WO1999043330A1 - Inhibiteurs de migration de cellules de langerhans - Google Patents

Inhibiteurs de migration de cellules de langerhans Download PDF

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WO1999043330A1
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langerhans cell
vitamin
inflammation
langerhans
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Inventor
Shigeru Kinoshita
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/59—Compounds containing 9, 10- seco- cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems
    • A61K31/593—9,10-Secocholestane derivatives, e.g. cholecalciferol, i.e. vitamin D3
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Definitions

  • the present invention relates to a Langerhans cell migration inhibitor, and more specifically, to a Langerhans cell migration inhibitor containing activated biminmin D as an active ingredient.
  • Langerhans cells take in foreign antigens into the skin, migrate to the lymphatic vessels, become bale cells, partially degrade the antigens inside the cells, and then migrate to nearby lymphoid organs to give the T cells this antigen. , The T cells are differentiated into cells that cause contact dermatitis. It is known that Langerhans cells infiltrate into the cornea from the limbus to the central part to produce various cytokines and cause immunoreactive inflammation.
  • compositions for the topical treatment of dermatitis comprising:
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-530392 discloses a method for promoting the treatment of wounds, which comprises administering a vitamin D compound to a patient.
  • WO 926,079 discloses an ophthalmic composition for treating inflammation in the anterior segment of the eye comprising active vitamin D as an active ingredient.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition having fewer side effects, which can prevent inflammation due to an immune reaction of the skin or cornea and can treat the inflammation after it has occurred. Disclosure of the invention
  • the present invention provides a Langerhans cell migration inhibitor comprising active vitamin D as an active ingredient.
  • the active vitamin D are preferably activated vitamin D 3, a bi evening Mi emissions D 3 derivative or bi evening Mi emissions D 3 analogs, more preferably activated vitamin D 3, and most preferably Is calcitriol or 22-oxacalcitriol.
  • the Langerhans cell migration inhibitor of the present invention can be preferably an eye drop, and can be used for prevention and treatment of eye inflammation, particularly keratoconjunctivitis, and prevention of corneal fritten or corneal infiltration.
  • FIG. 1 is a graph showing the score of neovascularization in the cornea of the mouse of Test Example 1.
  • the vertical axis represents the score, and the horizontal axis represents the number of days after placing the suture.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of calcitriol (1 strain, 25 (OH) 2 D 3 ) on human corneal epithelial cell proliferation in Test Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of calcitriol on IL-11 ⁇ production in Test Example 2.
  • FIG. 4 is a graph showing the effect of calcitriol on IL-1 / 3 production in Test Example 2.
  • FIG. 5 is a graph showing the effect of calcitriol on IL-8 production in Test Example 2.
  • inflammation to which the Langerhans cell migration inhibitor of the present invention is to be applied examples include inflammation of the corneal conjunctival surface such as allergic monokeratoconjunctivitis, spring catarrh, and diffuse keratoconjunctivitis, and corneal degeneration, corneal infiltration and corneal fritten. And inflammation of the corneal stroma. In particular, it is preferably applied to allergic keratoconjunctivitis.
  • Active vitamin D which is an active ingredient of the composition of the present invention, includes a cholecalcifni oral derivative, a cholecalcifrol analog, an ergocalcifrol derivative, an ergocalcifrol analog, and a hydrophilic group in the side chain. And a hydrophilic activated biminmin D analog.
  • active vitamin D may be natural or synthetic.
  • active vitamin D examples include calcitriol (1 ⁇ , 25-dihydroxyvitamin D 3 (1,25 ( ⁇ H) 2 D 3 )), 1 ⁇ , 2 4 — dihydric Dorokishibi evening Mi emissions D 3, alfacalcidol (1 alpha - human Dorokishibitami emissions D 3), Karushifue Doll (2 5 - arsenide Dorokishibita Mi emissions D 3), 1 ⁇ , 2 5, 2 6 - Application Benefits arsenide Dorokishibita Mi D 3 , 1 S, 25 — Dihydroxy vitamine D 3 , 24-Homo 1 ⁇ , 25 — Dihydroxy vititamin D 3 , 26 — Homo 1, 25 _ Dihydroxitamin down D 3, OCT (2 2- O Kisaka Rushito triol), and Karushipo trio Ichiru.
