WO1996004375A1 - Retrovirus-induzierte osteoklasten-modulation für die osteoporose-therapie - Google Patents

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retroviruses
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    • C12N2740/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to the reduction in the unphysiological bone degradation caused by osteoclasts in osteoporosis and other skeletal changes characterized by bone loss.
  • the bone matrix is subject to constant remodeling throughout life, with both the bone structure and the bone loss being regulated by numerous factors. Thereby the new formation of bone tissue by osteoblasts takes place, the breakdown of bone tissue by osteoclasts. Through an orderly regulation of these processes, regardless of the genetically programmed bone growth, the shape as well as the physical function of the bone and thus of the entire skeleton is preserved over several decades (skeletal homeostasis).
  • a disadvantage of the process described in DE 44 11 718.3 is that the degradation of the natural bone substance is not prevented.
  • This object is achieved according to the invention in that human or animal osteoblasts infected with an osteoinductive retrovirus are used for the production and isolation of one or more factors which can or can modulate the function of osteoclasts, the or the factors the infected osteoblast cells or from the cell culture supernatant of infected osteoblast cells can be isolated.
  • the factor is one or more proteins that are encoded by the virus or induced by the virus in the cell. This protein or these proteins can be
  • osteoblasts after an RFB retrovirus infection are no longer able to carry out osteoclast recruitment from undifferentiated progenitor cells and the formation of differentiated osteoclasts, that is to say the regeneration of bone-degrading cells.
  • an inhibition of bone degradation likewise, and indirectly, to a constant Leads to an increase in the total amount of bone tissue and thereby ensures skeletal homeostasis in the case of beginning or already advanced osteoporosis.
  • osteoblast-mediated signals provided they regulate osteoclast activity, are to be regarded as exocrine or paracrine factors.
  • the bioactive molecules are therefore directly encoded by the virus or induced as a result of a viral infection of an osteoblast in the target cell and act either within a "microenvironment" or, distributed over the bloodstream, on target cells located further away.
  • osteoinductive retroviruses leads to a reduction in osteoclast recruitment from precursor cells and / or a reduction in the biological activity of differentiated osteoclasts.
  • the present invention is also achieved by other retroviruses which code for a polypeptide or several polypeptides with osteoclast-modulating activities or induce corresponding factors in the target cell.
  • osteoclast-modulating activities relates to the maintenance of skeletal homeostasis in situations in which there is otherwise an increased breakdown of bone tissue due to increased osteoclast activity or a steady increase in bone tissue is observed.
  • new bone formation means the general increase in the trabecular thickness in the bone cancellous bone of tubular bones and vertebral bodies, the increase and strengthening of the bone shaft in the diaphyseal and metaphyseal area of long tubular bones and the local new bone formation in the entire skeletal area .
  • Retroviruses with osteoinductive properties were isolated: - Retroviruses cloned directly from the mouse genome (Murray et al.
  • the RFB retrovirus preferably in the molecular cloned form (RFB-14), is preferably used, produced by the cell line RFB MBK 6a (DSM ACC 2146).
  • these viruses induce bone changes such as osteopetrosis and osteomas and, to a different extent, lymphomas after injection into newborn mice, depending on the mouse test strain.
  • the RFB virus has the strongest biological activity of these retroviruses on skeletal cells. In the CBA test strain, no lymphoma formation was detectable eight months after infection with the RFB virus, while at this point multiple osteomas had already developed in over 50% of the mice.
  • osteoinductive retroviruses can be used to develop a therapeutic agent for the treatment of degenerative bone diseases.
  • Osteopetrosis is characterized by a thickening of the bone shaft in the area of long tubular bones and a focal or generalized thickening of the trabeculae in the spongiosa area of the vertebral bodies. In more pronounced forms, complete loss of the bone marrow cavity and replacement of bone marrow by compact bone tissue can occur. In these cases, massive growth of bone tissue on the trabeculae in the cancellous area of the vertebral bodies leads to complete loss of the cancellous bone structure and to the formation of a solid, "petrosed” bone (AB Murray, J. Schmidt, A. Luz Osteopetrosis induced by retrovirus , mouse. In: Cardiovascular and Musculoskeletal Systems, TC Jones, U. Mohr, RD Hunt (Eds.) Springer, 1991).
  • osteoclast-modulating factor produced or induced by osteoblasts infected with osteoinductive retroviruses acts on osteoclast precursor cells and on osteoclasts and can be used to develop a medicament for the therapy of osteoporosis.
  • Figure 1 shows the induction of multinuclear, TRAP-positive cells after treatment of spleen cells with 1,25 (OH) 2 vitamin D 3 and various retroviruses.
  • Osteoclasts are derived from hematopoietic stem cells (Hattersley and Chambers, J. Cell Physiol. 140: 478-482, 1989; Haganaars et al., Bone Miner. 6: 187-190, 1989).
  • the induction of osteoclasts from stem cells takes place through cellular alternating Effects due to cell-cell contact between hematopoietic progenitor cells and stromal cells (Takahashi et al., Endocrinology 123: 2600-2602, 1988).
  • Osteoclast-inductive stromal cells are found primarily in the bone marrow, with osteoclast precursor cells found in the bone marrow and spleen.
  • Osteopetrosis is characterized by a thickening of the bone shaft in the region of long tubular bones and a thickening of the bone trabeculae in the cancellous region of the vertebral bodies. In more pronounced forms, there can be complete loss of the bone marrow cavity and replacement of bone marrow with compact bone tissue.
  • osteopetrosis as a result of a retrovirus infection can be seen on the one hand as a direct result of an infection of osteoblasts and subsequent continuous, increased matrix protein formation (Schmidt et al., Am J.
