ID NO: 1.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)

Description

明 細 書 エバ一メクチン誘導体の製造法 技術分野
本発明は、 医薬品として有用な 22， 23-ジヒドロエバ一メクチン Bla又はその誘 導体の製造法、 その製造に用いる基質化合物と改変されたエバ一メクチンァグ リコン合成酵素、 ならびに該酵素をコードする遺伝子に関する。 背景技術
従来の 22， 23-ジヒドロエバ一メクチン Blaの製造法としては、 複数のエバ一メ クチン類を生産する微生物からエバ一メクチン混合物を有機溶剤で抽出し、 ェ バ一メクチン B1を精製後、 触媒量の化合物の存在下、 水素処理してエバーメク チン B1の 22位— 23位の炭素結合を還元して得る方法が知られておリ （特開昭 54 - 61198号）、 この方法で得られる 22, 23-ジヒドロエバ一メクチン Blaと 22, 23-ジヒ ドロエバ一メクチン Bibの混合物 （22， 23-ジヒドロエバーメクチン B1 ) が医薬品 として使用されている。
エバーメクチンはポリケチド化合物であり、 他のポリケチド化合物同様、 低 級脂肪酸の連続的縮合、 伸長したァシル基の) 3位のカルボニル基の還元、 脱水 あるいはエノィル化の過程を経て生合成される。 これら多くのポリケチド化合 物の種々の反復的な合成工程はそれぞれの反応触媒活性に必要な別々の活性部 位 （ドメイン） を有する高分子の多機能酵素複合体によって遂行される。 ポリ ケチド生合成の一般的な反応様式は、 例えば Ann. Rev. Gen.， 24, 37 ( 1990)、 Ann. Rev. Mi crob i o l . , 47, 875 ( 1993)に概説されている。
ポリケチド合成酵素をコードしている DNAは一般にポリケチド骨格（ァダリ コ ン）合成に必要な全ての活性部位をコードしておリ、 縮合工程と縮合後の修飾ェ 程を含む反復単位、 即ちモジュールから構成される。 そして、 各モジュールに 存在する遺伝情報によってァシル基の伸長や修飾が決定される。 ポリケチド合 成酵素は、 各縮合工程に含まれる特定のカルボン酸構成単位に対する特異的に 作用するか、 あるいは特定の縮合後の修飾機能を規定する部位に作用する。 エバ一メクチンァグリ コンの生合成機構に関し、 エバ一メクチンァグリコン は他のポリケチド化合物同様、 酢酸、 プロピオン酸等の低級脂肪酸がその構成 単位であること [J. Antibiot. , 39, 541-549 (1986)]、 及びエバーメクチン生 産菌にもモジュールから構成されているポリケチド合成酵素が存在することが 報告されている [Gene, 115, 119-125 (1992) 、 Ann. New York Acad, of Sci. , 721, 123-132 (1994)] 。 またエバーメクチン生合成に関与する DNA断片 （特開 平 3-15391号）や一部のモジュールのドメイン構造 [Ann. New York Acad. Sci. , 721， 123-132 (1994)]が報告されているが、 その根拠となるべき塩基配列は開 示されていない。 即ちエバーメクチンァグリコン合成酵素に関しては、 その一 部のモジュールの存在が推定されているだけで、 合成酵素全体の構造は明らか でなかった。 本発明者らはエバ一メクチンァグリ コン生合成酵素遺伝子につい て検討を重ね、 エバ一メクチンァグリコンの生合成に関わる各モジュールのド メィン構造を明確に推定することが可能となった。
22,23-ジヒドロエバーメクチン B1の成分のうち、 医薬品としての効果が高い のは 22， 23-ジヒ ド ロエノ ーメ ク チ ン Maであ る こ と が知 ら れている [Antimicrobial Agent and Chemotherapy, 15, 372-378 (1979)， 特公昭 62— 54113号] 。 また、 22,23-ジヒドロエバ一メクチン Blaの合成原料であるエバ一 メクチン Blaは、 エバ一メクチン Blaを生産する微生物を培養し、 該培養液から 精製することで得ている。 エバ一メクチンを生産するストレプトマイセス · ェ バーミチリスは、 類似構造をもつエバ一メクチン類を 8種類生産しており （特 公平 2— 17558号）、 またストレブトマイセス · エバ一ミチリスから変異育種され たェパ一メクチン成分選択生産株においてもエバ一メクチン Blaのみを生産する 菌株は得られていない。 従って、 22，23-ジヒドロエバ一メクチン Blaを製造する には類似構造をもつエバ一メクチン類からエバ一メクチン Blaを純粋に単離する 必要がある。 しかしながら、 エバ一メクチン類の構造は酷似しているため、 ェ パ一メクチン Blaを工業的に純粋に単離することは極めて困難であリ、 このよう な理由から、 現在使用されている 22， 23-ジヒドロエバーメクチン製剤はジヒド 口エバ一メクチン Blaとジヒドロエバ一メクチン Bibの混合物となっていると考 えられる。 また、 精製した後、 特殊な触媒による水素処理が必要なことは、 22，23-ジヒドロエバーメクチン B1の製造工程を煩雑にしており、 しかもコスト 増につながつている。
従って、 22,23-ジヒドロエバーメクチン Blaのみを直接生産できれば、 従来の 工業的製造法が抱える問題をすベて解消し、 なおかつ、 その成分中に抗寄生虫 活性が最も高い 22， 23-ジヒドロエバ一メクチン Blaのみを含有する医薬品を提供 することができるようになるが、 22,23-ジヒドロエバーメクチン Maを選択的に 直接生産する方法は未だ知られていない。 発明の開示
本発明の課題は、 22,23-ジヒドロエバ一メクチン Blaのみを選択的に直接生産 する方法を提供することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 エバーメクチ ンァダリコン合成酵素をコードする遺伝子を改変し、 該改変酵素遺伝子を発現 する細胞に該改変酵素の基質となる化合物を作用させることにより、 22， 23 -ジ ヒドロエバーメクチン Bla又はその誘導体を直接生産できることを見い出し、 本 発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 以下の （ 1 ) 〜 （25) に関する。
(1) エバーメクチンァグリコン合成反応に関与するァシルキヤリア一タンパ ク質 （AC P)、 /3ケトァシル AC P合成酵素 （K S)、 ァシル転移酵素 （A T)、 0ケトァシル AC Ρ還元酵素 （KR)、 脱水酵素 （DH)、 エノィル還元酵 素 （E R)、 チォエステラーゼ （TE) からなる群から選ばれる少なくとも 1以 上のドメィンの活性を消失又は低下させていることを特徴とする、 改変された エバーメクチンァグリコン合成酵素。
(2) 改変されたエバーメクチンァグリコン合成酵素がストレプトマイセス ' エバーミチリス由来である、 上記（1) の改変されたエバ一メクチンァグリ コン 合成酵素。
(3) 活性を消失又は低下させているドメインが、 AT s、 AC P s、 K S 1、 AT I , KR 1、 AC P 1、 K S 2、 D H 2及び K R 2からなる群から選ばれ ることを特徴とする、 上記（1) の改変されたエバ一メクチンァグリ コン合成酵
(4) 配列番号 4、 5、 6、 及び 7に記載のアミノ酸配列からなるエバーメク チンァグリコン合成酵素のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置 換、 若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ N—ァセチルシステアミン チォエステル化合物と接触させた場合に、 22,23-ジヒドロエバーメクチン Bla又 はその誘導体を生成する活性を有する、 改変されたエバ一メクチンァグリ コン 合成酵素。
(5) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、 上記（ 4 ) の改変されたエバ一メクチンァグリコン合成酵素。
(6) N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物が、 下記式 （ I ) ：
(I)
Figure imgf000006_0001
(式中、 R R2は、 同一又は異なって、 水素、 置換又は非置換のアルキル、 置換又は非置換のアルケニル、 置換又は非置換のァリール、 置換若しくは非置 換の複素環基、 あるいは一体となって置換若しくは非置換のシクロアルキルを 表す。） で示される N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物である、 上記 (4)の改変されたエバーメクチンァグリコン合成酵素。
(7) N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物が、 上記式 （ I ) におい て、 R 1がメチル、 R 2が s e c—ブチルである N—ァセチルシステアミンチォ エステル化合物であることを特徴とする、 上記（6) の改変されたエバ一メクチ ンァグリコン合成酵素。
(8) 上記（1) 〜（7) いずれかの改変されたエバーメクチンァグリ コン合成酵 素をコードする DNA。
(9) 配列番号 8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする D NAを含む DNA。
(10) 配列番号 3に記載の塩基配列からなる DNAを含む DNA。
(11) 上記（8) 〜（10)いずれかの DNAとストリンジェントな条件下でハイブ リダィズし、 かつ N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物と接触させた 場合に、 22,23-ジヒドロエバ一メクチン Bla又はその誘導体を生成する活性を有 するポリぺプチドをコードする DNA„ (12) 上記（8) 〜（11)いずれかの DNAをベクターに組み込んで得られる組換 え体 DNA。
(13) 上記（12)の組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
(14) 宿主細胞が微生物である、 上記（13)の形質転換体。
(15) 微生物がストレブトマイセス属に属する微生物である、 上記（14)の形質 転換体。
(16) ストレブトマイセス属に属する微生物がストレプトマイセス · エバーミ チリス (Streptomyces avermiti 1 is)である、 上記（15)の形質転換体。
(17) 形質転換体が、 ス トレブトマイセス · エバーミチリス (Streptomyces avermitilis) KSlmutである、 上記（16)の形質転換体。
(18) 上記（1) 〜（7) いずれかの改変されたエバーメクチン合成酵素の基質化 合物であって、 かつ該合成酵素と接触させた場合に 22， 23-ジヒドロエバ一メク チン Bla又はその誘導体を生成することを特徴とする、 N—ァセチルシステアミ ンチォエステル化合物。
(19) 下記式 （ I ) ：
Figure imgf000007_0001
(式中、 R R2は、 同一又は異なって、 水素、 置換又は非置換のアルキル、 置換又は非置換のアルケニル、 置換又は非置換のァリール、 置換若しくは非置 換の複素環基、 あるいは一体となって置換若しくは非置換のシクロアルキルを 表す。） で示される、 N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物。
(20) N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物が、 上記式 （ I ) におい て、 R 1がメチル、 R2が s e c—ブチルである N—ァセチルシステアミンチォ エステル化合物であることを特徴とする、 上記（19)の N—ァセチルシステアミ ンチォエステル化合物。
(21) 下記式 (II) ： (I I)
Figure imgf000008_0001
(式中、 R R 2は、 同一又は異なって、 水素、 置換又は非置換のアルキル、 置換又は非置換のアルケニル、 置換又は非置換のァリール、 置換若しくは非置 換の複素環基、 あるいは一体となって置換若しくは非置換のシクロアルキルを 表す。）
で示される化合物を出発物質とし、 かつ N—ァセチルシステアミンを加える反 応を含むことを特徴とする、 N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物の 製造法。
(22) 下記式 ( I I ) ：
(I I)
Figure imgf000008_0002
(式中、 R R 2は、 同一又は異なって、 水素、 置換又は非置換のアルキル、 置換又は非置換のアルケニル、 置換又は非置換のァリール、 置換若しくは非置 換の複素環基、 あるいは一体となって置換若しくは非置換のシクロアルキルを 表す。） で示される化合物を出発物質とし、
(a) 該化合物をオゾン酸化後、 ゥイツティッヒ反応により増炭し、
(b) 該反応によリ得られた化合物の t一プチルジメチルシリル基を脱保護後、 クロロトリエチルシランを用いて再度、 保護基を導入し、
(c) 得られた化合物をパラジウム—炭素触媒下で α— /3炭素不飽和結合を還 元した後、 エステルを水酸化カリウムで加水分解し、 中和してから縮合剤存在 下、 N—ァセチルシステアミンを加えてチォエステル化合物を得、
(d) 該チォエステル化合物に酢酸を加えることによリ保護基を取り除くこと を特徴とする、 上記（21)の N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物の製 造法。
(23) 上記（13)〜（17)いずれかの形質転換体を培地に培養し、 培養物中に改変 されたエバ一メクチンァグリコン合成酵素活性を有するポリぺプチドを生成、 蓄積させ、 該培養物中から該ポリペプチドを回収することを特徴とする、 改変 されたエバ一メクチン合成酵素の製造法。
(24) 上記（13)〜（ 17)いずれかの形質転換体の培養物又はその処理物あるいは 上記（1) 〜（7) いずれかの酵素と、 上記（18)の N—ァセチルシステアミンチォ エステル化合物とを媒体中で接触させ、 該媒体中に生成蓄積させた 22， 23-ジヒ ドロエバ一メクチン Bla又はその誘導体を採取することを特徴とする、 22， 23 -ジ ヒドロエバ一メクチン Bla又はその誘導体の製造法。
(25) N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物を上記（1) 〜（7) いずれ かの改変されたエバ一メクチン合成酵素の基質化合物とすることを特徴とする、 22， 23-ジヒドロエバーメクチン Bla又はその誘導体の製造方法。
