WO1995009868A1 - Composes modifiant la transmission serotoninergique; applications diagnostiques et therapeutiques - Google Patents
Composes modifiant la transmission serotoninergique; applications diagnostiques et therapeutiques Download PDFInfo
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Definitions
- the subject of the present invention is compounds having the property of modifying serotonergic transmission as well as the diagnostic and therapeutic applications of these compounds.
- the cerebral serotonergic system is a cerebral and peripheral neurotransmission system, which uses the serotonin or 5-hydroxytryptamine (5-HT) discovered in the years 1949-50.
- this system is special in that it is extremely centralized
- the 5-HT system uses a wide variety of specific receptors.
- the 5-HT 1B and 5-HT 1D type receptors are located on the serotonergic and non-serotonergic terminations, where they modulate the release of the neurotransmitter contained in these terminations, in particular they can regulate the release of 5-HT itself. same (autoreceptors) and then play a decisive role in the activity of serotonergic neurotransmission.
- the serotonergic system is involved in numerous physiological functions and in many pathologies, and in particular in depressive syndrome.
- depression is a psychiatric disorder still poorly understood despite the very many studies that have been devoted to it.
- many of the antidepressant drugs interact with the serotonergic system, and the most recent, which are the most effective and have the least number of side effects, are most often of the "serotoninergic" type. .
- These substances all result, by various mechanisms, in facilitating serotoni ⁇ nergic transmission (monoamine oxidase inhibitors, reuptake inhibitors, 5-HT 1A agonists). But on the one hand, their effectiveness is limited, and on the other hand, many of them still have side effects. important, and finally, their time of action is important (> 2 weeks).
- the work of the inventors has made it possible to demonstrate an endogenous cerebral compound recognizing a receptor site capable of interacting with the functioning of certain 5-HT receptors, in particular the 5-HT 1B / 1D receptors which modulate the release. of 5-HT itself.
- the brain endogenous compound highlighted is a tetrapeptide of sequence:
- the inventors also tested the activity of peptides comprising a part of the LSAL sequence or the modified LSAL sequence and showed that these compounds still had good activity on the 5-HT 1B / 1D receptors.
- a modification for example an acetylation
- modifications from the COOH end make it possible to obtain a peptide which still exhibits significant activity.
- the addition of the Gly-Gly-Gly-Tyr sequence to the COOH end of the LSAL sequence makes it possible to obtain a compound having a still significant activity.
- the addition of the same sequence, but of which the Tyr residue is iodized results in a compound no longer having 5-HT receptor ligand activity, probably due to the steric hindrance due to the large size of the iodine atoms which prevents the binding of the peptide thus modified on its receptor.
- the subject of the invention is therefore a compound of peptide sequence
- X represents H or Ala or Leu-Ser-Ala
- Y represents OH
- the peptide linking group (-CO- NH-) is advantageously replaced by a linking group -CO-NR'-, -CR 1 R 2 -CR 3 R 4 -, -CO-CR ⁇ -, R x , R 2 , R 3 and R 4 , identical or different, representing H or an al yl group in in particular a methyl group, and R ' representing a C 1 -C 6 alkyl group.
- hydrocarbyloxy residue is understood to mean in particular an alkyloxy, alkenyloxy or alkynyloxy group, with a linear or branched chain, having from 1 to 10 carbon atoms unsubstituted or substituted by one or more groups chosen from OH, NH 2 , N0 2 , Cl, Br, F, CF 3 , for example the group 0CH 3 , 0C 2 H 5 , 0CH0H-CH 3 , 0CH0H-CH 2 0H, 0CH 2 CH 2 NH 2 , 0C 3 H 7 , etc ...
- the invention more particularly relates to a compound of the following peptide sequence:
- Z represents OH, NH 2 a substituted or unsubstituted hydrocarbyloxy residue, or a peptide sequence having from 1 to 10 amino acids, as well as the corresponding compounds in which the peptide bond is replaced by a bond resistant to degradation enzymatic proteases or in which the peptide backbone has one or more intercalated groups making the peptide bond resistant to enzymatic degradation.
- the nature of the amino acids of Z is indifferent, the limit being that when they are modified amino acids (not genetically coded), these are not substituted by a bulky group (having a size greater than that of radius of the iodine atom.
- the compounds according to the invention comprise in particular the peptides of the following sequence: Ala - Leu; Leu -Ser; Ala - Leu -Ser;
- Tyr as well as analogous compounds in which the peptide bond is replaced by a bond as defined above, or the backbone of which comprises an intercalated group as defined above.
- the most active compounds are those whose constituent amino acids are in the L form, that is to say the natural form for the peptide structures defined above.
- the compounds according to the invention are prepared by extraction from lyophilized brain as described below or more advantageously by conventional peptide synthesis, for example by the solid phase method of MERRIFIELD when they are exclusively peptide in nature, or again by modification of the terminal groups of the amino acids and condensation of the residues thus obtained, the reactive functions other than those engaged in the connection between the successive residues having been previously protected with the aid of the protective groups well known to those skilled in the art.
- the first residue of the COOH terminal whose amino function is protected by a terbutyloxycarbonyl group is fixed on a resin, by means of its carboxylic group.
- the second amino acid residue whose amino function is protected as above is coupled in dimethylformamide, thus fixing the one after the other amino acid residues which will constitute the portion of the peptide according to the invention.
- the amino function of the N-terminal residue can be acetylated by the action of an excess of acetic anhydride in the presence of diisopropylethylamine.
- the reactive side chains of amino acids can be protected for example by a benzyl group, for the hydroxyl side chains.
- the peptide according to the invention is released from the solid support, for example with hydrofluoric acid.
- the crude product is lyophilized and subjected to liquid pressure chromatography at medium pressure, making it possible to obtain a practically pure product; this is then characterized by high pressure liquid chromatography as well as by analysis of its amino acid composition and by mass spectrometry.
- the characterized peptides have the property of modifying serotonergic transmission by its interactions with autoreceptors (and also heteroreceptors) and play a key role in various psychiatric pathologies where the 5-HT system is notoriously involved (stress, anxiety, depression , compulsive obsessions, appetite disorders, sleep disorders, behavioral disorders, aggression, etc ).
- a subject of the invention is also a compound capable of fulfilling the role of ligand of the receptor on which the endogenous peptide of sequence Leu-Ser-Ala-Leu (LSAL) is fixed, characterized in that it comprises a group whose structure spatial is substantially identical to that of a peptide of sequence
- X and Y are as defined above, X and Y do not simultaneously represent H and OH, respectively.
- Such a compound can be an agonist or an antagonist of the LSAL peptide.
- substantially identical spatial structure is meant within the meaning of the present invention that the average position of the atoms forming the group which binds to the receptor differs by no more than 5%, and preferably by no more than 2% of the average position of the atoms forming the corresponding peptide.
- the compounds according to the invention are produced from the spatial structure (s) of the peptides according to the invention by computer modeling and conventional chemical synthesis from the structure obtained after modeling, as described in J. Med. Chem., Vol. 37, N ⁇ 9, pp. 1233 to 1251 and J. Med. Chem. , flight. 37, No. 10, pp. 1385-1401.
- these compounds are further developed by relying on the spatial structure of known antidepressant molecules active on this same site.
- the modeling technique makes it possible in particular to define and characterize the structure of molecules which do not affect the amine transport sites (unlike most of the antidepressants currently known) but which affect the only allosteric site carried by receptors 5- HT 1B / D.
- the subject of the invention is also a therapeutic composition comprising a compound as defined above, capable of crossing the blood-brain barrier.
- the peptide is preferably administered in the form of a prodrug, in particular of the glycosylphospho-triester type, in which the peptide is linked for example by leucine to the phosphate group, as described in J. MED. CHEM. 92, Vol. 35, p. 30-39.
- the therapeutic composition is advantageously used in pathologies in which the serotonergic system is involved, in particular in pathologies linked to a deficiency in serotonergic transmission.
- the composition according to the invention can be used in particular in the treatment of depression, but also in all the indications currently covered by antidepressants, such as obsessive-compulsive disorder, generalized anxiety, panic attack, disorders appetite, sleep, impulsivity, sexual disorders, aggressiveness, and more generally those of the compounds facilitating serotonergic transmission.
- composition according to the invention is advantageously in injectable or oral form, or in any other known pharmaceutical form.
- the effective therapeutic dose is easily determined by a person skilled in the art depending on the nature and severity of the pathology to be treated, as well as the weight and age of the patient.
- Compounds according to the invention is not toxic. They are added to a pharmaceutically acceptable vehicle or to an excipient well known to those skilled in the art.
- the invention also relates to a method of in vitro diagnosis of a condition linked to the serotonergic system in a patient, characterized in that an assay is carried out in a biological fluid of the patient of a peptide of sequence
- the assay is carried out in particular by an immunological method comprising bringing a biological sample in the presence of an antibody specifically directed against a peptide according to the invention and demonstrating the antigen-antibody complex thus formed.
- the biological fluid can be blood, urine or cerebrospinal fluid.
- the antibodies can be monoclonal or polyclonal and constitute, as well as their Fab, Fab ', F (ab') 2 and Fc fragments, another object of the invention.
- the antibodies are obtained by coupling a peptide according to the invention to an immunogenic carrier peptide or protein.
- the subject of the invention is also a diagnostic kit for assaying a peptide according to the invention in a body fluid of a patient in whom a pathology linked to a deficiency in serotonergic transmission is suspected, in particular masked depression, comprising at least one antibody as defined above and optionally the reagents for the dosage work.