  • Pathol. 129 503-510, 1987; Livne et al., Calcif. Tissue int. 44: 25-35, 1989).
  • a disruption of skeletal homeostasis with continuous bone growth can also result from a reduction in the total number of osteoclasts in the skeleton and thus from a resulting reduced bone resorption.
  • the RFB virus and other osteoinductive retroviruses are able to significantly reduce the induction of osteoclasts, which in turn leads to an increase in new bone formation.
  • This result was extremely surprising since the entire literature and in particular DE 44 11 718.3 exclusively describe the bone-inducing properties of osteoinductive retroviruses, in particular the RFB retrovirus, by stimulating the bone-regenerating activity of the osteoblasts.
  • the present invention is also for the development of a therapeutic agent for the treatment of e.g. age-related bone loss can be used.
  • This step is surprising and unexpected in that these viruses are pathogenic in the infected mice and not only the changes in the lymphatic but also in the bone-forming system are of an unphysiological, pathogenic nature.
  • the infected cell or the supernatant, ie the nutrient medium becomes RFB virus-infected osteo- blast progenitor cells with a stromal cell character, a factor, namely a protein, which has osteoclast-modulating activities.
  • This factor is induced by the RFB virus.
  • a continuously growing cell line (RFB MBK 6a) containing the RFB-14 provirus genome was deposited with the DSM on August 18, 1993 and received the access number DSM ACC2146 (cf. DE 44 11 718.3).
  • the RFB retrovirus is therefore preferably used, particularly preferably in its molecularly cloned form as RFB-14.
  • RFB-14 the molecularly cloned form
  • other osteoinductive retroviruses can also be used, which are characterized in more detail above in the description.
  • the DNA or RNA of these osteoinductive retroviruses is preferably used, either in their complete sequence or in the form of a partial sequence thereof, these sequences preferably being present in a suitable vector system.
  • the nature of the osteoclast-modulating factor is still unknown, although it is almost certainly a protein or several poreins.
  • the osteoclast-modulating factor is either encoded by the osteoinductive retrovirus or induced by this in the cell.
  • the DNA or RNA of the osteoinductive retroviruses thus code for an osteoclast-modulating factor or induce it. Partial sequences of the DNA or the RNA of the osteoinductive retroviruses are preferably used, which code for or induce the osteoclast-modulating factor.
  • DNA or RNA hybridizing therewith, preferably under stringent conditions, can also be used.
  • spleen tissue of young mice For the experimental detection of the induction of osteoclast recruitment and the reduction of osteoclast induction from undifferentiated progenitor cells by retroviruses, cell cultures from spleen tissue of young mice are used. For this purpose, a single cell suspension is made from the spleen. These spleen cells are cultivated in a number of 5 ⁇ 10 5 cells per well together with 4x10 * osteoblasts in multi-well plates (96 wells per plate). The osteoblasts come from the bony skull roof of newborn mice, from which a single cell population was produced by fractional enzymatic digestion of the tissue. To reduce osteoclast recruitment, the osteoblasts intended for cocultivation are infected with RFB virus or other retroviruses.
  • the cells are washed twice with buffered saline and fixed with 3% formalin solution, after which a substrate solution to which tartrate has been added is added to the cells.
  • the expression of the calcitonin receptor is a specific feature of osteoclasts. After approximately 30-60 minutes of exposure to the substrate solution, mononuclear and multinucleated cells stain. The former represent osteoclast precursor cells, the latter represent osteoclasts.
  • the respective number of stained cells are quantitatively determined.
  • the experiments are carried out for statistical validation in a 4-fold parallel approach.
  • the number of stained cells provides a measure of the osteoclast recruitment activity of the osteoblast population used or of the effect of the retrovirus infection of the osteoblasts on the reduction of the osteoclast recruitment activity.
  • Table 1 shows the induction of mononuclear (osteoclast precursors) and multinuclear (osteoclasts), TRAP (tartrate-resistant, acid phosphatase, an osteoclast marker) - positive cells after treatment of spleen cells with 1.25 (OH) 2 Vitamin D 3 and RFB virus.
  • the treatment shows a significant reduction in osteoclast precursors (p ⁇ 0.005) and osteoclasts (p ⁇ 0.05) recruitment in two independent experiments.
  • Figure 1 shows the induction of multinuclear (osteoclasts), TRAP-positive cells after treatment of spleen cells with 1.25 (OH) 2 vitamin D 3 and various retroviruses.
  • A control group, 1.25 (OH ) 2 vitamin D 3 treatment;
  • Biological activity is defined by the steady increase in bone tissue in infected mice.
  • Treatment of the cells in the in vitro experiment shows a slight reduction in osteoclast recruitment with ⁇ 0TS-25-G18 (p ⁇ 0.05) and a strong reduction in osteoclast recruitment with RFB virus (p ⁇ 0.005) .
  • the method according to the invention is particularly well suited for the reduction of osteoclast recruitment from progenitor cells and thus for a reduction in bone resorption.
  • Cloned retrovirus genomes, in particular the RFB provirus genome, as well as the partial sequences of retrovirus genomes responsible for its biological effectiveness, in particular the RFB pro virus genome or related hybridizing sequences can also be used for somatic gene therapy. These are preferably sequences which hybridize under stringent conditions or partial sequences thereof.

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Abstract

Die Erfindung offenbart ein Verfahren zur Herstellung osteoklasten-modulierender Faktoren durch Infektion menschlicher oder tierischer Osteoblastenzellen mit einem osteoinduktiven Retrovirus und Isolation der Faktoren aus den infizierten Osteoblastenzellen oder aus dem Zellkulturüberstand infizierter Osteoblastenzellen.

