WO2001011946A1 - Orge obtenue par construction presentant une teneur reduite en proteines gels - Google Patents
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8251—Amino acid content, e.g. synthetic storage proteins, altering amino acid biosynthesis
Definitions
- the present invention relates to producing rye with reduced gel protein in rye seeds.
- Seeds of wheat contain a large amount of seed-specific expressed proteins (seed storage proteins), of which 35-55% are alcohol-soluble hordin (Shewry 1993, Barley Chemistry and Technology. Ppl64: American Association of Cereal Chemistrys).
- hordins are classified into four types, B, C, D, and a, based on their locus and amino acid composition.
- the content ratio of B to C is 70 to 80%, C is 10 to 20%, and D is 5% or less.
- hordins have been reported to play a very important role as a source of amino acids in yeast in beer brewing, as well as to influence beer chromaticity and the formation of cold turbidity. These reports examine the impact of hordin on beer quality and the beer manufacturing process, rather than on individual hordin classes.
- the present invention is intended to reduce the amount of gel protein in barley by suppressing the production of D-form, which is contained in trace amounts in hordin, that is, D-hordin.
- D-hordin accounts for only about 5% of all hordins.However, according to the present invention, it is possible to reduce the amount of gel protein more unexpectedly by suppressing the production of D-hordin. According to what they found.
- the present invention relates to a method for producing rye with a reduced amount of gel protein that can be aggregated in a gel form during protein extraction from rye, comprising D foldin expression capable of suppressing the production of endogenous D-foldin protein of rye.
- An inhibitory nucleic acid is introduced into wheat, and the introduction of the D-hordin expression-inhibiting nucleic acid suppresses the production of the D-hordin protein and reduces the amount of gel protein.
- the D-foldin expression-suppressing nucleic acid is introduced into barley to suppress the production of the D-foldin protein, thereby making it possible to reduce the D-foldin protein fraction from the gel protein. Furthermore, although this D-hordin protein constitutes only a very small part of the gel protein, the reduction of the D-foldin protein that occupies this very small part results in the reduction of other proteins that constitute the gel protein. The quality can also be eliminated or reduced from the gel protein. As a result, according to the present invention, the total gel protein amount can be reduced more than expected.
- the D-foldin expression-suppressing nucleic acid can express an antisense RNA that is complementary to endogenous D-foldin RNA of wheat. And
- antisense D-foldin RNA is expressed in barley, which complements the endogenous D-foldin RNA, inhibits protein translation, and suppresses the production of D-foldin protein.
- the present invention relates to a D-foldin expression-suppressing nucleic acid that produces an antisense RNA that can be complementary to endogenous D-foldin RNA produced in wheat, which produces the antisense RNA downstream of a promoter that operates in the wheat.
- the D-hordin coding sequence encoding the D-hordin is characterized in that it is connected in the reverse direction.
- antisense D-foldin RNA is transcribed from the promoter, and this antisense D-foldin RNA binds complementarily to endogenous D-foldin RNA to bind D-foldin RNA. It can inhibit the translation of the underlying D-foldin protein.
- the D-hordin coding sequence is (1) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, (2) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, (3) the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
- the present invention relates to a vector containing the above-mentioned D-hordin expression-suppressing nucleic acid.
- the present invention is characterized in that a selectable marker expression cassette capable of expressing a selectable marker is provided near the D-foldin expression-suppressing nucleic acid.
- the provision of the selectable marker-one expression cassette makes it possible to select a strain into which the D-foldin expression-inhibiting nucleic acid has been introduced, using the selectable marker as a clue, and suppresses the expression of D-foldin.
- Strain ie, a gel protein reduced strain, can be quickly identified.
- a kit for producing a reduced germ protein of the present invention comprises the nucleic acid for suppressing D-foldin expression or the vector, wherein the nucleic acid for suppressing D-foldin expression or the vector is introduced into rye to reduce rye gel protein.
- the present invention also includes a method of producing any of the above-described gel protein-reduced rye or a rye produced by the kit for producing a gel protein-reduced rye according to any one of claims 8 to 9.
- FIG. 1 is a diagram showing the structure of the D-hordin expression suppression vector used in Example 1.
- FIG. 2 is a diagram showing a method for constructing the D-hordin expression suppression vector used in Example 1.
- FIG. 3 is a diagram showing the results of confirmation of an introduced gene by Southern blotting of the transformed barley of Example 2.
- FIG. 4 is a diagram showing SDS polyacrylamide gel electrophoresis analysis of the hordin fraction of the transformed barley seeds of Example 3.
- FIGS. 5A and 5B are diagrams showing the results of gel protein quantification of the transformed barley seeds of Example 4.
- FIG. 6 is a diagram showing a change in the composition of gel protein of the transformed barley seeds of Example 5.
- D-hordin protein is processed through the processes of transcription from chromosomal genes to RNA and translation of RNA into proteins. It can be executed by '
- methods for suppressing the expression of the D-hordin protein include the antisense method, the co-supression method, and the ribozyme method.
- its expression may be suppressed by modifying the D-hordin gene region that is the basis of the production of D-hordin protein.
- a gene targeting method can be employed.
- any method described above may be used as long as it can suppress the expression of D-hordin protein, but the method is highly reliable and specific.
- An antisense method can be suitably used as a highly reliable method.
- nucleic acid for suppressing expression of D-hordin gene The structure of the nucleic acid for suppressing the expression of D-foldin varies depending on the expression suppression method to be employed.
- the antisense method specifically binds the antisense RNA to the target D-hordin mRNA, thereby inhibiting the translation of the D-hordin mRNA into a protein. Therefore, when the antisense method is adopted, antisense D-foldin RNA can be used as an expression-suppressing nucleic acid, and the expression of D-foldin protein can be suppressed by directly supplying this antisense RNA to barley. Can be.
- an expression cassette that expresses antisense RNA can be used as the expression-suppressing nucleic acid.
- antisense RNA can be stably supplied in the transformed barley, and this property can be applied to the next-generation seed group and the like obtained from this transformant. It can be inherited.
- the above antisense D hordin expression cassette can be configured as follows.
- the homing D-hordin gene is operably linked downstream of the promoter expressed in the ripening endosperm tissue, and a transcription terminator that also functions in the ripening endosperm tissue is linked downstream. It can be created by
- the “Hordeum D hordin gene” is reversely linked downstream of the promoter so that antisense RNA can be generated. It is not necessary that the “Dwarf D hordin gene” introduced into this expression cassette has the entire region of the D hordin gene, but has a length that can inhibit translation from endogenous D hordin mRNA. If so, it may be a partial sequence of the D-hordin gene.
- the “Dwarf D-hordin gene” in the cassette may also be used if it can inhibit translation based on the endogenous D-holdin mRNA. It may be longer than mRNA, and may be one to which an arbitrary DNA fragment is added.
- sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 2 can be suitably used as the above-mentioned wheat D hordin gene, but sequences substantially identical to these sequences can also be used.
- This substantially identical sequence is, for example, a sequence having at least one of substitution, deletion, addition, and insertion in the above sequence and capable of suppressing the expression of the endogenous D-hordin gene.
- the transgene in the expression cassette is not limited to the “Homwort D hordin gene”, and a gene having high homology to the D hordin gene can also be used.
- a wheat macromolecule glutenin subunit gene or a rye macromolecule serine gene can be used as long as it can complementarily bind to endogenous D-hordin mRNA.
- transgene in the expression cassette used here may be genomic DNA, cDNA, or a gene obtained by manipulating these genes by synthesis or modification.
- promo evening in the expression cassette as long as it has a promoting evening activity in the ripening endosperm tissue.
- B Holdin Promoter C Holdin Promoter, A Holdin Promoter, Amylase Promo — Yuichi, Wheat Macromolecule Glutenin Subunit Promoter, Rye Macromolecule Serine Promoter, Ca 35S Promoter, Actin promo overnight.
- the transcription termination factor is not particularly limited as long as it functions in the endosperm tissue during ripening of barley, and for example, NOS 1 min, 1 min, 1 min and the like can be used.
- the D-foldin expression-suppressing nucleic acid may be, for example, a barley D-hordin gene as a transgene downstream of a promoter expressed in ripening mesendosperm tissue, and further downstream of the N0S Yuichiminator. Transcription end It can be created by connecting the factors.
- the transgene used here is a DNA fragment necessary for reducing D-hordin, and for example, the D-hordin gene can be suitably used. This transgene can then be inserted in the positive direction between the promoter and the transcription termination factor. Also, the transgene need not include the entire region expressed as mRNA, and may be a short gene fragment. Conversely, the transgene may be longer than the entire region expressed as mRNA, or may be one to which an arbitrary DNA fragment has been added.
