WO1998016636A1 - Molecule that homologizes genotype and phenotype and utilization thereof - Google Patents

Molecule that homologizes genotype and phenotype and utilization thereof

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WO1998016636A1
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    • C12N15/1062Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently

Description

明 細 遺伝子型と表現型の対応付け分子及びその利用 技術分野

本発明は、 遺伝子型と表現型の対応付け分子に関し、 更に詳しくは遺伝子型を 反映する塩基配列を有する核酸部と表現型の発現に関与するタンパク質を含む夕 ンパク質部とを含む遺伝子型と表現型の対応付け分子に関する。 本発明の対応付 け分子は、 進化分子工学、 すなわち、 酵素、 抗体、 リボザィムなどの機能性生体 高分子の改変において、 さらには生物から見出せない機能をもった生体高分子の 創製において用いうる極めて有用な物質である。

生化学や分子生物学や生物物理学の進歩によって、 生物は分子間の相互作用に よって作動し、 増殖する分子機械であることがわかってきた。 地球上の生物の最 も基本的な特性は、 遺伝情報が DMのヌクレオチド配列に保存されていること、 その情報が mRNAを介して機能をもつ夕ンパク質に翻訳されることである。 現在、 遺伝子工学の発達により、 配列の与えられたヌクレオチドゃぺプチドのような生 体高分子は容易につくることができるようになった。 今日、 脚光を浴びている夕 ンパク質工学や RNA工学もその遺伝子工学のおかげである。 夕ンパク質工学や RNA 工学の目標は、 特定の機能を果たすタンパク質や RNAの立体構造はどうあるべき かの問題を解決し、 人間が任意の機能をもった夕ンパク質や RNAを自由にデザィ ンすることにある。 しかし、 現在のタンパク質工学や RNA工学は、 その構造の多 様さと複雑さのために、 その立体構造に関する理論的なアプローチが困難であり、 活性部位の残基のいくつかを変えて、 構造と機能の変化をみる段階にとどまって いる。 それ故、 人間の英知によりタンパク質や RNAをデザインする段階に至って いない。

生体高分子の機能を高次生命現象の素過程とむすびつけて理解するには、 タン パク質分子の構造 ·機能相関を解明する必要がある。 ここに述べる我々の考えは、 「人知を尽くす」 ばかりでなく 「自然の知恵」 を借りるものである。 従来のタン - L - パク質工学の困難を克服し、 人間の望むままに機能性生体高分子を設計 ·作出し て行くには、 この両者を駆使し得る能力を身に付けねばならないと考えたからで ある。 新しい機能、 活性を持つタンパク質を設計するのにこの古典的な方法を転 用すれば、 部位特異的変異による夕ンパク質設計の難しさを回避できる場合があ る。 「自然の知恵を借りる」 と言っても良い。

この方法の欠点は、 新しい機能、 活性を持つ変異体をスクリーニングするのが 難しいことであるカ^ 最近脚光を浴びている RNA触媒は、 この困難さをクリアし ている。 非常に沢山のランダム配列 (101 3種類位) の RNAを合成し、 その中から 特定の性質をもつ RNAを選び出す試みがされている (Ellington, A. D. & Szostak, J. W. (1990) Nature, 346, 818-822) 。

これは進化分子工学の一つの例であるが、 この例が象徴的に示すように、 タン パク質の進化分子工学の第一目標は、 従来のタンパク質工学ではまつたく考えら れないほど広大な配列空間の探索をし、 その中から最適配列を選び出すことであ る。 この時、 「人知を尽くして」 スクリ一ニングの系を工夫すれば、 最適配列の 周辺に多数の準最適配列を発見でき、 「配列 -機能」 を研究するための実験系が 構築できるのもメリッ トである。

生体の優れた機能は、 進化の過程で獲得されたものであるから、 進化を再現で きれば、 実験室内において、 酵素、 抗体、 リボザィムなどの機能性生体高分子を 改変したり、 さらには生物から見出せなし、機能をもつた生体高分子を創製するこ とが出来るはずである。 タンパク質の改変 ·創製研究が、 工業用触媒としての酵 素利用、 バイオチップ、 バイオセンサ一、 糖鎖工学などバイオテクノロジ一の様 々な面において最重要課題であることは言うまでもない。

我々が有用なタンパク質を選び出す時、 今なお 「スクリーニング」 を重宝して いることに象徴されるように、 構造理論的な分子設計が未完成な現在、 進化的手 法はより効率的な方法として実学的な価値がある。 より効率的に進化を起こさせ る、 いわば「タイムマシン」 を実験室内につくりだすことができれば、 既存の酵 素、 抗体 (ワクチン、 モノクローナル抗体) などのタンパク質を改変するばかり でなく、 環境汚染物質の分解酵素や浄化剤など、 従来生物界に存在しなかつた酵 - o ~

素や新しいタンパク質を創製する道も拓かれる。 従って、 タンパク質の進化実験 系が立ち上がれば、 産業プロセスの省力化 '省エネ化、 エネルギー生産、 環境保 全などの多くの分野に積極的に利用可能であると予想できる。 本発明の対応付け 分子は、 夕ンパク質の改変などの進化分子工学において極めて有用な物質である。 背景技術

進化分子工学とは、 実験室内高速分子進化によって、 すなわち実験室において 生体高分子の配列空間の適応歩行の仕組みをしらべ、 それを最適化することによ つて機能性高分子の分子設計を行おうとする学問領域であり、 1990年に具体的成 果が出始めた全く新しい分子バイオテクノロジーである (伏見譲 (1991 ) 科学, 61, 333 340 ; 伏見譲 (1992) 講座進化, 第 6巻,東大出版会) 。

生命は分子進化と自然選択の所産である。 分子の進化は普遍的な生命現象であ るが、 その機構は何も過去の進化の歴史を跡づける研究によってのみ解明される わけではない。 むしろ、 実験室の中に単純な進化する分子 ·生命系を構築し、 そ の挙動を研究するというアプローチの方が、 分子進化に関する基本的な知見を与 え、 検証可能な理論の構築と、 その分子工学的応用を可能にする。

高分子系が次の 5つの条件を満たせば、 進化することがわかっている。 すなわ ち、 (1 )平衡から遠く離れた開放系、 (2) 自己増殖系、 (3) 突然変異系、 (4) 遺伝子型と表現型の対応付け戦略をもつ系、 (5) 配列空間上に適切な適応度地 形をもつ系、 である。 (1 ) と (2) は自然淘汰が起こる条件で、 (5 ) は生体高 分子の物性ですでに決まっている。 自然淘汰による進化は、 (4) の遺伝子型と 表現型の対応付けを前提としている。

自然界でも進化分子工学でも次の 3種の戦略が採用されている。 すなわち、 ( a ) 遺伝子と表現型を同一分子上にのせるリボザィム型、 (b ) 遺伝子型と表 現型の複合体を形成するウィルス型、 (c ) 遺伝子型と表現型を一つの袋に入れ る細胞型、 である (第 1図) 。

( a ) の遺伝子型と表現型を同一分子にのせるリボザィム型は、 単純な系のた め、 これまで RNA触媒 (リボザィム) で成功をおさめている (柳川弘志, ( 1993) RNAのニューエイジ, pp. 57- 77, 羊土社) 。

( c ) の細胞型の問題点として、 (1 )平均化効果、 (2)偏奇効果、 (3)ランダム 複製効果が考えられる。 平均化効果は細胞のゲノムのコピー数が多い場合、 遺伝 子型と表現型の対応付けが統計的に平均化され、 あいまいになるため生ずる。 細 胞内ではコピー数 (n ) の中の一つに過ぎないために性能向上は平均化され、 淘 汰係数 ( s ) Znで細胞集団内生存競争を始める。 それ故、 コピー数 (n ) はで きるだけ小さい方が細胞型には有利である。 しかし、 偏奇効果があるために、 セ グメント数が多い場合、 偏奇効果を防ぐためには nは非常に大きくなくてはなら ない。 したがって、 細胞集団内生存競争におけるみかけの淘汰係数は、 ウィルス 型に比べて極めて小さいことが予想される。 淘汰に要する時間は淘汰係数の逆数 に比例するから、 進化速度はウィルス型に比べて極めて遅くなる。 さらに、 (.3) のランダム複製効果は細胞型にとって致命的である。 この効果は、 セグメント化 された必須遺伝子がランダムに複製されるため、 細胞分裂前に必須遺伝子のすべ てを複製することは極めて困難なことによる。 このことは、 有利突然変異がある 必須遺伝子に生じても、 それが複製されて娘細胞に伝わる確率は極めて小さいこ とを意味する。

効率よく進化するためには (b ) のウィルス型のように遺伝子型と表現型を一 体化させる必要がある。

すでに (b ) の遺伝子型と表現型の複合体を形成するウィルス型の進化分子ェ 学として、 ファージ .ディスプレイ (Smith, G. P. (1985) Science 228, 1315-1317; Scott, J. K. & Smith, G. P. (1990) Science 249, 386-390 ) 、 ポリソ ーム 'ディスプレイ (Mattheakis, L. C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022-9026) 、 コ一ド化タグ付ライブラリ一 (Brenner, S. & Lemer, R. A. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5381-5383) 、 セルスタツ ト (Husimi, Y. et al. (1982) Rev. Sci. Instrum. 53, 517-522) をはじめ、 様々な手 法が提案され、 開発されつつある。

しかし、 探査可能な配列空間の大きさが進化分子工学において重要であるにも かかわらず、 現在のところこれらのウィルス型においては、 リボザィム型並みの - 0 - 配列空間のグローバルな探査法は確立していない。

その理由として、 ファージ 'ディスプレイなどの現在のゥィルスを利用した場 合、 現在の細胞に寄生しているために、 どうしても宿主である細胞によって次の ような制限を受ける。 すなわち、 (1)細胞に規制されるため、 限られた配列空間 しか探査できない、 (2)膜透過性、 (3)宿主によるバイアス、 (4)宿主の個体数に よるライブラリーの制限、 などである。

ポリソ一ム ·ディスプレイ法 (Mattheakis, L. C. & Dower, W. J. ( 1995) WO 95/11922) は、 リボソームを介して核酸とタンパク質を非共有結合で結び付け ているため、 ペプチド位の鎖長の短いものには向いているが、 タンパク質のよう に鎖長が長くなると、 その取り扱いが問題になる。 特に、 巨大なリボソームをく わえたままなので、 選択操作 (たとえば、 吸着 ·溶出など) の際に条件の制約を 強く受ける。 コード化タグ付ライブラリ一 (Janda, F. H. & Lerner, R. A. (19 96) WO 96/22391 ) は、 ビーズを介して化学合成したペプチドと核酸のタグを対 応させているが、 現在の技術では 100残基程度の夕ンパク質の化学合成は収率が 非常に悪いため、 鎖長の短いペプチドには使えるが、 鎖長の長いタンパク質には 使用できない。

これらの問題点を乗り越える一つの方法として無細胞翻訳系の利用が考えられ る。 無細胞系の中で遺伝子型と表現型を単純に結合したウィルス型戦略分子の長 所を挙げてみると、 (1 ) リボザィム型にせまる莫大な変異体集団を合成できる、 (2) 宿主に依存しない多種多様のタンパク質の創製、 (3) 膜透過性の問題がな い、 (4) 21番目のコードが利用でき非天然のアミノ酸を導入できる、 などであ る o 発明の開示

本発明の目的は、 上記ウィルス型戦略分子の長所を有する、 ファージよりも効 率よく、 環境条件設定上の制約の少ないウィルス型作業レブリコン、 つまり、 in vitroウィルスと呼ぶべき核酸と夕ンパク質との間が化学結合で結びついた分子、 すなわち、 遺伝子型と表現型が対応づけられた分子の提供にある。 更に詳述すれ ば、 本発明は、 機能性タンパク質やペプチドの創出に利用し得る、 遺伝子型 (核 酸) と表現型 (タンパク質) の対応付けを無細胞タンパク質合成系を用いて行い、 リポソ一ムの上で遺伝子の 3'末端部と夕ンパク質の C末端部を共有結合で連結さ せ、 情報と機能に 1 : 1の対応関係をもつ分子の提供を目的としてなされたもの である。 また、 形成された遺伝子型と表現型の対応付け分子 (以下、 「in vitro ウィルス」 ともいう) を試験管内淘汰法により選択し、 選択された in vitroウイ ルスの遺伝子部分を逆転写 PCRにより増幅し、 さらに変異を導入しながら増幅す る操作を繰り返すことにより、 莫大な配列空間を探査し、 目的とする機能性タン パク質やべプチドを得ることを目的とする。

本発明者等は上記目的を達成すべく鋭意研究の結果、 無細胞夕ンパク質合成系 のリポソーム上で核酸とタンパク質が化学的に結合した二種類の遺伝?型と表現 型の対応付け分子が構築し得ることを見出した。 さらに、 その対応付け分子 (in vitroウィルス) を試験管内淘汰法により淘汰し、 選択された in vitroウィルス の遺伝子部分を逆転写 PCRにより増幅し、 さらに変異を導入しながら増幅する夕 ンパク質の進化実験系が構築し得ることを見出した。 本発明はこれらの知見に基 づ 、て成し遂げられたものである。