  • Preferred active vitamin D is vitamin D 3, a vitamin D 3 derivatives and bicycloalkyl evening Mi emissions D 3 analogs. Specific examples include calcitriol and 22-oxa
  • the Langerhans cell migration inhibitor of the present invention is generally used in the form of a pharmaceutical composition containing active vitamin D together with a carrier on a formulation, and is formulated for topical administration as a solution or an ointment. . It is preferably formulated as a coating for the ophthalmic composition, and particularly eye drops are preferred.
  • carriers used in these formulations include water, ethanol, ethylene glycol, propylene glycol, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, acacia, calcium phosphate, alginate, tragacanth, gelatin, methylcellulose, talc.
  • Magnesium stearate Including, but not limited to, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, collagen, fats and oils, or mineral oils.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can contain, in addition to these carriers, other additives such as a stabilizer, a preservative, a tonicity agent, a pH adjusting agent, an antioxidant, and a coloring agent.
  • Stabilizers include, but are not limited to, sodium bisulfite, glycerin, sodium edetate, sodium citrate, and butylhydroxydissol.
  • Preservatives include, but are not limited to, benzalkonium chloride.
  • Isotonic agents include, but are not limited to, sodium chloride, D-mannitol, glucose, and glycerin.
  • pH adjusters include, but are not limited to, sodium phosphate, phosphates such as sodium hydrogen phosphate, sodium hydroxide, and hydrochloric acid.
  • Antioxidants include, but are not limited to, vitamin C.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by a method well known in the art, and may take any form of an immediate-release preparation, a sustained-release preparation, and a delayed-release preparation.
  • concentration of active vitamin D in the compositions of the present invention will vary depending on the form of the formulation, but will generally range from about 0.0 lng / ml to about l // g / ml, preferably from about 1 to about 10 Ong Zm1.
  • calcitriol or 22-oxacalcitriol is dissolved in water or ethanol as active vitamin D, and the final concentration of active vitamin D is about 1 to about 100 ng / m 2.
  • the thus-prepared eye drops are typically applied 1 to 4 times a day, 1 to several drops per time depending on the symptoms, but the number is not limited to this.
  • composition of the present invention When the composition of the present invention is applied to a site where inflammation is to be prevented, the migration of Langerhans cells, which is thought to mediate the generation of inflammation due to an immune reaction, is inhibited. As a result, the occurrence of inflammation at that site is significantly prevented. be able to. Also, if inflammation is already occurring, it can be treated. In particular, when the inflamed area is the cornea, it is possible to treat inflammation without reducing the transparency of the cornea. Wear.
  • Active vitamin D 3 stock solution (1 alpha-arsenide Dorokishibitami emissions D 3 content, 5 0 mg / m 1) was diluted to 1 0 0 0 times with ethanol, which further 1 0 0 ophthalmic physiological buffer By diluting 2-fold, an ophthalmic composition having a concentration of 1 ⁇ -hydroxyvitamine D 3 of 0.5 ⁇ g / ml was prepared.
  • Calcitriol was diluted 100-fold with ethanol, and further diluted 100-fold with an ophthalmic oil-based base consisting of purified sesame oil to give an ophthalmic solution with a calcitriol concentration of 0.5 ⁇ g / m
  • ophthalmic oil-based base consisting of purified sesame oil
  • vitamin C L-ascorbic acid monophosphate
  • active vitamin D 3 is c test example 1 mixed solution to obtain an ophthalmic composition comprising the 0. 5 gZm 1
  • a group is divided into 6 groups A to F, each group consisting of 5 animals.
  • a group is a non-instilled group
  • B group is a steroid eye drop group (St)
  • C to E groups are calcitrio at the above three concentrations.
