WO1994021264A1 - Utilisation des glucocorticoides pour le traitement et la prevention du sida et compositions en contenant pour cet usage - Google Patents

Utilisation des glucocorticoides pour le traitement et la prevention du sida et compositions en contenant pour cet usage Download PDF

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WO1994021264A1
WO1994021264A1 PCT/FR1994/000282 FR9400282W WO9421264A1 WO 1994021264 A1 WO1994021264 A1 WO 1994021264A1 FR 9400282 W FR9400282 W FR 9400282W WO 9421264 A1 WO9421264 A1 WO 9421264A1
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acetate
cells
prednisolone
sodium salt
treatment
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Application number
PCT/FR1994/000282
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Jean-Marie Andrieu
Rafaël LEVY
Louis Lu
Original Assignee
Association Pour La Recherche, L'etude, Le Traitement Et La Prevention Des Maladies Malignes Du Sang(Aremas)
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/57—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of two carbon atoms, e.g. pregnane or progesterone

Definitions

  • the present invention relates to means for the treatment of HIV infection and the prevention of AIDS. It relates more particularly to the use of means for the treatment of HIV infection and / or the prevention of AIDS, as well as the means relating thereto, the main function of which is to restore the CD4 lymphocyte count, together with a maintenance of the number of CD8 lymphocytes in seropositive subjects or treated patients, whose CD4 / CD8 ratio is thus markedly increased.
  • HIV1 Human immunodeficiency virus type 1
  • HIV1 Human immunodeficiency virus type 1
  • the manifestations of AIDS are of various types: opportunistic infections; Kaposi's sarcoma; lymphomas; neurological disorders and a drop in blood CD4 below 200 / mm ** - 1 .
  • Contamination with this virus first shows up in the serum of the infected organism antibodies directed against this virus. The subject is then said to be HIV positive.
  • the clinical manifestations accompanying this phase include lymphadenopathy in particular.
  • ARC abbreviation for "AIDS Related Complex”
  • the ARC demonstrations precede and announce the occurrence of AIDS, which follows them from a few months to two years. According to current knowledge, more than 90% of infected people will evolve, in the absence of treatment, towards AIDS, the final phase of HIV infection, within fifteen years of being infected.
  • CD4 lymphocytes which are largely responsible for the body's defenses.
  • the normal CD4 blood level is 900 ⁇ 300 per mm 3 .
  • Activation of the CD4 lymphocyte initiates the process of virus multiplication within the infected CD4 cell. This first results in the appearance of viruses on the surface of the CD4 cell, then the death of the CD4 cell and the discharge into the blood stream of many newly manufactured infectious viruses. This leads to the fact that, in the last phase of infection, only 50 CD4 cells / mm 3 remain in the blood. Therefore the concentration of CD4 cells and the percentage of infected cells are such that these cells can no longer play their role in the body's defenses and AIDS appears. In the absence of treatment or even most often in spite of himself, the patient's death eventually occurs.
  • HIV also infects blood monocytes and tissue macrophages. The consequences of infection of these cells on the development of AIDS are currently unknown.
  • the course of the infection is slow and can last three to fifteen years or more after infection, depending on the individual.
  • the mechanisms used by the affected organism to slow the progression from infection to AIDS are therefore complex.
  • antibodies specific to the different constituents of the virus are produced by specialized cells (plasma cells) in the bone marrow. These antibodies are produced within three to twenty weeks of contamination, very exceptionally later. The contaminated subject is then declared HIV positive. Among these antibodies, some, by attaching themselves to various areas of the virus, are able to prevent the virus from entering new CD4 cells; this is why they are called neutralizing antibodies. Over time, the virus produced by lymphocytes is unfortunately progressively less and less neutralized. It is possible that the production capacity of neutralizing antibodies by plasma cells is ultimately exceeded by the importance of viral production. It is also possible that the rate of spontaneous mutations to which the virus genome is subject leads to even minor changes in the proteins of the envelope of the virus. The immune system may then no longer be able to use neutralizing antibodies adapted to these modified viruses.
  • CD8 Other white blood cells, called CD8 (or T8) lymphocytes, also play an important role in the fight against viral production.
  • CD8 cells whose normal blood level is around 500 / mm 3 , increase rapidly in the weeks following contamination
  • CD8 is to specifically destroy any cell carrying foreign proteins (mainly of viral origin) on its surface. It is thus possible that infected CD4 cells are destroyed by CD8 cells as soon as viruses appear on their surface. There are most likely other mechanisms for destroying CD4 cells. During much of the course of HIV infection, destroyed CD4 cells (either by one of the two processes described above or by other mechanisms not yet clearly identified) are replaced by new CD4 cells from precursor cells. This replacement, whose physiology is poorly understood, is gradually becoming more and more incomplete as the infection progresses. Thus, the progressive disappearance of CD4 cells is the result of a complex process where the role of viral multiplication and the implementation of the body's defenses against the virus and against the cells which carry it are very entangled.
  • the human immunodeficiency virus type 1 (HIV1) is a lentiretrovirus preferentially infecting CD4 lymphocytes, as well as macrophages, dendritic cells and other cells of the monocytic line. It causes a slowly progressing attack on the immune system, manifested mainly by a gradual and irreversible decrease in blood CD4 cells, an increase in CD8 lymphocytes and an increase in the concentration of serum in various classes of immunoglobulins. There is also an increase in biological markers of immune activation (microglobulin ⁇ 2 # neopterin). Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) manifests itself in a variable period (on average 8-10 years) after contamination.
  • AIDS Acquired immunodeficiency syndrome
  • cyclosporine a potent immunosuppressive drug substance
  • CSA cyclosporine
  • no increase in the number of CD4 cells has been noted.
  • glucocorticoids or glucocorticosteroids, or abbreviated below "GCC”
  • GCC glucocorticosteroids
  • adrenocorticotropic hormone or corticostimulin
  • corticostimulin is a clinical immunosuppressant and anti-inflammatory. It is also known that corticostimulin has the same sedative action on inflammatory and allergic phenomena as cortisone.
  • HIV Long Terminal Repeat sees its action increased by glucocorticoids in tissue culture cells and by the state of pregnancy in placental and uterine tissues in transgenic mice. It is suggested by these authors that hormonal stimulation may influence proviral activation and that placental expression of HIV-LTR may contribute to the high perinatal transmission of HIV.
  • cytokines constitute a complex network which regulates the expression of HIV, in the same way as the endogenous regulatory proteins thereof, and that a certain number of different physiological and pharmacological agents capable of interfering with Cytokine-mediated events, including glucocorticoids, antioxidants, and retinoic acid, have been shown to significantly increase HIV replication in vitro for glucocorticoids. It is noted that treatment with glucocorticoids alone of chronically infected Ul cells did not result in direct induction of HIV expression, and that in transient transfection systems glucocorticoids have been shown to both induce and suppress expression of HIV-LTR.
  • dexamethasone does not increase the action of HIV-LTR.
  • dexamethasone seems to be able to prevent the increase in HIV replication due to stimulation.
  • corticosteroids do not seem to promote the expression of virus and that an acute in vivo administration of these compounds should not have the harmful effects hitherto reported by other authors.
  • a primary object of the present invention is therefore the use of at least one glucocorticoid for obtaining a medicament intended for the treatment of HIV infection and the prevention of AIDS, in particular in a patient infected with the HIVl virus. .
  • the invention also relates to means for obtaining a medicament for the treatment of HIV infection, and in particular the prevention and / or treatment of AIDS, in particular in a patient infected with the HIVl virus, characterized in that they include an effective amount in the application considered at least one glucocorticoid.
  • These means are in particular a pharmaceutical composition comprising at least one glucocorticoid as active ingredient and presented and / or packaged for the treatment of HIV infection, in particular the prevention and / or treatment of AIDS.
  • the present invention thus also relates to a pharmaceutical composition presented and / or packaged for the treatment of HIV infection, in particular for the prevention and / or treatment of AIDS, comprising as active ingredient at least one glucocorticoid and / or a salt or other pharmacologically acceptable derivative thereof.
  • Said composition is advantageously in the form of tablets, tablets or lozenges, optionally effervescent, or alternatively solutions or suspensions for intramuscular or intravenous injections.
  • the dosage forms of this composition comprise in practice per unit dose approximately 1 mg to 1 g of prednisolone (or ⁇ 1 - dehydro-cortisol) or a weight equivalent, on the basis of the anti-inflammatory pharmacological effect, of any other glucocorticoid natural or synthetic or their different salts.
  • prednisolone or ⁇ 1 - dehydro-cortisol
  • weight equivalent on the basis of the anti-inflammatory pharmacological effect, of any other glucocorticoid natural or synthetic or their different salts.