- any gene having a high homology with the D-hordin gene can be used.
- a wheat macromolecule gluten-subunit gene or a rye macromolecule secarin gene can be used.
- the transgene used here includes genomic DNA, cDNA, and genes obtained by synthesizing, modifying and manipulating these genes.
- the “promo overnight” may be anything as long as it has promoter activity in the endosperm tissue during ripening of barley.
- the ribozyme method is a method in which D-hordin mRNA is degraded by a ribozyme (RNA enzyme) to suppress the expression of D-hordin. Therefore, the D-foldin gene expression-suppressing nucleic acid used in this method is expressed!
- a ribozyme designed gene capable of degrading foldin mRNA is prepared, and this gene is used as a promoter as described above. It can be constructed by positively linking to a transcription termination factor.
- nucleic acid for suppressing D-hordin expression requires restriction enzyme treatment. Procedures such as DNA cloning, DNA ligation, and transformation of Escherichia coli are required, which are performed using conventional techniques. For example, Molecular Cloning (Sambrook, Fritsch, aniatis. Cold Springharbor Laboratory) can be referred to.
- the cassette for suppressing the expression of a specific gene described in this section can be introduced into a plant chromosome as it is in a linear form, or incorporated into an arbitrary plasmid as described below and used as a vector for the expression of a specific gene expression suppressing gene. be able to.
- the expression-suppressing nucleic acid can be used directly as a nucleic acid fragment, but can be inserted into a vector and used as an expression-suppressing vector.
- the expression-suppressing vector can be prepared by inserting the above-described expression-suppressing nucleic acid into an arbitrary plasmid. Further, by sequentially linking a promoter, a structural gene, and a transcription termination factor to an arbitrary plasmid, an expression suppression vector can be simultaneously prepared together with the above-mentioned nucleic acid for expression suppression.
- the plasmid that can be used here for example, a commercially available one such as Plasmid ⁇ may be used, but it is preferable to select one according to the purpose. For example, when you want to collect a large number of vectors, it is desirable to select a plasmid with a large number of copies.
- the plasmid can be provided with a selection marker based on a drug (such as neomycin) or a nutritional component (eg, amino acid requirement) serving as an index when introducing the expression vector into an organism or the like. By providing this selection ability, a plant into which the expression vector has been introduced can be selected using the selection marker as an index.
- Construction of the above-mentioned D-foldin expression suppression vector requires operations related to gene cloning, such as restriction enzyme treatment, DNA ligation treatment, and transformation of Escherichia coli, which must be performed using conventional techniques. Can be. In this case, for example, Molecular Cloning (Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold Springharbor Laborator).
- the cell into which the expression-suppressing nucleic acid or the expression-suppressing vector containing the same is introduced is preferably a plant cell having a regeneration ability.
- Examples of such a cell include a cell derived from an immature embryo and a cell derived from an anther.
- a known method can be used. Specifically, in addition to the polyethylene glycol method, there are an election port method, a particle gun method, an agglomerator method and the like.
- the plant into which the expression-suppressing nucleic acid or the expression-suppressing vector has been introduced as foreign DNA is different from the pre-transformation property as a transformed plant. Form new varieties or breeds with reduced properties.
- the method of extracting and quantifying the gel protein from the seeds grown on the transformed barley can be performed by a known method. For example, use the method of Smith and Lister (Smith and Lister (1983), Journal of Cereal Science 1: 229-239) or Skerritt and Janes (Skerritt and Janes (1992), Journal of Cereal Science 16: 219-235) Can be. SDS polyacrylamide gel electrophoresis is effective for examining the composition of the obtained gel protein, but high performance liquid chromatography can also be used. Identification of each B, C, and D hordin can be performed based on known information based on the molecular weight. For example, Shewry (She wry (1993), Barley: Chemistry and Technology. ppl64: American Association of Cereal Chemists) is helpful.
- FIG. 1 shows the configuration of an expression suppression vector that expresses antisense RNA against D-hordin mRNA.
- the D-foldin expression suppression vector is provided with an antisense expression cassette 10 for expressing an antisense RNA against D-foldin mRNA as a D-foldin expression suppression nucleic acid.
- D-hordin cDNA 16 (SEQ ID NO: 1 or 2) is oriented downstream of the D-hordin promoter (D-hordin P) 14 (SEQ ID NO: 3), that is, 3 ′ ⁇ 5 ′. Connected in the direction. Further, downstream of this inverted D-hordin cDNA 16, 1 ⁇ ⁇ 3 ⁇ / ⁇ / ⁇ / ⁇ is connected.
- the D-hordin expression suppression vector contains the antisense expression cassette 1
- a selection marker expression cassette 12 is provided in a form in which the upstream and the upstream face each other (head to head).
- the selection marker expression cassette 12 includes neomycin phosphotransferase (NPT II) downstream of the arf promoter 20.
- NPT II neomycin phosphotransferase
- Gene 22 is connected, and NOS / Mine / 24 are connected downstream.
- Figure 2 shows the construction of the D Holdin vector.
- This DPP3Nhe2 vector is digested with the restriction enzymes BamHI and EcoRI, and contains BamHI- containing NOS / Mine / 118 from NOS derived from pBI221 (Clonetec) as a transcription termination factor.
- the EcoRI fragment was inserted and ligated together to obtain the DPP 3Nhe T vector (S 01) o
- this DPP3NheT vector was digested with the restriction enzyme BstX1, the ends were blunted and religated to obtain the DPP3NheTBXD vector (S02).
- the DPP3NheTBXD vector obtained here has a PmaCI site and a Sacl site between D-Holdin Promote and NOS and Mines.
- DPP3NheTBXD vector was erased with SacI to prepare a blunt-ended one (SO 3).
- pDH4 or pDH6 carrying D-hordin cDNA 16 is digested with EcoRI, and the EcoRI fragment containing the entire region of D-hordin cDNA (derived from pDH4: SEQ ID NO: 1, derived from pDH6: SEQ ID NO: 2) is blunt-ended. The fragment was prepared (S04). These two fragments were ligated, and the direction of D-foldin cDNA 16 was selected in a direction opposite to the promoter 114, and these were designated as DPADH4S and DPADH6S (SO5).
- the selection marker expression cassette was adjusted from pSBG121NH.
- neomycin phosphotransferase gene (neomycin phosphotransierase, Pharmacia; hereinafter, nptll gene) is ligated downstream of the arf promoter (SEQ ID NO: 4), and further N0S ⁇ ⁇ ⁇ Consolidated. Therefore, PSBG121NH was digested with Nhel, the expression cassette containing ⁇ gene 22 was recovered (S06), and this fragment was introduced into the Nhel site of DPADH4S and DPADH6S. After the introduction, those in which the selection marker expression cassette 12 and the antisense expression cassette 10 were linked head-to-head were selected, and these were designated as DPADH4NPT and DPADH6NPT (S07).
- Transformation of barley was carried out by using the polyethylene glycol method for protoplasts obtained from a cell line derived from immature embryos of the barley cultivar Igri. (DPADH4NPT or DPADH6NPT).
- Example 1 the two types of vectors prepared in Example 1 above were purified using Qiagen columns (manufactured by Quiagen), respectively; a TE buffer (10 mM Tris) was added to a concentration of g / ⁇ 1.
- the cells were suspended in HC1 (pH 7.5), ImM EDTA).
- Protoplasts were prepared by enzymatic treatment and purification from a liquid suspension cell line of cultivar Igri.
- the introduction of the vector into this protoplast was performed basically according to the method of Funatsuki et al. (Funatsuki et al. (1995) Theoritical and Applied Genetics 91: 707-712). That is, the obtained protoplasts were mixed with 50 ⁇ g of the above vector, 100 mM CaC12, 0.6 M sorbitol, 0.1% (w / v) MES, and adjusted to pH 5.7 with 250% Ca- Suspended in S (calcium sorbitol solution).
- the liquid medium and nurse cells were removed. Furthermore, in order to select only colonies having the NPTI I gene as the primary selection, the obtained colonies were cultured in a liquid medium containing G418 (dieneticin, manufactured by Gibco) at 20 or 25 / g / ml.
- G1418 resistant colonies were cultured with shaking for about 14 days, they were transferred to a regeneration medium containing G418 at the same concentration as the primary selection as secondary selection, and cultured. Colonies that had formed callus II embryoid bodies or differentiated shoots during the secondary selection process were transplanted into a modified L3 medium without G418 as transformed cell lines derived from independent protoplasts. Promoted regeneration of the body. When the green shoots reach 1-1 cm, move the petri dish under strong light, culture, and transfer to a hormone-free medium. Rooting was promoted and potted.
