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Fibroblasts with a foreign gene-containing composition for treating wounds

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Publication number
WO1998048012A1
WO1998048012A1 PCT/EP1998/002038 EP9802038W WO9848012A1 WO 1998048012 A1 WO1998048012 A1 WO 1998048012A1 EP 9802038 W EP9802038 W EP 9802038W WO 9848012 A1 WO9848012 A1 WO 9848012A1
Authority
WO
Grant status
Application
Patent type
Prior art keywords
wounds
foreign
gene
fibroblasts
wound
Prior art date
Application number
PCT/EP1998/002038
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Roland Mertelsmann
Felicia Rosenthal
Peter Kulmburg
Björn G. STARK
Eszter Tanczos
Jürgen Kopp
Original Assignee
KLINIKUM DER ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITäT FREIBURG
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    • C12N2510/02Cells for production

Abstract

A composition for treating wounds comprises fibroblasts which contain at least one foreign gene coding for a cytokine that promotes wound healing and at least another component that promotes wound healing.

Description

Fibroblasten mit einem Fremdgen enthaltende Zusammensetzung zur Fibroblasts with a foreign gene-containing composition for

Behandlung von Wunden Treatment of wounds

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Behandlung von Schädigungen der Haut, die nur schwer behandelbar sind. The present invention relates to a composition for the treatment of skin damage, which are difficult to treat. Bei großflächigen Verbrennungen kann es ein erhebliches Problem darstellen, die durch die Schädigung zerstörten Hautbereiche wiederherzustellen, insbesondere wenn ganz überwiegende Teile der Haut schwer geschädigt sind. In extensive burns, it can be a significant problem, restore the destroyed by damaging skin areas, especially when overwhelming parts of the skin are severely damaged. Auch bei anderen Erkrankungen wie beispielsweise Tumorerkrankungen oder chronischen Hautschädigungen stellt es häufig ein ganz erhebliches Problem dar, die geschädigten Hautbereiche wiederherzustellen. In other diseases such as tumors or chronic skin damage, it is often constitute a very significant problem, restore the damaged skin areas.

Gentransfizierte Fibroblasten per se sind bereits aus dem Stand der Technik bekannt. Gene transfected fibroblasts per se are already known from the prior art. In der internationalen Patentanmeldung WO 95/07105 wird ein Verfahren zur Inhibierung oder Verhinderung des Wachstums von Tumorzellen im Zentralnervensystem eines Patienten beschrieben, bei dem die Immunantwort des Patienten stimuliert wird durch Immunisierung mit entweder gentransfizierten Tumorzellen oder unmodifizierten Tumorzellen und gentransfizierten autologen Fibroblasten. In the international patent application WO 95/07105 a method for inhibiting or preventing the growth of tumor cells is described in the central nervous system of a patient, wherein the patient's immune response is stimulated by immunization with either gene-transfected tumor cells or unmodified tumor cells and gene-transfected autologous fibroblasts. Bei den verwendeten Zytokinen handelt es sich in erster Linie um solche, die das Immunsystem stimulieren. The used cytokines are primarily those which stimulate the immune system. Die DE-OS 44 06 073, die ebenfalls im Namen des Klinikums der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg eingereicht wurde, betrifft ein allgemeines Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten sowie ein Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten. DE-A 44 06 073, which was also filed on behalf of the Hospital of the Albert-Ludwigs-University of Freiburg, relates to a general process for the production of human, clonogenic fibroblasts and a process for Gentransfizierung of fibroblasts. Nicht offenbart wird in dieser Anmeldung die topische Applikation oder die Gentransfizierung speziell mit solchen Genen, die die Wundheilung fördern. topical application or Gentransfizierung is not disclosed in this application specifically promote with such genes wound healing.

Die WO 92/15676 beschreibt die Verwendung von gentransfizierten Fibroblasten für die somatische Gentherapie. WO 92/15676 describes the use of gene-transfected fibroblasts for somatic gene therapy. Dabei werden die transfizierten Fibroblasten in einer extrazellulären Kollagenmatrix fixiert und unter der Haut implantiert. The transfected fibroblasts are fixed in an extracellular collagen matrix and implanted under the skin. Die Aufgabenstellung dieser Anmeldung zielt darauf hin, genetische Defekte in menschlichen Genom zu therapieren. The task of this application aims aim to treat genetic defects in the human genome. Dabei wird ein funktioneil aktives "Ersatz"-Gen in eine somatische Zelle eingebracht und dazu verwendet, den durch das defekte Gen entstehenden Schaden auszugleichen. In this case, a functionally active "spare" gene is introduced into a somatic cell and used to compensate for the damage caused by the defective gene. Nicht angesprochen ist in dieser Literaturstelle die Behandlung von Wunden oder die is not addressed in this reference, the treatment of wounds or

Wundheilung fördernde Zytokine, wie beispielsweise TGF-α, EGF oder b-FGF. Wound healing-promoting cytokines such as TGF-α, EGF or b-FGF. In der Entgegenhaltung werden vor allem Zytokine mit anderen biologischen Eigenschaften erwähnt, wie GM-CSF, TNF oder EPO. In the citation especially cytokines with other biological properties are mentioned, such as GM-CSF, TNF, or EPO. Der in Anspruch 5 erwähnte "fibroblast growth factor" wird als Blutgefäße bildende Substanz eingesetzt. The mentioned in claim 5 "fibroblast growth factor" is used as a blood vessels forming substance.

Auch verschiedene auf Keratinozyten einwirkende Wachtumsfaktoren sind bekannt. Also, various acts on keratinocytes growth factors are known. Gegenstand der WO 90/08771 ist die gentechnologische Bereitstellung von Wachstumsfaktor-Proteinen, die epiteliale Zellen beeinflussen. Subject of WO 90/08771 is the genetic engineering providing growth factor proteins that affect epiteliale cells. Bei dieser Anmeldung wird der menschliche Keratinozyten-Wachstumsfaktor aber als im wesentlichen reines Protein eingesetzt. In this application, the human keratinocyte growth factor but is used as a substantially pure protein.

In der US-Patentschrift 5,302,701 wird die Entwicklung eines künstlichen Polypeptids beschrieben, das sowohl zelladhäsiv ist, wie auch zellwachstu sfordernde Aktivität hat. In US Patent 5,302,701 the development of an artificial polypeptide is described which is both cell adhesive, as has also zellwachstu sfordernde activity. Es handelt sich hierbei um eine Kombination von Fibronektin und Fibroblast Growth Factor (FGF). This is a combination of fibronectin and fibroblast growth factor (FGF). Das US-Patent 5,196,196 betrifft zwar eine Wundauflage, die auch eine Trägermatrix umfaßt, jedoch besteht ein wesentlicher Unterschied zu der vorliegenden Erfindung hinsichtlich des Wirkungsprinzips und des aktiven Agens. Although U.S. Patent 5,196,196 relates to a wound dressing which comprises a carrier matrix, however, there is an essential difference from the present invention in terms of the operating principle and the active agent. In dem US-Patent wird bei der Wundauflage gereinigte Protease Nexin-I (PN-I) eingesetzt. In U.S. Patent purified protease nexin-I (PN-I) is used in the wound dressing. Hierbei handelt es sich aber nicht um einen Wachstumsfaktor, sondern um ein Enzym mit bestimmten Eigenschaften. But This is not a growth factor, but an enzyme with specific properties. Die Protease Nexin-I ist ein Serin-Protease- Inhibitor; The protease nexin-I is a serine protease inhibitor; ein Mitglied der Serin-Protease-Superfamilie, die durch menschliche Fibroblasten in Kultur synthetisiert und sekretiert wird. a member which is synthesized by human fibroblasts in culture and secreted serine protease superfamily. Bei dem US-Patent wird das Protein in gereinigter Form eingesetzt und nicht in der Form eines Gens, das durch Fibroblasten, in die dieses Gen eingebaut wurde, exprimiert wird. In the US patent, the protein is used in purified form and not in the form of a gene that is expressed by fibroblasts, into which this gene has been incorporated.

