WO1999018218A1

WO1999018218A1 - Protease alcaline

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Publication number: WO1999018218A1
Application number: PCT/JP1998/004528
Authority: WO
Inventors: Mikio Takaiwa; Mitsuyoshi Okuda; Katsuhisa Saeki; Hiromi Kubota; Jun Hitomi; Yasushi Kageyama; Shitsuw Shikata; Masafumi Nomura
Original assignee: Kao Corporation
Priority date: 1997-10-07
Filing date: 1998-10-07
Publication date: 1999-04-15
Also published as: US6376227B1; US6759228B2; DK1029920T3; DE69833031D1; KR100832764B1; AU732369B2; KR20050099566A; CN1130462C; JP3479509B2; KR20010030974A; KR100601189B1; US20040142837A1; EP1029920A1; US7297528B2; US20020064854A1; ID24410A; EP1029920B1; AU9457998A; DE69833031T2; CN1280621A

Description

P 明細書アル力リプロテア一ゼ技術分野

本発明は洗浄剤配合用酵素として有用なアルカリプロテアーゼ、それをコードする遺伝子、該ァルカリプロテア一ゼを産生する微生物及び該ァルカリプロテア一ゼを含有する洗浄剤組成物に関する。背景技術

プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化助剤あるいは消炎剤といった医薬品等の多分野で利用されてきた。

その中でも最も大量に工業生産され市場規模が大きいのは洗剤用プロテアーゼであり、例えばアルカラ一ゼ、サビナーゼ（ノボ■ ノルディスク社製）、マクサカル（ジエネンコア社製）、ブラップ（ヘンケル社製）及びプロテアーゼ K ( K A P ；花王社製）などが知られている。

一方、現在もより性能の向上した洗剤用酵素の探索が試みられており、熱及び界面活性剤に対する安定性の高い酵素（特開平 6 - 7 0 7 6 5号公報等）、ケラチンなどの不溶性蛋白質に作用しかつ高い比活性を有する酵素 (特開平 9一 1 2 1 8 5 5号公報等）、低温域での活性に優れた酵素（特開平 5 - 2 1 1 8 6 8号公報、特開平 9一 1 2 1 8 5 6号公報等）及び酸化剤に対する安定性を向上させる方法（欧州特許第 0 1 3 0 7 5 6号公報）等が開示されている。

ところで、衣料等の汚れは蛋白質だけでなく、脂質、固体粒子など複数の成分が含まれていることがほとんどであり、かかる実際の複合汚れに対して洗浄力の高い洗浄剤が望まれている。これに対しては、通常複数種の酵素、複数種の界面活性剤の配合がなされている。

しかしながら、複数種の酵素を配合したところで、その配合した個々の酵素が複合汚れの条件下で安定で、かつ充分な活性を維持していなければ、その作用は充分に発揮されない。この点で従来の酵素は必ずしも十分ではなかった。発明の開示

本発明者は、高濃度の脂肪酸存在下でもカゼイン分解活性を保持し、蛋白だけでなく皮脂等の汚れのある複合汚れ条件下でも優れた洗浄性を有するアル力リプ口テアーゼを見出した。

すなわち、本発明は、下記の理化学的性質を有するアルカリプロテア一ゼを提供するものである。

( i ) 作用 PH範囲：

pH 4〜 l 3の広い範囲で作用し、 pH 6〜l 2で最適 pH活性値の 8 0 %以上を示す。

( i i ) 安定 PH範囲：

4 0で、 3 0分の処理条件で pH 6〜 1 1の範囲で安定である。

( iii ) 等電点：

8 . 9〜 9 . 1付近。

( iv ) 脂肪酸の影響：

ォレイン酸によってカゼィン分解活性の阻害を受けない。

また、本発明は、上記アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子を提供するものである。

また、本発明は、上記アルカリプロテア一ゼを産生する微生物を提供するものである。

さらに本発明は、上記アル力リプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物を提供するものである。

図面の簡単な説明

図 1は、アルカリプロテアーゼ KP 4 3の pHプロファイルを示す。図 2は、ァルカリプロテアーゼ KP 4 3の pH安定性（4 0 、 3 0分）を示す。図 3は、ァルカリプロテアーゼ K P 4 3の pH安定性（ 1 0 °C、 24時間）を示す。図 4は、アルカリプロテア一ゼ KP 4 3の温度プロファイルを示す。図 5は、アルカリブ口テアーゼ KP 4 3の耐熱性を示す。図 6は、 KP 4 3プロテアーゼの酸化剤 (5 OmM過酸化水素）に対する安定性を示す。図 7は、 KP 9 8 6 0プロテア一ゼ及びその部分分解物の N末端配列を示す。図 8は、 KP 9 8 6 0プロテアーゼの N末端配列からデザインしたプライマー配列を示す。図 9は、 5 7 b p PCR増幅断片とプライマーデザインを示す。

発明を実施するための最良の形態

本発明のアルカリプロテアーゼは、前記（ i ) 〜（_1V) の理化学的性質を有するが、特に（iv) の性質は重要である。すなわち、ォレイン酸は皮脂の成分の一つであり、ォレイン酸 1 OmM存在下でも、ォレイン酸不存在下の場合と同等の力ゼィン分解活性を保持している。

本発明のアルカリプロテア一ゼとしては、（V) SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS— PAGE) による推定分子量が約 4 3， 0 0 0のものが好ましい。

さらに、上記（ i ) 〜（V) の性質以外に下記（vi) 〜（ix) の性質を有するアル力リプロテア一ゼが特に好ましい。

(vi) 作用温度及び最適温度：

作用最適温度は 6 0° (〜 70でであるが、 2 0°C以下の低温でも作用する。

(vii) 金属イオンの影響： H g ²⁺及び C u ^{2 +}ィォンでは活性が阻害され、 C a ^{2 +}ィォンでは熱安定性が向上する。

(viii) 阻害剤の影響：

ェチレンジアミン四酢酸（EDTA) 及び p—クロロマ一キユリ一安息香酸（P CMB) では活性は阻害されないが、ジイソプロピルフルォロ燐酸 (DFP) 及びフエニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF) では活性は阻害される。

(ix) 界面活性剤耐性：

直鎖ァルキルべンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリォキシェチレンァルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ひ一才レフインスルホン酸ナトリウム及びひースルホ脂肪酸エステルで活性は阻害されなし、。

本発明のアル力リプロテア一ゼとしては、配列番号 1又は 2に示すァミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の 1若しくは 2以上のアミノ酸か欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列を有するものが好ましい。配列番号 1と 2とは、配列番号 2における 3位リジンが配列番号 1では欠失している点で異なるのみである。配列番号 1及び 2における X a aは、任意のアミノ酸を示すが、各位置の X a aの好ましいァミノ酸を配列番号 2における位置で下記の表に示す。