  • the F group and the F group were grouped with only the base. Instillation was started three times a day from the day after threading. The mice were sacrificed 14 days after threading, the eyes were enucleated, and the average value of the density of Langerhans cells in the central part of the corneal epithelium was determined for each group by immunostaining. Table 1 shows the results. Langerhans cell density in the central corneal epithelium
  • mice were observed with a slit lamp microscope every other day to evaluate angiogenesis.
  • the evaluation was performed by dividing the mouse cornea into four quadrants and scoring the length of new blood vessels in each quadrant according to the following criteria. The total score in the four quadrants was used as the neovascular score for one cornea (0 to 12 points). ) The average value was given for each group.
  • Score 2 New blood vessels that reach the central cornea (within a radius of 1 mm from the center) but do not reach the center;
  • Score 3 New blood vessels that reach the center of the cornea.
  • Karshi Bok Rio Ichiru (1 shed, 2 5 (OH) 2 D 3) in order to explore the mechanism of action of inhibitory effect of migration or angiogenesis Rangel Hans cells in the corneal epithelium by, 1 ⁇ , 2 5 (OH ) 2 were cultured D 3 of human corneal epithelial cells in the presence and measure the number of cells after culturing was further measured production of cytokines in the culture supernatant.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • F-12 F-12 (1/1) containing 1 gentamicin at 37 ° C, 95% humidity, and 5% carbon dioxide. Cultured. The medium was changed twice a week.