すなわち本発明は、 遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸部と、 表現型の 発現に関与するタンパク質を含む夕ンパク質部を含み、 前記核酸部と前記夕ンパ ク質部が直接化学結合している、 遺伝子型と表現型の対応付け分子を提供する。 本発明の好ましい態様によれば、 核酸部の 3'末端とタンパク質部の C末端とが 共有結合してなる上記の対応付け分子、 及び、 タンパク質部の C末端と共有結合 する核酸部の 3'末端がピューロマイシンである上記の対応付け分子が提供される。 また、 本発明の好ましい態様によれば、 核酸部が、 タンパク質をコードする遺 伝子を含み、 タンパク質部が該核酸部の遺伝子の翻訳産物である上記の対応付け 分子が提供される。 核酸部は、 好ましくは、 RNAからなる遺伝子と、 前記遺伝子 にスぺ一サ一を介して連結したサブレッサ一 tiRNAとを含む。 サブレッサ一 tRNAは、 好ましくは、 前記遺伝子の終始コドンに対応するアンチコドンを含む。 あるいは、 核酸部は、 RNAからなる遺伝子と、 MAと RNAまたは DNAとポリエチレングリコール からなるスぺ一サ一部分とを含む。 また、 核酸部は、 DNAからなる遺伝子と DNAと RNAからなるスぺ一サ一部分とを含んでもよい。

さらに本発明の別の態様により、 (a) 遺伝子を含む DNAの 3'末端側にサブレツ サ一 tRNAに対応する配列の MAをスぺ一サ一を介して連結し、 (b) 得られた MA 連結体を転写して RNAにし、 (c) 得られた RNAの 3'末端に、 アミノ酸あるいはァ ミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、 ヌクレオシドぁ るいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を連結し、 (d) 得ら れた連結体を mRNAとして無細胞タンパク質合成系で夕ンパク質合成を行い、 遺伝 子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物を連結することを特徴とする遺伝子型と 表現型の対応付け分子の構築方法、 及び (a) 終止コドンをもたない遺伝子をふ くむ DNAを作成し、 (b) 作成した DNAを転写して RNAにし、 (c) 得られた RNAの 3' 末端側に DMと RNAのキメラのスぺ一サーを連結し、 (d) さらに得られた連結体 の 3'末端側に、 アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質 と共有結合し得る、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格 を有する物質を連結し、 (e) 得られた連結体を mRNAとして無細胞タンパク質合 成系で夕ンパク質合成を行い、 遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物を連 結することを特徴とする遺伝子型と表現型の対応付け分子の構築方法が提供され る

また、 この発明の好ましい態様によれば、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシド に類似した化学構造骨格を有する物質がピューロマイシンである上記構築方法が 提供される。

また、 この発明の別の様態により、 (a) 終止コ ドンをもたない遺伝子をふく む DNAを作成し、 (b) 作成した MAを転写して RNAにし、 (c) 得られた RNAの 3'末 端側に DNAとポリエチレングリコールのキメラのスぺ一サ一を連結し、 (d) さら に得られた連結体の 3'末端側に、 アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造 骨格を有する物質と共有結合し得る、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似 した化学構造骨格を有する物質を連結し、 (e-) 得られた連結体を mRNAとして無 細胞夕ンパク質合成系でタンパク質合成を行い、 遺伝子を含む核酸部と前記遺伝 子の翻訳産物を連結することを特徴とする遺伝子型と表現型の対応付け分子の構 築方法が提供される。

また、 この発明の別の態様により、 (a) 終止コドンをもたない遺伝子を含む!) NAを作成し、 (b) 作成した DNAを転写して RNAにし、 (c) 得られた RNAの 3'末端 側に二本鎖の DNAのスぺーサ一を連結し、 (d) さらに得られた連結体の 3'末端側 に、 アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合 し得る、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物 質を連結し、 (e) 得られた連結体を mRNAとして無細胞夕ンパク質合成系で夕ン ノ、°ク質合成を行い、 遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物とを連結するこ とを特徴とする、 遺伝子型と表現型の対応付け分子の構築方法が提供される。 さらにまた、 この発明の別の態様により (a) 終止コドンをもたない遺伝子と スぺ一サ一の塩基配列とを含む MAを作成し、 (b) 作成した DNAを転写して RNAに し、 (c) 得られた RNAの 3'末端側に、 アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学 構造骨格を有する物質と共有結合し得る、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに 類似した化学構造骨格を有する物質を連結し、 (d) 得られた RNAの連結体の遺伝 子部分の 3'末端側の部分に短鎖の PNAまたは DNAを加えて二本鎖を形成させ、 (e) 得られた連結体を mRNAとして無細胞夕ンパク質合成系で夕ンパク質合成を行い、 遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物とを連結することを特徴とする、 遺 伝子型と表現型の対応付け分子の構築方法が提供される。

またさらに、 本発明の別の様態により、 上記の構築方法により、 遺伝子を含む DNAから、 対応付け分子を構築する構築工程と、 構築工程で得られた対応付け分 子を淘汰する淘汰工程と、 淘汰工程により選択された対応付け分子の遺伝子部分 に変異を導入する変異導入工程と、 変異導入工程で得られた遺伝子部分を増幅す る増幅工程とを含むことを特徴とするタンパク質の進化実験方法が提供される。 進化実験方法においては、 好ましくは、 増幅工程で得られた DNAを構築工程に供 することにより、 構築工程、 淘汰工程、 変異導入工程及び増幅工程が繰り返し行 われる。 また、 遺伝子を含む DNAの 3'末端側にサブレッサ一 tRNAに対応する配列 の DNAをスぺ一サーを介して連結する第一連結手段、 第一連結手段で得られた DNA 連結体を RNAに転写する転写手段、 転写手段で得られた RNAの 3'末端に、 アミノ酸 あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、 ヌク レオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を連結する 第二連結手段、 及び、 第二連結手段で得られた連結体を mRNAとして無細胞タンパ ク質合成系で夕ンパク質合成を行い、 遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産 物を連結する第三連結手段を含む対応付け分子の構築手段、 または、 遺伝子を含 む DNAを RNAに転写する転写手段、 転写手段で得られた RNAの 3'末端側に DNAと RNA のキメラもしくは DNAとポリエチレングリコールのキメラもしくは DMと MAから なる二本鎖もしくは RNAと短鎖のぺプチド核酸(PNA) もしくは DNAからなる二本鎖 のスぺ一サ一を連結する第一連結手段、 第一連結手段で得られた RNA スぺーサー 連結体の 3'末端に、 アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する 物質と共有結合し得る、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造 骨格を有する物質を連結する第二連結手段、 及び、 第二連結手段で得られた連結 体を mRNAとして無細胞夕ンパク質合成系で夕ンパク質合成を行い、 遺伝子を含む 核酸部と前記遺伝子の翻訳産物を連結する第三連結手段を含む対応付け分子の構 築手段と、 構築された対応付け分子を淘汰する手段と、 選択された対応付け分子 の遺伝子部分に変異を導入する手段と、 変異導入された遺伝子部分を増幅する手 段とを備えることを特徴とする、 上記の進化実験方法を行う装置も提供される。 さらに、 本発明の別の態様により、 上記の構築方法により対応付け分子を構築 する構築工程と、 構築工程で得られた対応付け分子と他の夕ンパク質または核酸 との相互作用を調べる検定工程とを含むことを特徴とするタンパク質一タンパク 質または夕ンパク質一核酸相互作用の検定方法が提供される。 図面の簡単な説明

第 1図は、 遺伝子型 (核酸部) と表現型 (タンパク質部) の対応付け戦略を示 す図である。

第 2図は、 核酸部とタンパク質部が部位指定 である、 本発明の遺伝子型と表 現型の対応付け分子の構築方法を示す図である。 第 3図は、 遺伝子型と表現型の対応付け分子 (in vitroウィルス) 構築のボイ ントとなる核酸部 3'末端の化学修飾部を示す図である。

第 4図は、 核酸部とタンパク質部が部位非指定的である、 本発明の遺伝子型と 表現型の対応付け分子の構築方法を示す図である。

第 5図は、 部位指定的方法におけるスぺーサ一の最適化を示す電気泳動写真で ある。 作成した a,b,c画分の長さのスぺ一サ一をもつそれぞれの RNAゲノムをピオ チン化リジン tRNAと一緒に大腸菌無細胞翻訳系で翻訳した後、 ストレプトァビジ ン付き磁性体粒子に特異的に吸着させ、 逆転写し、 PCRにより増幅された DNAの、 4%ポリアクリルアミ ド電気泳動 (8M尿素存在下) の結果である (染色は銀染色) 。 レーン 1は a画分のスぺ一サ一の長さ (255- 306残基) のもの、 レーン 2は b画分 のスぺ一サ一の長さ (102-238残基) のもの、 レーン 3は c画分のスぺーサ一の長 さ (0-85残基) のものである。

第 6図は、 部位指定的方法による核酸部とタンパク質部との連結を示す電気泳 動写真である。 レーン 1はタウタンパク質の 4リピ一ト領域をコードする niRNAを 大腸菌無細胞翻訳系で [ 3 5S]メチォニンを用いてラベルした翻訳産物、 レーン 2 は該 mRNAの 3'末端にピューロマイシンをもつ sup tRNAを連結し、 この inRNAの 5'末 端を [ 3 2P]でラベルし、 大腸菌無細胞翻訳系で翻訳した産物の、 18%ポリアクリル アミ ド電気泳動 (8M尿素、 SDS存在下) の結果である。

第 7図は、 部位非指定的方法による核酸部とタンパク質部との連結を示す電気 泳動写真である。 レーン 1はタウタンパク質の 4リピ一ト領域をコ一ドする mRNA を大腸菌無細胞翻訳系で [ 3 5S]メチォニンを用いてラベルした翻訳産物、 レーン 2は該 mRNAの 3'末端に DNAスぺ一サ一を介し、 5'末端を [ 3 2P]でラベルしたピュー ロマイシンを連結した mRNAを大腸菌無細胞翻訳系で翻訳した産物、 レーン 3はレ —ン 2の翻訳産物をリボヌクレア一ゼ T2で消化したものの、 18%ポリアクリルァ ミ ド電気泳動 (SDS存在下) の結果である。

第 8図は、 本発明の遺伝子型と表現型の対応付け分子 (in vitroウィルス) の 構築方法の一例を示す図である。 - 第 9図は、 ヒトタウタンパク質の N末端半分 (1 165) の C末端への rCpPurの - 11 - 結合を示す電気泳動写真である。 3つのゲノムすなわちヒトタウタンパク質の Ν 末端半分 (1 165) をコ一ドする mRNAの 3'末端に、 ストップコドンをもつが DNAス ぺ一サ一はもたないもの (左端のレーン) 、 ストップコドンと DMスぺーサ一の 両者をもたないもの (左から 2番目のレーン) 、 ストップコドンはもたないが DN Aスぺ一サ一をもつもの (左から 3番目のレーン) をそれぞれ構築し、 32Pで標識 した rCpPur存在下でゥサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞翻訳系で 30°Cで 20分 間翻訳を行わせた。 翻訳産物は 11.25% SDS- PAGEで分析した。 右端のレーンはヒ トタウタンパク質の N末端半分 (1-165) をコードする mRNAを [35S]メチォニン 存在下で上と同じ条件下で翻訳させたものである。

第 10図は、 無細胞翻訳系での in vitroウィルスの生成を示す電気泳動写真で ある。 (A)は in vitroウィルスの生成の時間経過を示している。 ヒ 卜タウタンパ ク質の N末端半分 (1-165) をコードする mRNA DNAスぺ一サ一 (105 mer) ーぺプ チドアクセプ夕一— rCpPurからなるゲノムを [35S]メチォニンを含むゥサギ網状 赤血球抽出液を用いた無細胞翻訳系で翻訳させ、 その翻訳産物を 30°Cで時間を追 つて (5分、 10分、 20分、 40分) 調べた。 翻訳産物は 11.25% SDS- PAGEで分析した。 左端のレーンはヒト夕ウタンパク質の N末端半分 ( 165) をコードする RNAを mR NAとして用い、 上と同じ条件下で [35S]メチォニンのタンパク質への取り込みを 調べたものである。 右端のレーンは32 Pで標識された in vitroウィルスゲノムで ある。 (B)は in vitroウィルスの生成に対する in vitroウィルスゲノムの濃度の 影響を示している。 レーン 1はゲノムの 3'末端を [32P]rCpPurでラベルしたもの、 レーン 2はゲノム (1.2〃 g) の 3'末端に rCpPurがついたもの、 レーン 3はゲノ ム (0.33// g) の 3'末端に rCpPurがついたもの、 レーン 4はゲノム (0.64 z g) の 3'末端に rCpPurがついたものである。 レーン 2〜4は、 ゲノムを [35 S]メチォ ニンを含むゥサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞翻訳系で、 30°Cで 20分間翻訳 させた。 翻訳産物は、 11.25% SDS-PAGEで分析した。

第 1 1図は、 無細胞翻訳系での in vitroウィルスの生成を示す電気泳動写真で ある。 ヒトタウタンパク質の N末端半分 (1-165) をコ一ドする mRNA DNAスぺ一 サ一 (105 mer) —ペプチドァクセプ夕一一 [32P]rCpPurからなる in vitroウィル - 1 L - スゲノムを、 ゥサギ網状赤血球抽出液を用い、 30°Cで 20分間翻訳させた。 翻訳産 物は 11. 25% SDS- PAGEで分析した。 ゲノムとタンパク質の結合はナタ豆 (mung bean) のヌクレア一ゼで消化することによって確認された。 翻訳産物 (レーン 3 ) をナタ豆のヌクレア一ゼで消化すると、 ヒ トタウタンパク質の N末端半分 (卜 165) のモノマーとダイマ一 (レーン 1 ) に相当する位置にバンドが現われ た (レーン 4 ) 。 レーン 2は3 2 Pで標識された in vitroウィルスゲノムである。 第 1 2図は、 in vitroウィルスを用いたタンパク質の進化実験方法の工程を示 す図である。 発明を実施するための最良の形態