- the peptides of the invention have been shown to be inactive at the 5-HT reuptake site.
- the discrimination between the reuptake effect and the effect on the 5-HT 1B / 1D site can be carried out by carrying out binding inhibition tests between on the one hand and increasing amounts of antidepressants. and the capture of 5-HT in synaptosomes, 5-HT being radiolabelled and on the other hand by carrying out tests of the same type on the 5-HT 1B / 1D receptor by varying the quantity of antidepressants in the presence of 'a radiolabel ligand specific for these receptors, and by determining the respective Ki or more generally the IC 50 .
- the choice of antidepressants having a selective activity on the 5-HT 1B / 1D site will be dictated by the substances having a high Ki or a low IC 50 in the reuptake test and conversely a low Ki or a high IC 50 in the binding inhibition assay at the 5-HT 1B / 1D receptor recognition peptide site.
- Radiolabel peptide tritium
- Another object of the invention also consists in a process for detecting ligands at the site of the 5-HT 1B / 1D receptor for the LSAL peptide, characterized in that the steps consisting in: - bringing into contact a molecule or a mixture containing different molecules, possibly not identified with a recombinant cell expressing on its surface the 5-HT 1B / 1D receptor in the presence of a compound according to the invention under conditions allowing interaction between the receptor 5-HT 1B / 1D and said (said) r molecule (s), in the case where it possess an affinity for the 5-HT 1B / 1D;
- This method can be used for the detection of agonists or antagonists of the LSAL peptide.
- Another subject of the invention relates to a method for detecting modulators (antagonists or agonists) of the site of the 5-HT 1B / 1D receptor for the LSAL peptide, characterized in that the steps consisting in: in contact with a molecule or a mixture containing different molecules, possibly unidentified, with a recombinant cell expressing on its surface the 5-HT 1B / 1D receptor in the presence of a compound according to the invention, under conditions allowing the interaction between the 5-HT 1B / 1D receptor and said compound according to the invention;
- Ligands obtained according to a method as described above can be used as active principle of a therapeutic composition useful in the treatment of psychiatric disorders such as depression, circulatory disorders such as migraine, or immunological disorders linked to 5-HT 1B receptors / 1D .
- the compounds according to the invention are also useful as diagnostic tools for labeling the 5-HT 1B / 1D receptors, and more particularly the site of binding of the endogenous peptide to these receptors.
- a diagnostic composition advantageously comprising a compound according to the radiolabel invention is used in an imaging technique using a positron emission tomography scanner.
- the isolation and characterization of the Leu-Ser-Ala-Leu peptide according to the invention will be described below, as well as the binding properties and the pharmacological activities on the 5-HT 1B / 1D receptors of the peptide.
- Leu-Ser-Ala-Leu with reference to the appended figures in which:
- FIG. 1 shows the binding interactions with [ 125 I] cyanopindolol.
- FIG. 1A represents the results obtained with cortical membranes of the rat brain (50 ⁇ g of proteins), incubated for 60 minutes at 37 ° C. in a total volume of 100 ⁇ l in the presence of [ 125 I] cyano-pindolol 0, 3 nM.
- the incubation was carried out in a 5 mM tris-HCl buffer, pH 7.5, containing 154 mM NaCl, 1 ⁇ M of pargyline, 30 ⁇ M of isoproterenol and various concentrations of the peptide (10 ⁇ 13 to 10 "8 Each point corresponds to an average plus or minus the standard deviation of five independent determinations.
- FIG. 1B represents the results obtained with membranes from NIH 3T3 cells, transfected with the 5-HT 1B receptor gene (50 ⁇ g of proteins), incubated for 60 minutes at 37 ° C. in the presence of [ 125 I] 0.3 nM cyanopindolol. The binding was measured as in Figure 1A.
- FIG. 1C shows the results obtained from the cortical membranes of the rat brain (50 - ⁇ g of protein) incubated for 60 minutes at 37 ° C in a total volume of 100 ⁇ l in the presence of increasing concentrations of [ 125 I] cyanopindolol (0 , 06 at 0.35 nM) with (0) or without ( ⁇ ), the peptide at 1 nM.
- Each point corresponds to the mean more or less the standard deviation of three independent determinations.
- Figure 1D shows the Scatchard curve of the saturation curves.
- FIG. 2 shows the results of the effects of LSAL on adenylylcyclase activity stimulated by forskolin.
- NIH 3T3 cell membranes expressing the mouse 5-HT 1B receptor gene were suspended and homogenized with a Dounce homogenizer in 50 mM tris-HCl buffer pH 7.4 containing 3 mMgCl 2 and EGTA at 0 , 2 mM (TME buffer).
- Adenylyl cyclase activities were measured in aliquots of 50 ⁇ l (30-50 ⁇ g of protein) of homogenates in a final volume of 100 ⁇ l containing 0.1 mM, [ ⁇ 32 P] ATP (l ⁇ Ci), 1 mM MgCl 2 , 50 ⁇ M GTP, 10 ⁇ M forskolin, 100 mM NaCl, 10 mM theophylline, 20 mM phosphocreatine, 0.2 mg / ml creatine kinase, 1 mM [ 3 H] cAMP ( ⁇ 15,000 cpm / test) and the substances to be studied.
- the membranes were incubated for 20 minutes at 30 ° C. The reaction was stopped by adding 200 ⁇ l of 5 mM ATP, 5 mM cAMP and 1% sodium dodecyl sulfate dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer.
- the [ 32 P] cAMP formed was isolated by the two-column chromatography method described by Salomon et al. (Adv. Cyclic Nucleotide Res., 10, 35-55 (1979)., Modified by De Vivo and Maayani (J. Pharmacol. Exp. Therap. 238, 248-253 (1986)).
- FIG. 2A expresses the effect of LSAL as a function of its concentration on the enzymatic activity stimulated by forskolin in the presence of 0.1 ⁇ M of 5-HT.
- FIG. 3 represents the effect of the peptide on the release of serotonin in synaptosomes of the hippocampus of rat brain. The results are expressed as percentages of the release of [ 3 H] 5-HT (P 2 / P 1 ratio) in the absence of peptide Each point is the mean plus or minus the standard deviation of triplicate determinations obtained using 3-6 homogenates of separate hippo ⁇ camps.
- an active compound was purified from extracts of rat, horse and bovine brains.
- the purification methodology used separations by gel permeation, normal or reversed phases or even ion exchanges.
- the characterization of the fractions obtained was carried out essentially on the basis of analysis by NMR, amino acid analysis and amino acid sequencing.
- the purified compound consisted of Leu-Ser-Ala-Leu.
- the synthetic peptide LSAL has been tested for its ability to "mimic” the effects of the purified fraction obtained from brain extracts.
- LSAL inhibits the binding of [ 3 H] -5-HT to 5-HT receptors j ⁇ with an IC 50 close to ÎO ' ⁇ M and a maximum inhibitory effect of 30 to 50% occurring at a concentration of 10 " 9 M
- the binding to 5-HT lnonA which under the experimental conditions used, mainly represents 5-HT 1B / 1D sites, is inhibited up to a maximum value of 75%, as shown in Table 2 below. below with an identical IC 50. This last observation indicates that the 5-HT 1B / 1D receptors are particularly sensitive to the peptide.
- the 5-HT 1 ⁇ receptors were not affected at a concentration of the peptide which strongly antagonized the binding to 5-HT • , 1B / 1D * Similarly, the binding of radioligands to the 5-HT 1E , 5-HT 1F , 5-HT 2 and 5-HT 3 receptors was not affected (Table 2), which indicates that among the serotonergic receptors studied , only class 5-HT 1B / 1D was sensitive to the peptide.
- the binding of other specific radio-ligands to receptors of various neurotransmitters has been examined: the ⁇ and ⁇ adrenergic, dopaminergic, muscarinic, histaminergic, opioid and benzodiazepine receptors. Binding to these receptors was not significantly reduced by LSAL at concentrations that had a maximum inhibitory effect for binding to 5-HT 1B / 1D receptors (Table 2).
- Brain membranes of rat brain (200 ⁇ g) were incubated for 30 minutes at 25 ° C with different specific radio-ligands (see Table) in the presence or absence of 1 nM of the peptide.
- the incubation medium consisted of 50 mM Tris-HCl pH 7.4 containing 120 mM NaCl and 50 mM KC1 ([ 3 H] spiroperidol, [ 3 H] quinuclidinyl benzylate, [ 3 H] naloxone, or 4 mM CaCl 2 and 4 mM MgCl 2 ([ 3 H] flu- nitrazepam), or 120 mM NaCl, 5 mM KC1, 2.5 mM CaCl 2 and 1 mM MgS0 4 ([ 3 H] prazosin), or 90 mM NaCl ([ 3 H] dihydroalprenolol).
- Each point corresponds to an average plus or minus the standard deviation of five independent determinations.
- the tetrapeptide identified did not show any other effect on the reuptake of 5-HT in the synaptosomal preparations. It also did not show any effect on the reuptake of other neurotransmitters (or their precursors), for example choline, GABA, histamine, dopamine and norepinephrine, this result indicates that the peptide is different from endogenous compounds previously suspected of interacting with amine transport.
- the peptide Ala - Leu is active in its L form (natural form) and shows almost no activity in its D form.