Aus dem Stand der Technik ist weiterhin die Verwendung von kultivierten autologen Keratinozyten, die in Fibrinkleber suspendiert sind, zur Behandlung von großflächigen Verbrennungswunden bekannt [Stark et al., Eur. J.Plast. From the prior art is the use of cultured autologous keratinocytes, which are suspended in fibrin glue, known for the treatment of large-area burn wounds [Stark et al., Eur. J.Plast. Surg. Surg. (1995) 18, S. 267-271]. (1995) 18, pp 267-271]. Es wurde auch bereits im Schweinemodell versucht, bei der Wundheilung Keratinozyten einzusetzen, die in situ mit Hilfe von Partikel-DNA-Transfer transfiziert wurden [Andree et al . An attempt was also already in the pig model to use keratinocytes in wound healing transfected in situ with the aid of particle-DNA transfer [Andree et al. , Proc.Natl .Acad.Sci. , Proc .Acad.Sci. USA, (1994) 91, S. 12188- 12192] . USA, (1994) 91, pp 12188- 12192].

Andreatta-van Leyen et al. Andreatta-van Leyen et al. [J. [J. Biomedical Materials Res., Vol. 27 (1993), S. 1201-1208] beschreiben eine Wundbandage, die gentransfizierte Keratinozyten umfaßt, die Rinderwachstumshormon (bGH) produzieren. Biomedical Materials Res., Vol. 27 (1993), pp 1201-1208] describe a wound bandage which comprises gene transfected keratinocytes, the bovine growth hormone (bGH) produce.

Die aus dem Stand der Technik bekannten Lösungsvorschläge greifen zum Teil auf Keratinozytenpräparationen (zB sog. Keratinozyten-Sheets) zurück, die sehr schwierig zu handhaben sind und oft erst dann verwendet werden können, wenn sich bei der Zellkultivierung räumliche Strukturen gebildet haben. Known from the prior art solutions fall in part to Keratinozytenpräparationen (eg, so-called. Keratinocyte sheets) returns that are very difficult to handle and can only be used often when spatial structures have formed in the cell cultivation. Es besteht die Gefahr, daß allogene Präparate, insbesondere solche, die von verschiedenen Spendern stammen und nicht charakterisiert sind, mit Viren (HIV, HCV oder noch nicht charakterisierte Viren) kontaminiert sind und, daß dadurch der zu behandelnde Patient infiziert werden kann. There is a risk that allogeneic preparations, in particular those derived from different donors and are not characterized with viruses (HIV, HCV or yet uncharacterized viruses) are contaminated and that can be infected by the patient to be treated.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Zusammensetzungen zur Behandlung von Wunden enthaltend Fibroblasten, die wenigstens ein Fremdgen kodierend für ein die Wundheilung förderndes Zytokin enthalten und wenigstens eine weitere die Wundheilung fördernde Komponente. Accordingly, the present invention provides compositions for treating wounds comprising fibroblasts, the coding include at least one foreign gene for a wound-healing promoting cytokine and at least one other wound healing promoting component. Darüber hinaus kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung weitere Bestandteile aufweisen, die üblicherweise in derartigen Zusammensetzungen verwendet werden. In addition, the composition of the invention may comprise other ingredients which are commonly used in such compositions.

Bei der weiteren die Wundheilung fördernden Komponente kann es sich um einen sogenannten Fibrinkleber handeln. Upon further promoting wound healing component may be a so-called fibrin glue. Derartige Fibrinkleber sind kommerziell erhältlich und werden in verschiedenen Bereichen der Medizin, insbesondere in der Chirurgie eingesetzt. Such fibrin glue are commercially available and are used in various fields of medicine, particularly in surgery.

Bei der Fibrinklebung wird im Prinzip die letzte Phase der Blutgerinnung benutzt. In the fibrin in principle the final phase of blood coagulation is used. Der Fibrinkleber beinhaltet Fibrinogen, das vom Thrombin zum monomeren Fibrin umgesetzt wird. The fibrin glue includes fibrinogen, which is converted by thrombin to fibrin monomers. Dieses wiederum bildet durch End-zu-End- bzw. Seit-zu-Seit-Anlagerung aggregiertes Fibrin. This in turn forms by end-to-end or side-to-side attachment aggregated fibrin. Außerdem beinhaltet der Fibrinkleber in bevorzugter Ausführungsform Fibronectin. In addition, the fibrin glue includes in a preferred embodiment of fibronectin. Gleichzeitig aktiviert Thrombin den Faktor XIII, der üblicherweise bei dem Fibrinkleber in ausreichender Menge vorhanden ist. At the same time, thrombin activates factor XIII, which is usually present in the fibrin sealant in sufficient quantity. Der Fibrinkleber beinhaltet als weitere Komponente eine Thrombinlösung, die häufig zusammen mit Kalziumchlorid als separate Komponente zugefügt wird. The fibrin glue contains as further component a thrombin solution, which is often added together with calcium chloride as a separate component.

Darüber hinaus kann der Fibrinkleber auch ausreichende Mengen an Albumin oder Plasminogen enthalten. In addition, the fibrin sealant may also contain sufficient amounts of albumin or plasminogen.

Bei der weiteren die Wundheilung fördernden Komponente kann es sich in einer bevorzugten Ausführungsform auch um einen festen Bestandteil handeln, der als Trägermatrix dient. In the further wound-healing promoting component can also be in a preferred embodiment by a fixed part, which serves as a support matrix. Derartige Träger für "künstliche Haut" sind kommerziell erhältlich (beispielsweise Laserskin® oder Biobrane®). Such carriers for "artificial skin" are commercially available (for example Laserskin® or Biobrane®). Bei den festen Komponenten kann es sich bevorzugt um eine Matrix aus einem Derivat der Hyaluronsäure handeln, vorzugsweise um einen Hyaluronsäureester. In the solid components can preferably be a matrix of a derivative of hyaluronic acid, preferably a Hyaluronsäureester. Bei der Hyaluronsäure handelt es sich um einen körpereigenen Bestandteil im Bindegewebe, der einer außerordentlich hohen Umsatzrate unterliegt. When hyaluronic acid is a component of the body's connective tissue that is subject to an extremely high turnover rate. Wenn also die Matrix aus Hyaluronsäure besteht, wird sie in der Wunde sehr rasch von der körpereigenen Hyaluronidase abgebaut. Thus, if the matrix is ​​composed of hyaluronic acid, it is broken down in the wound very quickly by the body's hyaluronidase. Daher werden erfindungsgemäß bevorzugt solche Derivate der Hyaluronsäure eingesetzt, die etwas langsamer im Körper abgebaut werden. Therefore, according to the invention preferred are those derivatives of hyaluronic acid used, which are somewhat more slowly degraded in the body.

Ein besonderer Vorteil, der durch die Verwendung einer Trägermatrix erzielt werden kann, ist, daß Zellen auf die Wunde aufgebracht werden können, die noch keinen zusammengewachsenen Zellverband bilden. A particular advantage which can be achieved by the use of a carrier matrix is ​​that cells can be applied to the wound, which still do not form a confluent cell cluster. Wenn bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung auch Keratinozyten eingesetzt werden, können diese mit Hilfe der Trägermatrix im subkonfluenten Zustand verwendet werden. Although keratinocytes are used in the inventive composition, these can be used with the carrier matrix in subconfluent state. Zu diesem Zeitpunkt befinden sie sich in ihrer optimalen Wachstumsphase , teilen sich noch sehr häufig und reagieren besonders gut auf die Zytokine, die von den gentransfizierten Fibroblasten produziert werden. At this time they are in their optimal growth phase, yet share very common and respond very well to the cytokines that are produced by the gene-transfected fibroblasts.

Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in einer bevorzugten Ausführungsfor auch Keratinozyten, und zwar bevorzugt autologe Keratinozyten umfassen. The inventive composition may also keratinocytes, in a preferred Ausführungsfor specifically include preferably autologous keratinocytes. Die Keratinozyten bilden insbesondere die äußere Hautschicht, die sogenannte Epidermis. The keratinocytes are in particular the outer layer of skin, called epidermis. Keratinozytenkulturen können nach einer an sich bekannten Routinetechnik kultiviert werden [zB Rheinwald et al. Keratinocyte cultures can be cultivated by a known routine technique [eg Rheinwald et al. Nature 265 (1977) S. 421-424]. Nature 265 (1977) pp 421-424]. Hierbei wird üblicherweise ein kleines Stück der Haut mittels Biopsie entfernt und dann werden Epidermis und Der is voneinander getrennt. In this case, a small piece of skin is usually removed by biopsy and then epidermis and is separated from each other. Aus der Epidermis wird eine Zellsuspension hergestellt, vorzugsweise durch Behandlung mit einem proteolytischen Enzym. From the epidermis, a cell suspension is prepared, preferably by treatment with a proteolytic enzyme. Die so erhaltenen einzelnen Zellen werden dann in Kulturbehältern (Flaschen oder Schalen) unter sterilen Bedingungen angezogen und zu einem geeigneten Zeitpunkt von den Kultivierungsbehältern abgelöst. The thus-obtained individual cells are then grown in culture containers (flasks or dishes) under sterile conditions and replaced at an appropriate time of the cultivation vessels. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung weist genetisch veränderte Fibroblasten auf. The composition of the invention comprises genetically modified fibroblasts. Fibroblasten sind dem Mesenc ym entstammende Zellen mit einem großen Zelleib und einem etwas abgeplatteten Kern. Fibroblasts are the Mesenc ym entstammende cells with a large cell body and a slightly flattened core. Die Fibroblasten sind insbesondere an der Bildung der Interzellularsubstanz des Bindegewebes beteiligt. The fibroblasts are particularly involved in the formation of the intercellular substance of connective tissue. Erfindungsgemäß können entweder autologe Fibroblasten eingesetzt werden oder in einer bevorzugten Form werden allogene Fibroblasten verwendet, die von einem anderen Individuum, also nicht dem zu behandelnden Patienten stammen. According to the invention, either autologous fibroblasts can be used alone or in a preferred form of allogeneic fibroblasts are used by another individual, not come to the patient to be treated. Ganz besonders bevorzugt werden solche Fibroblasten eingesetzt, die klonal selektiert wurden, dh von einem Klon abstammen. Very particularly preferably those fibroblasts are used which were clonally selected, ie derived from a clone.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die gentransfizierten Fibroblasten mit einer derartigen Dosis ionisierender Strahlen behandelt worden, daß sich die Fibroblasten nicht mehr vermehren können und nach einer gewissen Zeit absterben. In a particularly preferred embodiment, the gene-transfected fibroblasts were treated with a dose of ionizing radiation such that the fibroblasts can no longer multiply, and die after a certain time. Diese Bestrahlung hat den Vorteil, daß die gentransfizierten Zellen im Körper absterben, und zwar nach einer überschaubaren Zeit (< 3 Wochen). This radiation has the advantage that the gene-transfected cells die in the body, after a reasonable time (<3 weeks). Ein weiterer Vorteil der Verwendung bestrahlter Fibroblasten besteht darin, daß die so behandelten Zellen das Zytokin weiterhin gut exprimieren. Another advantage of the use of irradiated fibroblasts is that the so-treated cells continue to express the cytokine good.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden erfindungsgemäß Zellen von immortalisierten Fibroblastenzellinien verwendet, wobei sich eine Zellinie, die die Bezeichnung KMST-6 erhalten hat, besonders bewährt hat. In a particularly preferred embodiment, cells are immortalized fibroblast cell lines used by the present invention, wherein a cell line which has received the designation KMST-6, has proven particularly useful. Immortalisierte Fibroblastenzellinien sind vorteilhaft, da sie kontinuierlich kultiviert und biologisch genau charakterisiert verwendet werden können. Immortalized fibroblast cell lines are advantageous because they can be used continuously cultured and biologically well characterized. Ohne Schwierigkeiten können aber auch andere geeignete immortalisierte Fibroblastenzellinien verwendet werden. Without difficulty but other appropriate immortalized fibroblast cell lines can be used.

In die erfindungsgemäß eingesetzten Fibroblasten wird ein Fremdgen, das für ein geeignetes Zytokin kodiert, eingebracht. In the inventively used fibroblasts is a foreign gene that encodes a suitable cytokine, is introduced. Bevorzugt handelt es sich bei diesem Fremdgen um ein Gen, das für ein Zytokin wie EGF, TGF-α oder KGF kodiert. It is preferable that in this foreign gene is a gene encoding a cytokine, such as EGF, TGF-α or KGF. Der epidermale Wachstumsfaktor (epidermal growth factor) wird kurz als EGF bezeichnet. The epidermal growth factor (epidermal growth factor) is abbreviated as EGF. Es handelt sich hierbei um ein globuläres Protein von etwa 6,2 kDa, das 53 Aminosäuren aufweist. This is a globular protein of about 6.2 kDa, which has 53 amino acids. Erfindungsgemäß ist es nicht unbedingt erforderlich, daß das vollständige Gen in die transfizierten Fibroblasten eingebracht wird; According to the invention it is not essential that the complete gene is introduced into the transfected fibroblasts; es ist ausreichend, wenn derjenige Teil eingeführt wird, der die biologische Aktivität aufweist. it is sufficient if the part is introduced, which has the biological activity. Um eine Sekretion des biologisch aktiven Peptids zu ermöglichen, ist der entsprechende cDNA-Anteil bevorzugt In-Leserahmen mit der sekretorischen Signalsequenz des humanen G-CSF fusioniert. To allow secretion of the biologically active peptide, the corresponding cDNA moiety is preferably fused in-frame with the secretory signal sequence of the human G-CSF. Erfindungsgemäß werden bevorzugt auch EGF-ähnliche Proteine, wie beispielsweise der transformierende Wachstumsfaktor According to the invention are also preferred EGF-like proteins, such as transforming growth factor

( transforming growth factor) TGF-α, der eine hohe Homologie zu EGF aufweist, eingesetzt. (Transforming growth factor), TGF-α, which has a high homology to EGF, are used. Die biologische Aktivität von EGF und TGF-α ist vergleichbar. The biological activity of EGF and TGF-α is comparable. Beide Zytokine haben einen Einfluß auf die epidermale Entwicklung und die Differenzierung der Zellen. Both cytokines have an effect on the epidermal development and differentiation of the cells.

Bevorzugt eingesetzt werden kann auch NGF (nerve growth factor). may preferably be used also NGF (nerve growth factor). Dieses Zytokin ist vor allem verantwortlich für das Überleben, die Differenzierung und die funktioneile Aktivität von sensorischen und sympathischen Neuronen im peripheren Nervensystem. This cytokine is mainly responsible for the survival, differentiation and functional activity of sensory and sympathetic neurons in the peripheral nervous system. Der beschleunigende Effekt auf die Wundheilung dürfte auf die Fähigkeit von NGF zurückzuführen sein, das Überleben und die funktionellen Aktivitäten verschiedener immunkompetenter Zellen, wie Granulozyten, Mastzellen, Makrophagen und Ly phozyten zu steigern. The accelerating effect on wound healing may be due to the ability of NGF to increase the survival and functional activities of various immunocompetent cells, such as granulocytes, mast cells, macrophages and Ly phozyten.