上記 （4) の 「配列番号 4、 5、 6、 及び 7に記載のアミノ酸配列からなる ェパ一メクチンァグリ コン合成酵素のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸 が欠失、 置換、 若しくは'付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ N—ァセチルシ ステアミンチォエステル化合物と接触させた場合に、 22,23-ジヒドロエバーメ クチン Bla又はその誘導体を生成する活性を有する、 改変されたエバーメクチン ァグリ コン合成酵素」 は、 Molecular Cloning, A laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (·¾下、 モレキユラ ― - クローニング第 2版と略す）、 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (以下、 カレント · プロトコールズ ' イン ' モ レキユラ一 . バイオロジーと略す）、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982) 、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) 、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 82， 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、 配列番号 4、 5、 6、 又は 7に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする DN Aに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。
欠失、 置換もしくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、 1個か ら数十個、 特に 1個から数個のアミノ酸であることが好ましい。
また、 本発明のポリべプチドが N—ァセチルシステアミンチォエステル化合 物と接触させた場合に、 22,23-ジヒドロエバ一メクチン Bla又はその誘導体を生 成する活性を有するためには、 B LA S T[J. Mol. Biol. , 215, 403 (1990)]、 FA S Τ A [Methods in Enzymology, 183, 63 ( 1990) ]等を用いて計算したと きに、 配列番号 1 に記載のアミノ酸配列と少なく とも 6 0 %以上、 通常は 8 0 %以上、 特に 9 5 %以上の相同性を有していることが好ましい。
上記 （11) の 「ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA」 と は、 配列番号 3で表される塩基配列を有する DNAをプローブとして、 コロニ ― · ハイブリダイゼ一ション法、 プラーク · ハイブリダイゼ一ション法あるい はサザンハイプリダイゼーション法等を用いることにより得られる D N Aを意 味し、 具体的には、 コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィ ルタ一を用いて、 0.7〜1.0mol/l の NaCl存在下、 65°Cでハイブリダィゼーショ ンを行った後、 0.1 X ~ 2 XSSC (sal ine - sodium citrate) 溶液 [ 1 XSSC溶液 (150mmol/l NaCl、 15mmol クェン酸ナトリウム） ； n Xは n倍濃度の溶液を示 す。] を用い、 65°C条件下でフィルタ一を洗浄することにより同定できる DNA を挙げることができる。
ハイブリダィゼ一シヨンは、 モレキュラー ' クロ一ニング第 2版、 カレン ト . プロ トコ一ルズ ' イン ' モレキュラー ' バイォ口ジー、 DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。 ハイブリダィズ可能な DN Aとして具体的には、 B LA S T、 FA S TA等を 用いて計算したときに、 配列番号 3で表される塩基配列と少なく とも 80%以上 の相同性を有する DN A、 好ましくは 95%以上の相同性を有する D NAを挙げ ることができる。 以下、 本発明を詳細に説明する。 [1] エバーメクチンァグリ コン合成酵素の構造解析
(1) エバーメクチンァグリコン合成酵素遺伝子の単離と塩基配列の決定
エバ一メクチンァグリコン合成酵素遺伝子を単離する方法としては、 特開平
3― 15391 号に記載の方法、 モレキュラー ' クロ一ニング第 2版に記載のコ口 二一ハイプリダイゼーション法等を挙げることができる。
具体的な例としては、 ストレプトマイセス ' エバ一ミチリス (Streptomyces avermitUis)の染色体 D N Aを適当な制限酵素、 例えば Sau3AI で部分分解する。 大腸菌内で複製可能なコスミ ドベクターをユニークな制限酵素部位、 例えば ^ HI部位で切断し、 該切断されたコスミ ドベクターと上記の分解された染色体 DNAを連結した後、 この組換え体 DNAで大腸菌を形質転換し、 得られた形 質転換株の中からエバーメクチンァグリコン合成酵素遺伝子を保持する形質転 換株をコロニーハイプリダイゼーション法で選択する方法を挙げることができ る。
該方法によリ取得される DN Aとして、 具体的には配列番号 1又は 2に示さ れた塩基配列を有する DNAを挙げることができる。 これらの配列に含まれる 転写解読枠（0RF)は、 0RF1 (配列番号 1のヌクレオチド番号 1-11916)、 0RF2(配列 番号 1のヌクレオチド番号 11971- 30688)、 0RF3(配列番号 2のヌクレオチド番号 1 - 14643)及び 0RF4(配列番号 2のヌクレオチド番号 14824- 31419)である。 これら の配列にコードされるポリぺプチドのアミノ酸配列としてそれぞれ配列番号 4、 5、 6または 7の配列が挙げられる。 第 1図に、 ストレプトミセス ' エバ一ミ チリスのゲノム D NA中のエバ一メクチンァグリ コン合成酵素遺伝子領域 (aveAI 及び aveAII) の制限酵素地図を、 予想される転写単位 （矢印） ととも に示す。
(2) エバーメクチンァグリコン合成酵素のモジュール及びドメインの推定
エバ一メクチンァグリコン合成酵素遺伝子に係わるモジュール、 ドメイン及 び 0 R Fは、 エリスロマイシンの 3種のポリケチド合成酵素ドメインの配列 [Nature, 348, 176-178 (1990) 、 Science, 252, 675-679 (1991)、 Eur. J. Biochem., 204, 39-49 (1992)] との類似性を比較することによって決定するこ とができる。
ポリケチド合成過程の基本反応である縮合反応はァシルキヤリァータンパク 質 （AC P)、 /3ケトァシル AC P合成酵素 （K S)、 ァシル転移酵素 （AT) を含む種々の触媒活性を必要とする。
縮合反応後に生じた 0位力ルポニル基が多くの場合修飾を受ける。 なおモジ ユールによってはこれらの修飾反応を受けずに次の縮合反応に利用される場合 もめる。
縮合反応後に関与する /3位カルボニル基の修飾に関与する触媒活性には、 β ケトァシル AC P還元酵素 （KR)、 脱水酵素 （DH)、 エノィル還元酵素 （E R) が含まれる。 ポリケチド鎖の生合成はチォエステラーゼ （T E) 活性によ つてポリケチド合成酵素から切り放され終了する。 各々の縮合過程にこれらの 修飾活性のすべてあるいはいくつかが作用することによって最終産物の構造が 決定される。
ストレプトミセス · エバーミチリスのエバーメクチンァグリコン合成酵素の 遺伝子群 （aveAI 及び aveAII) は、 既に明らかにされている他のポリケチド生 合成遺伝子と同様にモジュールと呼ばれる 1又はそれ以上の反復単位をそれぞ れ含むいくつかの転写解読枠が存在することを特徴とする。 モジュールは 1回 の合成、 すなわち 1回の縮合反応及びそれに引き続く |3位カルボニル基の各種 修飾反応活性をコードしている遺伝子断片と定義される。 各モジュールはポリ ケチド合成の縮合反応に関与する AC P、 K S、 ATならびに /3位カルボニル 基修飾反応に関与する KR、 DHおよび E Rのすベてあるいはいくつかをコ一 ドしている。 なおいずれの修飾反応ドメインも有していないモジュールも存在 する。 このようなモジュ一ルによってコードされているポリぺプチドを合成酵 素単位 （SU) と呼ぶ。
第 2図 （b ) ( c ) に、 ストレプトミセス ' エバーミチリスのエバ一メクチン ァグリコン合成酵素によって合成される 6， 8 aセコ— 6， 8 aデォキシー 5 —ォキソエバ一メクチンァグリコンの生合成経路を示す。
開始モジュール （ S U s ) は他のモジュールと違って N末端側にァシル転移 酵素 （AT) 活性を有していることより、 PK S— 1は初発反応に関与してい ることがわかる。 モジュール 9 ( S U 9 ) にはチォエステラーゼ （T E) ドメ インがあることより、 P K S— 3はポリケチドの最後の反応に関与しているこ とがわかる。 このように推定された、 エバ一メクチン合成酵素遺伝子のモジュール、 該モ ジュールによってコ一ドされる合成ュニッ ト、 各合成ュニッ トを構成する ドメ イン及び該ドメインをコードする DNAであるサブドメインとして以下の配列 が挙げられる。
なお、 本発明で使用する語句については以下のように定義する。
モジュール； 1回の縮合反応及びそれに引き続く 3位カルボニル基の各種修飾 反応活性をコードしている遺伝子断片。
合成酵素単位 （S U) ； モジュールによってコードされているポリペプチド。 ドメイン ；合成酵素単位を構成する各反応触媒活性を有するポリべプチド。 サブドメイン ； ドメインをコードする遺伝子断片。
モジュールは、 配列番号 1及び 2中の以下のヌクレオチド番号、 すなわち、 配列番号 1中の
開始モジュール： 8 5— 1 3 5 3、
モジュール 1 ： 1 44 1 — 6 1 8 0、
モシユール 2 6 2 5 6 - 1 1 6 5 8、
モジュール 3 1 2 0 7 6— 1 5 1 47、
モジュール 4 1 5 2 1 7— 1 9 9 3 8、
モジュール 5 2 00 0 8— 24 6 9 0、
モジュール 6 247 8 1 — 30 3 0 9、
ならびに配列番号 2中の
モジュール 7 1 00— 46 92、
モジュール 8 4 7 7 1 - 7 8 1 8,
モジュール 9 7 90 6— 1 46 1 9、
モジュール 1 0 1 4 9 3 5— 2 0 3 34、
モジュール 1 1 204 1 3 - 2 5 7 34,
モジュール 1 2 2 5 8 1 0 - 3 1 1 2 5
によって表される。
これらのモジュールによってコードされる種々の合成酵素単位 （ S U) のァ ミノ酸配列はそれぞれ、 以下のアミノ酸番号、 すなわち、
配列番号 4中の 開始 S U ： 2 9— 4 5 1、
SU 1 : 4 8 1 - 2 0 6 0,
S U 2 ： 20 8 6 - 3 8 8 6,
配列番号 5中の
SU 3 : 3 6 - 1 0 5 9,
S U 4 ： 1 0 8 3— 2 6 5 6、
S U 5 ： 2 6 80— 4 24 0、
SU 6 : 4 2 7 1 - 6 1 1 3,
配列番号 6中の
S U 7 ： 34 - 1 5 64、
S U 8 : 1 5 9 1 — 2 6 0 6、
S U 9 ： 2 6 3 6— 4 8 7 3、
及び配列番号 7中の
SU 1 0 : 3 8 - 1 8 3 7 ,
S U 1 1 : 1 8 64— 3 6 3 7、
SU 1 2 ： 3 6 6 3— 54 34によって示される。
更に、 エバーメクチンァグリ コン合成酵素ドメインをコードする DN A (サ ブドメイン） は以下のヌクレオチド番号、 すなわち、
配列番号 1中の
開始モジュールの
AT s ： 8 5— 1 0 3 2、
AC P s ： 1 0 9 6— 1 3 5 3、
モジュ一ノレ 1の
K S 1 1 44 1 - 2 74 2,
AT 1 3 1 4 8— 40 6 8、
KR 1 5 1 4 3 - 5 6 7 6,
AC P I ： 5 9 3 5— 6 1 80、
モジュール 2の
K S 2 ： 6 2 5 6 - 7 54 5,
AT 2 ： 7 9 0 6— 8 8 2 9、 D H 2 ： 8 94 7— 9 3 84、
K R 2 ： 1 0 6 0 9 - 1 1 1 4 2、 AC P 2 ： 1 1 4 1 3— 1 1 6 5 8、 モジュール 3の
K S 3 ： 1 2 0 7 6— 1 3 3 6 8、
A T 3 ： 1 3 7 5 6— 1 46 94、
AC Ρ 3 ： 1 4 9 0 2— 1 5 1 47、 モジュール 4の
K S 4 1 5 2 1 7— 1 6 50 6、 A Τ 4 1 6 9 1 7— 1 7 8 6 2、 K R 4 1 8 8 8 6— 1 94 1 9、 AC P 4 : 1 9 6 9 3— 1 9 9 3 8、 モジユーノレ 5の
K S 5 ： 20 0 0 8— 2 1 2 9 7、
AT 5 ： 2 1 6 5 8— 2 2 5 84、
K R 5 ： 2 3 6 0 2— 24 1 3 8、
AC P 5 ： 24445 - 246 90, モジュール 6の
K S 6 ： 24 7 8 1— 2 6 0 7 9、
AT 6 ： 264 1 3— 2 7 3 3 6、
D H 6 ： 27 47 5 - 2 7 8 94,
K R 6 ： 29 2 2 7 - 2 9 7 6 0,
AC P 6 ： 3 0 0 64 - 3 0 30 9 配列番号 2中の
モジュール 7の
K S 7 1 0 0 - 1 3 8 3、
AT 7 1 6 48 — 2 6 7 3、 KR 7 36 34 — 4 1 8 8、
AC P 7 : 444 7 - 46 9 2, モジュール 8の S 8 ： 47 7 1— 6 06 0、
A T 8 ： 6 3 2 2 - 7 344,
AC P 8 ： 7 5 7 3— 7 8 1 8、
モジュール 9の
K S 9 ： 7 9 0 6— 9 2 5 8、
AT 9 ： 9 6 7 6 - 1 07 7 3 ,
DH 9 : 1 0 8 8 5 - 1 1 2 8 9,
KR 9 : 1 2 547— 1 3 1 04、
AC P 9 : 1 3 3 7 8— 1 3 6 5 9、
T E 9 : 1 3 8 7 9— 1 46 1 9、
モジュール 1 0の
K S 1 0 1 49 3 5— 1 6 2 24、
AT 1 0 1 6 543— 1 7 5 6 5、
D H 1 0 1 7 6 89— 1 80 6 6、
K R 1 0 1 9 2 8 5 - 1 9 842、
A C P 1 0 ： 20 0 8 9— 20 3 34、
モジュール 1 1の
K S 1 1 2 04 1 3— 2 1 7 0 5、
A T 1 1 2 1 9 9 1 — 2 3 0 1 9、
D H 1 1 2 3 1 49 - 2 3 5 29,
KR 1 1 246 8 5 - 2 5 242,
A C P 1 1 ： 2 548 9 - 2 5 7 34,
モジュール 1 2の
K S 1 2 : 2 5 8 1 0 - 2 7 1 0 2,
A T 1 2 ： 2 7 3 6 7 - 2 8 3 9 2,
D H 1 2 ： 2 8 5 1 6 - 2 8 8 7 8,
K R 1 2 ： 3 0 0 7 6 - 3 0 6 3 3、