- the Ala - Leu and Leu - Ser fractions also showed great interaction specificity, since their binding inhibiting effect was only exerted on the 5-HT subtypes ! 5-HT receptors and more particularly on the 5-HT 1B / 1D subtype; under the experimental conditions used, they do not appear to affect the 5-HT 2 and 5-HT 3 receptors nor the ⁇ adrenergic, ⁇ adrenergic, dopaminergic, muscarinic, histaminergic, receptor receptors.
- Benzodiazepines and opioid receptors These peptides also lack the displacement activity of the marker for transport sites ( 3 H paroxetine) and are not inhibitors of 5-HT reuptake.
- the activity of the peptide Ala - Leu a in addition was measured in preliminary tests on the inhibitory function of 5-HT 1B / 1D receptors on the evoked release of acetylcholine.
- the 5-HT j B / D receptors are known to be mainly coupled to the Gi protein, by inhibiting the activity of adenylyl cyclase.
- the interaction of LSAL was examined on the enzymatic activity correlated with the stimulation of the 5-HT 1B receptor expressed in NIH 3T3 cells.
- the peptide had no effect on basal cAMP production.
- the activity of the peptide on the rat black substance homogenates was practically similar.
- Tests have been performed in vivo in mice to examine the behavioral effects of LSAL.
- LSAL The activity of LSAL was determined in the open field test on C57 / Black-6 mice. Male C57 / BL / 6 mice (20-25 g) were used. The open field consisted of a plastic box white (35 x 35 x 20 cr? divided into 25 equal squares. LSAL dissolved in 5.1 of 0.9% saline in a volume of 5 ⁇ l, this injected icv to the mice, which were placed at a corner of the box. After two minutes, the number of squares crossed, the U-turns made and the immobilization time were measured. The results are expressed as the mean plus or minus the standard deviation. : * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.005 (Student's Test). 26
- This experimental test is used to determine the degree of anxiety and consists of a raised labyrin ⁇ with two arms, one protected by walls and the other unprotected.
- the animal is supposed to be anxious when it avoids entry and reduces the time spent in open arms.
- mice Male BALB / C mice weighing 20-24 g were used.
- the raised cross labyrinth was made of plexiglass with open arms and two closed arms of the same size (12.5 x 5 cm) with 15 cm walls. height, these arms starting from a central platform of 5 x 5 cm, placed 40 cm above the ground.
- LSAL dissolved in 5 ml of 0.9% saline in a volume of 5 ⁇ l was injected icv into the mice. Three hours later, the animal was placed on the central platform of the labyrinth. Each entry into an arm and the time spent in each arm was recorded. The duration of the test was 5 minutes. The labyrinth was cleaned after each test.
- results were expressed as the mean plus or minus the standard deviation of the percentage of entries in the open arms (% of entries in the open arms), percentage of time spent in the open arms (% time in the open arm) and total number of entries in the arms. Difference with the control: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01 (Student's Test).
- test of forced swimming is a simple test which cannot in any case be compared to a model of "depression". However, it has the merit of discriminating a good number of antidepressant substances. However, it should be noted that some antidepressants are not active in this test and certain non-antidepressant substances are active in it.
- LSAL appears capable of inducing anxiety after administration in vivo.
- LSAL appears as an endogenous regulator, capable to finely modulate the control exerted by 5-HT on neurotransmission in the central nervous system. It probably plays a key role in physiological functions (sleep, thermoregulation, learning and memory, behavior, pain, ...), as well as in pathophysiological mechanisms (stress, anxiety, depression, aggression, eating disorders. , etc %) known or strongly suspected to involve the serotonergic system.
- 5-HT 1 (5-HT 1 -like (probably 5 HT 1D ) receptors) have been located in the vessels of human brain and into other smooth muscles. It undoubtedly also regulates the immune response insofar as the 5-HT 1B / 1D receptors are present in immuno-competent tissues, and insofar as the transmission of 5-HT is known to interact with the immune response.
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Abstract
L'invention a pour objet des composés de séquence peptidique suivante: X Leu Y, dans laquelle X représente H ou Ala ou Leu-Ser-Ala, Y représente OH ou une séquence peptidique ayant de 1 à 10 aminoacides, dont l'extrémité carboxy terminale est amidifiée par un groupe NH2 ou estérifiée par un reste hydrocarbyloxy substitué ou non substitué, sous réserve que X et Y ne représentent pas simultanément H et OH, respectivement, ainsi que les composés correspondant dans lesquels le groupe de liaison peptidique -CO-NH- est remplacé par une groupe de liaison résistant à la dégradation enzymatique des protéases, ou dans lesquels le squelette peptidique comporte un ou plusieurs groupes intercalés rendant la liaison peptidique résistante à la dégradation enzymatique, ainsi que les composés comprenant un groupement dont la structure spatiale est sensiblement identique à celle d'un peptide de séquence X-Leu-Y dans laquelle X et Y sont tels que définis ci-dessus.
Description
"Composés modifiant la transmission sérotoninerqique; applications diagnostiques et thérapeutiques"
La présente invention a pour objet des composés possédant la propriété de modifier la transmis¬ sion sérotoninergique ainsi que les applications diagnos¬ tiques et thérapeutiques de ces composés. Le système sérotoninergique cérébral est un système de neurotransmission cérébral et périphérique, qui met en oeuvre la sérotonine ou 5-hydroxytryptamine (5-HT) découverte dans les années 1949-50.
Au niveau central, ce système est particu- lier, dans la mesure où il est extrêmement centralisé
(tous les corps cellulaires sont localisés dans la région postérieure du cerveau, le raphé) et où il se projette dans pratiquement toutes les régions du cerveau. Il est caractérisé par un nombre extrêmement élevé de varicosi- tés (ou équivalent de terminaisons neuronales) le long des axones ; cette disposition multiplie ses points d'interactions avec les autres systèmes neuronaux cérébraux. De plus, une très grande partie de ces varicosités ne présente pas de profil synaptique, c'est- à-dire que la 5-HT libérée par ces "terminaisons" va diffuser et atteindre les cibles (récepteurs) situées à une certaine distance ; ce mécanisme nécessite la mise en oeuvre de récepteurs particuliers possédant une affinité élevée pour l'aminé. Cette disposition structu- raie est tout à fait favorable à une fonction de contrôle de l'ensemble des cellules neuronales du cerveau, et par là à un rôle essentiel dans le maintien de 1'homéostasie du système nerveux central.
Pour exercer ce contrôle, le système 5-HT met en oeuvre une grande variété de récepteurs spécifiques.
Il s'agit en effet de plusieurs familles dont certaines sont bien caractérisées (5-HT^ 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4) et d'autres mises en évidence plus récemment sont encore peu
connues (5-HT5, 5-HT6, 5-HT7). Certaines d'entre elles sont représentées par de nombreux sous-types ; c'est le cas en particulier de la famille 5-HTj, caractérisée par une affinité nanomolaire de la 5-HT pour ces sites, et qui comporte les sous-types 5-HT1A B D E F
Les récepteurs de type 5-HT1B et 5-HT1D sont localisés sur les terminaisons sérotoninergiques et non- sérotoninergiques, où ils modulent la libération du neurotransmetteur contenu dans ces terminaisons, en particulier ils peuvent réguler la libération de la 5-HT elle-même (autorécepteurs) et jouer alors un rôle déterminant dans l'activité de la neurotransmission sérotoninergique.
D'un point de vue fondamental, le système sérotoninergique est impliqué dans de très nombreuses fonctions physiologiques et dans de nombreuses patholo- gies, et notamment dans le syndrome dépressif.
La dépression est un désordre psychiatrique encore mal connu malgré les très nombreuses études qui lui ont été consacrées. Cependant, il est maintenant assez clair qu'une très grande partie sinon la totalité des dépressions implique le système sérotoninergique et notamment, il est généralement accepté qu'il existe une relation entre un déficit sérotoninergique et le suicide. En outre, les médicaments antidépresseurs interagissent pour un grand nombre d'entre eux avec le système sérotoninergique et les plus récents, qui sont les plus efficaces et qui possèdent le moins d'effets indésirables, sont le plus souvent de type "sérotoniner- gique". Ces substances aboutissent toutes, par des mécanismes divers, à faciliter la transmission sérotoni¬ nergique (inhibiteurs de monoamine oxydases, inhibiteurs de recapture, agonistes 5-HT1A). Mais d'une part, leur efficacité est limitée, et d'autre part, ils possèdent encore pour nombre d'entre eux des effets secondaires
importants, et enfin, leur délai d'action est important ( > 2 semaines) .
Les résultats récents de la littérature et des inventeurs indiquent que les récepteurs 5-HT1B/1D pr rraient jouer un rôle important dans le syndrome dépressif et dans le mécanisme d'action des antidépres¬ seurs. Il a en effet été montré que non seulement ils modulent la libération d'acétylcholine, mais ils modulent aussi celle de la 5-HT elle-même, et par là même régulent de façon efficace la transmission sérotoninergique dont on sait l'importance dans le syndrome dépressif. De plus, ils sont la cible des antidépresseurs qui interagissent de façon vraisemblablement non compétitive ; autrement dit, les antidépresseurs reconnaîtraient un site distinct des récepteurs 5-HT1B/1D, mais étroitement interactif avec ces derniers.
Les travaux des inventeurs ont permis la mise en évidence d'un composé endogène cérébral reconnaissant un site récepteur capable d'interagir avec le fonction- nement de certains récepteurs 5-HT, en particulier les récepteurs 5-HT1B/1D qui modulent la libération de la 5-HT elle-même.