  • Cytokines were determined for interleukin-la (IL-1 ⁇ ), interleukin-13 (IL-1 / 3) and interleukin-8 (IL-8) ⁇ LI SA kit (R & D System Corp.). Each site chi The quantitation limits for IL-1 ⁇ were 0.5 pg / m1, IL-1 / Q was 1 pg / m1, and IL-8 was 10 pgZm1. Colorimetry was performed at 450 nm using EL 308 (Bio-tek Instrument, incoski). The measurement results of the three experiments were totaled, and statistical processing was performed using an unsupported t-test.
  • IL-1 ⁇ interleukin-la
  • IL-1 / 3 interleukin-13
  • IL-8 interleukin-8

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Description

明 細 書 ランゲルハンス細胞遊走阻害剤 技術分野
本発明は、 ランゲルハンス細胞遊走阻害剤に関し、 より特定的には、 活性型ビ 夕ミ ン Dを有効成分とするランゲルハンス細胞遊走阻害剤に関する。 背景技術
ランゲルハンス細胞は、 皮膚への外来抗原を取り込んで、 リ ンパ管に移動し、 ベール細胞となってその抗原を細胞内で部分分解し、 次いで近くのリンパ系器官 に移動して T細胞にこの抗原を提示することにより、 その T細胞を接触皮膚炎を 引き起こす細胞へと分化させる。 また、 ランゲルハンス細胞は、 角膜において、 角膜輪部から中央部へ侵入して種々のサイ トカインを産生し、 免疫反応性の炎症 を引き起こすことが知られている。
このように、 ランゲルハンス細胞は、 皮膚及び角膜における免疫反応による炎 症の発生段階に深く関与する細胞であるから、 外来抗原の侵入部位においてその 細胞数を少なく維持すれば、 周辺における炎症の予防が可能になると考えられる。 とりわけ、 角膜における炎症は、 角膜の透明性を低下させて患者の視力を低下さ せるので、 その予防は特に重要である。
現在、 皮膚や角膜の免疫反応を抑制するには、 ステロイ ドゃシクロスポリン A 等の強力な薬剤が使用されているが、 これら薬剤は種々の副作用を有するので、 炎症が発生していない段階では使用し難い。 従って、 炎症が発生する前でも安心 して使用できる、 より副作用が少ない薬剤の開発が望まれている。
米国特許第 4， 6 1 0 , 4 7 8号は、 活性型ビタミ ン Dである 1— α—ヒ ドロキ シルコレカルシフエロ一ル又は 1 一ひ， 2 5—ジヒ ドロキシルコレカルシフエロ ールを含有する、 皮膚炎の局所処置のための組成物を開示している。
特表平 5— 5 0 3 9 2 2 (W O 9 1 / 0 5 5 3 7 ) は、 ビタミン D化合物を患 者に投与することからなる、 創傷の治療を促進する方法を開示している。 WO 9 6 2 9 0 7 9は、 活性型ビタミ ン Dを有効成分とする、 眼球前眼部内 の炎症を治療するための眼科用組成物を開示している。
これら文献は、 ステロイ ド等に代えて活性型ビタミ ン Dを用いることにより、 副作用の少ない抗炎症剤及び治療方法を提供するものであるが、 いずれも既に発 生した炎症の治療に向けられており、 免疫反応性の炎症の発生段階に深く関係す るランゲルハンス細胞の遊走を阻害することを示唆していない。
本発明は、 皮膚や角膜の免疫反応による炎症を予防し、 並びに炎症が発生した 後にはそれを治療することもできる、 より副作用の少ない医薬組成物を提供する ことを目的とする。 発明の開示
本発明は、 活性型ビタミ ン Dを有効成分とするランゲルハンス細胞遊走阻害剤 を提供する。 この活性型ビタミ ン Dは、 好ましくは活性型ビタミン D 3、 ビ夕ミ ン D 3誘導体又はビ夕ミ ン D 3類似体であり、 より好ましくは活性型ビタミ ン D 3 であり、 そして最も好ましくはカルシトリオール又は 2 2—ォキサカルシトリオ ールである。
本発明のランゲルハンス細胞遊走阻害剤は、 好ましくは点眼剤であることがで き、 眼の炎症、 特に角結膜炎の予防及び治療並び角膜フリクテン又は角膜浸潤の 予防に用いることができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 試験例 1のマウスの角膜における新生血管のスコアを表わすグラフで ある。 縦軸がスコアを表わし、 横軸は縫合留置後の日数を表わす。