- DPADH4NPT is present, or DPADH6NPT
- DPADH4NPT DPADH4NPT
- the Southern Hybridization was carried out according to the manual of Boehringer. After washing the membrane after hybridization, the membrane was washed twice with 2X SSC and 1% SDS at room temperature for 30 minutes and then with 0.1X SSC and 0.1% SDS at 42 ° C for 30 minutes twice. . The signal was detected according to the manual of Behringer. As a result of detecting the transgene of each line of the obtained redifferentiated plant by Southern hybridization, the redifferentiated plant obtained from the section into which the introduction of the D-foldin expression suppression vector was attempted was obtained. The transgene was detected in 12 lines, 48 individuals, and in 10 lines, 23 individuals out of the regenerated plants obtained from the plot into which DPADH6NPT was introduced.
- FIG. 3 1 shows an example of detection of a transgene by hybridization.
- the signal of the endogenous D-hordin gene was detected in the DNA obtained from a regenerated plant into which the gene used as the control had not been introduced (Fig. 3, lane 8). From the regenerated plants, it was confirmed that signals other than the endogenous gene, that is, the transgene were present (FIG. 3, lanes 1 to 7, lanes 9 to 12).
- the effect of the D-hordin expression suppression vector was confirmed by measuring the D-hordin content in the transformant seeds from the electrophoretic band intensity, as shown below.
- Proteins were extracted from seeds (hereinafter referred to as T1 seeds) that grew into transformants in which the D-hordin expression-suppressing vector was confirmed to have been introduced above.
- T1 seeds seeds that grew into transformants in which the D-hordin expression-suppressing vector was confirmed to have been introduced above.
- one seed of the above is finely ground using a hammer, USD buffer (8 M urea, 0.1 M dithiothreitol, 50.0 mM sodium carbonate) is added, and the mixture is stirred. Incubated. Then, a transparent fraction (supernatant) obtained by centrifuging the sample at 15,000 rpm for 20 minutes was collected.
- the supernatant fraction obtained here was fractionated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis, stained with Coomassie brilliant blue R250, and analyzed.
- Figure 4 shows the analysis results.
- the black diamonds indicate the bands of D-hordin.
- Fig. 4 shows an example of the electrophoresis of a soluble fraction of USD buffer and three T1 seeds of 90113AT15-14 lines into which DPADH6NPT was introduced.
- As negative controls commercially available Igri seeds and seeds of regenerated plants not transfected were used.
- the D-hordin expression-suppressing vector constructed in the present invention has an effect of reducing D-hordin specifically in transformed barley, that is, without substantially changing other hordin contents.
- SDS-soluble fraction (or “SDS fraction”).
- the fraction precipitated in the above centrifugation was 1.53 ⁇ 4 (w / v) SDS / 10% (v / v) 2-mercaptoethanol / 16% (v / v) N, N, -dimethylformamide (hereinafter, referred to as SDM) was added, and the mixture was stirred well and incubated at 45 ° C for about 20 hours.
- the sample after the incubation was centrifuged at 40,000 ⁇ g and 20 ° C. for 1 hour, and the obtained supernatant was dialyzed using 0.2% SDS. This dialysis is repeated 2 hours 3 times, and the volume is measured after dialysis did.
- the fraction obtained here is the "gel protein fraction" (or "gel fraction").
- TDS seeds used were examined for the presence of reduced D-foldin by SDS polyacrylamide gel electrophoresis as described above, and the transgene was separated (dropped). Data for T1 seeds, for which no reduction was observed, were deleted here.
- FIG. 5A shows the amount of gel protein in the gel fraction extracted per gram of sample and the standard error.
- D-horde occurs as a result of transgene isolation in T1 seed It was investigated how the amount of gel protein changes depending on the presence or absence of thinning.
- 90113AT15 Extracted gel protein from 10 T1 seeds obtained from the same individuals in 1 to 4 lines and qualitatively examined the amount of D-hordin reduction by electrophoresis. They were divided into groups (5 grains) in which no decrease was observed. After that, using these two groups of samples, the relationship between the presence or absence of this D-hordin reduction and the amount of gel protein was investigated. The results are shown in FIG. 5B.
- Fig. 5B As shown in Fig. 5B, the amount of gel protein (Fig. 5B: Sample 2) in the seed group (5 grains) in which the amount of D-hordin was decreased showed no decrease in the amount of D-hordin (5 seeds). (Fig. 5B: sample 1), it was found to be significantly lower (significant level 1%).
- T1 seeds (Fig. 6: lanes 4 and 8) with reduced D-hordein content compared to the control (Fig. 6: lanes 2, 3, 5, 6, 7, 9) originally had gel fractions.
- GS protein a specific protein that was extracted in large amounts per minute migrated to the SDS fraction.
- This result indicates that the decrease in gel protein caused by the introduction of the D-hordin expression suppression vector is not only attributable to the decrease in D-foldin, but also to the proteins that make up other gel proteins (at least GS protein). Is included in the gel fraction at the same time.