  • Non-limiting examples of these compounds are in particular: fludrocortisone acetate, hydrocortisone, hydrocortisone acetate, cortisone cypionate, sodium salt of phosphate d hydrocortisone, the sodium salt of hydrocortisone succinate, beclomethasone dipropionate, betamethasone, the sodium salt of betamethasone phosphate, betamethasone valerate, cortisone acetate, dexamethasone, dexamethasone acetate, sodium salt of dexamethasone phosphate, Flunisolide, methylprednisolone, methylprednisolone acetate, sodium salt of methylprednisolone succinate, paramethasone acetate , prednisolone, prednisolone acetate, sodium salt of prednisolone phosphate, prednisolone tebutate, triamcinolone, triamcinolone acetonide
  • the present invention comprises the use of an effective amount of at least one compound chosen from the group of glucocorticoids.
  • glucocorticoids also called glucocorticosteroids, adrenocortical steroids or 11-oxy-corticosteroids
  • glucocorticoids are steroids secreted by the fasciculated zone of the adrenal corticosteroid and contain in their molecule a ketone or alcohol radical attached to the carbon atom in position 11. They constitute a chemical group comprising in particular: corticosterone, 11-dehydrocorticosterone, 17-hydroxycorticosterone or cortisol or also hydrocortisone, and 17-hydroxy-ll-dehydrocorticosterone or cortisone.
  • Synthetic steroids such as prednisone and prednisolone, which belong to this same group, are also known.
  • Prednisone (or ⁇ *** - -cortisone) is obtained by dehydrogenation in positions 1 and 2 of cortisone, while prednisolone (or delta-hydroxycortisone) is obtained by dehydrogenation in positions 1 and 2 of 1 • hydroxycort isone.
  • the present invention comprises the use of an effective amount of at least one compound chosen from the group of glucocorticoids. More advantageously, said effective amount consists of daily doses of approximately 1 mg to 1 g of prednisolone or of a dose of pharmacologically equivalent anti-inflammatory effect of any other natural or synthetic glucocorticoid. These doses may, depending on the route used, the condition of the patient and the product used vary over time and be administered according to a dosage comprising administration in one or more times per day, per week or per month, preferably in the morning.
  • a daily dose as mentioned above can itself be replaced by any other chronology and / or dose of administration of the active compound (weekly, monthly, quarterly administration) insofar as the dosage form of the active principle thus administered provides a pharmacological effect appreciably similar to that obtained with daily administration.
  • the glucocorticoids can be administered by the oral, parenteral, for example intravenous routes, the preference going to the oral route.
  • the glucocorticoids can be administered together with a physiologically acceptable carrier or carrier or diluent to thereby form a pharmaceutical composition.
  • a physiologically acceptable carrier or carrier or diluent to thereby form a pharmaceutical composition.
  • Such compositions advantageously contain more than 0.1% by weight of at least one glucocorticoid and can be prepared by conventional techniques allowing their formulation in conventional dosage forms, for example tablets, capsules, dragees, dispersible powders , syrups, elixirs, suspensions or solutions, drops, nebulizations, suppositories.
  • Suitable diluents or pharmaceutical fillers include, for example, water, alcohols, natural or hardened oils or waxes, calcium or sodium carbonates, calcium phosphate, kaolin, talc and lactose, as well as appropriate preservatives, such as for example 1 • methyl hydroybenzoate, suspending agents such as methyl cellulose, tragacanth and sodium alginate, wetting agents such as lecithin, polyoxyethylene stearate and polyoxyethylene -sorbitan, granulating and / or disintegrating agents such as starch and alginic acid, cohesion agents such as starch, gelatin and gum arabic, and lubricating agents such as magnesium stearate , stearic acid and talc.
  • compositions in tablet form can be coated by known techniques, so that the disintegration of the tablet and the absorption of the active ingredient in the gastrointestinal tract are postponed and so that a prolonged action is obtained over a long period.
  • the intramuscular forms can be designed by the usual techniques, known to those skilled in the art, so as to release the active principle over an extended time.
  • a preferred form is represented by the forms for oral administration which are the drops and the tablets.
  • a person skilled in the art is able to determine in each individual case whether or not a compound is an equivalent of the glucocorticoids by resorting to routine tests and by proceeding if necessary iteratively, preferably on the basis of the indications and proposed methods provided below.
  • Fig. 1 shows graphs showing the rescue of CD4 + T cells by glucocorticoids from activation-induced cell death caused by HIV1.
  • Fig. 2 represents graphs showing the effects of activation markers of PBMC acutely infected by HIV and stimulated by PHA or the soluble antigen of the influenza A virus.
  • Fig. 3 represents graphs showing the CD4 + T and CD8 + T cell counts of peripheral blood of patients seropositive for HIV1 before and under treatment with prednisolone (PDN), as well as the levels of immunological and virological markers under treatment with PDN.
  • PDN prednisolone
  • ZDV Zidovudine
  • Prednisolone (hereinafter abbreviated as PDN) (marketed under the name Solupred by the company Laboratoire Houdé, Puteaux, France) was administered orally to each of the above patients at a daily dose of 0.5 mg / kg (that is to say more precisely in this case: 25 mg for individuals weighing from 46 to 55 kg, 30 mg for those weighing between 56 and 65 kg, 35 mg for those weighing 66 to 75 kg, and 40 mg for those weighing between 76 and 85 kg), taken once before breakfast.
  • treatments have been associated with it, in the form of an additional potassium intake, at a rate of 1200 mg per day (product marketed under the name Diffu K, by the Delagrange Laboratory,
  • PDN therapy was initially planned to last 3 months at the maximum dose. On the seventieth day of treatment according to the evolution of the CD4 cell count and in the absence of side effects, it was decided in agreement with the patients to continue the treatment for another period, of six months this time.
  • the initial assessment was done in the two weeks before the start of PDN therapy (day 0). The evaluations were then scheduled to be carried out on days 15 and 70. In the case of the modification of the length of the test, the evaluation of the treatment was also carried out on days 125 and 170.
  • the evaluation was carried out comprising the following points: complete clinical examination, including measurement of the lymph nodes (or nodes), measurements of weight and blood pressure, usual renal and hepatic chemistries, blood count with phenotypes of CD4 and CD8 lymphocytes (percentage of total lymphocytes and absolute values). For 8 patients, a more complete characterization of the peripheral blood lymphocyte phenotypes (CD19,
  • CD4 + / DR +, CD4 + / CD45RO +, CD4 + / CD25 +, CD8 / DR +, CD8 + / CD57 + was performed with appropriate antibodies by simultaneous double immunofluorescence if necessary.
  • Serum immunoglobulins (Ig) G, A and M, as well as the levels of microglobulin ⁇ 2 and neopterin were also measured.
  • the TNF- ⁇ , IL4, IL6 and soluble IL2 receptor concentrations were determined when sufficient serum was available.
  • the serum concentration of viral particles and the blood concentration of infectious cells were determined on days 0, 70 and 125.
  • Table I are summarized the changes in hemoglobin, hematocrites, platelets, white blood cells (WBC), neutrophils and total lymphocytes.
  • the hemoglobin level increased significantly from day 70, while the hematocrit remained constant; the platelet count remained stable.
  • the WBC count increased significantly from day 15 and then remained stable.
  • a significant increase in the neutrophil count has been observed since days 15 and 70; this then decreased to a level not significantly different (although higher) than that observed on day 0.
  • a significant increase in the lymphocyte count appeared under administration of PDN from day 15.
  • Table 2 below below below shows the individual evolution and the average evolution of the CD4 and CD8 lymphocyte subpopulations.
  • CD4 cells absolute values, as well as percentages of total lymphocytes
  • the absolute value of the CD8 cell count remained stable, while their percentage decreased significantly. This was due to a significant increase in the CD4 / CD8 ratio from day 15.
  • Table 3 illustrates the evolution of the other lymphocyte phenotypes produced in 8 patients. The percentage of CD4 DR cells / CD4 cells decreased significantly, as did that of the CD8 DR subpopulation.
  • Table 4 summarizes the evolution of the serological parameters tested. IgG decreased significantly from day 70, while IgA began to decrease from day 125. IgM remained stable.
  • the p24 antigenemia content (pg / ml) of the 4 positive patients did not change throughout the treatment (day 0: 202, day 70: 187, day 170 (1 patient): 180; the eight patients without p24 antigenemia were remained negative).
  • the evolution of the serum concentration in viral particles, as well as that of the blood concentration in infectious cells, are indicated in Table 4. The two parameters remained stable during the treatment with PDN.
  • Glucocorticosteroids have been used for decades for a multitude of medical conditions, including viral infections. Their effects have also been tested in healthy subjects. In these studies, glucocorticosteroids have usually resulted in a very marked decrease in the lymphocyte count, mainly with regard to the CD4 lymphocyte subpopulation, which resulted in a very marked decrease in the CD4 / CD8 ratio (0.57 ⁇ 0.07 (P ⁇ 0.0001) at 80 days). It has been suggested that this lymphopenia results from a redistribution of the recirculating mass of extra-vascular lymphocytes. In two studies a temporary (less than four weeks) increase in CD4 cell count was observed, but it was associated with a parallel and similar increase in the CD8 cell subpopulation, which resulted in stable CD4 / CD8 ratio.