Ein weiteres bevorzugt eingesetztes Zytokin ist der Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF), der insbesondere die Teilung von teilungsfähigen Keratinozyten stimuliert. Another preferred cytokine is employed the keratinocyte growth factor (KGF), which stimulates in particular the division of proliferating keratinocytes. Erfindungsgemäß können auch Varianten der Gene eingesetzt werden. According to the invention, variants of the genes may be employed. Derartige Varianten können Deletionen oder Anfügungen aufweisen und die Sequenz kann gezielt verändert sein. Such variants may comprise deletions or attachments, and the sequence can be specifically altered. Es ist auch durchaus möglich, solche Varianten von Zytokinen einzusetzen, die eine höhere biologische Aktivität aufweisen als die natürlich vorkommenden Zytokine, wie insbesondere Fusionskonstrukte von zwei oder mehr Zytokinen. It is also quite possible to use such variants of cytokines, which have a higher biological activity as the naturally occurring cytokines, such as in particular fusion constructs of two or more cytokines. Die erfindungsgemäß eingesetzten Fibroblasten enthalten ein Fremdgen, das für ein die Wundheilung förderndes Zytokin kodiert. The fibroblasts used in this invention contain a foreign gene coding for a wound-healing promoting cytokine. Dieses Fremdgen kann bevorzugt vom Menschen, aber auch von einem Tier, wie beispielsweise Maus oder Rind stammen. This foreign gene may preferably be human, but also from an animal such as a mouse or bovine derived. Voraussetzung ist aber, daß das Zytokin dann nicht Speziesspezifisch ist, wenn das Fremdgen von einer anderen Spezies herstammt. However, a prerequisite is that the cytokine is then not species specific, when the foreign gene from another species originated.

Es ist erforderlich, daß das Fremdgen in die Fibroblasten eingebracht wird. It is necessary that the foreign gene is introduced into fibroblasts. Dies kann dadurch bewirkt werden, daß das gewünschte Gen in einen geeigneten Vektor eingebaut wird und dann in die Fibroblasten transfiziert wird. This can be effected in that the desired gene is incorporated into a suitable vector and then transfected into the fibroblasts. Als Vektoren eignen sich virale Vektoren oder Plasmidvektoren, wobei die Plasmidvektoren besonders bevorzugt sind, da bei viralen Vektoren zusätzliche Untersuchungen zum Ausschluß von Kontamination mit replikationskompetenten Viren durchgeführt werden müssen. Suitable vectors are viral vectors or plasmid vectors, the plasmid vectors are especially preferred as must be carried out in viral vectors additional tests to rule out contamination with replication-competent viruses.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen weisen verschiedene Vorteile auf gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Lösungen. The compositions of the invention have several advantages over the methods known from the prior art solutions.

Durch die genveränderten Fibroblasten, die in bevorzugter Ausführungsform lethal bestrahlt wurden, kann für eine vorbestimmte Zeit das oder die gewünschten Zytokine exprimiert und in das Gewebe abgegeben werden. By genetically modified fibroblasts, which were irradiated in a preferred embodiment lethal, can be expressed or the desired cytokines for a predetermined time and released into the tissue. Aufgrund der kontinuierlichen Produktion des Zytokins können die Probleme umgangen werden, die auf die kurze Halbwertszeit von Zytokinen bei lokaler externer Applikation zurückzuführen sind. Due to the continuous production of the cytokine, the problems can be avoided, due to the short half-life of cytokines in the local external application. Bei den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können verschiedene Zelltypen (Keratinozyten/Fibroblasten) miteinander kombiniert werden, wobei die gentransfizierten Fibroblasten auch unterschiedliche Zytokine beinhalten können. In the inventive compositions, different types of cells (keratinocytes / fibroblasts) can be combined with each other, wherein the gene-transfected fibroblasts can also include different cytokines. Dadurch können gezielt verschiedene Wachstumsfaktoren in den Wundbereich eingebracht werden. Thereby, various growth factors can be introduced into the wound area targeted. Wenn autologe Keratinozyten verwendet werden, kann die Histoinkompatibilitätsabstoßungsreaktion vermieden werden. If autologous keratinocytes are used, the Histoinkompatibilitätsabstoßungsreaktion can be avoided. Es ist auch denkbar, zusätzlich Gene für Wachstumsfaktoren einzuführen, die auf weiße Blutkörperchen wirken, wie beispielsweise G-CSF oder GM-CSF, um dadurch die körpereigene Immunabwehr in den Wundbereichen zu stimulieren. It is also possible to additionally introduce genes for growth factors that act on white blood cells, such as G-CSF or GM-CSF, to thereby stimulate the body's immune system into the wound areas. Dadurch kann die körpereigene Abwehr gegenüber Infektionen gestärkt werden, was insbesondere bei Verbrennungswunden relevant ist. Thus, the body's defenses can be strengthened to infection, which is especially relevant for burn wounds.

Es ist auch durchaus möglich, die erfindungsgemäße Zusammensetzung ohne Keratinozyten einzusetzen. It is also quite possible to use the composition according to the invention without keratinocytes. In diesem Fall wird durch die genveränderten Fibroblasten das Zytokin in die Umgebung abgegeben und es werden diejenigen Keratinozyten des behandelten Patienten stimuliert, die sich beispielsweise in den Randbereichen der Wunde finden. In this case, the cytokine is released into the environment by genetically modified fibroblasts and keratinocytes are stimulated those of the treated patients are found for example in the peripheral areas of the wound.

Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen liegen bevorzugt in Form von pharmazeutisch annehmbaren Formulierungen vor. The compositions of the invention are preferably in the form of pharmaceutically acceptable formulations. Hierbei kann es sich entweder um Suspensionen von Fibrinkleber und gentransfizierten Fibroblasten handeln, die als Lösungen, Suspensionen, Salben oder in Form von Gelen auf die Wunde aufgebracht werden können. This can be either suspensions of fibrin glue and gene-transfected fibroblasts, which can be applied as solutions, suspensions, ointments, or in the form of gels on the wound. Wenn es sich um eine Zusammensetzung handelt, die eine feste Komponente, also eine Trägermatrix aufweist, dann liegen diese Zusammensetzungen bevorzugt in Form von sterilen Einheiten vor, die in geeigneter Art und Weise konserviert werden. If it is a composition which are a fixed component, ie having a carrier matrix then these compositions preferably in the form of sterile units, which are conserved in a suitable manner. Derartige Präparate können beispielsweise in Form von tiefgefrorenen, sterilen Auflagen vorliegen. Such preparations may be, for example, in the form of deep-frozen sterile conditions.

Beschreibung der Figure Description of the Figure

Figur 1 zeigt die Struktur des Expressionsvektors für humanes EGF. Figure 1 shows the structure of the expression vector for human EGF. Teil (A) zeigt die Plasmidkonstruktion mit dem Chimären EGF-Gen. Part (A) shows the plasmid with the chimeric EGF gene. Teil (B) zeigt die Sequenz der Fusion im Leserahmen zwischen der humanen G-CSF-Signalsequenz (unterstrichen) und der reifen für humanes EGF kodierenden Region (Asn Ser Asp ...). Part (B) shows the sequence of in-frame fusion between the human G-CSF signal sequence (underlined) and the mature coding for human EGF region (Asn Ser Asp ...).

Figur 2 zeigt die Sekretion von EGF von Fibroblasten, die mit dem Plas id pCMV-EGF-IRES-TKNeo transfizierten wurden. Figure 2 shows the secretion of EGF by fibroblasts transfected with the EGF-Plas id pCMV-IRES-TKNeo. Es handelt sich hierbei um Fibroblasten der Zellinie KMST-6 nach Bestrahlung (100 Gy) . This is to fibroblast cell line KMST-6 after irradiation (100 Gy). Bei dem Versuch wurden 2 x 10 bestrahlte Zellen in Kulturplatten mit sechs Löchern ausgesät und die EGF- Konzentration wurde in Kulturüberständen nach 24 Stunden bestimmt. In the experiment, 2 x 10 were seeded irradiated cells in culture plates with six holes and the EGF concentration was determined in culture supernatants after 24 hours. Die Werte stellen Durchschnittswerte dar. Values ​​represent averages.