- the present invention it has been clarified that oats in which the gel protein which is considered to be highly relevant to wort filterability and wort extract amount is reduced by about 40% can be easily and efficiently produced.
- the present invention it is possible to reduce the time and labor conventionally required in the cross breeding method or the sudden breeding method, and to eliminate the need for breeding fields and radiation irradiation devices required for these methods. In both cases, it is possible to obtain germs with reduced gel protein quality.
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Description
明細：
ゲルタンパク質低減ォォムギの作出
技術分野
本発明は、 ォォムギ種子中のゲルタンパク質を低減したォォムギを作出するこ とに関する。
背景技術
ォォムギ（Hordeum vulgare )の種子には、種子特異的に発現するタンパク質（種 子貯蔵タンパク質） が多量に存在し、 そのうち 3 5〜5 5 %をアルコール可溶性 のホルディンが占めている (Shewry 1993， Barley： Chemistry and Technology. ppl64： American Association of Cereal Chemi sts) 。
このホルディンは、 その遺伝子座及びアミノ酸組成等から B、 C、 D、 ァの 4 タイプに分類され、 全ホルディンに対する含量比は、 Bが 70から 80%、 Cが 10か ら 20%、 Dが 5%以下である。
これらホルディンはビール醸造においては、 酵母のアミノ酸源として非常に重 要な役割を持っている他に、 ビールの色度や寒冷混濁の形成に影響を及ぼすこと が報きた。 これらの報告は、 ホルディンの各分類個々のものではなく、 ホルディ ン全体が及ぼすビール品質やビール製造工程への影響を調べたものである。
例えば、 Baxter (Baxter, 1980， Brewers Digest 55 :45 -47) はマイシェ （mash) に還元剤を加えることにより、 麦汁の濾過速度が改善されることを見いだした。 さらに、 von den Bergら (van den Berg et al . 1981, Proceeding of the EBC congress, Copenhagen, 47:461 -469) は、 ォォムギから 1.5% SDSでタンパク抽出後、 遠心分 離により沈殿するゲル状のタンパク質凝集体、 すなわちゲルタンパク質が、 麦汁 濾過性に悪影響を及ぼすと報告している。 これらの報告は、 B、 Dホルディンがジ スルフイ ド結合により高分子化したゲルタンパク質と麦汁濾過性との関連性を示 唆している。
また、 このゲルタンパク質と麦芽エキスとの間に強い負の相関があることも報
告されている (Smith and Lister ( 1983) , Journal of Cereal Science 1 :229 -239、 Smith and Simpson( 1983), Journal of Cereal Science 1 : 185 -197、 Skerritt and Janes ( 1992 ), Journal of Cereal Science 16 :219 -235、 Howard et al. ( 1996)， Journal of Cereal Science 24:47 -53) σ
さらに、 Brennan (Brennan et al. ( 1998), Journal of Cereal Science
28:29卜 299)は、 Dホルディンを欠くォォムギ系統を用いた isogenic lineを利用 し、 Dホルディンの有無とゲルタンパク質量について検討し、両者間の関連を示唆 した。
このような見地から、 何らかの方法によりゲルタンパク質を低減することがで きれば、 麦汁濾過性や麦汁エキス収量を改善できる可能性が示唆されてきた。 発明の開示
しかしながら、 これまでゲルタンパク質を減少させる方法として、 ゲルタンパ ク質含量の低いォォムギ系統を片親とする交配によるか（Brennan et al. ( 1998) , Journal of Cereal Science 28:291 -299) 、 または放射線照射等による突然変異 育種による方法が採用されていたが、 これら方法はいずれも効率的な方法とは言 えなかった。
すなわち、 上記交配を用いた方法では、 目的のゲルタンパク質が低下した品種 あるいは系統を得るためには、 かなりの時間、 労力、 育種圃場、 及び適切な育種 技術が要求されることになる。 また、 選抜にあたっても多くの系統を供試するこ とが必要となる。 そのため、 この方法では、 経済的且つ、 効率的なゲルタンパク 質が低減されたォォムギの作出を図ることは極めて困難であった。
また、 もう一つの方法である放射線などを用いた突然変異体の誘発方法は、 突 然変異の頻度は低く、 また、 突然変異が挿入される位置はランダムであることか ら、 目的の突然変異体を得るためには、 かなりの規模の突然変異誘発試験を必要 とする。 また、 このような放射線照射を行うには特別の施設を必要とし、 作出操 作を行う場所が制約されるという問題がある。
一方、 近年の分子生物学の進展により、 遺伝子工学技術を利用して植物を改変 する方法が開発され、 プロトプラスト法、 パーティクルボンバ一ドメント法、 ァ グロパクテリゥム法などォォムギの形質転換技術の開発、 改善により比較的容易 に、 かつ短期間に形質転換ォォムギが得られるようになってきている。
そこで、本願発明者らは、これら諸問題を解決すべく、鋭意研究を重ねた結果、 形質転換技術を利用して効率的且つ経済的にゲルタンパク質が低減されたォォム ギの作出方法を開発した。
本発明は、 ホルディンの中の微量に含まれる D型、 すなわち、 Dホルディンの 生成を抑制して、 ォォムギ中のゲルタンパク質量の低減を図るものである。 この 本発明は、 Dホルディンが全ホルディンにおいて 5 %程度を占めるに過ぎないが、 この Dホルディンの生成を抑制することにより、 ゲルタンパク質量を予想以上に 低減させることが可能となることを本願発明者らが見出したことによる。
すなわち、 本発明は、 ォォムギからのタンパク抽出時にゲル状に凝集し得るゲ ルタンパク質が低減されたォォムギを作出する方法であって、 ォォムギの内在 D ホルディンタンパク質の産生を抑制し得る Dホルディン発現抑制核酸をォォムギ に導入し、 前記 Dホルディン発現抑制核酸の導入により前記 Dホルディンタンパ ク質の生成が抑制されてゲルタンパク質量が低減されることを特徴とする。
上記発明によれば、 ォォムギに Dホルディン発現抑制核酸が導入されて前記 D ホルディンタンパク質の産生が抑制され、 ゲルタンパク質から Dホルディンタン パク質画分を低減させることが可能となる。 さらには、 この Dホルディンタンパ ク質はゲルタンパク質のうち極一部を構成するに過ぎないが、 この極一部を占め る Dホルディンタンパク質の低減により、 ゲルタンパク質を構成する他のタンパ ク質をもゲルタンパク質から排除又は低減させることが可能となる。 その結果、 本発明によれば、 全ゲルタンパク質量を予想以上に低減させることができる。 本発明は、 上記発明において、 前記 Dホルディン発現抑制核酸が、 ォォムギの 内在 Dホルディン R N Aと相補するアンチセンス R N Aを発現し得ることを特徴
とする。
上記発明によれば、ォォムギ内でアンチセンス Dホルディン R N Aが発現され、 これが内在の Dホルディン R N Aと相補し、 タンパクへの翻訳が阻害され、 Dホ ルディン夕ンパク質の生成を抑制することが可能となる。
本発明は、 ォォムギ内で生成される内在 Dホルディン R N Aと相補し得るアン チセンス R N Aを生成させる Dホルディン発現抑制核酸であって、 前記ォォムギ 内で作動するプロモー夕の下流に、 前記ァンチセンス R N Aを生成させ得るよう に、 Dホルディンをコ一ドする Dホルディンコ一ド配列が逆向きに連結されてい ることを特徴とする。
本発明の Dホルディン発現抑制核酸によれば、 プロモ一夕からアンチセンス D ホルディン R N Aが転写され、 このアンチセンス Dホルディン R N Aは、 内在の Dホルディン R N Aと相補的に結合して、 Dホルディン R N Aを基にする Dホル ディンタンパク質の翻訳を阻害することができる。
また、本発明の Dホルディン発現抑制核酸は、上記 Dホルディンコード配列が、 ( 1 )配列番号 1に記載の塩基配列、 （ 2 )配列番号 2に記載の塩基配列、 （ 3 ) 配列番号 1に記載の塩基配列において置換、 欠失、 付加、 挿入のうち少なくとも 一つを有し、 前記ォォムギの内在 Dホルディン R NAと相補し得る R N Aをコ一 ドした塩基配列、又は、 （ 4 )配列番号 2に記載の塩基配列において置換、欠失、 付加、 挿入のうち少なくとも一つを有し、 前記ォォムギの内在 Dホルディン R N Aと相補し得る R NAをコードした塩基配列、 のいずれかであることを特徴とす る。
これら塩基配列によれば、 これらが発現することにより内在の Dホルディン R N Aと相補的に結合し、 Dホルディンタンパク質の生成を抑制することができる。 また、 本発明は、 上記 Dホルディン発現抑制核酸を含むベクターに関する。 このように発現抑制核酸をベクターにつなぐことにより、 発現カセットを安定 に保持することができ、 また、 発現カセットの増幅生成を自在に行うことが可能
となる。
本発明は、 前記 Dホルディン発現抑制核酸の近傍に選択可能なマーカーを発現 し得る選択マーカー発現カセヅ卜が備えられていることを特徴とする。
上記発明によれば、 選択マーカ一発現カセットを備えることにより、 上記 Dホ ルディン発現抑制核酸が導入された株を上記選択マーカーを手がかりに選抜する ことが可能となり、 Dホルディンの発現が抑制されている株、 すなわち、 ゲル夕 ンパク質低減株を迅速に識別することが可能となる。
本発明のゲルタンパク質低減ォォムギ作出キットは、 上記 Dホルディン発現抑 制核酸若しくは上記ベクターを含み、 前記 Dホルディン発現抑制核酸又は前記べ クタ一をォォムギに導入し、 ォォムギのゲルタンパク質を低減させることを特徴 とする。
本発明によれば、 Dホルディン発現抑制核酸若しくは上記ベクターが含まれて いるため、 これらをォォムギに導入して形質転換をするだけで簡便にゲルタンパ ク質が低減されたォォムギを得ることが可能となる。
本発明は、 上記のいずれかのゲルタンパク質低減ォォムギの作出方法又は請求 項 8〜 9のいずれかに記載のゲル夕ンパク質低減ォォムギの作出キットにより作 出されたォォムギをも含む。
本発明のォォムギによれば、 ホルディンの中でも微量と言える Dホルディン夕 ンパク質量のみを低減し、 これによつてゲル夕ンパク質量の低減が図られている ため、 ゲルタンパク質量と関連性があるとされる麦汁濾過性や麦芽エキス収量の 向上が望める。
図面の簡単な説明
図 1は、 本実施例 1で用いた Dホルディン発現抑制ベクターの構成を示す図で ある。
図 2は、 本実施例 1で用いた Dホルディン発現抑制ベクターの構築方法を示す 図である。
図 3は、 本実施例 2の形質転換ォォムギのサザンブロッテイングによる導入遺 伝子確認の結果を示す図である。