AC P 1 2 : 3 0 8 8 0— 3 1 1 2 5。
これらサブドメインによってコードされる種々のドメインの予測されるアミ ノ酸配列はそれぞれ、 配列番号 4中の
AT s : 2 9 - 344、
AC P s ： 3 6 6 - 4 5 1 K S 1 48 1 — 9 1 4、
AT 1 1 05 0 - 1 3 5 6、 KR 1 1 7 1 5 - 1 8 9 2、 AC P 1 : 1 9 7 9 - 2 0 6 0 K S 2 2 08 6 - 2 5 1 5、 A T 2 2 6 3 6 - 2 943 D H 2 2 98 3 - 3 1 2 8、 K R 2 3 53 7 - 3 7 1 4、 AC P 2 : 38 0 5 - 3 8 8 6 配列番号 5中の
K S 3 : 3 6 - 46 6、
AT 3 : 5 96 — 9 0 8、
A C P 3 : 97 8 - 1 0 5 9、 K S 4 1 08 3 - 1 5 1 2、 A T 4 1 6 5 3 - 1 9 6 4、 K R 4 2 30 6 - 24 8 3、 AC P 4 : 2 5 7 5 - 2 6 5 6 K S 5 2 6 8 0 - 3 1 0 9、 A T 5 3 20 3 0 - 3 5 3 8 R 5 3 87 8 - 0 5 6、 A C P 5 : 4 1 5 9 - 4 2 40 S 6 427 1 - 7 0 3、 A T 6 474 1 - 5048、 D H 6 509 5 - 5 2 3 4、 KR 6 5 6 7 9 - 5 8 5 6 AC P 6 : 59 5 5 - 6 0 3 6 配列番号 6中の K S 7 34 - 46 1、
AT 7 5 50— 8 9 1、
KR 7 1 2 1 2— 1 3 9 6、
AC P 7 ： 1 4 8 3— 1 5 64、
K S 8 : 1 5 9 1— 2 0 20、
AT 8 : 2 1 0 8— 2448、
AC P 8 ： 2 5 2 5 - 2 6 0 6, K S 9 2 6 3 6— 3 0 8 6、
A T 9 3 2 2 6— 3 5 9 1、
D H 9 3 6 2 9— 3 7 6 3、
K R 9 4 1 8 3— 4 3 6 3、
A C P 9 ： 44 6 0— 45 5 3、
T E 9 : 46 2 7— 48 7 3、
配列番号 7中の
K S 1 0 3 8— 4 6 7、
A T 1 0 5 7 4— 9 1 4、
D H 1 0 9 5 6— 1 0 8 1、
K R 1 0 1 4 8 8— 1 6 7 3、
AC P I 0 ： 1 7 5 6— 1 8 3 7、 K S 1 1 1 8 64 - 2 2 94, A T 1 1 2 3 9 0— 2 7 3 2、
D H 1 1 2 7 7 6 - 2 9 0 2, K R 1 1 3 2 8 8— 347 3、
AC P I 1 ： 3 5 5 6— 3 6 3 7、 K S 1 2 3 6 6 3— 40 9 3、
AT 1 2 4 1 8 2— 4 5 2 3、
D H 1 2 4 5 6 5— 4 6 8 5、
K R 1 2 5 0 8 5 - 5 2 7 0, AC P I 2 ： 5 3 5 3— 54 34である [2] 改変されたエバ一メクチン合成酵素の取得
( 1 ) 部位特異的変異の導入
上記の情報に基づき、 少なく とも一つ以上のドメインの活性を消失又は著し く低下させるような変異を有する改変されたエバーメクチンァグリ コン合成酵 素をコードする D N Aを作成する。 活性を消失又は著しく低下させる ドメイン は、 上述のどのドメインでもよい。 好ましくは ATs、 ACPs、 KS 1、 AT I , KR1、 ACP 1、 KS2、 DH2及び KR2が挙げられる。
これらのドメインの活性が消失又は著しく低下させる変異としては、 特に制 限はないが、 例えば活性中心にあるアミノ酸残基の欠失又は別のアミノ酸への 置換が挙げられる。 注意すべきことは、 エバーメクチンァグリ コン合成酵素蛋 白質は大きな 2つの転写単位から翻訳されて生成する点である。 このため転写 単位の上流のドメイン遺伝子に終結コ ドンやフレームシフト変異が導入される と、 転写が途中で終結してしまい、 下流ドメインの活性が発現しない場合があ りえる。 このような場合は下流のドメイン遺伝子自身には変異がなく とも、 変 異を受けた転写単位全体が不活性化されたとみなされる。 転写単位全体への影 響を最小限にとどめるため、 導入される変異はフレームシフトゃ終結コ ドンの 導入を避けた形で行なうことが望ましい。 より好ましくは、 活性中心の特定の アミノ酸を別のアミノ酸に置換する変異である。 そのような変異の例として、 A Tの活性中心であるセリン、 A C Pの活性中心であるセリン、 K Sの活性中 心であるシスティン [Eur. J . B i ochem. , 204, 39-49 ( 1992) ]を別のアミノ酸に 置換するような変異が考えられる。 さらに具体的な例として、 KS 1がコードされ ている配列番号 1記載の塩基配列中のヌクレオチド番号 1969の Τを Gに置換し た変異を挙げることができる。 この変異の結果、 配列番号 4記載のアミノ酸配 列中のアミノ酸番号 657のシスティン残基がダリシン残基に変わる。 配列番号 4 記載のアミノ酸配列中のアミノ酸番号 657のシスティン残基は他のケトシンタ一 ゼでも保存されておリ [Eur. J. B i ochem. , 204, 39-49 ( 1992) ]、 このドメイン の活性発現に必須であると予想される。
変異の導入方法に特に制限はないが、 変異を持たないエバーメクチンァグリ コン合成酵素をコードする MAを保有する細胞に NTG処理や U V照射による変異 処理を施す方法や、 変異を持たないエバーメクチンァグリ コン合成酵素をコ一 ドする DNAそのものをヒドロキシゥレアなどの変異誘起剤で処理する方法、 エバ —メクチンァグリコン合成酵素遺伝子の塩基配列情報に基づき、 部位特異的な 変異を導入する方法などが挙げられる。 これらの方法のうち塩基配列情報に基 づく部位特異的変異導入法は、 エバーメクチンァグリコン合成酵素遺伝子のよ うな巨大な遺伝子に特定の変異を意図せざる変異を生じることなく導入できる ので、 好適である。 例えばモレキュラー ' クロ一ニング第 2版、 カレント ' プ 口トコールズ ' イン ' モレキュラー ' ノ ィォ口ジ一、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)、 Gene, 34- 315 (1985)、 Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)等に記載の方法に準じて行うことが可能である。
(2) 組換え体 D N Aで形質転換された細胞の作製と改変されたエバーメクチ ンァダリコン合成酵素の取得
改変されたエバーメクチン合成酵素を取得するには （1)に記載した改変され たエバ一メクチンァグリコン合成酵素を保有する菌株を用いる方法と、 （1) で 記載した変異剤で処理した D N A又は部位特異的変異が導入された D N Aをべ クタ一 D N Aと連結させ組換え体 D NAを作製し、 該組換え体 DNAを宿主と なる細胞に導入した形質転換細胞を用いる方法がある。 後者の方法で用いられ る宿主細胞としては、 導入した改変遺伝子を発現できるのであれば、 細菌、 酵 母、 糸状菌、 動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞などいずれも用いることが可能で ある。 発現ベクターとしては、 上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染 色体中への組込みが可能で、 導入した改変遺伝子 （以下、 本発明のポリぺプチ ドをコードする DNAという） を転写できる位置にプロモータ一を含有してい るものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、 本発明のポリぺプチドを コードする DN Aを含有してなる組換えべクタ一は原核生物中で自立複製可能 であると同時に、 プロモータ一、 リボソーム結合配列、 本発明の DNA、 転写 終結配列、 より構成されたベクターであることが好ましい。 プロモータ一を制 御する遺伝子が含まれていてもよい。
発現べクタ一としては、 例えば、 pBTrp2、 pBTacl, pBTac2 (いずれもベーリ ンガ一マ ンハイ ム社よ リ 市販）、 pKK233- 2 ( Pharmacia社製）、 pSE280 (Invitrogen社製）、 GEMEX-1 (Promega社製）、 pQE- 8、 pQE- 9、 pQE- 60、 pQE-70 (いずれも QIAGEN社製）、 pKYPIO (特開昭 58- 110600)、 PKYP200 (Agric. Biol. Chem. , 48, 669 (1984)〕、 pLSAl (Agric. Biol. Chem. , 53, 277 (1989)〕、 pGELl ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)〕、 pBluescript 11 SK (-) (Stratagene社製）、 pTrs30 (Escherichia coli JM109/pTrS30 ( FERM BP- 5407) よ り調製〕、 Trs32 [Escherichia coli JM109/pTrS32 (FERM BP- 5408) よリ調製〕、 pGHA2 (Escherichia coli IGHA2 (FERM B-400) より調製、 特開昭 60-221091〕、 pGKA2 [Escherichia coli IGKA2 (FERM BP- 6798) より調製、 特開昭 60-221091〕、 Term2 (US4686191、 US4939094、 US5160735)、 pSupex, pUB110、 pTP5、 pC194、 pEG400 〔 J. Bacteriol. , 172, 2392 (1990)〕、 pGEX (Pharmacia社製）、 UC19 (Gene, 33, 103 (1985)〕、 pUC118 (Pharmacia社製）、 pETシステム （Novagen社製）、 pIJ702、 pi J922等をあげることができる。
染色体組込み型べクタ一としては、 ァクチノファージ R 4由来のベクター 〔J. Bacteriol. , 173, 4237(1991)] 等をあげることができる。
遺伝子相同組換え用べクタ一としては、 PKC7 (特開平 6- 189774号） 等をあげ ることができる。
プロモータ一としては、 宿主細胞中で機能するものであればいかなるもので もよい。 例えば、 trpプロモータ一 （Ptrp)、 lacプロモーター （Plac)、 PLプロモ —ター、 PRプロモータ一、 T7プロモーター等の、 大腸菌やファージ等に由来す るプロモータ一をあげることができる。 また Ptrpを 2つ直列させたプロモーター (PtrpX 2)、 tacプロモーター、 lacT7プロモータ一、 let Iプロモーターのよう に人為的に設計改変されたプロモータ一等も用いることができる。
リボソーム結合配列であるシャイン一ダルガノ （Shine- Dalgarno) 配列と開 始コ ドンとの間を適当な距離 （例えば 6〜18塩基） に調節したプラスミ ドを用 いることが好ましい。 本発明の組換えべクタ一においては、 本発明の DNAの 発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、 構造遺伝子の直下に転写終 結配列を配置することが好ましい。
宿主細胞としては、 ェシエリヒア属、 セラチア属、 バチルス属、 ブレビパク テリゥム属、 コリネバクテリウム属、 ミクロパクテリゥム属、 シュ一ドモナス 属、 ストレブトマイセス属等に属する微生物、 例えば、 Escherichia coli XLl- Blue , Escherichia col i XL2-Blue , Escherichia col i DH1、 Escherichia coli MC1000 、 Escherichia coli KY3276 、 Escherichia coli W1485 、 Escherichia coli JM109、 Escherichia coli HB101、 Escherichia coli No.49、 Escherichia coli W3110、 Escherichia colj_ NY49、 Escherichia col i GI698, Escherichia coli TBI , Serrati a f i car i a Serratia fonticola, Serratia 1 iquef aci ens 、 Serratia raarcescens 、 Bacillus— subti lis 、 Bacillus amylol iquefacines 、 Brevibacter ium ammoni agenes 、 Brevi bacterium immar iophi lum ATCC14068、 Brevibacter ium saccharolyticum ATCC14066、 Brevibacterium f 1 avum ATCC14067 、 Brevibacter ium lactofermentum ATCC13869 、 Corynebacter ium glutamicum ATCC13032 、 Corynebacter ium glutamicum ATCC13869 、 Corynebacter ium acetoacidophi lum ATCC13870 、 Microbacter ium ammoni aphi lum ATCC15354、 Pseudomonas putida, Pseudomonas sp. D - 0110 、 Streptomyces 1 ividans TK23 、 Streptomyces 1 ividans ATCC69411 、 Streptomyces coel icolor ATCC13405、 Streptomyces griseus ATCC23915、 Streptomyces avermitilis ATCC31267、 Streptomyces avermitj lis FERM BP- 2773、 Streptomyces avermitilis FERM BP- 2775等をあげることができ る。
組換えベクターの導入方法としては、 上記宿主細胞へ DN Aを導入する方法 であればいずれも用いることができ、 例えば、 カルシウムイオンを用いる方法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、 プロ トプラスト法 （特開 日召 63-248394)、 又は Gene, Π, 107 (1982)や Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
酵母を宿生細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 YEP13 (ATCC37115)、 YEp24 (ATCC37051)、 YCp50 (ATCC37419)、 pHS19、 pHS15等を あげることができる。
