WO1998017800A1

WO1998017800A1 - Larc, nouvelle chimiokine cc humaine

Info

Publication number: WO1998017800A1
Application number: PCT/JP1997/002557
Authority: WO
Inventors: Hisayuki Nomiyama; Toshio Imai; Osamu Yoshie
Original assignee: Shionogi & Co., Ltd.
Priority date: 1996-10-17
Filing date: 1997-07-24
Publication date: 1998-04-30
Also published as: JP4001246B1

Description

明細書

新規ヒト C C型ケモカイン L A R C

技術分野

本発明は新規な CC型ケモカインタンパク質、その構造遺伝子、該タンパク質の製造方法、該製造方法に使用される該タンパク質をコードする D N Aを含有するべクタ一および該ベクターを含有する形質転換体、ならびに該タンパク質またはその構造遺伝子を含有する医薬組成物、炎症およびノまたは免疫に関連する病気の診断薬、さらには該タンパク質の単クローン抗体および該抗体を産生し得るハイプリド一マに関する。

背景技術

物理的、化学的あるいは生物学的な機序により起こる外来性あるいは内因性のさまざまな組織障害、侵襲、抗原暴露、などは強い炎症反応や免疫反応を誘導する。これらの反応は重要な生体防御反応であるが、ときには急性あるいは慢性の疾患の原因ともなりうる。炎症反応や免疫反応を誘発する原因が組織に加えられると、まず好中球、顆粒球、リンパ球、あるいはマクロファージなどのような炎症性細胞あるいは免疫担当細胞の血管内皮細胞への吸着、血管外への移動、そして侵襲あるいは障害された組織や抗原の存在する組織での集積が起こる。このような一連の細胞遊走反応を誘導する物質として一群のケモタクティック ' サイ卜力イン、いわゆるケモカイン、が存在する。ケモカインは遊走反応（ケモタクティック反応）を誘導する一群のサイ卜力インであり、アミノ酸配列の類似性から構造的にも相互に密接に関係する。これまでにヒ卜では少なくとも 21種のケモカインが報告されている。ケモカインは、共通に保存された 4個のシスティン残基のうちの最初の 2個の並び方から、大きく αあるいは CXC型（2個のシスティンが 1個のアミノ酸で隔てられている）と） 3あるいは CC型（2個のシスティンが隣り合つている）に分けられる。

CXC型ケモカインとして、ヒトでは、 -8、 j8 - TG、 PF-4、 MGSA/GRO, ENA-78、 NAP-2、 GCP-K GCP- 2、 I P- 1 0、 SDF- 1 /PBSF, M i g、などが知られている。 CXC型ケモカインは主に好中球の活性化と遊走を誘導する。 CC型ケモカインとして、ヒ卜では、 MIP- 1 . MIP-1 β、 ANTES, MCP-1, MCP-2、 MCP-3、卜 309、ェォタキシンなどが知られている。 CC型ケモカインは、主にモノサイ卜ノマクロファージの活性化と遊走を誘導する。さらに CC型ケモカインには、 T細胞、好塩基球、好酸球、などに対して活性化と遊走誘導を示すものが知られている U. J. Oppenheimら、 Annu. Rev. Immunol. 9: 617-648, 1991； M. Baggiol ini & C. A. Dahinderu Immunol. Todey 15: 127-133, 1994) ₀

発明の開示

本発明者らは、新たな CC型ケモカインを見出すべく、種々のヒト CC型ケモカインアミノ酸配列をもとに、アメリカ NCBIが公開している核酸配列データベース GenBankの一部で、 cDNA部分配列から構成される Expressed Sequence Tag (EST) データベースを TBLASTN検索ソフトを用いて検索した。その検索により、新たな CC型ケモカインタンパク質をコードする D N A配列の存在を見出し、その c D N Aを実際にヒト細胞からクローニングし、全長 c D N Aの塩基配列を決定するとともに、そのタンパク質を発現させた。この遺伝子はおもに肝臓で構成的に発現しており、そのタンパク質はリンパ球に対して細胞遊走活性を示すという結果から、この新規 CC型ケモカインを LARC (Li er and Act i vat ion Regulated Chemokine)と命名した。本発明者らは、遺伝子工学技術を用いて LARCを大量生産し、精製した LARCを用いてリンパ球に対する遊走活性を示し、またリンパ球に存在する LARC に対する高親和性の特異的レセプターを同定することによって、本発明を完成するに至った。

LARCは遺伝子の塩基配列から予想されるオープンリ一ディングフレームでは 9 6個のアミノ酸残基からなるタンパク質であるが、成熟タンパク質では 2 6番目と 2 7番目のァラニンの間でシグナル配列が切断されて、 7 0個のアミノ酸残基からなる分子量約 8 kDaの塩基性タンパク質である。成熟型の LARCは既知の CC型ケモ力インと有意の相同性を示し、特に CC型ケモカインで保存されている 4個のシスティンはすべて保存されていた。しかし、既存のケモカインとの相同性は最も高い M I P- 1 8に対しても 2 8 %程度である。また単球様細胞株 U937を刺激するとその産生が誘導されるほか、肝臓や肺などで構成的に発現しているという特徴も従来の CC型ケモカインについては知られていない。

発明の概要

本発明は、新規な CC型ケモカイン LA RCについて、該タンパク質の構造遺伝子、該タンパク質の製造方法、該製造方法に使用するベクターおよび形質転換体、該タンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチド分子の全長もしくは一部を含有する医薬組成物、該タンパク質に対する単クローン抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、およびァゴニストアンタゴニストを検索、測定または評価する方法に関する。

本発明の 1 つの発明は、配列番号 1 のアミノ酸残基 2 7 - 9 6のアミノ酸配列を有するヒト CC型ケモカイン（LARC ) 、またはその断片もしくは変異体タンパク質、好ましくはこの配列に 1 または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる 1 またはそれ以上の変異を含み、かつ該ヒ卜 CC型ケモカインの機能または活性と実質的に同じ程度である機能または活性、または該ヒ卜 CC型ケモカインの機能または活性を抑える機能または活性を有する該ヒ卜 CC型ケモカインの変異体タンパク質に関する。

また、本発明は、配列番号 1 のアミノ酸残基 1 ~ 9 6のアミノ酸配列を有するヒ卜 CC型ケモカイン（LARC前駆体）、またはその断片もしくは変異体タンパク質、好ましくはこの配列に 1 または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる 1 またはそれ以上の変異を含み、かつ該ヒト CC型ケモカインの機能または活性と実質的に同じ程度である機能または活性、または該ヒ卜 CC型ケモカインの機能または活性を抑える機能または活性を有する該ヒト CC型ケモカインの変異体に関する。

本明細書中、「CC型ケモカインの断片タンパク質」とは本発明のヒ卜 CC型ケモ力インのアミノ酸配列の一部からなる適当な断片を意味する。

本明細書中、「cc型ケモカインの変異体タンパク質」とは該変異体の機能または活性が実質的に該 CC型ケモカインと同じ、あるいは該ヒ卜 CC型ケモカインの機能または活性を選択的に抑えるものであれば、化学的または生化学的な改変または天然もしくは非天然のアミノ酸を含むことのできる改変タンパク質を意味する。別の態様として、本発明は、本発明の CC型ケモカインおよび該タンパク質の変異体をコードする単離されたポリヌクレオチド分子に関する。詳細には、配列番号

1 に記載の配列の 1 3 7位の Gから 3 4 6位の Gからなる配列を有するポリヌクレ才チド分子、あるいは配列番号 1 に記載の配列の 5 9位の Aから 3 4 6位の Gからなる配列を有するポリヌクレオチド分子、あるいは配列番号 1 に記載の D N A配列の 1位の Cから 7 9 9位の Tからなる配列を有するポリヌクレ才チド分子に関する。本発明のポリヌクレオチド分子は R N Aまたは D N Aの形態をとることができ、 D N Aには c D N A、ゲノム D N Aおよび合成 D N Aが包含される。また D N Aおよび R N Aは二本鎖または一本鎖であってよく、一本鎖の場合はセンス鎖またはァンチセンス鎖のいずれでもよい。

本発明のポリヌクレオチド分子は本発明タンパク質、例えば LARCの発現誘導あるいは抑制（アンチセンスなど）に利用でき、 ex v i voあるいは i n ν ί νοにおいてベクターにより、あるいは遺伝子銃により打ち込むことができる。このような用途に利用できる限り、本発明のポリヌクレオチド分子には上記本発明ポリヌクレオチド分子の一部の配列からなるポリヌクレオチド分子も包含される。

さらに、本発明はこれらのポリヌクレオチド分子の塩基置換、塩基付加もしくはアレル変異による変異体分子（以下、変異体と称することもある）に関する。

「塩基置換、塩基付加による変異体」とは、配列番号 1 に記載された塩基配列とは異なる遺伝子コードを用いて、結果的には、配列番号 1 に記載されたアミノ酸 1 から 9 6のタンパク質と同じタンパク質、あるいは配列番号 1 に記載されたァミノ酸配列 2 7から 9 6のタンパク質と同じタンパク質、をコードしうる変異体を意味する。