本明細書において、 いくつかの術語を用いるが、 ここで用いるときそれらの術 語は次の意味を有する。 「核酸部」 とは、 靈、 DNA、 PNA (Peptide nucleic acid, ぺプチド核酸;核酸塩基がァミノ酸類似体を介してつながった重合体) などのよ うなヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質の 連結体を意味し、 「タンパク質部」 とは、 天然アミノ酸、 非天然アミノ酸などの ようなアミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質の連結体 を意味する。 「サブレッサ一 tRNA (sup tRNA) 」 とは、 mRNA上の終止コドンをあ るアミノ酸に対応するコドンとして読むなどのように、 構造変化することにより 変異を抑圧することができる tRNAをいう。 「遺伝子型を反映する塩基配列を有す る」 とは、 遺伝子型に関係する遺伝子またはその部分を含むことを意味する。 「表現型の発現に関与するタンパク質を含む」 とは、 それ自体の発現が表現型の 形質となつたり、 酵素等としての働きにより表現型の形質の発現に関わつたりす るタンパク質を含むことを意味する。

核酸部の 3'側に位置するスぺ一サ一は、 好ましくはその長さ力 s'lOO A以上、 さ らに好ましくは 100〜1000 Α程度の高分子物質であれば如何なる物であっても良 い。 具体的には、 天然または合成の DNAや RNAの一本鎖、 DNAと DNAの二本鎖、 RNA と短鎖 (例えば 15〜25ヌクレオチド程度) の PNAまたは DNAからなる二本鎖、 多糖 類等の高分子物質や、 ポリエチレングリコール、 好ましくは分子量3,000〜30,00 - 1 ό - ο程度のポリエチレングリコール等の有機合成高分子物質等を挙げることができ る。

本発明の対応付け分子の核酸部と夕ンパク質部は、 共有結合などの化学結合で 連結される。 特に、 核酸部 3'末端のヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似し た化学構造骨格を有する物質あるいはその連続体と、 タンパク質部 C末端のァミ ノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質が化学的に結合、 例 えば共有結合したものが好ましい。

核酸部とタンパク質部の結合には、 例えば、 核酸部の 3'末端に化学結合として アミ ド結合を有するピューロマイシン (Puromycin) 、 3' アミ ノアシルピュー ロマインンァ ノヌクレ ン r ( 3'-N-Aminoacylpuromycm aminonucleoside, P ANS-ァミノ酸) 、 例えばァミノ酸部がグリシンの PANS-Gly、 ノくリ ンの PANS- Val、 ァラニンの PANS Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する PANS 全アミノ酸が利用で きる。 また、 化学結合として 3' -アミノアデノシンのァミノ基とァミ ノ酸のカル ボキシル基が脱水縮合した結果形成されたァミ ド結合でつながった 3' -N-アミノ アンノレァァノシンア ノメクレ 1 ン ト (3'-Aminoacylaaenosine aminonucleoside, AANS-ァミノ酸) 、 例えばァミノ酸部がグリシンの AANS Gly、 バリ ンの AANS -Val、 ァラニンの AANS- Ala、 その他、 全アミノ酸に対応する AANS-全アミノ酸が 利用できる。 また、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドとアミノ酸のエステル結 合したものなども利用できる。 その他、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシ ドに類 似した化学構造骨格を有する物質と、 アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学 構造骨格を有する物質を化学的に結合可能な結合様式のものなら全て利用するこ とができる。

本発明の遺伝子型と表現型の対応付け分子は、 例えば、 以下に示す (1 ) 核酸 部とタンパク質部の結合が部位指定的な方法、 または (2) 核酸部とタンパク質 部の結合が部位非指定的な方法によつて構築することができる。

先ず、 (1 ) 核酸部とタンパク質部の結合が部位指定的な方法について述べる。 この方法においては、 (a) 遺伝子を含む DNAの 3'末端側に sup tRNAに対応する 配列の MAをスぺ一サ一を介して連結し、 (b) 得られた DNA連結体を転写して KNA WO 98/16636 , t PCT/JP97/03766 - 1 4 ―

にし、 (c) 得られた RNAの 3'末端に、 アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学 構造骨格を有する物質と共有結合し得る、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに 類似した化学構造骨格を有する物質、 例えばピューロマイシンを連結し、 (d) 得られた連結体を mRNAとして、 無細胞タンパク質合成系、 例えば大腸菌の無細胞 夕ンパク質合成系でタンパク質合成を行うことにより、 (e) 遺伝子 RNA (遺伝子 型) とその翻訳産物のタンパク質 (表現型) とが、 ヌクレオシドあるいはヌクレ オシドに類似した化学構造骨格を有する物質、 例えばピュー口マイシンを介して 化学的に結合した遺伝子型と表現型の対応付け分子を構築することができる。 すなわち、 本発明の方法によれば、 タンパク質の合成において、 リボソームの Aサイ 卜に終止コドンが来たときに sup tRNAが対応して入り、 ぺプチジルトラン スフヱラーゼの作用により、 sup tRNAの 3'末端のヌクレオシドあるいはヌクレオ シドに類似した化学構造骨格を有する物質、 例えばピューロマイシンが夕ンパク 質と結合する (第 2図) 。 だから、 この方法は核酸部とタンパク質の結合が遺伝 コ一ドに依存した部位指定的である。

ピューロマイシン (第 3図) は細菌 (Nathans, D. (1964) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 51, 585-592 ; Takeda, Y. et al. ( 1960) J. Biochem. 48, 169 17 7) 及び動物細胞 (Ferguson, J. J. (1962) Biochim. Biophys. Acta 57, 616 6 17 ; Nemeth, A. M. & de la Haba, G. L. ( 1962) J. Biol. Chem. 237, 1190 11 93) のタンパク質合成を阻害することが知られている。 ピューロマイシンの構造 はアミノアシル tRNAの構造と類似していて、 リボソームの Pサイ 卜に結合してい るぺプチジル tRNAと反応し、 ぺプチジルビユ一口マイシンとしてリポソームから 遊離するためタンパク質合成が中断される (Harris, R. J. (1971 ) Biochim. Bi ophys. Acta 240, 244 262) 。

ネイティブ(native)な sup tRNAを精製して mRNAに連結する方法は、 sup tRNAの 精製やアミノ酸と tRNAの 3' 末端のエステル結合の加水分解のし易さなどの問題 があり実用的ではない。 これまで、 tRNA identityの研究で未修飾の tRNAがイン タク ト(intact)な tRNAと同様にアミノアシル化されることや、 アミノアシル化さ れた未修飾の tRNAがリポソ一ムに取り込まれ翻訳されることがわかっている (Shimizu, M. et al. (1992) J. Mol. Evol. 35, 436-443) 。 また、 sup tRNAを作成 するために、 tRNAのアイデンティティ一が利用されている。

ァラニン、 ヒスチジン、 ロイシンのアミノアシル合成酵素は、 これらのアンチ コドンを認識していないことがわかっている (Tamura, K. et al. (1991) J. Mol. Recog. 4, 129-132) 。 したがって、 ァラニンの tRNAのアンチコドンを終止コドン

(例えば、 アンバー) に変えると、 終止コドンに対応してァラニンの tRNA (sup tRNA) が取り込まれることが期待できる。

ここで問題になるのが、 通常の tRNAと異なり、 RNAse Pなどによって 5'側が整 形されていない tRNAでもリボソームの Aサイ 卜に入るかどうかである。 これは本 モデルの可否を決定する上で、 調べなければならない最も重要な課題である。 Brome Mosaic Virus (BMV) や Turnip Yellow Mosaic Virus (TYMV) は、 そ の 3'末端が tRNA様構造をしており、 ァミノアシルシンテ夕一ゼによりアミ ノアシ ル化され、 無細胞翻訳系で 1 %の効率でァミノ酸が取り込まれることがわかって いる (Chen, J. M. & Hall, T. C. (1973) Biochemistry 12, 4570 4574) 。 BMV の RNAがリボソームに 1 %でも取り込まれるならば、 3'末端にインタク ト(intact) な tRNAをもった RNAならば、 もう少し効率良く入る可能性がある。 仮に、 インタ ク 卜な tRNAの 10%以下の効率で取り込まれるとしても、 濃度効果で十分にリ リ一 スファクタ一(Release factor)との競争に勝てる可能性がある。

そこで、 mRNA- sup tRNA (mRNAの 3'側にスぺ一サ一を介して sup tRNAを連結し たもの) の 3'末端にタンパク質を結合させる実験の前に、 mRNAと切り離した sup tRNAでもリボソームの Aサイ 卜に入り、 タンパク質と結合するかどうかを調べて みた。 実際に、 sup tRNAの 3'末端にピューロマイシンを結合させた sup tRNAを調 製し、 これを無細胞タンパク質合成系に投入し、 sup tRNA部分がリボゾームの A サイ 卜の終始コドンに対応して入り、 タンパク質と結合するかどうか調べた。 mR NAはタウ ·タンパク質の 4リピー卜領域 (127残基) を用いた (Goedert, M. (19 89) EMBO J. 8, 392-399) 。 その結果、 無細胞タンパク合成系で翻訳させところ、 3'末端にピューロマイシンをもつ sup tRNAはリボゾームの Aサイ 卜の終始コドン に対応して入り、 タンパク質と結合することが確認できた (第 2図) 。 WO 98/16636 , n PCT/JP97/03766 -

- 1 b

次に、 mRNAと sup tRNAとの間のスぺ一サの長さを変えた RNA sup tRNA連結体を 構築して、 リボソームの Aサイ 卜に sup tRNA部分が最も効率良く取り込まれるス ぺーサ一の最適の長さを、 in vitroセレクション法によって選択する試みをした。 その結果、 あるスぺ一サ一長をもつ RNA- sup tRNA連結体がその翻訳産物のタンパ ク質と効率よく化学的に結合することがわかつた。

本発明の遺伝子型と表現型の対応付け分子を構築するためには、 まず核酸部の 3'末端につける、 アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物 質と共有結合し得る、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨 格を有する物質、 例えば、 2' -デォキシシチジリルピューロマイシン(dCpPur)や リボシチジルビユ一ロマイシン(rCpPur) (第 3図) を合成する必要がある。

dCpPurを合成する方法の一例は次の通りである。 まずピューロマイシンの 5'水 酸基をォキシ塩化リンとリン酸卜リメチルを用いて化学的にリン酸化することに より、 ピューロマイシン- 5'モノ リン酸をつくることができる。 次に、 ピュー口 マイシン- 5'モノ リン酸にトリフルォロ酢酸とトリフルォロ酢酸無水物を反応さ せることにより、 ピュー口マイシン 5'モノ リン酸のァミノ酸部のァミノ基とリ ボース部の 2'水酸基を保護できる。 これに、 デォキシシチジンのピリ ミジン環内 のァミノ基とリボース部の 5'水酸基を保護した Bz MTデォキシシチジンを縮合剤、 ジシクロへキシルカルポジイミ ド存在下で反応ざた後、 酢酸とアンモニアで脱保 護することにより、 2' -デォキシシチジリルピューロマイシン (dCpPur) が得ら れる。 dCpPurの 5'水酸基をポリヌクレオチドキナ一ゼでリン酸化することにより、 pdCpPurを得ることができる。

リボシチジルピューロマイシンはピュー口マイシンと保護基のついた r C -ベ —タアミダイ トをテトラゾ一ル存在下で縮合させ、 さらに酸化、 脱保護すること によりつくることができる。

次に、 核酸部と夕ンパク質部を部位指定的につなげるための核酸部を構成する 連結体の構築について述べる。

部位指定的な方法に用いる核酸部を構成する連結体としては、 例えば、 5' T7 プロモータ一領域一シャイン ·ダルガーノ配列 (SD) 領域一 mRNA領域ースぺーサ —領域一 sup tRNA領域—ピュ一ロマイシン領域 3'の順につながった連結体を挙 げることができる。

この核酸部の連結体の構築においては、 先ず、 htau24と呼ばれるヒトタウタン パク質 (Goedert, M. ( 1989) E BO J. 8, 392-399) の微小管結合領域である 4リ ピート領域を T7プロモータ一の下流に揷入したプラスミ ド (PAR3040) を構築し、 それを制限酵素 Bgl l lと BamHIで切断し、 直線 DNAとする。 この DNAを錚型にして、 T7領域を含む上流側 (forward) と SD領域と開始コドン付近の領域を含む下流側 (backward) のプライマ一を用いて、 Taq DNAポリメラ一ゼで PCRを行い、 増幅す このとき、 backwardのプライマ一にはタンパク質合成した後夕ンパク質部の放 射性のメチォニンの検出感度を高めるため、 メチォニンを 3個増す。 すなわち、 4リピ一ト領域の 4番目のロイシン及び 5番目と 8番目のリジンをそれぞれメチ ォニンに置換する。 結局、 翻訳された 4リピートタンパク質は合計 4個のメチォ ニンを含む。 次に、 forwardのプライマ一として上記の backwardのプライマ一と 相補鎖を用い、 backwardのプライマ一は 4 リピ一卜の C末端に終止コドンとして アンバーコドンがくるように設計したプライマ一を用い、 先の直線化した 4 リピ —ト領域を含む DNAを銬型として、 PCRで増幅する。

PCRで増幅した二つの DNA断片、 すなわち T7プロモーターと SD領域を含む DNA断 片と 4リピ一ト領域を含む DNA断片をまぜ合わせ、 最初プライマ一なしで伸長さ せ、 次に T7プロモータ一の配列を含むプライマ一を forwardに、 4 リピー ト領域 の C末端の終止コドンを含むプライマ一を backwardに用い、 再度 PCRで増幅する。 この DNA連結体 (T7プロモータ一— SD— 4リ ピート) に、 両端に付着末端をも つ 17残基からなる二本鎖 DNA断片を DNAリガ一ゼでタンデムに連結させ、 スぺーサ —の長さの異なる連結体をつくる。