Figur 3 zeigt die Bioaktivität von chimären EGF-Polypeptiden, die von den Klonen #3 und #6 von gentransfizierten KMST-6- Fibroblasten erhalten wurden. Figure 3 shows the bioactivity of EGF chimeric polypeptides obtained from clones # 3 and # 6 of gene-transfected KMST-6 fibroblasts.

Teil (A) zeigt die Bioaktivität an Mäusekeratinozyten vom Stamm BALB/MK. Part (A) shows the bioactivity of Mäusekeratinozyten from BALB / MK.

Teil (B) zeigt die Ergebnisse, die mit Hilfe von menschlichen primären Keratinozyten erhalten wurden. Part (B) shows the results obtained with the aid of human primary keratinocytes. Die Werte geben die Durchschnittsergebnisse von acht Messungen mit Standardabweichung an. The figures indicate the average results of eight measurements with standard deviation. Die gepunkteten Balken stellen die Eichkurve dar, die mit rekombinantem EGF erhalten wurden. The dotted bars represent the standard curve obtained with recombinant EGF. Die leeren Balken stellen die Kontrollwerte dar, erhalten mit Fibroblasten der Zellinie KMST-6. The open bars represent control values ​​obtained with fibroblasts of the cell line-KMST. 6 Die gestreiften und grauen Balken stellen die Ergebnisse dar, die mit Kulturüberständen beider Klone 3 bzw. 6 erhalten wurden. The striped and gray bars represent the results obtained with culture supernatants of both clones 3 and 6 respectively.

Figur 4 zeigt die Proliferation von primären menschlichen Keratinozyten im Kulturtest mit bestrahlten Fibroblasten der Zellinie KMST-6 , die gentransfiziert wurden. Figure 4 shows the proliferation of primary human keratinocytes in culture test with irradiated fibroblasts of the cell line KMST-6, which were gentransfiziert.

Teil (A) zeigt die Ergebnisse nach vier Tagen Co-Kultur. Part (A) shows the results after four days of co-culture.

Teil (B) zeigt die Ergebnisse nach 10 Tagen Co-Kultur. Part (B) shows the results after 10 days of co-culture.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgend aufgeführten Beispiele weiter erläutert: The present invention is further illustrated by the following examples:

Beispiel 1 example 1

Konstruktion eines Plasmids enthaltend ein Gen für EGF und Transfektion In den meisten menschlichen Zellen wird EGF als ein 130 kDa Transme branglycoprotein-Precursormolekül synthetisiert, das proteolytisch gespalten wird in das biologisch aktive 6,2 kDa EGF-Peptid mit 53 Aminosäuren. Construction of a plasmid containing a gene for EGF and transfection in most human cells is synthesized as a 130 kDa precursor molecule Transme branglycoprotein-EGF, which is proteolytically cleaved in the biologically active EGF 6.2 kDa peptide of 53 amino acids. Erfindungsgemäß wurde daher ein chimäres Konstrukt hergestellt, das für eine In-Leserah en-Fusion des reifen EGF-Peptids und die menschliche G-CSF sekretorische Signalsequenz kodiert. According to the invention, therefore, a chimeric construct was prepared which codes for an in-Leserah en fusion of the mature EGF peptide and human G-CSF secretory signal sequence. Der Aufbau ist schematisch in Figur 1 (A) dargestellt. The structure is shown schematically in Figure 1 (A). Das dabei entstandene DNA-Fusionsfragment wurde unter die transkriptioneile Kontrolle des menschlichen CMV (Cytomegalievirus) -Promotors gestellt und in einen dicistronischen Vektor eingebaut, um die Expression des Transgens an die des Selektionsmarkers Neomycin-Phosphor- Transferase zu binden. The thereby resulting DNA fusion fragment was placed under the transcriptional control of the human CMV (cytomegalovirus) promoter and incorporated into a dicistronic vector to bind the expression of the transgene to the selection marker neomycin transferase phosphorus.

Bei der Klonierung wurde die für das reife menschliche EGF- Peptid kodierende Sequenz mit Hilfe der PCR-Technologie amplifiziert und das dabei erhaltene Produkt in dem Vektor pBluescript (Stratagene) subkloniert und anschließend sequenziert. In cloning the DNA encoding the mature human EGF peptide sequence was amplified by PCR technology, and the product thereby obtained in the vector pBluescript (Stratagene) and then sequenced. Ebenso wurde die menschliche G-CSF-Signalsequenz aus menschlicher G-CSF cDNA mit Hilfe der PCR-Technologie amplifiziert, wobei eine verbesserte Kozak-Konsensus-Sequenz am 5 ' -Ende und eine einzelne Nhel Restriktionsschnittstelle geschaffen wurden. Similarly, the human G-CSF signal sequence was amplified from human G-CSF cDNA by PCR technology, in which an improved Kozak consensus sequence at the 5 'end and a single Nhel restriction site was created. Die relevante Sequenz ist in Figur 1 (B) dargestellt. The relevant sequence is shown in Figure 1 (B).

Das so erzeugte Plasmid wurde in menschliche Fibroblasten der Zellinie KMST-6 transfiziert und alle Neomycin-resistenten Klone sekretierten menschliches EGF, was durch einen ELISA-Test nachgewiesen wurde. The plasmid thus generated was transfected into human fibroblast cell line KMST-6 and all neomycin-resistant clones secreted human EGF, which was detected by an ELISA assay. Die Kontrolle zeigte, daß nicht transfizierte menschliche Fibroblasten der Zellinie KMST-6 keine nachweisbare Mengen an hEGF sowohl vor als auch nach Bestrahlung sekretierten. The control showed that untransfected human fibroblasts of the cell line KMST-6 secreted no detectable amounts of hEGF, both before and after irradiation.

Für die weiteren Untersuchungen wurden die Klone #3 und #6 verwendet, die 37 bzw. 8 ng EGF/10 6 Zellen und 24 Stunden sekretierten. The clones were # 3 and # 6 are used for the further investigations, the secreted 37 and 8 ng EGF / 10 6 cells and 24 hours. Die Sekretion von menschlichem EGF in den Überstand durch transfizierte Fibroblasten wurde mit Hilfe der ELISA-Technik (Quantikine, R & D Systems) bestimmt. The secretion of human EGF in the supernatant by transfected fibroblasts was determined using the ELISA technique (Quantikine, R & D Systems). Es wurde der Überstand von bestrahlten oder nicht bestrahlten Ausgangszellen oder EGF-gentransfizierten Zellen nach 24 Stunden entnommen und hinsichtlich der EGF-Produktion untersucht, nachdem die Anzahl der lebensfähigen Zellen bestimmt wurde. the supernatant from irradiated or non-irradiated output cells or EGF gene-transfected cells, it was taken out after 24 hours and tested for the EGF production, after the number of viable cells was determined.

Eine Bestrahlung wurde bei Raumtemperatur mit einer 137Cs- Bestrahlungsquelle mit einer Dosisrate von 3 Gy/Minute durchgeführt. Irradiation was performed at room temperature with a 137Cs- radiation source at a dose rate of 3 Gy / minute.