24位 S e r又は A s n 30位 G £ y又は A s p

33位 A s n又は Th r 47位 hi a又は Va £

4 8位 L y s又は S e r 54位 G y又は A r

7 位 P r o又は L e u 75位 G £ n又は L e u

90位 I £ e又は Va Ά 1 03位 G £ n又は L y s

1 06位 L y s又は Th r 1 29位 L y s又は G £ n

1 3 1位 A ί a又は L y s 1 32位 Th r又は Va £

1 33位 S e r又は A r g 1 34位 Th r又は S e r

1 47位 I i e又は L y s 1 4 9位 A r g又は L y s

1 6 1位 G u又は Th r 1 66位 Va 又は L e u

1 73位 L y s又は A s n 1 84位 Gi n又は υ

1 88位 P h e又は Ty r 1 8 9位 A£ a又は Va ί

1 90位 I £ e又は a 1 95位 L e u又は H i s

28 7位 S e r又は A £ a 307位 y又は S e r

325位 Ty r又は Ph e 370位 G£ y又は Ar g

4 32位 Ph e又は Ty r 5 02位 I £ e又は Va £

532位 S e r又は A £ a 542位 S e r又は T h r

585位 G £ n又は A r g 5 92位 Th r又は S e r

5 93位 S e r又は a 5 95位 Ty r又は Ph e

5 96位 A s n又は A s p 5 97位 A s p又は A s n

6 1 2位 A£ a又は S e r 6 33位 Th r又は A s n 本発明アルカリプロテアーゼにおける前記欠失、置換又は付加は、アルカリプ口テアーゼ活性を失わない限り特に制限されないが、配列番号 1又は 2で示されるアミノ酸配列の好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 9 0 %以上が保存されているものが好ましい。

本発明のアル力リプロテアーゼの具体例としては、配列番号 3、 4又は 5で示されるァミノ酸配列、又は該ァミノ酸配列の 1若しくは 2以上のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列を有するアル力リプロテア一ゼが挙げられる。

本発明のアルカリプロテア一ゼは、例えばバチルス属 (Bac i i ius に属するァルカリプロテアーゼ生産菌を培養し、その培養物から採取することにより製造することができる。ここで、本発明アルカリプロテアーゼ生産菌としては、バチ儿ス属に属する野生株、及び前記のァミノ酸配列を有するぺプチドをコ一ドする遺伝子を有する形質転換体が挙げられる。また、該野生株としては例えば K P 4 3 株、 K P 1 7 9 0株及び K P 9 8 6 0株が挙げられる。これらの菌株の菌学的性質を以下に示す。

表 1

KP 4 3 KP 1 7 9 0 KP 9 8 6 0

A. 形態学的性質

(a) グラム染色 ' 陽性陽性陽性

(b) アミノぺプチダ一ゼ不定不不 ¾

( c ) 運動性有する有する有する

(d) 鞭毛周鞭毛周鞭毛周鞭毛

(e) 胞子. (有無、形、位置、膨らみ）有胞子、楕円有胞子、楕円有胞子、楕円形、中央、無形、中央、無形、端〜中央、しし有り

B. 生理学的性質

(a) 硝酸塩の還元陰性陰性陰性

(b) インドール生成陰性陰性陰性

(c) 生育の ρΗ範囲 pH6. 2〜 PH6. 2 ~pH pH 6. 2 pH

1 1. 7で生 1 1. 7で生 1 0. 0で生育、 pH8 pH 育、 PH8. 5 育、 pH9付近

1 0で良好に pH 1 0で良で良好に生生育。好に生育。育。

(d) 塩化ナトリゥムに対する耐性 7 %以上 NaC? 7 %以上 NaC 7 %以上 NaC 含有培地上で含有培地上で含有培地上で生育できない。生育できない。生育できない。

( e ) 生育の温度範囲 1 0 4 0 °C 1 0 4 0 °C 2 0 4 0 C

( f ) 3—ガラクトシダ一ゼ陽性陽性陽性

(g) アルギニンジヒドロラーゼ陰性陰性陰性

(h) リジンジヒドロラ一ゼ陰性陰性陰性

( i ) ォキシダ一ゼ陽性陽性陽性

( j ) クェン酸の利用陰性陰性陰性

(k) 尿素の利用陰性陰性陰性

( 1 ) 力タラ一ゼ陽性陽性陽性

(m) グルコース及び硝酸塩からのガス陰性陰性陰性

の生成

(n) 嫌気条件下での生育陰性陰性陰性

(o) VPテスト陰性陰性陰性

(p) 糖からの酸生成

D—グルコース + 十

Lーァラビノース ― ―

D—キシロース一 ― ―

D—マンニト一ル十

D—ガラクト一ス + ― ― シュ一クロース +

D—マンノース

イノシトール ― ―

D _ ノレビ卜一ノレ +

トレハロース

ラクト一ス

グリセロール

マルト一ス +

D—フラクトース +

ラフイノ一ス

メリビオース +

でんぷん十以上の菌学的性質について rBergey' s Manual of Systematic Bacteriology」 (Williams & Wilkins社、 1984年）の記載に準じ検討したところ、上記の 3菌株はバチルス属に属させることが妥当である。しかし、種については、既知のバチルス属の種の諸性質とは完全に一致しないことから新規な微生物である。そこで上記 3菌株を工業技術院生命工学技術研究所（あて名：〒305- 0046日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号）にバチルスエスピー (Bacillus sp.) KSM - KP 4 3 (FERM BP- 6532) 、バチルスエスピー (Bac lus sp.) KSM—KP 1 7 9 0 (FERM BP- 6533) 、バチルスエスピー (Bacilius sp.) KSM— KP 9 8 6 0 (FERM BP- 6534) として寄託した（原寄託日： 1996年 9月 18日）。

上記の菌株を用いて本発明アル力リプロテア一ゼを生産するには、菌株を資化性の炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従い培養すれぱよい。

かくして得られた培養液中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製方法に準じて行うことができる。例えば、培養液から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、培養上清液から常法の精製手段により目的酵素を得る。このようにして得られる酵素液は、そのまま用いることもできるがさらに公知の方法により精製、結晶化することもできる。

本発明アル力リプロテア一ゼは、該ァルカリプロテアーゼをコ一ドする遺伝子を取得し、これを用いて組換えベクターを作製し、該組換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、培養物からアルカリプロテァ一ゼを採取することによつても得られる。

本発明アル力リプロテア一ゼ遺伝子は、例えば上記 3菌株からクロ一ニングすることができる。該クロ一ニング手段としては、既知の手段、例えば（ 1 ) 適当な制限酵素による染色体 DN Aの全分解又は部分分解で得られた DN A断片を適当なベクターに組み込み、大腸菌や枯草菌などに導入し発現させるショットガン法、（2) 適当なプライマーを合成して PCR法で目的とする遺伝子をクロー二ングする方法等が挙げられる。

本発明アル力リプロテア一ゼ遺伝子の塩基配列の一例を配列番号 3〜 5に示す c 該塩基配列は、配列番号 3〜 5に限定されるものではなく、配列番号 1若しくは 2に示されたァミノ酸配列をコードする塩基配列、又は該ァミノ酸配列の 1若しくは 2以上のァミノ酸が欠失し、置換若しくは付加したァミノ酸配列をコードする塩基配列であればよいが、配列番号 3〜 5で示される塩基配列、又は該塩基配列の 1若しくは 2以上の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を有するものが好ましい。ここで欠失、置換若しくは付加は、前記ァミノ酸配列の変異の範囲内であることが好ましい。

前記アル力リプロテア一ゼ遺伝子を含む組換えベクターを作製するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターにアル力リプロテアーゼ遺伝子を組み込めばよい。かかるベクターとしては、大腸菌を宿主とする場合、 p U C 1 8、 p B R 3 2 2、 p U C 1 9等が挙げられ、枯草菌を宿主とする場合、 p U B 1 1 0等が挙げられる。