Description

Retrovirus-induzierte Osteoklasten-Modulation für die Osteoporose-Therapie
Die Erfindung betrifft die Verringerung des durch Osteoklasten hervorgerufenen, unphysiologischen Knochenabbaus bei der Osteoporose und anderen, durch Knochenschwund charakterisier¬ ten Skelettveränderungen.
Die Knochenmatrix ist während des ganzen Lebens einem ständi¬ gen Umbau unterworfen, wobei sowohl der Knochenaufbau als auch der Knochenabbau durch zahlreiche Faktoren reguliert wird. Dabei erfolgt die Neubildung von Knochengewebe durch Osteobla- sten, der Abbau von Knochengewebe durch Osteoklasten. Durch eine geordnete Regulation dieser Vorgänge bleibt, ungeachtet des genetisch programmierten Knochenwachstums, die Form sowie die physikalische Funktion des Knochens und somit des gesamten Skeletts über mehrere Jahrzehnte erhalten (Skeletthomeosta- se) .
Mit zunehmendem Alter kommt es insbesondere bei der Frau zu einem fortschreitenden Verlust an mineralisiertem Knochengewe¬ be, der aufgrund veränderter Struktur und verminderter Funk¬ tion des Skeletts vermehrt zu Knochenbrüchen führt. Dieser auf einer I balanz zwischen Osteoblastenaktivität und Osteokla- stenaktivität begründete Knochenverlust wird als Osteoporose klinisch manifest und verursacht erhebliche gesundheitliche und sozioökonomische Probleme.
Bisher gibt es für die Osteoporoseprophylaxe bzw.für die Osteoporosetherapie mehrere Ansätze mit sehr unterschied- liehen, generell gesehen jedoch insgesamt unbefriedigenden Ergebnissen. Dazu gehören:
a) eine Östrogenprophylaxe, bei der dem positiven Einfluß auf die Knochenzellen und den Lipidstoffwechsel das Risiko einer Thromboembolie entgegensteht,
b) eine erhöhte Kalziumgabe,
c) eine Kalzitoninbehandlung, welche selbst bei nasaler Ap¬ plikation die Knochenresorption in einem gewissen Umfang hemmt,
d) eine Vitamin D-Therapie, die jedoch für eine prophylakti¬ sche Behandlung keine eindeutigen Ergebnisse erbrachte und bei therapeutischer Anwendung stark von der Dosierung und von der Wahl des biologisch wirksamen Vit. D-Metaboliten abhängt und außerdem jederzeit die Gefahr der Entwicklung einer Hyperkal- zämie in sich trägt.
In jüngster Zeit konnten in einer Reihe von in vivo- und in vitro-Untersuchungen in unseren Labors experimentell gezeigt werden, daß durch Infektion von Osteoblasten mit Retroviren (MuLV), insbesondere mit dem RFB Virus, entweder lokal oder generalisiert die Knochenneubildung signifikant induziert wird. In infizierten Labormäusen kommt es dabei zur Entstehung von Osteomen und Osteopetrose. Bei der Infektion von Knochen¬ zellen in vitro mit Retroviren, insbesondere mit dem RFB Vi¬ rus, kommt es zu einer Erhöhung der osteoblastischen Differen¬ zierung. Daraus ergibt sich, daß entweder ein virus-kodierter Faktor oder ein durch die Virusinfektion in der Zelle indu¬ zierter Faktor für die Erhöhung der Differenzierungsleistung verantwortlich ist. Die daraus sich ableitende therapeutische Ausnutzung der biologischen Aktivität von sogenannten osteoin- duktiven Retroviren für eine Induktion der Knochenzell-Diffe- renzierung und somit Erhöhung der Knochenmatrix-Produktion ist in der DE 44 11 718.3, eingereicht beim Deutschen Patentamt am 5.4.1994, beschrieben.
Ein Nachteil des in der DE 44 11 718.3 beschriebenen Verfah¬ rens liegt darin, daß der Abbau der natürlichen Knochensub¬ stanz nicht verhindert wird.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen neuen Weg zur therapeutischen Behandlung von Osteoporose und ande¬ ren, mit dem Verlust von Knochengewebe einhergehenden Krank¬ heiten aufzuzeigen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß mit ei¬ nem osteoinduktiven Retrovirus infizierte menschliche oder tierische Osteoblasten zur Produktion und Isolation eines oder mehrerer Faktoren verwendet werden, der bzw. die die Funktion von Osteoklasten modulieren kann bzw. können, wobei der oder die Faktoren aus den infizierten Osteoblastenzellen oder aus dem Zellkulturüberstand infizierter Osteoblastenzellen iso¬ lierbar sind.
Bei dem Faktor handelt es sich um eines oder mehrere Proteine, die vom Virus kodiert oder vom Virus in der Zelle induziert werden. Dieses Protein bzw. diese Proteine können
a) die Bereitstellung von Osteoklastenvorläufer-Zellen aus dem hämatopoetischen System inhibieren (Rekrutierungsinhibi¬ tion) und/oder
b) die knochen-resorbierende Aktivität von differenzierten Osteoklasten inhibieren (Funktionsinhibition)).