プロモーターとしては、 酵母菌株中で発現できるものであればいずれのもの を用いてもよく、 例えば、 へキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモー ター、 PH05プロモータ一、 P GKプロモータ一、 GAPプロモ一ター、 A DHプロモーター、 gal 1プロモーター、 gal 10プロモータ一、 ヒートショック ポリペプチドプロモーター、 MFa l プロモ一タ一、 CUP 1プロモータ一等をあげ ることができる。
宿 主 細 胞 と し て は 、 Saccharomyces 属 、 Schi zosaccharomyces 属 、 Kluyveromyces属、 Trichosporon属、 Schwanniomyces属、 Pichiafe、 し andid f禺 等に属する微生物、 例えば、 Saccharomyces cerevisiae、 Schi zosaccharomyces pombe、 Kluyveromyces lactis、 Trichosporon pul lulans , Schwanniomyces alluvius, Candida uti lis 等をあげることができる。
組換えべクタ一の導入方法としては、 酵母に DN Aを導入する方法であれば いずれも用いることができ、 例えば、 エレク トロボレ一シヨン法 [Methods Enzymol. , 194, 182 (1990)〕、 スフエロプラスト法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、 酢酸 リ チウム法 〔 J. Bacteriology, 153， 163 (1983) 〕、 Pro Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)記載の方法等をあげ ることができる。
動物細胞を宿主と して用いる場合には、 発現ベクターと して、 例えば、 pcDNAI、 pcDM8 (フナコシ社製）、 AGE107 〔特開平 3-22979、 Cytotechno logy, 3, 133 (1990)〕、 pAS3-3 (特開平 2-227075)、 pCDM8 (Nature, 329, 840 (1987)〕、 pcDNAI/Amp ( Invi trogen社製）、 pREP4 ( Invi trogen社製）、 pAGE103 〔 J. Biochem. , 101, 1307 (1987)〕、 pAGE210等をあげることができる。
プロモータ一としては、 動物細胞中で機能するものであればいずれも用いる ことができ、 例えば、 サイ トメガロウィルス （CMV) の IE (immediate early) 遺伝子のプロモータ一、 SV40の初期プロモータ一、 レトロウイルスのプロモ一 タ一、 メタ口チォネインプロモーター、 ヒートショックプロモータ一、 S R a プロモーター等をあげることができる。 また、 ヒト CM Vの I E遺伝子のェン ハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
宿主細胞としては、 ヒトの細胞であるナマルバ （Namalwa) 細胞、 サルの細胞 である COS細胞、 チャイニーズ 'ハムスターの細胞である CH0細胞、 HBT5637 (特 開昭 63-299) 等をあげることができる。
動物細胞への組換えべクタ一の導入方法としては、 動物細胞に DN Aを導入 する方法であればいずれも用いることができ、 例えば、 エレク トロボレ一ショ ン法 〔Cytotechnology， 3, 133 (1990)〕、 リ ン酸カルシウム法 （特開平 2- 227075 )、 リ ポフエクシ ヨ ン法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84， 7413 (1987)〕、 Virology, 52, 456 (1973)等をあげることができる。
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、 例えばカレント · プロトコ一ルズ ' イ ン · モ レキュラー · ノヽィォロシ一、 Baculovi rus Expression Vectors, A Laboratory Manual , W. H. Freeman and Company, New York (1992) 、 Bio/Technology, 6, 47 (1988)等に記載された方法によって、 ポリペプチドを 発現することができる。
即ち、 組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウィルスを昆虫細胞に共導入 して昆虫細胞培養上清中に組換えウィルスを得た後、 さらに組換えウィルスを 昆虫細胞に感染させ、 ポリべプチドを発現させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入べクタ一としては、 例えば、 pVL1392、 pVL1393、 pBlueBacIII (ともに Invi torogen社製） 等をあげることができる。 バ キュロウィルスと しては、 例えば、 夜盗蛾科昆虫に感染するウィルスであるァ ゥ トグラファ · カ リ フォルニ力 · ヌクレア一 ' ポリへ ドロシス · ウィルス (Autographa cal i f orni ca nuclear polyhedrosis vi rus)等を用レヽること力 s、でき る。
昆虫細胞と しては、 Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞である Sf9、 Sf21 L Baculovi rus Expression Vectors, A Laboratory Manual , W. H. Freeman and Company, New York (1992)〕、 Trichoplusia niの卵巣細胞である High 5 (Invitrogen社製） 等を用いることができる。
組換えウィルスを調製するための、 昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入べク ターと上記バキュロウィルスの共導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシゥ ム法 （特開平 2- 227075)、 リポフエクシヨン法 〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)〕 等をあげることができる。
植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、 発現べクタ一として、 例えば、 T i プラスミ ド、 タバコモザイクウィルスベクター等をあげることができる。 プロモータ一としては、 植物細胞中で発現できるものであればいずれのもの を用いてもよく、 例えば、 カリフラワーモザイクウィルス （CaMV) の 35Sプロモ —ター、 ィネアクチン 1プロモーター等をあげることができる。
宿主細胞としては、 タバコ、 ジャガイモ、 トマト、 ニンジン、 ダイズ、 アブ ラナ、 アルフアルファ、 イネ、 コムギ、 ォォムギ等の植物細胞等をあげること ができる。
組換えべクタ一の導入方法としては、 植物細胞に D N Aを導入する方法であ ればいずれも 用 いる こ と がで き 、 例え ば、 ァ グロ ノ ク テ リ ウ ム ( Agrobacter i um) (特開昭 59- 140885、 特開昭 60- 70080、 W094/00977 ) , エレク トロポレーシヨン法 （特開昭 60- 251887)、 パーティクルガン （遺伝子銃） を用 いる方法 （特許第 2606856、 特許第 2517813) 等をあげることができる。
以上のようにして得られる本発明の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に 本発明のポリペプチドを生成蓄積させ、 該培養物から採取することにより、 本 発明のポリべプチドを製造することができる。
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、 宿主の培養に用いられる通常 の方法に従って行うことができる。
本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主 として得られた形質転換体である場合、 該形質転換体を培養する培地として、 該形質転換体が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 該形質転換 体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、 合成培地のいずれを用いて もよい。
炭素源としては、 該形質転換体が資化し得るものであればよく、 グルコース、 フラクト一ス、 スクロース、 これらを含有する糖蜜、 デンプンあるいはデンプ ン加水分解物等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プ ロパノールなどのアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、 アンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸 アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニゥム 塩、 その他の含窒素化合物、 ならびに、 ペプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 コ —ンスチープリカ一、 カゼイン加水分解物、 大豆粕及び大豆粕加水分解物、 各 種発酵菌体及びその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第二カリウム、 リン酸マグネ シゥム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫 酸銅、 炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、 振盪培養又は深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。 培養温 度は 1 5〜 4 0 °Cがよく、 培養時間は、 通常 1 6時間〜 7 日間である。 培養中 の p Hは 3. 0〜 9. 0に保持することが好ましい。 p Hの調整は、 無機又は 有機の酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニアなどを用いて行 ラ。
また、 培養中必要に応じて、 アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質 を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモータ一を用いた組換えべクタ一で形質転 換した微生物を培養するときには、 必要に応じてインデューサ一を培地に添加 してもよい。 例えば、 1 a cプロモータ一を用いた組換えべクタ一で形質転換した 微生物を培養するときにはイソプロピル— /?一 D—チォガラクトビラノシド等 を、 ！££プ口モータ一を用いた組換えべクターで形質転換した微生物を培養する ときにはィンド一ルァクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用 さ れて い る RPMI1640培地 [ The Journal of the American Medical
Association, 199, 519 (1967)〕 、 Eagleの MEM培地 [ Science, 2, 501
(1952)〕、 ダルベッコ改変 MEM培地 〔Virology， 8, 396 (1959)〕、 1 9 9培地
(Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73， 1 (1950)〕 又はこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H 6〜 8、 3 0〜40°C、 5 % C O2存在下等の条件下で：！〜
7日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ペニシリン等の抗生物質を培地 に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、 一般に 使用されている TNM- FH培地 （Pharmingen社製）、 Sf-900 II SFM培地 （Life Technologies社製）、 ExCell400、 ExCell405 (いずれも JRH Biosciences社製）、 Grace's Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) 等を用いることができる。 培養は、 通常 p H 6〜7、 2 5〜 3 0°C等の条件下で、 1〜 5日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加して もよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、 細胞として、 又は植物の細胞 や器官に分化させて培養することができる。 該形質転換体を培養する培地とし ては、 一般に使用されているムラシゲ · アンド ' スク一グ（MS)培地、 ホワイ ト (Wh i te)培地、 又はこれら培地にオーキシン、 サイ トカイニン等、 植物ホルモン を添加した培地等を用いることができる。
培養は、 通常 p H 5〜 9、 2 0〜 4 0 °Cの条件下で 3 ~ 6 0日間行う。
また、 培養中必要に応じて、 カナマイシン、 ハイグロマイシン等の抗生物質 を培地に添加してもよい。
上記のとおり、 本発明のポリペプチドをコードする D N Aを組み込んだ組換 え体べクタ一を保有する微生物、 動物細胞、 あるいは植物細胞由来の形質転換 体を、 通常の培養方法に従って培養し、 該ポリペプチドを生成蓄積させ、 該培 養物よリ該ポリぺプチドを採取することにょリ、 該ポリべプチドを製造するこ とができる。
遺伝子の発現方法としては、 直接発現以外に、 モレキュラー · クローニング 第 2版に記載されている方法等に準じて、 分泌生産、 融合ポリペプチド発現等 を行うことができる。
また、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞又は植物細胞にょリ発現させた場合には、 糖あるいは糖鎖が付加されたポリペプチドを得ることができる。
本発明のポリぺプチドの生産方法としては、 宿主細胞内に生産させる方法、 宿主細胞外に分泌させる方法、 あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があ リ、 使用する宿主細胞や、 生産させるポリペプチドの構造を変えることにより、 該方法を選択することができる。