  • peripheral lymphocytes may be due to the fact that the immunosuppressive action of glucocorticosteroids interrupts the autoimmune pathways which usually cause the death of CD4 cells.
  • HIV using a drug with a broad immunosuppressive spectrum.
  • HIV-induced immune activation causes CD4 cell depletion are not yet fully understood; they are probably multiple and could include overlapping: a) autoimmune processes involving all immune cells and triggered by HIV infection; b) the activity of follicular dendritic cells, probably necessary for the destruction of CD4 cells; c) apoptotic death of inappropriate CD4 cells.
  • glucocorticoids which are preeminent anti-inflammatory agents, have been shown to be antagonists of activation-induced apoptotic cell death in mouse thymocytes and T cell hybridomas. It is thus demonstrated according to the present invention that Pharmacological doses of glucocorticoids (or GCC) are effective not only for saving CD4 + T cells from apoptosis caused by HIV1 in vitro, but also for preventing apoptotic CD4 depletion in patients infected with HIV1.
  • FIG. 1 shows in diagram form the rescue of CD4 + T cells from cell death induced by activation caused by HIV1.
  • Fig. 2 shows in graph form the effects of glucocorticoids on activation markers of PBMC acutely infected with HIV.
  • Fig. 3 diagrammatically depicts the peripheral blood cell counts of HIV-positive patients.
  • Apoptosis which is a form of cell death fundamentally different from acute pathological cell death (commonly called “necrosis”) has so far been recognized as representing an important physiological test to which most cells respond, both in developing and mature tissue.
  • Activation-induced cell suicide due to apoptosis has been identified as a cell death mechanism to which human T lymphocytes infected with human immunodeficiency virus type 1 (HIV1) are subjected both in vitro and in vivo .
  • HV1 human immunodeficiency virus type 1
  • glucocorticoids which are the most widely used anti-inflammatory agents with life-saving potentials to protect the body from many types of harmful stimuli, have been shown to be effective in saving murine thymocytes and T cell hybridomas of activation-induced cell death, although GCC alone causes apoptosis of these cells in the absence of stimulators. Since circulating T cells in HIV-infected patients undergo apoptosis when mediated in vitro by mitogens or the CD3 / T cell receptor (TCR), it was necessary to examine whether GCCs were effective in inhibit apoptosis induced by activation in human T cells infected with HIV1.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • HPA phytohemagglutinin
  • anti -CD3 a monoclonal antibody for CD3
  • DNA is degraded to oligomers corresponding to fragments the size of an oligonucleosome, revealed by a pattern (plot) of DNA degradation in multiples of 200 base pairs (called fragmentation).
  • DNA gel electrophoresis of PBMC highly infected with HIV1 following activation with anti-CD3 showed a corresponding characteristic pattern.
  • the stimulator or the virus were removed, the cellular DNA no longer produced any discernible characteristic of such a degraded pattern of DNA, which suggested that apoptosis depended on both activation and infection. DNA fragmentation did not appear when cyclosporin A or hydrocortisone / prednisolone was added at the time of activation.
  • GCCs effectively suppress apoptosis induced by activation in primary PBMCs acutely infected with HIV1
  • a quantitative polymerase chain reaction (PCR) demonstrated that, although PBMC appeared to be infected with an equal number of copies of HIV RNA, total genomic HIV RNA (including extrachromosomal forms and integrated provirus ) was strongly lowered (10 to 100 times) by pretreatment of the cells with CSA, which indicated a blockage of viral reverse transcription. However, this did not happen when prednisolone was used to pretreat the cells.
  • PBMCs infected in vitro the PBMCs of patients stimulated by anti-CD3 have given rise to apoptotic CD4 depletion in a manner dependent on the virus load.
  • high concentrations of blood cells carrying infectious HIV1 correspond to a rapid depletion of CD4 + peripheral T cell counts.
  • PBMCs of unstimulated patients a higher level of apoptosis was observed than in acutely infected PBMCs.
  • Apoptotic cell death reached 20% of CD4 cells in 3 cases (patients 1-3) with the highest viral load, against only 7% and 5% in both cases (patients 4 and 5) with the lowest viral load.
  • This spontaneous apoptosis of patients' T cells provides an explanation for the observation that the rescue of CD4 cells from apoptosis by GCC appeared to be less effective in naturally infected cells than in acutely infected PBMCs.
  • GCC which usually cause CD4 + T lymphocytopenia in normal humans
  • CD4 cell counts without modifying the CD8 subpopulation at 15 th day as well as at the 120th day (see Figs. 3a and 3b).
  • An increased CD4 cell count (20-200%) was noted in 36 of 50 subjects (72%) after 15 days and in 29 out of 44 (68%) after 120 days of treatment, while a decrease in at least 20% of the CD4 count was seen in 5 cases (10%) iS 6111® day and in 4 cases (9%) 120® me day (Figs. 3a3 and 3a4).
  • GCCs are agents that are capable of: 1) save CD4 + T cells from apoptotic cell suicide caused by HIV1 by cell activation mediated by lectin or CD3 / TCR in vitro;
  • CD8 + T cells from HIV1 positive individuals have also been shown to undergo apoptosis upon TCR / CD3 binding in vitro, what has been demonstrated above emphasizes that the destruction of T cells induced by HIVl is essentially restricted to CD4 cells both in vitro and in vivo.
  • the immense effects of GCCs on CD4 counts in infected patients are consistent with the rationale that apoptosis caused by HIV is an active process that takes place in the lymphoid organs and governs the gradual CD4 depletion observed throughout infection, leading to the new perspective that virus-induced pathogenic destruction of CD4 + T cells in vivo can be alleviated by treating infected patients with specific anti-apoptotic agents, such as GCC.
  • Fig. la % of cell mortality (1 - ratio of viable cells to initial cells),
  • Fig. lb the% of CD4 + T cells viable in PBMC acutely infected with HIV and activated by PHA or anti-CD3, in each case in the presence or absence of cyclosporin A, hydrocortisone and prednisolone.
  • Fig. le % CD4 mortality (1 -% of viable control CD4)
  • Fig. ld % of total cell mortality (1 -% of viable control PBMCs) in PBMCs acutely infected with HIV and activated by anti-CD3, in each case in the presence of the indicated concentrations of cyclosporin A, hydrocortisone and prednisolone .
  • Data represents mean ⁇ SD
  • PBMCs were freshly separated by Ficoll-Hypaque density gradient centrifugation from heparinized blood from normal HIV negative donors.
  • the cells (2 x 10 ⁇ ) were incubated with primary HIVl isolates for 2 hours at a multiplicity of infection (MOI) of 2 x 10 " 4 units of infectious virus per cell (according to Poisson distribution, one unit infectious corresponds to 63% of positive cultures for a given dilution of viral stock), which corresponds to 1% of cells positive for HIV1 DNA (assay by polymerase amplification reaction or PCR) in PBMCs inoculated by quantitative analysis cells diluted in series (limiting dilution method).
  • MOI multiplicity of infection
  • the cells were cultured for a further 3 days in the presence or absence of the substances indicated above, and then harvested for counting viable cells by the blue dye test. trypan. The percentage of CD4 + cells in the final cell population was analyzed by flow cytometry (FACScan, Becton, Dickinson, Mountain View, CA) after reaction with a fluorescently labeled monoclonal antibody for CD4 (Leu-3a).
  • Fig. 2a the effects of glucocorticoids on activation markers of PBMC acutely infected by HIV and stimulated by PHA or the antigen of the soluble influenza A virus.
  • the results represent the mean ⁇ AND of measurements made in triplicate : 2al:% of transformed lymphoblasts (blast cells), 2a2:% of cells positive for the interleukin 2 receptor (IL2), 2a3: of [ 3 H] -thymidine binding to PHA, 2a4: of [ 3 H] -thymidine binding to
  • Figs. 2b average% of fragmented DNA (ratio between
  • PBMCs were infected with HIV1 and activated with PHA or influenza A virus antigen (10 ⁇ g / ml) in the presence of different concentrations of cyclosporin A and glucocorticoids such as indicated on the legend above for FIG. 1. After another 3 days of culture, a count of the blast cells was carried out in a hemocytometer and the cells positive for the IL2 receptor were evaluated by flow cytometry after their treatment with a monoclonal antibody directly labeled for fluorescence for the IL2 receptor (CD 25). Cell proliferation was determined by the technique of [ 3 H] -thymidine fixation.