連結後、 ポリアクリルアミ ド電気泳動 (PAGE) により長さを基準にして三つ画 分 (a、 b、 c) に分画する。 スぺ一サ一は(17)nで、 a画分は n= 15- 18、 b画分は η=6 - 14、 c画分は n=0- 5である。 sup tRNAは、 天然のァラニン tRNAの数力所の配列と アンチコドンの配列をアンバー (UAG) に改変したものを化学合成により調製す る。 この sup tRNAにスぺーサ一の長さの異なる a、 b、 c画分の連結体を T4 DNAリ ガーゼで連結させる。 連結部位には過剰量の一本鎖の裏打ち DNAを用い、 一度温 度を上昇させ融解させた後、 ァニールさせ、 相補鎖をつく らせた後、 連結させる。 連結後、 連結体の 5'末端と 3'末端のプライマ一を用い、 PCRで増幅させる。 この D ΝΑ連結体を Τ7 RNAポリメラ一ゼを用いて転写し、 RNAの連結体をつくる。

この RNA連結体の 3'末端に先に化学合成した pdCpPurを Τ4 RNAリガーゼで連結さ せることにより、 無細胞の夕ンパク質合成系の遺伝子として使うことのできる RN A連結体、 5' T7プロモータ一領域— SD領域一 4リピ一ト領域一スぺ一サ一領域一 sup tRNA領域—ピューロマイシン- 3'を得ることができる。

無細胞夕 ンパク質合成系、 例えば大腸菌やゥサギ網状赤血球(rabbit reticulocyte)等の無細胞夕ンパク質合成抽出液に上記の RNA連結体を mRNAとして 加えタンパク質合成を行う。 核酸部 (RNA) とタンパク質部が最も効率よく連結 されるための最適スぺ一サ一長を求めるためには次のような実験を行う。

すなわち、 三種の異なるスぺ一サ一長、 a、 b、 c画分をもつ上記 RNA連結体を遺 伝子としての無細胞タンパク質合成系を用いタンパク質合成を行う。 このとき、 リジンにその ε -アミノ基を介してピオチンが連結した修飾リジンをチャージし た tRNAを加えると、 翻訳された 4リピ一卜のタンパク質のいくつかのリジン残基 の位置にビォチ二ルリジンが取り込まれる。 タンパク質合成後、 表面にストレブ トァヴィジンが連結した磁性体ビーズを加え、 ピオチンを取り込んだタンパク質 を釣り上げる。

核酸部 (RNA) がピューロマイシンを介してタンパク質部が連結していれば、 タンパク質の C末端に核酸部 (RNA) がついているはずである。 磁性体ビーズで R NA -タンパク質連結体が本当に釣り上がつたかどうかを確かめるために、 4 リ ピ —卜の N末端領域に対応する配列を forwardプライマーに、 sup tRNAの 3'末端部 を backwardプライマ一に用いて、 逆転写を行い、 ポリアクリルアミ ド電気泳動で 調べると、 c画分のスぺ一サ一長のみ逆転写された DNAのバンドが確認される。 こ のことは、 c画分のスぺ一サ一長をもつ RNA連結体が最も効率よく夕ンパク質部と 連結することを意味する。 次に、 (2) 核酸部と夕ンパク質部の結合が部位非指定的な方法について述べ る。

この方法においては、 (a) 終止コドンをもたない遺伝子を含む DMを作成し、 (b) 作成した DNAを転写して RNAにし、 (c) 得られた RNAの 3'末端側に DNAと RNA のキメラのスぺ一サ一を連結し、 (d) さらにその 3'末端側に、 アミ ノ酸あるい はアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、 ヌクレオシ ドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質、 例えばピュー口 マイシンを連結し、 (e) 得られた連結体を mRNAとして、 上記無細胞タンパク質 合成系、 例えば大腸菌の無細胞夕ンパク質合成系で夕ンパク質合成を行うことに より、 (f) 遺伝子 RNAとその翻訳産物のタンパク質とがピューロマイシンを介し て化学的に結合した遺伝子型と表現型の対応付け分子を構築することができる。 すなわち、 本発明の方法によれば、 核酸部 3'末端のヌクレオシドあるいはヌク レオシドに類似した化学構造骨格を有する物質、 例えばピューロマイシンがリボ ソ一ムの Aサイ 卜に、 リボソーム上の mRNAの終止コドンに対応して入るのでなく、 スぺ一サ一の長さに応じてランダムに入り、 ぺプチジルトランスフヱラ一ゼの作 用により、 RNA DNAキメラ核酸部の 3'末端のピュー口マイシンがタンパク質と化 学的に結合する (第 4図) 。 だから、 この方法は核酸部とタンパク質の結合が遺 伝コ一ドに非依存の部位非指定的である。

この方法においては、 核酸部の連結体に部位非指定的なものを用い、 上記 (1) の部位指定的な方法と同様の方法で、 遺伝子型と表現型の対応付け分子を構築で きる。

部位非指定的な方法に用いる核酸部の連結体としては、 例えば、 5' T7プロモ ―夕一領域一シャイン ·ダルガーノ配列 (SD) 領域一 mRNA領域一スぺ一サ一領域 一ピューロマイシン領域- 3'の順につながった連結体を挙げることができる。 この核酸部の連結体の構築においては、 先ず、 T7プロモータ一領域から 4 リピ —ト翻訳領域の終りまでの連結体の構築は、 前記 (1 ) 部位指定的な方法の核酸 部の連結体の構築のところで述べた方法に準ずるが、 違うところは前記で構築し た連結体を铸型にして PCKで増幅する際に、 backwardのプライマ一に 4 リ ピー卜 の C末端の二つの終止コドン、 オーカ一 (CTG) とアンバー (TAA) をそれぞれ CA G (グルタミン) と AAA (リジン) に変え、 終始コドンをなくするように設計した プライマ一を用いることである。

この DNAの連結体を铸型にして T7 RNAポリメラ一ゼを用いて転写し、 対応する R NAの連結体をつくる。 この一本鎖の RNA連結体に化学合成した一本鎖の DNAリンカ - (鎖長 20、 40、 60、 80ヌクレオチド) をそれぞれ別々に T4 RNAリガ一ゼを用い て連結させる。 次に、 この連結体にペプチドァクセプタ一と名付けた 25残基から なる一本鎖の MA-RNAキメラオリゴヌクレオチド (MAは 21残基、 RNAは 4残基) を裏打ちの一本鎖 DNA存在下で、 T4 DNAリガ一ゼを用いて連結させる。

ペプチドァクセプタ一の配列は、 ァラニル tRNAの 3'末端配列を有しており、 リ ボゾームの Aサイ トへのピューロマイシン誘導体の取り込みを促進させるもので あるので、 スぺ一サ一領域とピュー口マイシン領域との間にべプチドアクセプ夕 —を用いることが好ましい。

この連結体の 3'末端に先に化学合成した pdCpPurを T4 RNAリガーゼで連結させ ることにより、 無細胞のタンパク質合成系の遺伝子として使うことのできる RNA- DNAキメラ連結体、 5' T7プロモータ一領域 (RNA) — SD領域 (RNA) 4 リ ピート 領域 (RNA) —スぺ一サ一領域 (DNA) —ペプチドァクセプター領域一ピューロマ イシン 3'を得ることができる。

上記の RNA-DNAキメラ連結体を遺伝子として、 前記無細胞タンパク質合成系を 用いてタンパク質合成を行えば、 核酸部 (RNA DNAキメラ連結体;遺伝子型) と タンパク質部 (表現型) がピューロマイシンを介して化学結合でつながった連結 体を得ることができる。

また、 上記方法において、 MAと RNAのキメラのスぺ一サ一の代わりに、 DNAと ポリエチレングリコールのキメラのスぺーサ一を用いることができる。

さらに、 また、 上記方法において、 DNAと RNAのキメラのスぺ一サ一の代わりに、 DNAと DNAの二本鎖、 RNAと短鎖 (例えば 15〜25ヌクレオチド程度) の PNAまたは DN Aからなる二本鎖のスぺ一サ一を用いることができる。 DNAと DNAの二本鎖からな るスぺ一サ一は、 全長にわたって二本鎖である必要はなく、 大部分が二本鎖 (通 丄

常、 両末端の数残基が一本鎖で他の部分が二本鎖) であればよい。 RNAと短鎖の Ρ ΝΑまたは DNAからなる二本鎖スぺ一サ一は、 (a) 終止コドンをもたない遺伝子と スぺ一サ一の塩基配列とを含む DNAを作成し、 (b) 作成した DNAを転写して RNAに し、 (c) 得られた RNAの 3'末端側に、 アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学 構造骨格を有する物質と共有結合し得る、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに 類似した化学構造骨格を有する物質を連結し、 (d) 得られた RNAの連結体の遺伝 子部分の 3'末端側の部分に短鎖の PNAまたは DNAを加えて二本鎖を形成させること によっても作成することができる。

なお、 本明細書における、 核酸の単離 ·調製、 核酸の連結、 核酸の合成、 PCR、 プラスミ ドの構築、 無細胞系での翻訳等の遺伝子操作技術は、 特に明記しない限 り、 Samrook et al. (1989) Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載の方法またはそれに準じた方法により行うことができる。 本発明の対応付け分子は、 上記に例を挙げた方法の他、 各構成要素を順次、 公 知の科学的結合方法によつて連結することによって得ることもできる。

本発明のタンパク質の進化実験方法は、 第 1 2図に示すように、 (1 ) in vitro ウィルスゲノムの構築、 (2) in vitroウィルスの完成、 (3) 淘汰プロセス、 (4) 変異導入、 (5) 増幅、 の工程を含む方法であり、 これらの工程により、 あるい はこれらの工程を必要に応じて繰り返し行うことにより機能性タンパク質の改変 及び創製が可能となる。 この内、 (1 ) 及び (2) の工程については上記に詳述し た構築方法に従って行うことができる。 すなわち、 (1 )の工程は、 ヌクレオシド あるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質の連結した連結体の 構築に相当し、 (2)の工程は、 当該連結体からの対応付け分子の構築に相当する。 従って、 ここでは (3) 、 (4) 及び (5) の工程について述べる。

(3) 淘汰プロセスとは、 in vitroウィルスを構成するタンパク質部の機能 (生 物活性) を評価し、 目的とする生物活性に基づいて in vitroウィルスを選択する 工程を意味する。 このような工程は公知であり、 例えば、 Scott, J. K. & Smith, G. P. (1990) Science, 249, 386-390; Devlin, P. E. et al. (1990) Science, 249, 404-406; Mattheakis, L. C. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, - 1 1 -

9022-9026等に記載されている。

次に (4) 変異導入及び (5) 増幅の工程において、 選択された in vitroウィル スの核酸部に変異を導入して PCR等で増幅する。 ここで、 in vitroウィルスの核酸 部が RNAの場合は、 逆転写酵素により cDNAを合成した後に変異の導入を行えば良 く、 核酸部の増幅は変異導入しながら行っても良い。 変異導入は、 すでに確立し ている Error- prone PCR (Leung, D. W., et al., (1989) J. Methods Cell Mol. Biol., 1, 11-15) や Sexual PCR (Stemmer, W. P. C. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10751) を用いて容易に行うことができる。

変異が導入され増幅された in vitroウィルスの核酸部を用いて (1 ) in vitroゥ ィルスゲノムを構築し、 それを用いて (2) in vitroウィルスを完成させて (3) 淘汰プロセスにかけ目的とする生物活性によって選択し、 (4) 変異導入及び増 幅を行うことができる。 これらの工程を必要に応じて繰り返すことにより、 機能 性夕ンパク質の改変及び創製が可能となる。

上記進化実験方法を行う本発明の装置における各手段自体はそれぞれ公知のも のであり、 これらの手段における、 試薬の添加、 攪拌、 温度制御、 生物活性評価 等の操作は、 それ自体既知の方法により行えば良い。 これらの操作を組み合わせ、 全自動または半自動の本発明の装置を構築することができる。

本発明の夕ンパク質一タンパク質または夕ンパク質一核酸の相互作用の検定方 法における、 対応付け分子を構築する構築工程は、 一般には、 ( 1 ) 遺伝子ライ ブラリ一や cDNAライブラリ一から mRNAを合成し、 in vitroゲノムを構築する工程、 及び、 (2 ) 無細胞タンパク質合成系を利用して、 m Aとそれに対応するタンパ ク質とをリポソ一ム上で連結した in vitroウィルスを構築する工程を含む。

( 1 ) の工程は、 配列既知の MAで 0RFに対応する配列を含む cDNAや配列未知の DNAで適当な制限酵素で断片化した断片を含む cDNAから KNAポリメラーゼを用いて mRNAを合成し、 in vitroウィルスゲノムを構築することに相当する。

上記 ( 1 ) の in vitroウィルスゲノムの構築と、 (2 ) の in vitroウィルスの 構築の工程は、 上記に詳述した構築方法に従って行うことができる。

また、 対応付け分子と他のタンパク質や核酸 (DNAまたは RNA) との相互作用を WO 98/16636 - 2 3 - PCT/JP97/03766 - 調べる検定工程は、 一般には、 (3 ) ( 2 ) の工程で構築された in vitroウィル スの中から特定の機能をもつタンパク質のみを選択する工程、 及び、 (4 ) 選択 した in vitroウィルスを逆転写、 増幅し、 配列を決定する工程を含む。

( 3 ) の工程では、 標的のタンパク質や核酸 (DNAまたは RNA) や他の物質、 例 えば糖質や脂質などをマイクロプレートゃビーズに予め共有結合や非共有結合を 介して結合させておき、 これに (2 ) の工程で構築した in vitroウィルスを加え、 ある温度条件で、 一定時間反応させた後、 洗浄し、 標的に結合しない in vitroゥ ィルスを除去する。 その後、 標的に結合した in vitroウィルスを遊離させる。 本 工程はすでに確立している E L I S A (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (Crowther, J. R. (1995) Methods in Molecular Biology, Vol. 42, Humana Press Inc.)に準じて行うことができる。