本発明のポリべプチドが宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場 合、 ポールソンらの方法 〔J. B i o l . Chem.， 264, 17619 ( 1989)〕、 ロウらの方 法 〔Pro Nat l . Acad. Sc i . USA, 86, 8227 ( 1989) 、 Genes Deve l op. , 4, 1288 ( 1990)〕、 又は特開平 5-336963、 特開平 6- 823021等に記載の方法を準用す ることにより、 該ポリべプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができ る。
すなわち、 遺伝子組換えの手法を用いて、 本発明のポリペプチドの活性部位 を含むポリペプチドの手前にシダナルぺプチドを付加した形で発現させること により、 本発明のポリぺプチドを宿主細胞外に積極的に分泌させることができ る。 また、 特開平 2- 227075に記載されている方法に準じて、 ジヒドロ葉酸還元酵 素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。 さらに、 遺伝子導入した動物又は植物の細胞を再分化させることにより、 遺 伝子が導入された動物個体 （トランスジエニック非ヒ ト動物） 又は植物個体 (トランスジエニック植物） を造成し、 これらの個体を用いて本発明のポリべ プチドを製造することもできる。
形質転換体が動物個体又は植物個体の場合は、 通常の方法に従って、 飼育又 は栽培し、 該ポリペプチドを生成蓄積させ、 該動物個体又は植物個体よリ該ポ リぺプチドを採取することにより、 該ポリベプチドを製造することができる。 動物個体を用いて本発明のポリべプチドを製造する方法としては、 例えば公知 の方法 [ American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996)、 American Journal of Clinical Nutrition, 63. 627S (1996)、 Bio/Technology, 9, 830 (1991)〕 に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明のポリぺプ チドを生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、 例えば、 本発明のポリペプチドをコードする DNAを導 入したトランスジエニック非ヒト動物を飼育し、 該ポリベプチドを該動物中に 生成 · 蓄積させ、 該動物中より該ポリペプチドを採取することにより、 該ポリ ペプチドを製造することができる。 該動物中の生成 ·蓄積場所としては、 例え ば、 該動物のミルク （特開昭 63- 309192)、 卵等をあげることができる。 この際 に用いられるプロモータ一としては、 動物で発現できるものであればいずれも 用いることができるが、 例えば、 乳腺細胞特異的なプロモーターである αカゼ インプロモータ一、 /3カゼインプロモータ一、 /3ラクトグロブリンプロモータ ―、 ホェ一酸性プロティンプロモーター等が好適に用いられる。
植物個体を用いて本発明のポリべプチドを製造する方法としては、 例えば本 発明のポリぺプチドをコ一ドする D Ν Αを導入したトランスジエニック植物を 公知の方法 〔組織培養， (1994)、 組織培養， (1995)、 Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)〕 に準じて栽培し、 該ポリペプチドを該植物中 に生成 ·蓄積させ、 該植物中よリ該ポリペプチドを採取することにより、 該ポ リぺプチドを生産する方法があげられる。
本発明の形質転換体によリ製造されたポリぺプチドを単離精製するためには、 通常の酵素の単離精製法を用いることができる。
例えば本発明のポリペプチドが、 細胞内に溶解状態で発現した場合には、 培 養終了後、 細胞を遠心分離により回収し、 水系緩衝液に懸濁後、 超音波破砕機、 フレンチプレス、 マントンガウリンホモゲナイザ一、 ダイノミル等により細胞 を破砕し、 無細胞抽出液を得る。 該無細胞抽出液を遠心分離することによリ得 られる上清から、 通常の酵素の単離精製法、 即ち、 溶媒抽出法、 硫安等による 塩析法、 脱塩法、 有機溶媒による沈殿法、 ジェチルアミノエチル （DEAE) —セ ファロース、 D IAI ON HPA-75 (三菱化成社製） 等のレジンを用いた陰イオン交換 クロマトグラフィー法、 S-Sepharose FF (Pharmac i a社製） 等のレジンを用いた 陽イオン交換クロマトグラフィー法、 ブチルセファロ一ス、 フエ二ルセファロ —ス等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ一法、 分子篩を用いたゲルろ 過法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィー法、 クロマトフォーカシング法、 等 電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、 精製 標品を得ることができる。
また、 該ポリペプチドが細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、 同様に 細胞を回収後、 破砕し、 遠心分離を行うことにより、 沈殿画分としてポリぺプ チドの不溶体を回収する。 回収したポリぺプチドの不溶体を蛋白質変性剤で可 溶化する。 該可溶化液を希釈又は透析し、 該可溶化液中の蛋白質変性剤の濃度 を下げることにより、 該ポリペプチドを正常な立体構造に戻す。 該操作の後、 上記と同様の単離精製法により該ポリべプチドの精製標品を得ることができる。 本発明のポリべプチド、 あるいは該ポリべプチドに糖鎖の付加されたポリぺ プチド等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、 培養上清に該ポリべプチド あるいは該ポリペプチドの誘導体を回収することができる。 即ち、 該培養物を 上記と同様の遠心分離等の手法によリ処理することによリ培養上清を取得し、 該培養上清から、 上記と同様の単離精製法を用いることにより、 精製標品を得 ることができる。
このようにして取得されるポリペプチドとして、 例えば、 配列番号 8記載の ァミノ酸配列を有するポリペプチドをあげることができる。
また、 本発明のポリペプチドは、 F m 0 c法 （フルォレニルメチルォキシカ ルポニル法）、 t B o c法 （ t 一ブチルォキシカルボニル法） 等の化学合成法に よっても製造することができる。 また、 Advanced ChemTech社、 パーキン ' エル マ一千土、 Pharmacia社、 Protein Technology Instrument社、 Synthece 11 - Vega社、 PerSeptive社、 島津製作所等のぺプチド合成機を利用して化学合成することも できる。
一方、 in vitroで導入した変異を持つ DN Aを、 宿主細胞の染色体 DNAに 組み込む方法については DNAの相同組換えを利用した方法で可能であり、 そのよ うな方法として例えば特開平 6— 189774号に記載の方法などが挙げられる。
上記のようにして変異を導入した改変されたエバーメクチンァグリ コン合成 酵素遺伝子を有する細胞は該遺伝子を保持できる限り特に制限はないが、 大腸 菌、 枯草菌、 放線菌などの原核生物細胞のいずれでもよく、 例えば、 ストレブ トマイセス · エバ一ミチリス (Streptomyces averaiti lis)に属する微生物が挙 げられる。
[3] 22,23-ジヒドロエバ一メクチン Bla又はその誘導体の製造のための基質化合 物の取得
本発明において、 22， 23-ジヒドロエバ一メクチン Bla又はその誘導体製造のた めの基質化合物は、 上記の改変されたエバーメクチンァグリコン合成酵素の基 質となる物質ならばいかなる物質でも使用できる。 すなわち、 該物質は、 エバ ーメクチンァグリ コン合成の過程において、 改変されたドメインの後段の反応 を担う ドメィンの基質となリうる物質であり、 N-ァセチルシステアミン化合物 が好ましく用いられる。 該 N-ァセチルシステアミン化合物としては、 例えば第 2図記載の S U 1の K Sドメイン改変した場合は、 下記式 （ I ) ：
Figure imgf000030_0001
(式中、 R R2は、 同一又は異なって、 水素、 置換又は非置換のアルキル、 置換又は非置換のアルケニル、 置換又は非置換のァリール、 置換若しくは非置 換の複素環基、 あるいは一体となって置換若しくは非置換のシクロアルキルを 表す。） に示すような構造の化合物が好ましい。 上記式 （ I ) の各基の定義において、 アルキルとしては、 直鎖または分枝状 の炭素数 1 〜 2 0の、 例えばメチル、 ェチル、 プロピル、 イソプロピル、 プチ ル、 s e c—ブチル、 t e r t—ブチル、 ペンチル、 イソペンチル、 ネオペン チル、 へキシル、 ヘプチル、 デシル、 ドデシル、 ペンタデシル、 エイコシルな どが挙げられる。
アルケニルとしては、 直鎖または分枝状の炭素数 2〜 2 0の、 例えばビニル、 ァリル、 1 —プロぺニル、 メタクリル、 クロチル、 1 —ブテニル、 3—ブテニ ル、 2—ペンテニル、 4一ペンテニル、 2—へキセニル、 5—へキセニル、 へ プテニル、 デセニル、 ドデセニル、 ペンタデセニル、 エイコセニルなどが挙げ られる。
ァリールとしては、 炭素数 6〜 1 4の、 例えばフエニル、 ナフチル、 アント リルなどが挙げられる。
複素環基としては、 ピリジル、 ピラジニル、 ピリ ミジニル、 ピリダジニル、 キノ リニル、 イソキノリニル、 フタラジニル、 キナゾリニル、 キノキサリニル、 ナフチリジニル、 シンノリニル、 ピロリル、 ビラゾリル、 イミダゾリル、 トリ ァゾリル、 テトラゾリル、 チェニル、 フリル、 チァゾリル、 ォキサゾリル、 ィ ンドリル、 インダゾリル、 ベンゾィミダゾリル、 ベンゾトリアゾリル、 ベンゾ チァゾリル、 ベンゾォキサゾリル、 プリニルなどの芳香族複素環基、 ピ口リジ ニル、 ピペリジノ、 ピペラジニル、 モルホリノ、 チオモルホリノ、 ホモピペリ ジノ、 ホモピペラジニル、 テトラヒドロピリジニル、 テトラヒドロキノリニル、 テトラヒドロイソキノリニル、 テトラヒドロフラニル、 テトラヒドロビラニル、 ジヒドロベンゾフラニルなどの脂環式複素環基が挙げられる。
シクロアルキルとしては、 炭素数 3〜 8の、 例えばシクロプロピル、 シクロ ブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル などが挙げられる。
置換アルキル、 置換アルケニルおよび置換シクロアルキルにおける置換基と しては、 同一または異なって置換数 1 〜 3の、 ヒドロキシ、 置換若しくは非置 換のアルコキシなどが挙げられる。 ここで、 アルコキシのアルキル部分は、 前 記アルキルと同義であり、 置換アルコキシの置換基としては、 置換数 1 〜 3の ヒドロキシなどが挙げられる。 置換ァリール、 置換複素環基における置換基としては、 同一または異なって 置換数 1〜 3の、 ヒドロキシ、 置換若しくは非置換の低級アルキル、 置換若し くは非置換の低級アルコキシなどが挙げられる。 ここで、 低級アルキルおよび 低級アルコキシは、 それぞれ前記と同義であり、 置換低級アルキルおよび置換 低級アルコキシの置換基としては、 置換数 1〜 3のヒドロキシなどが挙げられ る。
このような化合物として具体的には、 上記式中、 R 1がメチル、 R 2が s e c —プチルである化合物 （下表の化合物 4 ) が挙げられ、 当該化合物は例えば下 表に示す化合物 Aを出発原料とし、 同じく下表に示す化合物 1〜 3を経て以下 のようにして化学的に合成できる。
まず、 化合物 Aを出発原料にし、 オゾン酸化後、 ゥイツティッヒ反応により 増炭することで化合物 1を得、 化合物 1の t -プチルジメチルシリル基を脱保護 後、 クロロェチルトリシランを用いて再度、 保護基を導入することで化合物 2 を得る。 次に、 化合物 2をパラジウム-炭素触媒下で α - /3炭素不飽和結合を還 元した後、 エステルを水酸化カリウムで加水分解し、 中和してから縮合剤存在 下、 Ν-ァセチルシステアミンを加えてチォエステル化合物である化合物 3を得 る。 最後に、 化合物 3に酢酸を加えることにより保護基を取り除き、 化合物 4 とする。
式 （ I ) で表される他の化合物についても、 同様に製造することができる。 上記製造法における中間体および目的化合物は、 有機合成化学で常用される 分離精製法、 例えば、 濾過、 抽出、 洗浄、 乾燥、 濃縮、 再結晶、 各種クロマト グラフィーなどに付して単離精製することができる。 また、 中間体においては 特に精製することなく次の反応に供することも可能である。 纖vu O lofcldAVー ≠ ≠ ΐ
Figure imgf000033_0001
ミ
[4] 22， 23-ジヒドロエバ一メクチン B l a又はその誘導体の製造
形質転換された宿主細胞は、 [2]- 2 で取得した改変遺伝子保持細胞及び形質 転換細胞内で発現した改変されたエバ一メクチンァグリコンが機能する状態な らば、 細胞の培養物、 細胞、 細胞処理物のいずれでも基質化合物との反応に用 いることができる。
細胞処理物としては、 細胞の乾燥物、 凍結乾燥物、 界面活性剤又は有機溶剤 処理物、 酵素処理物、 超音波処理物、 機械的磨砕処理物、 細胞の蛋白質画分、 細胞及び細胞処理物の固定化物を挙げることができる。
形質転換された宿主細胞に、 上記基質化合物を作用させる方法は、 エバーメ クチンァグリコンの合成に支障のない限りどのような方法によってもよい。 具 体的には、 該細胞の培養物あるいはその処理物と該基質を適当な媒体中で反応 させる方法や、 該細胞を培養する際に該基質を初発若しくは途中で添加して培 養を行なう方法が挙げられる。
反応を行なう際の媒体としては、 水、 リン酸塩、 炭酸塩、 酢酸塩、 ホウ酸塩、 クェン酸塩、 トリスなどの緩衝液、 ならびに、 メタノール、 エタノールなどの アルコール類、 酢酸ェチルなどのエステル類、 アセトンなどのケトン類、 ァセ トアミ ドなどのアミ ド類などの有機溶媒を含有した水性溶液が挙げられる。 ま た必要に応じてトリ トン X- 100 (ナカライテスク社製）ゃノニオン HS204 (日本油脂 社製）などの界面活性剤あるいはトルエンゃキシレンのような有機溶媒を 0. 1〜 20δΛ程度添加してもよい。
反応は、 上記水性媒体中、 p H 5〜 1 0、 好ましくは p H 6〜 8、 20〜50°C の条件で 1 〜96時間行う。
また、 上記宿主細胞を培地に培養する際の培養は、 上記ポリペプチドを得る ための培養と同様にして行うことができる。
上記いずれかの方法で得られた反応物あるいは培養物からの、 22， 23-ジヒド 口エバ一メクチン B l a 又はその誘導体の単離は、 通常の単離方法で行なうこと ができる。 たとえば、 培養終了菌体をアセ トン又はメタノールで処理して 22，23-ジヒドロエバ一メクチン B la 又はその誘導体を抽出し、 残渣を除去後濃 縮する。 濃縮物を塩化メチレンで処理し、 塩化メチレン層を分取し、 減圧濃縮 して目的化合物を得ることができる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 ストレブトマイセス ■ エバ一ミチリスのエバ一メクチンァグリ コ ン合成酵素遺伝子 aveAIと aveAIIの^ HI、 BgllL Clal 、 EcoRI, K nl, Mlul 、 Pstl 、 Stul 及び^ I 部位の制限酵素地図した図である。 矢印はそれぞれの遺 伝子の予想される転写方向を示す。