かくして得られた組換えベクターを用いて宿主を形質転換するには、常法、例えばプロトプラスト法、コンビテントセル法等により行われる。宿主としては、特に制限されないが、微生物が好ましく、バチルス属細菌等のグラム陽性菌；大腸菌 (Esd nchia∞1 ϋ 等のグラム陰性菌；サッカロマイセス属酵母、ァスべルギルス属カビ等の真菌等が挙げられる。

得られた形質転換体を培養して本発明アル力リプロテアーゼを採取するには、例えば前記の野生株を用いた培養、採取、精製の手段に準じればよい。

本発明のアル力リプロテアーゼは、前記の如く優れたアル力リ耐性を有し、月^ 質の存在下でも優れたプロテア一ゼ活性を有し、さらに酸化剤に対する耐性及び界面活性剤耐性を有するので、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用である。洗浄剤組成物中への上記アル力リプロテア一ゼの配合量は、アル力リプロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物 1 kg当たり 0. 1〜5 000 U、特に 1〜500 Uが好ましい。

また、本発明のアルカリプロテア一ゼ含有洗浄剤組成物には、公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄成分としては、 WO 94Z268 8 1 の第 5頁、右上欄、第 1 4行〜右下欄、第 29行記載のものを使用することができる。

界面活性剤は、洗浄剤組成物中 0. 5〜60重量％ (以下単に％で示す）配合され、特に粉体状洗浄剤組成物については 1 0〜4 5%、液体洗浄剤組成物については 20〜50%配合することが好ましい。また、本発明洗浄剤組成物が漂白洗浄剤又は自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に 1〜 1 0%、好ましくは 1〜5%配合される。

二価金属イオン捕捉剤は、 0. 0 1〜5 0 %、好ましくは 5〜40 %配合される。

アルカリ剤及び無機塩は 0. 0 1〜80%、好ましくは 1〜4 0 %配合される。再汚染防止剤は 0. 0 0 1〜 1 0 %、好ましくは 1〜 5 %配合される。

本発明のアルカリプロテアーゼ以外にセルラーゼ、アミラーゼ、プロトぺクチナーゼ、ぺクチナーゼ、リパーゼ、へミセルラ一ゼ、 /3—グリコシダーゼ、グ儿コ一スォキシダ一ゼ、コレステロールォキシダーゼ等を使用することができる。これらの酵素は 0. 0 0 1〜5%、好ましくは 0. 1〜3%配合される。

漂白剤（例えば過酸化水素、過炭酸塩等）は 1〜1 0%配合するのが好ましい。漂白剤を使用するとき漂白活性化剤（ァクチべ一ター）を 0. 0 1〜1 0%配合することができる。

蛍光剤はビフニル型蛍光剤（例えばチノパール CBS— X) やスチルベン型蛍光剤（例えば DM型蛍光染）等が挙げられる。蛍光剤は 0. 00 1〜2%配合するのが好ましい。

上記の洗浄剤組成物の形態は、例えば液体、粉末、顆粒等とすることができる = また、この洗浄剤組成物は、衣料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、漂白剤等として使用することができる。実施例

実施例 1 (アル力リプロテアーゼ生産菌のスクリ一二ング）

土壌サンプル 1 gを生理食塩水（ 1 OmL) に懸濁し、 8 (TCで 1 0分間熱処理を行つた後、以下に示した組成を有するプロテアーゼ生産菌液体集積培地へ接種し、 20°Cで培養を行った。 3回程度同培地で植え継ぎ集積を行った後、以下に示した組成を有するプロテアーゼ生産判定プレートに塗抹し、 2 0°Cで 5〜7日間培養した。生育した集落の周囲にスキムミルクの分解によって生じた透明帯を指標としてプロテアーゼ生産菌を分離した。その結果、アルカリプロテアーゼ生産菌としてバチルスエスピー KSM— KP 4 3株、 KSM— KP 1 7 9 0株及び KSM - KP 9 8 6 0株を得た。

表 2

スクリ一ニング用液体集積培地（pH 1 1 ) の組成

リン酸一力リウ厶 0. 1 %

硫酸マグネシウム 0. 0 2 %

酵母エキス（ディフコ社製） 0. 0 5 %

ケラチン（東京化成社製） 1. 0 %

グルコース 0. 5 %

炭酸ナトリウム 0. 3 %

スクリーニング用寒天平板培地

ニュートリエントァガ一（ディフコ社製） 2. 3 %

スキムミルク（ディフコ社製） 0. 3%

炭酸ナトリウム 1. 0 %

実施例 2

得られたバチルスエスピー KSM— KP 4 3株をポリペプトン S 1 %、酵母エキス 0. 0 5%, リン酸 1カリウム 0. 1 %、硫酸マグネシウム 0. 0 2%、グルコース（別滅菌） 1 %、炭酸ナトリウム（別滅菌） 0. 5%、の組成の液体培地に接種し 3 0°C、 2 4時間培養した。この時の培養上清の酵素濃度は、約 1. 5U/Lであった。この培養液を 4 °Cで遠心分離し得られた培養上清に攪拌しながら粉砕した硫安を 9 0%飽和濃度になるように添加した。攪拌しながら 4 でで一昼夜放置後遠心分離により沈殿を回収し、得られた沈殿を 5 mMの塩化カルシゥムを含む 1 OmMトリス—塩酸緩衝液 pH7. 5に溶解し、同緩衝液に対して透析した。続レ、てこの透析内液を 5 の塩化力几ゥ厶を含む 1 0 mMトリスー塩酸緩衝液 pH 7. 5で平衡化させた D EAE-S e p h a r o s e FF (ファルマシァ社製）カラムを通過させ非吸着画分を回収した。この回収液を 2 mM塩化カルシゥムを含む 5 OmM HEPES緩衝液 pH7. 5に対して透析し、同緩衝液で平衡化させた SP—セファロ一ス FFカラムを通過させ非吸着画分よりやや遅れて溶出してくる活性画分を回収した。活性回収率 1 5 %のこのサンプルを用いて S D S ポリアクリルアミド電気泳動を行ったところ単一バンドとして検出された。実施例 3

得られたバチルスエスピー KSM— K P 1 7 9 0株及び KSM— K P 9 8 6 0株を実施例 2と同様の培地で培養し、実施例 2と同様に培養液を精製してアル力リプロテアーゼを採取した。

実施例 4

実施例 2及び 3で得られたアル力リプロテアーゼの酵素学的性質を検討した。その実験方法及び結果を以下に示す。

I . 実験材料及び実験方法

( 1 ) 活性測定法

(a) カゼィン法

1 % (w/v) カゼイン（ハマ一スティン：メルク社製）を含む 5 0誦 o /L 各種緩衝液 1 mLを 4 0 で 5分間保温した後、 0. 1 mLの酵素溶液を添加し、 40°Cで 1 0分間反応を行った。 TCA溶液（0. 1 lnu^/Lトリクロ口酢酸： 0. 22moiZL酢酸ナトリウム： 0. 33 mo ZL酢酸） 2 mLを添加して反応を停止し、室温で 1 0分間放置した後、酸変性蛋白を濾過（No. 2濾紙：ホヮットマン社製）した。そして、濾液 0. 5mLにアルカリ性銅試薬（ 1 % (w/v) 酒石酸力リウム ·ナトリウム： 1 % (w/v) 硫酸銅： 2 % (w/v) 炭酸ナトリウ厶、 0. Imo / L水酸化ナトリウム = 1 : 1 : 1 0 0 (v/v) ) 2. 5 mLを添加し、 30 °C、 1 0分間保温した後、希釈フエノール試薬（フノール試薬（関東化学社製）をイオン交換水で 2倍希釈したもの） 0. 25mしを加え、 30°C. 30分間保温した後、 6 6 Onmにおける吸光度を測定した。上記の酵素反応系に反応停止液を混合した後、酵素溶液を加えた系をブランクとした。