Le composé endogène cérébral mis en évidence est un tétrapeptide de séquence :
Leu - Ser - Ala - Leu (séquence LSAL).
Les inventeurs ont également testé 1'activité de peptides comprenant une partie de la séquence LSAL ou la séquence LSAL modifiée et montré que ces composés avaient encore une bonne activité sur les récepteurs 5-HT1B/1D. De manière générale, une modification (par exemple une acetylation) de l'extrémité NH2 terminale aboutit à un composé ayant une moins bonne activité de ligand sur le récepteur 5-HT, alors que des modifications
de l'extrémité COOH permettent d'obtenir un peptide qui présente encore une activité importante.
Par exemple, l'adjonction de la séquence Gly- Gly-Gly-Tyr à l'extrémité COOH de la séquence LSAL permet d'obtenir un composé ayant une activité encore importan¬ te. Cependant, l'adjonction de la même séquence, mais dont le résidu Tyr est iodé aboutit à un composé n'ayant plus d'activité de ligand du récepteur 5-HT, probablement en raison de l'encombrement stérique dû à la taille importante des atomes d'iode qui empêche la liaison du peptide ainsi modifié sur son récepteur.
L'invention a ainsi pour objet un composé de séquence peptidique
X Leu Y
dans laquelle X représente H ou Ala ou Leu-Ser-Ala, Y représente OH, ou une séquence peptidique ayant de 1 à 10 aminoacides, dont l'extrémité carboxy terminale est amidifiée par un groupe NH2 ou estérifiée par un reste hydroxycarbyloxy substitué ou non substitué, sous réserve que X et Y ne représentent pas simultanément H et OH, respectivement ainsi que les composés correspondants dans lesquels le groupe de liaison peptidique -CO-NH- est remplacé par un groupe de liaison résistant à la dégradation enzymatique des protéases, ou dans lesquels le squelette peptidique comporte un ou plusieurs groupes intercalés rendant la liaison peptidique résistante à la dégradation enzymati- que.
Ainsi, le groupe de liaison peptidique (-CO- NH-) est avantageusement remplacé par un groupe de liaison -CO-NR'-, -CR1R2-CR3R4-, -CO-CR^-, Rx, R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentant H ou un groupe al yle en
notamment un groupe méthyle, et R'
représentant un groupe alkyle en C^Cg.
Parmi les groupes pouvant être intercalés dans le squelette peptidique, on peut citer les groupes suivants -CRXR2-, -NR-^- et -0-, Rλ et R2 étant définis comme précédemment.
Par reste hydrocarbyloxy, on entend notamment un groupe alkyloxy, alcènyloxy ou alcynyloxy, à chaîne linéaire ou ramifiée, ayant de 1 à 10 atomes de carbone non substitué ou substitué par un ou plusieurs groupes choisis parmi OH, NH2, N02, Cl, Br, F, CF3, par exemple le groupe 0CH3, 0C2H5, 0CH0H-CH3, 0CH0H-CH20H, 0CH2CH2NH2, 0C3H7, etc...
L'invention a plus particulièrement pour objet un composé de séquence peptidique suivante :
Leu - Ser Ala - Leu - Z
dans laquelle Z représente OH, NH2 un reste hydrocarby¬ loxy substitué ou non substitué, ou une séquence peptidi- que ayant de 1 à 10 aminoacides, ainsi que les composés correspondants dans lesquels la liaison peptidique est remplacée par une liaison résistante à la dégradation enzymatique des proteases ou dans lesquels le squelette peptidique comporte un ou plusieurs groupes intercalés rendant la liaison peptidique résistante à la dégradation enzymatique.
La nature des aminoacides de Z est indiffé¬ rente, la limite étant que lorsqu'il s'agit d'aminoacides modifiés (non codés génétiquement), ceux-ci ne soient pas substitués par un groupe encombrant (ayant une taille supérieure à celle du rayon de l'atome d'iode.
Les composés selon 1'invention comprennent notamment les peptides de séquence suivante : Ala - Leu; Leu -Ser;
Ala - Leu -Ser;
Leu - Ser - Ala - Leu;
Leu - Ser - Ala - Leu - OCH 3'
Leu - Ser - Ala - Leu - NH2; Leu - Ser - Ala - Leu - Gly - Gly - Gly -
Tyr; ainsi que les composés analogues dans lesquels la liaison peptidique est remplacée par une liaison telle que définie ci-dessus, ou dont le squelette comprend un groupe intercalé tel que défini ci-dessus.
Les composés les plus actifs sont ceux dont les aminoacides constitutifs sont sous la forme L, c'est- à-dire la forme naturelle pour les structures peptidiques définies ci-dessus. Les composés selon l'invention sont préparés par extraction à partir de cerveau lyophilisé comme décrit ci-après ou plus avantageusement par synthèse peptidique classique, par exemple par la méthode en phase solide de MERRIFIELD lorsqu'ils sont de nature exclusive- ment peptidique, ou encore par modification des groupes terminaux des aminoacides et condensation des résidus ainsi obtenus, les fonctions réactives autres que celles engagées dans la liaison entre les résidus successifs ayant été préalablement protégées à 1'aide des groupes protecteurs bien connus de l'homme du métier.
Selon un exemple de préparation d'un peptide selon l'invention, on fixe sur une résine, par l'intermé¬ diaire de son groupe carboxylique, le premier résidu de 1'extrémité COOH terminale dont la fonction aminé est protégée par un groupe terbutyloxycarbonyle, puis, après avoir déprotégé la fonction aminé en lavant la résine avec de 1'acide trifluoroacétique dans du dichlorométha- ne, on couple dans le diméthylformamide le second résidu d'acide aminé dont la fonction amino est protégée comme précédemment, on fixe ainsi les uns après les autres les
résidus aminoacides qui vont constituer la portion du peptide selon l'invention. Après déprotection, la fonction aminé du résidu N-terminal peut être acétylée par action d'un excès d'anhydride acétique en présence de diisopropyléthylamine.
Les chaînes latérales réactives des aminoa¬ cides peuvent être protégées par exemple par un groupe benzyle, pour les chaînes latérales hydroxyles.
Après avoir éliminé le groupe protecteur,le peptide selon l'invention est libéré du support solide, par exemple avec de l'acide fluorhydrique. Le produit brut est lyophilisé et soumis à une chromatographie en phase liquide à moyenne pression, permettant d'obtenir un produit pratiquement pur ; celui-ci est alors caracté- risé par chromatographie en phase liquide à haute pression ainsi que par 1'analyse de sa composition en aminoacides et par spectrométrie de masse.
Les peptides caractérisés possèdent la propriété de modifier la transmission sérotoninergique par ses interac ions avec les autorécepteurs (et aussi les hétérorécepteurs) et jouent un rôle clef dans diverses pathologies psychiatriques où le système 5-HT est notoirement mis en jeu (stress, anxiété, dépression, obsessions compulsives, troubles de l'appétit, du sommeil, troubles du comportement, agressivité, etc...).
L'invention a également pour objet un composé apte à remplir le rôle de ligand du récepteur sur lequel se fixe le peptide endogène de séquence Leu-Ser-Ala-Leu (LSAL), caractérisé en ce qu'il comprend un groupement dont la structure spatiale est sensiblement identique à celle d'un peptide de séquence
X - Leu - Y
dans laquelle X et Y sont tels que définis précédemment,
X et Y ne représentant pas simultanément H et OH, respectivement.
Un tel composé peut être un agoniste ou un antagoniste du peptide LSAL. Par structure "spatiale sensiblement identi¬ que" , on entend au sens de la présente invention que la position moyenne des atomes formant le groupement qui se lie au récepteur ne diffère qu'au plus de 5 %, et de préférence au plus de 2 % de la position moyenne des atomes formant le peptide correspondant.
Parmi les composés préférés, on peut citer ceux comprenant un groupement dont la structure spatiale est sensiblement identique aux di-, tri- et tétrapeptides suivants : Ala-Leu
Leu-Ser
Ala-Leu-Ser
Leu-Ser-Ala-Leu.
Les composés selon 1'invention sont élaborés à partir de(s) la (les) structure(s) spatiale(s) des peptides selon 1'invention par modélisation informatique et synthèse chimique classique à partir de la structure obtenue après modélisation, comme décrit dans J. Med. Chem., vol. 37, Nβ 9, pp. 1233 à 1251 et J. Med. Chem. , vol. 37, N° 10, pp. 1385-1401.
Avantageusement, ces composés sont élaborés en outre en s'appuyant sur la structure spatiale de molécules d'antidépresseur connues actives sur ce même site. La technique par modélisation permet notam¬ ment de définir et caractériser la structure de molécules n'affectant pas les sites de transport des aminés (à la différence de la plupart des antidépresseurs connus actuellement) mais affectant le seul site allosterique porté par les récepteurs 5-HT1B/D.
L'invention a également pour objet une composition thérapeutique comprenant un composé tel que défini ci-dessus, capable de traverser la barrière hématoencéphalique. Pour traverser la barrière hématoencéphali¬ que, le peptide est de préférence administré sous la forme d'une pro-drogue, notamment de type glycosyl- phospho-triester, dans laquelle le peptide est lié par exemple par la leucine au groupe phosphate, comme décrit dans J. MED. CHEM. 92, Vol. 35, p. 30-39.