「アレル変異による変異体 J とは自然に存在する個人差や人種差に基づく塩基変異を意味し、コードするアミノ酸配列が変化する場合もある。

本発明はさらに、配列番号 1 に記載の塩基配列の 1位の Cから 7 9 9位の丁からなる配列の一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド分子、またはその塩基置換、塩基付加、塩基修飾、アレル変異による変異体であって、本発明タンパク質の活性または機能を阻害する分子に関する。

特に、 5 'ノンコーディング部分の相補的な配列が好ましいが、より好ましくは転写開始部位、翻訳開始部位、 5 '非翻訳領域、ェクソンとイン卜ロンとの境界領域もしくは 5' CAP領域に相補的配列であることが望ましい。

好ましい長さは、約 1 0塩基対（ b p ) 〜約 4 0 b pである。

また、別の態様として、本発明は本発明のポリヌクレオチド分子を含有するべクターに関する。本発明ベクターには発現ベクター、クローニングベクター、治療用ベクターなどの種々の用途を持つベクタ一が包含される。

発現べクタ一は本発明タンパク質の大量生産に利用できる。発現ベクターについての詳細は以下の発明の実施形態の項に示す。

治療用ベクターは本発明ポリヌクレオチド分子を投与し細胞内に導入する手法に用い、ウィルスベクターによる方法およびその他の方法（日経サイエンス、 1 994年 4月号、 20-45頁、月刊薬事、 36 ( 1 ) 23-48 ( 1 994) , 実験医学増刊、 1 2 ( 1 5)、 ( 1 994)、およびこれらの引用文献（等）のいずれの手法も適用することができる。ウィルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルぺスウィルス、ワクシニアウィルス、ボックスゥィルス、ポリオウイルス、シンビスウィルス等の RNAウィルス等に本発明の DMAを組み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ワクシニアウィルス等を用いた方法が特に好ましい。その他の方法としては、プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（DNAワクチン法）リボソーム法、リポフエクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸力ルシゥ厶法、エレクト口ポレーシヨン法等が挙げられ、特に DNAワクチン法、リポソー厶法が好ましい。

また、別の態様として、本発明は、本発明の上記種々のベクターを含有する形質転換体に関する。また、本発明は本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体；該形質転換体を培養し、産生されたタンパク質を回収することを特徴とする本発明のタンパク質またはその変異体を製造する方法に関する。

さらなる態様として、本発明は本発明の夕ンパク質もしくはその変異体またはそれらをコードするポリヌクレオチド分子の全長もしくはその一部またはその変異体分子を含有する医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物には例えば、抗炎症剤、免疫応答調節剤、抗感染症剤、抗癌剤、炎症およびまたは免疫に関連する病気の予防薬または診断薬が包含される。

本発明医薬組成物の投与量および投与経路は通常の方法によって、使用目的、投与される対象の病状等から適時決定することができる。なお、本発明のタンパク質は生体内活性物質であることから、該タンパク質の活性が生じる量、すなわち本発明の医薬組成物の使用量においてはその急性毒性は問題とならないことが容易に推定される。

さらに、本発明は本発明のタンパク質またはその変異体に対する抗体、特に単クローン抗体、および該単クローン抗体を産生するハイプリドーマ細胞に関する。別の態様として、本発明は、本発明のタンパク質のァゴニスト、インバースァゴニス卜またはアンタゴニス卜をスクリ一二ングする方法であって、該ァゴニス卜、インバースァゴニストまたはアンタゴニストを含むと推定される試料と該タンパク質に特異的なレセプター GPR- CY4とを反応させ、その結合性およびノまたは反応性を測定する工程を包含する方法に関する。また、別の態様として、本発明は、本発明スクリ一二ング方法によって見出されるァゴニスト、インバースァゴニストまたはアンタゴニス卜を包含する。本発明のタンパク質に特異的なレセプター GPR- CY4は、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 227 (3), 846-853 (1996)に CKR-L3としてそのアミノ酸配列が記載されている。

図面の簡単な説明

図 1 は、ヒト LARCの cDNAの塩基配列とその推定アミノ酸配列を示す。

図 2は、 LARC夕ンパク質と既知の 12種のヒ卜 CC型ケモカインとのアミノ酸配列の比較を示す。

図 3は、無刺激および刺激下における各種ヒ卜細胞株での LARC mRNAの発現結果を示す図面に代わる写真（A) 、および各種ヒト組織における LARC mRNAの発現結果を示す図面に代わる写真（B) である。

図 4は、組換えベクター pVL- LARCの遺伝子地図である。

図 5は、昆虫細胞から生産したヒ卜 LARCの精製の最終ステップからの溶出バターンを示すグラフ（A) 、および精製ヒ卜 LARCの SDS- PAGEによる電気泳動と銀染色の結果を示す図面に代わる写真（B) である。

図 6は、 LARCと陽性対照 MCP- 3のヒト単球様細胞株 THP-1細胞に対するケモタキシス誘導を示すグラフ（A) 、 LARCと陽性対照 MCP- 3のヒト末梢血単球に対するケモタキシス誘導を示すグラフ（B) 、 LARCと MCP- 3のヒト末梢血リンパ球に対するケモタキシス誘導を示すグラフ（C) 、そして LARCと陽性対照 IL-8のヒト末梢血顆粒球に対するケモタキシス誘導を示すグラフ（D) である。

図 7は、組換えベクター pDREF-SEAP(His)₆の遺伝子地図（A) 、および精製ヒ卜 LARC-SEAP融合夕ンパク質の SDS-PAGEによる電気泳動結果を示す図面に代わる写真（B) である。

図 8において、（A) はヒト末梢血リンパ球に対する LARC-SEAP特異的結合を示すグラフ、（ B) はその Scatchard解析の結果を示すグラフ、（C) は一定濃度 (1 nM) の LARC- SEAPに対し非標識 LARCの濃度を変化させたときの LARC- SEAPのヒ卜リンパ球への結合量の変化を示すグラフ、および（D) は 1 nMの LARC-SEAP のヒ卜末梢血リンパ球への結合に対する LARCを含む各種の非標識ヒ卜ケモカイン 200 nMによる阻害結果を示すグラフである。

図 9 において、（A ) は LARC-SEAP 融合タンパクの濃度を変化させた場合の GPR-CY4発現 Raj i細胞に対する特異的結合を示すグラフ、（B ) はその Sc a t cha rd 解析の結果を示す図、（C ) は一定濃度（1 nM) の LARC- SEAP に対し非標識 LARC の濃度を変化させたときの LARC- SEAPのヒ卜リンパ球への結合量の変化を示すダラフ、および（D ) は 1 nMの LARC- SEAPの GPR-CY4発現 Raj i細胞への結合に対する LARCを含む各種の非標識ヒトケモカイン 200 nM による阻害を検討した結果を示すグラフである。

図 1 0は、 GPR- CY4を発現させた 293/EBNA-1細胞および Ve c t o tのみを発現させた 293/EBNA- 1細胞の遊走活性に対する LARC濃度の影響を示すグラフである。

図 1 1 は、 GPR- CY4 を発現させた 293/EBNA-1 細胞に対して、 LARC は特異的に細胞内カルシウム濃度を上昇させる活性を有することを示すグラフである。

発明を実施するための最良の形態

本発明は主として、単球様細胞株、黒色腫細胞、正常人由来の単球またはマクロファージ、ある種の癌細胞を刺激することによリその産生が誘導され、主として肝臓と肺にて構成的に発現しているヒ卜 CC型ケモカインに関する。

次に本発明タンパク質の調製工程を説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技術、発現したタンパク質の分離精製法、分析法および免疫学的手法が採用され得る。

本発明タンパク質の調製

本発明の LARCタンパク質をコードする DNAを含む DMA断片の配列決定方法を例示する。この DNA断片の配列は、例えば PMA、 PHA、 LPSで刺激したヒ卜単球様細胞株 U937、黒色腫細胞株 Bowes由来の cDNAライブラリ一から得ることができるが、そのためには、まず、 cDNAライブラリーから LARCタンパク質をコードする遺伝子のクローニングを行うためのプライマーが必要である。

(1 ) ESTライブラリーからの LARC cDNA部分配列の検索

ァメリ力 NCBIが公開している核酸配列データベース GenBankの一部であり cDMA 部分配列から構成される Expressed Sequence Tag (EST)データベースを、種々のヒト CC型ケモカインアミノ酸配列をもとに TBLASTN挨索ソフ卜を用いて検索し、 CC型ケモカインと有意の相同性をもつが、既知のケモカインとは異なるタンパク質をコードすると考えられる cDNA部分配列を得る。得られた cDNA部分配列をもとにポリメラーゼ連鎖反応（PCR) 用プライマー 1対を合成する。

(2) LARC cDNAの単離

つぎに、 PMAなどで刺激した U937細胞の mRNAから cDNA末端迅速増幅法（_rap i d amplification of cDNA ends、 RACE法) (Frohman et al. , Pro at I. Acad. Sci. USA 85:8998-9002, 1988) により 5'側と 3'側へ cDNA断片を増幅し、全長をコードする cDNAの塩基配列を決定する。 5'側 RACEと 3'側 RACEは、 Quickprep Micro mRNA精製キット（Pharmac i a社製）を用いて po I y (A)+RMAを抽出し、この poly(A)+RNAからマラソン cDNA増幅キッ卜 (Marathon cDNA Ampl if ication Kit) (Clontech社製）を用いて行う。得られた LARC cDNAを例えば pGEM-Tベクター (Promega社製）、 pBluescript (St ratagene社製）に挿入することにより組換えプラスミドを得る。