なお、酵素 1単位（P. U) は、上記の反応条件において 1分間に 1國 o のチ口シンに相当する酸可溶性蛋白分解物を遊離する酵素量とした。

(b) 合成基質法

0. 9mLの 1 00瞧ホウ酸緩衝液（pH 1 0. 0, 2隱 o ZL塩化カルシゥム含有）に 50誦合成基質溶液（サクシ二ルーァラニルーァラニルーフェニルーロイシン ·ノくラ二トロア二ライドをジメチルスルホキサイドに溶解） 0. 05 を混合し、 30°Cで 5分間保温した後、 0. 05mしの酵素溶液を加え、 30°C、 1 0分間反応を行った。 5% (w/v) クェン酸溶液 2 mLを添加して反応を停止させ、 42 Onmにおける吸光度を測定した。

なお、酵素 1単位（U) は、上記の反応条件において 1分間に 1 (^の p - 二トロア二リンを遊離させるのに必要な酵素量とした。

(c) アンソン 'へモグロビン法

アンソンの方法に従い（M. L. Anson, J. Gen. Physiol. 22, 79(1938))、尿素を用いて牛血清ヘモグロビンを変性させ、水酸化ナトリウムにて pHl 0. 5とした。この基質溶液（へモグロビンとして 2. 2 %) 0. 5 mしに酵素液 0. 1 mL ( 1. 0 X 1 0— ⁵〜1. 0 X 1 0— ³A. U) を添加し 25°Cにて 1 0分間反応を行い、 4. 9 %のトリクロル酢酸 1. 0 mLを加え、反応を停止した。反応終了後、遠心分離（3, 0 0 Orpm, 1 0分）を行い、その上清液中に含まれる蛋白分解物をフォーリン ' 口一リー法（0. H. Lowryら、 J. Biol. Chem. , 193, 265(1951)) によって定量した。

なお、酵素 1単位（A. U) は、上記の反応条件において 1分間に 1睡 0 のチロシンに相当する酸可溶性蛋白分解物を遊離する酵素量とした。

( 2 ) 至適 ρΗ

カゼイン 1 % (w/v) を含む 5 0瞧 ot/ Lのブリットン · ロビンソン緩衝液 lmLに酵素溶液（3. 0 X 1 0— ⁵mP. U) 0. 1 mLを加え、カゼイン法によつて活性測定を行った。

( 3 ) pH安定性

ブリットン ■口ビンソン緩衝液（ 20讓 0 / L、 2隱 0 / L塩化力ルシゥム含有）中に酵素溶液を（8. 0 1 0"⁴mP. U. ) 混合し、 4 0°C、 30分間及び 1 0°C：、 24時間の処理を行った。この処理液を氷冷後、 50誦 o Lホウ酸緩衝液で 4 0倍に希釈した後、カゼイン法により残存活性を測定した。

( 4 ) 至適温度

カゼイン 1 % (w/v) を含有する 5 Ommo ZLホウ酸緩衝液（pH 1 0. 0) lmL中に、酵素溶液 2. 0 X 1 0— ⁵mP. U. ) 0. lmLを添加し、 1 0〜8 0 °Cまでの各温度でカゼィン法により活性測定を行った。

なお、活性測定は 5賺 ZL塩化カルシウムの存在下及び非存在下の両系において行った。

( 5 ) 耐熱性

20誦 o ZLホウ酸緩衝液（pHl 0. 0) 中、 5隱塩化カルシウムの存在下及び非存在下の両系において、酵素溶液（2. 5 X 1 0-⁴mP. U. ) を加え、各温度で 1 0分間熱処理を行った。氷冷後、 50隱 o /Lホウ酸緩衝液（pH 1 0. 0 ) で 5倍希釈し、カゼイン法により残存活性の測定を行った。 (6) 金属イオンの影響

1謹各種金属塩を含む 2 0画 0 / Lホウ酸緩衝液（pHl 0. 0 ) 中に酵素溶液（4. 0 X 1 0— ⁴mP. U. ) を添加し、 3 0 °C、 2 0分間の処理を行つた。その後、 5 0睡 0 ZLホウ酸緩衝液（pHl 0. 0) で 5倍希釈し、カゼイン法により活性の測定を行った。

(7) 阻害剤の影響

1 0薩リン酸緩衝液（pH7. 0) に各種阻害剤を所定濃度になるよう調製し、酵素溶液（ 1. 0 X 1 0— ³mP. U. ) を添加し、 3 0°C、 2 0分間の処理を行った。その後、イオン交換水で 2 0倍希釈し、カゼイン法により残存活性の測定を行った。

( 8 ) 界面活性剤の影響

1 %の界面活性剤を溶解した 1 0 0隱 0 / Lホウ酸緩衝液に、酵素溶液 (7. 0 X 1 0— ⁴mP. U. ) を添加し、 4 0°C、 4時間の処理を行った。その後、 5 0mmoi//Lホウ酸緩衝液（pH 1 0. 0) で 2 0倍希釈し、カゼイン法により残存活性の測定を行った。

( 9 ) 酸化剤（過酸化水素）の影響

過酸化水素及び塩化カルシウムを含むプリットン . ロビンソン緩衝液（最終濃度： 5 0隱過酸化水素、 2誦 0 ZL塩化カ儿シゥム、 2 0隱 o Z Lブリットン · ロビンソン（pH 8. 0) 2. 7 mLを 3 0 °C、 1 5分間保温した後、 0. 3 mLの酵素溶液を添加した。経時的に、予め準備しておいた 5 Lの力タラーゼ（ベ一リンガーマンハイム社製： 2 0 mg/mL) 入り試験管に 0. 8mLサンプリングし、酸化反応を停止させた。そして、各サンプルを 2隱 0 /L塩化カルシゥムで適当に希釈した後、合成基質法を用いて残存活性を測定した。

( 1 0 ) 脂肪酸の影響

1 % (W/Y) カゼインを含む 5 OmMリン酸緩衝液（pH7) を基質溶液として、 0〜 1 0 mMのォレイン酸ナトリゥム存在下で 2 0で、 1 5分間反応を行し、、力ゼイン法で活性測定を行った。

II. 実験結果

( 1 ) 至適 pH

3種類のプロテア一ゼ（KP43, KP1790, KP9860) に及ぼす pHの影響を検討した _c 至適 pHにおける活性を 1 00 %とし、各 pHでの K P 4 3の相対活性を図 1に示した。その結果、いずれのプロテアーゼも、作用最適 pHは pH6〜l 2にあり、非常に広い pH領域において高い蛋白分解活性能範を有することが明らかになった。

( 2 ) pH安定性

処理前の酵素活性を 1 00 %とし、 4 0 °Cで 30分間及び 1 0でで 24時間の保存後の、各 pHにおける KP 4 3の残存活性を図 2及び 3に示した。その結果、 40て、 30分間の処理では、し、ずれも pH 6〜 1 2の広範囲で安定であり、カ儿シゥムイオンの添加によって pH 5における安定性も改善されることが明らかになつた。一方、 1 0°C、 24時間の処理では、いずれも pH5〜l 2の広範囲で安定であつ 7こ。