Une telle pro-drogue, ainsi que de manière générale une molécule précurseur susceptible de libérer in vivo un composé selon l'invention, consitue un autre objet de l'invention. La composition thérapeutique est utilisée avantageusement dans des pathologies dans lesquelles est impliqué le système sérotoninergique, notamment dans les pathologies liées à une déficience de la transmission sérotoninergique. Ainsi, la composition selon l'invention peut être utilisée en particulier dans le traitement de la dépression, mais également dans toutes les indications actuellement couvertes par les antidépresseurs, comme les troubles obsessionnels compulsifs, l'anxiété généralisée, la crise de panique, les troubles de l'appétit, du sommeil, l'impulsivité, les troubles sexuels, l'agressi¬ vité, et plus généralement celles des composés facilitant la transmission sérotoninergique.
La composition selon 1'invention se présente avantageusement sous forme injectable ou orale, ou sous toute autre forme pharmaceutique connue.
La dose thérapeutique efficace est aisément déterminée par 1'homme du métier en fonction de la nature et de la gravité de la pathologie à traiter, ainsi que du poids et.de l'âge du patient. Les composés selon
l'invention ne sont pas toxiques. Ils sont ajoutés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable ou à un excipient bien connu de l'homme du métier.
L'invention a également pour objet un procédé de diagnostic in vitro d'une affection liée au système sérotoninergique chez un patient, caractérisé en ce que l'on effectue un dosage dans un fluide biologique du patient d'un peptide de séquence
Leu - Ser - Ala - Leu
Le dosage est effectué notamment par une méthode immunologique comprenant la mise en présence d'un prélèvement biologique avec un anticorps spécifiquement dirigé contre un peptide selon l'invention et la mise en évidence du complexe antigène-anticorps ainsi formé.
Ces procédés peuvent être basés sur une méthode radioimmunologique de type RIA, RIPA ou IRMA, ou sur une méthode immunoenzymatique, par* exemple de type ELISA.
Le fluide biologique peut être le sang, l'urine ou le liquide céphalo-rachidien.
Les anticorps peuvent être monoclonaux ou polyclonaux et constituent, ainsi que leurs fragments Fab, Fab', F(ab' )2 et Fc, un autre objet de l'invention.
Les anticorps sont obtenus par couplage d'un peptide selon 1'invention sur un peptide ou une protéine porteurs immunogènes.
L'invention a également pour objet un kit de diagnostic pour le dosage d'un peptide selon 1'invention dans un fluide corporel d'un patient chez lequel on suspecte une pathologie liée à une déficience de la transmission sérotoninergique, notamment une dépression masquée, comprenant au moins un anticorps tel que défini ci-dessus et éventuellement les réactifs pour la mise en
oeuvre du dosage.
Les peptides de 1'invention se sont révélés inactifs sur le site de recapture de la 5-HT.
L'existence d'un facteur endogène cérébral non actif sur le site de recapture constitue un standard de référence en terme d'activité et permet ainsi d'envi¬ sager un procédé de sélection de substances antidépres¬ sives, consistant à discriminer entre l'effet de recap¬ ture et l'effet d'interaction sur le site 5-HT1B/1D. Ce procédé s'applique aux antidépresseurs connus et permet également la mise au point de médica¬ ments nouveaux.
En pratique, la discrimination entre l'effet de recapture et l'effet sur le site 5-HT1B/1D peut être effec uée en réalisant des essais d'inhibition de liaison entr d'une part des quantités croissantes d'antidépres¬ seurs et la capture de la 5-HT dans les synaptosomes, la 5-HT étant radiomarquée et d'autre part en réalisant des essais de même type sur le récepteur 5-HT1B/1D en faisant varier la quantité d'antidépresseurs en présence d'un ligand radiomarque spécifique de ces récepteurs, et en déterminant les Ki respectifs ou de façon plus générale les CI50.
Le choix d'antidépresseurs ayant une activité sélective sur le site 5-HT1B/1D sera dicté par les substan¬ ces présentant un Ki élevé ou une CI50 faible dans l'essai de recapture et inversement un Ki faible ou une CI50 élevée dans l'essai d'inhibition de liaison sur le site de reconnaissance du peptide du récepteur 5-HT1B/1D. On peut également et plus aisément utiliser le peptide radiomarque (tritium) pour identifier et caractériser le site spécifique de reconnaissance du peptide, et ainsi directement étudier les capacités de diverses substances à déplacer (compétition) ce peptide en mesurant leur Ki et en comparant ce dernier aux valeurs de Ki obtenues
pour ces mêmes substances pour inhiber la capture de la 5-HT (ou déplacer un inhibiteur de recapture (3H paroxe- tine par exemple).
Un autre objet de l'invention consiste également en un procédé de mise en évidence de ligands du site du récepteur 5-HT1B/lD pour le peptide LSAL, caractérisé en ce que l'on effectue les étapes consistant à : - mettre en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées avec une cellule recombinée exprimant à sa surface le récepteur 5-HT1B/1D en présence d'un composé selon 1'invention dans des conditions permettant 1'inte- raction entre le récepteur 5-HT1B/1D et ladite (lesdites) r molécule(s), dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour le récepteur 5-HT1B/1D;
- détecter la quantité dudit composé selon l'invention liée au récepteur; - en déduire la fixation éventuelle de ladite
(desdites) molécule(s) .
Ce procédé peut être utilisé pour la mise en évidence d'agonistes ou d'antagonistes du peptide LSAL.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de mise en évidence de modulateurs (antagonistes ou agonistes)du site du récepteur 5-HT1B/1D pour le peptide LSAL caractérisé en ce que l'on effectue les étapes consistant à : - mettre en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées, avec une cellule recombinée exprimant à sa surface le récepteur 5-HT1B/1D en présence d'un composé selon l'invention, dans des conditions permettant l'interaction entre le récepteur 5-HT1B/1D et ledit composé
selon l'invention;
- détecter les molécules capables de mimer ou d'antagoniser l'activité du composé selon l'invention sur ledit récepteur. Des ligands obtenus selon un procédé tel que décrit ci-dessus peuvent être utilisés comme principe actif d'une composition thérapeutique utile dans le traitement de troubles psychiatriques tels que la dépression, circulatoires tels que la migraine, ou immunologiques liés aux récepteurs 5-HT1B/1D.
Les composés selon 1'invention sont également utiles comme outils de diagnostic pour marquer les récepteurs 5-HT1B/1D, et plus particulièrement le site de liaison du peptide endogène sur ces récepteurs. A cette fin, on utilise avantageusement une composition de diagnostic comprenant un composé selon 1'invention radiomarque dans une technique d'imagerie mettant en oeuvre un scanner de tomographie par émission de positons. On décrira ci-après l'isolement et la caractérisation du peptide Leu-Ser-Ala-Leu selon 1'inven¬ tion, ainsi que les propriétés de liaison et les activi¬ tés pharmacologiques sur les récepteurs 5-HT1B/1D du peptide Leu-Ser-Ala-Leu en se reportant aux figures annexées sur lesquelles :
- La Figure 1 représente les interactions de liaison avec le [125I]cyanopindolol.
La liaison du [125I]cyanopindolol a été mesurée comme décrit dans HOYER D. et al. , Eur. J. Pharmacol. 118, 1-12 (1985).
- La Figure 1A représente les résultats obtenus avec des membranes corticales de cerveau de rat (50 μg de protéines), incubées pendant 60 minutes à 37°C dans un volume total de 100 μl en présence de [125I]cyano- pindolol 0,3 nM.
L'incubation a été effectuée dans un tampon tris-HCl 5 mM, pH 7,5, contenant 154 mM NaCl, 1 μM de pargyline, 30 μM d' isoprotérénol et différentes concen¬ trations du peptide ( 10~13 à 10"8 M). Chaque point corres- pond à une moyenne plus ou moins 1'écart type de cinq déterminations indépendantes.
- La Figure 1B représente les résultats obtenus avec des membranes de cellules NIH 3T3, trans- fectées avec le gène du récepteur 5-HT1B ( 50 μg de protéines), incubées pendant 60 minutes à 37°C en présence de [125I]cyanopindolol 0,3 nM. La liaison a été mesurée comme pour la Figure 1A.
- La Figure 1C représente les résultats obtenus des membranes corticales de cerveau de rat ( 50 - μg de protéines) incubées pendant 60 minutes à 37°C dans un volume total de 100 μl en présence de concentrations croissantes de [125I]cyanopindolol (0,06 à 0,35 nM) avec (0) ou sans (§), le peptide à 1 nM. Chaque point corres¬ pond à la moyenne plus ou moins l'écart type de trois déterminations indépendantes.
La Figure 1D représente la courbe de Scatchard des courbes de saturation.
- La Figure 2 représente les résultats des effets de LSAL sur 1'activité adénylylcyclase stimulée par la forskoline.
Des membranes de cellules NIH 3T3 exprimant le gène du récepteur 5-HT1B de souris ont été mises en suspension et homogénéisées avec un homogénisateur Dounce dans un tampon tris-HCl 50 mM pH 7,4 contenant MgCl2 à 3 mM et EGTA à 0,2 mM (tampon TME) .
Les activités adénylyl cyclase ont été mesurées dans des fractions aliquotes de 50 μl (30-50 μg de protéines) d'homogénéisâts dans un volume final de 100 μl contenant 0,1 mM, [α32P]ATP (lμCi), 1 mM MgCl2, 50 μM GTP, 10 μM forskoline, 100 mM NaCl, 10 mM théophylline,
20 mM phosphocréatinine, 0,2 mg/ml créatine kinase, 1 mM [3H]AMPc (≈ 15 000 cpm/essai) et les substances à étudier.