  • Low molecular weight DNA (including fragments of extrachromosomal DNA and degraded DNA) was separated from high molecular weight nucleosomal DNA by centrifugation (5000 xg for 15 min). DNA was isolated from both the supernatant and pellet fractions using a commercial DNA purification kit. The supernatant DNA was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel containing 0.5 ⁇ g / ml of ethidium bromide at 80 V for 2.5 h. To determine the ratio of DNA from the supernatant to DNA from the pellets (% fragmented DNA), the two fractions were quantified by spectrophotometry. PBMCs alone, infected with HIV or heat inactivated HIV (HI) (56 ° C, 40 min) served as controls.
  • HI heat inactivated HIV
  • Figs. 3a3 and 3a4 In the abovementioned counts, the number of individual patients was used for the analysis of the population and its representation in diagram.
  • Fig. B Immunological and virological markers were used in 27 consecutive patients treated with PDN. Blood samples from 10 healthy donors negative for HIV were used as a control for each trial performed. The data were expressed by the mean ⁇ SD (Figs. 3bl to 3b4 and 3b6) or by the geometric mean ⁇ AND (Fig. 3b5) of the measurements.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells isolated under gradient according to Ficoll- Hypaque and taken from 27 of the 28 consecutive subjects who reached the first 120 days of PDN treatment (the cells were not available for a patient). Briefly, the cell suspensions were divided into two aliquots and the pellets were either gently resuspended in 1.5 ml of a solution of propidium iodide (PI, 50 ⁇ g / ml in citrate 0.1% sodium plus Triton X-100 at
  • the viral RNA was extracted, subjected to reverse transcription and amplified by PCR. Amplified HIV signal was quantified using the curve standard obtained with dilutions of RNA derived from virions. HIV genomic DNA was quantified in a PHA-stimulated PBMC overnight (reflecting total infection of blood cells by the virus) and viral RNA was quantified in a PHA-stimulated PBMC for 3 days (representing the number of viruses expressing / replicating in the patient's cells).
  • the proliferative response of patients' PBMCs to stimulation by anti-CD3 and the booster antigen (influenza A) was obtained as indicated above (see section on Fig. 2a). Since these experiments were performed in an advanced phase of the present study, 14 of 27 patients did not have cell samples for a proliferative booster response.
  • Platelets f / ⁇ D Average ⁇ SE 215 ⁇ 11,237 ⁇ 11,234 ⁇ 12,221 ⁇ 22,244 ⁇ 39 Probability * 0.002 0.02 0.722 0.753
  • PBL peripheral blood lymphocytes

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Abstract

Utilisation d'au moins un glucocorticoïde, pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement de l'infection par le VIH et à la prévention du SIDA, notamment chez un patient infecté par le virus VIH1. La composition pharmaceutique destinée à cet usage comprend comme principe actif au moins un glucocorticoïde et/ou un sel ou autre dérivé pharmacologiquement acceptable de celui-ci, notamment de la prednisone ou de la prednisolone, à raison d'environ 1 mg à un 1 g par dose unitaire.

Description

UTILISATION DES GLUCOCORTICOIDES POUR LE TRAITEMENT ET LA PREVENTION DU SIDA ET COMPOSITIONS EN CONTENANT POUR CET USAGE
La présente invention concerne des moyens pour le traitement de 1'infection par le VIH et la prévention du SIDA. Elle concerne plus particulièrement une utilisation de moyens aux fins de traitement de l'infection par le VIH et/ou de prévention du SIDA, ainsi que les moyens y relatifs, dont la fonction principale est un rétablissement du taux de lymphocytes CD4, conjointement avec un maintien du nombre de lymphocytes CD8 chez les sujets séropositifs ou les patients traités, dont le rapport CD4/CD8 est ainsi nettement accru.
Le SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise) est un ensemble de manifestations cliniques, jusqu'à présent mortelles, témoignant de la dégradation extrême du système immunitaire sous l'influence du virus VIH. Le virus de 1'immunodéficience humaine de type 1 (VIHl) est un lentirétrovirus, qui infecte préfèrentiellement les lymphocytes CD4, ainsi que les macrophages, les cellules dendritiques ou d'autres cellules de lignée monocytaire. Les manifestations du SIDA sont de divers types: les infections de type opportuniste; le sarcome de Kaposi; les lymphomes; les troubles neurologiques et la baisse des CD4 du sang en dessous de 200/mm**-1.
La contamination par ce virus fait d'abord apparaître dans le sérum de l'organisme infecté des anticorps dirigés contre ce virus. Le sujet est alors dit séropositif. Les manifestations cliniques accompagnant cette phase comprennent notamment des adénopathies.
Les symptômes apparaissant dans une phase subséquente, souvent beaucoup plus tardive, sont regroupés sous l'acronyme d'ARC (abréviation pour "AIDS Related Complex"). Les manifestations d'ARC précèdent et annoncent la survenue du SIDA, qui les suit d'environ quelques mois à deux ans. Selon les connaissances actuelles, plus de 90% des personnes infectées évolueront, en l'absence de traitement, vers le SIDA, phase finale de l'infection par le VIH, dans les quinze années suivant la contamination.
Une fois entré dans l'organisme du sujet le plus souvent par voie sexuelle ou sanguine, le virus VIHl pénètre une catégorie de globules blancs appelés lymphocytes CD4 (ou T4), qui sont pour une grande part responsables des défenses de l'organisme. Le taux sanguin normal des CD4 est de 900 ± 300 par mm3. L'activation du lymphocyte CD4 initie le processus de multiplication du virus au sein de la cellule CD4 infectée. Il en résulte d'abord l'apparition de virus à la surface de la cellule CD4, puis la mort de la cellule CD4 et la décharge dans le courant sanguin de nombreux virus infectieux nouvellement fabriqués. Cela aboutit à ce que, dans la dernière phase de l'infection, il ne subsiste dans le sang que moins de 50 cellules CD4/mm3. Dès lors la concentration des cellules CD4 et le pourcentage de cellules infectées sont tels que ces cellules ne peuvent plus jouer leur rôle dans les défenses de l'organisme et le SIDA apparaît. En l'absence de traitement ou même le plus souvent malgré lui, le décès du patient finit par survenir.
Le VIH infecte également les monocytes du sang et les macrophages des tissus. On ne connaît pas actuellement les conséquences de l'infection de ces cellules sur le développement du SIDA.
L'évolution de l'infection est lente et peut durer de trois à quinze ans ou plus après la contamination, selon les individus. Les mécanismes mis en oeuvre par l'organisme atteint pour ralentir l'évolution de l'infection vers le SIDA sont donc complexes.
Comme dans toute infection virale, des anticorps spécifiques des différents constituants du virus sont produits par des cellules spécialisées (les plasmocytes) de la moelle osseuse. Ces anticorps sont produits dans les trois à vingt semaines suivant la contamination, très exceptionnellement plus tard. Le sujet contaminé est alors déclaré séropositif. Parmi ces anticorps, certains, en s'attachant à diverses zones du virus, sont capables d'empêcher ce dernier de pénétrer de nouvelles cellules CD4; c'est la raison pour laquelle on les appelle anticorps neutralisants. Au cours du temps, le virus produit par les lymphocytes est malheureusement progressivement de moins en moins neutralisé. Il est possible que la capacité de production des anticorps neutralisants par les plasmocytes soit finalement dépassée par l'importance de la production virale. Il est aussi possible que le taux de mutations spontanées dont le génome du virus est l'objet entraîne des modifications même mineures des protéines de l'enveloppe du virus. Le système immunitaire pourrait alors ne plus être capable de mettre en oeuvre des anticorps neutralisants adaptés à ces virus modifiés.
D'autres globules blancs, appelés lymphocytes CD8 (ou T8), jouent aussi un rôle important dans la lutte contre la production virale. Ces cellules CD8, dont le taux sanguin normal est de l'ordre de 500/mm3, augmentent rapidement dans les semaines suivant la contamination
(souvent au-delà de 1000/mm3). Le rôle d'une partie de ces
CD8 est de détruire de façon spécifique toute cellule portant à sa surface des protéines étrangères (d'origine virale principalement) . Il est ainsi possible que les cellules CD4 infectées soient détruites par les cellules CD8 dès l'apparition de virus à leur surface. Il existe très probablement d'autres mécanismes de destruction des cellules CD4. Pendant une grande partie de l'évolution de l'infection par le VIH, les cellules CD4 détruites (par l'un des deux processus décrits ci-dessus ou par d'autres mécanismes encore non clairement identifiés) sont remplacées par de nouvelles cellules CD4 issues de cellules précurseurs. Ce remplacement, dont la physiologie est mal connue, est progressivement de plus en plus incomplet au fur et à mesure de l'évolution de l'infection. Ainsi, la disparition progressive des cellules CD4 est le résultat d'un processus complexe où le rôle de la multiplication virale et la mise en oeuvre des défenses de l'organisme contre le virus et contre les cellules qui le portent sont très intriqués.