図 4は、本実施例 3の形質転換ォォムギ種子のホルディン画分の SDSポリァクリ ルアミド電気泳動による解析を示す図である。
図 5 A、 図 5 Bは、 本実施例 4の形質転換ォォムギ種子のゲルタンパク質定量 の結果を示す図である。
図 6は、 本実施例 5の形質転換ォォムギ種子のゲル夕ンパク質の組成変化を示 す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の好適な実施の形態を説明する。
1 . Dホルディン遺伝子の発現抑制法
ォォムギの Dホルディンの発現の抑制は、 Dホルディンタンパク質が、 染色体 遺伝子からの R N Aへの転写、 R N Aからのタンパク質への翻訳という過程を経 て行われることから、 これらいずれかの過程を抑制することにより実行すること ができる。 '
例えば、 Dホルディンタンパク質の発現を抑制するための方法としては、 アン チセンス法、 co-supression法，リボザィム法等が挙げられる。 また、 Dホルディ ン夕ンパク質の生成過程を阻害する方法のみならず、 この Dホルディン夕ンパク 質の生成の基礎となる Dホルディン遺伝子領域を改変することにより、 その発現 を抑制してもよい。 このような発現抑制方法としては、 例えば、 遺伝子夕一ゲッ ティング法を採用することができる。
Dホルディンの発現を抑制することが目的であるため、 このように Dホルディ ンタンパク質の発現を抑制し得るものであれば、 上記のいかなる方法を採用して もよいが、 確実性が高く且つ特異性の高い方法としてはアンチセンス法を好適に 利用することができる。
2 . Dホルディン遺伝子の発現抑制用核酸の作成
Dホルディンの発現を抑制するための核酸は、採用する発現抑制方法によって、 その構成が異なる。
( 1 ) アンチセンス法
アンチセンス法は、 目的となる Dホルディン mR N Aにアンチセンス R N Aを 特異的に結合させ、 これにより Dホルディン mR N Aからのタンパク質への翻訳 を阻害する。 従って、 アンチセンス法を採用した場合には、 発現抑制核酸として アンチセンス Dホルディン R N Aを用いることができ、 このアンチセンス R N A をォォムギに直接供給することにより Dホルディン夕ンパク質の発現を抑制する ことができる。
また、 この発現抑制核酸としては、 好ましくは、 アンチセンス R N Aを発現す る発現カセットを採用することができる。 この発現カセットを用いて、 ォォムギ を形質転換させることにより、 形質転換ォォムギにおいて安定にアンチセンス R N Aを供給することができ、 また、 この形質転換体から得られた次世代種子群等 にこの性質を遺伝させることもできる。
上記アンチセンス Dホルディン発現カセットは、 次のように構成することがで きる。 ォォムギ登熟中胚乳組織で発現するプロモーターの下流に作動可能に、 ォ ォムギ Dホルディン遺伝子を逆向きに連結し、さらにその下流に同様にォォムギ登 熟中胚乳組織で機能する転写終結因子を連結することにより作成することができ る。
ここで、 「ォォムギ Dホルディン遺伝子」 は、 アンチセンス R N Aを生成し得 るようにプロモー夕の下流に逆向きに連結されている。 この発現カセッ卜に導入 されている 「ォォムギ Dホルディン遺伝子」 は、 Dホルディン遺伝子の全領域を 有している必要はなく、 内在の Dホルディン mR N Aからの翻訳を阻害し得る長 さを有していれば、 Dホルディン遺伝子の一部配列でもよい。
また逆に、 カセット内の「ォォムギ Dホルディン遺伝子」は、 同様に内在の Dホ ルディン mR N Aに基づく翻訳を阻害し得るものであれば、 内在の Dホルディン
mR N Aよりも長くてもよく、 また、任意の DNA断片が付加されたものであっても よい。
上記ォォムギ Dホルディン遺伝子として、 具体的には配列番号 1又は 2に示す 配列を好適に用いることができるが、 これら配列と実質的に同一の配列をも用い ることができる。 この実質的同一な配列とは、 上記配列に置換、 欠失、 付加、 揷 入のうち少なくとも一つを有し、 上記内在 Dホルディン遺伝子の発現を抑制し得 る配列等である。
また、 発現カセット内の導入遺伝子は、 「ォォムギ Dホルディン遺伝子」 に限 られず、 Dホルディン遺伝子と相同性が高い遺伝子をも用いることができる。 た とえば、 コムギ高分子グルテニンサブユニット遺伝子あるいはライムギ高分子セ 力リン遺伝子などでも、 内在の Dホルディン m R N Aと相補的に結合し得るもの であれば用いることができる。
また、 ここで用いる発現カセット内の導入遺伝子は、 ゲノム DNA、 cDNA、 これら の遺伝子を合成、 改変等の操作された遺伝子などであってもよい。
発現カセット内の 「プロモー夕一」 は、 ォォムギ登熟中胚乳組織でプロモー夕 一活性を持つものであれば、特に制限はない。たとえば、 Bホルディンプロモー夕 一、 Cホルディンプロモーター、 ァホルディンプロモー夕一、 ?アミラーゼプロモ —夕一、 コムギ高分子グルテニンサブユニットプロモーター、 ライムギ高分子セ 力リンプロモータ一、 Ca 35Sプロモータ一、ァクチンプロモ一夕一等が挙げられ る。
' また、 転写終結因子としては、 ォォムギ登熟中胚乳組織で機能するものであれ ば、 特に限定は無く、 例えば、 N O S夕一ミネ一夕一等を用いることができる。 ( 2 ) co - supression法
co - supression法における Dホルディン発現抑制核酸は、例えば、ォォムギ登熟 中胚乳組織で発現するプロモーターの下流に正方向に導入遺伝子としてォォムギ Dホルディン遺伝子を連結し、さらにその下流に N0S夕一ミネーターなどの転写終
結因子を連結することで作成できる。
ここで用いる導入遺伝子は、 Dホルディン低減のために必要な DNA断片であり、 例えば、 Dホルディン遺伝子を好適に用いることがでできる。 そして、 この導入 遺伝子は、 プロモー夕一と転写終結因子の間に正方向に揷入することができる。 また、 導入遺伝子は、 mRNAとして発現する全領域を含んでいる必要はなく、 短い 遺伝子断片でもよい。 逆に、 導入遺伝子は mRNAとして発現する全領域より長くて もよく、 任意の DNA断片が付加されたものでもよい。
また、導入遺伝子は、 Dホルディン遺伝子以外にも、 Dホルディン遺伝子と相同 性が高い遺伝子であれば用いることができる。 たとえば、 コムギ高分子グルテ二 ンサブュニット遺伝子あるいはライムギ高分子セカリン遺伝子を用いることがで ぎる。
ここで用いる導入遺伝子は、 ゲノム DNAと、 cDNAと、 これらの遺伝子を合成、 改 変、 操作した遺伝子とを含む。
また、 「プロモ一夕一」 としては、 ォォムギ登熟中胚乳組織でプロモーター活 性を持つものであれば何でもよい。 たとえば Bホルディンプロモーター、 Cホルデ インプロモー夕一、 ァホルディンプロモーター、 ?アミラーゼプロモータ一、 コ ムギ高分子グルテニンサブュニットプロモーター、 ライムギ高分子セカリンプロ モ一夕一、 CaMV35Sプロモ一夕一、 ァクチンプロモーター等が挙げられる。
( 3 ) リボザィム法
リボザィム法は、 リボザィム （R N A酵素） により Dホルディン m R N Aを分 解して、 Dホルディンの発現を抑制する方法である。 従って、 この方法に用いる Dホルディン遺伝子発現抑制核酸は、発現している!)ホルディン mRNAを分解できる ように設計されたリボザィムをコ一ドした遺伝子を作成し、 この遺伝子を上記の ようにプロモーターと転写終結因子との間に正方向に連結することによって構成 することができる。
( 4 ) 上記において述べた Dホルディン発現抑制用核酸の構築には、 制限酵素処
理、 DNA連結処理、大腸菌の形質転換など遺伝子クローニングに関わる操作が必要 であるが、 これらは慣用技術を用いて実行される。 たとえば、 Molecular Cloning (Sambrook, Fritsch , aniatis . Cold Springharbor Laboratory)を参考とする ' ことができる。
本項記載の特定遺伝子発現抑制用カセットは直鎖状のままで植物の染色体に導 入するか、 後述のように任意のプラスミ ドに組み込んで特定遺伝子発現抑制遺伝 子発現べクタ一として使用することができる。
3 . 特定遺伝子発現抑制用べクタ一の作成
上記発現抑制核酸は、 核酸断片として直接用いることもできるが、 ベクターに 挿入し、 発現抑制べクタ一として用いることができる。 発現抑制用べクタ一は、 上記発現抑制用核酸を任意のプラスミ ドに挿入して作成することができる。また、 任意のプラスミ ドに、 プロモーター、 構造遺伝子、 転写終結因子を順次連結させ ることにより、 上記発現抑制用核酸とともに発現抑制ベクターを同時に作成する こともできる。
ここで用いることができるプラスミ ドとしては、 例えばプラスミ ド ρΒΙΙΟΙなど 市販のものなどのいかなるものを用いてもよいが、 目的に応じて選択することが 好ましい。 例えば、 ベクタ一を大量に回収したいときなどでは、 コピー数の多い プラスミ ドを選択することが望ましい。 さらに、 前記プラスミ ドには、 前記発現 ベクターを生物等に導入する際の指標となる薬剤 （ネオマイシンなど） 又は栄養 成分 （例えば、 アミノ酸要求性など） などに基づく選択マーカーを備えることが できる。 この選択マ一力一を備えることにより、 選択マーカ一を指標として上記 発現べク夕一が導入された植物を選択することできる。
以上に述べた Dホルディン発現抑制ベクターを構築するには、 制限酵素処理、 DNA連結処理、大腸菌の形質転換など遺伝子クローニングに関わる操作が必要であ るが、 これらは慣用技術を用いて実行することができる。 この場合、 たとえば、 Molecular Cloning ( Sambrook, Fritsch ， Maniatis, Cold Springharbor
Laborator )を参考とすることができる。
4 . 発現抑制核酸またはこれを含む発現抑制ベクターの植物への導入
発現抑制核酸またはこれを含む発現抑制べクターを導入する細胞としては、 再 分化能を有する植物細胞が好ましく、 このような細胞としては、 例えば、 未熟胚 由来細胞、 葯由来細胞が挙げられる。
核酸の導入の方法としては、 公知の方法を用いることができる。 具体的には、 ポリエチレングリコ一ル法のほかに、 エレクト口ポレーシヨン法、 パーティクル ガン法、 ァグロパクテリゥム法などが挙げられる。
5 . 形質転換植物
前記のように外来 DNAとして発現抑制核酸または発現抑制用べク夕一が導入さ れた植物は形質転換植物として形質転換以前の性質とは異なり、 Dホルディンが生 成されないか、 あるいは生成量が低減された性質を備えた新しい品種あるいは系 統を形成する。
また、 上記発現抑制方法にて作成した形質転換植物を他の品種や系統と交配さ せることによつても同様の性質、 Dホルディンが低減等されたという性質を持つ 植物を得ることができるが、 これらも本質的に発現抑制法にて作成した形質転換 植物に該当する。
6 . ゲルタンパク質の定量と定性
形質転換ォォムギに実った種子からゲルタンパク質を抽出し、 定量する方法は 公知の方法で行うことができる。 たとえば、 Smith and Lister (Smith and Lister ( 1983) , Journal of Cereal Science 1 :229 -239) あるいは Skerritt and Janes (Skerritt and Janes ( 1992), Journal of Cereal Science 16 :219 -235) の方法 を用いることができる。得られたゲルタンパク質の組成を調べるには SDSポリアク リルアミド電気泳動が有効であるが、 高速液体クロマトグラフィーを用いても可 能である。 B、 C、 D各ホルディンの同定は、 分子量から公知の情報を基に行うこと ができる。たとえば、 Shewry (She wry ( 1993), Barley： Chemistry and Technology.