Erfindungsgemäß wurde überraschend festgestellt, daß Osteobla¬ sten nach einer RFB Retrovirusinfektion nicht mehr in der Lage sind, die Osteoklastenrekrutierung aus undifferenzierten Vor¬ läuferzellen und die Ausbildung zu differenzierten Osteokla¬ sten, das heißt die Neubildung von knochensubstanz-abbauenden Zellen, zu bewerkstelligen. Erfindungsgemäß wurde somit gefunden, daß im Gegensatz zur di¬ rekten Induktion der Knochenproduktion durch eine Retroviru¬ sinfektion von Osteoblasten, wie sie in der obengenannten DE 44 11 718.3 beschrieben wurde, eine Inhibition des Knochenab¬ baus ebenfalls, und zwar indirekt, zur einer stetigen Erhöhung der Gesamtmenge an Knochengewebe führt und dadurch bei begin¬ nender oder bereits fortgeschrittener Osteoporose die Skelett- homeostase sicherstellt.
Im Skelett sind knochenaufbauende und knochenabbauende Zellen selten in direkter, zellulärer Nachbarschaft gelegen. Aus die¬ sem Grund sind osteoblasten-vermittelte Signale, sofern sie die Osteoklastenaktivität regulieren, als exo- bzw. parakrine Faktoren anzusehen. Die bioaktiven Moleküle sind deshalb di¬ rekt durch das Virus kodiert oder als Folge einer Virusinfek¬ tion eines Osteoblasten in der Zielzelle induziert und wirken entweder innerhalb einer "Mikroumgebung" oder, über die Blut¬ bahn verteilt, auf weiter entfernt liegende Zielzellen.
Die biologische Wirkung von Osteoklasten im Skelett im Rahmen des sogenannten "bone remodeling" ist eine Folge enger Wech¬ selwirkungen zwischen Osteoblasten und Osteoklasten (Rodan und Martin, Calcif. Tissue Int.). Ein Eingriff in diese Wechsel¬ wirkungen durch eine Retrovirusinfektion im experimentellen System hat somit
a) eine verminderte Rekrutierung von Osteoklasten aus Vorläu¬ ferzellen und/oder
b) eine Reduktion des Knochenabbaus durch Osteoklasten zur Folge.
Erfindungsgemäß wird durch die Infektion von Osteoblasten mit osteoinduktiven Retroviren eine Reduktion der Osteoklastenre- krutierung aus Vorläuferzellen und/oder eine Reduktion der biologischen Aktivität differenzierter Osteoklasten erreicht. Die vorliegende Erfindung wird auch durch andere Retroviren, die für ein Polypeptid oder mehrere Polypeptide mit osteokla- sten-modulierenden Aktivitäten kodieren oder entsprechende Faktoren in der Zielzelle induzieren, gelöst. Der Begriff "osteoklasten-modulierende Aktivitäten" betrifft in diesem Zu¬ sammenhang den Erhalt der Skeletthomeostase in Situationen, in denen ansonsten ein erhöhter Abbau von Knochengewebe durch verstärkte Osteoklastenaktivität gegeben ist oder eine stetige Zunahme von Knochengewebe beobachtet wird.
Diese Retroviren können auch im Tierexperiment eine Knochen¬ neubildung induzieren. Der Begriff "Knochenneubildung" bedeu¬ tet in diesem Zusammenhang die generelle Zunahme der Trabekel¬ dicke in der Knochenspongiosa von Röhrenknochen und Wirbelkör¬ pern, die Zunahme und Verstärkung des Knochenschaftes im di- aphysären und metaphysären Bereich langer Röhrenknochen sowie die lokale Knochenneubildung im gesamten Skelettbereich.
Retroviren mit osteoinduktiven Eigenschaften wurden isoliert: -direkt aus dem Mausgenom klonierte Retroviren ( Murray et al.
Osteopetrosis induced by retrovirus, mouse. Monographes on Pathology of Laboratory animals. Springer Berlin, Heidelberg, New York. T.C. Jones, U. Mohr, R.d. Hunt (Eds.), ILSI, Seiten 284-291, 1991; Luz et al., Osteoma mouse, spontarϊeous and vi- rus-induced. Monographs on Pathology of Laboratory Animals, Springer Berlin, Heidelberg, New York. T.C. Jones, U. Mohr, R.D. Hunt (Eds.), ILSI, Seiten 182-190, 1991; Pedersen et al. Virology 179, S. 931-935, 1990;
- aus normalem Knochengewebe (OL-6 MLV, Schmidt et al. 1988, Leuk.Res., 12, S. 393-403);
-aus bestrahltem Knochengewebe im Verlauf der Knochentumorent¬ stehung, (0L-1, OL-2, OL-7, OL-8 MLV, Schmidt et al. 1988, Leuk. Res. 12, Seiten 393-403);
-aus spontan entstehenden, benignen Knochentumoren (OA MLV, Schmidt et al. 1984, Journal of General Virology, 65, S. 2237- 2248); RFB, Pedersen et al. 1992, Journal of Virologyl, 66, S. 6186-6190);
-aus Osteosarkomen, (OS-5 MLV, Erfle et al. 1986 (Leuk. Res., 10, S. 905-913);
RFB MLV, Pedersen et al. 1992; Bone tumor viruses. In: Bone- Certain aspects of neoplasia. Colston Papers No. 24 (ed. Pri- ce, C, H., G., Ross, F., G., M. ) 353-366, Butterworth, Lon¬ don.
Erfindungsgemäß wird bevorzugt das RFB Retrovirus, bevorzugt in der molekular geklonten Form (RFB-14), verwendet, produ¬ ziert von der Zellinie RFB MBK 6a (DSM ACC 2146).
Zur vollständigen Offenbarung der Erfindung, insbesondere der osteoinduktiven Retroviren, wird der Offenbarungsgehalt der DE 44 11 718.3, hinterlegt beim Deutschen Patentamt am 5.4.1994, vollinhaltlich in die vorstehende Anmeldung mit aufgenommen.