図 2は、 試験例 2におけるカルシトリオ一ル （1 ひ， 2 5 ( O H) 2 D 3) のヒト 角膜上皮細胞増殖への作用を示すグラフである。
図 3は、 試験例 2におけるカルシトリオールの I L一 1 α産生への作用を示す グラフである。
図 4は、 試験例 2におけるカルシトリオ一ルの I L— 1 /3産生への作用を示す グラフである。 図 5は、 試験例 2におけるカルシトリオールの I L— 8産生への作用を示すグ フフである。 発明を実施するための好ましい形態
本発明のランゲルハンス細胞遊走阻害剤を適用すべき炎症としては、 アレルギ 一性角結膜炎、 春季カタル、 及びび漫性角結膜炎などの角結膜表層の炎症、 並び に角膜変性症、 角膜浸潤及び角膜フリクテンなどの角膜実質層に及ぶ炎症が挙げ られる。 特に、 アレルギー性角結膜炎に適用するのが好ましい。
本発明の組成物の有効成分である活性型ビタミン Dには、 コレカルシフニ口一 ル誘導体、 コレカルシフヱロール類似体、 ェルゴカルシフヱロール誘導体、 エル ゴカルシフ ロール類似体、 及び側鎖に親水基を設けた親水性の活性型ビ夕ミン D類似体等が含まれる。 これら活性型ビタミン Dは、 天然のものでも合成された ものであってもよい。 具体的な活性型ビタミ ン Dの例には、 カルシトリオ一ル ( 1 α， 2 5—ジヒ ドロキシビタ ミ ン D 3 ( 1 ， 2 5 (〇 H ) 2 D 3 ) ) 、 1 α , 2 4 —ジヒ ドロキシビ夕 ミ ン D 3、 アルファカルシ ドール （ 1 α —ヒ ドロキシビタミ ン D 3 ) 、 カルシフエ ドール （2 5 —ヒ ドロキシビタ ミ ン D 3) 、 1 α , 2 5 , 2 6 — ト リ ヒ ドロキシビタ ミ ン D 3、 1 S , 2 5 —ジヒ ドロキシビタミ ン D 3、 2 4 - ホモ一 1 α， 2 5 —ジヒ ドロキシビタ ミ ン D 3、 2 6 —ホモ一 1 ， 2 5 _ジヒ ド 口キシビ夕ミ ン D 3、 O C T ( 2 2—ォキサカルシトリオール） 、 及びカルシポ トリオ一ルが含まれる。 好ましい活性型ビタミ ン Dは、 ビタミ ン D 3、 ビタミ ン D 3誘導体及びビ夕ミ ン D 3類似体である。 具体的には、 カルシトリオール及び 2 2 一ォキサカルシトリオールが挙げられる。
本発明のランゲルハンス細胞遊走阻害剤は、 一般に、 活性型ビタミ ン Dを製剤 上の担体と共に含有する医薬組成物の形態で用いられ、 溶液剤又は軟膏剤などと して局所投与用に製剤される。 眼科用組成物の塗布剤として製剤されるのが好ま しく、 特に点眼剤が好ましい。 これら製剤に用いられる担体の例には、 水、 エタ ノール、 エチレングリコール、 プロピレングリコール、 ポリ ビニルアルコール、 ポリ ビニルピロリ ドン、 アラビアガム、 リ ン酸カルシウム、 アルギネー ト、 トラ ガカン トガム、 ゼラチン、 メチルセルロース、 タルク、 ステアリ ン酸マグネシゥ ム、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン硫酸、 コラーゲン、 油脂、 又は鉱油が含まれ るカ これらに限定されない。 本発明の医薬組成物は、 これら担体の他に、 安定 化剤、 保存剤、 等張化剤、 p H調製剤、 酸化防止剤、 及び着色剤などの他の添加 剤を含ませることができる。 安定化剤には、 亜硫酸水素ナトリウム、 グリセリン、 ェデト酸ナトリウム、 クェン酸ナトリウム、 及びプチルヒ ドロキシァ二ソ一ルが 含まれるが、 これらに限定されない。 保存剤には、 塩化ベンザルコニゥムが含ま れるが、 これらに限定されない。 等張化剤には、 塩化ナトリウム、 D—マンニト —ル、 グルコース、 及びグリセリンが含まれるが、 これらに限定されない。 p H 調製剤には、 リン酸ーナトリウム、 リン酸水素ナトリウムのようなリン酸塩、 水 酸化ナトリウム、 及び塩酸が含まれる力 これらに限定されない。 酸化防止剤に はビタミ ン Cが含まれるが、 これらに限定されない。