( 4 ) の工程では、 (3 ) の工程で遊離した in vitroウィルスを逆転写 PCRに より逆転写、 増幅させ、 増幅した D N Aをお直接あるいはクローニングした後、 その配列を決定する。

本発明の検定方法により、 (1)配列既知ある L、は未知の遺伝子 DNAから mRNAを合 成し、 in vitroウィルスゲノムを構築し、 (2)それを用いて in vitroウィルスを 構築し、 (3)in vitroウィルスの中から標的のタンパク質あるいは核酸あるいは 他の物質、 たとえば糖質や脂質などと結合するもののみを選択し、 (4 )選択した in vitroウィルスを逆転写、 増幅、 クローニング、 配列決定すること;こより、 機 能未知の遺伝子に対応する遺伝子産物 (タンパク質) の機能を同定することが可 能になる。

上記の相互作用の検定方法を行うために、 公知の適切な手段を組み合わせて装 置を構築してもよい。 本装置における各手段自体はそれぞれ公知のものであり、 これらの手段における、 試薬の添加、 攪拌、 温度制御、 生物活性評価等の操作は、 それ自体既知の方法により行えば良い。 これらの操作を組み合わせ、 全自動また は半自動の、 相互作用の検定方法を行うための装置を構築することができる。 実施例 - 2 4

以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、 下記の実施例は本発 明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、 本発明の範囲は下 記の実施例により何ら限定されるものでな 、。 実施例 1 In vitroウィルスの調製 ( 1 )

く 1 >核酸部の 3'末端部の調製

( a ) リン酸化ピューロマイシン(pPur)の合成

材料 : ヒ ュ 一 ロ マ ン ン (3,-[ a -Amino-p-methoxyhydrocinnamamido]- 3,-deoxy-N,N'-dimethyl-adenosine)はシグマから購入した。 ォキシ塩化リ ン (Phosphorous oxy chloride)、 リン酸トリメチル (Trimethyl phosphate)は禾 [け t純 薬から購入した。

方法: 1. 5 匪 olのォキシ塩化リンと 11. 4 匪 olのリン酸トリメチルを混合した 溶液を氷冷し, 0. 3 匪 olのピューロマイシン (Puromycin) を加えてよく混合し、 0°Cで 7時間反応させた (Yoshikawa, M. et al. (1969) Bull. Chem. So Jap. 42, 3505-3508) 。 次に、 氷令した 40 mlのアセトンと 20 mlのエーテルそして 0. 4 g の過塩素酸ソ一ダ (NaC104 ) の混合液に反応液を加えてよく撹拌した。 720 mlの 水を加えて 4°Cで一昼夜撹拌し、 塩素基を加水分解する。 加水分解して沈澱した 生成物を遠心で分離し、 アセトンとェ一テルで洗浄する。 白い粉末を真空下で乾 燥し、 リン酸化ピューロマイシンをピューロマイシンに対して 70- 90!¾の収率で得 た。

( b ) リン酸化ピューロマイシンのァセチル化保護

材料: トリフルォロ酢酸 (TFA) はナカライテスタから購入した。 トリフルォ 口酢酸無水物 (TFAA) は和光純薬から購入した。

方法: 0. 2 mmolの乾燥したリン酸化ピューロマイシンと 5 mlの TFAを混合し、 - 10 °Cで 2 mlの TFAAを加えて撹拌した。 室温で混合しながら 1時間反応させた (Weygand, F. & Gieger, R. (1956) Chem. Ber. 89, 647-652) 。 50 mlの水を加 えて反応を止め、 水(10 ml)を加えては減圧下で蒸発乾固する操作を 5回繰り返 すことにより TFAを除去した。 最後に 50 mlの水を加えて凍結乾燥し、 ピューロマ ィシンのァミノ酸部のァミノ基とリボース部の 2'水酸基をァセチル基で保護した リン酸化ピューロマイシンをリン酸化ピューロマイシンに対して 50- 60%の収率で 得た。

( c ) dCpPur (2, - Deoxycytidyl (3 uromycin の合成

材料 : BZ- DMTデォキシシチジン (N4-Benzoyl-5,-0-(4,4,-dimethoxyti'ityl)-2,- deoxycytidine) はシグマ力ヽら、 DCC (Dicyclohexyl carbodiimide) は渡辺ィ匕学:か ら購入した。 ピリジンはナカライテスクから購入した。

方法: 40 molのァセチル基で保護したリン酸化ピューロマイシンと 600 〃mo 1の Bz- MTデォキシシチジンをピリジン(2 ml)を加えては蒸発乾固をする操作を 3回繰り返すことにより無水化し、 最終的に 2 mlのピリジンを加え、 これに 400 〃molの DCCを撹拌しながら加え、 室温で 3日〜 2週間反応させた (Ralph, R. K. et al. (1965) J. Am. Chem. Soc. 87, 5661-5670及び Harris, R. J. et al. (1972) Can. J. Biochem. 50, 918-926) 。 反応後、 5 mlの 80 %酢酸で 2時間反応させ、 MT基 を脱保護した。 次に、 6 mlの濃アンモニア水一エタノール (体積比 2 : 1 ) で 20°C で 2日間反応させてァセチル基を脱保護した。 減圧下で蒸発させることにより濃 アンモニア水を除去した後 40 mlの水で溶解した。 この溶液を QAE- Sephadex A -25

(ファーマシア) を充填したカラムに通して吸着させ、 0. 5M トリェチルァミ ン 炭酸塩 (TEAB、 pH7. 5)で所望の生成物を含むフラクションを溶出させた後、 凍結 乾燥し、 最終的に HPLCで分離し、 脱保護した dCpPurをピューロマイシンに対して 1 - 5%の収率で得た。

< 2 >核酸部 (in vitroウィルスのゲノム) の調製

In vitroウィルスゲノムとして 2種類作成した。 すなわち、 (1 ) 核酸部と夕 ンパク質部を部位指定的につなげるためのものと、 (2) 核酸部とタンパク質部 を部位非指定的につなげるためのものである。

材料:大腸菌の無細胞タンパク質合成系 Ε· coli S30 Extract System for Linear Templates) はプロメガから購入。 T7 RNAポリメラ一ゼ、 T4 DNAリガ一 ゼ、 T4 DNAキナーゼ、 ヒ ト胎盤由来リボヌク ア一ゼ阻害剤、 EcoRI、 BamHK デォキシリボヌクレオチドは宝酒造から購入した。 制限酵素 BstNI、 Bgl l lはニュ WO 98/16636 n r PCT/JP97/03766 -

- L b -

—ィングランドラブから購入した。 [ 3 5S]メチォニン、 [ァ - 3 2P]ATPはアマシャ ム、 Taq DNAポリメラ一ゼはクラボウとグライナ一のものを使用。 他のすべての 生化学試薬はシグマ及び和光純薬のものを使用した。 ヒトタウタンパク質の微小 管結合領域 (4リピート) を組み込んだプラスミ ド (pAR3040) は、 λ ΖΑΡΠにク ローン化されたヒ卜脳の cDNAライブラリ一からヒトタウタンパク質の全長遺伝子 を PCR法で釣り上げて、 プラスミ ドに組み込んだものから 4リピー卜領域のみを P CRで増幅してプラスミ ドに組み込んだものである。 PCK (Polymerase chain reaction) 装置は、 PTC 100型 (MJリサーチ) と ASTEC PC800型 (アステック) を 使用した。

( 1 ) 部位指定的に結合させるためのゲノムの作成

A . 変異 4リピート部分の DNA作成

1 ) ヒトタウタンパク質 (Goedert, M. ( 1989) EMBO J. 8, 392- 399 ) の微小管 領域 (4リピ一卜) を組み込んだプラスミ ド (pAR3040) 構築し、 それを制限酵素 Bgl l lと BamHIによって切断し直鎖状にした。

2) このゲノムから T7プロモータ一領域及びシャインダルガノ配列を含んだ 4リ ピート部分を PCRによって増幅した。 この際、 プライマ一として、 5'側は、 Left+ (配列番号 1 ) と 3'側は Right- (配列番号 2) を使った。 また、 Right -の配列は ォ一カー終始コドンの前のロイシンをアンバー終始コドンに変異させるようにな つている。 PCR条件は、 変性 92°C/30秒、 アニーリング 65°C/30秒、 伸長反応 73°C/ 1分で 30回繰り返した。

3) 次に、 この増幅したゲノムを精製後、 メチォニンの取り込みを多く し、 放 射性同位元素での検出を高めるために、 PCRを利用して変異を加えた。 すなわち、 変異を加えたい領域を含むプライマー Left (配列番号 3) 、 Right (配列番号 4) を合成し、 上記 2) の DNAを銬型として、 まず、 プライマ一 Left 、 Left -で PCRに よって増幅し、 増幅された DNAを 「Left」 とした。 また、 プライマ一 Right Rig ht で PCRによって増幅し、 増幅された DNAを 「Right」 とした。 5 %アクリルアミ ド変性ゲル電気泳動により 「Left」 、 「Right-」 をゲルから切り出し抽出した。 切り出した Leftと Rightは、 まず、 プライマーなしで前出の条件で PCRによって増 幅した。 さらに、 この反応液から 採取し铸型とし、 プライマー Le: -、 Right -で同じ条件で PCRによって増幅した。 これにより、 メチォニンの数を 1個から 4個 に増やした変異 4リピ一ト部分の DNAが作成された。

B . 様々な長さのスぺーサをもつァラニン 'サプレッサ一 tRNA (Ala - sup tRNA) の 4リピー卜部分への連結

1) 上記 Aの 4リピ一ト部分の 3'末端側にある BamHl部位を BamHlを使って切断処 理した。 その後、 BamHl部位の 3'側断片の除去のために QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN製) を使って、 5'側の 4リピ一ト部分のみを抽出、 精製した。

2) 上記 1 ) の精製物と 5'側に T4キナーゼでリン酸化した Spacer- A (配列番号 5) を Spacer B (配列番号 6) によって裏打ちし T4 MAリガ一ゼで結合させた。

3) T4キナーゼでリン酸化した Spacer- C (配列番号 7) とこれと相補な領域をも つ Spacer- Bを T4 DNAリガ一ゼを使って連結した。 15°C、 2時間反応させた。 その 後、 エタノール沈澱で精製した。

4) 上記 2) 及び 3) の産物及び Spacer- D (配列番号 8) と 5'側をリン酸化した su p tRNA (配列番号 9) を T4 DNAリガ一ゼバッファ(Buffer)に溶かし、 85°C、 2分で 変性させた後、 氷上で冷やす。 さらに T4 DNAリガ一ゼを加えて 15°C、 2時間反応 させ、 フヱノール抽出後、 エタノール沈澱した。

5) 上記 4) で得た産物を銬型として、 プライマ一 Left+,プライマー 3' Pur (配 列番号 10) を使い、 変性 92°C/30秒、 アニーリング 65°C/30秒、 伸長反応 73°C/1分 で 30回の条件で PCRによって増幅し,その産物をァクリルァミ ド変性ゲル電気泳動 して、 泳動距離の異なる 3つの領域 A,B,Cを切り出し、 DNAを抽出した。

6) 上記 5) の長さの異なる A,B,Cを铸型として再度、 同じ条件で PCRによって増 幅し、 電気泳動によりその長さを同定すると同時に、 転写用の鍩型 DNAとした。 これにより、 c画分は Spacer- Cが 0〜5、 b画分は 6〜14、 a画分は 15〜^挿入され たものであることがわかった。

C RNAゲノムの作成及び dCpPurの連結

上記 Bで得られた A,B,C領域は T7ポリメラーゼを用い 37°C、 2時間反応させるこ とで RNAに転写した。 さらに、 上記く 1〉核酸部の 3'末端の調製で得られた dCpPur - L o

を ATP存在下 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用い 15°C、 24時間反応させリン酸化 したのち、 上記転写 RNAゲノムと T4 RNAリガ一ゼを用い 4°C、 50時間反応させた。 この操作により、 3'末端にピューロマイシンを付けた sup tRNAをもつ RNAゲノム が構築できた。

( 2 ) 部位非指定的に結合させるためのゲノムの作成

A. 変異 4リピート部分の DNA及び RNAの作成

変異 4リピート部分の DNAは、 基本的に上記 (1 ) の Aと同一の方法で作成した。 ただし、 2つの終止コドンすなわちアンバーをグル夕ミン、 オーカーをリジンに 替えて終始コドンをなくし、 また、 3'末端をプリンリッチ(rich)にするために、 新しいプライマ一 New/Right (配列番号 10) を合成し、 Lef とともに変性 92°C/ 30秒、 アニーリング 65°C/30秒、 伸長反応 73°C/1分で 30回の条件で PCRによって増 幅した。 この DNAを铸型として、 T7ポリメラ一ゼを使い 37°C、 2時間反応させるこ とにより RNAゲノムを得た。

B . Spacerl〜4の連結

上記 Aで得た RNAに、 21塩基からなる DNA、 Spaced (配列番号 11 ) 、 40塩基から なる DNA、 Spacer2 (配列番号 12) 、 60塩基からなる DNA、 Spacer3 (配列番号 13) 、 80塩基からなる DNA、 Spacer4 (配列番号 14) を T4ポリヌクレオチドキナーゼで 36 °C、 1時間反応させた後、 T4 RNAリガ一ゼで 10°C、 48時間反応させた。