第 2図は、 （ a) がエバーメクチンァグリ コン合成酵素遺伝子群の染色体上の 位置及び合成酵素単位のドメイン配列を、 （b )および （ c ) が予想されるエバ —メクチンァグリ コン合成工程を示した図である。 （d)がエバ一メクチンァグ リコン合成酵素遺伝子 aveAIと aveAIIの遺伝子産物であるポリケチド合成酵素群 によって合成される 6， 8—セコ一 6， 8 a—デォキシー 5—ォキソエバーメ クチンァグリコンの構造及びその骨格に取り込まれる低級脂肪酸の位置を示す。
(符号の説明）
AC P ： ァシルキャリアータンパク質
K S ： ^ケトァシル AC P合成酵素
AT ： ァシル転移酵素
K R ： /3ケトァシル AC P還元酵素
DH ：脱水酵素
E R ： エノィル還元酵素
T E ： チォエステラーゼ
第 3図は、 ストレブトマイセス ' エバーミチリスの形質転換に用いたプラス ミ ドの構築方法を示した図である。 （I) は活性中心のアミノ酸残基をコードす る DNAを含む K S 1 をクロ一ン化したプラスミ ド p K S 1、 (II) は活性中心 のァミノ酸残基を置換した K S 1をコードする DNAをクローン化したプラス ミ ド p K S m u t、 (III) は、 p K S m u tに （IV) に示す D N A断片の付加 及び置換を施して作成したプラスミ ド p K S mu t R Lを示す。 また （IV) は P K Smu t R Lを構築する際に用いた、 K S 1 をコードする D N Aの制限酵 素地図である。
図中 Λは塩基置換を施した塩基の位置を示し、 Hind!II 、 Pstl 、 BamHI、 Kpnl、 EcoRIは各々の制限酵素による各 D Ν Αの切断位置を示す。 （1)、 （11)、 (III)にある数字は、 それぞれのプラスミ ドの任意の塩基を 1番としたとき、 そ の塩基からの距離 （b p ) を示し、 円内の数字はプラスミ ドの全長サイズ （b P) を示す。 （IV)の数字は配列番号 1記載のヌクレオチド番号に準ずる。 図中 略語は以下の通りである。
(符号の説明）
b 1 a ： β -ラクタマ一ゼ (矢印は転写方向）
0 r i ：複製起点 （オリジン）
P 1 a c ： /3 -ラクタマ一ゼプロモータ一 （矢印はプロモーターの向き）
1 G ： M 1 3 ファージイ ンタージエニック リ一ジョ ン （M13 Intergenic region) 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、 本発明はこれらにより 何ら限定されるものではない。
〔実施例 1〕 エバーメクチンァグリコン合成酵素遺伝子の塩基配列と構造の 決定
ストレプトミセス . エバーミチリス K2033 (米国特許第 5206155号、 FERM BP - 2773) 由来のエバ一メクチンァグリ コン合成酵素をコ一ドする DN Aの塩基配 列を、 以下のように決定した。
エバーメクチン B 5— O—メチル転移酵素 （Av e D) をコードする遺伝子 を単離する [Gene, 206, 175-180 (1998)] 際に、 同時に取得されたエバ一メク チンァグリ コン合成酵素遺伝子 （aveAI 及び aveAII) の断片を含むコスミ ドょ リ、 エバ一メクチンァグリコン合成酵素遺伝子内の、 連続的あるいは才一バー ラップしている DN A断片をサブクローニングし、 これらサブクローン中の揷 入 DN A断片の塩基配列を決定した。
即ち、 第 1図に示した aveAI 及び aveAI Iの^ HI制限酵素地図に示された、 3. 4 k t» p、 2. O k b p、 0. 5 k b p、 6. 8 k b p、 7. O k b p、 7. 8 k b p、 3. 7 k b p、 4. 8 k b p、 1. 3 k b p、 2. 4 k b p、 0. 7 k b p、 1. O k b p、 5. 4 k b p、 2. 5 k b p、 1. 9 k b p、 0. 1 k b p , 7. O k b p、 3. l k b p、 4. 7 1^ 13 、 及び 1. 3 k b pの ^lHI処理断片をサブクローンした。 これらサブクロ一ン中の挿入 DN A断片を ェキソヌクレア一ゼ III 及び S 1ヌクレア一ゼで処理し、 段階的な欠失断片を 調製した。 蛍光標識プライマ一を用いたサイクルシーケンス反応を行い、 それ ぞれの欠失断片の塩基配列を決定することにより aveAI 及び aveAI Iの全塩基配 列を決定した。 aveAI は配列番号 1 に示す塩基配列を、 aveAIIは配列番号 2に 示す塩基配列を有していた。
〔実施例 2〕 22,23-ジヒドロエバ一メクチン Bla の直接生産に供する菌株の 作製）
第 3図に示すプラスミ ドを以下の方法で作成し、 ストレブトマイセス · エバ —ミチリスの形質転換に用いた。
(1) K S 1 を含む DN A断片のサブクローニング
エバ一メクチンァグリコン合成酵素遺伝子を含むコスミ ド DNAのうち、 K S 1 を含むコスミ ド DNAを制限酵素^ ΗΙ( 宝酒造社製）で消化した後、 ァガ ロースゲル電気泳動 （モレキュラー · クロ一ニング第二版記載） し、 K S 1の 活性中心であるシスティン残基 （配列番号 4記載のアミノ酸番号 657番） が含ま れる 2.0kb の D NA断片 （第 1 図参照、 配列番号 1記載の 1 7 0 1〜 3 7 1 6) をモレキュラー ' クロ一ニング第 2版記載の方法で分離 '精製した。 また、 プラスミ ド P U C 1 1 8 (宝酒造社製） は、 HIで消化した後、 Alkaline Phosphatase (Calf intestine) (宝酒造社製） で脱リン酸化した。 K S 1 を含 む 2. OkbD N A断片と p U C 1 1 8の^ ΗΙ消化物、 各々約 0.1 μ gを Ligation High (東洋紡社製） を用いて、 16°Cで 16時間反応することで連結させた。 この DN A連結反応物 10 1と大腸菌 DH 5 αのコンピテントセル （日本ジーン社 製） を接触させ、 モレキュラー · クロ一ニング第 2版記載の方法に従い形質転 換を行なった。 形質転換株の選択には、 50 tg/mlのアンピシリン （和光純薬社 製） を含有した L B寒天培地を用いた。 0.1mol/lイソプロピル-^一 D—チォガ ラク トビラノシド （ I P T G、 和光純薬社製） 水溶液、 1% 5—ブロモ一 4一 クロ口一 3—インドリル一 /3— D—ガラクトシド （X— g a l、 ナカライテス ク社製） のジメチルホルムアミ ド （ナカライテスク社製） 溶液を、 あらかじめ 各々 50μ 1 /20ml LB寒天培地塗布しておいた。 組換えプラスミ ドを保持する形 質転換株のコロニーは、 /3—ガラクトシダ一ゼ活性を失っているため、 5—ブ ロモ一 4一クロ口一 3—インドリル一 /3— D—ガラク トシドを分解できず、 白 色を呈する。 この白コロニ一をエーゼで拾い、 10m 1の L B培地に植菌し、 3 7 °Cで 16時間振盪培養後、 モレキュラー ' クローニング第 2版記載のアルカリ 法にて菌体からプラスミ ドを抽出 ·精製した。 得られた組換えプラスミ ドのー 部を制限酵素 l で消化し、 K S 1遺伝子を含む DNA断片が、 p UC 1 1 8 にコ一ドされている 1 a c Zと同じ向きに揷入されているプラスミ ド p K S 1 が得られていることを確認した。
(2) K S 1活性中心への塩基置換の導入
塩基置換の導入には Takara LA PCR in vitro Mutagenesis Kit (宝酒造社 製） を用いた。 以下、 塩基置換の導入は該キット添付のプロトコ一ルに従って 行なった。 1st PCRに使用する铸型 DN Aには上記（1) で調製した K S 1遺伝子 を含む組換えプラスミ ドを用いた。 また 1st PCR— (a)のプライマーには、 変異 導入用のプライマ一として配列番号 9記載の 5' -AC CGT GGACAC GG GGGGC T CGGCAT CGCTCGT-3 ' (配列番号 1の 1 9 54番から 1 9 8 5番に対応、 1 9 6 9番の Tを Gに置換） と、 M l 3 M4プライマ一
(該キッ ト添付） を用いた。 1st PCR— (b)のプライマーには M 1 3 R Vプライ マ一と MU T 4プライマ一 （いずれも該キッ ト添付） を用いた。 1st PCR は、 98°Cで 5分保温した後、 94°Cで 30秒間、 55°Cで 2分間、 72°Cで 3分間の工程を 1サ ィクルとして 30サイクル行なった。 P C Rには TaKaRa PCR Thermal Cycler 480
(宝酒造社製） を用いた。 各々の反応液をァガロースゲル電気泳動し、 1st PCR — (a)では約 1.8kb、 1st PCR— (b)では約 2. Okbの増幅断片を分離 '精製して次の ステップで用いた。 1st PCR で得られた増幅断片同士のへテロ 2本鎖 D N Aの形 成は、 98°Cで 15分間保温した後、 1時間かけて 37°Cまで温度をさげ、 37°Cで 15分 間保温することで行なった。 該反応液に LA Taqポリメラ一ゼ添加後、 72°Cで 3分 間保温することでへテロ 2本鎖 D N A末端を平滑化した。 その後に行なう 2nd PCR は、 94°Cで 20秒間、 60°Cで 30秒間、 72°Cで 3分間の工程を 1サイクルとし、 30サイクル行なった。 2nd PCR 産物の一部をァガロースゲル電気泳動し、 約 2.0kb の断片が増幅していることを確認した。 2nd PCR の残りの溶液は、 水で 飽和したフエノール ： クロロフオルム = 1 ： 1溶液とよく混合した後遠心分離 し、 その上清をモレキュラー · クロ一ニング第 2版記載の方法に従いエタノ一 ル沈殿させ、 乾燥後、 水に再溶解した。 該 D N A溶液に制限酵素 Hindlll 、 Eco I (いずれも宝酒造社製） を加えて消化した後、 ァガロースゲル電気泳動を 行い、 2.0kb の DNA断片を分離、 精製した。 同様にプラスミ ドベクタ一 p U C 1 9 (宝酒造社製） も Hindlll 、 ^ RIで消化したのち、 ァガロースゲル電気 泳動にて 2.7kb の断片を分離、 精製した。 ίΙ ΙΙΙ 、 で消化した 2.0kb D
NA断片と p U C 1 9を Ligation Highを用いて連結した後、 大腸菌 D H 5 αの 形質転換に供した。 形質転換株選択用の 50^ g/mlのアンピシリンを含有する L B寒天培地には上記（1) と同様に I P TG、 X— g a 1 を塗布しておいた。 白 コロニーとして得られた形質転換株のうち、 数株を 10mlの 50 g/mlのアンピシ リンを含有した L B培地に植菌し、 37°Cで 16時間振盪培養後、 集菌しアルカリ 法にて各々の株が保持していたプラスミ ド DNAを抽出、 精製した。
(3) 塩基配列の決定による塩基置換導入の確認
塩基配列の決定には、 ABI PRISM DNA Sequencing Kits - Dye primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kits with Am l iTaqR DNA Polymerase, FS -21M13 一 (PE Applied Biosystems社製） 及び ABI373Aを用いた。 上記（2) で得られた 塩基置換導入 K S 1 をもっと考えられる各組換え体プラスミ ド DN Aを錡型に して、 上述の Sequencing Kitsに添付されたプロトコ一ルに従い、 PCRにてシ一 ケンシング試料を作成した。 ABI373Aを用いて試料を電気泳動し、 得られたデー タを遺伝子解析ソフトウエア Genetyx (ソフトウエア開発社製） を用いて解析し た。 その結果、 配列番号 3記載の 1701〜3716に対応する、 約 2.0kb の BamHI断片 を含むプラスミ ド DNA ( p K S 1 mut) が得られていることが確認された。 配 列番号 3は、 配列番号 1の 1〜11916 番目の塩基配列において、 1969番のチミン がグァニンに置換された塩基配列を有している。
(4) ストレブトマイセス · エバ一ミチリス染色体 DN Aへの塩基置換の導入 相同組換えを利用して、 プラスミ ド上の変異を染色体 DNAに導入するため には、 ある程度長い相同領域が必要である。 また P C R法で DNAに変異を導 入しているので目的箇所以外にも変異が入ってしまっている可能性があること から、 変異箇所以外のできるだけ広い領域をストレプトマイセス ' エバ一ミチ リス染色体 DN A由来の D N Aと置き換えて余計な変異を排除する必要もある。 そこで相同組換えに用いるプラスミ ド DN Aを以下のような方法で構築し、 ス トレプトマイセス · エバ一ミチリスの形質転換に供した。
上記（3) で作成した p K S limitを制限酵素 £§11 、 Sa^I (いずれも宝酒造社 製） で消化した後、 ァガロースゲル電気泳動し、 4.1kb の DNA断片を分離 ' 精製した。 つぎに p K S l を^ II 、 Sail で消化後、 電気泳動し、 1.57kbの Pstl、 Sail 消化断片を分離、 精製した。 回収した各々の DNA断片を Ligation Highを用いて連結後、 大腸菌 D H 5 αのコンビテントセルと接触させ、 形質転 換を行なった。 形質転換株の選択には 50 g/mlのアンピシリンを含有した L B 寒天培地を用いた。 37°Cで 16時間培養し、 出現したコロニ一" 数株をエーゼで 拾い、 各々 50 g/mlのアンピシリンを含有する 10mlの L B培地に植菌し、 37°C で 16時間振盪培養後集菌し、 アルカリ法にて各々の菌株の保持するプラスミ ド を精製した。 各々のプラスミ ドを制限酵素^ II 、 Sail で消化し、 ァガロース ゲル電気泳動を行い、 4. lkb と 1.57kbの D N A断片を含むプラスミ ド p K S lm u t Rが得られていることを確認した。
次に p K S 1 mutRを制限酵素^ l (宝酒造社製） で消化し、 Alkaline phosphatase処理した。 つぎに配列番号 1記載のヌクレオチド番号 8 1 7〜 1 8 8 7の £ l 領域を含むコスミ ドを^ 2HI で消化後、 電気泳動し、 約 l. lkb の Kpnl 断片を分離、 精製した。 精製した各々の DNA断片を Ligation Highを用 いて連結後、 大腸菌 D H 5 αのコンビテントセルと接触させ、 形質転換を行な つた。 形質転換株の選択には 50 t g/mlのアンピシリンを含有した L B寒天培地 を用いた。 37°Cで 16時間培養し、 出現したコロニーのうち十数株をェ一ゼで拾 い、 各々 SO ig/mlのアンピシリンを含有する 10mlの L B培地に植菌し、 37°Cで 16時間振盪培養後、 集菌し、 アルカリ法にて各々の菌株の保持するプラスミ ド を精製した。 各々のプラスミ ドを制限酵素 l で消化し、 ァガロースゲル電気 泳動を行い、 1.27kb、 1.57kb及び 2.7kb の DNA断片を含むプラスミ ド p K S 1 m u t R Lが得られていることを確認した。