Les membranes ont été incubées pendant 20 minutes à 30°C. La réaction a été arrêtée par addition de 200 μl d'ATP à 5 mM, 5 mM d'AMPc et du dodécyl sulfate de sodium à 1% dissous dans 50 mM de tampon Tris-HCl.
Le [32P]AMPc formé a été isolé par la méthode de chromatographie à deux colonnes décrite par Salomon et al. (Adv. Cyclic Nucleotide Res., 10, 35-55 (1979)., modifié par De Vivo et Maayani (J. Pharmacol. Exp. Therap. 238, 248-253 (1986)).
- La Figure 2A exprime l'effet de LSAL en fonction de sa concentration sur 1'activité enzymatique stimulée par la forskoline en présence de 0,1 μM de 5-HT.
- - La Figure 2B exprime la courbe dose-réponse de l'effet de 5-HT sur l'activité enzymatique stimulée par la forskoline en l'absence (• •), ou en présence
(0 0) de LSAL (ÎO"9 M). - La Figure 3 représente l'effet du peptide sur la libération de sérotonine dans des synaptosomes de l'hippocampe de cerveau de rat. Les résultats sont exprimés en pourcentages de la libération de [3H]5-HT (rapport P2/P1)en l'absence de peptide. Chaque point est la moyenne plus ou moins l'écart type de déterminations en triple obtenue à l'aide de 3-6 homogénéisats d'hippo¬ campe distincts.
La méthode mise en oeuvre est la méthode dé¬ crite précédemment (BOLANOS-JIMENEZ B. et al., Eur. J. Pharmacol. 242, 1-6 (1993)) avec les modifications suivantes : la [3H]acétylcholine était substituée par 60 nM [3H]5-HT et 0,01% d'acide ascorbique était ajouté au milieu d'incubation.
1. Isolement et purification du peptide Leu- Ser-Ala-Leu
En utilisant comme critère de discrimination la capacité d'un facteur potentiel à interagir avec la reconnaissance de la 5-HT par le récepteur 5-HT1B/1D de membranes de synaptosomes de cerveau de rat, comme décrit dans FR-2 657 784, un composé actif a été purifié à partir d'extraits de cerveaux de rat, de cheval et de bovin. La méthodologie de purification a fait appel à des séparations par perméation sur gel, des phases normales ou inversées ou encore des échanges ioniques.
Elle est résumée sur le tableau ci-dessous
17
Etapes de purification du peptide endogène
La caracterisation des fractions obtenues a été réalisée essentiellement sur la base d'analyse par
RMN, d'analyse d'aminoacides et de séquençage d'aminoa¬ cides. Le composé purifié consistait en Leu-Ser-Ala-Leu.
La même fraction a été obtenue également à partir de cerveau de cheval et de bovin, ce qui signifie que ce peptide est conservé chez les mammifères.
2. Interactions du peptide purifié avec les récepteurs 5-HT1B lr
Le peptide synthétique LSAL a été testé pour sa capacité à "mimer" les effets de la fraction purifiée obtenue à partir d'extraits de cerveau. LSAL inhibe la liaison de [3H]-5-HT aux récepteurs 5-HTj^ avec une CI 50 proche de ÎO'^M et un effet inhibiteur maximum de 30 à 50% se produisant à une concentration de 10"9M. La liaison aux 5-HTlnonA, qui dans les conditions expérimen¬ tales mises en oeuvre, représente principalement des sites 5-HT1B/1D, est inhibée jusqu'à une valeur maximale de 75%, comme représenté au tableau 2 ci-dessous avec une CI50 identique. Cette dernière observation indique que les récepteurs 5-HT1B/1D sont particulièrement sensibles au peptide. C'est pourquoi des essais ont été réalisés sur des homogénéisats de tissu cérébral de rat dans lesquels les récepteurs 5-HT1B étaient marqués spécifiquement avec du [1Z5I] cyanopindolol, 1'interaction correspondait à une CI50 de 10_11M et un effet maximum de 60%d'inhibition, comme représenté à la Figure 1A.
En outre, l'activité de ce peptide sur les récepteurs 5-HTlD a été démontrée chez le cobaye et sur le cerveau humain à l'aide de [3H]5-HT. La valeur de la CI50 était à nouveau de 10_11M. Ces résultats suggèrent fortement que in vitro, les récepteurs 5-HT1B/1D consti¬ tuent la cible du peptide LSAL.
L'activité du peptide a également été évaluée sur la liaison aux récepteurs 5-HT1B dans des cellules NIH 3T3 transfectées avec le gène du récepteur 5-HT1B de la souris. L'effet inhibiteur du peptide était très similaire à celui observé dans les homogénéisats de tissu cérébral (Figure 1B).
L'effet maximum correspondait à 70% d'inhibi¬ tion de la liaison spécifique du [125I] cyanopindolol avec une valeur de la CI50 de 10"UM. Ce résultat démontre clairement que LSAL interagit directement avec les récepteurs 5-HT1B.
Pour étudier plus loin le type d'interaction du tétrapeptide avec les récepteurs 5-HT1B/1D, des courbes de saturation du ligand radiomarque ont été établies en présence du peptide. Les résultats de liaison obtenus suggèrent que l'activité inhibitrice du peptide corres¬ pond à une interaction non compétitive (Figures 1C, 1D). Ce résultat a été observé avec la [3H]5-HT, aussi bien qu'avec le [125I]cyanopindolol pour marquer les récepteurs 5-HT1B et est en accord avec l'hypothèse précédente de l'existence d'un site spécifique pour le peptide distinct mais étroitement apparenté au site de liaison de 5-HT. La spécificité pharmacologique des fractions partiellement purifiées a été étudiée au cours d'une purification ultérieure en utilisant des homogénéisats de cerveau de rat. Les essais ont été effectués en utilisant le LSAL synthétique pour déterminer si le peptide interagissait ou non avec d'autres récepteurs 5- HT, ou ceux d'autres neuro-transmetteurs.
Les récepteurs 5-HT 1Λ n'étaient pas affectés à une concentration du peptide qui antagonisait fortement la liaison au 5-HT •,1B/1D*
De manière analogue, la liaison de radio- ligands aux récepteurs 5-HT1E, 5-HT1F, 5-HT2 et 5-HT3 n'était pas affectée (Tableau 2), ce qui indique que parmi les récepteurs sérotoninergiques étudiés, seule la classe 5-HT1B/1D était sensible au peptide. La liaison d'autres radio-ligands spécifiques à des récepteurs de neurotransmetteurs variés a été examinée : les récepteurs α et β adrénergiques, dopaminergiques, muscariniques, histaminergiques, aux opiacées et aux benzodiazépines. La liaison à ces récepteurs n'était pas significativement réduite par LSAL à des concentrations qui avaient un effet inhibiteur maximum pour la liaison aux récepteurs 5-HT1B/1D (Tableau 2).
Tableau 2
Effet inhibiteur du peptide sur différentes liaisons de radioligands dans des tissus de cerveau de rat
Des membranes cérébrales de cerveau de rat (200 μg) ont été incubées pendant 30 minutes à 25°C avec différents radio-ligands spécifiques (voir Tableau) en présence ou en absence de 1 nM du peptide.
Les différentes conditions de liaisons utilisées pour les récepteurs sérotoninergiques sont celles décrites précédemment (PALACIOS J.M. et al., Methods in Neurosciences 12, 238-262 (1993)). Pour les autres liaisons, le milieu d'incubation consistait en 50 mM Tris-HCl pH 7,4 contenant 120 mM de NaCl et 50 mM de KC1 ( [3H]spiropéridol, [3H] benzylate de quinuclidinyle, [3H]naloxone, ou 4 mM de CaCl2 et 4 mM de MgCl2 ([3H]flu- nitrazépam), ou 120 mM de NaCl, 5 mM de KC1, 2,5 mM de CaCl2 et 1 mM de MgS04 ( [3H]prazosin) , ou 90 mM de NaCl ( [3H]dihydroalprénolol) .
Chaque point correspond à une moyenne plus ou moins 1'écart type de cinq déterminations indépendantes.
Le tétrapeptide identifié n'a pas montré d'autre effet sur la recapture de 5-HT dans les prépara¬ tions synaptosomales. Il n'a pas non plus montré d'effet sur la recapture d'autres neurotransmetteurs (ou leurs précurseurs), par exemple la choline, le GABA, l'histami- ne, la dopamine et la noradrénaline, ce résultat indique que le peptide est différent des composés endogènes suspectés antérieurement d'interagir avec le transport des aminés.
La liaison de la [3H]5-HT ou de [125I]cyano- pindolol sur les récepteurs de type 5-HT1B/1D est également inhibée par les peptides suivants avec les CI50 corres¬ pondantes :
M
Le peptide Ala - Leu est actif dans sa forme L (forme naturelle) et ne présente quasiment pas d'activité dans sa forme D.