(3) 塩基配列決定

得られた組換えプラスミドの挿入 cDNAの塩基配列の決定には、例えば、まず、挿入断片を該断片の内部に存在する制限酵素部位を用いて切断し、それぞれの cDNA断片をそれぞれ適当なシークェンスベクター、例えば pGEM-Tベクター

(Promega社製）、 pBluescript (St ratagene社製）にサブクローニングする。次に、常法に従ってプラスミド DNAを抽出し、クローニングした断片の塩基配列を、例えば Sanger法（Sanger et al.、 Pro at I. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977) によって決定する。これにより、全長 LARC cDNAの塩基配列が決定される。 (4 ) 組換え LARCの発現

得られた LARCタンパク質遺伝子を適当な発現ベクターに組み込み、 LARCタンパク質を発現するための発現ベクターとする。適切な発現ベクターとしては例えば、細菌については pRSET, pGE EX, pKK233- 2、酵母については pYES2、昆虫細胞については pVL1393、動物細胞については pEF-BOS, pSR α , pDR2、などが各々挙げられる。この発現べクタ一を適当な宿主細胞、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞に導入して、形質転換体を作製する。大腸菌などの原核微生物では、原核微生物の分泌タンパク質に由来するシグナル配列（例えばシグナルペプチド OMPa) と成熟型 LARCタンパク質とが融合した前駆タンパク質として、強力なプロモーター（例えば T7プロモーター）の支配下に発現し得る。酵母では、酵母の分泌タンパク質の天然前駆物質に由来するシグナル配列（例えばフェロモン αのプレプロ配列）と成熟型 LARCタンパク質とが融合した前駆タンパク質として、発現し得る。動物細胞では、すでに存在するシグナル配列を含む LARCタンパク質前駆体の遺伝子を強力なプロモーター（例えば EF-1 αプロモーター）の下流に挿入し、効果的な選択マーカー（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ）と共に動物細胞（例えば CHO dhf r" 細胞）に導入し、薬剤（この場合はメ卜卜レキセ一卜）に対する耐性により細胞を選択し、高発現の細胞株を樹立し得る。またシグナル配列を含む LARCタンパク質前駆体の遺伝子をウィルスまたはレトロウィルスに組込み、この組換えウィルスを動物細胞、ヒト細胞等に感染させることにより、発現し得る。これら形質転換体を培養することにより、 LARCタンパク質が産生分泌され得る。あるいは、成熟型 LARCタンパク質は、例えば固相法を用いて 2個のジスルフィド結合の存在に必要な注意を払って、公知の方法（Clark- Lewis et al.，

Biochemistry 30:3128-3135, 1991 ) を用いて全合成され得る。

得られたタンパク質の精製は当業者に周知の硫安沈殿、ァフィ二ティークロマ卜グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマ卜グラフィー、疎水クロマトグラフィーを単独であるいは組合わせ行うことができる ( Imai et al.， J. Biol. Chem. 271 :21514-21521, 1996) 。

本発明の LARCタンパク質の変異体は、当業者に周知の遺伝子組換え技術 (Sambrook et aに， Molecular Cloning: A laboratory manual, 2^nd edn. New

York, Cold Spring Harbor Laboratory) によって調製することができる。

本発明タンパク質に対する抗体の調製

本発明の LARCタンパク質に対する抗体を得るには、例えば、推定される LARCのアミノ酸配列の一部に基づいて通常のぺプチド合成機で合成した合成ペプチドや、 LARCを発現するベクターで形質転換した細菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞、などにより産生された LARCタンパク質を通常のタンパク化学的方法で精製し、これらを免疫原として、マウス、ラッ卜、ハムスター、ゥサギなどの動物を免疫し、その血清由来の抗体（ポリクローナル抗体）を作製すればよい。

あるいは、免疫したマウスゃラッ卜の脾臓またはリンパ節からリンパ球を取りだし、ミエローマ細胞と融合させて Kohlerと Mi I steinの方法 [Nature, 256, 495- 497 (1975)] またはその改良法である Uedaらの方法 [Pro Natに Acad. Sc i. USA, 79:4386-4390, 1982)] に従ってハイプリドーマを作製した後、該ハイブリドーマから単クローン抗体を産生させ得る。例えば以下の工程により LARCタンパク質の単クローン抗体を得ることができる：

( a ) LARCタンパク質によるマウスの免疫、

( b) 免疫マウスの脾臓の除去および脾臓細胞の分離、

( c ) 分離された脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合促進剤（例えばポリエチレングリコール）の存在下での上記の Kohler らに記載の方法による融合、

(d ) 未融合ミエローマ細胞が成長しない選択培地での得られたハイプリドーマ細胞の培養、

( e ) 酵素結合免疫吸着検定（EUSA)、ウェスターンプロットなどの方法による所望の抗体を生産するハイプリドーマ細胞の選択および限定希釈法等によるクロ一二ング、 ( f ) LARC単クローン抗体を生産するハイプリドーマ細胞を培養し、単クローン抗体を収穫する。

LA RCタンパク質の mRNAとタンパク質の検出

本発明の LARCの mRMAとタンパク質の存在は、通常の特異的 mRNAおよびタンパク質に対する検出法を用いて検出できる。例えば、 mRNAはアンチセンス RNAや C DNAをプローブに用いたノーザンプロッ卜解析やインサイッ ·ハイブリダィゼーシヨン法により検出できる。また、 mRNAを逆転写酵素で c DNAに変換したのち、適当なプライマーの組み合わせによる PC R法によっても検出することができる。タンパク質については、 LARC特異的な抗体を用いた免疫沈降やウェスタンプロッ卜などにより検出することができる。

LA RCタンパク質の免疫学的定量法

例えば、放射性アイソトープ、ペル才キシダーゼやアルカリフォスファターゼのような酵素あるいは蛍光色素などで標識した一定量の LARCに、濃度既知の非標識 LARCおよび血清由来の抗 LARCポリクロ一ナル抗体またはモノクローナル抗体を加え、抗原抗体競合反応を行わせる。非標識抗原の濃度を適当に変化させた後、抗体と結合した標識抗原と抗体に結合していない標識抗原とを適当な方法で分離し、抗体と結合した標識抗原の放射能量、酵素活性または蛍光強度を測定する。非標識抗原量が増すにつれ、抗体と結合する標識抗原の量は減少する。この関係をグラフにして標準曲線を得る。また LARCタンパク質上の異なるェピトープを認識する 2種類の単クローン抗体の一方を固相化し、他方を上記のいずれかの方法でラベルし、固相化抗体に結合した LA RCの量をラベル抗体で検出定量する、いわゆるサンドィツチ法も可能である。

次に、上記の反応系に濃度既知の非標識抗原の代わりに未知量の抗原を含む試料を加え、これを反応させた後に得られる、放射能量、酵素活性、または蛍光強度、を標準曲線にあてはめれば、試料中の抗原、すなわち LARCタンパク質の量を知ることができる。 LARCタンパク質を定量することにより、炎症反応や免疫反応をモ二ターする方法が提供され得る。

LARCタンパク質のケモカイン活性の確認

本発明の LARCタンパク質のケモカイン活性は例えば、試験管内では、一定の口径のポアを有するフィルターを介在させて仕切った培養容器の一方の側に LARCを入れ、他方の側に標的細胞を入れて、一定時間後にフィルターのポアを通過して LARCの存在する側へ移動した細胞数をランダムな移動数と比較して示し得る。また、生体内では、精製した LARCタンパク質を動物に投与して細胞の浸潤と集合を組織学的方法で検出することによつても示し得る。

実施例

本発明を以下の実施例によりさらに詳しく説明する。

実施例 1

LARCの cDNAの単離およびその構造決定

( 1 ) ESTライブラリーからの LARC cDNA部分配列の検索

ァメリ力 NCB Iが公開している核酸配列データベース GenBankの一部である、 cDNA部分配列から構成される Exp re s s ed Seq uence Tag (EST)データベースを、種々のヒト CC型ケモカインアミノ酸配列をもとに TBLASTN検索ソフ卜を用いて検索し、 CC型ケモカインと有意の相同性をもつが、既知のケモカインとは異なる夕ンパク質をコードすると考えられる 5個の ESTデータ（GenBankァクセッション · ナンバー： D17181、 D31065. D8Z589. T27336、 Τ27433) を見出した。これらのデー夕はそれぞれヒト肝細胞株 HepG2、ヒ卜胎児肺組織、ヒト脬島細胞、ヒ卜脬島細胞、ヒト薛島細胞の cDMAライブラリー由来の cDNAで、長さはそれぞれ 226 bp、 360bp、 342 bp、 292 bp、 342 bpであり、 1 994年 1 2月 1 日、 1 995年 2月 8日、 1 996年 1 月 1 1 日、 1 994年 1 2月 6日、 1 994年 1 2月 6 日にそれぞれ GenBankに登録されている。