Als gemeinsames Merkmal induzieren diese Viren nach Injektion in neugeborene Mäuse, in Abhängigkeit vom Mäuse-Teststamm, Knochenveränderungen wie Osteopetrose und Osteome und in un¬ terschiedlichem Maße auch Lymphome. Die stärkste biologische Wirksamkeit dieser Retroviren auf Skelettzellen hat das RFB Virus. Im Teststamm CBA ist acht Monate nach der Infektion mit RFB Virus noch keine Lymphombildung feststellbar, während zu diesem Zeitpunkt bereits in über 50 % der Mäuse multiple Osteome entstanden.
Bevor diese Knochenveränderungen voll ausgesprägt sind, stirbt in anderen Mäusestämmen, wie z.B. in NMRI-Mäusen, ein hoher Prozentsatz der Tiere an den durch die osteoinduktiven Retro¬ viren induzierten Lymphomen. Nicht nur das RFB-Retrovirus , sondern auch die anderen, obengenannten osteoinduktiven Retro¬ viren sind demnach für bestimmte infizierte Mäuse pathogen, und sie führen zum frühzeitigen Tod.
Die Lymphominduktion und die von den osteoinduktiven Retrovi¬ ren verursachten Knochenveränderungen (Osteopetrose und Osteo- me) sind unphysiologischer, pathologischer Natur; letztere gehen mit einer unkontrollierten Zunahme an Knochengrundsub¬ stanz einher. Es war deshalb überraschend, daß osteoinduktive Retroviren zur Entwicklung eines Therapeutikums zur Behandlung degenerativer Knochenerkrankungen verwendbar sind.
Osteopetrose ist gekennzeichnet durch eine Verdickung des Kno¬ chenschafts im Bereich langer Röhrenknochen und einer fokalen bzw. generalisierten Verdickung der Knochenbälkchen im Spon- giosa-Bereich der Wirbelkörper. In stärker ausgeprägten Formen kann es zum vollständigen Verlust der Knochenmarkhöhle und Er¬ satz von Knochenmark durch kompaktes Knochengewebe kommen. In diesen Fällen kommt es auch durch massiven Zuwachs von Knochengewebe an den Knochenbälkchen im Spongiosabereich der Wirbelkörper zum vollständigen Verlust der Spongiosastruktur und zur Entstehung eines soliden, "petrosierten" Knochens (A.B. Murray, J. Schmidt, A. Luz Osteopetrosis induced by re¬ trovirus, mouse. In: Cardiovascular and Musculoskeletal Sy¬ stems, T.C. Jones, U. Mohr, R.D. Hunt (Eds. ) Springer, 1991).
Der von mit osteoinduktiven Retroviren infizierten Osteobla¬ sten produzierte oder induzierte osteoklasten-modulierende Faktor wirkt auf Osteoklastenvorläufer-Zellen und auf Osteo¬ klasten und kann zur Entwicklung eines Arzneimittels zur The¬ rapie der Osteoporose herangezogen werden.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die bei¬ liegende Abbildung näher erläutert.
Die Abbildung 1 zeigt die Induktion von multinukleären, TRAP- positiven Zellen nach einer Behandlung von Milzzellen mit 1,25(OH)2 Vitamin D3 und verschiedenen Retroviren.
Osteoklasten stammen von hämatopoetischen Stammzellen ab (Hat- tersley und Chambers, J. Cell Physiol. 140:478-482, 1989;Hage- naars et al., Bone Miner. 6:187-190, 1989). Die Induktion von Osteoklasten aus Stammzellen erfolgt durch zelluläre Wechsel- Wirkungen in Folge eines Zell-Zell-Kontaktes zwischen hämato- poetischen Vorläuferzellen und Stromazellen (Takahashi et al., Endocrinology 123:2600-2602,1988). Osteoklasten-induktive Stromazellen finden sich vornehmlich im Knochenmark, wobei sich Osteoklasten-Vorläuferzellen im Knochenmark und in der Milz finden. Es gibt bereits auch in vitro wachsende Zellen, die sowohl Stromazell-Eigenschaften als auch osteoblastäre Eigenschaften aufweisen; jedoch sind nur wenige kontinuierli¬ che Zellinien in der Lage, ähnlich wie Stromazellen, die In¬ duktion von Osteoklasten aus Milzzellpopulationen zu bewerk¬ stelligen (Yamashita et al., J. Cell Physiol. 145:587-595, 1990).
Im experimentellen System wird die Induktion von Osteoklasten aus Knochenmark oder Milzzellen durch Vitamin D3 ( 1,25(OH)2D3) (Füller und Chambers, J. Cell Physiol. 132:441-452, 1987) und Prostaglandin E2 (PGE2) (Akatsu et al., J. Bone Miner. Res. 4:29-35,1989) verstärkt, wobei PGE2, das auch von hämatopoeti- schen Zellen produziert wird, wiederum auf hämatopoetische Stammzellen wirkt und im Zellkontakt mit Stromazellen die Osteoklasteninduktion hervorruft (Collins und Chambers, J. Bone Miner. Res. 7:555-561, 1992).