ppl64： American Association of Cereal Chemists ) は参考となる。
E実施例 3
以下に、 本発明を実施例により詳しく説明するが、 本発明はこれらに限定され るものではない。
[実施例 1] Dホルディン発現抑制ベクター作製
Dホルディン mRNAに対するアンチセンス RN Aを発現する発現抑制べクタ 一の構成を図 1に示す。
Dホルディン発現抑制ベクターには、 図 1に示すように Dホルディン発現抑制 核酸として、 Dホルディン mRNAに対するアンチセンス RNAを発現するアン チセンス発現カセット 10が備えられている。 このアンチセンス発現カセット 1 0には、 Dホルディンプロモーター （Dホルディン P) 14 (配列番号 3) の下 流に Dホルディン cDNA 16 (配列番号 1又は 2) が逆向き、 すなわち 3'→ 5 ' 方向に接続されている。 さらに、 この逆向き Dホルディン cDNA 16の下 流には、 1^〇3夕一ミネ一夕一18が接続されている。
また、 Dホルディン発現抑制べクタ一には、 前記アンチセンス発現カセット 1
0と上流同士が向き合う形 （head to head) で選択マーカ一発現カセット 12が 備えられ、 この選択マーカー発現カセット 12には、 arfプロモ一夕一 20の 下流にネオマイシンホスホトランスフェラ一ゼ （NPT I I) 遺伝子 22が接続 され、 さらに、 その下流に NO S夕一ミネ一夕一 24が接続されている。
この Dホルディンべクタ一の構築を、 図 2に示す。
Dホルディンプロモーター 14である DPP3プロモーターを担持したベクタ一を 準備し、このべクタ一のマルチクロ一ニングサイ卜の Hindlll部位を Nhel部位変え た DPP3Nhe2ベクタ一を調製した。 この DPP3Nhe2ベクタ一を制限酵素 B a mH Iと E c oR Iとを用いて消化し、 ここに転写終結因子として pBI221 (Clonetec社製） 由来の NO S夕一ミネ一夕一 18を含む BamHI— E coRIフラグメントを 挿入し、 ライゲ一シヨンにより接続して、 DPP 3Nhe Tベクタ一を得た （S
01) o
次いで、この DPP 3 Nhe Tベクタ一を制限酵素 B s t X 1を用いて消化し、 末端を平滑化して再接続して、 DPP3NheTBXDベクタ一を得た（S 02)。 ここで得 られた DPP3NheTBXDベクタ一は、 Dホルディンプロモー夕一と NOS夕一ミネ一夕一の 間に PmaCI部位と Sacl部位を有する。
次に、上記 DPP3NheTBXDベクタ一を S a c Iで消ィ匕し、末端を平滑化したものを 調製した （S O 3) 。 一方、 Dホルディン cDNA 16を担持する pDH4又は pDH6 を E c o R Iで消化し、 Dホルディン cDNA ( p D H 4由来：配列番号 1、 pDH6由来： 配列番号 2)の全領域をふくむ EcoRI断片を平滑末端化した断片を調整した（S 0 4)。 これら両断片を連結し、 Dホルディン cDNAl 6の方向はプロモータ一 14に 対して逆向きのものを選抜して、 それそれ DPADH4S、 DPADH6Sとした （S O 5) 。 上記の通り、 アンチセンス発現カセット 10が形成された DPADH4S、 DPADH6Sベ クタ一に選択マーカ一発現カセット 12を導入するために、 pSBG121NHから選択マ —力一発現カセットの調整を行った。
この pSBG121NHには、 arfプロモーター （配列番号 4) の下流にネオマイシンホ スホトランスフエラーセ遺伝子 (neomycin phosphotransierase, Pharmacia社製、 以下 nptll遺伝子） が連結され、 さらにその下流に N0S夕一ミネ一夕一が連結され ている。 そのため、 この PSBG121NHを Nhelで消化し、 ΝΡΤΠ遺伝子 22を含む発現 カセットを回収し （S 06) 、 この断片を上記 DPADH4Sならびに DPADH6Sの Nhel部 位に導入した。 導入後、 選択マ一カー発現カセット 12とアンチセンス発現カセ ット 10とが head-to-headに連結したものを選抜し、これらを DPADH4NPTならびに DPADH6NPTとした （S 07) 。
[実施例 2] ォォムギの形質転換
1. ォォムギの形質転換
ォォムギの形質転換は、 ォォムギ品種 Igriの未熟胚由来の細胞系から得たプロ トプラストにポリエチレングリコール法を用いて Dホルディン発現抑制べクタ一
(DPADH4NPTあるいは DPADH6NPT) を導入することにより行った。
詳細には、 上記実施例 1で作成した 2種のベクターを、 それそれキアゲンカラ ム（Quiagen社製）を用いて精製後、； g/〃1の濃度になるように TE緩衝液（10 mM トリス HC1 (pH 7.5)、 I mM EDTA) に懸濁した。一方、 プロトプラストは、 品種 Igri の液体懸濁培養細胞系より酵素処理後、 精製することで調製された。
このプロ トプラス トへのベクタ一導入は、 基本的に Funatsuki et al. ( Funatsuki et al . ( 1995) Theoritical and Applied Genetics 91 :707 -712) の方法に従って行った。すなわち、得られたプロトプラストを 50〃gの上記べクタ ―、 lOO mMの CaC12、 0.6 Mのソルビトール、 0.1% (w/v) のMESを含みpHを5.7に調 整した 250〃1の Ca-S (カルシウムソルビトール液） に懸濁した。
この懸濁液に、 PEG (ポリエチレングリコール、 分子量 1540) を 40% (w/v)含む Ca-S PEG (pH 7.0)を 600〃1滴下し、 数回の振とう後、 5 - 10分静置した。 10 ml の LW液を加え希釈した後、 遠心処理しプロトプラストを回収した。 このプロトプ ラストを 1 mlの 1.8% Sea Plaque Agarose (FMC社製）、 0.4 Mマルトースを含む改 変 L1培地 (Lazzeri et al . 1991 ) に懸濁し、 ナース細胞とともに培養した。
2 . ベクター導入コロニーの選抜及び植物への生育
プロトプラス卜の培養を開始して 2 - 3週間経過後に、 液体培地及びナース細胞 を除去した。 更に、 一次選抜として N P T I I遺伝子を有するコロニーのみを選 抜するために、 得られたコロニーを、 G418 (ジエネティシン、 Gibco 社製） を 20 もしくは 25 /g/ml含有させた液体培地にて培養した。
上記 G 4 1 8耐性コロニーを約 14日間振盪培養を行った後、 二次選抜として、 1次選抜と同濃度の G418を含む再分化培地に移して培養を行った。 2次選抜の過程 でカルスゃ胚様体の形成、あるいはシュートの分化をみせたコロニーについては、 それぞれ独立したプロトプラストに由来する形質転換細胞系として、 G418を含ま ない改変 L3培地に移植し、 植物体の再分化を促した。 緑色シュートが 1 - 1 cmに なつた時点でシャーレを強光下に移動し培養後、 ホルモン非添加の培地に移植し
発根を促進、 鉢上げを行った。
以上の形質転換実験の結果、 DPADH4NPTの導入を試みた区からは 18系統、 66個体 が得られ、 また、 DPADH6NPTの導入を試みた区からは 12系統、 29個体の再分化植物 が得られた。なお、供試したすべてのォォムギの育成は、 16°C、 16時間日長、 20000 〜30000ルックス照明に制御した人工気象庫内で行った。
3 . 植物中におけるベクタ一の存在の確認
再分化した植物体中に、 導入した Dホルディン発現抑制べクタ一 （DPADH4NPT あるレ、は DPADH6NPT)が存在しているかどうかを、サザンハイブリダィゼ一シヨン 法を用いて確認した。