Exprimées en d'autres termes, les indications susdites peuvent se résumer comme suit:
Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (HIV1) est un lentirétrovirus infectant préférentiellement les lymphocytes CD4, ainsi que les macrophages, les cellules dendritiques et les autres cellules de la lignée monocytaire. Il provoque une atteinte à progression lente du système immunitaire, se manifestant principalement par une diminution graduelle et irréversible des cellules CD4 sanguines, une augmentation des lymphocytes CD8 et une augmentation de la concentration du sérum en immuno- globulines des diverses classes. On observe également un accroissement des marqueurs biologiques de l'activation immunitaire (microglobuline β2# néoptérine) . Le syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA) se manifeste dans un délai variable (en moyenne 8-10 ans) après la contamination. Dix ans après la découverte du virus VIHl, agent causal du SIDA, les mécanismes de la disparition de la quasi-totalité des cellules CD4 restent sans explication claire. En 1985 J.M. Andrieu et al. ont émis l'hypothèse que la destruction des cellules CD4 pourrait être amplifiée par un processus auto-immun conduisant à la destruction des cellules CD4 infectées, ainsi que de celles qui n'étaient pas infectées. Dans ce contexte, J.M.
Andrieu et al. (voir brevet US 4814323, incorporé aux présentes par référence) ont proposé que la cyclosporine (CSA), puissante substance médicamenteuse immunosuppressi- ve, soit utilisée dans la prévention de l'activation des cellules CD4 requise tant pour la replication du VIH que pour le développement du processus immun conduisant à la destruction des cellules CD4. Une étude pilote conduite avec de la cyclosporine pendant 3 à 24 mois chez 15 sujets séropositifs avec des cellules CD4 dénombrées entre 300 et 600/mm3 (moyenne à 420) a révélé que le décompte des cellules CD4 restait stable au 24eme mois (moyenne de 480 cellules/mm3) . Cependant aucune augmentation du nombre de CD4 n'a été constatée.
Or on a maintenant trouvé de manière inattendue que les glucocorticoïdes (ou glucocorticostéroïdes, ou encore en abrégé ci-après "GCC"), qui représentent une famille de substances médicamenteuses non équivalentes aux cyclosporines et ont classiquement des propriétés immuno- suppressives et anti-inflammatoires, sont un agent remarquablement et exceptionnellement efficace par son induction paradoxale d'un rétablissement du taux de CD4 et par là-même très vraisemblablement prévenant la survenue des infections opportunistes, de même que d'autres manifestations pathologiques associées à l'infection par le VIH. Les glucocorticoïdes, agents classiquement immuno- suppresseurs, sont utilisés en médecine clinique depuis plus de 40 ans. L'homme du métier ne pouvait pas en déduire que les glucocorticoïdes eussent pu être utilisés à des fins préventives et/ou curatives dans la lutte contre le SIDA et cela sans effets secondaires dommageables.
Haynes R.C., Jr. et Murad F. ont rappelé dans le chapitre 63 de 'Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics', 7e éd., 1985, Macmillan Publishing Company, New York, pp. 1459-1488, que l'hormone adréno- corticotrope (ou corticostimuline) est un immuno- suppresseur clinique et anti-inflammatoire. Il est en outre connu que la corticostimuline a sur les phénomènes inflammatoires et allergiques la même action sédative que la cortisone. Quant à l'action constatée des corticostéroïdes sur le sang, il est précisé en page 1471 que l'administration de glucocorticoïdes produit un très net abaissement des lymphocytes circulants, probablement plus à cause d'une redistribution des cellules qu'en raison de leur destruction. Shafer R. . et al. ont décrit dans la revue The
Lancet, pp. 934-935, (20.04.1985) les risques auxquels peut donner lieu l'administration de stéroïdes chez des patients à risque vis-à-vis de l'infection par le SIDA. Les cas relatés font état d'une très brève amélioration, immédiatement suivie après quelques jours seulement d'une aggravation de l'état avec issue fatale dans tous les cas. La conclusion de ces auteurs était qu'il faudrait éviter de prescrire des stéroïdes, parmi lesquels la prednisone a été mentionnée et testée, chez les sujets à risque en ce qui concerne l'ARC et le SIDA.
Markham P.D. et al. ont relaté dans Int. J. Cancer:37, pp.67-72 (1986) l'augmentation de l'expression du virus HTLV-III (ou VIH) par 1'hydrocortisone et d'autres hormones. Au mieux un corticostéroïde, la dexamethasone, était réputé sans effet significatif sur l'expression du virus. Ces auteurs également ont en conclusion alerté contre les risques qu'il y aurait à utiliser des hormones stéroïdes pour le traitement d'individus qui se révéleraient contaminés par le virus HTLV-III.
Becker Y. a fait dans Journal of Chemotherapy, vol. 2, No. 3, pp.152-155, (1990), une proposition de chimiothérapie anti-SIDA visant à la destruction sélective des cellules dendritiques infectées qui sont in vivo une cible pour le VIHl. L'approche de traitement proposée est assez complexe. Elle s'applique essentiellement au traitement des cellules de Langerhans de la peau et de 1 'épithélium, plus particulièrement de l'épithélium cervical et vaginal des femmes séropositives. Les moyens proposés comprennent un traitement local avec une combinaison de stéroïdes et d'AZT (azidothymidine) , avant l'apparition d'ARC ou du SIDA chez les sujets infectés traités et ensuite la restauration des cellules dendritiques au moyen de rétinoïdes administrés oralement en combinaison avec un médicament antiviral. Furth P. A. et al. ont décrit dans AIDS Research
And Human Retroviruses , vol. 6, No. 4, pp. 553-558 (1990), des expériences établissant que les glucocorticoïdes et l'état de grossesse stimulent l'expression du VIH-LTR. Le VIH Long Terminal Repeat (LTR) voit son action augmentée par les glucocorticoïdes dans des cellules de culture de tissus et par l'état de grossesse dans les tissus placentaires et utérins chez la souris transgénique. Il est suggéré par ces auteurs que la stimulation hormonale puisse influencer l'activation provirale et que l'expression placentaire du VIH-LTR puisse contribuer à la forte transmission périnatale du VIH.
Saulsbury F. . et al. ont décrit dans Southern Médical Journal, vol. 84, No. 4, pp. 431-435 (1991), les effets de la prednisone sur l'infection par le VIH. En cherchant à sonder les conséquences immunologiques d'une telle thérapie appliquée au traitement d'un certain nombre de complications de l'infection par VIH, ils notent un certain nombre d'effets cliniques positifs, mais soulignent l'absence de changements significatifs dans les concentrations en IgA ou IgM, ainsi que dans le nombre ou le pourcentage de lymphocytes CD3, CD4, CD8 ou CD19, chez tous les patients.
Poli G. et Fauci A. S. ont étudié dans AIDS Research And Human Retroviruses, vol. 8, No. 2, pp. 191- 197 (1992), l'effet des cytokines et d'agents pharmacologiques sur l'infection chronique par VIH. Ils concluent que les cytokines imπtunorégulatrices constituent un réseau complexe qui régule l'expression du VIH, au même titre que les protéines régulatrices endogènes de celui - ci, et qu'un certain nombre d'agents physiologiques et pharmacologiques différents aptes à interférer avec des événements à médiation par la cytokine, notamment des glucocorticoïdes, des antioxydants et de l'acide rétinoïque, se sont avérés, en ce qui concerne les glucocorticoïdes, augmenter profondément la replication du VIH in vitro. Il est précisé que le traitement avec des glucocorticoïdes seuls de cellules Ul infectées de façon chronique n'entraînait pas d'induction directe de l'expression du VIH, et que dans les systèmes de transfection transitoires les glucocorticoïdes se sont avérés aussi bien induire que supprimer l'expression du VIH-LTR .
Kolesnitchenko V. et al. ont enfin décrit dans AIDS Research And Human Retroviruses, vol. 8, No. 12, pp. 1977-1980 (1992) l'effet d'activation d'un stéroïde (glucocorticoïde) sur un plasmide de (VIHl)LTR- chloramphénicol acétyl transférase (CAT) . Ils en ont conclu que des traitements antistéroïdiques seraient très efficaces dans la lutte contre des tumeurs dépendantes des stéroïdes et tumeurs apparentées . Ils suggèrent alors que l'administration de glucocorticoïdes chez un sujet entraîne l'augmentation de la replication virale et qu'un traitement antistéroïdique approprié devrait pouvoir être développé pour lutter contre 1 ' infection par le SIDA/VIH1 , Laurence J. et al. rapportent dans Blood, vol. 74, No. 1 (juillet), pp. 291-297 (1989), les effets in vitro de la dexamethasone sur un plasmide de VIHl(LTR)- chloramphénicol acétyl transférase (CAT) . Selon eux la dexamethasone n'entraîne pas d'augmentation de l'action du VIH-LTR. Par ailleurs, en étudiant les effets de la dexamethasone sur des lignées cellulaires de CD4 infectées par le VIH, ils ne trouvent pas d'augmentation induite par la dexamethasone de l'expression du VIH. Dans un contexte d'activation des cellules la dexamethasone semble pouvoir empêcher l'augmentation de la replication du VIH dû à la stimulation. Leur conclusion est que, in vitro, les corticostéroïdes ne semblent pas favoriser l'expression du virus et qu'une administration aiguë in vivo de ces composés ne devrait pas avoir les effets néfastes jusqu'alors rapportés par d'autres auteurs.