Beispiel 2 example 2

Einfluß einer lethalen Bestrahlung auf die Expression von chimärem EGF-Protein durch gentransf izierte Fibroblasten Influence of lethal irradiation on the expression of EGF chimeric protein by fibroblasts gentransf ied

Für optimale Wundheilungsergebnisse ist es erforderlich, daß EGF in den ersten Tagen der Behandlung zur Verfügung steht. For optimal wound healing results, it is necessary that EGF is on sale in the first days of treatment. Andererseits kann durch eine lethale Bestrahlung das unkontrollierte in vivo-Wachstum von genetisch modifizierten Zellen verhindert werden. On the other hand, can be prevented by lethal irradiation, the uncontrolled in vivo growth of genetically modified cells. Es wurde daher der Einfluß einer lethalen Bestrahlung auf die Expression von EGF untersucht, wobei KMST-6 Fibroblasten (Klon #3, transfiziert mit dem Plasmid pCMV-EGF-IRES-TKNeo) untersucht wurden. the influence of lethal irradiation on the expression of EGF It was therefore investigated, wherein KMST-6 fibroblasts (clone # 3, transfected with the plasmid pCMV-EGF-IRES-TKNeo) were examined. Es wurde gefunden, daß nach Bestrahlung mit 100 Gy die Sekretion von EGF langsam absank, aber im Überstand über mindestens sieben Tage in vitro nachweisbar war. It was found that after irradiation with 100 Gy the secretion of EGF slowly dropped, but at least seven days was detectable in the supernatant in vitro. Die Ergebnisse sind in Figur 2 zusammengefaßt. The results are summarized in Fig. 2

Beispiel 3 example 3

Biologische Aktivität des Chimären EGF-Polypeptids Biological activity of chimeric EGF polypeptide

Um nachzuweisen, daß das EGF-Protein, das von den transfizierten Fibroblasten sekretiert wird, auch tatsächlich die biologische Aktivität aufweist, wurden die Überstände der Medien von den EGF-gentransfizierten Klonen auf die mitogene Aktivität überprüft an permanenten Mäusekeratinozyten-Zellinien und an primären humanen Keratinozyten. In order to demonstrate that the EGF protein, which is secreted by the transfected fibroblasts, actually having the biological activity, the supernatants of the media were checked by the EGF gene-transfected clones on the mitogenic activity of permanent Mäusekeratinozyten cell lines and primary human keratinocytes , Zur Kontrolle wurden verschiedene Konzentration von rekombinantem humanem EGF eingesetzt. To control various concentrations of recombinant human EGF were employed. Beide Zelltypen wurden sowohl durch das rekombinante Protein als auch durch die Kulturüberstände der Klone #3 und #6 in dosisabhängiger Weise stimuliert. Both cell types were stimulated in a dose dependent manner by both the recombinant protein as well as by the culture supernatants of clones # 3 and # 6. Eine optimale Stimulation der Mäusekeratinozyten wurde bei einer Konzentration zwischen 2 und 20 ng/ml rekombinantem hEGF beobachtet. An optimal stimulation of Mäusekeratinozyten was used at a concentration between 2 and 20 ng / ml of recombinant hEGF observed. Dies entspricht der Stimulation, erreichbar durch eine 1:5 Verdünnung des Kulturüberstandes. This corresponds to the stimulation, accessible by a 1: 5 dilution of culture supernatant. Die Ergebnisse sind in Figur 3 (A) dargestellt. The results are shown in Figure 3 (A).

Bei Verwendung von primären humanen Keratinozyten war die effektive Dosis geringfügig niedriger und es wurde eine optimale Proliferation bereits bei 0,2 ng/ml an rEGF und bei einer 1:50 Verdünnung des Kulturüberstandes des Klons pCMV-EGF-IRES- TKNeo/KMST6#3 beobachtet. When using primary human keratinocytes, the effective dose was slightly lower and there was an optimal proliferation already at 0.2 ng / ml rEGF and at a 1:50 dilution of the culture supernatant of the clone pCMV-EGF-IRES TKNeo / KMST6 # 3 observed. Die Ergebnisse sind in Figur 3 (B) dargestellt. The results are shown in Figure 3 (B). Bei beiden Tests konnte die Tendenz beobachtet werden, daß das Zellwachstu bei höheren Konzentrationen inhibiert wurde. In both tests, the tendency was observed that the Zellwachstu was inhibited at higher concentrations. Kulturüberstände von nicht transfizierten Fibroblasten der Zellinie KMST-6 zeigten keine Stimulierung der Proliferation im Vergleich mit Zellkulturüberständen ohne zugesetzten Wachstumsfaktor. Culture supernatants from non-transfected fibroblasts of the cell line KMST-6 showed no stimulation of the proliferation in comparison with cell culture supernatants without added growth factor. Um die therapeutische Wirksamkeit bei der Wundheilung genauer zu untersuchen, wurden lethal bestrahlte EGF-gentransfizierte Fibroblasten in vitro co- kultiviert mit primären humanen Keratinozyten. In order to investigate the therapeutic efficacy in wound healing in more detail, were lethally irradiated EGF gene transfected fibroblasts in vitro co-cultured with primary human keratinocytes. Bei den Versuchen zeigte sich, daß nach einer Inkubationszeit von vier Tagen mit verschiedenen Konzentrationen von bestrahlten EGF sezernierenden Fibroblasten eine dosisabhängige Stimulation der Keratinozytenproliferation ähnlich derjenigen erhalten werden konnte, die durch rekombinanten Wachstumsfaktor induziert wurde. In the experiments, it was found that a dose dependent stimulation of keratinocyte proliferation that was similar after an incubation period of four days with various concentrations of EGF irradiated secreting fibroblasts are obtained, which was induced by the recombinant growth factor. Dies ist in Figur 4 dargestellt, wobei Figur 4 (A) die Werte zeigt nach vier Tagen Co-Kultivierung und die Figur 4 (B) zeigt die Werte nach 10 Tagen Co-Kultivierung. This is illustrated in Figure 4, wherein Figure 4 (A) shows the values ​​after four days of co-cultivation and the Figure 4 (B) shows the values ​​after 10 days of co-cultivation. Beispiel 4 example 4

Nachweis der in vivo EGF -Produktion durch in vitro liposomal transfizierte KMST-6 Zellen Detection of in vivo EGF production by in vitro liposomal transfected KMST-6 cells

Versuchsauf bau Versuchsauf construction

1,5 x 1,5 cm große Vollhautwunden wurden auf dem Rücken von 42 Nacktmäusen erzeugt. 1.5 x 1.5 cm full-thickness skin wounds were created on the back of 42 nude mice. 9,4 x 10 hEGF-transfizierte und letal bestrahlte KMST-6 Zellen wurden in 2,8 ml Fibrinkleber suspendiert und auf die Vollhautwunden von 14 Nacktmäusen 9.4 x 10 hEGF-transfected and lethally irradiated KMST-6 cells were suspended in 2.8 ml of fibrin glue and on the full-thickness skin wounds of 14 nude mice

2 transplantiert (300 000 Zellen/cm , Gruppe I). 2 transplanted (300 000 cells / cm, Group I).

Als Kontrollen dienten 14 Vollhautwunden, transplantiert mit untransfizierten KMST-6 Zellen (300 000 Zellen/cm 2 , Gruppe II) sowie 14 unbehandelte Vollhautwunden (Gruppe III). 14 were full-thickness skin wounds than controls transplanted with untransfected KMST-6 cells (300,000 cells / cm 2, Group II) and 14 untreated whole skin wounds (Group III).

Am Tag 1, 2, 3, 4, 5, 7 und 14 wurden aus jeder Gruppe jeweils zwei Tiere nekropsiert und 0,8 g Wundgewebe mit einem Triton-X- PBS Puffer homogenisiert. On day 1, 2, 3, 4, 5, 7 and 14 respectively, two animals were necropsied from each group and homogenized 0.8 g wound tissue with a Triton X-PBS buffer. Die Homogenisate wurden zentrifugiert und die EGF-Konzentration der Überstände mit Hilfe eines anti- human-EGF ELISA ausgewertet. The homogenates were centrifuged and analyzed the EGF concentration in the supernatants by means of an anti-human EGF ELISA.

.Ergebnisse .Results

In vivo waren in der Gruppe I (erfindungsgemäß) am Tag 1 470 pg/ml detektierbar, verglichen mit 18 pg/ml in Gruppe II und 1,3 pg/ml in Gruppe III. In vivo were in group I (Invention) day 1 470 pg / ml detected, compared with 18 pg / ml in group II and 1.3 pg / ml in group III. An den Tagen 2-7 sanken die EGF- Konzentrationen in der Gruppe I, waren jedoch significant höher als in den Kontrollgruppen. On days 2-7, the EGF concentrations decreased in group I, but were significant higher than in the control groups. Am Tag 14 war kein EGF in allen drei Gruppen detektierbar. On day 14, no EGF was detectable in all three groups.

Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, daß in vitro EGF- transfizierte Fibroblasten in einer Fibrinkleber-Suspension erfolgreich transplantiert werden konnten. In summary, these results indicate that in vitro EGF-transfected fibroblasts were successfully transplanted into a fibrin glue suspension. Das transgene Protein war zumindest bis Tag 7 in vivo nachweisbar. The transgenic protein was detectable at least until day 7 in vivo. Die bei dem Versuch erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengefaßt. The results obtained in the experiment are summarized in Table I below.

Tabelle I table I.

Tage pCMV-EGF-IRES- KMST6 unbehandelte TKNeo/KMST6#3 Kontrolle Vollhaut¬ Days pCMV-EGF-IRES KMST6 untreated TKNeo / KMST6 # 3 control Vollhaut¬

(transplantiert wunden erfindungsgemäß mit untransfizierten (Gruppe III) (Transplanted wounds according to the invention with untransfected (group) III

KMST6-Zellen, KMST6 cells

Gruppe II ) Group II)

1 470 18 1,3 1 470 18 1.3

2 393 58 1,6 2 393 58 1.6

3 330 28 2,3 3330 28 2.3

4 150 8 6,5 4150 8 6.5

5 180 8,5 8 5180 8.5 8

7 140 8,3 2,6 7140 8.3 2.6

14 0,4 0 0 14 0.4 0 0

Tabelle I zeigt die hEGF-Freisetzung in pg/ml in vivo in Wunden durch bestrahlte KMST6-Fibroblasten, die mit chimärem hEGF-Gen transfiziert wurden. Table I shows the release hEGF in pg / ml in vivo in wounds by irradiated KMST6 fibroblasts which have been transfected with chimeric hEGF gene.

Beispiel 5 example 5

Wundheilungs fördernder Effekt nach Transplantation von in vitro EGF -transf izierten KMST-6 Zellen in Kombination mit humanen Keratinozyten (Mischzelltransplantation) Wound healing promoting effect after transplantation of in vitro EGF -transf izierten KMST-6 cells in combination with human keratinocytes (mixed cell transplantation)

Versuchsaufbau experimental setup

1,5 x 1,5 cm große Vollhautwunden wurden auf den Rücken von 72 Nacktmäusen erzeugt. 1.5 x 1.5 cm full-thickness skin wounds were created on the back of 72 nude mice. 1,0125 x 10 EGF-transfizierte und letal bestrahlte KMST-6 Zellen wurden in Kombination mit 2,025 x 10 humanen Keratinozyten in 3,6 ml Fibrinkleber suspendiert und auf Vollhautwunden von 18 Nacktmäusen transplantiert (Ratio 1:2, 75 000 Zellen/cm 2 , Gruppe I). 1.0125 x 10 EGF-transfected and lethally irradiated KMST-6 cells were suspended in combination with 2.025 x 10 human keratinocytes in 3.6 ml of fibrin glue and on full-thickness skin wounds of 18 nude mice transplanted (Ratio 1: 2, 75 000 cells / cm 2 , group I). Als Kontrolle dienten 18 Vollhautwunden, transplantiert mit EGF-transfizierten KMST-6 Zellen alleine (25 000 Zellen/cm, Gruppe II), 18 Vollhautwunden, transplantiert mit humanener As a control, were 18 full thickness wounds, transplanted with EGF-transfected KMST-6 cells alone (25,000 cells / cm, Group II), 18 full-thickness skin wounds with transplanted humanener

2 2

Keratinozyten alleine (50 000 Zellen/cm , Gruppe III) sowie 18 Vollhautwunden transplantiert mit nicht transfizierten KMST-6 Keratinocytes alone (50,000 cells / cm, group III) as well as 18 full-thickness skin wounds transplanted with non-transfected KMST-6

Zellen in Kombination mit humaner Keratinozyten (Ratio 1:2, 7 755 000000 ZZeelllleenn//ccm 2 , Gruppe IV). Cells in combination with human keratinocytes (Ratio 1: 2, 7755 000000 ZZeelllleenn cc // 2, Group IV). Tabelle II zeigt die Gruppenaufteilung. Table II shows the group division.

Tabelle II table II

Figure imgf000018_0001

Am Tag 1, 3, 5, 7, 10 und 12 wurde aus jeder Gruppe jeweils ein Tier nekropsiert und 0 , 8g Wundgewebe mit einem Triton-X-PBS Puffer homogenisiert. On day 1, 3, 5, 7, 10 and 12, one animal from each group was necropsied and 0, 8g wound tissue was homogenized with a Triton X-PBS buffer. Die Homogenisate wurden zentrifugiert und die EGF-Konzentration der Überstände mit Hilfe eines anti-human- EGF ELISA ausgewertet. The homogenates were centrifuged and analyzed the EGF concentration of the supernatants using an anti-human EGF ELISA. Die andere Hälfte der Biopsien wurde beginnend mit Tag 5 für die histologischen Untersuchungen verwendet . The other half of the biopsies was starting with day 5 used for histological examinations.

An den post-OP-Tagen 7, 10, 12, 14, 17 und 21 wurden jeweils Biopsien von zwei weiteren Tieren aus jeder Gruppe histologisch untersucht. each biopsies of two additional animals from each group were examined histologically at the post-surgical days 7, 10, 12, 14, 17 and 21st

Ergebnisse Results

Es war in der Gruppe I und II EGF detektierbar, jedoch nicht in Gruppe III und IV. It was detectable in the group I and II EGF but not in group III and IV.

Bezüglich des Wundverschlusses zeigten die Ergebnisse in Gruppe I am Tag 7 bis 12 kontinuierlich eine fast komplette, ausgeprägte, ab Tag 14 eine komplette Epithelialisation. Regarding the wound closure, the results continually showed almost complete, distinct, from 14 days a complete epithelialization in Group I at day 7 to 12th Die besten Ergebnisse bezüglich der Rekonstitutionsqualitat der Epidermis (Zellagigkeit des Epithels) zeigten auch die Wunden der Gruppe I. Die Kontrollgruppen dagegen zeigten erst am Tag 14 eine ausgeprägte Epithelialisation und am Tag 21 zeigten sie noch immer keine hochwertige Epithelialisation. The best results in terms of Rekonstitutionsqualitat the epidermis (Zellagigkeit the epithelium) also showed the wounds of Group I. The control groups showed against it until the day 14 a pronounced epithelialization and on day 21 they still showed no quality epithelialization. In der Tabelle III ist die Epithelialisation tabellarisch dargestellt. In Table III, the epithelialization is tabulated.

Tabelle III: Tabellarische Darstellung der Epithelialisation Table III: Tabular presentation of epithelialization

Epithelialisation / Differentiation Epithelialization / differentiation

Figure imgf000019_0001
keine Epithelialisation nachweisbar + beginnende Epithelialisation no detectable epithelialization + incipient epithelialization

++ ausgeprägte aber nicht vollständige Epithelialisation +++ vollständige Epithelialisation ++ strong but not complete epithelialization +++ complete epithelialization

Beispiel 6 example 6

Wundheilungsfördernder Effekt nach Transplantation von in vitro EGF-transf izierten KMST-6 Zellen im Großtiermodell Wound healing promoting effect after transplantation of izierten in vitro EGF-transf KMST-6 cells in a large animal model

Versuchsaufbau experimental setup

In einem Großtierversuch wurden Versuche an insgesamt 3 Schweinen (Pl, P2 , P3 ) mit insgesamt je 21 standardisierten In a large animal experimental tests on a total of 3 pigs (Pl, P2, P3) with a total of 21 each were standardized