Bei Untersuchungen des onkogenen Potentials von murinen Retro¬ viren auf das Skelett von jungen Mäusen wurde festgestellt, daß virusinfizierte Mäuse bis zu 100% Osteopetrose entwickeln (Pedersen et al., J. Virol. 179:931-935, 1990). Osteopetrose ist gekennzeichnet durch eine Verdickung des Knochenschafts im Bereich langer Röhrenknochen und einer Verdickung der Knochen¬ bälkchen im Spongiosa-Bereich der Wirbelkörper. In stärker ausgeprägten Formen kann es zum vollständigen Verlust der Kno¬ chenmarkhöhle und Ersatz von Knochenmark durch kompaktes Kno¬ chengewebe kommen. In diesen Fällen kommt es auch durch mas¬ siven Zuwachs von Knochengewebe an den Knochenbälkchen im Spongiosabereich der Wirbelkörper zum vollständigen Verlust der Spongiosastruktur und zur Entstehung eines soliden, "pe- trosierten" Knochens (A.B. Murray, J. Schmidt, A. Luz Osteope- trosis induced by retrovirus, mouse. In: Cardiovascular and Musculoskeletal Systems, T.C. Jones, U. Mohr, R.D. Hunt (Eds. ) Springer, pp 284-291, 1991).
Die Entstehung von Osteopetrose als Folge einer Retrovirusin¬ fektion kann einerseits als direkte Folge einer Infektion von Osteoblasten und anschließender kontinuierlicher, erhöhter Ma¬ trixprotein-Bildung gesehen werden (Schmidt et al., Am J.
Pathol. 129:503-510,1987; Livne et al., Calcif. Tissue Int. 44:25-35, 1989). Andererseits kann eine Störung der Skelettho¬ meostase mit kontinuierlichem Knochenzuwachs auch aus einer Reduktion der Gesamtzahl der Osteoklasten im Skelett und somit aus einer daraus resultierenden verminderten Knochenresorption entstehen.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß das RFB-Virus und an¬ dere, osteoinduktive Retroviren in der Lage sind, die Osteo¬ klasteninduktion signifikant zu vermindern, was im Umkehr¬ schluß eine Zunahme der Knochenneubildung bewirkt. Dieses Er¬ gebnis war äußerst überraschend, da die gesamte Literatur und insbesondere die DE 44 11 718.3 ausschließlich die knochenin¬ duzierenden Eigenschaften osteoinduktiver Retroviren, insbe¬ sondere des RFB-Retrovirus durch Stimulation der knochenneu- bildenden Aktivität der Osteoblasten beschreiben.
Obwohl die Verminderung der Osteoklasteninduktion eine an sich krankhafte Zunahme der Knochenneubildung bewirkt, ist die vor¬ stehende Erfindung auch zur Entwicklung eines Therapeutikums zur Behandlung von z.B. altersbedingtem Knochenschwund ein¬ setzbar. Dieser Schritt ist insofern erstaunlich und unerwar¬ tet, als diese Viren in den infizierten Mäusen pathogen sind und nicht nur die Veränderungen des lymphatischen, sondern auch die des knochenbildenden Systems unphysiologischer, pat- hogener Natur sind.
Erfindungsgemäß wird aus der infizierten Zelle oder dem Über¬ stand, d.h. aus dem Nährmedium, RFB-Virus-infizierter Osteo- blasten-Vorläuferzellen mit Stromazellcharakter ein Faktor, nämlich ein Protein, bereitgestellt, der osteoklasten-modulie- rende Aktivitäten besitzt. Die Induktion dieses Faktors er¬ folgt durch das RFB Virus. Eine kontinuierlich wachsende Zel- linie (RFB MBK 6a), die das RFB-14 Provirusgenom enthält, wur¬ de am 18. 8. 1993 bei der DSM hinterlegt und erhielt die Zu¬ gangsnummer DSM ACC2146 (vgl. DE 44 11 718.3).
Erfindungsgemäß wird somit bevorzugt das RFB-Retrovirus, ins¬ besondere bevorzugt in seiner molekular geklonten Form als RFB-14, verwendet. Erfindungsgemäß können aber auch andere osteoinduktive Retroviren verwendet werden, die weiter oben in der Beschreibung näher gekennzeichnet sind. Weiterhin bevor¬ zugt wird die DNA oder RNA dieser osteoinduktiven Retroviren verwendet, entweder in ihrer vollständigen Sequenz oder in Form einer Teilsequenz hiervon, wobei diese Sequenzen weiter¬ hin bevorzugt in einem geeigneten Vektosystem vorliegen.
Die Natur des osteoklasten-modulierenden Faktors ist noch un¬ bekannt, wobei es sich mit an Sicherheit grenzender Wahr¬ scheinlichkeit jedoch um ein Protein oder um mehrere Porteine handelt. Der osteoklasten-modulierende Faktor wird entweder vom osteoinduktiven Retrovirus kodiert oder von diesem in der Zelle induziert. Die DNA oder RNA der osteoinduktiven Retrovi¬ ren kodieren somit für einen osteoklasten-modulierenden Faktor oder induzieren diesen. Bevorzugt werden Teilsequenzen der DNA oder der RNA der osteoinduktiven Retroviren verwendet, die für den osteoklasten-modulierenden Faktor kodieren oder diesen induzieren. Damit hybridisierende DNA oder RNA, bevorzugt un¬ ter stringenten Bedingungen, ist ebenfalls verwendbar.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der unten aufgeführten Experimente und der daraus resultierenden Befunde in der bei¬ liegenden Tabelle und Abbildung näher erläutert. Durchführung der Experimente:
Für den experimentellen Nachweis der Induktion der Osteokla- stenrekrutierung und der Verminderung der Osteoklasteninduk¬ tion aus undifferenzierten Vorläuferzellen durch Retroviren werden Zellkulturen aus Milzgewebe junger Mäuse verwendet. Dazu wird aus der Milz eine Einzelzellsuspension hergestellt. Diese Milzzellen werden in einer Zahl von 5xl05 Zellen pro Ver¬ tiefung zusammen mit jeweils 4x10* Osteoblasten in Multi-Loch- Platten (96 Vertiefungen pro Platte) kultiviert. Die Osteobla¬ sten stammen aus dem knöchernen Schädeldach neugeborener Mäu¬ se, aus denen durch fraktionierten enzymatischen Verdau des Gewebes eine Einzelzellpopulation herstellt wurde. Für die Verminderung der Osteoklastenrekrutierung werden die für die Kokultivierung vorgesehenen Osteoblasten mit RFB Virus oder anderen Retroviren infiziert.