Rien de ce qui a ainsi été porté à la connaissance de l'homme du métier n'antériorisait, ou même ne rendait évident un traitement et des moyens pour la lutte préventive ou curative contre des atteintes par le virus VIHl selon les caractéristiques de la présente invention. Celle-ci recouvre en effet l'administration desdits glucocorticoïdes pour la prévention du SIDA chez des patients infectés par le virus VIHl avant l'apparition des symptômes du SIDA, c'est-à-dire chez des patients sans de tels symptômes ou manifestant un ARC. Elle englobe également l'administration des glucocorticoïdes pour la prévention de l'ARC chez des patients infectés par le virus VIHl, avant apparition de l'ARC, ainsi que pour le traitement du SIDA chez les patients atteints de celui-ci. L'invention est ainsi fondée sur un nouveau concept inventif général du ressort de la thérapeutique, à savoir l'utilisation dans l'application considérée de glucocorticoïdes par ailleurs connus comme agents immuno- suppresseurs de spectre large et comme agents anti- inflammatoires.
La présente invention a ainsi pour premier objet l'utilisation d'au moins un glucocorticoïde pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement de l'infection par le VIH et la prévention du SIDA, notamment chez un patient infecté par le virus VIHl.
L'invention a également pour objet des moyens d'obtention d'un médicament pour le traitement de l'infection par le VIH, et en particulier la prévention et/ou le traitement du SIDA, notamment chez un patient infecté par le virus VIHl, caractérisés en ce qu'ils comprennent une quantité efficace dans l'application considérée d'au moins un glucocorticoïde. Ces moyens sont en particulier une composition pharmaceutique comprenant au moins un glucocorticoïde en tant que principe actif et présentée et/ou conditionnée pour le traitement de l'infection par le VIH, en particulier la prévention et/ou le traitement du SIDA.
La présente invention a ainsi également pour objet une composition pharmaceutique présentée et/ou conditionnée pour le traitement de l'infection par VIH, en particulier pour la prévention et/ou le traitement du SIDA, comprenant comme principe actif au moins un glucocorticoïde et/ou un sel ou autre dérivé pharmacologi- quement acceptable de celui-ci. Ladite composition est avantageusement sous forme de comprimés, tablettes ou pastilles, éventuellement effervescents, ou encore de solutions ou suspensions pour injections intramusculaires ou intraveineuses. Par ailleurs, au stade de la prévention de l'infection, on peut même préconiser l'emploi d'une forme topique locale de glucocorticoïde. Les formes galeniques de cette composition comportent en pratique par dose unitaire environ 1 mg à 1 g de prednisolone (ou Δ1- déhydro-cortisol) ou un équivalent pondéral, sur la base de l'effet pharmacologique anti- inflammatoire, de tout autre glucocorticoïde naturel ou synthétique ou de leurs différents sels. L'homme du métier est à même de déterminer un tel équivalent pondéral en s ' appuyant sur le tableau d'équivalence publié par Goodman et Gilman dans "The Pharmacologie Basis of Therapeutics", 8ème édition, p. 1447, Pergamon Press Publisher, New York, 1990. Des exemples non limitatifs de ces composés sont notamment: l'acétate de fludrocortisone, 1 'hydrocortisone, l'acétate d' hydrocortisone, le cypionate de cortisone, le sel de sodium du phosphate d' hydrocortisone, le sel de sodium du succinate d'hydrocortisone, le dipropionate de béclométhasone, la bêtaméthasone, le sel de sodium du phosphate de bêtaméthasone, le valérate de bêtaméthasone, l'acétate de cortisone, la dexamethasone, l'acétate de dexamethasone, le sel de sodium du phosphate de dexamethasone, le Flunisolide, la méthylprednisolone, l'acétate de méthylprednisolone, le sel de sodium du succinate de méthylprednisolone, l'acétate de paraméthasone, la prednisolone, l'acétate de prednisolone, le sel de sodium du phosphate de prednisolone, le tébutate de prednisolone, la triamcinolone, l'acétonide de triamcinolone, le diacétate de triamcinolone, 1 ' hexacétonide de triamcinolone.
Selon une forme de mise en oeuvre préférée, la présente invention comprend l'utilisation d'une quantité efficace d'au moins un composé choisi dans le groupe des glucocorticoïdes . Plus généralement les glucocorticoïdes, encore dénommés glucocorticostéroïdes, stéroïdes adrénocorticaux ou 11-oxy-corticostéroïdes, sont des stéroïdes sécrétés par la zone fasciculée de la corticosurrénale et comportent dans leur molécule un radical cétone ou alcool fixé sur l'atome de carbone en position 11. Ils constituent un groupe chimique comprenant notamment : la corticostérone, la 11-déhydrocorticostérone, la 17- hydroxycorticostérone ou cortisol ou encore hydrocortisone, et la 17-hydroxy-ll-déhydrocorticostérone ou cortisone. On connaît également des stéroïdes de synthèse comme la prednisone et la prednisolone, qui appartiennent à ce même groupe.
La prednisone (ou Δ***- -cortisone) est obtenue par déshydrogénation en positions 1 et 2 de la cortisone, tandis que la prednisolone (ou delta-hydroxycortisone) est obtenue par déshydrogénation en positions 1 et 2 de 1 • hydroxycort isone .
Selon une forme de mise en oeuvre préférée, la présente invention comprend l'utilisation d'une quantité efficace d'au moins un composé choisi dans le groupe des glucocorticoïdes . Plus avantageusement ladite quantité efficace consiste en des doses journalières d'environ 1 mg à 1 g de prednisolone ou d'une dose d'effet anti-inflammatoire pharmacologiquement équivalent d'un quelconque autre glucocorticoïde naturel ou synthétique. Ces doses peuvent selon la voie employée, l'état du patient et le produit utilisé varier dans le temps et être admministrées suivant une posologie comprenant une administration en une seule ou plusieurs fois par jour, par semaine ou par mois, de préférence le matin. Ainsi une dose quotidienne telle que mentionnée ci-dessus peut être elle-même remplacée par toute autre chronologie et/ou dose d'administration du composé actif (administration hebdomadaire, mensuelle, trimestrielle) dans la mesure où la galénique du principe actif ainsi administré procure un effet pharmacologique sensiblement similaire à celui obtenu avec une administration quotidienne.
Les glucocorticoïdes peuvent être administrés par les voies orales, parentérales, par exemple intraveineuse, la préférence allant à la voie orale.
Les glucocorticoïdes peuvent être administrés conjointement avec un support ou vecteur ou un diluant physiologiquement acceptable pour former ainsi une composition pharmaceutique. De telles compositions contiennent avantageusement plus de 0,1% en poids d'au moins un glucocorticoïde et peuvent être préparées par des techniques classiques permettant leur formulation dans des formes galeniques classiques, par exemples des comprimés, des capsules, des dragées, des poudres dispersables, des sirops, des élixirs, des suspensions ou des solutions, des gouttes, des nébulisations, des suppositoires. Des diluants ou des charges pharmaceutiques appropriés comprennent par exemple l'eau, des alcools, des huiles ou cires naturelles ou durcies, des carbonates de calcium ou de sodium, du phosphate de calcium, du kaolin, du talc et du lactose, ainsi que des agents conservateurs appropriés, tels que par exemple de 1•hydroybenzoate de méthyle, des agents de mise en suspension, comme la méthyl cellulose, la gomme adragante et l'alginate de sodium, des agents mouillants, tels que la lécithine, le polyoxyéthylène stéarate et le monooléate de polyoxyéthylène-sorbitan, des agents de granulation et/ou de désintégration tels que l'amidon et l'acide alginique, des agents de cohésion, tels que l'amidon, la gélatine et la gomme arabique, et des agents lubrifiants comme le stéarate de magnésium, l'acide stearique et le talc. Les compositions sous forme de comprimé peuvent être revêtues par des techniques connues, afin que soient différées la désintégration du comprimé et l'absorption du principe actif dans le tractus gastro-intestinal et que soit ainsi procurée une action prolongée sur une longue période. Les formes intramusculaires peuvent être conçues par les techniques habituelles, connues de l'homme du métier, de façon à libérer le principe actif sur un temps prolongé. Une forme préférée est représentée par les formes pour administration per os que sont les gouttes et les comprimés.