先ず、再分化植物の葉 l gを準備し、これを液体窒素中で磨砕後、 CTAB法（Murray et al . 1980, Nucleic Acids Res. 8:432 1-4325) にて全 MAを抽出した。 得られ た DNAは、 Hind iで消化後、 ァガロースゲル電気泳動を行い、 アルカリ変性後ナイ ロンメンブレン （ベーリンガー社製） にキヤビラリ一ブロッテイングした。 プロ ーブは、 pDH4のインサートを逆方向に連結し直したベクター、 PDH4R6を Hind i消 化して得られる約 1.7 Kbの断片を鍀型として DIG-high prime (ベーリンガー社製） を用いてラベルしたものを用いた。
サザンハイプリダイゼ一シヨンは、ベーリンガ一社のマニュアルに従い行つた。 ハイプリダイゼーシヨン後のメンプレンの洗浄は、 2 X SSC、 1% SDSで室温下 30 分の洗浄の後、 0.1 X SSC, 0.1 % SDSで 42°C下、 30分の洗浄を 2回繰り返した。 シグナルの検出法はべ一リンガー社のマニュアルに従った。 得られた再分化植 物の各系統についてサザンハイブリダィゼ一シヨンにて導入遺伝子の検出を行つ た結果、 Dホルディン発現抑制ベクターの導入を試みた区から得られた再分化植 物のうち 12系統、 48個体、 DPADH6NPTの導入を試みた区から得られた再分化植物の うち 10系統、 23個体から導入遺伝子が検出された。
ただし、 ここでは、 各系統の代表で導入遺伝子が検出された場合は、 その系統 に属する個体は全て導入遺伝子を持っているものとして計算した。 図 3に、 サザ
ンハイブリダイゼ一シヨンによる導入遺伝子の検出例を示す。 これから明らかな ように、対照として用いた遺伝子を導入していない再分化植物から得た DNAでは内 在の Dホルディン遺伝子のシグナルが検出されるのみであるが （図 3レーン 8) 、 遺伝子導入した再分化植物からは内在遺伝子以外のシグナル、 すなわち導入遺伝 子が存在することが確認された （図 3レーン 1〜レーン 7、 レーン 9〜レーン 12) 。
[実施例 3 ] Dホルディン発現抑制ベクターの効果の確認
Dホルディン発現抑制べクタ一の効果の確認は、 以下に示す通り、 形質転換体 の種子中の Dホルディン含量を、 電気泳動のバンド強度から測定することにより 行った。
1 . 種子から蛋白質画分の抽出
上記において Dホルディン発現抑制ベクターが導入されていることが確認され た形質転換体に稔実した種子 （以後 T1種子と呼ぶ） から蛋白質を抽出した。 この 抽出は、上記種子 1粒をハンマーを用いて細かく粉砕し、 USDバッファー（8M尿素、 0. 1 Mジチオスレィトール、 50. 0 mM炭酸ナトリウム） を加え攪拌後、 60°Cで 30分 ィンキュベ トした。そして、 このサンプルを 15000回転、 20分間遠心分離して得 られる透明な画分 （上清部） を採取した。
2 . 蛋白質画分の電気泳動
ここで得られた上清画分を SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分画し、ク マシーブリリアントブルー R250で染色した後、解析した。解析結果を図 4に示す。 なお図 4において黒抜きのひし形の印は Dホルディンのバンドを示している。 図 4は、 その 1例として DPADH6NPTを導入した 90113AT15— 1一 4系統の T1種子 3粒 の USDバッファ一可溶性画分を電気泳動したものである。陰性対照としては、巿販 されている Igriの種子及び遺伝子導入していない再分化植物についた種子を供試 した。
図 4に示したように、 形質転換体のホルディン画分であるレーン 5と 7では、 非形質転換の対照（レーン 2、 3、 4 ) と比較して Dホルディンの他のホルディン
に対する相対含量が、 劇的に減少していることが明らかとなった。
また、 Dホルディン発現抑制ベクターを導入した他の系統においても、 若干の 差はあるものの対照と比較して Dホルディンの相対含量が減少することが明らか となった。 このことから、 本発明で構築した Dホルディン発現抑制べクタ一は、 確かに形質転換したォォムギにおいて特異的に、 すなわち、 他のホルディン含量 をほとんど変化させることなく、Dホルディンを減小させる効果を持つと結論でき る。
なお、 レーン 6では対照との間に差が認められなかったが、 この結果は導入遺 伝子が T 1種子において分離したために起こったためであると説明できる。よって、 この事実は、 Dホルディンの減少が Dホルディン発現抑制べクタ一の導入の結果 として、 起こるという上記結論に矛盾するものではない。
[実施例 4 ] ゲル夕ンパク質の定量
1 . 種子からゲルタンパク質の回収
ゲルタンパク質の定量は、 Skerritt and Janes (Skerritt and Janes (1992), Journal of Cereal Science 16 :219 -235 )を参考に行った。
形質転換体から得られた T1種子 1粒の榖皮を剥ぎハンマーで細かく砕き、あらか じめ重量が測定された遠心チューブに入れ、 Speed Vac Concentrater (Savant社 製）を用いて 30分間乾燥させた後、重量を測り、穀粒の重量を算出した。 このサン プルに 1.5% (w/v) SDSを 3 ml加え、 ボルテックスにて 1時間攪拌した。
攪拌後のサンプルは、 40000 X g、 20°Cで 1時間遠心分離が行われ、 得られた上 清を、 「SDS可溶性画分」 （又は 「SDS画分」 ） とした。
一方、 上記遠心分離における沈殿した画分は、 1.5¾(w/v) S D S /10%(v/v)2- メルカプトエタノール/ 16%(v/v)N，N， -ジメチルホルムアミド（以後、 S D Mと呼 ぶ） を 2ml加え、 よく攪拌後、 45°Cで約 20時間インキュベートした。 このインキュ ペート後のサンプルを 40000 X g、20°Cで 1時間遠心分離し、得られた上清を 0.2%SDS を用いて透析を行った。 この透析は、 2時間を 3回繰り返し、 透析後に体積を測定
した。 なお、 ここで得られた画分が 「ゲルタンパク質画分」 （又は 「gel画分」 ） である。
2 . Dホルディンの減少によるゲルタンパク質の減少
上記 SDS画分および gel画分のタンパク質定量は、 BCA Protein Assay Reagent (Pierce社製） を用い、 ゥシ血清アルブミン （Bovine serum albumin ) を標準夕 ンパク質とした。 なお、 形質転換体のゲルタンパク質定量後、 用いた T1種子で D ホルディンが低減されているかどうかを上記 SDSポリアクリルアミド電気泳動に て調べ、 導入遺伝子が分離した （脱落した） ことによって、 Dホルディンの低減が 観察されなくなつた T1種子のデー夕は、 ここから削除した。
ォォムギ品種 Igriおよび遺伝子導入していない再分化ォォムギ系統
(90213AC1-5A, 90213AC1 -6B, 90213AC1 -4B) を陰性対照として、 Dホルディン発 現抑制べク夕一を導入した形質転換体系統 （90113AT1- 1-2C， 90113AT14-1-3C, 90113AT14-1-5G, 90113AT15 -1-4) の T1種子から得られる gel画分のタンパク量を 調べた。
なお、 各系統について少なくとも 5サンプルを用いて抽出、 定量を行った （n≥
5)。図 5 Aは、 サンプル l gあたりから抽出される gel画分中のゲルタンパク質量 と標準誤差を示した。