( 3 ) 至適温度

基質にカゼインを用いて、各々のプロテア一ゼに及ぼす温度の影響を検討した。カルシウム無添加系における最高活性を 1 00 とし、各温度における ΚΡ 4 3 の相対活性を図 4に示した。この結果から、カルシウムイオン無添加系においては、 3種類のプロテア一ゼは至適温度を 6 0°Cに有することが判った。また、力ルシゥ厶イオン添加系によっていずれも至適温度は 70°Cとなり、既存の洗剤用プロテアーゼと同様、カルシウムィォン添加系による至適温度の高温側への移行が認められた。

( 4 ) 耐熱性

30〜60°Cまでの各温度で（pHl 0. 0、 5隱 0 / L塩化カルシウム添加及び無添加系）、 1 0分間の熱処理を行い、残存活性を測定した。未処理時の活性を 1 0 0%とし、各処理温度における KP 43の残存活性を図 5に示す。その結果、いずれのプロテア一ゼも塩化カルシウム無添加系においては、 60°Cまで安定であり、塩化カルシウム（5隱の添加により温度安定性は 1 0°C程高温側にシフトすることが明らかになった。市販の洗剤用酵素と比較した場合、最も耐熱性に優れているエスペラーゼに匹敵する耐熱性を保持するものと考えられた。

(5) 金属イオンの影響

4種類のプロテア一ゼについて、各種金属塩（ 1隱 o /L) で 20画 o ZLホゥ酸緩衝液中（PHI 0) 、 30°C、 20分間の処理を行い、残存活性を測定した _c 残存活性は、金属塩無添加系で同様の処理を行った時の酵素活性を 1 0 0%とする相対値で表わした（表 3参照）。その結果、いずれのプロテア一ゼも塩化水銀及び硝酸銀による阻害が認められたが、他の各種金属塩に対しては、非常に安定であることが判った。

表 3

相対活性（％)

( ImM) KP43 KP1790 P9860

無添加 100 100 100

AgN0₃ 66 70 45

NiC ₂ 92 95 96

CaC £₂ 97 95 101

CoC £₂ 91 101 98

FeC ₃ 93 113 96

ZnC £₂ 85 94 91

CuC ₂ 91 96 94

HgC^₂ 38 37 33

MgC £₂ 92 103 100

処理条件： ImM金属塩、 20mMホウ酸緩

衝液（pH10.0)30°C、 20分

( 6 ) 各種阻害剤の影響

一般的な酵素阻害剤が本発明プロテアーゼに対して与える影響を検討した。 1 0隱 oiZLリン酸緩衝液（pH7. 0) に各種阻害剤を所定濃度になるように添加し、 3 0°C、 2 0分間の処理を行い、残存活性を測定した。残存活性は、阻害剤無添加系で同様の処理を行った時の酵素活性を 1 0 0 %とする相対値で表わした（表 4参照）。この結果から明らかなように、 3種類のプロテアーゼはいずれも、セリンプロテア一ゼの阻害剤であるジイソプロピルフルオルリン酸 (DF P) 、フエニルメタンスルホニルフルオライド（PMSF)

チンで阻害されることから、活性中心にセリン残基を有するプロテアと考えられた。また、放線菌由来でセリンプロテア一ゼの阻害作用が報告されているアンチパインやロイぺプチンによる影響は認められなかった。表 4 阻 1 害斉 (J ^ 存 1 J / ί3& 性 1 ( V%)

濃度 ΚΡ43 KP1790 ΚΡ9860 添加 100 100 100

EDTA 5 110 97 101

EGTA 5 Q9 91 qn o—フエナン卜 Πリン 5 100 103 inn

DTT 5 104 102

P CMB 1 125 115 126

NEM 5 97 100 100

D F P 1 14 17

PMS F 1 0 ο 0 キモス夕チン 0.1 87 87 80 アンチパイン 0.1 103 99 97 ロイぺプチン 0.1 102 101 93

E - 6 4 0.1 104 99 103 エラス夕チナール 0.1 99 102 102

EDTA：エチレンジアミン 4酢酸製） EGTA：エチレングリコール 4酢酸製） DTT ：ジチオスレィトール

PCMB： p—クロロマ一キュリ安息香酸製） NEM ： N—ェチルマレイミド製） DFP ：ジィソプロピルフルオルリン酸製） PMSF：フエニルメタンスルホニルフルオリド製）界面活性剤の影響各種プロテアーゼを 0 . I moiZLトリスー塩酸緩衝液（pH 9 . 0 ) 中、 1 % の各種界面活性剤で 4 0 °C、 4時間の処理を行い、残存活性を測定した。残存活性は、処理時間 0分での酵素活性を 1 0 0 %とする相対値で表わした（表 5参照）。その結果、 3種類の酵素は、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸（L A S ) をはじめとする界面活性剤に非常に安定であることから、界面活性剤を含有する洗浄剤成分として有用であると考えられた。

表 5 界面活性剤存活性（％)

(濃度： 1 96) KP43 KP1790 KP9860

無添加 100 100 100

直鎖アルキルベンゼン 100 88 100

スルホン酸ナトリゥム（LAS)

ポリォキシエチレンアルキル 101 102 104

硫酸ナトリウム（ES)

ドデシル硫酸ナトリウム（SDS) 104 97 103

ひ一ォレフィンスルホン酸 100 111 100

ナ 1、リゥ厶（AOS)

アルキル硫酸ナトリウム（AS) 113 107 107

ひースノしホ脂肪酸エステル 112 113 105

(ひ一 SFE)

ソフタノール 7 0 H 109 109 104

処理条件： 1 %界面活性剤、 lOOm ホウ酸緩衝液（ρΗΙΟ. Ο)

40て、 4時間処理

( 8 ) 酸化剤の影響

各種プロテア一ゼを 5 0誦過酸化水素を含むプリットン ' ロビンソン緩衝液（pH 8 . 0 ) 中 3 0 °Cで処理を行い、経時的に残存活性を測定した。図 6に示すように、 3種の酵素は市販洗剤用酵素のサピナーゼゃ K A Pを大きく上回る安定性を示し、蛋白工学的手法を用いてサビナーゼに酸化剤耐性を付与したデュノルディスク社製）並の優れた安定性を示した。 ( 9 ) 脂肪酸の影響

結果を表 6に示すように、本発明アルカリプロテアーゼは、皮脂の成分の一つであるォレイン酸 1 0 mMの存在下で活性を全く失わなかつた。

表 6

脂肪酸存在下での相対活性（％)

ォレイン酸濃度（mM)

0 1 2 5 1 0

KP43プロテア一ゼ 100 100 100 103 119

KP1790プロテアーゼ 100 100 100 108 121

KP9860プロテアーゼ 100 100 100 100 106 実施例 5 (KP 9 8 6 0プロテア一ゼ遺伝子のクロ一二：

( 1 ) KS -KP 9 8 6 0株ゲノム DNAの調製法

KSM— KP 9 8 6 0株を液体培地（ 0. 5%グルコース、 0. 2%ポリぺプトン一 S、 0. 0 5 %酵母エキス、 0. 1 %KH₂P0₄ · 7 H₂〇、 0. 2 6% N a C 0 ： H 9. 0 ) 5 0 0 mLで 3 0 °C、 2日間培養した後、遠心分離により菌体を回収した。得られた菌体から、 Saito と Miura らの方法（Biochim. Biophyc. Actao， 72, 619(1963) ) らの方法によりゲノム DNAを調製した。