Bien qu'elle soit décrite ci-dessus et plus loin en relation avec les glucocorticoïdes, la présente invention englobe naturellement aussi tous les équivalents techniques et pharmacologiques de ceux-ci.
L'homme du métier est apte à déterminer dans chaque cas d'espèce si un composé est ou non un équivalent des glucocorticoïdes en recourant à des essais de routine et en procédant si nécessaire de manière itérative, de préférence sur la base des indications et des propositions de méthodes fournies ci-après.
L'invention est décrite plus en détail dans les modes de mise en oeuvre concrets donnés à titre d'exemples illustratifs ci-après, qui ne la limitent aucunement et dans lesquels, sauf mention contraire, les posologies du principe actif sont rapportées au poids corporel. Les essais pharmacologiques effectués relatés plus loin correspondent à l'indication thérapeutique susdite et sont complétés par les figures annexées, dans lesquelles:
- Fig. 1 représente des graphes montrant le sauvetage de cellules T CD4+ par des glucocorticoïdes d'une mort cellulaire induite par activation, provoquée par VIHl.
- Fig. 2 représente des graphes montrant les effets de marqueurs d'activation de PBMC infectées de façon aiguë par VIH et stimulées par PHA ou l'antigène soluble du virus de l'influenza A.
- Fig. 3 représente des graphes montrant les numérations de cellules T CD4+ et T CD8+ de sang périphérique de patients séropositifs pour VIHl avant et sous traitement à la prednisolone (PDN) , ainsi que les niveaux de marqueurs immunologiques et virologiques sous traitement par PDN.
Interventions thérapeutiques
Patients et Méthodes
Patients:
Vingt-sept individus répondant aux critères suivants ont été enrôlés dans l ' étude: séropositivité par VIHl déterminée par méthodes immuno-enzymatiques ELISA et Western Blot ; âge entre 20 et 60 ans ; classe II (asymptomatique) ou classe III ( lymphadénopathique ) selon les Centres de contrôle et de prévention des maladies (Centers of disease control and prévention, en abrégé CDC) ; numération des lymphocytes CD4 sanguins entre 200 et 600/cm3 ; absence d ' état de grossesse en cours; absence de contre-indications à une thérapie par glucocortico- stéroïdes (diabètes , ulcères gastrique ou duodénal , affection psychiatrique sévère, hypertension artérielle : tension diastolique > 90 mm de Hg, tension systolique > 150 mm de Hg, infection par mycobacterium présente ou passée), absence de thérapie antérieure par glucocortico- stéroïdes. Un traitement par la Zidovudine (ZDV) n'était pas un critère d'exclusion pour la participation au traitement, s'il avait été effectué plus de six mois avant l'inclusion dans le test. Tous les patients ont été complètement informés à titre confidentiel sur les glucocorticostéroïdes utilisés, en pratique la prednisolone, y compris quant aux effets secondaires possibles et au déroulement du traitement-test. Tous ont donné leur propre accord par écrit. Les patients avaient le choix de stopper le traitement à tout moment, mais ils ont été avisés de ce que dans un tel cas ils devraient encore prendre de la prednisolone à un taux décroissant pendant trois semaines.
Traitement:
On a administré par voie orale à chacun des patients susdits de la prednisolone (ci-après en abrégé PDN) (commercialisée sous la dénomination Solupred par la société Laboratoire Houdé, Puteaux, France) à la dose journalière de 0,5 mg/kg (c'est-à-dire plus précisément dans ce cas: 25 mg pour des individus pesant de 46 à 55 kg, 30 mg pour ceux pesant entre 56 et 65 kg, 35 mg pour ceux pesant 66 à 75 kg, et 40 mg pour ceux pesant entre 76 et 85 kg), en une prise avant le petit-déjeuner. A titre de préccaution, des traitements y ont été associés, sous la forme d'un apport complémentaire de potassium, à raison de 1200 mg par jour (produit commercialisé sous la dénomination Diffu K, par le Laboratoire Delagrange,
Chilly Mazarin, France) et d'une prophylaxie de la pneumonie à Pneumocystis carinii par les produits de dénominations Sulfaméthoxazole (800 mg) et Triméthoprime (160 mg) (associés dans la préparation commercialisée sous la dénomination Bactrim forte par Laboratoire Roche, Neuilly-sur-Seine, France), per os trois fois par semaine. En cas de douleurs gastriques, il a été prescrit aux patients du produit de DCI Sulcrafate (commercialisé sous la dénomination Ulcar par Laboratoire Houdé, Puteaux, France), excepté pendant les trois heures suivant la prise de prednisolone. Les patients traités par ZDV ont été maintenus à leur dosage précédent pour ce produit. Il n'a pas été prescrit ou toléré d'autre médication. Le traitement par PDN a été prévu initialement pour durer 3 mois à la dose maximale. Au soixante-dixième jour de traitement en fonction de l'évolution de la numération cellulaire en CD4 et en l'absence d'effets secondaires, il a été décidé en accord avec les patients de poursuivre le traitement pour une autre période, de six mois cette fois.
Evaluation du traitement:
L'évaluation initiale a été effectuée dans les deux semaines précédant le début de la thérapie par PDN (jour 0) . Les évaluations ont ensuite été planifiées pour être réalisées aux jours 15 et 70. Dans le cas de la modification de la longueur du test, l'évaluation du traitement a également été effectuée aux jours 125 et 170.
A chacun de ces intervalles de temps on a procédé à l'évaluation comprenant les points suivants: examen clinique complet, incluant la mesure des ganglions (ou noeuds) lymphatiques, mesures de poids et de pression sanguine, chimies rénale et hépatique usuelles, numération sanguine avec phénotypes des lymphocytes CD4 et CD8 (pourcentage de lymphocytes totaux et valeurs absolues) . Pour 8 patients une caractérisation plus complète des phénotypes de lymphocytes de sang périphérique (CD19,
CD4+/DR+, CD4+/CD45RO+, CD4+/CD25+, CD8/DR+, CD8+/CD57+) a été effectuée avec des anticorps appropriés par immunofluorescence double simultanée si nécessaire. Les immunoglobulines sériques (Ig)G, A et M, ainsi que les teneurs en microglobuline β2 et en néoptérine ont également été mesurées. Aux jours 0, 15, 70 et 170 les concentrations en récepteurs de TNF-α, IL4, IL6 et IL2 soluble ont été déterminées, lorsqu'on disposait d'une quantité suffisante de sérum.
Pour les six premiers patients, la concentration sérique en particules virales et la concentration sanguine en cellules infectieuses ont été déterminées aux jours 0, 70 et 125.
Résultats Douze patients asymptomatiques remplissant les critères d'inclusion ont été soumis à l'expérience. Leurs caractéristiques initiales étaient les suivantes: ils se composaient de 9 hommes et 3 femmes, avec une moyenne d'âge de 34 ans (minimum: 25, maximum: 51); la voie de contamination par le virus VIH déclarée par les patients était: contacts homosexuels pour 5 patients, rapports hétérosexuels pour 4 d'entre eux (3 femmes), usage de drogues par voie intraveineuse pour 3. Sept patients appartenaient à la classe II CDC et 5 à la classe III CDC. Quatre patients avaient une antigenémie à la p24 détectable (No. 4: 200 pg/ml; No. 7: 160 pg/ml; No. 9: 100 pg/ml et No. 10: 350 pg/ml). Deux de ces patients (Nos. 7 et 11) ont reçu de la ZDV (à raison de 500 mg par jour) pendant plus de 12 mois. Une numération des cellules CD4 effectuée dans l'unité de recherche de la demanderesse était disponible 36 ± 3, 24 ± 3, 12 ± 2 et 4 ± l± mois avant le début du traitement par PDN chez les patients Nos. 6, 8, 9 et 11 respectivement. La numération moyenne en cellules CD4 (± écart-type) était en ces moments-là de 812 ± 424, 821 ± 392, 616 ± 228 et 552 ± 258. L'évaluation au jour 0 a été effectuée 0 à 17 jours (moyenne 4) avant l'administration de PDN. La numération moyenne des cellules CD4 au jour 0 était de 395 ± 42. Les patients ont débuté la thérapie par PDN entre le 01.07.1992 et le 17.11.1992. Evolution clinique et biologique sous prednisolone:
L'évaluation au jour 15 a été effectuée après 13 à 21 jours d'administration de PDN (moyenne 15), puis le jour 70 après 63 à 78 jours (moyenne 72), au jour 125 après 122 à 130 jours (moyenne 126) et au jour 170 après 145 à 196 jours d'administration de PDN (moyenne 170) . Tous les patients ont reçu la dose totale du traitement planifié. Aucune autre médication n'a été prise. Deux patients ont décidé de stopper la prise de PDN sans raisons médicales (patient No.l au jour 161 et patient No.