( 2 ) LARC tnRNA発現ヒト細胞の確認

LARC mRNAの検出は mRNAを逆転写酵素で cDNAに変換したのち、 LARCに特異的なプライマーの組み合わせによる PCR法を用いて行った。まず、 GenBank EST データ D31065の配列をもとに PCR用プライマー 1 対、 NCC- 5Fプライマーおよび NCC- 5Rプライマーを合成した。 NCC- 5Fプライマーおよび NCC- 5Rプライマーの配列はそれぞれ次の通りである：

NCC-5F 5' -GTACTCAACACTGAGCAGATCT-3' (配列番号 2 )

NCC-5R 5' -AGGTGGAGTAGCAGCACT-3' (配列番号 3 )

次に、 50ng/mlの PMAで 6時間刺激したヒト単球様細胞株 U937から、 QuickPrep Micro mRNA Purif ication Kit (Pharmac i a社製）を用いて mRNAを抽出した。精製した mRNAを錶型として、一本鎖 cDNAを Preampl if ication System (GIBCO- BRL社製）を用いて合成した。得られた一本鎖 cDMAを錶型として反応緩衝液（10 m Tris-HCL pH 8.3、 50 mM KCI、 1.5 mM MgCI₂、 0.1¾ ゼラチン、 200 μ. M dNTP(dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP)、 400 nM NCC- 5Fプライマー、 400 nM NCC-5Rプライマ一、および 100 U/ml Ampl aq DNAポリメラーゼ I)中で、ポリメレースチェインリアクション（PCR) 反応を行った。 PCRには宝酒造から購入した Ampl iTaq Kit を用い、 DNA Thermal Cycler (Perk i n- E I mer社製）で行った。反応は、 94°C で 3分間前処理した後、 94°Cで 45秒間、 60°Cで 45秒間、 72°Cで 1分間の反応サイクルを 40回繰り返し、最後に 72°Cで 3分間処理して行った。 cDNAが予想される cDNA断片 100bpのシグナルを与えることから、 U937細胞が PMA刺激により LARC mRNAを発現することを見出した。

(3) LARC cDNAの単離

50 ng/mlの PMAを培地に加え 6時間培養したヒト単球様細胞株 U937から抽出した mRNAから Marathon cDNA Ampl if ication Kit (Clontech社製）を用いて LARC cDNAを単離する。まず U937 mRNA 1 μ gと Marathon cDNA 合成プライマー 10 pmoleとを含む溶液 5 Iを 70°Cで 2分間加熱し、氷冷後、これに dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP (各 1 mM) および關 LV逆転写酵素（100ユニット）を加え、 50 mM Tris-HCI (pH8.3)、 6 mM MgCIい 75 mM KCI の反応液 10 μ I 中、 42°Cで 1時間一本鎖 cDNA合成反応を行った。反応後、反応液を氷冷し、これに dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP (各 0· 2 m ) 、 E. col i DNA ポリメラーゼ I (24ュニッ卜）、 E. col i DNA リガーゼ（4· 8ュニッ卜）および E. col i RNase H (1ュニッ卜）を加え、 100 mM KCし 10 mM硫酸アンモニゥ厶、 5 mM MgCI₂、 0. 15 mM -NAD、 20 mM Tris-HCI (pH7.5) および 0.05 mg/ml ゥシ血清アルブミンの反応液 80 t I 中、 16°Cで 1時間半、二本鎖 cDNA合成反応を行った。

次いで、この反応液中に T4 DNAポリメラーゼ（10ユニット）を加え、 16°Cで 45 分間反応し、 cDNAを平滑末端化した。反応後、フエノール抽出 ·ェタノール沈殿の操作を行った後、 DNAを 10 μ Iの蒸留水に溶解した。その内の 5 β Iの溶液に Marathon cDNAアダプター 20 pmoleおよび T4 DNAリガーゼ（1ュニッ卜）を加え、 50 mM Tris-HCI (pH7.8)、 10 mM MgCI₂、 1 mM DTT、 1 mM ATP、 5¾ (w/v) ポリェチレングリコール（MW 8， 000)の反応液 10 At I 中、 16°Cで約 20時間反応させ、二本鎖 cDNAの両端にアダプターを結合させた。反応後、 70°Cで 2分間加熱してリガーゼを失活させ、さらに ΙΟ ιιιΜ Tricine-KOH (pH9.2)、 0.1 mM EDTAで 250倍に希釈後、 94°Cで 2分間加熱し、アダプターを結合させた二本鎖 cDNAを変性させた。 5' RACE 反応はこの変性させた cDNA 5 μ I に dATP、 dCTP、 dGTP、 dTTP (各 0.2 mM) 、 TAKARA LA Taq (2.5ュニット）、 TaqStart抗体（0· 55 μ g) 、アダプタ一部に結合する API プライマー 10 pmole、および NCC-5Rプライマー（配列番号 3 ) 10 pmoleを加え、 Ix TAKARA LA Taq緩衝液の反応液 50 μ I 中、 94°Cで 1分の前処理後、直ちに 94°C、 30秒； 60°C、 30秒； 68°C、 4分の条件で 30サイクルの PCRを行つた。 3' RACE反応は上記の反応条件で MCC-5Rプライマーの代わりに NCC- 5Fプライマー（配列番号 2 ) を用いた。反応後、 PCR産物を ^低融点ァガロースゲル電気泳動で分離し、約 120bpの 5' RACE断片および約 780bpの 3' RACE断片をフエノール抽出法で回収し、エタノール沈殿の操作を行った後、 DNAを 10 μ I の蒸留水に溶解した。その内の 5 μ Iをベクター pGEM- T (Promega社製） 1.0 M I と混合し、 T4 DNAリガーゼを用いて 16°Cで約 20時間反応させて両者を連結させ、組換え DNA を作製した。これを大腸菌（E. col i) XLl-Blue MRF' (St ratagene社製）に形質転換し、コロニーを得た。

(4) 陽性クローンの同定と塩基配列決定

上記工程で得られたコロニーの内の数個からプラスミド DNAを抽出し、 SP6 プロモーター . プライマーあるいは T7 プロモーター ■ プライマーを用いて cDNAの 5' および 3'端側の塩基配列を調べたところ、すべて EST D31065とほぼ同一の塩基配列であった。そこで 5' RACEおよび 3' RACEから 1 個づつのクローン DNAを無作為に選択し（以下、 5'- RACE cDNAと 3'- RACE cDNAと称す）、それらについて全塩基配列を Sangerらの方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467 , 〗 977] に従って決定した。その結果、最初に現れる翻訳開始コドン ATGの規定するメチォ二ンを含む 96個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードする cDNAの全塩基配列を決定した。このタンパク質のアミノ酸配列は既知のケモカインとは完全に一致はしないが、有意の相同性を有し、また CC型ケモカインの構造的特徴である保存された 4個のシスティン残基を含むこと、および N端側に分泌タンパク質に特徴的なシグナル配列様の配列が存在すること、などから新規の CC型ケモカインと推定された。

(5) LARCの推定アミノ酸配列解析

調製した cDNAクローンの塩基配列および内部に翻訳終了コドンを持たない open reading frame (0RF)のアミノ酸配列を図 1 に示す。この遺伝子は 96個のアミノ酸よりなる 0RFを有し、 N末端にシグナルペプチドに特徴的な、疎水性の強いアミノ酸配列を有する遺伝子であることが明らかとなった。この 96個のアミノ酸からなるタンパク質の分子量は、計算によると〗 0, 794であった。推定上のシグナルぺプチドの切断部位は、計算によると Ala- 26と Ala- 27の間であった。シグナルべプチド切断後の 70個のアミノ酸からなる推定上の成熟型タンパク質は、分泌タンパク質であると推定された。この 70個のアミノ酸からなる推定上の成熟型分泌タンパク質の分子量は、計算によると 8， 020であった。この 70個のアミノ酸からなる推定上の成熟型分泌夕ンパク質の等電点は、計算によると 10.3であった。アミノ酸配列の類似性解析は FASTAおよび ClustalVプログラムを用いて行った。その結果を図 2に示す。得られた cDNAの 0RFから推定される CC型ケモカインを含めてすべての CC型ケモカインで保存されているアミノ酸は四角で囲み、一方殆どのケモカインで保存されているアミノ酸は黒丸で示した。また得られた cDNAの 0RFから推定される CC型ケモカインと他の CC型ケモカインとの相同性の程度をシグナルペプチドが切断されたあとの成熟型のタンパク質について !¾表示で右側に示している。すなわち成熟型分泌タンパク質のアミノ酸配列は CC型ケモカインに属する例えば LD78 α/ΜΙΡ-1 αとは 27!¾、 M I Ρ-1 jSとは 28¾、 RANTESとは 25%、 MCP-1 とは 25¾、 MCP-3とは 24¾、 MCP- 2とは 24 卜 309とは 20%の相同性があることが明らかとなつた。また、全ての CC型ケモカインで保存されている 4つのシスティンは LARCでも保存されていることが明らかとなった。従って、得られたアミノ酸配列は新規のヒ卜 CCケモカインのものであると考えられる。