C . ペプチドァクセプター (P- Acceptor) の連結

3'末端に dCpPurを結合させ、 リボゾームへの取り込みの効率を上げる目的で DN A 21塩基と RNA 4塩基、 計 25塩基よりなるキメラ核酸、 ペプチドァクセプ夕一 (P-Acceptor) (配列番号 15) を合成した。 P- Acceptorの 5'末端をリン酸化する ために T4ポリヌクレオチドキナーゼで 36°C、 1時間反応させた後、 これに相補な 配列をもつ Back3' (配列番号 16) によって裏打ちさせ、 上記 Bで作成した各スぺ —サ一の 3'末端に T4 DNAリガ一ゼを用いて 16°C、 2時間反応を行い連結させた。 また、 この P Acceptorを直接、 上記 Aで得た RNAの 3'末端に T4 RNAリガーゼを用い て 10°C、 48時間反応させて連結させたものをィ乍成し、 これを、 Nori Spacerゲノム と称する。 D . dCpPurの連結

上記 Cで作成した各ゲノムの 3'末端に、 上記く 1〉核酸部の 3' 末端の調製で得 られた dCpPurを T4ポリヌクレチドキナ一ゼを用い 15°C、 24時間反応させ、 リン酸 化したのち T4 RNAリガ一ゼを用い 4°C、 50時間反応させた。 これにより、 3'末端 にピュー口マイシンを付けたキメラ RNAゲノムが構築できた。

< 3〉核酸部の最適化

A . 部位指定的方法

上記 < 2〉の (1 ) で作成した a、 b、 c画分の長さに分類されたそれぞれの RNAゲ ノムをピオチン化リジン tRNA (Promega) と一緒に大腸菌無細胞翻訳系 50 1 [E. coli S30 Extract Systems for Linear Templates (Promega) ] で翻訳した後 それぞれのチューブにストレブトアビジン付き磁性体粒子ダイナビーズ (ダイナ ル) を 5 mg加え、 室温で 1時間インキュべ一卜する。 次に、 ダイナビーズを磁石 によって集め、 上清を吸い取る。 残ったダイナビーズを 1000 ^ 1の B&W Bufferで 2 回洗った。 さらに、 500 / 1の RT- PCR Bufferで 2回洗った後、 500 / 1の RT- PCR B ufferで再度、 サスペンド(suspend)する。 それを 50 1採取し 500 ^ 1のエツペン チューブに移し、 磁石でダイナビーズを固定し、 上清を吸い取った。 残ったダイ ナビーズに RT- PCR Buffer及び逆転写酵素と Taq ポリメラ一ゼ [Access RT-PCR System(Promega)] を加え 48°C、 1時間で逆転写、 PCRは 94°C/30秒、 (;5°C/40秒、 68°C/1分 40秒、 40回、 プライマ一は Right+ (配列番号 4) と 3' Pur (配列番号 10) で行った。 a、 b、 c画分それぞれを電気泳動で調べたものが第 5図である。

ここで、 c画分のグループ (第 5図のレーン 3 ) からバンドが検出された。 こ のバンドは電気泳動によりゲルから分離し、 さらに、 T7プロモータ及びシャイン ダルガノ領域をもつ 「Left」 と PCRによって連結し、 これをさらにプライマ一 Le ftl (配列番号 3) と 3' Pur- (配列番号 10) で PCRによって増幅した。 このゲノム を rstrangerj と名付けた。

次に、 この Strangerは実際に翻訳されたタンパク質が mRNA部分 (RNAゲノム部 分) と結合しているかどうかを調べるために、-転写後、 3'側に pdCpPurを T4 RNA リガ一ゼで連結した後 RNAの 5'側を HK フォスファタ一ゼ (Epicentre) で 30°C、 1 時間脱リン酸化し、 [ Ί 3 2P]ATP存在下 T4ポリヌクレオチドキナ一ゼでラベル化 した。 これを大腸菌無細胞翻訳系に mRNAとして加え、 37°C 1時間 40分反応させ た。 これを、 18%SDS PAGEで泳動した結果が第 6図である。 これから、 約 80%以 上の割合で核酸部 (遺伝子型) とタンパク質部 (表現型) が結合し、 in vitroゥ ィルス、 即ち遺伝子型と表現型の対応付け分子が形成されていることがわかる。 B . 部位非指定的方法

すでに、 部位指定的方法で短いスぺ一ザのものが選ばれてきたため、 スぺ一サ なしの 「Non spacerj RNAゲノムの 3'末端に、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用 い [ァ - 3 2P]ATP存在下、 5'側をリン酸化した dCpPurを T4 RNAリガ一ゼを用い 4°C 50時間反応させ連結させた。 次にこれを通常の 4リピ一トをコ一ドしている raRNA とともに大腸菌無細胞翻訳系に加え、 37°C 1時間 30分反応させた。 この反応 10 〃1をリボヌクレア一ゼ T2で分解したものと、 等量の反応液を 18%SDS PAGEで泳 動し、 イメージアナライザ一 BAS2000 (富士フィルム) で解析した (第 7図) 。 その結果、 リボヌクレアーゼ T2で RNAを分解した方は、 タンパク質部分のみと なるため、 対照の [ 3 5S]メチォニンでラベルした 4リピ一卜の夕ンパク質部分と同 じ移動距離のところにバンドが出現した。 一方、 何の処理も行わない方は、 4リ ピートのタンパク質部分より上に、 つまり、 分子量が明らかに大きいことがわか つた。 また、 これは、 tRNAよりも移動していることからラベルされた mRNA (約 40 0塩基) そのものではない。 したがって、 RNAと蛋白が結合したものと同定した。 すなわち、 この結果は核酸部とタンパク質部が部位非指定的に連結したことを示 している。 実施例 2 In vitroウィルスの調製 (2 )

< 1 >核酸部の 3'末端部の調製

( a ) rCpPur (ribocytidyl(3'― 5' )puromyciriの合成

材料: ピューロマイシン (puromycin) はシグマから、 r C -ベータアミダイ ト N4-benzoyl-5'-0-(4,4 -dimethoxytrityl)-2 -O^tert-butyldimethy siiyl)-cytidine- 3'-0-[0-(2-cyanoethyl)-N,N'-dusopropyl-phosphoramidite] ) は日本 — i?プティ ブから、 テトラゾ一ルは日本ミ リポアから、 フッ化テトラブチルアンモニゥムは アルドリツチから、 QAE-セフアデックスはファーマシアから、 クロマト用シリカ ゲルはメルクからそれぞれ購入した。

方法: ピューロマイシン (50 mg、 92 // mol) を 2 mlの乾燥ピリジンに溶かし、 減圧下で蒸発させ、 脱水させた。 この操作を 3回繰り返した。 これに 15 mlの 4% テトラゾ一ル /ァセ卜二トリル溶液とを加え、 室温で撹拌させた。 反応はシリ力 ゲルの薄層クロマトグラフィ一 (TLC、 展開溶媒: クロロフオル厶: メ夕ノール = 9 : 1 ) でモニタ一した。 通常、 反応は 1 日で終了する。 反応後、 溶媒を減圧下で 追い出し、 これに 0. 1Mのヨウ素をテトラヒドロフラン/ピリジン/水 =80 :40 : 2に溶 かした溶液 3 ml加え、 室温で撹拌させながら生成したホスフアイ ト-ト リエステ ルを酸化させた。 1時間半後、 溶媒を減圧下で追い出し、 残部をクロロフオルム で抽出した。 抽出液は無水硫酸マグネシウム存在下で乾燥させた後、 減圧下で溶 媒を追い出した。 これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけ、 クロロフ オルム /メタノール = 90: 10で溶出させた。 保護基のついたリボシチジルビユ一口 マイシン (CpPur) はシリ力ゲル TLC (展開溶媒: クロロフオルム: メタノ一ル =9 : 1) で Rf 0. 32のところに溶出される。 次に保護基の脱保護を行った。 保護基の ついたリボシチジルビユ一ロマイシンを最初 80%酢酸水溶液 0. 5 mlで室温で 1時 間処理し、 酢酸を減圧下で追い出した後、 濃アンモニア水/エタノール =2 : 1の混 合溶液 0. 5 mlを加えた。 室温で 15時間放置した後、 溶媒を減圧下で追い出し、 残 部に 1 Mのフッ化テトラブチルアンモニゥムのテトラヒ ドロフラン溶液 0. 5 mlを 加え、 3 -シァノエチル基を除去した。 30分後溶媒を減圧下で追い出し、 残部を Q AE-セフアデックスのカラムクロマトグラフィ一にかけ、 0-0. 5 Mのトリエチルァ ミン炭酸塩の直線グラージェン卜で溶出させた。 溶出液を集め、 凍結乾燥させた。 リボシチジルビユ一ロマイシンが 10 mg得られた。 合成品がリボシチジルピュー ロマイシンであることは、 ヌクレア一ゼ P 1消化でシチジンとピュー口マイシン 5' -リン酸が等量得られることと、 MALDI/T0Fマススぺク トロメ トリ一で [M- の 分子イオンが m/z 777に現われることから同定された。 < 2 >核酸部 (in vitroウィルスのゲノムの調製)

材料: ゥサギ網状赤血球抽出液 (Nuclease treated Rabbit reticulocyte lysate) の無細胞夕ンパク質合成系はプロメガから購入。 T7 RNAポリメラ一ゼ、 T4 DNA リガーゼ、 T4 RNAリガーゼ 、 T4 ポリヌクレオチドキナーゼ、 ヒト胎盤由来リボ ヌクレア一ゼ阻害剤、 EcoRI、 BamHI、 デォキシリボヌクレオチドは宝酒造から購 入した。 制限酵素 BstNI、 Bgll lはニューイングランドラブから購入した。 [ 3 ;iS] メチォニン、 [ 3 2P]-ァ ATPはアマシャム、 TaqDNAポリメラ一ゼはクラボウとグラ イナ一のものを使用した。 他のすべての生化学試薬はシグマ及び和光純薬のもの を使用した。 ヒ トタウタンパク質の N末端半分領域 (アミノ酸残基番号 165) を組み込んだプラスミ ド (pAR3040) は、 λ ΖΑΡΠにクローン化されたヒ ト脳の cD NAライブラリ一からヒ トタウタンパク質の全長遺伝子を PCR法で釣り上げて、 プ ラスミ ドに組み込んだものから N末端半分領域のみを PCRで増幅してプラスミ ド に組み込んだものである。 PCR (Polymerase chain reaction) 装置は ASTECPC800 型 (アステック) を使用した。

( 1 ) ゲノムの作製

A . N末端半分領域の DNAの作製

3'末端にスぺ一サ一、 ぺプチドアクセプタ一、 rCpPurの連結したストップコド ンをもつものともたないヒトタウタンパク質 N末端半分領域 (アミ ノ酸残基 1 16 5) をコードする mRNAは以下の通り構築された (第 8図) 。

1) ヒトタウタンパク質(Goedert, M. (1989) EMBO J. 8, 392 399)の N末端半 分領域を組み込んだプラスミ ド (PAR3040)を制限酵素 Bgll lによって切断し直鎖 状にする。

2) このゲノムから N末端半分領域部分 (アミノ酸残基番号: 1 - 165) を PCRによ つて増幅する。 この際、 プライマ一として、 5 ' 側は Leftl (配列番号 18) 、 3 ' 側はストップコドンを含む Rightl (配列番号 19)とストップコドンを含まない Righ t2(配列番号 20)を使った。 PCR条件は、 変性 92°C/30秒、 アニーリング 65°C/30秒、 伸長反応 73°C/1分で 30回繰り返した。 -

3) T7 RNAポリメラ一ゼのプロモータ一領域、 コザック (Kozak) 配列、 ヒ ト夕 - ϋ ο - ウタンパク質のァミノ酸残基番号卜 25までに相当する DNA配列の順につなげた環 A (配列番号 21 ) は化学合成により調製した。

4) 上記 2) と 3) の操作で得られた二つの精製 DNAは次の二段階の PCRにより連 結された。 すなわち、 上記 2種の DNAの混合物は最初はプライマ一非存在下で増 幅され、 次いで Left2(配列番号 22) と RightlC配列番号 19)あるいは Right2(配列 番号 20)のプライマー存在下で増幅された。 以上の操作により、 ヒ ト夕ゥタンパ ク質の N末端半分領域の 0RFの上流に T7 RNAポリメラ一ゼのプロモーターとコザ ック配列をもつ DNAが作成された。 この DNAを錶型として、 T7 RNAポリメラ一ゼを 用い 37°C、 2時間反応させることにより RNAを得た。

B . Spacerとペプチドァクセプタ一の連結

Spacer5(配列番号 23)と DNA 21塩基と RM 4塩基、 計 25塩基よりなるキメラ核酸, ぺプチドアクセプ夕一(P Acceptor) (配列番号 15)を化学的に合成した。 ぺプチド ァクセプ夕一の 5'末端をリン酸化するため T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、 36°C、 1時間反応させた後、 これに相補な配列をもつスプリント DNA (配列番号 2 4) によって裏打ちし、 Spacer5の 3'末端に T4 MAリガ一ゼを用いて、 16°C、 2時 間反応を行い連結させた。

C RNAと Spacer-ペプチドァクセプタ一の連結

上記 Bで得た Spacer5-ぺプチドアクセプターの連結体の 5'末端をリン酸化する ため、 T4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、 36°C、 1時間反応させた後、 上記 Aで得た RNAと T4 RNAリガ一ゼを用いて、 4°C、 48時間反応させることにより、 連 結させた。

P . rCpPurの連結

上記 Cで作成したゲノムの 3'末端にく 1 >核酸部の 3'末端の調製で得られた rCp Purを T4 ポリヌクレオチドキナーゼを用い 15°C、 24時間反応させリン酸化した後、 T4 RNAリガ一ゼを用い 3 7 °C、 3 0分反応させた。 これにより、 3'末端にピュー ロマイシンの付いたキメラ RNAゲノムが構築できた。