(2) KP 9 8 6 0プロテア一ゼの部分分解と分解産物の回収

1 ) 熱失活による KP 9 8 6 0プロテアーゼの変性

KP 9 8 6 0プロテア一ゼ（ 5mg/mL) 4 5 L

PMS F ( 1 0 OmM) 2 0 / L

EDTA (2 0 OnAO I 0 uh

上記の組成のプロテア一ゼ溶液を沸騰水中で 1 0分間加熱した。プロテアーゼ溶液を 2mM 酢酸アンモニゥ厶で透析し、 SDS、 EDTA、 PMSFを除いた後、凍結乾燥した後、 1 00 Lの蒸留水に溶解し、変性蛋白サ

2) トリプシンによる部分分解

変性蛋白サンプル 1 00〃L トリプシン（ 1〃 g/iriL, Sigma) 1 00〃 L

1 M Tr i s -HC (pH7. 5) 50〃L 蒸留水 750 L トリプシンを 1 ) で得られた変性蛋白サンプルに対して、上記の組成で氷中で

3時間作用させた。反応の停止は SDS ( 0. 0 8 mg/mL) 、 EDTA (20 0 mM) 、 PMS F ( 1 0 OmM) をそれぞれ 300〃 L、 1 00 / L、 200〃 L加え、沸騰水中で 3分間加熱することで行った。

2mM 酢酸アンモニゥムで透析し、 SDS、 EDTA, PMSFを除いた後、凍結乾燥した後、 1 00 Lの蒸留水に溶解し、 SDS— PAGE用のサンプ儿とした。

3 ) 部分分解物の回収

2) で得られたサンプルをレディゲル— J (Bio- Rad社製） 1 2 %で電気泳動し、 Qu i c k CBB染色液（Bio- Rad社製）で染色し蛋白バンドを検出した _c 蛋白バンド部分を剃刀で切り出し、 1. 5mLチューブ内で破砕後、 5倍量の S D S - PAG E泳動バッファー（組成はグリシン 1 4. 4 % '/V) 、 T r i sは 3. 03%、 SDS (Bio - Rad社製） 1 0 %) を加え、室温で攪拌し蛋白バンドを溶出させた。得られた溶出液を 2mM 酢酸アンモニゥ厶で透析、凍結乾燥して、プロテインシーケンサ一（Protein Sequencer 476A型： Appl ied Biosystem社製）を用いた解析に供した。

得られた部分分解物の N末端配列を図 7に示す。

(3) PCR

増幅すべき DNA領域のそれぞれの +鎖、一鎖の 5 ' 末端に相当する 20〜3 0塩基数のプライマ一（図 8) を合成し、铸型 DNA 1 00ng、プライマー 20 pmolを用いて PwoDNA polymerase (Boehringer mannheim社製）を用いて 1 00 〃 Lの反応系で P C R反応を行った。また、インバース P C Rを行う場合は Expand™long template PCR system (Boehringer mannheim社製）を用いて 5 0〃 Lの反応系で行った。図 8に示したプライマ一である 9 8 6 0—N 2と 9 8 60 - 25 k一 RVを用いた PCRにより、 527 bpの DN A断片を取得した。

(4) PCR産物のサブクロ一ニング

PCR産物 ¾rHigh pure PCR product purification kit (Boehringer mannheim 社製）を用いて精製した後、 pUC 1 8の Sma Iサイトにし igation kit ver. 2 (Takara社製）を用いて 1 6て、一夜反応により挿入した。得られた組換えプラスミドとコンビテントセル E. coli JM 1 0 9株（Takara社製）を混合し、 42°C、 4 5秒間のヒートショックを与え、 E. coli JM1 09株を形質転換した。菌液に LBを加え、 37でで 1時間保温した後に、 I PTG (0. 1 ml Sigma) 及び X— ga 1 [0. 004 % (w/v) 、 Sigma]ヽアンピシリン（50 1 g/mU Sigma) を含有する L Bプレートに塗布した。 37°Cで一夜培養し、生育したホワイトコロニーを組換えプラスミドが導入された形質転換体として選抜した。

( 5 ) 塩基配列の決定

形質転換体をアンピシリン 50 g/mしを含有した LBで 37°Cで一夜培養し、菌体を遠心分離により回収後、 High pure plasmid isolation kit を用いて (Boehringer mannheim社製）組換えプラスミドを得た。得られた組換えプラスミド 1 gを錄型として、プライマーと DNA Sequencing kit (PERKIN ELMER 社製）を用いて 2 0 / Lの反応系で PCR反応を行った。反応生成物を Quick spin column (Boehringer mannheim社製) を用いて精製した後に、遠心エバボレーターで乾燥させ、 DNASequencer 377型（Applied Biosystem社製）を用いた解析に供した。 PCRによって得られた DNA断片は、 KP— 98 60プロテアーゼの Ν末端配列に一致するアミノ酸配列を有し、サブチリシン等のアル力リプロテアーゼとの活性中心を構成する 3つのァミノ酸（As p、 H i s、 S e r) の内、 As p と H i s周辺の共通配列と考えられる配列が認められたことから、 KP— 9860プロテア一ゼ遺伝子の一部分であると考えられた。

( 6 ) サザンノヽイブリダイゼーシヨン

KP 9 8 6 0染色体を EcoR し Sac し pn し Hind ΠΙ、 BamH I、 Xho し Pst I、 Bgl Πを用いて処理し、得られた 527 bp DNAをプローブにサザンハイプリダイゼーシヨンを行い、相間性領域の検出を試みた。

その結果、 Kpn I を除く各々のレーンでハイブリダィズするバンドが認められ十-

(7) インバース PCR

得られた 527bpの配列から作製したプローブ 1〜4 (図 9) を用いてインバ —ス PC Rを行った。 KP— 9 8 60染色体を制限酵素 EcoR I, Hind III, Pstl, Bsl!iによる完全消化を行い、各々 Ligation Kit ver.2 (Takara社製）処理をキットに従って行った。得られた反応液をエタノール沈殿させ、インバース PCR 用铸型 DNAとした。 ^1, Hindlll, Ps , Bgl 11制限酵素処理ィンバース P CR用铸型 DNA 0. 1 id g. プライマー 1及び 4各 1 0 p mo と Expand long template PCR systemを用いて、 PCR反応（条件；（ 94 °C 1 0秒、 60 °C 30秒、 68 °C 4分） 1 0サイクル、（ 94 °C 1 0秒、 60で 30 秒、 68°C 4分 +2 O xサイクル数） 20サイクル、 68°C 7分、 4°C 1 分）を行った。又、 EcoRI制限酵素処理ィンバース PCR用铸型 DNA 0. 1 〃g、プライマー 2及び 3各 1 Op mo と Expand long template PCR system を用いて、 PCR反応（条件；同上）を行った。得られた増幅 DNA断片を High Pure PCR Product Purification Kit を用いて精製後、 DNA blunting Kit (Takara社製）を用いて末端を平滑化した。得られた DN A断片と制限酵素 Sma I処理した pUC l 8とを混合し、キットに従って Ligation Kit ver.2処理を行った。得られた、処理反応液を用いて大腸菌 JM 1 0 9株をコンセル法を用いて形質転換し、組換えプラスミドを取得した。得られた組換えブラスミドに揷入された DNA断片を上記に従ってシーケンスし、塩基配列の決定を行った。