図 5 Aに示すグラフから明らかなように、 Dホルディン含量が低下した区（図 5 A : 5、 6、 7、 8) では、 陰性対照と比べて （図 5 A： 1、 2、 3、 4) 、 明らかにゲ ルタンパク質量が低下していた。また、 Dホルディンが減少した全サンプルのゲル タンパク質量の平均は、 陰性対照全サンプルの平均値と比較して有為に低いこと (平均値で約 40%減少） が明らかとなった （有為水準 1 %) 。 以上の結果から、 ゲルタンパク質の減少は、培養変異等によるものではなく、 Dホルディン減少によ つて生じた現象であることを示す。
3 . Dホルディンの減少とゲルタンパク質の減少との関連性の確認
同一個体に実る T1種子において、導入遺伝子の分離の結果として起こる Dホルデ
ィン量減少の有無により、 ゲルタンパク質量がどのように変化するかを調べた。
90113AT15— 1~4系統の同じ個体から得た T1種子 10粒について、ゲルタンパク質 を抽出し、電気泳動によって Dホルディンの減少量を定性的に調べ、 Dホルディン 量が減少した群 （5粒） と、 減少が認められなかった群 （5粒） に分けた。 その 後、 これら 2群の試料を用いて、 この Dホルディン減少の有無とゲルタンパク質量 との関係を調査した。 その結果を図 5 Bに示す。
図 5 Bに示したように、 Dホルディン量が減少した種子群 （5粒） におけるゲル タンパク質量（図 5 B：サンプル 2 ) は、 Dホルディン量の減少が認められなかつ た種子（5粒） のゲルタンパク質量（図 5 B：サンプル 1 ) と比較して有為に低い ことが明らかとなった （有為水準 1 %) 。
これは、 同じ個体に稔実した種子を調べた試験であるので、 個体間に生じる生 育環境の差異は無視できる。 よって、 ゲルタンパク質の減少は、 生育環境の差異 による結果ではなく、 個体の持つ特性、 すなわち、 特異的に Dホルディンタンパ ク質の生成量が低減されているとの特性として生じる現象であることが示された。 以上の結果から、 ゲルタンパク質量の減少は、 Dホルディン発現抑制ベクター を導入し、 Dホルディンタンパク質の生成量を低減させることにより可能になる と結論づけることができる。
[実施例 5 ] ゲルタンパク質の組成変化
Dホルディン発現抑制べクタ一を導入することによって生じるゲルタンパク質 の組成変化について検討した。 90113AT15— 1— 4より抽出した SDS画分 （図 6 ：レ ーン 2、 3、 4、 5 ) および gel画分 （図 6 ：レーン 6、 7、 8、 9 ) をそれそれ SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて解析した。
その結果、 対照 （図 6 ：レーン 2、 3、 5、 6、 7、 9 ) と比較して、 Dホルデ イン含量が減少した T1種子 （図 6 ：レーン 4、 8 ) では、 本来、 gel画分に多量に 抽出される特定のタンパク質 （以下、 「GSタンパク質」 と呼ぶ。 図 6において矢 印で示す） が、 SDS画分に移行していることが明らかとなった。
この結果は、 Dホルディン発現抑制べクタ一を導入することによって起こるゲ ルタンパク質の減少は、 Dホルディンが減少することのみによるのではなく、他の ゲルタンパク質を構成するタンパク質 （少なくとも、 GSタンパク質を含む） も同 時に gel画分から除かれることにより生ずると考えられる。
[実施例 6 ] 導入形質の後代への伝達
上記実施例に記載した導入形質が、後代に伝達されるか検討した。 Dホルディン が減少した T2種子 7粒より、 ゲルタンパク質を抽出、定量した結果、榖粒 あたり 平均 16.9mg ( ± 1.48)のゲルタンパク質が抽出された。このゲルタンパク質量は、 Dホルディンが減少した親の T1種子の場合と、ほぼ同程度の含量であり、ゲルタン パク質減少という形質について、 後代に安定して伝達されることが明らかになつ た。
産業上の利用可能性
本発明により、 麦汁濾過性や麦汁エキス量と関連性が高いとされるゲルタンパ ク質を約 40%減少させたォォムギが、 容易にかつ効率よく作製できることが明ら かとなつた。 本発明を用いれば、 従来、 交配育種法や突然育種法などで必要であ つた時間、 労力の軽減が可能であるうえ、 それらに必要であった育種圃場ゃ放射 線照射装置などを使用しなくとも、 ゲル夕ンパク質低減ォォムギを得ることが可 能である。
Claims
1. ォォムギからのタンパク抽出時にゲル状に凝集し得るゲルタンパク質が低 減されたォォムギを作出する方法であって、
ォォムギの内在 Dホルディンタンパク質の産生を抑制し得る Dホルディン発現 抑制核酸をォォムギに導入し、
前記 Dホルディン発現抑制核酸の導入により前記 Dホルディンタンパク質の産 生が抑制されてゲルタンパク質量が低減されることを特徴とする、 ゲルタンパク 質低減ォォムギの作出方法。
2. 前記 Dホルディン発現抑制核酸が、 ォォムギの内在 Dホルディン RNAと 相補するアンチセンス RN Aを発現し得ることを特徴とする請求項 1に記載のゲ ルタンパク質低減ォォムギの作出方法。
3. 前記 Dホルディン発現抑制核酸が、 前記ォォムギ内で作動するプロモー夕 の下流に、 前記アンチセンス RN Aを生成させ得るように Dホルディンをコード する Dホルディンコード配列が逆向きに連結されていることを特徴とする請求項 2に記載のゲルタンパク質低減ォォムギの作出方法。
4. Dホルディンコード配列が、
( 1 ) 配列番号 1に記載の塩基配列、
(2) 配列番号 2に記載の塩基配列、
(3) 配列番号 1に記載の塩基配列において置換、 欠失、 付加、 挿入のうち少 なくとも一つを有し、 前記ォォムギの内在 Dホルディン RNAと相補し得る RN
Aをコードした塩基配列、 又は
(4) 配列番号 2に記載の塩基配列において置換、 欠失、 付カロ、 挿入のうち少 なくとも一つを有し、 前記ォォムギの内在 Dホルディン RNAと相補し得る RN Aをコードした塩基配列、 のいずれかであることを特徴とする請求項 3に記載の ゲル夕ンパク質低減ォォムギの作出方法。
5 · ォォムギ内で生成される内在 Dホルディン： RNAと相補し得るアンチセン
ス R N Aを生成させる Dホルディン発現抑制核酸であって、
前記ォォムギ内で作動するプロモー夕の下流に、 前記アンチセンス R N Aを生 成させ得るように、 Dホルディンをコードする Dホルディンコード配列が逆向き に連結されていることを特徴とする Dホルディン発現抑制核酸。
6 . Dホルディンコード配列が、
( 1 ) 配列番号 1に記載の塩基配列、
( 2 ) 配列番号 2に記載の塩基配列、
( 3 ) 配列番号 1に記載の塩基配列において置換、 欠失、 付加、 挿入のうち少 なくとも一つを有し、 前記ォォムギの内在 Dホルディン R N Aと相補し得る R N Aをコードした塩基配列、 又は
( 4 ) 配列番号 2に記載の塩基配列において置換、 欠失、 付カロ、 挿入のうち少 なくとも一つを有し、 前記ォォムギの内在 Dホルディン R N Aと相補し得る R N Aをコードした塩基配列、 のレ、ずれかであることを特徴とする請求項 5に記載の Dホルディン発現抑制核酸。
7 . 請求項 5又は 6に記載の Dホルディン発現抑制核酸を含むベクター。
8 . 前記 Dホルディン発現抑制核酸の近傍に選択可能なマーカーを発現し得る 選択マーカ一発現カセットが備えられていることを特徴とする請求項 7に記載の ベクター。
9 . 請求項 5又は 6に記載の Dホルディン発現抑制核酸若しくは請求項 7又は 8に記載のベクタ一を含み、
前記 Dホルディン発現抑制核酸又は前記ベクターをォォムギに導入し、 ォォム ギのゲルタンパク質を低減させることを特徴とする、 ゲルタンパク質低減ォォム ギ作出キット。
1 0 . 請求項 1〜4のいずれかに記載のゲルタンパク質低減ォォムギの作出方 法又は請求項 8〜 9のいずれかに記載のゲルタンパク質低減ォォムギの作出キッ トにより作出されたォォムギ。
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