E . ヒトタウタンパク質の N末端半分の C末^の rCpPurの結合

夕ンパク質の C末端とそれをコ一ドする RNAを有効に連結させるためには、 ピ - o 4 - ュ一ロマイシンとストップコドンの間の距離やストップコドンの有無が重要な因 子になると考えられる。 そこでこの分子間結合に対するこれらの因子の影響を調 ベるために、 次のような 3つのゲノムを作製した。 すなわち、 ヒト夕ウタンパク 質の N末端半分 (1 165) をコードする mRNAの 3'末端に、 (1 ) ストップコ ドンを もつが DNAスぺ一サ一はもたないもの、 (2) ストップコドンと DMスぺ一サ一の 両者をもたないもの、 (3) ストップコドンはもたないが DNAスぺ一サ一をもつも の、 である。 これら 3つのゲノムから、 3 2Pで標識した rCpPur存在下でゥサギ網 状赤血球抽出液を用いた無細胞翻訳系でタンパク質合成を行わせた (第 9図) 。 3'末端に DNAスぺーサ一がついていない場合、 ストップコドンの有無に拘わらず 夕ンパク質の C末端に rCpPurが同程度の効率で連結することがわかった。 すなわ ち、 rCpPurが連結したタンパク質のバンド (第 9図の左から 1番目と 2番目のレ ーン) は SDS PAGE (SDS-ポリアクリルアミ ド電気泳動) で [ 3 5 S ]メチォニンで標 識したタンパク質のモノマ一 (第 9図の一番右のレーン) と同じ位置に現われる。 一方、 ストップコドンがなくても DNAスぺ一サ一がついていると、 rCpPurはタン パク質の C末端に前 2者の 3倍程度の効率で連結することがわかつた (第 9図の 左から 3番目のレーン) 。 この結果は、 リポソ一ムの翻訳休止が DNAの配列上で 起こり、 その結果 rCpPurとタンパク質が効率よく連結するものと考えられる。 さ らに、 この結果はストップコドンがなく、 DNAスぺ一サ一と 3'末端に rCpPurをも っゲノムが無細胞翻訳系で mRNAとして使われた場合、 mRNAの 3'末端のピューロマ イシンが対応する翻訳されたタンパク質の C末端に効率よく結合できることを示 唆している。

く 3〉無細胞翻訳系での In vitroウィルスの構築

前記く 2〉核酸部 (in vitroウィルスのゲノムの調製) の項で構築したヒ ト夕 ウタンパク質の N末端半分 (卜 165) をコードする mRNA DNAスぺ一サー (105 mer) 一ペプチドァクセプター一 rCpPurからなるゲノムをゥサギ網状赤血球抽出液を用 い翻訳させた。 まずヒトタウタンパク質の N末端半分 (卜 165) をコードする RNA を mRNAとして用い、 [ 3 5 S ]メチォニンの夕ンパタ質への取り込みで調べてみると、 N末端半分 (1 - 165) のモノマ一 (〜28KDa) とダイマ一 (〜55KDa) の位置にバ ンドが現われた。 この場合、 モノマーが主で、 ダイマ一はごくわずかである (第 1 0図の(A)の左端のレーン) 。 この結果はヒトタウタンパク質の N末端半分 (1 -165) をコードする RNAは mRNAとして機能していることを示している。 ヒ トタウ タンパク質の N末端半分 (1-165) をコードする mRNA DNAスぺ一サー (105 mer) —ぺプチドアクセプ夕一— rCpPurからなるゲノムを同様な [ 3 5 S ]メチォニンを含 む無細胞翻訳系で翻訳させ、 時間を追って (5分、 10分、 20分、 40分) 調べてみ ると、 モノマーとダイマ一の位置の他に、 新しい幅広いバンドがゲノムの位置 (第 1 0図の(A)の右端のレーン) の少し上の位置に現われた。 このバン ドの強 度は反応時間の経過 (第 1 0図の(A)の左から 2番目〜 5番目のレーン) ゃゲノ ム量の増加 (第 1 0図の(B)のレーン 3と 4 ) と共に増加した。 この結果はゲノ ムがピューロマイシンを介して夕ンパク質の C末端に共有結合で連結したことを 示している。 また、 このことは遺伝子型 (genotype) が共有結合で表現型 (phenotype)に結びつけられたことを意味している。 すなわち、 遺伝子型と表現 型の対応付け分子が出来たのである。 本発明者等は、 この対応付け分子を in vitroウィルス (in vitro virus) と名付けた。 In vitroウィルスの形成に対する D NAスぺ一サ一の長さの影響について調べたところ、 80 mer程度の長さでは効率よ く形成せず、 少なくとも 100 mer以上の長さが必要であることがわかった。

さらに in vitroウィルスの生成の確認は、 3 2 Pで標識した rCpPurを用いてなさ れた。 すなわち、 ヒ トタウタンパク質の N末端半分 (1 165) をコードする mRNA — DNAスぺ一サ一 (105 mer) —ペプチドァクセプ夕一一 [ 3 2P]rCpPurからなるゲ ノムをゥサギ網状赤血球抽出液を用い翻訳させた。 ゲノムとタンパク質の結合は ナタ豆 (mung bean) のヌクレア一ゼで消化することによって確認された。 すな わち、 翻訳産物 (第 1 1図のレーン 3 ) をナ夕豆のヌクレア一ゼで消化すると、 ヒトタウタンパク質の N末端半分 (1 165) のモノマーとダイマ一 (第 1 1図の レーン 1 ) に相当する位置にバンドが現われた (第 1 1図のレーン 4 ) 。 このこ とは、 夕ンパク質の C末端に3 2 Pで標識された rCpPurが付いていることを意味し ている。 この結果からもゲノムがピュー口マイ-シンを介して夕ンパク質の C末端 に共有結合で連結したことがわかる。 結合の効率は約 1 0 %と推測された。 40〜 100 pmol/mlの濃度の in vitroウィルスゲノムは調製できるので、 生成した in vitroウィルスは 2. 4〜6 X 101 2の変異体を含む集団からなり、 この数はファージ 'ディスプレイ法 (Scott, J. K. & Smith, G. P. (1990) Science 249, 386-390) の 1万倍に相当する。 In vitroウィルスを用いた遺伝子型と表現型の対応付けは、 透過性の問題が回避できたり、 種々の非天然のアミノ酸の導入が可能などの長所 をもっており、 非常に沢山の変異体の合成や種々の機能性夕ンパク質の生成を可 能にする。 実施例 3 In vitroウィルスを用いた夕ンパク質の進化実験方法

In vitroウィルスを用いてのタンパク質の進化実験方法は、 第 1 2図に示すよ うに、 (1 ) in vitroウィルスゲノムの構築、 (2) in vitroウィルスの完成、 (3) 淘汰プロセス、 (4) 変異導入、 (5) 増幅、 の工程からなり、 機能性タン パク質の改変及び創製を可能とする。 特に、 この工程を繰り返し行うことにより 効率的な機能性タンパク質の改変及び創製が可能となる。 この内、 (1 ) 及び (2) の工程については上記実施例 1及び 2で具体的に述べた。 ここでは (3) 、 (4) 及び (5) の工程について述べる。

まず、 抗体に特異的なペプチドが淘汰されるかどうかについて検討した。 具体 的には抗体はマウス IgGを用い、 抗体に特異的に結合するべプチド配列は既知の プロテイン Aの Z Z領域 (Nilsson, B., et al" (1987) Protein Eng., 1, 107-113) を用いた。 また、 コントロールとしてはヒトタウタンパク質の N末端領域 (1 10 5) (Goedert, M. (1989) EMBO J. 8, 392-399)を用いた。 上記実施例 1及び 2で 述べた in vitroウィルスの構築方法に従い、 プロテイン Aの Z Z領域とヒトタウ タンパク質の N末端領域 (1 105) をコードする in vitroウィルスゲノムを作製 した。 プロティン Aの Z Z領域を含む in vitroウィルスゲノムとヒ トタウタンパ ク質の N末端領域 (1 -105) を含む in vitroウィルスゲノムの比率を 1 : 1、 1: 10、 1 : 100、 1: 1000のように変え、 ゥサギ網状赤血球抽出液を用いた無細胞翻訳系 で 30°C、 10分間翻訳させた。 その後、 翻訳産物を希釈し、 遠心分離を行って不溶 性画分を除去し、 その上清をマウス IgGを吸着させたマイクロプレート (牛血清 アルブミンでブロッキング処理済) に加え、 4 °Cで 2時間静置した。 その後、 マ イク口プレー卜から翻訳産物を除き、 洗浄用緩衝液 (50 mM Tris酢酸、 pH 7. 5/1 50 mM 食塩 /10 mM EDTA/0. 1% Tween 20) で計 6回洗浄し、 溶出用緩衝液 (1M酢 酸、 pH 2. 8) で 2回溶出した。 溶出液をエタノール沈殿させ、 20 ^ 1の滅菌水で 溶解して、 逆転写 PCRのテンプレートとした。 逆転写 PCRは逆転写酵素 (Avian Mieloblastosis Virus Reverse Transcriptase、 プロメカ製) と DNAポリメラ一セ (Tfl DNA Polymerase, プロメガ製) とプライマ一として RT i (配列番号 25) 及 び RT- (配列番号 26) とを用い、 48°Cで 40分反応させた後、 94°Cで 5分間処理で逆 転写酵素を失活させ、 次いで、 94 °Cで 30秒、 66°Cで 40秒、 72°Cで 40秒のサイク ルを 3 0回繰り返した。 得られた PCR産物は、 8M尿素を含む 4%ポリアクリルアミ ドゲルを用い、 55°Cで電気泳動し、 銀染色して確認した。 その結果、 プロテイン Aの Z Z領域を含む in vitroウィルスゲノムはコントロールゲノムであるヒ ト夕 ウタンパク質の N末端領域 (1 - 105) を含む in vitro ウィルスゲノムの 100分の 1量でも増幅できることがわかった。 この結果は、 プロテイン Aの Z Z領域を含 む in vitroウィルスゲノムが翻訳されたプロテイン Aの Z Z領域を介してマウス IgGに特異的に結合したことを示している。 それ故、 in vitroウィルスが淘汰で きることが明らかになつた。 変異導入及び増幅はすでに確立している Error- prone PCR (Leung, D. W" et al., (1989) J. Methods Cell Mol. Biol.. 1, 11-15 ) や Sexual PCR (Stemmer, W. P. C. (1994) Pro Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10751) を用いれば可能である。 したがって、 第 1 2図に示した in vitro ウィルスを用いた夕ンパク質の進化実験方法は実行可能であることが証明された。 産業上の利用可能性

本発明により、 遺伝子型 (核酸部) と表現型 (タンパク質部) の対応付け分子 及びその構築方法が提供される。 また、 本発明により構築した対応付け分子 (m vitroウィルス) を試験管内淘汰法により淘汰し、 選択された極く少量の in vitro ウィルスの遺伝子部分を逆転写 PCRにより増幅し、 さらに変異を導入しながら増 幅することを特徴とする in vitroウィルスを用いた夕ンパク質の進化実験方法等 が提供される。 本発明の遺伝子型と表現型の対応付け分子やそれを用いた夕ンパ ク質の進化実験方法等は、 進化分子工学、 すなわち、 酵素、 抗体、 リボザィ厶な どの機能性生体高分子を改変したり、 さらには生物から見出せな L、機能をもった 生体高分子の創製等において用いうる極めて有用な物質や実験系である。

配列表

(1)一般情報

(i) 出願人: 三菱化学株式会社

(ϋ) 発明の名称:遺伝子型と表現型の対応付け分子及びその利用

(iii) 配列数: 2 6

(iv) 連絡先

(A)宛名 三菱化学株式会社

(B)番地 丸の内二丁目 5番 2号

(C)巿 千代田区

(D)州 東京都

(E)国 曰本国

(F) ZIP 1 0 3

(V) コンビュ—夕読取り可能形式

(A)媒体: フロッピーディスク

(B)コンピュータ IBM PC互換

(C)操作システム PC-DOS/MS-DOS

(D)ソフトウェア Patentln

(vi) 現行出願データ

(A)出願番号:

(B)出願日 : 17. 10. 97

(C)分類:

(D)書類記号: E97128W0623

(vii) 先の出願データ

(A)出願番号: JP 1996274855

(B)出願日 : 17. 10. 96

(2) 配列番号 1に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 33

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ϋ) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報: T7プロモータ一上流

(xi) 配列:配列番号 1

GAGCATAGAT CTCGATCCCG CGAAATTAAT ACG 34

(2) 配列番号 2に関する情報

(i) 配列の特徴 (A) 長さ : 33

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:終始コドンを含む

(xi) 配列:配列番号 2

GCAGCCGGAT CCTTACTACT TGTGGGTTTC AAT 33

(2) 配列番号 3に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 33

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:開始コドンを含む、 配列番号 4と相補

(xi) 配列:配列番号 3

GGACATGACA TTCATCATGT CTGGCATATG TAT 33

(2) 配列番号 4に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 33

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:開始コドンを含む、 配列番号 3と相補

(xi) 配列:配列番号 4

ATACATATGC CAGACATGAT GAATGTCATG TCC 33

(2) 配列番号 5に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 16

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖 (D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:配列番号 6と相補な部分を有する

(xi ) 配列:配列番号 5

GATCTATTTC TTATTC 16

(2) 配列番号 6に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 17

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数 -'一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:配列番号 5と相補な部分を有する

(xi) 配列:配列番号 7

GAAGAGAATA AGAAATA Π

(2) 配列番号 7に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 17

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:配列番号 6と相補な部分を有する

(xi) 配列:配列番号 7

TCTTCTATTT CTTATTC 17

(2) 配列番号 8に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 30

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DM (ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:配列番号 9と相補な部分を有する