本発明の医薬組成物は、 当該技術分野で周知の方法により調製でき、 速放性製 剤、 徐放性製剤、 及び遅放性製剤のいずれの形態をとつてもよい。 本発明の組成 物中における活性型ビタミン Dの濃度は、 その製剤の形態に依存して変動するが、 一般に約 0 . 0 l n g /m l〜約 l // g /m l、 好ましくは約 1〜約 1 0 O n g Z m 1である。
好ましい態様においては、 活性型ビタミ ン Dとして、 カルシトリオール又は 2 2—ォキサカルシトリオールを、 水又はエタノールに溶解させ、 活性型ビタミ ン Dの最終濃度が約 1〜約 1 0 0 n g /m 1である点眼剤を調製する。 p Hを一般 に約 5 . 0〜 9 . 0、 好ましくは約 7 . 0〜 8 . 0に調節する。 活性型ビタミ ン Dが 溶解し難い場合には、 ポリソルベー卜 8 0、 プロピレングリコール、 ポリビニル ピロリ ドン K 3 0、 又はポロキサマ一 1 8 8のような可溶化剤を加えてもよい。 こうして調製された点眼剤は、 症状に応じて 1日 1〜4回、 1回あたり 1〜数滴 点眼するのが典型的であるが、 この回数に限定されるものではない。
本発明の組成物を、 炎症を予防すべき部位に適用すると、 免疫反応による炎症 の発生を媒介すると考えられるランゲルハンス細胞の遊走が阻害される結果、 そ の部位における炎症の発生を有意に防止することができる。 また、 炎症が既に発 生している場合であっても、 それを治療することができる。 特に、 炎症部位が角 膜である場合には、 角膜の透明性を低下させることなく炎症を治療することがで きる。
以下に実施例を示して本発明を説明するが、 これら実施例は本発明の範囲を限 定するものではない。
実施例
実施例 1
活性型ビタミ ン D3原液 （ 1 α—ヒ ドロキシビタミ ン D3含有量， 5 0 mg/m 1 ) をエタノールで 1 0 0 0倍に希釈し、 これを更に眼科用生理緩衝液で 1 0 0 倍に希釈して、 1 α—ヒ ドロキシビタミ ン D3濃度が 0. 5 μ g/m 1の眼科用組 成物を調製した。
実施例 2
カルシトリオールをエタノールで 1 0 0 0倍に希釈し、 これを更に精製ゴマ油 よりなる眼科用油性基剤で 1 0 0倍に希釈して、 カルシトリオール濃度が 0. 5 β g/m 1 の眼科用組成物を調製した。
実施例 3
6 0 m gのビタミ ン C (L—ァスコルビン酸一リン酸） を実施例 1のやり方で 調製した 1 0 m 1の眼科用組成物に混合して溶解させ、 ビタミ ン Cが 6 m g/m 1で活性型ビタミ ン D3が 0. 5 gZm 1 の混合液よりなる眼科用組成物を得た c 試験例 1
カルシトリオ一ルを、 リン酸ナトリウム、 塩化ナトリゥム、 エタノール、 及び ポリソルベート 8 0からなる基剤に溶解させて、 それぞれ 1. 0 X 1 0 - 6M、 1. 0 X 1 0— 7M、 及び 1. 0 X 1 0一8 Mの 3種の溶液を調製した。 別にステロイ ド であるデキサメタゾンナトリゥムを同じ基剤に溶解させて 0. 1 %の溶液を調製 した。
B A L BZ cマウスの角膜にランゲルハンス細胞を遊走させるため、 同マウス 3 0匹の片眼角膜中央部に 1 0一 0ナイロン糸を通して 2針縫合して留置した。
1グループを 5匹とする A~Fの 6グループに分け、 Aグループを無点眼グルー プ、 Bグループをステロイ ド点眼グループ （S t ) 、 C〜Eグループをそれぞれ 上記 3種の濃度のカルシトリオ一ル点眼グループ、 そして Fグループを基剤だけ の点眼グループとした。 通糸翌日から 3回 日の頻度で点眼を開始した。 通糸 1 4日後にマウスを屠殺 して眼球を摘出し、 免疫染色法で角膜上皮中央部におけるランゲルハンス細胞の 密度の平均値を各グループごとに出した。 結果を表 1に示す。 角膜上皮中央部におけるランゲルハンス細胞の密度
Figure imgf000008_0001