次に p K S lmu t R Lを制限酵素 Hindlll 、 ^ RIで消化したのち、 ァガロ —スゲル電気泳動にて 2.9kb の Hindlll 、 EcoRI D N A断片を分離 ·精製した。 同様にプラスミ ドベクタ一 P KC 7 (特開平 6— 189774号） も Hindlll ゝ EcoRI で消化したのち、 ァガロースゲル電気泳動にて精製した。 これら 2つの DNA 断片を Ligation Highを用いて 16°Cで 16時間連結反応した後、 大腸菌 DH 5 の コンビテントセルと接触させ、 形質転換を行なった。 形質転換株の選択には 50 ； g/mlのアンピシリンを含有した L B寒天培地を用いた。 37°Cで 16時間培養し、 出現したコロニーのうち十数株をエーゼで拾い、 各々 50 ig/mlのアンピシリン を含有する 10m 1 の L B培地に植菌し、 37°Cで 16時間振盪培養後、 集菌してァ ルカリ法にて各々の菌株の保持するプラスミ ドを精製した。 それぞれのプラス ミ ドを制限酵素 Hindi II 、 ^RIで消化したのち、 ァガロースゲル電気泳動を行 い、 2.9kb の断片を保持するプラスミ ド p KC— K S l mu tが得られている ことを確認した。
p KC-K S l mu t を用いて、 特開平 6— 189774号公報に記載の方法に準 じて、 ストレプトミセス ' エバ一ミチリス K2038 (FERM BP- 2775) の染色体の K S 1領域に K S 1 m u t断片を相同組換えにより組み込んだ。 染色体 DNA 上で K S 1 m u tが組換えられたことを確認するため、 上記の様にして得た組 換え株の染色体 DNAを特開平 6 — 189774号記載の方法で調製し、 該染色体 D N Aを铸型として配列番号 1 0記載の合成 DNA ( 5 ' - ATAAGC TTAA T C GATC CGCT GT CCGGTA-3 ' 、 配列番号 1記載のヌクレオチド 番号 1758〜1776に相当する配列を含む） と配列番号 1 1記載の合成 D NA ( 5 ' -AT GAAT T C C C T C CAAAAT C ACAT G C G CAT T - 3 ' 、 配列番号 1記載のヌクレオチド番号 2710〜2729に相当する配列を含む） をプライマ一セッ トとして用いて P C Rを行なった。 増幅した約 1. Okb の D N A断片を制限酵素 Hindlll 、 ^RIで消化した後、 ァガロースゲル電気泳動によ リ約 1. Okb の増幅断片を分離 ·精製した。 同様にプラスミ ドベクタ一 p UC l 9も制限酵素 Hindlll 、 ^RIで消化した後、 ァガロースゲル電気泳動により分 離 ·精製した。 こうして得た 2つの DN A断片を Ligation High を用いて 16°C で 16時間連結した後、 大腸菌 DH 5 αの形質転換に供した。 形質転換株選択用 の 50μ g /mlのアンピシリンを含有する L B寒天培地には I P TG、 X- g a 1 を塗布しておいた。 白コロニーとして得られた形質転換株のうち、 数株を 10ml の
Figure imgf000041_0001
のアンピシリンを含有した L B培地に植菌し、 37°Cで 16時間振盪培 養後、 集菌しアルカリ法にて各々の株が保持していたプラスミ ドを抽出、 精製 した。 こうして得たプラスミ ドを用いて上記（3) に記載の方法で塩基配列を決 定し、 目的とする組換え体ストレブトミセス ' エバ一ミチリス KSlnrnt 株が得 られたことを確認した。
〔実施例 3〕 基質化合物の合成
以下の各化合物の物理化学的データは次の機器類によって測定した。
MS 日本電子 HX/HX110A
'Η NMR 日本電子 Lambda300(300MHz)
化合物の物理データ中、 「FABMS」 は 「FAB」 法によるマススペクトルを示す。 また、 「通常の後処理」 とは、 下記の反応後処理を表す。
各工程の反応終了後、 必要に応じて反応液に水、 酸、 緩衝液等を加え、 酢酸 ェチル、 エーテル、 クロ口ホルム、 ジクロロェタン等の非水溶性溶媒で抽出す る。 抽出液は水、 食塩水等で洗浄後、 無水硫酸ナトリウムで乾燥し、 溶媒を減 圧下に留去する。
(1) 化合物 1の合成
化合物 A (16 g， 0.060 mol ； 第 1表）をメタノール （620 mL) に溶解し、 - 78°C攪拌下オゾン -空気気流を 4時間流した。 反応液に空気を 15分間流した後、 ジメチルスルフイ ド （44 mL, 0.60 mol)を加え、 25°C 15時間攪拌した。 通常の 後処理後、 残渣を トルエン （290 mL) に溶解し、 メチル（トリフエニルホスフォ ラニリデン）アセテート（33, 7g， 0.10 mol) を加え、 65°C 17時間攪拌した。 通常 の後処理後、 シリカゲルクロマトグラフィー （へキサン//酢酸ェチル =100ノ 0か ら 10/1で溶出） で精製し、 化合物 1 (9.4 g， 収率 53% ;第 1表）を得た。
lH NMR (CDC13) δ pm ； 7.04 (dd， J=8.3, 15.8 Hz, 1H), 5.78 (dd， J=l. l, 15.7 Hz, 1H)， 3.72 (s， 3H)， 3,48 (t， J=3.5 Hz, 1H)， 2.52 (m， 1H)， 1.35-1.54 (m， 2H), 1.10 (m, 1H)， 1.04 (d, J= 7.0 Hz, 3H)， 0.40 (s, 9H)， 0.37 (d， J=7.4Hz, 3H)， 0.35 (d， J=6.8Hz, 3H)， 0.03(s, 3H)， 0.02 (s， 3H) FABMS M/Z 315 (M+H)+ 分子式に基づく理論値 C N3Si=314
(2) 化合物 2の合成
化合物 1 (0.20 g， 0.63 mmol) をメタノール （8.9 mL) に溶解し、 10% 塩化 水素/メタノール溶液 （0.99 mL)を加え、 50°Cで 1時間攪拌した。 通常の後処理 後、 残渣を N，N-ジメチルホルムアミ ド （6.2 mL) に溶解し、 クロ口トリチルシ ラン （0.31 mL, 1.8 mmol )及びイミダゾ一ル （0.21 g， 3.1 mraol) を加え、 25°Cで 1.5時間攪拌した。 通常の後処理後、 シリカゲルクロマトグラフィー （へ キサン/酢酸ェチル =25Z1で溶出） で精製し、 化合物 2 (0.18 g，収率 93% ；第 1表）を得た。
LH NMR (CDC13) δ ppm ； 7.04 (dd， J= 8.4， 15.7 Hz, 1H)， 5.79 (dd， J = 1.1， 15.7 Hz, 1H)， 3.73 (s， 3H)， 3.48 (dd， J= 4.1， 5.4 Hz, 1H), 2.51 (m， 1H), 1.35-1.51 (m, 2H), 1.12 (m， 1H)， 0.81 - 1.08 (m, 18H)， 0.47-0.66 (m， 6H)
FABMS m/z 315 (M+H)+ 分子式に基づく理論値 C17H34N3Si = 314
(3) 化合物 3の合成
化合物 2 (4.1 g, 0.013 mol)をエタノール （200 mL) に溶解し、 10% パラジ ゥム-炭素 （0.41 g) を加え、 水素雰囲気下 25°Cで 4.5時間攪拌した。 反応液を セライ ト R545 に通した後、 溶媒を減圧下留去した。 残渣を 1,4-ジォキサン (100 mL) 及び水 (100 mL) に溶解し、 4mol 水酸化カリゥム水溶液 （6.4 mL, 0.026 mol)を加え、 60°C3.5時間攪拌した。 反応液に DOWEX 50Wを加え中和した 後、 溶媒を減圧下留去した。 残渣をジクロロメタン （200 mL) に溶解し、 N -ァ セチルシステアミン （1,8 mL， 0.017 mol), 塩酸 ·1-ェチル -3- (3'-ジメチルァ ミノプロピル） カルボジイミ ド （3.2 g， 0.017 mol) 及び 4-ジメチルアミノビ リジン （0.32 g， 0.0026 mol) を加え、 25°C 11時間攪拌した。 通常の後処理後、 シリカゲルクロマトグラフィー （へキサンノ酢酸ェチル =1ノ1で溶出） で精製し、 化合物 3 (3.8 g, 収率 74% ；第 1表）を得た。
Ή NMR (CDC13) δ ppm ； 5.80 (br s， 1H), 3.43 (dd, J= 6.1， 12.5 Hz, 2H), 3.32 (dd, J= 3.7， 5.3 Hz, 1H), 3.02 (t, J= 6.6 Hz, 2H)， 2.63 (dd, J= 5.3， 9.9 Hz, 1H)， 2.54 (dd, J= 6.3, 9.4 Hz, 1H)， 1.97 (s， 3H)， 1.94 (m， 1H)， 1.58 (m， 1H), 1.31-1.54 (m， 3H)， 1.16 (m, 1H)， 0.81-1.00 (m， 18H), 0.61 (q, J =7.6Hz， 6H)
FABMS m/z 404 (M+H)+ 分子式に基づく理論値 C20H41N03SiS= 403
(4) 化合物 4の合成
化合物 3 (15 mg， 0.038 mmol) をテ ト ラヒ ドロフラン （0.46 mL)及び水 (0.46 mL)に溶解し、 酢酸 （0.45 mL)を加え、 0°C2時間攪拌した。 通常の後処理 後、 薄層クロマトグラフィー （クロ口ホルム/メタノール =10 1で溶出） で精 製し、 化合物 4 (7.7 mg,収率 71%, 純度 63% ；第 1表）を得た。
Ή 丽 R (CDC13) δ pm ； 5.88 (br s， 1H)， 3.64 (dd， J= 6.0, 12.3 Hz, 2H)， 3.20 (m, 1H)， 3.02 (dt, J= 1.8， 6.4 Hz, 2H)， 2.58-2.72 (m, 2H)， 2.06 (m, 1H), 1.97 (s, 3H)， 1.43-1.70 (m， 3H)， 1.33 (m, 1H)， 1.28 (m, 1H)， 0.82-0.95 (m， 9H)
FABMS m/z 290 (M+H)+ 分子式に基づく理論値 C14H27N03S = 289
〔実施例 4〕 22,23-ジヒドロエバ一メクチン B 1 aの直接生産
実施例 2で得たストレブトミセス · エバーミチリス KSlmut の胞子懸濁液 10 1 を 10mlの種培地 [ラク ト一ス 20g 、 デイスティラ一ズ溶液 15g 、 酵母自己 消化物（Difco)2.5g 、 蒸留水 1000mlを含む溶液を 2mol./l水酸化カリゥムで pH7.2 とした後、 121 °C15分間、 高圧蒸気滅菌にかけた培地] の入った太型試験管に 接種し、 28°Cで 20時間振盪培養して種培養液を得た。 この種培養液 0.4ml を 20mlの生産培地 [グルコース 46g 、 ペプトン化牛乳（0xoid)24g、 酵母自己消化 物（Difco)2,5g 、 ポリ プロピレングリ コール #2000 2.5ml 、 蒸留水 1000mlを 121 °C15分間、 高圧蒸気滅菌にかけた培地] の入った 100ml 容三角フラスコに 移植し、 ロータリーシェーカーで、 28°C、 3日間、 220rpm培養した後、 実施例 3で合成した化合物 4の lmg/mlメタノール溶液 （化合物 4を 50% 含有） を 50 μ
1添加し、 再び 28°Cで 2日間振盪培養した。 培養終了後、 該培養液に 2倍量のメ タノールを加えて十分撹拌した後、 3000rpm で 5分間、 室温にて遠心分離して菌 体を沈殿させ、 その上清を高速液体クロマトグラフィー （H P L C) 分析に供 した。
HP L C分析
クロマト条件
カラム ： G Lサイエンス社製イナ一トシル O D S— 2 (4.6 X 150mm ) ガードカラム ： G Lサイェンス社製 ガードカラム Eカートリ ッジ （4 X 10mm)
移動相 ： ァセトニトリノレ ： メタノール： 水 =70： 10： 20 0.6 ml/min
検出 246 nm
温度 55°C
上記分析条件にて、 培養液のメタノール抽出液を分析した結果、 化合物 4を 添加した培養液抽出物にのみ、 保持時間 21.7分にピークが見られた。 22，23 -ジ ヒドロエバ一メクチン Bla を同様の条件で分析したところ、 保持時間は 21.7分 で一致した。 また 22,23-ジヒドロエバ一メクチン Bla をスタンダードとした場 合、 培養液抽出物から得られた保持時間 21.7分を示す物質の生産量は 23.3mg/L であった。
日本分光社製の多波長検出器 MD— 9 1 5を用いて三次元 H P L C分析を行 つた結果、 保持時間 21.7分のピークの最大吸収波長は 248mn であリ、 そのスぺ クトルも 22， 23-ジヒドロエバ一メクチン Bla のそれらと一致していた。
また、 上記の保持時間 21.7分ピークを H P L Cを用いた分取によリ白色粉末 を 5 m g取得し、 質量分析に供した。 結果は以下のようであった。
m/z 873.5 (M + ) C 48 H 7 3 O 1 4
これは、 Ivermectin and Abamectin, William C. Campbell (1989)記載の 22， 23-ジヒドロエバ一メクチン Bla のデータと一致した。
以上よリ、 化合物 4をストレプトミセス · エバ一ミチリス KSlmut に添加培 養して得られた物質は 22， 23 -ジヒドロエバ一メクチン Bla であることが明らか となった。 この添加培養では、 22,23-ジヒドロエバーメクチン Bla 以外のエバ ーメクチン類縁体は全く生産されていなかった。 22,23-ジヒドロエバーメクチ ン Bla の単一生産が可能となったことから、 22,23-ジヒドロエバ一メクチン Bla の製造が格段に容易になった。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 医薬、 動物薬及び農薬として有用な 22，23-ジヒドロエバー メクチン Bla を直接生産できる。 従って、 これまで行われていた煩雑でしかも 困難であった工業レベルでのエバーメクチン Bla の精製過程、 及びエバーメク チン Bla の化学修飾過程を省略することができ、 22,23-ジヒドロエバーメクチ ン Bla の工業的製造法のコスト、 時間が大幅に減少される。 また、 医薬品とし ての効果が高い 22， 23-ジヒドロエバーメクチン Bla のみを含む製剤の製造が可 能となる。
「配列表フリ一テキスト」
配列番号 9 ： これは、 配列番号 1の塩基番号 1954から 1985の間の配列に基く 合成 D N Aである。
配列番号 1 0 ： これは、 配列番号 1の塩基番号 1758から 1776の間の配列を有 する合成 D N Aである。
配列番号 1 1 ： これは、 配列番号 1の塩基番号 2710から 2729の間の配列を有 する合成 D N Aである。