実施例 2

ノ一ザンブロッ卜解析による LARC tnRNAの発現解析

未刺激および 50 ng/mlの PMAで 6時間刺激したヒト T細胞株 Jurkat、ヒ卜血芽球系白血病株 K562、ヒ卜単球様細胞株 U937、およびヒ卜メラノーマ細胞株 Bowes から、 Quickprep Micro mRNA精製キット（Pharmac i a社製）を用いて、

poly(A)+RNAを抽出した。単離した poly(A)+RNA 2 μ gを、 0· 66Μ ホルムアルデヒドを含む U ァガロースゲル中で電気泳動にかけ、ナイロン膜（Hybond- Ν+、

Amersham 社製）に転写した。また各種のヒ卜組織より単離した poly(A)+RNA 2 μ g を、ァガロースゲル電気泳動にかけ、ナイロン膜に転写したもの（マルチプルティッシュブロット）は Clonetech社よリ購入した。これらの膜を、マルチプライ厶 DNA標識システム（Amersham 社製）により ³²Pで標識した LARCの 3' -RACE cDNAをプローブとして、ハイプリダイゼーシヨンを行った。ハイプリダイゼーショ溶液は 5x SSPE (lx SSPEは、 0.18M NaCL 0.01M リン酸ナトリウム、 pH 7, 5、 Im EDTA)、 50¾ ホルムアミド、 Vk ドデシル硫酸ナトリウム（SDS)、 10x Denhardt' s溶液、 100 ix g/mlサケ精子 DNAを用い、 42°Cで一晩ハイブリダィゼーションを行った。 0. Ix SS 0. 1¾ SDSの緩衝液、 50°Cの条件で膜の洗浄を行った後、その膜を X線フイルム（Kodak社製）に感光させ、それらを現像して解析した。各種のヒト細胞株の未刺激および PMAで刺激した後の LARC mRNAの発現をノーザンブロッ卜により解祈した結果を図 3 Aに示す。図 3 Α·では、（―）は無刺激、（+ ) は ΡΜΑ (50 ng/ml) で 6時間刺激した場合を示す。

各種のヒ卜組織での LARC mRNAの発現をノーザンブロッ卜にょリ解析した結果を図 3 Bに示す。図 3 A、図 3 Bともに内部対照として同じフィルターでの GAPDH (グリセルアルデヒド -3-リン酸デヒドロゲナーゼ）の mRNAのノーザンブロッ卜の結果も示している。図 3 Aは、 U937および Bowesで PMA刺激により LARC mRNA が誘導されてくることを表わしている。図 3 Bは、 LARCの mRMAは主に肝臓で構成的に、また肺でもやや弱く構成的に発現していることを表わしている。

実施例 3

組換え LARCタンパク質の発現および精製

組換え LARCタンパク質のカイコ細胞での発現と精製は以下のように行った。 LARCの翻訳開始コドンから翻訳終了コドンまでを含む DMA断片を Bgl I I と Not l で切り出し、 PVL1393バキュロウィルス転移ベクター（baculovi rus transfer vector, Invi trogen 社製）の BamH I と No 11部位に組み込み、 pVL- LARCを作製した。この組換えベクター pVL-LARCの遺伝子地図を図 4に示す。次に、組換えべクター pVL-LARCと致死的な欠失を持つ直線状の Autographa cal i fornica nuclear polyhedrosis vi rus (AcNPV)の DNA (Clontech社製）とを Sf9昆虫細胞

( Invi trogen社製）に同時にリポフエクチン（GIBC0- BRL社製）を用いて導入し、組換えバキュロウィルスを得た。得られた組換えバキュロウィルスは限界希釈法により純化し、さらに、 Sf9昆虫細胞に M.0. I. = 0. 1で感染させて、種ウィルスを得た。この種ウィルスを、 Tn5B-4昆虫細胞（Invi trogen社製）（150 cm² のフラスコあたり 1. 2x10⁷個）に M.0. に = 10から 20で感染させ、 EX-CELL 400 無血清培地 (JRH Biosciences社製）（150 cm² のフラスコあたり 30 ml) で、 27°Cで 2 日間培養した。その後、培養上清を回収し、 0.22 μ ιηのフィルターメンブランでろ過した。このろ液に 1/10容の 500 m 2-モルホリノエタンスルホン酸（MES) (pH 6.5) を加え、 A緩衝液（50 mM MES (pH 6.5) /100 mM NaCI) で平衡化した 1 mlの陽イオン交換 HiTrap-S column (Pharmac i a社製）に適用した。この LARCタンパク質の結合したカラムを A緩衝液で洗浄後、 45 mlの NaCIの塩濃度の勾配（0.1-1.0 M) により溶出した。 LARCタンパク質を含む分画は SDS- PAGEと銀染色を用いて同定した。

この LARCタンパク質を含む分画に最終濃度が 0· 05%となるように卜リフル才ロ酢酸（TFA)を加えた後、 A緩衝液 + 0.05¾！ TFAで平衡化したコスモシル 5C4- AR-300 カラム（Cosmo Bio社製）にかけ、 100 ml のァセトニ卜リル濃度勾配（20-40¾)を用いて溶出した。 LARCタンパク質の溶出パターンを図 5 Aに示す。 LARCタンパク質を含む分画を集め、真空乾燥でァセトニ卜リルを揮発させ、 PBSに対して透析して最終的な精製品を得た。タンパク質の濃度は BCA kit (Pierce社製）を用い、 BSAを対照として決定した。培養上清 1.5 リットルから 500 μ gの精製 LARCタンパク質が得られ、発現量は良好であった。混入しているエンド卜キシン量は Limulus amoebocyte !ysate assay (QCL- 1000、 Bio Wh i taker社製）を用いて定量すると、 4 pg/μ g以下であった。精製 LARCタンパク質の SDS- PAGEによる電気泳動と銀染色の結果を図 5 Bに示す。精製 LARCタンパク質の N末端アミノ酸配列は、アミノ酸シーケンサー（島津社製）を用いて決定し、 Ala- Ser-Asn-Phe-Aspであった。このァミノ酸配列は、図 1 に示した塩基配列から予測されるアミノ酸配列において 26位の Alaと 27位の Alaの間でシグナルべプチドが切断されたのち、 7 0個のアミノ酸からなる成熟型分泌タンパク質の推定される N末端アミノ酸配列と一致した。実施例 4

アル力リフォスファタ一ゼ標識 LARCの調製

(1 ) 融合タンパク質の調製リンパ球上のレセプターとの結合を検討するため、アルカリホスファターゼ- (ヒスチジン）₆ (SEAP(HIS)₆) と LARCとの分泌型融合タンパク質を調製する。

Clontech社製のプラスミツド pSEAP- Enhancerを錶型として、 SEAPをコードする領域をヒスチジンが 6個つながった配列である（ H i s ) ₆部分をカルボキシル端に付加した形でコードする領域を 5' -Xba卜 APプライマー（配列番号 4 ) と 3'- ?0115)₆- Notl プライマー（配列番号 5 ) を用いた PCRにより増幅した：

5' -Xbal-APプライマー

5' -CGCTCTAGAAGCTCCGGAATCATCCCAGTTGAGGAGGAGAAC-3' (配列番号 4 )

3'-AP(HIS)₆-Notl プライマー

5' -CGCGCGGCCGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGACCCGGGTGCGCGGCGTCGGT-3' (配列番号 5 ) 得られた PCR産物を制限酵素 Xbal と Notlで分解後、 pDREF-Hyg (itnai et aに， J. Biol. Chem. 271 : 21514-21521， 1996)の Xba I と No 11部位の間に導入し、組換えタンパク質を SEAP(HIS)₆との融合タンパク質として発現するためのベクター pDREF-SEAP(HIS)₆をまず作製した。このベクターの制限断片地図を図 7 Aに示す。次に、図 7 Aに示しているように、 pDREF- SEAP(His)₆ベクターの Sai l と Xbal部位の間に LARC cDNAの 0RFを挿入し、 LARCが 5個のアミノ酸からなるリンカ一

(Ser- Arg- Ser-Ser- Gly)を介して SEAP- (H I S) ₆と融合しているタンパク質をコードするベクター pDREF- LARC- SEAP(HIS)₆を作製する。このベクターを作製するため、まず LARCをコードする塩基配列を LARCの 3'- RACE cDNA (上記）を錶型として、 5'- SaU-LARCプライマー（配列番号 6) と 3' -LARC- Xba I プライマー（配列番号 7 ) を用いた PCRで増幅した：

5' - Sal卜 LARCプライマー

5' -CGCGTCGACAAAACCATGTGCTGTACCAAG-3' (配列番号 6 )

3' -LARC-Xbal プライマ一

5' -CGCTCTAGACATGTTCTTGACTTTTTTACT- 3' (配列番号 7 )

得られた PCR産物を制限酵素 Sal I と Xbalで分解後、 pDREF- SEAP (H I S) ₆の Sal I と Xbal部位の間に導入し、 pDREF-LARC- SEAP(HIS)₆を作製した。

pDREF- LARC- SEAP(HIS)₆ベクターを 293/EBNA- 1細胞（ i nv i ogen社製）にリボフェクチン（Gibco- BRL社製）を用いて導入した。培養 3— 4日後、培養上清を回収し、 0.45 μ mのポアサイズのフィルターに通し、 20 mM HEPES (ρΗ 7.4) と 0.02¾ アジ化ナトリウム（sodium azide) を加えて 4 °Cに保存した。