表 1から、 無点眼グループ A及び基剤点眼グループ Fに比べて、 カルシトリオ —ル点眼グループの C〜 Eでは、 ランゲルハンス細胞数が有意に減少しているこ とが分かる。 更に、 カルシトリオールによる減少は濃度非依存的である。 これは、 ランゲルノヽンス細胞の遊走阻害に関してカルシトリオ一ルが至適濃度を有する可 能性を示唆している。 一般に、 免疫反応に関与する細胞の遊走阻害物質には、 こ のような至適濃度を有するものが多い。
この点眼実験中、 マウスの眼を 1日おきに細隙灯顕微鏡で観察して、 血管新生 についても評価した。 評価は、 マウスの角膜を 4象限にわけ各象限毎にその新生 血管の長さを下記基準でスコアし、 4象限のスコアの合計を 1つの角膜の新生血 管スコアとし （0〜1 2点） 、 グループごとに平均値を出した。
スコア 0 ：全く新生血管が認められないもの ；
スコア 1 ：新生血管の長さが角膜中央部 （中心より 1 m m半径以内） に達し ないもの ；
スコア 2 ：新生血管の長さが角膜中央部 （中心より 1 mm半径以内） に達す るが中心に及ばないもの ；
スコア 3 ：新生血管の長さが角膜中央に達するもの。
結果を図 1に示す。 図 1から、 カルシトリオールは血管新生の抑制効果も有す ることが分かる。
試験例 2
実験：
カルシ卜リオ一ル （ 1ひ， 2 5 (OH)2D3) による角膜上皮におけるランゲル ハンス細胞の遊走あるいは血管新生の抑制効果の作用機序を探るために、 1 α, 2 5 (OH)2D3の存在下でヒ ト角膜上皮細胞を培養し、 培養後の細胞数を測定し、 更に、 培地上清中におけるサイ トカインの産生量を測定した。
佐々木博士 （大阪府， 豊中巿立病院） から供与されたヒ ト角膜上皮細胞を、 1 0%のゥシ胎児血清、 5 gZm 1のインスリ ン、 0, 1 gZm 1のコレラ ト キシン、 1 0 n gZm 1のヒ ト E G F、 0. 5 %の D M S 0、 及び 4 0 g
1のゲンタマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地 （DMEM) /F - 1 2 (1/ 1) 中で、 3 7°Cの温度、 9 5 %の湿度、 及び 5%の二酸化炭素の条 件下で培養した。 培地は 1週間に 2回の割合で交換した。
ヒ ト角膜上皮細胞がコンフルェン トになった段階で、 培地を、 5 / g/ m lの インスリ ン、 5 m gZm 1のトランスフェリ ン、 及び 5 n g/m 1のセレナイ ト ナトリウムを含有する DMEM無血清培地に変更した。 4 8時間培養した後、 細 胞を 6ゥヱルプレートに各々 4 X 1 06個の割合で蒔き、 エタノール中 0. 1 %濃 度の 1 α， 2 5 (OH)2D3を、 2ゥエルずつの濃度が 1. 0 x 1 0— 7、 1. 0 X 1 0— 11及び 1. 0 X 1 (Τ15Μになるように添加して増殖させた。 これらゥエルを 1 α, 2 5 (OH)2D3濃度が異なる 3ゥヱルからなる 2組に分け、 一方の組につ いては 6時間培養後に、 他方については 1 2時間後に細胞数を測定した。 また、 その時点における培地を 1 5 0 gにて 5分間遠心分離して上清を得て、 — 8 0°C で保存した。 これら実験は少なく とも 3回行った。
対照として、 1 α， 2 5 (OH)2D3で処理しなかったことを除いては同じよう に処理した実験 （未処理） 及び 1 α， 2 5 ( 0 H) 2 D 3を含まないエタノールを添 加したことを除いては同じように処理した実験 （溶媒） も行った。
サイ トカインの定量は、 インタ一ロイキン— l a ( I L - 1 α) 、 インタ一口 ィキン一 1 3 ( I L - 1 /3) 及びィンタ一ロイキン一 8 ( I L - 8 ) について Ε L I SAキッ ト （R & D System Corp. ) を用いて行った。 それぞれのサイ トカイ ンの定量限界は、 I L— 1 αについては 0. 5 p g/m 1、 I L— 1 /Qについて は 1 p g/m 1、 そして I L— 8については 1 0 p gZm 1であった。 比色定量 は E L 3 0 8 (Bio-tek Instrument, incoski) を用いて 4 5 0 nmで行った。 3実験の測定結果を集計し、 統計処理を対応のない t- test で行った。