2 Tage nach Beginn der Kultur werden 100 μl des Zellkulturme¬ diums entnommen und durch neues Medium (D'MEM, 10% fötales Kölberserum, Antibiotika, 10"βM l,25(OH)2 Vitamin D3) ersetzt. 3 bis 5 Tage nach Beginn der Kokultivierung dieser zwei Zellpo¬ pulationen werden die Zellen 2 mal mit gepufferter Kochsalzlö¬ sung gewaschen und mit 3%iger Formalinlösung fixiert. Danach wird den Zellen eine Substratlösung, die mit Tartrat versetzt wurde, zugesetzt. Tartrat-Resistenz ist zusammen mit der Ex¬ pression des Calcitonin-Rezeptors ein spezifisches Merkmal von Osteoklasten. Nach etwa 30-60 Min Einwirkungszeit der Sub¬ stratlösung färben sich einkernige und mehrkernige Zellen an. Erstere stellen Osteoklastenvorläuferzellen, letztere stellen Osteoklasten dar. Mit dem Lichtmikroskop kann die jeweilige Zahl der gefärbten Zellen quantitativ bestimmt werden. Die Experimente werden zur statistischen Absicherung im 4-fach Parallelansatz durchgeführt. Die Zahl der gefärbten Zellen ergibt ein Maß für die Osteoklasten-Rekrutierungsaktivität der verwendeteten Osteoblastenpopulation bzw. für den Effekt der Retrovirusinfektion der Osteoblasten auf die Reduktion der Osteoklasten-Rekrutierungsaktivität. Die Tabelle 1 zeigt die Induktion von mononukleären (Osteokla- stenvorläufer) und multinukleären (Osteoklasten), TRAP (tar- trat-resistente, saure Phosphatase, ein Osteoklasten-Marker)- positiven Zellen nach einer Behandlung von Milzzellen mit l,25(OH)2 Vitamin D3 und RFB Virus. Die Behandlung zeigt eine signifikante Reduktion der Osteoklastenvorläufer (p<0.005) bzw. der Osteoklasten (p<0.05)-Rekrutierung in zwei unabhängi¬ gen Experimenten.
Die Abbildung 1 zeigt die Induktion von multinukleären (Osteo¬ klasten), TRAP-positiven Zellen nach einer Behandlung von Milzzellen mit l,25(OH)2 Vitamin D3 und verschiedenen Retrovi¬ ren. A), Kontrollgruppe, l,25(OH)2 Vitamin D3-Behandlung; B) negative Kontrolle, die Osteoblasten wurden mit Virus-freiem Medium behandelt; C) die Osteoblasten wurden mit einem Retro¬ virus (λ0TS-25G18, Pedersen et al. , Virology 179:931-935, 1990) mit geringer biologischer Aktivität, behandelt; D) die Osteoblasten wurden mit RFB Virus, einem Retrovirus mit hoher biologischer Aktivität, behandelt. Die biologische Aktivität ist durch stetige Zunahme von Knochengewebe in infizierten Mäusen definiert. Die Behandlung der Zellen im in vitro-Expe- riment zeigt eine geringe Reduktion der Osteoklasten-Rekrutie- rung bei λ0TS-25-G18 (p<0,05) und eine starke Reduktion der Osteoklasten-Rekrutierung bei RFB Virus (p<0,005).
Zur Induktion und Produktion dieses osteoklasten-modulierenden Proteins bzw. dieser Proteine werden menschliche oder murine Osteoblasten infiziert bzw. transfiziert, das so induzierte Protein aus den Zellen oder dem Zeilüberstand isoliert und di¬ rekt oder nach einer Filtration zur Eliminierung infektiöser Viruspartikel als Therapeutikum oder zur Entwicklung eines solchen bereitgestellt. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich aufgrund seiner hohen biologischen Wirksamkeit besonders gut für die Reduktion der Osteoklasten-Rekrutierung aus Vor¬ läuferzellen und somit für eine Verminderung der Knochenre¬ sorption. Geklonte Retrovirusgenome, insbesonders das RFB-Provirusgenom, sowie die für dessen biologische Wirksamkeit verantwortlichen Teilsequenzen von Retrovirusgenomen, insbesonders des RFB-Pro- virusgenoms oder damit verwandte, hybridisierende Sequenzen können auch zur somatischen Gentherapie eingesetzt werden. Bevorzugt handelt es sich um Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen hybridisieren oder Teilsequenzen hiervon.
Tabelle 1
Infektion von Behandlung von TRAP-positive, TRAP-positive, Osteoblasten Osteoblasten einkernige mehrkernige
Figure imgf000016_0001
*p<0.05; **p<0.005
BUDAPESTER VERTRAG OBER DIE INTERNATIONALE
ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
POR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN
"adZeabUtuieo GβbH *^^
INTERNATIONALES FORMBLATT
DUPLIKAT
GSF-Forschungszentrum für
Umwelt und Gesundheit GmbH
Institut für Molekulare
Virologie
Neuherberg EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNC,
85758 Oberschleißheim auageatellt (tmU Regal 7.1 von dar untan aagaga anan INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER augateUte* Beeugaaeichen: Von dar INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE augatailt« EINGANGSNUMMER:
RFB MBK 6a DSM ACC21 6
II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I. beaeichneten Mikroorganiamua wurde
( X ) ein« wiaaanachaftlich« Bcachraibung
( ) ain« vorgeschlagen* taxonomiae a Beuic nung
«ingaraicht. (Zutreffend«» ankrausan).