Les fractions Ala - Leu et Leu - Ser ont également montré une grande spécificité d'interaction, puisque leur effet inhibiteur de liaison ne s'exerçait que sur les sous-types 5-HT! des récepteurs 5-HT et plus particulièrement sur le sous-type 5-HT1B/1D ; dans les conditions expérimentales utilisées, elles n'apparais¬ saient pas affecter les récepteurs 5-HT2 et 5-HT3 ni les récepteurs α adrénergiques, β adrénergiques, dopaminergi- ques, muscariniques, histaminergiques, récepteurs aux
" benzodiazépines et récepteurs aux opiacés. Ces peptides sont également dépourvus d'activité de déplacement du marqueur des sites de transport (3H paroxetine) et ne sont pas inhibiteurs de recapture de la 5-HT. L'activité du peptide Ala - Leu a en outre été mesurée dans des essais préliminaires sur la fonction inhibitrice des récepteurs 5-HT1B/1D sur la libération évoquée d'acétylcholine.
En accord avec les résultats des études de liaison indiquant une interaction avec les récepteurs 5- HT1B/1D, il a été montré que le peptide LSAL antagonisait l'activité modulatrice des réc oteurs 5-HT1B/1D à très faible concentration et potentialisait au contraire l'effet d'un agoniste 5-HT1B à concentration plus élevée. L'ensemble de ces résultats suggère que ce peptide pourrait jojer le rôle d'un modulateur allosterique du récepteur 5-HT1B/1D.
3) Interaction de LSAL avec l'activité fonctionnelle des récepteurs 5-HT1B (système de transduc- tion)
Les récepteurs 5-HTj B/D sont connus pour être majoritairement couplés à la protéine Gi, en inhibant l'activité de l'adénylyl cyclase. L'interaction de LSAL a été examinée sur 1'activité enzymatique corrélée à la stimulation du récepteur 5-HT1B exprimée dans des cellu¬ les NIH 3T3. Le peptide n'avait pas d'effet sur la production basale d'AMPc. Toutefois, il augmentait significativement l'effet inhibiteur de la 5-HT sur l'activité adénylyl cyclase stimulée par la forskoline (Figure 2). Cet effet était dépendant de la concentration avec une courbe dose-réponse en forme de cloche. L'acti¬ vité du peptide sur les homogénéisats de substance noire de rat était pratiquement similaire. Ces résultats indi¬ quent clairement que LSAL interagit avec 1'activité du récepteur 5-HT1B.
4) Effets du peptide sur l'activité fonc¬ tionnelle cellulaire des récepteurs 5-HT 1B/D
L'activité du peptide sur la libération de [3H]5-HT à partir de synaptosomes d'hippocampe, de cerveau de rat préalablement chargées en aminé radioac¬ tive a été examinée.
La libération de [3H]5-HT induite par K* a diminué en présence de LSAL de manière dose-dépendante avec une CI50 apparente proche de 10"nM. L'effet maximum, observé à une concentration de 10"10M, correspond à une inhibition de 20 à 25% de la libération évoquée et diminue à des concentrations plus élevées (Figure 3).
Dans des séries d'essais dont les conditions sont proches de celles utilisées pour les essais de liaison (à l'équilibre), le peptide LSAL ne potentialise
plus l'action de la 5-HT mais au contraire s'oppose à son effet inhibiteur sur la libération de 3H-5HT.
Ces résultats démontrent que LSAL interagit avec la fonction cellulaire corrélée à 1'activité des récepteurs 5-HT1B/1D. L'hypothèse la plus vraisemblable pour expliquer ces résultats est que le peptide LSAL agissant en tant que modulateur allosterique du récepteur 5-HT1B/1D est capable d'induire des transitions conforma- tionnelles de ce récepteur correspondant soit à un état actif (potentialisation) soit à un état désensibilisé (inhibition) du récepteur.
5) Effets in vivo de LSAL
Des essais ont été réalisés in vivo chez la souris, pour examiner les effets comportementaux de LSAL.
Dans la mesure où des études neuro-pharmaco- logiques antérieures avaient montré 1'implication des récepteurs 5-HT 1B dans les désordres liés au stress et à l'anxiété, les effets du peptide ont été examinés dans deux modèles animaux d'anxiété.
Test du champ ouvert
L'activité de LSAL a été déterminée dans le test du champ ouvert sur des souris C57/Black-6.Des souris mâles C57/BL/6 (20-25 g) ont été utilisées.Le champ ouvert consistait en une boîte de plastique blanc (35 x 35 x 20 cr ? divisée en 25 carrés égaux. Du LSAL dissous dans 5 .1 de 0,9% de solution saline dans un volume de 5 μl , ce injecté par voie icv aux souris, qui ont été placées à un angle de la boîte. Après deux minutes, le nombre de carrés traversés, les demi-tours effectués et le temps d'immobilisation ont été mesurés. Les résultats sont exprimés comme la moyenne plus ou moins l'écart type. Différence avec le témoin : *p < 0,05, **p < 0,005 (Test de Student). A des doses de
26
50 μg ICV par animal, l'activité exploratrice a été significativement diminuée par rapport à des animaux témoins qui recevaient l'excipient dans les mêmes conditions ( ableau 3).
TABLEAU 3
Effet d'injections intracérébroventriculaires de LSAL chez la souris dans le test du champ ouvert
Labyrinthe en croix surélevé
Ce test expérimental est utilisé pour déterminer le degré d'anxiété et consiste en un labyrin¬ the surélevé à deux bras, l'un protégé par des parois et l'autre non protégé.
L'animal est supposé anxieux lorsqu'il évite l'entrée et réduit le temps passé dans les bras ouverts.
Des souris mâles BALB/C pesant de 20 à 24 g ont été utilisées.
Le labyrinthe en croix surélevé était fait de plexiglas avec bras ouverts et deux bras fermés de la même taille (12,5 x 5 cm) avec des murs de 15 cm de
hauteur, ces bras partant d'une plateforme centrale de 5 x 5 cm, placée 40 cm au-dessus du sol.
Du LSAL dissous dans 5 ml de solution saline à 0,9% dans un volume de 5 μl a été injecté icv aux souris. Trois heures plus tard, l'animal a été placé sur la plateforme centrale du labyrinthe. Chaque entrée dans un bras ainsi que le temps passé dans chaque bras a été enregistré. La durée du test était de 5 minutes. Le labyrinthe a été nettoyé après chaque essai.
Le LSAL a été testé dans des conditions de basse intensité lumineuse (BENJAMIN D. et al., Life Sci. 47, 195-203 (1990)).
Les résultats ont été exprimés comme la moyenne plus ou moins 1'écart type du pourcentage des entrées dans les bras ouverts (% d'entrées dans les bras ouverts), pourcentage du temps passé dans les bras ouverts (% temps dans le bras ouvert) et nombre total d'entrées dans les bras. Différence avec le témoin : *p < 0,05, **p < 0,01 (Test de Student).
TABLEAU 4A (1 heure après injection i.v.)
TABLEAU 4B (3 heures après injection i.v.)
Ce résultat suggère fortement que dans les conditions expérimentales mises en oeuvre, le peptide a un effet anxiogène. Une dose de 10 μg de LSAL augmente le nombre d'entrées dans les bras ouverts non protégés du labyrinthe, suggérant un effet anxiolytique de ce peptide dans les conditions d'essai.
Test de la nage forcée Le test de la nage forcée (Porsolt) est un test simple qui ne peut en aucun cas être assimilé à un modèle de "dépression". Il a cependant le mérite de discriminer un bon nombre de substances antidépressives. Il faut cependant remarquer que quelques antidépresseurs ne sont pas actifs dans ce test et certaines substances non antidépressives y sont actives.
Dans des conditions expérimentales où 1'on mesure l'activité d'antidépresseurs dans ce test, il a été montré que le peptide Ala - Leu injecté par voie ip à forte concentration, mais aussi i.c.v. (intra cérébro- ventriculaire) à faible concentration, réduit légèrement mais significativement le temps d'immobilité des souris ;
les antidépresseurs de type noradrénergique (no ifensine) sont beaucoup plus efficaces que le peptide dans ce test, mais les antidépresseurs sérotoninergiques ont également une activité faible. La mesure de 1'activité locomotrice horizon¬ tale a été réalisée dans un appareil d'activométrie. Le peptide a un effet stimulant. Au cours de ce test, une forte augmentation des défécations (signe lié à 1'anxié¬ té) a été notée chez des animaux qui ont reçu le peptide. Cependant, dans tous ces essais, il semble que l'état de "stress" initial des animaux joue un rôle dans l'amplitude des phénomènes observés.
Diverses séries d'essais ont été réalisées sur les effets du dipeptide Ala - Leu sur l'appétit. Des administrations i.c.v. de 7 à 30 μg du peptide ont des
"effets très significatifs sur la prise de nourriture chez la souris, puisqu'elles entraînent sur 24 heures une diminution d£ près de la moitié de la consommation alimentaire des animaux, ainsi qu'une perte de poids également significative.
Ces dernières observations sont bien en accord avec le fait que les antidépresseurs sérotoniner¬ giques ont le plus souvent des effets importants sur la prise alimentaire, certains favorisant, d'autres rédui- sant le poids chez les patients traités, et que leur activité est mise à profit dans les cas de boulimie ou d'anorexie qui souvent accompagnent la dépression.