ロ: ¾ ：
細胞増殖に関し、 図 2に示すように、 1 α， 2 5 (OH) 2D 3処理群と溶媒添加 対照群との間に有意な差は認められない。 従って、 in vitro における角膜上皮 細胞増殖への 1 α， 2 5 (OH)2D3の影響は非常に弱いものである。
一方、 サイ ト力インの量に関しては、 図 3〜 5に示すように、 I L— 1 α、 I L— 1 yS及び I L一 8の全てについて 1 α， 2 5 ( 0 H) 2 D 3による産生抑制効果 が認められる。 特に I L— 1 α及び I L— 1 /3についての効果が顕著である。 他 方、 I L一 8についての効果はかなり劣る。
詳細には、 図 3及び 4から、 1 α， 2 5 (OH)2D3未処理の場合は、 6時間培 養後の I L— 1 及び I L— 1 ;3の産生量は、 それぞれ 1 9 9. 8 ± 0. 6 5 p g / 1 06個及び 2 9. 9 ± 2. 8 p g/ 1 06個であり、 これらは、 それぞれ 1 2時 間培養後に約 1. 5倍に増加するが、 1 α， 2 5 (OH) 2 D 3処理群における I L— 1 α及び I L _ 1 3の 6時間培養後の産生量は、 1 α， 2 5 (OH)2D3の濃度に 関係なく、 それぞれ未処理の場合の 2 5 %及び約 7 7 %程度に過ぎない。 そして、 それらの値は 1 2時間培養しても殆ど増加しないことが分かる。 また、 図 5から は、 1 α， 2 5 (OH)2D3処理群における I L一 8の 6時間培養後の産生量は、 未処理群に比べて濃度依存的に有意に低下するが、 1 2時間培養では未処理群に 比べて有意に低下しないことが分かる。
以上から、 in vitro では、 1 α， 2 5 ( 0 H) 2 D 3によるヒ卜角膜上皮細胞での I L - 1の産生抑制効果は非常に強いが、 I L一 8の抑制効果は比較的弱いこと が明らかである。 これは、 角膜上皮細胞に対して 1 α， 2 5 (OH)2D3が直接に I L一 1の産生を抑制することを示した初めての知見である。 in vitro で I L 一 1の産生抑制効果が強いことは in vivo でランゲルハンス細胞遊走抑制作用 が強いことに対応し、 また、 in vitro で I L一 8の抑制効果が比較的弱いこと は in vivo で血管新生抑制作用が相対的に弱いことに対応するので、 上記の結 果は、 1 α, 2 5 (OH)2D3による角膜上皮におけるランゲルハンス細胞の遊走 阻害は、 1 α， 2 5 (OH)2D3が角膜上皮において I L一 1の産生を抑制するこ とによりもたらされると考えられる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 活性型ビタミ ン Dを有効成分とするランゲルハンス細胞遊走阻害剤。
2. 活性型ビタミ ン D力く、 ビタミ ン D3、 ビタミン D3誘導体又はビタミン D3 類似体である請求項 1記載のランゲルハンス細胞遊走阻害剤。
3. 活性型ビタミ ン Dがビ夕ミ ン D3である請求項 2記載のランゲルハンス細 胞遊走阻害剤。
4. 活性型ビタミン D3がカルシトリオ一ル又は 2 2一ォキサカルシトリオ一 ルである請求項 3記載のランゲルハンス細胞遊走阻害剤。
5. 点眼剤である請求項 1〜 4のいずれか 1項に記載のランゲルハンス細胞遊 走阻害剤。
6. 眼の炎症の予防及び Z又は治療に用いる請求項 5記載のランゲルハンス細 胞遊走阻害剤。
7. 眼の炎症が角結膜炎である請求項 6記載のランゲルハンス細胞遊走阻害剤 c
8. 眼の炎症の予防に用いる請求項 5記載のランゲルハンス細胞遊走阻害剤。
9. 眼の炎症が角膜フリクテン又は角膜浸潤である請求項 8記載のランゲルハ ンス細胞遊走阻害剤。
1 0. 角膜上皮細胞におけるインタ一ロイキン— 1の産生を抑制することにより 眼の炎症を予防及び 又は治療する請求項 5記載のランゲルハンス細胞遊走阻害 剤。
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