得られたヒ卜 LARC- SEAP融合タンパク質をニッケルァガロースカラム（Qiagen 社）を用いてァフィ二ティー精製し、生成融合タンパク質を SDS-PAGEによる電気泳動と Coomassie Bri I I iant Blue染色を行った。結果を図 7 Bに示す。

(2) LARC- SEAP (HIS) ₆の比活性の決定

産生された融合タンパク質（LARC- SEAP)はサンドウイツチ型の酵素結合免疫吸着検定（ELISA)によって定量した。即ち、 96穴マイクロテス卜プレー卜

(Maxsorb) (Nunc社製）を単クローン型抗胎盤アル力リホスファターゼ（ant i- PLAP) (Medix Biotech社製）（2 μ g/ml， 50m Tris-HCI, pH 9.5)でコートし、ゥシ血清アルブミン（BSA) (1 mg/ml, リン酸緩衝化食塩水（PBS) )でブロックした。検体は希釈液（0.02¾ Tween- 20を含む PBS)で希釈し、マイクロプレー卜に加えて室温で 1 時間反応後、希釈液で洗浄後、 500倍に希釈したビ才チン化ゥサギ抗 PLAP抗体を加えて 1 時間反応した。さらに洗浄後、パーォキシダーゼ結合ス卜レプ卜ァビジン（Vector社製）を加えて 3 0分間反応した。洗浄後、結合したパー才キシダーゼの活性を 3.3'- 5, 5'-テ卜ラメチルベンジジンで検出した。反応を 1 N H₂S0₄で停止し、 450 nmの吸光度を測定した。アルカリホスファターゼ（AP) の活性を Great EscApe Detection Kit (CI ontech社製）を用いたケミルミネセンス法で測定し、相対光量（Relative Light Un i t) (RLU)/sとして求めた。 AP標準曲線の作製は精製 PLAP(Cosmo B i o社製）を用いて行った。試験した SEAPと LARC- SEAPの相対光量は 1 pmo! 当たリそれぞれ 8· 7xl0⁷ RLU/sと 1· 7xl0⁸ RLU/sであった。

試験例 1

LARCの各種細胞に対する遊走活性 ( 1 ) リンパ球、単球および顆粒球細胞の調製

Lymphoprep (Nyegaard社製）による比重遠心法で健常人末梢血を単核球分画と沈殿分画に分離した。

単核球分画を磁気マイクロビーズ（paramagnetic microbeads)を結合した抗 CD14 (単球マーカー）と 30分間 4°Cで反応させ、次いで細胞浮遊液を磁場においた力ラム（VavioMACS) (Mi I tern Biotec社製）に通して CD14陽性細胞を除去することにより、リンパ球を分離した。単球は単核球分画をそのまま用いた。

顆粒球と赤血球を含む沈殿分画をヒドロキシェチルデンプン（Plasmas teri I) (Fresenius AG社）に懸濁し、赤血球を 30分間の沈降により除去し、さらに残留した赤血球は蒸留水処理により溶血して、顆粒球分画を得た。

(2 ) LARCの細胞遊走活性

LARCの細胞遊走活性は 48ゥ； Lルの走化性チャンバ一（Chemotaxis chamber) (Neuro Probe 社製）を用いて測定した。

実施例 3にて調製した精製組換えヒト LARCを緩衝液（ハンクス平衡塩溶液 + 0.1¾ ヒ卜血清アルブミン）で希釈し、下ゥエルに加え、穴のサイズが 5 /i mのポリカーボネー卜フイソレター (po I ycarbonate f i lter, Nuc I eopore 社製) で隔て、上ゥエルに上記（ 1 ) にて入手した各種細胞を加えた。

各種細胞がリンパ球の場合はフイブロネクチン（Gibco- BRL 社製）をコートしたポリビニルピロリドン（PVP)不含フィルターを、単球の場合は PVP処理したフィルターを、顆粒球の場合は PVPで処理されていないフィルターを用いた。反応は 37°Cでリンパ球が 4時間、単球が 2時間、顆粒球が 45分で行った。ヒ卜単球様細胞株 THP- 1の場合は 1時間行った。陽性対照としてはリンパ球と単球に対しては MCP- 3、顆粒球に対しては IL- 8を用いた。反応後、フィルターを固定し、 Diff- Quick (Harleco 社製）で染色し、 800倍の顕微鏡下で各穴について無作為に選んだ 10視野の細胞数をカウン卜した。遊走指数は得られた細胞数を陰性対照での細胞数で割って算出した。 LARCと陽性対照 MCP- 3のヒト単球様細胞株 THP- 1細胞に対するケモタキシス誘導を検討した結果を示すグラフを図 6 Aに、 LARCと陽性対照 MCP- 3のヒ卜末梢血単球に対するケモタキシス誘導を検討した結果を示すグラフを図 6 Bに、 LARCと MCP- 3のヒ卜末梢血リンパ球に対するケモタキシス誘導を検討した結果を示すグラフを図 6じに、そして LARCと陽性対照 IL- 8のヒ卜末梢血顆粒球に対するケモタキシス誘導を検討した結果を示すグラフを図 6 Dにそれぞれ示す。

図 6 Cに示されるように、リンパ球は濃度依存的に LARCに対して遊走した。また顆粒球も高濃度の LARCに対して遊走を示した（図 6 D) 。一方、単球や THP-1 は LARCに対し有意の遊走活性を示さなかった（図 6 A、 B) 。

試験例 2

アル力リフォスファターゼ標識 LARCのリンパ球への結合試験

結合試験は 20 mM HEPES (ρΗ 7.4)、 1 ¾ BSAおよび 0.02% アジ化ナトリウムを含む RPMI- 1640、 200 ml 中で行った。飽和型の結合実験の場合、 1 5°Cの条件で 5x10⁵個の細胞に各種濃度の LARC-SEAPを加えて 1 時間反応させた。非特異的結合の測定は〗 μ Mの非標識 LARCを存在させて行った。洗浄後、細胞を 50 μ I の 1¾ Triton X-100を含む 10 mM Tris-HCI (pH 8.0)で溶解し、細胞に由来するホスファターゼを 65°C10分間の処理で不活化し、遠心後、 25 μ Iの上清中の ΑΡ活性を測定した。 LARC- SEAP融合タンパクの濃度を変化させた場合のヒト末梢血リンパ球に対する特異的結合を示すグラフを図 8 Aに示す。このデータをもとに LIGANDプログラムによりスキャッチヤード解析（Scatchard plot)を行い、 Kdを求めた（図 8 B) 。 Kdは 0.4 nMで細胞 1 個当たり 2100部位であった。また排除型の結合実験として、 2xl0⁵の細胞に 1 nMの LARC- SEAPと各種の濃度の非標識 LARCを加え、室温で 1 時間反応させ、洗浄後、上記と同様に細胞溶解液中の AP活性を求めた。一定濃度（1 nM) の LARC-SEAPに対し非標識 LARCの濃度を変化させたときの LARC- SEAPのヒトリンパ球への結合量の変化を示すグラフを図 8 Cに示す。非特異的結合は 1 nMの SEAPを用いて測定した。さらに、 1 nMの LARC- SEAPに対し、 200 nMの各種の非標識ケモカインを加え、 LARC-SEAPの結合阻害実験を行った。得られた結果を図 8 Dに示す。 LARCの結合は LARCでのみ阻害され、調べた他の CC型および CXC型ケモカイン（TARCを除き全て PeproTech社製）では阻害されなかった。従って、リンパ球上の LARCレセプターは他のケモカインに対するレセプターとは異なる独立のレセプターであることが判明した。

試験例 3

LARCとその特異的レセプター GPR- CY4との結合試験

( 1 ) GP -CY4を発現する 293/EBNA- 1細胞および Raj i細胞の調製

GPR-CY4を発現させるために、まず GPR- CY4をコードする DMAの増幅を行った。 Genbank accession number U4598 の塩基配列に基づいて、 GPR-CY4 をコードする領域を増幅させるためのプライマーとして以下の HSU45984-Sal IF プライマー（配列番号 8) と HSU45984- NotlRプライマー（配列番号 9 ) を作製した。

HSU45984-Sal IF： 5' -CGCGTCGACGCCACCATGAATTTCAGCGATGTTTTCGA-3' (配列番号 8)

HSU45984-NotiR： 5' -CGCGCGGCCGCTCACATAGTGAAGGACGACGCAT-3' (配列番号

9)