Claims

請 求 の 範 囲
1. エバ一メクチンァグリコン合成反応に関与するァシルキヤリア一タンパク 質 （AC P)、 /3ケトァシル AC P合成酵素 （K S)、 ァシル転移酵素 （AT)、
/3ケトァシル AC P還元酵素 （KR)、 脱水酵素 （D H)、 エノィル還元酵素 (E R)、 チォエステラーゼ （T E) からなる群から選ばれる少なく とも 1以上 のドメインの活性を消失又は低下させていることを特徴とする、 改変されたェ バ一メクチンァグリコン合成酵素。
2. 改変されたエバ一メクチンァグリコン合成酵素が、 ストレブトマイセス ' エバ一ミチリス由来である、 請求項 1に記載の改変されたエバーメクチンァグ リコン合成酵素。
3. 活性を消失又は低下させている ドメインが、 AT s、 AC P s、 K S 1、 AT I , KR 1、 AC P I , K S 2、 D H 2及び K R 2からなる群から選ばれ ることを特徴とする、 請求項 1 に記載の改変されたエバ一メクチンァグリ コン 合成酵素。
4. 配列番号 4、 5、 6、 及び 7に記載のアミノ酸配列からなるエバ一メクチ ンァダリコン合成酵素のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、 置換、 若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ N—ァセチルシステアミンチォ エステル化合物と接触させた場合に、 22， 23 -ジヒドロエバ一メクチン Bla又はそ の誘導体を生成する活性を有する、 改変されたエバ一メクチンァグリコン合成
5. 配列番号 8に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、 請求項 4 に記載の改変されたエバーメクチンァグリコン合成酵素。
6. N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物が、 下記式 （ I ) :
Figure imgf000047_0001
(式中、 R R2は、 同一又は異なって、 水素、 置換又は非置換のアルキル、 置換又は非置換のアルケニル、 置換又は非置換のァリール、 置換若しくは非置 換の複素環基、 あるいは一体となって置換若しくは非置換のシクロアルキルを 表す。） で示される N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物である、 請求 項 4に記載の改変されたエバ一メクチンァグリコン合成酵素。
7. N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物が、 請求項 6に記載の式 ( I ) において、 R 1がメチル、 R2が s e c—ブチルである N—ァセチルシス テアミンチォエステル化合物であることを特徴とする、 請求項 6に記載の改変 されたエバ一メクチンァグリコン合成酵素。
8. 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の改変されたエバ一メクチンァグリ コ ン合成酵素をコードする DNA。
9. 配列番号 8に記載のァミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする D N Aを含む D N A。
1 0. 配列番号 3に記載の塩基配列からなる DNAを含む DNA。
1 1. 請求項 8〜 1 0のいずれか 1項に記載された D N Aとストリンジェント な条件下でハイプリダイズし、 かつ N—ァセチルシステアミンチォエステル化 合物と接触させた場合に、 22,23-ジヒドロエバ一メクチン Bla又はその誘導体を 生成する活性を有するポリペプチドをコードする D N A。
1 2. 請求項 8〜 1 1のいずれか 1項に記載の D N Aをべクタ一に組み込んで 得られる組換え体 DNA。
1 3. 請求項 1 2に記載の組換え体 DNAを宿主細胞に導入して得られる形質 転換体。
1 4. 宿主細胞が微生物である、 請求項 1 3に記載の形質転換体。
1 5. 微生物がストレブトマイセス属に属する微生物である、 請求項 1 4に記 載の形質転換体。
1 6. ストレブトマイセス属に属する微生物がストレプトマイセス . エバ一ミ チリス (Streptomyces avermiti 1 is) である、 請求項 1 5に記載の形質転換体。
1 7. 形質転換体が、 ストレブトマイセス · エバ一ミチリス (Streptomyces avermiti lis) KSlmutである、 請求項 1 6に記載の形質転換体。
1 8. 請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の改変されたエバ一メクチン合成酵 素の基質化合物であって、 かつ該合成酵素と接触させた場合に 22， 23-ジヒド口 エバ一メクチン Bla又はその誘導体を生成することを特徴とする、 N—ァセチル システアミンチォエステル化合物 <
1 9. 下記式 （ I ) :
Figure imgf000049_0001
(式中、 R 1 R2は、 同一又は異なって、 水素、 置換又は非置換のアルキル、 置換又は非置換のアルケニル、 置換又は非置換のァリール、 置換若しくは非置 換の複素環基、 あるいは一体となって置換若しくは非置換のシクロアルキルを 表す。） で示される、 N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物。
20. N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物が、 請求項 1 9記載の式
( I ) において、 R 1がメチル、 R2が s e c—ブチルである N—ァセチルシス テアミンチォエステル化合物であることを特徴とする、 請求項 1 9に記載の N —ァセチルシステアミンチォエステル化合物。
2 1. 下記式 （II) ：
(ID
Figure imgf000049_0002
(式中、 R R2は、 同一又は異なって、 水素、 置換又は非置換のアルキル、 置換又は非置換のアルケニル、 置換又は非置換のァリール、 置換若しくは非置 換の複素環基、 あるいは一体となって置換若しくは非置換のシクロアルキルを 表す。） で示される化合物を出発物質とし、 かつ N—ァセチルシステアミンを加 える反応を含むことを特徴とする、 N—ァセチルシステアミンチォエステル化 合物の製造法。
2 2. 下記式 （II) ：
Figure imgf000050_0001
(式中、 I 1、 R 2は、 同一又は異なって、 水素、 置換又は非置換のアルキル、 置換又は非置換のアルケニル、 置換又は非置換のァリール、 置換若しくは非置 換の複素環基、 あるいは一体となって置換若しくは非置換のシクロアルキルを 表す。） で示される化合物を出発物質とし、
(a) 該化合物をオゾン酸化後、 ゥイツティッヒ反応により増炭し、
(b) 該反応によリ得られた化合物の t—プチルジメチルシリル基を脱保護後、 クロロトリエチルシランを用いて再度、 保護基を導入し、
(c) 得られた化合物をパラジウム—炭素触媒下で α _ β炭素不飽和結合を還 元した後、 エステルを水酸化カリウムで加水分解し、 中和してから縮合剤存在 下、 Ν—ァセチルシステアミンを加えてチォエステル化合物を得、
(d) 該チォエステル化合物に酢酸を加えることにより保護基を取り除くこと を特徴とする、 請求項 2 1に記載の N—ァセチルシステアミンチォエステル化 合物の製造法。
2 3 . 請求項 1 3〜 1 7のいずれか 1項に記載の形質転換体を培地に培養し、 培養物中に改変されたエバ一メクチンァグリ コン合成酵素活性を有するポリぺ プチドを生成、 蓄積させ、 該培養物中から該ポリペプチドを回収することを特 徴とする、 改変されたエバーメクチン合成酵素の製造法。
2 4 . 請求項 1 3〜 1 7のいずれか 1項に記載の形質転換体の培養物又はその 処理物あるいは請求項 1〜 7のいずれか 1項に記載の酵素と、 請求項 1 8に記 載の N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物とを媒体中で接触させ、 該 媒体中に生成蓄積させた 22， 23-ジヒドロエバ一メクチン B la又はその誘導体を採 取することを特徴とする、 22, 23-ジヒドロエバ一メクチン Bla又はその誘導体の 製造法。
2 5. N—ァセチルシステアミンチォエステル化合物を請求項 1〜 7のいずれ か 1項に記載の改変されたエバ一メクチン合成酵素の基質化合物とすることを 特徴とする、 22,23-ジヒドロエバ一メクチン Bla又はその誘導体の製造方法。
PCT/JP2001/001381 2000-02-24 2001-02-23 Procede de production d'un derive d'avermectine WO2001062939A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2001234164A AU2001234164A1 (en) 2000-02-24 2001-02-23 Process for producing avermectin derivative
CA002402398A CA2402398A1 (en) 2000-02-24 2001-02-23 Process for producing avermectin derivative
DE60127948T DE60127948T2 (de) 2000-02-24 2001-02-23 Verfahren zur herstellung von avermectinderivaten
EP01906278A EP1270728B1 (en) 2000-02-24 2001-02-23 Process for producing avermectin derivative
US10/204,862 US20040101936A1 (en) 2000-02-24 2001-02-23 Process for producing avermectin derivative

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000-47405 2000-02-24
JP2000047405 2000-02-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001062939A1 true WO2001062939A1 (fr) 2001-08-30

Family

ID=18569657

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/001381 WO2001062939A1 (fr) 2000-02-24 2001-02-23 Procede de production d'un derive d'avermectine

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20040101936A1 (ja)
EP (1) EP1270728B1 (ja)
AT (1) ATE360086T1 (ja)
AU (1) AU2001234164A1 (ja)
CA (1) CA2402398A1 (ja)
DE (1) DE60127948T2 (ja)
WO (1) WO2001062939A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7332535B2 (en) 2002-05-14 2008-02-19 Clariant Finance (Bvi) Limited Stabilizer mixtures for the protection of polymer substrates

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030211985A1 (en) * 2000-07-18 2003-11-13 Zerhusen Bryan D. Novel proteins and nucleic acids encoding same
CA2723648A1 (en) 2008-04-10 2009-10-15 Piyush Gupta Methods for identification and use of agents targeting cancer stem cells
US10106778B2 (en) 2012-11-08 2018-10-23 Whitehead Institute For Biomedical Research Selective targeting of cancer stem cells
US10398672B2 (en) 2014-04-29 2019-09-03 Whitehead Institute For Biomedical Research Methods and compositions for targeting cancer stem cells
CN113930407A (zh) * 2021-05-28 2022-01-14 湖北中农华威生物工程有限公司 一种水解酶及其在生物催化合成4″-甲氨基-5′-羟基-阿维菌素中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0391594A2 (en) * 1989-03-31 1990-10-10 Merck & Co. Inc. Cloning genes from streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use
JPH06189774A (ja) * 1992-12-24 1994-07-12 Kitasato Inst:The ５−オキソ−エバーメクチン誘導体の直接醗酵法ならびにその生産微生物
EP0997528A1 (en) * 1998-09-14 2000-05-03 Pfizer Products Inc. Streptomyces avermitilis regulatory genes for increased avermectin production
WO2000050605A1 (fr) * 1999-02-24 2000-08-31 The Kitasato Institute Genes de la synthase d'avermectine aglycone

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6066721A (en) * 1995-07-06 2000-05-23 Stanford University Method to produce novel polyketides
GB9814622D0 (en) * 1998-07-06 1998-09-02 Biotica Tech Ltd Polyketides,their preparation,and materials for use therein
JP2002535387A (ja) * 1999-01-27 2002-10-22 コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド オリゴケチドの合成

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0391594A2 (en) * 1989-03-31 1990-10-10 Merck & Co. Inc. Cloning genes from streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use
JPH06189774A (ja) * 1992-12-24 1994-07-12 Kitasato Inst:The ５−オキソ−エバーメクチン誘導体の直接醗酵法ならびにその生産微生物
EP0997528A1 (en) * 1998-09-14 2000-05-03 Pfizer Products Inc. Streptomyces avermitilis regulatory genes for increased avermectin production
WO2000050605A1 (fr) * 1999-02-24 2000-08-31 The Kitasato Institute Genes de la synthase d'avermectine aglycone

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A.F.A. MARSDEN ET AL.: "Engineering broader specificity into an antibiotic-producing polyketide synthase", SCIENCE, vol. 279, no. 5348, 1998, pages 199 - 202, XP002941701 *
H. IKEDA ET AL.: "Avermectin biosynthesis", CHEM. REV., vol. 97, no. 7, 1997, pages 2591 - 2609, XP002941702 *
H. IKEDA ET AL.: "Strategic strain improvement of antibiotic producer", ACTINOMYCETOLOGICA, vol. 5, no. 2, 1991, pages 86 - 99, XP002941703 *
Y. LIU ET AL.: "Biosynthetic incorporation of advanced precursors into dehydrocurvularin, a polyketide phytotoxin from alternaria cinerariae", TETRAHEDRON, vol. 54, no. 52, 1998, pages 15937 - 15958, XP002941705 *
Y.S. TSANTRIZOS ET AL.: "Biosynthesis of the hypotensive metabolite oudenone by oudemansiella radicata. 1. Intact incorporation of a tetraketide chain elongation intermediate", J. ORG. CHEM., vol. 60, no. 21, 1995, pages 6922 - 6929, XP002941704 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7332535B2 (en) 2002-05-14 2008-02-19 Clariant Finance (Bvi) Limited Stabilizer mixtures for the protection of polymer substrates

Also Published As

Publication number Publication date
CA2402398A1 (en) 2001-08-30
EP1270728A4 (en) 2004-11-24
DE60127948D1 (de) 2007-05-31
AU2001234164A1 (en) 2001-09-03
ATE360086T1 (de) 2007-05-15
EP1270728A1 (en) 2003-01-02
DE60127948T2 (de) 2008-01-17
US20040101936A1 (en) 2004-05-27
EP1270728B1 (en) 2007-04-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20020062361A (ko) 개변된 α1,2-푸코오스 전이효소 유전자 및α1,2-푸코오스 전이효소와 푸코오스 함유 당질의 제조법
US20050164359A1 (en) Process for producing cytidine 5&#39;-diphosphate choline
ES2276427T3 (es) Aislamiento de los genes de biosintesis de seudo-oligosacaridos de streptomyces glaucescens gla.o y su uso.
WO2001062939A1 (fr) Procede de production d&#39;un derive d&#39;avermectine
WO2001077313A1 (fr) α1,2-FUCOSYLTRANSFERASE ET PROCEDE SERVANT A PREPARER UN GLUCIDE COMPLEXE CONTENANT FUCOSE
US7897370B2 (en) Process for producing HMG-CoA reductase inhibitor
WO2001021774A1 (fr) Nouveau gene transaldolase
US7223581B2 (en) F0F1-ATPase and DNA encoding the same
US7371548B2 (en) Avermectin aglycon synthase genes
US20180251486A1 (en) Lincomycin biosynthetic intermediates, method for preparation, and use thereof
AU706116B2 (en) Acarbose biosynthesis genes from Actinoplanes sp., process for the isolation thereof and the use thereof
KR20010102019A (ko) Ｎ-아세틸글루코사민 ２-에피머라아제 및 이 효소를코딩하는 ｄｎａ
JP2003033188A (ja) エバーメクチン誘導体の製造法
CN115094016B (zh) 敲除葡萄糖-6-磷酸异构酶基因的重组大肠杆菌及其在生产1,2,4-丁三醇中的应用
WO2000065072A1 (fr) Nouvelle mannose isomerase et adn codant pour cette enzyme
CN117431285A (zh) 玉米糖基转移酶ZmUGT84A1和ZmUGT84A2在合成黄酮糖苷衍生物中的应用
WO2003014352A2 (en) Nucleic acids for aminocoumarin biosynthesis
WO2001077337A1 (fr) Gene transferase $g(a)1,4-n-acetylgalactosamine et procede de production de cette enzyme et glucide complexe contenant n-acetylgalactosamine
JP2001299351A (ja) 新規ポリペプチド
JP2004089156A (ja) ビセニスタチン合成酵素遺伝子クラスター、ビセニサミン糖転移酵素ポリペプチドおよび当該ポリペプチドをコードする遺伝子
WO2001038536A1 (fr) POLYPEPTIDE GlmU ET ADN CODANT POUR CE POLYPEPTIDE
JPH11285384A (ja) マクロライド抗生物質アシル化酵素遺伝子を含有するｄｎａ
JP2005052007A (ja) アミダーゼ様酵素をコードする遺伝子及び当該遺伝子によってコードされる遺伝子産物

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref country code: JP

Ref document number: 2001 561749

Kind code of ref document: A

Format of ref document f/p: F

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2402398

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001906278

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001906278

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10204862

Country of ref document: US

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2001906278

Country of ref document: EP