(8) K P - 9 8 6 0プロテア—ゼ遺伝子の全塩基配列の解析

シーケンスの結果、 K P— 9 8 6 0プロテアーゼ遺伝子には 1 9 1 7 bp、 6 3 9アミノ酸残基をコードする Open Reading Frame (0RF) が存在し、 ORF中には精製酵素の N末端配列に一致する領域が存在した（NDVARHIVKADVAQSSYGLY) _c N末端配列から、成熟型プロテア—ゼは 1 3 0 2 bp, 4 34アミノ酸残基と推定された（配列番号 3、分子量 45310Da) 。また〇R Fの上流にはプロモーター領域（一 3 5領域： Ugtgt、一 1 0領域： tacgat) 及びリポソーム結合部位（SD 配列： aggagO と推定される配列が認められた。終止コドン (taa) の下流にはターミネ一夕一と推定される、 — 2 6. 2kcal/mol の自由エネルギーを有するィンバ一テツド ' リピートが存在した。

実施例 5と同様にして、 KP— 4 3プロテア一ゼ及び KP— 1 7 9 0プロテアーゼのそれぞれの遺伝子の全塩基配列及びアミノ酸配列を解析した。その結果を配列番号 4及び 5に示す。

実施例 6

洗浄試験：

J I S K 3 3 7 1に準じ洗浄試験を行った。洗浄系は、表 7記載の配合組成から成る洗剤を 7 1. 2mgC a C0₃/L (4° DH) の水にて使用濃度に溶解後、各種のプロテア一ゼをアンソン 'ヘモグロビン法で 4 OmAPU/Lとなるようにそれぞれ添加した（表 8参照）。

試験布は、ワイシャツの衿部分（3日間着用）とし、一対比較ができるように 8 X 8cm程に裁断後、酵素添加、あるいは酵素無添加の洗浄系にて夕ーゴトメ一夕一（上島製作所製）を使用し、 1 5°C、 1 0 Orpm で 1 0分間洗浄を行った。濯ぎ、乾燥後、一対の衿布（ 1 5組）を見比べ汚れ落ちの程度を肉眼で判定した _c

<

判定方法は、汚れがほぼ完全に落ちている場合を 5点、汚れがほとんど落ちていない場合を 1点とし、 1 5枚の衿布の合計評価点を求め、酵素無添加の洗浄系による評価点を 1 0 0とした場合の比率を洗浄力指数として表した。この結果を表 8に示す。表 7

(重量

成分（％) 洗剤 A 洗剤 B 洗剤 C

LAS 23.0 4.0 20.0

4 n

AE 5.0

AE P 5.0

AES 20.0

脂肪酸塩 3.0 2.5 2.0

ゼォライト 22.0 20.0

炭酸ナトリウム 15.0

炭酸カリウム 3.0

非晶質珪酸塩 7.0 7.0

結晶性珪酸塩 4.0

亜硫酸ナトリウム 2.0 0.5 2.0

硫酸ナトリウム 2.0 23.0

AA-MA 5.0

クェン酸 10.0

PEG 2.0 2.0

モノエタノールァミン 8.0

ェ夕ノ一ル 5.0

水分 3.0 残部 7.0

形態粒状液状粒状

使用濃度 20g/30L 20g/30L 40g/30L

洗濯後の pH 10.7 9.2 8.0

LAS：直鎖アルキル（ ₂— , ₄) ベンゼンスルホン酸ナトリウム

(液体洗剤は酸型で配合）

AS : ドデシルァルコ―ル硫酸ェステルナトリウム

AE ：ポリオキシエチレンラウリルエーテル（E0平均付加モル数 4) W

AEP ：ポリオキジエチレンポリオキシプロピレンラウリルエーテル

(E0平均付加モル数 8、 P0平均付加モル数 3)

AES ：ポ 1-12 ) エーテル硫酸ナトリウム

(E0平均付加モル数 2.5)

脂肪酸：ヤシ油由来脂肪酸ナトリウム

ゼォライト： 4 A型ゼォライト、平均粒径 3 m

炭酸ナトリウム：デンス灰

非晶質珪酸塩： J I S 2号珪酸ナトリウム

結晶性珪酸塩： S K S _ 6 (へキストトクャマ社製）粉砕品、

平均粒径 1 5 m

AA— MA ：ソカラン C P 5、アクリル酸一マ z酸共重合体

(BASF社製）

P E G ：ポリエチレリコール、平均分子量 8 0 0 0

表 8

表 8より、活性が同じ条件であっても、本発明品を配合した洗浄剤（洗剤 A) は、従来のプロテアーゼ配合洗浄剤より優れた洗浄力を有することが分かる。本発明品の優れた洗浄効果は、同様に、洗剤 B及び洗剤 Cでも得られる。

実施例 7 W 表 9に示す組成の洗浄剤 1 0 0重量部に、実施例 2又は 3で得られた Baci I lus sp. KSM-KP43, KSM- KP1790又は KSM-KP9860由来の本発明プロテアーゼ精製標品から特開昭 6 2 - 2 5 7 9 9 0号公報記載の方法に基づき調製した造粒物 ( 6 APU/g) を 1重量部配合して本発明の洗浄剤組成物を調製した。なお、粒状洗浄剤の場合には、酵素、 PC、 AC— 1、 AC— 2を除し、た成分で粒子化した洗剤生地に、酵素、 P C：、 AC - 1、 AC— 2をそれぞれ粒子化したものをブレンドすることにより製造した。各洗浄剤を 7 1. 2mgC a C0₃/L ( 4 ° DH) の水にて使用濃度に溶解後、実施例 6と同様にして衿布を洗浄した。得られた洗浄剤は優れた洗浄力を有し、衣料用洗浄剤として有用である。

表 9

LSA- 2 ： '酸（アルキル鎖の炭素数 10〜14) を 4 8

%N a OHで中和したもの

LAS- 3 "ホン酸（アルキル鎖の炭素数 10〜14) を 5 0

ΚΟΗで中和したもの

AS- 2 ：ドバノール 25サルフヱート（C₁₂〜C₁₅硫酸）のナトリウム塩

SAS ： C₁₃〜C₁₈アルカンスルホン酸ナトリウム

AOS ：アルファオレフィンスルホン酸ナトリウム

S FE ：パ一ム油由来、アルファスルホ脂肪酸メチルエステルナトリウム脂肪酸塩：パルミチン酸ナトリウム

AES- 2 ：ポ C₁₅) エーテル硫酸ナトリゥム（E0平均付加モル数 2)

AE- 3 ： C₁₂〜C_i3アルコールに E0を平均 3モル付加したもの

AE- 4 ： C_i2〜C₁₅アルコールに E0を平均 7. 2モル付加したもの

AE- 5 ： C ₁₂〜じ！ ₅2級アルコールに E0を平均 7モル付加したもの

AG ：アルキル（ヤシ油由来）グルコシド（平均重合度 1. 5 )

吸油性担体：非晶質アルミノ珪酸ツーダ、吸油能 2 3 5mL/100g

ί晶性珪酸塩： SKS - 6 (0 -Na₂S i ₂0_s. 結晶性層状シ、平均粒子径 20 jam)