ヒト活性化末梢血 cDNA ライブラリー（ Imai ら、 Journal of Biological Chemistry 271： 21514-21521, 1996) を錶型として、 GPR-CY4 をコードする領域を HSU45984-Sal IFプライマー（配列番号 8) と HSU45984- No 11 R プライマー（配列番号 9) を用いた PCRにより増幅し、得られた PCR産物を制限酵素 Sal I と Not I で同時に切断後、 pBluescript SK+ (Stratagene社製）の Sa I I と Not I サイトの間に導入した。得られたプラスミドから、 GPR- CY4をコードする領域を Sal I と Notl で切断後、 pDREF-Hyg ( Yoshida ら、 FEBS Letters 360: 155-159, 1995) の Sai l と Notl サイ卜の間に導入し、 pDREF-GPR- CY4 を作製した。このベクターを 293/EBNA- 1細胞（invitrogen社製、ヒト胎児腎臓細胞株）に I i pof ec tam i n (G i bco- BRL社製）を用いて導入した。 GPR- CY4 が導入された 293/EBNA- 1 細胞は、ハイグロマイシン (200 μ g/ml)存在下で 1 週間培養し、薬剤耐性を示す細胞を選択することにより得た。 Raji 細胞（ B細胞株）にはエレク卜口ポレーション法を用いて導入した。エレクト口ポレーシヨンは、バイオラッド社の Gene Pulser で、電圧 250V、静電容量 500 F で行った。 GPR-CY4 が導入された Raji 細胞は、ハイグロマイシン (200 μ g/ml)存在下で 1 週間培養し、薬剤耐性を示す細胞を選択することにより得た。

( 2 ) LARC- SEAP融合蛋白質の GPR-CY4を発現させた Raj i細胞への特異的結合結合実験に用いる標識 LARC として、 LARC と分泌型アルカリホスファターゼ

(SEAP) との融合タンパク質を用いた（Lusterら、 J. Exp. Med. 182, 219-231, 1995)。結合実験は 20 m HEPES (pH 7.4), 1% BSA, 0.02¾ sodium azide を含む RPM卜 1640, 200 ml 中で行った。図 9 Aに示した飽和型の結合実験の場合、 16°Cの条件で 2x10⁵個の細胞に各種の濃度の LARC-SEAPを加えて 1 時間反応させた。非特異的結合の測定は ImMの非標識 LARCを存在させて行った。洗浄後、細胞を 50 ml の 1¾ Tri ton X- 100を含む 10 mM Tris-HCI (pH 8.0)で溶解し、細胞に由来するホスファターゼを 65°C10分間の処理で不活化し、遠心後、 25 μ I の上清中のホスファタ一ゼ（ΑΡ) 活性を測定した。このデータをもとに LIGAND program により Scatchard plot (図 9 B) を行い、 Kdを求めた。 Kdは 0.9 nMで細胞 1 個当たりのレセプター数は 28, 800個であった。従って、 LARC- SEAP は GPR- CY4 に強く結合することがわかった。また排除型の結合実験（図 9 C) では 2xl0⁵の細胞に 1 nM の LARC- SEAP と各種の濃度の非標識 LARC を加え、 16°Cで 1 時間反応させ、洗浄後、上記と同様に細胞溶解液中のアルカリホスファターゼ活性を求めた。結合の強さを表す 50%阻害濃度は約 3.4nM であった。従って、 LARC は GPR- CY4 に強く結合することがわかつた。

次に、 LARCの GPR-CY4を発現させた Raj i 細胞への結合が他のケモカインにより競合されるか否かを調べた。 LARC- SEAP の濃度を 1 nM とし、非標識ケモカイン非存在下もしくは 200 nMの MCP- 1、 RANTES, IP-1 OL、 ΜΙΡ-1 β (全てべプロテック社製）、 TARCあるいは LARCの存在下での 2χ10⁵個の GPR- CY4を発現させた Raj i細胞への結合を 16°Cで 1 時間行った。非特異的結合は 1 nM の SEAP を用いて測定した。特異的結合量は、各種の非標識ケモカイン存在下で結合した LARC-SEAPの値から、非特異的に結合した SEAPの値を差し引いて求め、非標識 LARCの非存在下での特異的結合量を 100¾として計算した。その結果を、図 9 Dに示す。 LARC-SEAPの結合は非標識 LARC でのみ競合阻害され、他のケモカインでは結合阻害は認められなかった。従って、 GPR- CY4は他のケモカインとは強く結合せず、 LRACとのみ強く結合するレセプターであることがわかった。

( 3 ) ヒト LARCの GPR- CY4を発現させた 293/EBNA- 1細胞に対する遊走活性ヒ卜 LARCの GPR-CY4を発現させた 293/EBNA- 1 細胞に対する遊走活性を 48 ゥェルの走化性チャンバ一（chemotaxis chamber, Neuro Probe 社製）を用いて測定した。試験例 1 の記載に従い、昆虫細胞で発現させ精製した組換えヒ卜 LARC を緩衝液 [RPM卜 1640、 20 mM Hepes (pH 7.4)、 1¾ BSA] で希釈し、下ゥエルに加え、 lxlO⁵個の GPR-CY4を発現させた 293/EBNA- 1細胞を上ゥエルに加えた。コラーゲン IV溶液（20 μ g/ml 水溶液）で 37°C、 4 時間コートしたポリビニルピロリドン不含ポリカーボネー卜膜（口径 8 μ m、 Neuro Probe 社製）で上下ゥエルの分離を行った。 37°Cで 4時間培養後、膜を取り外し、 PBSで上側を洗浄し、固定及び染色を行った。遊走した細胞は 400倍の顕微鏡下で、 1 ゥエルにつき無作為に選んだ 5 視野について数を測定した。その結果を図 1 0に示す。図 1 0のグラフに示される様に、 GPR-CY4を発現させた 293/EBNA-1 細胞は LARC に対して濃度依存的に遊走した。すなわち、 LARC濃度約 1 から 1000 ng/ml においては LARC濃度の増加と共に GPR-CY4 を発現させた 293/EBNA-1 細胞の遊走が増加し、 1000 ng/ml で最大の遊走を示し、よリ高い濃度では逆に遊走が減少するといぅケモカインに特徴的なベル型の濃度依存性が観察された。一方、発現ベクターのみで LARC cDNAが導入されていない（Vector) 293/EBNA-1細胞に対し、 LARCは有意の遊走活性を示さなかった。 ( 4 ) ヒト LARCの GPR- CY4を発現させた 293/EBNA- 1細胞に対する細胞内カルシゥ厶濃度上昇活性

GPR-CY4 を発現させた 293/EBNA- 1 細胞を HBSS- BSA 緩衝液 [Hank' s 緩衝液に 1 mg/m l BSA と 10 m HEPES, pH 7. 4 を含む]で 3 x 10⁶個/ m l になるように懸濁し、さらに f u ra-PE3-AM (Texas F l uo res s en ce Labs社製）を 2 になるように加え、室温暗所で 1 時間培養した。 HBSS- BSA 緩衝液で 2 回洗浄した後、細胞を同緩衝液に 2 X 1 0⁶個/ m l になるように懸濁した。得られた細胞 2 m l に 1 00 nMの LARCを加えたときの蛍光度の変化を蛍光分光光度計（LS 50B, Pe rk i n E l me r) を用いて、励起波長 340 nmおよび 380 ηι 蛍光波長 51 0 nm、レスポンス 0. 2秒で測定した。その結果を、 340 nm および 380 nmで励起したときの 51 0 nm での蛍光の蛍光強度比で図 1 1 に示す。ヒト LARCは GPR-CY4を発現させた 293/EBNA- 1細胞に対して蛍光強度の比の上昇を誘導した。更に、連続したヒ卜 LARC の添加に対しては蛍光強度の比の上昇が認められない、いわいる脱感作も認められた。従って、本発明のヒト LARC は、 GPR- CY4 を発現させた 293/EBNA- 1 細胞に対して、特異的に細胞内カルシゥ厶濃度を上昇させる活性を有することがわかった。

産業上の利用の可能性

本発明は、肝臓や肺などで構成的に発現しており、 PMAのような免疫学的刺激により単球様細胞等から産生が誘導される CC型ケモカインである LARCに関する。白血球の遊走と組織への浸潤を誘導するケモカインは生体内での炎症反応や免疫反応にとって必須の物質である。ケモカインには現在、主に CXC型と CC型が知られており、それぞれに複数の種類が存在し、産生細胞、産生を誘導する刺激の種類、産生誘導から産生停止に到る反応時間、遊走を誘導する標的細胞の種類などに関し相互に異なる性質を示すことが知られている。 LARCは構造的には CC型ケモカインのグループに属し、おもにリンパ球に選択的に作用し、末梢血単核球を刺激すると産生が誘導されてくるほか、他のケモカインには知られていない特徴として、おもに肝臓で、そして弱く肺で構成的に発現しているという性質を示す。特に肝臓で構成的に発現していることから、肝臓でのリンパ球のホーミングや分化に関与していることが推測される。また単球様細胞株 U937を PMA刺激することによつて産生が誘導されてくることから、肝臓や肺、またその他の臓器や末梢組織での炎症および免疫反応で重要な働きをしていることが推測される。本発明の LARCは、その機能の解明により、特に肝臓でのリンパ球のホーミングと分化成熟、および肝臓での炎症反応や免疫反応の制御、さらに他の臓器や末梢での炎症反応や免疫反応、等を解明するのに有用であり、それにより、肝臓やその他の臓器また末梢での炎症反応または免疫反応を誘導したりあるいは抑制するための新たな手段を提供することができる。また、本発明によって提供される LARCの遺伝子およびその抗体は、 LARCの遺伝子変異およびその mRNAおよび夕ンパク質の発現状態を解析するのに有用であリ、血液系疾患および免疫系疾患の原因究明や診断に新たな手段を提供し、それによって血液系疾患および免疫系疾患の診断および治療方法の新たな開発が図られる。また本発明によって提供される LARCの遺伝子は適当なベクターに挿入され、 ex v i voで培養細胞に導入してから体内に戻したり、あるいは直接に体内に投与されることにより、 LARC遺伝子の異常による遺伝性疾患、各種の癌、および各種の感染症（特にエイズ）、炎症性疾患、免疫性疾患等を対象にした遺伝子治療の開発に有用である。