Ces modifications comportementales observées après administration in vivo de LSAL et d'autres peptides selon 1'invention montrent fortement que les modifica¬ tions moléculaires et cellulaires induites par le peptide conduisent effectivement à des modifications de la fonction du système nerveux central. En fait, LSAL semble capable d'induire de 1'anxiété après administration in vivo. LSAL apparaît comme un régulateur endogène, capable
de moduler finement le contrôle exercé par la 5-HT sur la neurotransmission au niveau du système nerveux central. Il joue vraisemblablement un rôle-clé dans les fonctions physiologiques (sommeil, thermo-régulation, apprentissage et mémoire, comportement, douleur, ...), ainsi que dans des mécanismes physio-pathologiques (stress, anxiété, dépression, agressivité, désordres alimentaires, etc... ) connus ou fortement soupçonnés pour impliquer le système sérotoninergique. Il devrait également jouer un rôle important dans les pathologies liées à la tension artérielle et la migraine, car des récepteurs de type 5-HT1 (5-HT1-like (probablement des 5- HT1D)) ont été localisés dans les vaisseaux de cerveau humain et dans d'autres muscles lisses. II régule sans doute également la réponse immune dans la mesure où les récepteurs 5-HT1B/1D sont présents dans des tissus immuno-compétents, et dans la mesure où la transmission de la 5-HT est connue pour interagir avec la réponse immunitaire.
7) Activité relative des peptides selon 1'invention
L'activité relative de différents aminoacides ou peptides à 1 nM a été déterminée sur des récepteurs 5-HTXB et 5-HT1B/1D à l'aide de 0,3 nM de [125I] cyanopindo¬ lol et 30 nN [3H] 5-HT respectivement. Les expériences de liaison ont été réalisées comme décrit précédemment. Les résultats sont exprimés en pourcentage de 1'effet de LSAL. Chaque valeur correspond à la moyenne ± l'écart type de trois essais indépendants réalisés en cinq exemplaires.
TABLEAU 5
N.D. : non déterminé
Claims
1. Composé de séquence peptidique
Leu
dans laquelle X représente H ou Ala ou Leu-Ser-Ala, Y représente OH ou une séquence peptidique ayant de 1 à 10 aminoacides, dont l'extrémité carboxy terminale est amidifiée par un groupe NH2 ou estérifiée par un reste hydrocarbyloxy substitué ou non substitué, sous réserve que X et Y ne représentent pas simultanément H et OH, respectivement ainsi que les composés correspondants dans lesquels le groupe de liaison peptidique -CO-NH- est remplacé par un groupe de liaison résistant à la dégradation enzymatique des proteases, ou dans lesquels le squelette peptidique comporte un ou plusieurs groupes intercalés rendant la liaison peptidique résistante à la dégradation enzymati¬ que.
2. Composés de séquence peptidique suivante :
Leu - Ser - Ala - Leu - Z
dans laquelle Z représente OH, NH2 un reste hydrocarby- loxy substitué ou non substitué, ou une séquence peptidi¬ que ayant de 1 à 10 aminoacides, ainsi que les composés correspondants dans lesquels la liaison peptidique est remplacée par une liaison résistante à la dégradation enzymatique des proteases ou dans lesquels le squelette peptidique comporte un ou plusieurs groupes intercalés rendant la liaison peptidique résistante à la dégradation enzymatique.
3. Composés selon la revendication 1 ou 2, dans lesquels le groupe de liaison peptidique -CO-NH- est remplacé par un groupe choisi parmi -C0- NR' , -CR^- CR3R4-, -C0-CR1R2-, ou dans lesquels le squelette peptidi¬ que présente un ou plusieurs groupes intercalés choisis parmi les groupes -CR1R2-, -NRX-, -0-, Rl f R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentant H ou un groupe alkyle en C^Cg et R' représentant un groupe alkyle en C-!-C6.
4. Composés selon la revendication 1 ou 2, comprenant une séquence choisie parmi :
Ala - Leu
Leu - Ser
Ala - Leu -Ser
Leu - Ser - Ala - Leu
Leu - Ser - Ala - Leu - 0CH3 Leu - Ser - Ala - Leu - NH2
Leu - Ser - Ala - Leu - Gly - Gly - Gly - Tyr
ainsi que les composés correspondants dans lesquels la liaison peptidique est remplacée par une liaison résis- tante à la dégradation enzymatique des proteases, ou dans lesquels le squelette peptidique comporte un ou plusieurs groupes intercalés rendant la liaison peptidique résis¬ tante à la dégradation enzymatique.
5. Composés selon 1'une des revendications 1 à 4, caractérisés en ce qu'ils sont sous la forme L.
6. Composé apte à remplir le rôle de ligand du récepteur sur lequel se fixe le peptide endogène de séquence Leu-Ser-Ala-Leu (LSAL), caractérisé en ce qu'il comprend un groupement dont la structure spatiale est sensiblement identique à celle d'un peptide de séquence
X - Leu - Y
dans laquelle X et Y sont tels que définis à la revendi- cation 1, X et Y ne représentant pas simultanément H et OH, respectivement.
7. Composé selon la revendication 6, caracté¬ risé en ce qu'ils comprennent un groupement dont la structure spatiale est sensiblement identique aux peptides suivants : Ala-Leu, Leu-Ser, Ala-Leu-Ser, et Leu-Ser-Ala-Leu.
8. Composé suivant la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisé en ce qu'ils comprennent un groupement dans lequel la position moyenne des atomes formant le groupement qui se lie au récepteur ne diffère qu'au plus de 5 % de la position moyenne des atomes formant le peptide correspondant.
9. Composé selon la revendication 6 ou la revendication 7, caractérisé en ce qu'ils comprennent un groupement dans lequel la position moyenne des atomes formant le groupement qui se lie au récepteur ne diffère qu'au plus de 2 % de la position moyenne des atomes formant le peptide correspondant.
10. Procédé de production d'un composé selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une modélisation informatique à partir de(s) la (les) structure(s) spatiale(s) des peptides correspon¬ dants et synthèse chimique classique à partir de la structure obtenue après modélisation.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la modélisation est réalisée à partir de la structure spatiale de molécules d'antidé¬ presseurs actives sur le site de fixation du peptide endogène.
12. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Composition thérapeutique, caractérisée en ce qu'elle comprend une molécule précurseur suscepti¬ ble de libérer in vivo un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
14. Procédé de diagnostic in vitro d'une affection liée au système sérotoninergique chez un patient, caractérisé en ce que l'on effectue un dosage dans un fluide biologique du patient d'un peptide de séquence
Leu - Ser - Ala - Leu
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le dosage est effectué à l'aide d'un anticorps spécifique dudit peptide.
16. Anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé spécifiquement contre un peptide tel que défini dans la revendication 14, ainsi que les fragments dudit anti¬ corps, notamment les fragments Fab, Fab', F(ab' )2 ou Fc.
17. Kit de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé selon la revendication 14 ou la revendication 15, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps ou un fragment d'anticorps tels que définis à la revendication 16.
18. Procédé de criblage de substances antidé¬ pressives occupant le même site conformationnel que le peptide Leu-Ser-Ala-Leu, caractérisé en ce que l'on réalise une discrimination par des essais d'inhibition entre d'une part leur liaison sur le site de recapture de la 5-HT et d'autre part entre leur liaison sur le site 5-HT1B/1D.
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'on compare la constante d'inhibi¬ tion Kix des substances à tester par des essais d'inhibi- tion de liaison en présence d'un peptide selon la revendication 1 ou la revendication 2 à la constante d'inhibition Ki2 de ces mêmes substances, pour inhiber la recapture de la 5-HT ou déplacer un inhibiteur de recapture.
20. Composition diagnostique comprenant un composé selon la revendication 1 ou la revendication 2, radiomarque.
21. Procédé de visualisation des sites peptidiques des récepteurs 5-HT1B/1D, caractérisé en ce que l'on utilise une composition selon la revendication 20 et que l'on visualise les récepteurs 5-HT1B/1D à l'aide d'un scanner de tomographie par émission de positions.
22. Procédé de mise en évidence de ligands du site du récepteur 5-HT1B/1D pour le peptide LSAL, caracté- risé en ce que l'on effectue les étapes consistant à :
- mettre en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées avec une cellule recombinée exprimant à sa surface le récepteur 5-HT1B/1D en présence d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 dans des conditions permettant 1'interaction entre le récepteur 5-HT1B/1D et ladite (lesdites) molécule(s), dans le cas où celle-ci posséderait une affinité pour le récepteur 5-
- détecter la quantité dudit composé selon l'invention liée au récepteur;
- en déduire la fixation éventuelle de ladite (desdites) molécule(s).
23. Procédé selon la revendication 22 pour la mise en évidence d'agonistes ou d'antagonistes du peptide endogène LSAL.
24. Procédé de mise en évidence de modula¬ teurs du site du récepteur 5-HT1B/1D pour le peptide LSAL caractérisé en ce que 1'on effectue les étapes consistant à : mettre en contact une molécule ou un mélange contenant différentes molécules, éventuellement non identifiées avec une cellule recombinée exprimant à sa surface le récepteur 5-HT1B/1D en présence d'un composé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11 dans des conditions permettant 1'interaction entre le récepteur 5-HT1B/1D et ledit composé selon l'une des revendications 1 à 11;
- détecter les molécules capables de moduler l'activité du composé selon l'une des revendications 1 à 11 sur ledit récepteur.
25. Ligand ou modulateur du site du récepteur 5-HT1B/1D pour le peptide LSAL, identifié selon le procédé de la revendication 22 ou 24.
26. Composition thérapeutique comprenant comme principe actif un ligand ou modulateur selon la revendication 25.
27. Utilisation d'un composé selon l'une des revendications 1 à 11 pour la préparation d'une composi- tion ayant une activité modulatrice de la liaison sérotoninergique.
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