非晶質珪酸塩： J I S 1号珪酸ナトリウム

STPP ：トリポリリン酸ナトリゥム

NT A：ニトリロトリ酢酸ナトリゥム

P A A ：ポリアクリル酸ナトリウム、平均分子量 1 2， 0 0 0

A A— M A：アタリル酸/マレィン酸共重合体

CMC ：カルボキシメチルセルロースナトリゥム

P E G ：ポリエチレングリコ一儿、平均分子量 6， 0 0 0

P V P ：ポリビニルピロリドン、平均分子量 4 0， 0 0 0、 K値 = 2 6〜 3 5 蛍光染料：チノパール CBSと、ホワイテックス S Aを重量比 1 ： 1で配合したもの（注意：液体洗剤の場合はチノパール CBSのみ配合）香料：特開平 8 - 23 9 7 0 0号公報の実施例記載の香料組成を使用酵素：リポラーゼ 1 0 0 T、夕一マミル 6 0 Τ、及び K AC 5 0 0 ® (花王㈱製）を重量比率で 1 ： 1 ： 1の割合で配合したもの

PC ：過炭酸ソーダ、平均粒子径 4 0 0 / m、メタホウ酸ソーダにて被覆したもの

AC— 1 ：テトラァセチルエチレンジァミン

AC— 2 ：ラウロイルォキシベンゼンスルホン酸ナトリゥム実施例 8

表 1 0に示す組成のうち、過炭酸ナトリウムと炭酸ナトリウム（デンス灰）を攪拌混合しながら、ポリアクリル酸ナトリウム 4 0 %水溶液及び直鎖ァルキルべンゼンスルホン酸ナトリウ厶又は非イオン性界面活性剤又はラウロイルォキンべンゼンスルホン酸ナトリゥ厶を添加した。次いで実施例 7で得られた BacUlus sp. KSM- KP43由来のアルカリプロテア一ゼ造粒物を添加し、全体的に均一になる程度に攪拌することにより、漂白剤を調製した。次いで、各漂白剤の 0. 5 %水溶液中に衿布を 2 0°C、 3 0分間浸漬後、洗剤 A (実施例 6参照）にてターゴトメーターで 1 0 0 r pm、 1 0分、 20°Cで洗浄した。得られた漂白剤は優れた漂白力を有し、衣料用漂白剤として有用である。

表 1 0

(重量％)

1)粒径 5 0 0〜 7 0 0〃m

2) リウム (炭素数 12〜14)

3)

（アルキル基の炭素数

12〜i4、 E0平均付加モル数 12)

平均分子量 8 , 0 0 0

実施例 9

表 1 iに示す組成の自動食器洗浄機用洗浄剤組成物を実施例 8と同様にして調製した。得られた自動食器洗浄機用洗浄剤組成物について、下記条件で洗浄力試験を行った。得られた洗浄剤は優れた洗浄力を有し、自動食器洗浄機用洗浄剤として有用である。表 1 1

1) ：ポリオキシエチレン—ポリオキシプロピレン共重合体

(平均分子量 2 0 0 0 )

2) ：炭素数 12 14の sec -アルコールのエチレンォキサイド 7モル、

及びプロピレンォキサイド 8 . 5モル付加物

3) ： J I S 2号珪酸ナトリウム

：ァクリル酸—マレィン酸共重合体

( 1 ) 汚染皿の調製

直径 2 5 cmの磁器製の皿に一枚当たり 2 . 5 gの卵黄を刷毛で均一に塗布し. 1 1 5 °Cに温めた乾燥機中で 6 0分乾燥させ、試験に供した。

( 2 ) 洗浄条件

使用洗浄機；松下電器㈱製全自動食器洗い機（機種 NP - 8 1 0)

洗浄；標準コース

洗浄用水；硬度 6 2. 3mgC a C0₃/L (3. 5° DH) の水

洗剤濃度； 0. 2重量％

( 3 ) 評価方法

汚染皿 5枚を洗浄機に入れ、上記の洗浄条件にて実施例の洗浄剤組成物を用いて洗浄を行った。洗浄後の皿を 1 %エリトロシン溶液を用いて蛋白染色し、残留する蛋白汚れを肉眼判定した。

実施例 1 0

表 1 2に示す各成分を用い、自動食器洗浄機用洗浄剤組成物を得た。これらの自動食器洗浄機用洗浄剤組成物を用いて、実施例 9と同様に洗浄力試験を行ったところ、いずれも優れた洗浄効果が得られた。

表 1 2

(重量

1) アクリル酸/マレイン酸共重合体 BAS F社製

2) 炭素数 12〜14の sec アルコールのエチレンオキサイド 7モル、及びプロピレンォキサイド 4. 5モル付加物

3,4) 合成例は特開平 6 - 1 7 9 8 9 9号公報に記載

実施例 1 1

前記洗剤 A (実施例 6参照）に下記表 1 3記載の配合量にて各種酵素を添加し、実施例 6と同様にしてワイシャツの衿部分を洗浄した。

表 1 3

(重量％) 本発明

酵素

27 28 29 30 31 32 33 本発明品プロテア一ゼ 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 従来プロテア一ゼ ²⁾ 0.6 0.6 0.6 セルラーゼ ³⁾ 0.7 0.7 0.7 リパーゼ 0.5 0.5

1) 実施例 2で得られた Bacillus sp. KSM- KP43株由来の本発明プロテ

ァーゼ精製標品から特開昭 62- 257990号公報に記載の方法に基づき調製した造粒物（6 APU/g)

2) 特開平 5- 25492号公報に記載のプロテアーゼ K- 16を特開昭 62- 257990号公報に記載の方法に基づき、 5APUノ gとしたもの

3) KAC- 500® (セルラ一ゼ、 5 00 UZg、花王㈱製）

4) Lipolase 100T® (ノボノルディスク社製）

その結果、本発明プロテア一ゼと従来プロテア一ゼ、セルラーゼ、又はリパーゼとを組合わせて用レ、ると洗浄効果がより向上する。

産業上の利用可能性

本発明のアルカリプロテアーゼは、各種の界面活性剤に極めて安定であり、月 H 肪酸耐性を有し、力、つ酸化剤にも高い安定性を有することから、漂白剤成分を含有する食器洗浄機用洗剤及び衣料用洗浄剤用の酵素として有用である。

Claims

1. 下記の理化学的性質を有するアル力リプロテアーゼ。

( i ) 作用 PH範囲：

pH4〜l 3の広い範囲で作用し、 pH6〜l 2で最適 pH活性値の 8 0 %以上を示す。

(ii) 安定 pH範囲：請

4 0 °C、 3 0分の処理条件で pH 6〜 1 1の範囲で安定である。

(iii) 等電点：

8. 9〜 9. 1付近。

囲

(iv) 脂肪酸の影響：

ォレイン酸によってカゼィン分解活性の阻害を受けない。

2. S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量が約 4 3 0 0 0である請求項 1記載のアル力リプロテアーゼ。

3. 配列番号 1又は 2で示されるアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列の 1若しくは 2以上のァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列を有するものである請求項 1又は 2記載のアル力リプロテアーゼ。

4 · 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載のァルカリプロテア—ゼをコ一ドする遺伝子。

5. 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載のアル力リプロテア一ゼを産生する微生物：:

6. 請求項 1〜 3のいずれか 1項記載のアル力リプロテアーゼを含有する洗浄剤組成物。