(xi) 配列:配列番号 8

GGGTAAACGA ATGAACAAGA ATAAGAAATA 30

(2) 配列番号 9に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 108

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:ァラニン tRNAの配列を有する

(xi) 配列:配列番号 9

TTGTTCATTC GTTTACCCGG GGCTATAGCT CAGCTGGGAG AGCGCCTGCT TCTAACGCAG 60 GAGGTCTGCG GTTCGATCCC GCGTAGCTCC ACCAGGAGGC GACTAGCT 108

(2) 配列番号 1 0に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 23

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:ァラニン tRNAの 3'側の配列の一部を有する

(xi) 配列:配列番号 1 0

GTGGAGCTAC GCGGGATCGA ACC 23

(2) 配列番号 1 1に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 25

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:終始コドンをもたない (xi) 配列:配列番号 1 1

GCAGCCGGAT CCTTTCTGCT TGTGG 25

(2) 配列番号 1 2に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 21

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:配列番号 17と一部相補な配列をもつ

(xi) 配列:配列番号 1 2

CTTTAATGAC CTCCCCTCTC C 21

(2) 配列番号 1 3に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 40

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ϋ) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:配列番号 17と一部相補な配列をもつ

(xi) 配列:配列番号 1 3

CTTTAATAAT TTTTTTTTTT TTTAATGACC TCCCCTCTCC 40

(2) 配列番号 1 4に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 60

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ϋ) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:配列番号 17と一部相補な配列をもつ

(xi) 配列:配列番号 1 4

CTTTAATAAT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTAATGACC TCCCCTCTCC 60 (2) 配列番号 1 5に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 80

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:配列番号 17と一部相補な配列をもつ

(xi) 配列:配列番号 1 5

CTTTAATAAT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 60 TTTAATGACC TCCCCTCTCC 80

(2) 配列番号 1 6に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 25

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(C) 存在位置: 22. . 25

(D) 他の情報: RNA

(xi) 配列:配列番号 1 6

CTTACTGTCT TTTTTTTTTT TGAGC 25

(2) 配列番号 1 7に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 33

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:配列番号 16と一部相補な配列をもつ

(xi) 配列:配列番号 1 7

AAAAAAGACA GTAAGGGAGA GGGGAGGTCA TTA 33 (2) 配列番号 1 8に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 24

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー :直鎖状

(ϋ) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報: タウタンパク質の N末端半分領域の N末の開始コドンを 含む

(xi) 配列:配列番号 1 8

ATGGCTGAGC CCCGCATGGA GTTC 24

(2) 配列番号 1 9に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 24

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー :直鎖状

(ϋ) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 MA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報: タウタンパク質の N末端半分領域の 末の終始コ ドンを 含む

(xi) 配列:配列番号 1 9

CTCTGCCACT TACTAGGGCT CCCG 24

(2) 配列番号 2 0に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 23

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー :直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報: タウタンパク質の N末端半分領域の C末の終始コ ドンを 含まない

(xi) 配列:配列番号 2 0

CTCTGCCACC TTCTTGGGCT CCC 23 (2) 配列番号 2 1に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 118

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー :直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報: T7RNAポリメラ一ゼのプロモータ一領域、 kozak配列、 ヒ トタウタンパク質のァミノ酸残基番号 1-25に相当する DNA配列を含む DNA

(xi) 配列:配列番号 2 1

GATCCCGCGA AATTAATACG ACTCACTATA GGGAGACCAC AACGGTTTCC CTCTAGAAAT 60 AATTTTGTTT AACTTTAAGA AGGAGATGCC ACCATGGTTG AGCCCCGCAT GGAGTTCG 118

(2) 配列番号 2 2に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 30

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー :直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DM

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報: T7KNAポリメラーゼのプロモータ一を一部含む 5'末端領 域

(xi) 配列:配列番号 2 2

GATCCCGCGA AATTAATACG ACTCACTATA 30

(2) 配列番号 2 3に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 105

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー :直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DM

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報: Spacer5

(xi) 配列:配列番号 2 3

AAGCCACTCG CGTGGTCTCG CATTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 60 TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTAA TGACCTCCCC TCTCC 105 (2) 配列番号 2 4に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 25

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:スプリント DNA

(xi) 配列:配列番号 2 4

AAAGACAGTA AGGGAGAGGG GAGGT 25

(2) 配列番号 2 5に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 47

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:逆転写 PCR用プライマ一

(xi) 配列:配列番号 2 5

GGTTTCCCTC TAGAAATAAT TTTGTTTAAC TTTAAGAAGG AGATATA 47

(2) 配列番号 2 6に関する情報

(i) 配列の特徴

(A) 長さ : 25

(B) 型:核酸

(C) 鎖の数:一本鎖

(D) トポロジー:直鎖状

(ii) 配列の種類:他の核酸

(A) 説明: 合成 DNA

(ix) 配列の特徴

(D) 他の情報:逆転写 PCR用プライマ一

(xi) 配列:配列番号 2 6

AGCTTTCAGG CCAGCGTCCG TGTCA 25

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 遺伝子型を反映する塩基配列を有する核酸部と、 表現型の発現に関与する夕 ンパク質を含む夕ンパク質部とを含み、 前記核酸部と前記夕ンパク質部とが直接 化学結合している、 遺伝子型と表現型の対応付け分子。
2 . 核酸部の 3'末端と夕ンパク質部の C末端とが共有結合してなる請求の範囲第 1項に記載の対応付け分子。
3 . タンパク質部の C末端と共有結合する核酸部の 3'末端がピューロマイシンで ある請求の範囲第 1項または第 2項に記載の対応付け分子。
4 . 核酸部が、 タンパク質をコードする遺伝子を含み、 タンパク質部が該核酸部 の遺伝子の翻訳産物である請求の範囲第 1項ないし第 3項の 、ずれかに記載の対 応付け分子。
5 . 核酸部が、 RNAからなる遺伝子と、 前記遺伝子にスぺ一サーを介して連結し たサブレッサ一 tRNAとを含む請求の範囲第 4項に記載の対応付け分子。
6 . 前記サブレッサ一 tRNAが、 前記遺伝子の終始コドンに対応するアンチコドン を含む、 請求の範囲第 5項に記載の対応付け分子。
7 . 核酸部が、 RNAからなる遺伝子と、 DNAと RNAとからなるスぺ一サ一とを含む 請求の範囲第 4項に記載の対応付け分子。
8 . 核酸部が、 RNAからなる遺伝子と、 MAとポリエチレングリコールとからなる スぺーサ一とを含む請求の範囲第 4項に記載の対応付け分子。
9 . 核酸部が、 RNAからなる遺伝子と、 二本鎖の DNAからなるスぺ一サ一とを含む 請求の範囲第 4項に記載の対応付け分子。
1 0 . 核酸部が、 RNAからなる遺伝子と、 RNAと短鎖のペプチド核酸 (PNA) また は DNAとの二本鎖からなるスぺ一サ一とを含む請求の範囲第 4項に記載の対応付 け分子。
1 1 . 核酸部が、 DNAからなる遺伝子と、 MAと RNAとからなるスぺーサ一とを含 む請求の範囲第 4項に記載の対応付け分子。
1 2 . (a) 遺伝子を含む DNAの 3'末端側にサブ-レッサ一 tRNAに対応する配列の DN Aをスぺーサーを介して連結し、 (b) 得られた MA連結体を転写して RNAにし、 (c) 得られた RNAの 3'末端に、 アミノ酸あるいはアミノ酸に類似した化学構造骨 格を有する物質と共有結合し得る、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似し た化学構造骨格を有する物質を連結し、 (d) 得られた連結体を mRNAとして無細 胞タンパク質合成系で夕ンパク質合成を行い、 遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子 の翻訳産物とを連結することを特徴とする、 請求の範囲第 5項に記載の対応付け 分子の構築方法。
1 3 . (a) 終止コドンをもたない遺伝子を含む DNAを作成し、 (b) 作成した DNA を転写して RNAにし、 (c) 得られた RMの 3'末端側に MAと RNAのキメラのスぺー サ一を連結し、 (d) さらに得られた連結体の 3'末端側に、 アミノ酸あるいはァ ミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、 ヌクレオシドぁ るいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を連結し、 (e) 得ら れた連結体を mRNAとして無細胞タンパク質合成系で夕ンパク質合成を行い、 遺伝 子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物とを連結することを特徴とする、 請求の 範囲第 7項に記載の対応付け分子の構築方法。
1 4 . ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質 がピューロマイシンである請求の範囲第 1 2項または第 1 3項に記載の構築方法。
1 5 . (a) 終止コドンをもたな t、遺伝子を含む DNAを作成し、 (b) 作成した DNA を転写して RNAにし、 (c) 得られた RNAの 3'末端側に DNAとポリエチレングリコー ルのキメラのスぺ一サ一を連結し、 (d) さらに得られた連結体の 3'末端側に、 アミノ酸あるいはァミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得 る、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を 連結し、 (e) 得られた連結体を mRNAとして無細胞タンパク質合成系でタンパク 質合成を行い、 遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物とを連結することを 特徴とする、 請求の範囲第 8項に記載の対応付け分子の構築方法。
1 6 . (a) 終止コドンをもたない遺伝子を含む MAを作成し、 (b) 作成した DNA を転写して RNAにし、 (c) 得られた RNAの 3'末端側に二本鎖の DNAのスぺ一サーを 連結し、 (d) さらに得られた連結体の 3'末端側に、 アミノ酸あるいはアミノ酸 に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、 ヌクレオシドあるいは ヌクレオシ ドに類似した化学構造骨格を有する物質を連結し、 (e) 得られた連 結体を mRNAとして無細胞夕ンパク質合成系で夕ンパク質合成を行い、 遺伝子を含 む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物とを連結することを特徴とする、 請求の範囲第 9項に記載の対応付け分子の構築方法。
1 7 . (a) 終止コドンをもたない遺伝子とスぺーサ一の塩基配列とを含む DNAを 作成し、 (b) 作成した DNAを転写して RNAにし、 (c) 得られた RNAの 3'末端側に、 アミノ酸あるいはァミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得 る、 ヌクレオシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を 連結し、 (d) 得られた RNAの連結体の遺伝子部分の 3'末端側の部分に短鎖の PNA または DNAを加えて二本鎖を形成させ、 (e) 得られた連結体を mRNAとして無細胞 夕ンパク質合成系で夕ンパク質合成を行い、 遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の 翻訳産物とを連結することを特徴とする、 請求の範囲第 1 0項に記載の対応付け 分子の構築方法。
1 8 . 請求の範囲第 1 2項、 第 1 3項、 第 1 5項、 第 1 6項及び第 1 7項のいず れかに記載の方法により、 遺伝子を含む DMから、 対応付け分子を構築する構築 工程と、 構築工程で得られた対応付け分子を淘汰する淘汰工程と、 淘汰工程によ り選択された対応付け分子の遺伝子部分に変異を導入する変異導入工程と、 変異 導入工程で得られた遺伝子部分を増幅する増幅工程とを含むことを特徴とする夕 ンパク質の進化実験方法。
1 9 . 増幅工程で得られた DNAを構築工程に供することにより、 構築工程、 淘汰 工程、 変異導入工程及び増幅工程を繰り返し行うことを特徴とする、 請求の範囲 第 1 8項に記載のタンパク質の進化実験方法。
2 0 . 請求の範囲第 1 2項、 第 1 3項、 第 1 5項、 第 1 6項及び第 1 7項のいず れかに記載の方法により対応付け分子を構築する構築工程と、 構築工程で得られ た対応付け分子と他のタンパク質または核酸との相互作用を調べる検定工程とを 含むことを特徴とするタンパク質一タンパク質またはタンパク質一核酸相互作用 の検定方法。
2 1 . 遺伝子を含む DNAの 3'末端側にサブレッサ一 tRNAに対応する配列の DNAをス WO 98/16636 Γ , PCT/JP97/03766 -
- 5 1 - ぺーサ一を介して連結する第一連結手段、 第一連結手段で得られた DNA連結体を R ΝΑに転写する転写手段、 転写手段で得られた RNAの 3'末端に、 アミノ酸あるいは ァミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、 ヌクレオシド あるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を連結する第二連結 手段、 及び、 第二連結手段で得られた連結体を mRMとして無細胞タンパク質合成 系でタンパク質合成を行い、 遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物を連結 する第三連結手段を含む対応付け分子の構築手段、 または、 遺伝子を含む DNAを R NAに転写する転写手段、 転写手段で得られた RNAの 3'末端側に DNAと RNAのキメラ もしくは DNAとポリエチレングリコールのキメラもしくは DNAからなる二本鎖もし くは RNAと短鎖の PNAもしくは DNAからなる二本鎖のスぺ一サ一を連結する第一連 結手段、 第一連結手段で得られた RNA-スぺ一サ一連結体の 3'末端に、 アミノ酸あ るいはアミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質と共有結合し得る、 ヌクレ オシドあるいはヌクレオシドに類似した化学構造骨格を有する物質を連結する第 二連結手段、 及び、 第二連結手段で得られた連結体を mRNAとして無細胞タンパク 質合成系でタンパク質合成を行い、 遺伝子を含む核酸部と前記遺伝子の翻訳産物 を連結する第三連結手段を含む対応付け分子の構築手段と、 構築された対応付け 分子を淘汰する手段と、 選択された対応付け分子の遺伝子部分に変異を導入する 手段と、 変異導入された遺伝子部分を増幅する手段とを備えることを特徴とする、 請求の範囲第 1 8項または第 1 9項に記載の進化実験方法を行う装置。
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