配列表

配列番号： 1

配列の長さ： 799

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： cDNA t o mRNA

起源

生物名：ヒ卜配列の特徴

特徴を表わす記号： CDS

存在位置： 59..346

特徴を決定した方法： S

配列

CACTCCCAAA GAACTGGGTA CTCAACACTG AGCAGATCTG TTCTTTGAGC TAAAAACC 58

ATG TGC TGT ACC AAG AGT TTG CTC CTG GCT GCT TTG ATG TCA GTG CTG 106

Met Cys Cys Thr Lys Ser Leu Leu Leu Ala Ala Leu Met Ser Val Leu

1 5 10 15

CTA CTC CAC CTC TGC GGC GAA TCA GAA GCA GCA AGC AAC TTT GAC TGC 154 し eu Leu His Leu Cys Gly G I u Ser G I u A I a A I a Ser Asn Phe Asp Cys

20 25 30

TGT CTT GGA TAC ACA GAC CGT ATT CTT CAT CCT AAA TTT ATT GTG GGC 202

Cys Leu Gly Tyr Thr Asp Arg l ie Leu His Pro Lys Phe I I e Val Gly

35 40 45

TTC ACA CGG CAG CTG GCC AAT GAA GGC TGT GAC ATC AAT GCT ATC ATC 250

Phe Thr Arg Gin Leu Ala Asn G I u Gly Cys Asp l ie Asn A I a l ie lie

50 55 60

TTT CAC ACA AAG AAA AAG TTG TCT GTG TGC GCA AAT CCA AAA CAG ACT 298

Phe His Thr Lys Lys Lys Leu Ser Val Cys Ala Asn Pro Lys Gin Thr

65 70 75 80

TGG GTG AAA TAT ATT GTG CGT CTC CTC AGT AAA AAA GTC AAG AAC ATG 346

Trp Val Lys Tyr l ie Val Arg Leu Leu Ser Lys Lys Val Lys Asn Met

85 90 95

TAA AAA CTG TGG CTT TTC TGG 367 AATGGAATTG GACATAGCCC AAGAACAGAA AGAACCTTGC TGGGGTTGGA GGTTTCACTT 427 GCACATCATG GAGGGTTTAG TGCTTATCTA ATTTGTGCCT CACTGGACTT GTCCAATTAA 487

TGAAGTTGAT TCATATTGCA TCATAGTTTG CTTTGTTTAA GCATCACATT AAAGTTAAAC 547

TGTATTTTAT GTTATTTATA GCTGTAGGTT TTCTGTGTTT AGCTATTTAA TACTAATTTT 607

CCATAAGCTA TTTTGGTTTA GTGCAAAGTA TAAAATTATA TTTGGGGGGG AATAAGATTA 667

TATGGACTTT CTTGCAAGCA ACAAGCTATT TTTTAAAAAA ACTATTTAAC ATTCTTTTGT 727

TTATATTGTT TTGTCTCCTA AATTGTTGTA ATTGCATTAT AAAATAAGAA AAACATTAAT 787

AAGACAAATA TT 799 配列番号： 2

配列の長さ： 2 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

GTACTCAACA CTGAGCAGAT CT 22 配列番号 3

配列の長さ： 1 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DMA

配列

AGGTGGAGTA GCAGCACT 18 配列番号 4

配列の長さ： 4 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DMA

配列

CGCTCTAGAA GCTCCGGAAT CATCCCAGTT GAGGAGGAGA AC 42

配列番号 5

配列の長さ： 5 3

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

卜ポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CGCGCGGCCG CTCAGTGATG GTGATGGTGA TGACCCGGGT GCGCGGCGTC GGT 53

配列番号 6

配列の長さ： 3 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DMA

配列

CGCGTCGACA AAACCATGTG CTGTACCAAG 30 配列番号 7

配列の長さ： 3 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DMA

配列

CGCTCTAGAC ATGTTCTTGA CTTTTTTACT 30 配列番号： 8

配列の長さ： 38

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DMA

配列

CGCGTCGACG CCACCATGAA TTTCAGCGAT GTTTTCGA 38 配列番号： 9

配列の長さ： 34

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸合成 DNA

配列

CGCGCGGCCG CTCACATAGT GAAGGACGAC GCAT 34

Claims

請求の範囲

1 · 配列番号 1 のアミノ酸残基 1 または 2 7からアミノ酸残基 9 6からなるァミノ酸配列を含有するヒ卜 CC型ケモカインまたはその断片もしくは変異体であるタンパク質。

2 . 配列番号 1 のアミノ酸残基 1 または 2 7からアミノ酸残基 9 6からなるァミノ酸配列に 1 または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる 1 またはそれ以上の変異を含み、かつ該ヒト CC型ケモカインの機能または活性と実質的に同じ程度である機能または活性を有している、請求項 1 に記載のヒ卜 CC型ケモカインの変異体タンパク質。

3 . 配列番号 1 のアミノ酸残基 1 または 2 7からアミノ酸残基 9 6からなるァミノ酸配列に 1 または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加の中から選ばれる 1 またはそれ以上の変異を含み、かつ該ヒ卜 CC型ケモカインの機能または活性を抑制する機能または活性を有している、請求項 1 に記載のヒト CC型ケモ力インの変異体夕ンパク質。

4 . 請求項 1 から 3のいずれかに記載のタンパク質を含有する医薬組成物。

5 . 請求項 1 から 3のいずれかに記載のタンパク質に対する抗体。

6 . 単クローン抗体である請求項 5に記載の抗体。

7 . 請求項 6に記載の単クローン抗体を産生するハイプリドーマ細胞。

8 . 請求項 1 から 3までのいずれかに記載のタンパク質をコードする塩基配列を含有する単離されたポリヌクレオチド分子。

9 . 配列番号 1 に記載の塩基配列の 5 9位の Aまたは 1 3 7位の Gから 3 4 6 位の Gからなる配列を有する請求項 8に記載のポリヌクレオチド分子、またはその塩基置換、塩基付加もしくはアレル変異による変異体分子。

1 0 . 配列番号 1 に記載の塩基配列の 1 位の Cから 7 9 9位の Tからなる配列を有する請求項 8に記載のポリヌクレオチド分子、またはその塩基置換、塩基付加もしくはァレル変異による変異体分子。

1 1 . 配列番号 1 に記載の塩基配列の 1位の Cから 7 9 9位の Tからなる配列の一部と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド分子、またはその塩基置換、塩基付加、アレル変異による変異体分子であって、請求項 1 記載のタンパク質の活性または機能を阻害する分子。

1 2 . 請求項 8から 1 1 までのいずれかに記載のポリヌクレオチド分子またはオリゴヌクレオチド分子を含有するベクター。

1 3 . 発現ベクターである請求項 1 2に記載のベクター。

1 4 . 請求項 1 2に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。

1 5 . 請求項 1 3に記載の発現ベクターを含有する請求項 1 4に記載の形質転換体。

1 6 . 宿主細胞がカイコ細胞である請求項 1 5に記載の形質耘換体。

1 7 . 請求項 1 5に記載の形質転換体を培養し、産生されたタンパク質を回収することを特徴とする、請求項 1 に記載のタンパク質を製造する方法。

1 8 . 請求項 8から 1 1 までのいずれかに記載のポリヌクレオチド分子、オリゴヌクレオチド分子またはその塩基置換、塩基付加もしくはアレル変異による変異体分子を含有する医薬組成物。

1 9 . 請求項 1 に記載のタンパク質のァゴニス卜、インバースァゴニス卜またはアンタゴニストをスクリーニングする方法であって、該ァゴ二スト、インバースァゴニス卜またはアンタゴニス卜を含むと推定される試料と該タンパク質に特異的なレセプタ一 GPR- CY4とを反応させ、その結合性およびまたは反応性を測定する工程を包含する方法。

2 0 . 請求項 1 9の方法によって見出されるァゴニスト、インバースァゴニス卜またはアンタゴニス卜。

不利にならない開示又は新規性喪失の例外に関する陳述

Statement Concerning Non-Prejudicial Disclosures or Exceptions to Lack of Novelty

( 1 ) 開示の日：平成 8年 7月 2 5日

(Date of Disclosure： 25 July, 1996) 開示の種類：刊行物発表

合同年会講演要寶集

(Embodiment of Disclosure： Disclosure on Publications

Abstract of Papers Presented at the Joint Annual Meeting)

( 2 ) 開示の日：平成 8年 8月 2 7日

(Date of Disclosure： 27 August, 1996) 開示の場所：北海道厚生年金会館

(Place of Disclosure: Hokkaiao Kouseinenkinkaikan) 開示の種類：学会発表

第 6 9回日本生化学会大会

第 1 9回日本分子生物学会年会合同年会

(Embodiment of Disclosure： Presentation m Conterence

69^th Annual Meeting of the Japanese Biochemical Society

19^th Annual Meeting of the Molecular Biology Society of Japan)