Verbrennungswunden (5 cm 2 groß, Grad 2a) durchgeführt. Burn wounds (5 cm 2 in size, degree 2a) is performed. Bei einem Schwein (Pl) wurden 7 standardisierte Verbrennungswunden mit EGF-transfizierten KMST-6 Zellen in Fibrinkleber transplantiert (Therapiegruppe). In one pig (Pl) 7 standardized burn wounds with EGF-transfected KMST-6 cells were transplanted in fibrin glue (therapy group). Hier dienten 7 unbehandelte standardisierte Verbrennungswunden (Kontrollgruppe I) sowie 7 standardisierte Verbrennungswunden, die mit Fibrinkleber behandelt wurden (Kontrollgruppe III), als Kontrolle. Here served 7 untreated standardized burn wounds (control group I) and 7 standardized burn wounds treated with fibrin glue (control group III), as a control. Bei zwei weiteren Schweinen (P2, P3) wurden ebenfalls je 7 standardisierte Verbrennungswunden mit EGF-transfizierten KMST-6 Zellen in Fibrinkleber transplantiert (Therapiegruppe). In two other pigs (P2, P3) also each 7 standardized burn wounds with EGF-transfected KMST-6 cells were transplanted in fibrin glue (therapy group). Als Kontrolle dienten je 7 unbehandelte standardisierte Verbrennungswunden (Kontrollgruppe I) sowie je 7 standardisierte Verbrennungswunden, die mit nicht transfizierten KMST-6 Zellen transplantiert wurden (Kontrollgruppe II). 7 each untreated standardized burn wounds (control group I), and each 7 standardized burn wounds that have been transplanted with non-transfected cells KMST-6 (control group II) served as controls. Tabelle IV zeigt die Gruppenaufteilung. Table IV shows the group division.

Tabelle IV table IV

Figure imgf000020_0001

Am Tag 1, 3, 5, 7, 10, 21 und 35 wurde aus jeder Gruppe jeweils eine Wunde biopsiert. On day 1, 3, 5, 7, 10, 21 and 35 are each a wound was biopsied from each group. 0,8g Wundgewebe von den Biopsien bis Tag 10 wurden mit einem Triton-X-PBS Puffer homogenisiert. 0.8 g of the wound tissue biopsies to day 10 were homogenized with a Triton X-PBS buffer. Die Homogenisate wurden zentrifugiert und die EGF Konzentration der Überstände mit Hilfe eines anti-human-EGF ELISA ausgewertet. The homogenates were centrifuged and analyzed the EGF concentration of the supernatants using an anti-human EGF ELISA. Weiterhin wurden die Biopsien histologisch ausgewertet. Furthermore, the biopsies were evaluated histologically.

Ergebnisse Results

Tabelle V zeigt EGF-Konzentrationswerte in von jeweils einer Wunde der Gruppen. Table V shows EGF concentration values ​​in each of a wound of the groups. Tabelle V EGF-Gewebekonzentrationen in pg / ml im GroBtierversuch Table V EGF-tissue concentrations in pg / ml in the coarse animal experiment

Figure imgf000021_0001

Claims

Patentansprüche claims
1) Zusammensetzung zur Behandlung von Wunden, die Fibroblasten, die wenigstens ein Fremdgen kodierend für ein die Wundheilung förderndes Zytokin enthalten und wenigstens eine weitere die Wundheilung fördernde Komponente umfaßt. 1) A composition for treatment of wounds, the fibroblasts containing at least one foreign gene containing coding for a wound-healing promoting cytokine and at least one further comprising promoting wound healing component.
2) Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die die Wundheilung fördernde Komponente ein Fibrinkleber ist. 2) Composition according to claim 1, characterized in that the wound healing-promoting component is a fibrin glue.
3) Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Fibrinkleber Fibrinogen und Fibronectin sowie gegebenen alls Albumin, Faktor XIII und Plasminogen umfaßt. 3) A composition according to claim 2, characterized in that the fibrin fibrinogen and fibronectin, as well as given alls albumin, factor XIII, and Plasminogen comprises.
4) Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die weitere die Wundheilung fördernde Komponente eine feste Komponente ist, die als Trägermatrix dient. 4) Composition according to claim 1, characterized in that the further promoting wound healing component is a solid component which serves as a support matrix.
5) Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die feste Komponente eine aus einem Hyaluronsäureester bestehende Trägermatrix ist. 5) Composition according to claim 4, characterized in that the solid component is a made of a Hyaluronsäureester support matrix.
6) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie auch Keratinozyten umfaßt. 6) Composition according to any one of the preceding claims, characterized in that it also comprises keratinocytes.
7) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das für das Zytokin kodierende Gen ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend das Gen kodierend für den transformierenden Wachstums faktor α (TGF-α) , das Gen kodierend für den epidermalen Wachstums faktor (EGF), das Gen kodierend für den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF), das Gen kodierend für den Nervenwachstumsfaktor (NGF) und das Gen kodierend für den Keratinozytenwachstumsfaktor (KGF) . 7) A composition according to any one of the preceding claims, characterized in that the gene encoding the cytokine is selected from the group comprising the gene factor encoding transforming growth α (TGF-α), the gene factor encoding the epidermal growth factor (EGF ), the gene coding for the basic fibroblast growth factor (b-FGF), the gene encoding nerve growth factor (NGF) and the gene encoding the keratinocyte growth factor (KGF). 8) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten wenigstens ein weiteres Fremdgen, kodierend für ein Zytokin, das auf Blutzellen wirkt, umfaßt. 8) A composition according to any one of the preceding claims, characterized in that the fibroblasts comprises at least one further foreign gene coding for a cytokine that acts on blood cells.
9) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das für das Zytokin kodierende Gen mit Hilfe eines Plasmidvektors in die Fibroblasten eingebracht wurde. 9) A composition according to any one of the preceding claims, characterized in that the gene coding for the cytokine was introduced with the aid of a plasmid vector in the fibroblasts.
10) Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasmidvektor eine In-Leserahmenfusion des Gens kodierend für das reife Zytokin und eine sekretorische Signalsequenz aufweist. 10) A composition according to claim 9, characterized in that the plasmid vector having an in-reading frame of the fusion gene coding for the mature cytokine and a secretory signal sequence.
11) Zusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der sekretorischen Signalsequenz um die des menschlichen G-CSF Gens handelt. 11) A composition according to claim 10, characterized in that it is in the secretory signal sequence to that of the human G-CSF gene.
12) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um autologe Fibroblasten handelt . 12) A composition according to any one of the preceding claims, characterized in that it is autologous fibroblasts.
13) Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um allogene Fibroblasten handelt. 13) A composition according to any one of claims 1 to 11, characterized in that it is allogeneic fibroblasts.
14) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten bestrahlt wurden. 14) A composition according to any one of the preceding claims, characterized in that the fibroblasts were irradiated.
15) Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um klonal-selektierte Fibroblasten handelt. 15) A composition according to any one of the preceding claims, characterized in that it is clonally-selected fibroblasts.
16) Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den allogenen Fibroblasten um Fibroblasten der Zellinie KMST-6 handelt. 16) A composition according to any one of claims 13 to 15, characterized in that it is in the allogeneic fibroblasts fibroblasts of the cell line-KMST. 6 17) Verwendung von Fibroblasten, die wenigstens ein Fremdgen, kodierend für ein die Wundheilung förderndes Zytokin enthalten, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Wunden. 17) Use of fibroblasts that at least one foreign gene encoding a cytokine contain wound healing, for the manufacture of a medicament for the treatment of wounds.
18) Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Fremdgen ausgewählt ist unter den Genen kodierend für den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), den transformierenden 18) Use according to claim 17, characterized in that the foreign gene is selected among the genes encoding the epidermal growth factor (EGF), transforming
Wachstumsfaktor α (TGF-α) , den Nervenwachstumsfaktor , den basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF) und den Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) . Growth factor α (TGF-α), nerve growth factor, basic fibroblast growth factor (b-FGF) and keratinocyte growth factor (KGF).
PCT/EP1998/002038 1997-04-17 1998-04-08 Fibroblasts with a foreign gene-containing composition for treating wounds WO1998048012A1 (en)

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DE1997116098 DE19716098A1 (en) 1997-04-17 1997-04-17 Fibroblasts containing a foreign gene composition for the treatment of wounds
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