III. EINGANG UND ANNAHME
Diaaa international* Hintarlagungaetell« nimmt d«n unter I beaeichneten Mikroorcaniarnua an, dar bei ihr am 1993 — 08 — 18 (Datum der Erathinterlegung) eingegangen itt.
IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I beaeichnet» Mikroorganiamua iat bei dieser Internationalen Hintarl«cun(aat*U* am eingegangen (Datum der Erathinterlegung) und ain Antrag auf Umwandlung dieacr Erathinterlegung in ein* Hinterlegung gemiβ
Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingang» des Antragt auf Umwandlung).
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSM-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschriften) dar aur Vertretung der internationalen
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Hint«rl*(unfiet«U* befugten P«raon(«n) oder de» (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Adraaae: Maacheroder Weg 1 B D-3S124 Braunachweig
Datum: 1993 -08-30
** Falla Regal β.4. Buchatab« d au trifft, iat diaa dar Zeitpunkt, au dam dar Statua einer internationalen Hinterlegungaatet erworben worden iat.

Claims

Retrovirus-induzierte Osteoklasten-Modulation für die Osteoporose-TherapieP A T E N T A N S P R Ü C H E
1. Verfahren zur Herstellung osteoklasten-modulierender Fak¬ toren durch Infektion menschlicher oder tierischer Osteo¬ blastenzellen mit einem osteoinduktiven Retrovirus und Isolation der Faktoren aus den infizierten Osteoblasten¬ zellen oder aus dem Zellkulturüberstand infizierter Osteoblastenzellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA oder die RNA osteoinduktiver Retroviren ver¬ wendet wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die vollständige Sequenz oder eine Teilsequenz oder eine damit hybridisierende Sequenz der DNA oder der RNA eines osteoinduktiven Retrovirus in einem Vektorsystem verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Retrovirus das RFB-Retrovirus, bevorzugt in mole¬ kular geklönter Form als RFB-14, oder damit verwandte Retroviren verwendet werden.
5. Osteoklasten-modulierender Faktor, hergestellt durch In¬ fektion menschlicher oder tierischer Osteoblastenzellen mit osteoinduktiven Retroviren und nachfolgender Isola¬ tion des Faktors nach einem der Ansprüche 1 bis 4.
6. Osteoklasten-modulierender Faktor nach Anspruch 5, hergestellt durch Transfektion menschlicher oder tieri¬ scher Osteoblastenzellen mit der DNA oder RNA osteoinduk¬ tiver Retroviren und nachfolgender Isolation des Faktors gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
7. Osteoklasten-modulierender Faktor nach einem der Ansprü¬ che 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß er ein oder mehrere Proteine umfaßt.
8. Osteoklasten-modulierender Faktor nach einem oder mehre¬ ren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er vom Retrovirus kodiert oder vom Retrovirus in der
Zelle induziert wird.
9. Osteoklasten-modulierender Faktor nach einem oder mehre¬ ren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er die Bereitstellung von Osteoklastenvorläuferzellen aus dem hämatopoetischen System inhibiert.
10. Osteoklasten-modulierender Faktor nach einem oder mehre¬ ren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß er die knochen-resorbierende Aktivität differenzier¬ ter Osteoklasten inhibiert.
11. DNA oder RNA osteoinduktiver Retroviren oder eine damit hybridisierende Sequenz, die für eine osteoklasten-modu¬ lierenden Faktor kodiert oder diesen induziert.
12. Teilsequenz einer DNA oder RNA osteoinduktiver Retroviren oder eine damit hybridisierende Sequenz, die für einen osteoklasten-modulierenden Faktor kodiert oder diesen in¬ duziert.
13. DNA oder RNA nach einem der Ansprüche 11 oder 12 in einem Vektorsystem.
14. Verwendung osteoinduktiver Retroviren oder DNA oder RNA osteoinduktiver Retroviren oder damit hybridisierender DNA oder RNA oder TeilSequenzen hiervon zur Gewinnung eines osteoklasten-modulierenden Faktors aus Osteobla¬ stenzellen.
15. Verwendung der DNA oder RNA osteoinduktiver Retroviren oder damit hybridisierender DNA oder RNA oder Teilsequen¬ zen hiervon zur Herstellung eines Arzneimittels zur soma- tischen Gentherapie bei Mensch oder Tier.
16. Verwendung eines von osteoinduktiven Retroviren oder von DNA oder RNA osteoinduktiver Retroviren, Teilsequenzen hiervon oder damit hybridisierender Sequenzen induzierten oder produzierten osteoklasten-modulierenden Faktors zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von durch Knochenschwund charakterisierten Skelettveränderungen, insbesondere der Osteoporose, bei Mensch oder Tier.
17. Verwendung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als osteoinduktives Retrovirus das RFB Retrovirus, bevorzugt das RFB-14 Retrovirus, verwendet wird.
18. Verwendung eines osteoklasten-modulierenden Faktors nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Her¬ stellung eines Arzneimittels zur Inhibierung der knochen- resorbierenden Aktivität von Osteoklasten, insbesondere von differenzierten Osteoklasten.
19. Verwendung eines osteoklasten-modulierenden Faktors nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche zur Her¬ stellung eines Arzneimittels zur Inhibierung von Osteo- klasten-Vorlauferzellen aus dem hämatopoetisehen System.
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