6 au jour 145) . Les sept patients de classe II CDC sont restés asymptomatiques; parmi les 5 patients de classe III CDC, la tuméfaction ganglionnaire a diminué ou a disparu chez deux d'entre eux. Le poids moyen (± écart-type) des patients n'a pas significativement changé (jour 0 = 66 ±
7 kg, jour 80: 66 ± 2 kg, jour 120: 67 ± 3 kg (P = 0,3). Quatre patients ont développé une légère hypertension (tensions diastolique et systolique respectivement entre 95-100 mm de Hg et 150-160 mm de Hg) . Un patient s'est plaint de douleurs gastriques à partir du jour 120 et a pris du Sulcrafate. Le visage d'un patient est devenu érythroïde à partir du jour 120. Les concentrations en glycémie et en potassium plasmatique sont restées normales durant tout le traitement. On n'a noté aucun autre effet secondaire.
Dans le tableau I ci-après sont résumées les évolutions de l'hémoglobine, des hématocrites, des plaquettes, des globules blancs (WBC), des neutrophiles et des lymphocytes totaux. Le taux d'hémoglobine s'est significativement accru à partir du jour 70, tandis que 1'hématocrite est resté constant; la numération des plaquettes est demeurée stable. La numération de WBC s'est significativement accrue à partir du jour 15 et est ensuite restée stable. Une augmentation significative de la numération des éléments neutrophiles a été observée dès les jours 15 et 70; celle-ci a ensuite décru jusqu'à un niveau non significativement différent (bien que supérieur) de celui observé au jour 0. Une augmentation significative de la numération des lymphocytes est apparue sous administration de PDN à partir du jour 15. Le tableau 2 ci-dessous montre l'évolution individuelle et l'évolu¬ tion moyenne des sous-populations de lymphocytes CD4 et CD8. Une très nette augmentation des cellules CD4 (valeurs absolues, ainsi que pourcentages des lymphocytes totaux) est apparue à partir du jour 15. Au contraire, la valeur absolue de la numération des cellules CD8 est restée stable, tandis que leur pourcentage diminuait significativement. Cela provenait d'une augmentation significative du rapport CD4/CD8 à partir du jour 15. Le tableau 3 ci-dessous illustre l'évolution des autres phénotypes de lymphocytes réalisés chez 8 patients. Le pourcentage de cellule CD4 DR/cellules CD4 a significativement diminué, tout comme celui de la sous- population CD8 DR. Le tableau 4 résume l'évolution des paramètres sérologiques testés. L'IgG a significativement diminué à partir du jour 70, tandis que l'IgA a commencé à décroître à partir du jour 125. L'igM est restée stable. La teneur en antigenémie p24 (pg/ml) des 4 patients positifs n'a pas changé durant tout le traitement (jour 0: 202, jour 70: 187, jour 170 (1 patient) : 180; les huit patients sans antigenémie p24 sont restés négatifs). L'évolution de la concentration sérique en particules virales, ainsi que celle de la concentration sanguine en cellules infectieuses, sont indiquées dans le tableau 4. Les deux paramètres sont restés stables pendant le traitement à la PDN.
Le tableau 5 ci-dessous illustre l'évolution des paramètres biologiques des deux patients qui ont stoppé le traitement par la PDN. De ces résultats l'on peut déduire que:
Sur les vingt-sept patients séropositifs asympto¬ matiques ayant reçu de la prednisolone (à raison de 0,5 mg/kg par jour) pendant 70 à 196 jours (médiane 91 jours), on n'a pas décelé d'effet secondaire notable ou d'événement de classe IV CDC. L'observation biologique majeure a été une augmentation très nette de la numération des lymphocytes CD4 (en valeur absolue et en pourcentage des lymphocytes totaux) et une augmentation du rapport CD4/CD8 (provenant de la stabilité de la numération des lymphocytes CD8); on a également observé un abaissement concomitant de tous les marqueurs testés d'activation immune (CD4 DR, IgG, IgA, microglobuline β2, néoptérine) . Dans le même temps, le degré d'infection virale est resté stable.
Les glucocorticostéroïdes ont été utilisés depuis des décennies pour une multitude d'états pathologiques, y compris des infections virales. Leurs effets ont été également testés chez des sujets sains. Dans ces études les glucocorticostéroïdes ont usuellement entraîné une diminution très nette de la numération des lymphocytes principalement en ce qui concernait la sous-population de lymphocytes CD4, ce qui entraînait une diminution très marquée du rapport CD4/CD8 (0,57 ± 0,07 (P < 0,0001) à 80 jours). Il a été suggéré que cette lymphopénie résultait d'une redistribution de la masse recirculante des lymphocytes extra-vasculaires. Dans deux études une augmentation temporaire (de moins de quatre semaines) de la numération des cellules CD4 a été observée, mais elle était associée à une augmentation parallèle et semblable de la sous-population des cellules CD8, ce qui avait pour résultat la stabilité du rapport CD4/CD8.
Le profil d'évolution des cellules CD4 et CD8 observé dans les présentes expériences apparaît donc original. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, on peut raisonnablement penser que les mécanismes de l'accroissement constaté de la numération des cellules CD4, sans modification notable de celle des lymphocytes CD8 et sans modification des paramètres de charge virale, seraient comme suit :
- L'explication de ce renversement de la numéra¬ tion des lymphocytes périphériques peut tenir à ce que l'action immunosuppressive des glucocorticostéroïdes interrompt les voies auto-immunes qui provoquent d'ordinaire la mort des cellules CD4.
- L'activation de tous les compartiments du système auto-immun et en particulier des lymphocytes pivots CD4 est l'indice de l'infection par VIH et l'activation des cellules CD4 peut être la cause de leur déplétion. On peut ainsi penser que l'amélioration de la numération des cellules CD4 sanguines, associée à la normalisation de marqueurs de l'activation immune (y compris les cytokines), aurait un lien, bien qu'a priori plutôt paradoxal, avec le traitement de l'infection par
VIH au moyen d'un médicament ayant un large spectre immunosuppresseur.
Les mécanismes par lesquels l'activation immune induite par VIH provoque la déplétion des cellules CD4 ne sont pas encore complètement élucidés; ils sont probable¬ ment multiples et pourraient comporter en chevauchement: a) des processus auto-immuns impliquant toutes les cellules immunes et déclenchés par l'infection au VIH; b) l'activité des cellules dendritiques follicu- laires, probablement nécessaire à la destruction des cellules CD4; c) la mort par apoptose des cellules CD4 inappropriées.
Ce dernier phénomène devrait pouvoir être considéré comme dominant. En effet la demanderesse a pu établir à son propos ce qui suit: Les lymphocytes T humains infectés par VIH donnent lieu à un suicide cellulaire apoptotique lors d'une activation in vitro par des agents mitogènes ou par des stimuli immunorégulateurs. Les glucocorticoïdes, qui sont des agents anti-inflammatoires prééminents, se sont avérés être des antagonistes de la mort cellulaire apoptotique induite par une activation, dans les thymocytes de souris et les hybridomes de cellules T. Il est ainsi démontré selon la présente invention que des doses pharmacologiques de glucocorticoïdes (ou GCC) sont efficaces non seulement pour sauver des cellules T CD4+ d'une apoptose provoquée par VIHl in vitro, mais également pour empêcher une déplétion apoptotique des CD4 chez des patients infectés par VIHl. Dans un système de culture, les GCC à des doses anti-apoptotiques ne bloquaient pas les signaux d'activation cellulaire dépendants de 1'interleukine-2 et n'avaient pas non plus d'effet sur une infection et une replication virales. Dans une étude pilote sur 50 individus séropositifs pour VIHl asymptomatiques (numéra- tion des cellules CD4 initiale > 200) traités quotidienne¬ ment avec de la prednisolone (0,5 mg/kg) , on a trouvé qu'une rapide augmentation (en 2 semaines) de la numéra¬ tion des cellules CD4 était associée à une nette diminution de la proportion de cellules T apoptotiques lors d'une activation in vitro, bien que demeurent inchangés la réactivité des cellules T et le degré d'infestâtion virale. Ces effets se maintenaient après 120 jours de traitement. Les résultats ainsi obtenus constituent une nouvelle approche pour le traitement de l'infection par VIHl.
L'essentiel des résultats est représenté sous forme de diagrammes schématiques sur les figures 1 à 3 des planches de dessins ci-annexées.
Dans ces planches de dessins: Fig. 1 représente sous forme de diagrammes le sauvetage de cellules CD4+ T de la mort cellulaire induite par activation provoquée par VIHl.
Fig. 2 représente sous forme de graphes les effets des glucocorticoïdes sur des marqueurs d'activation de PBMC infectées de façon aiguë par VIH.
Fig. 3 représente sous forme de diagrammes des numérations cellulaires de sang périphérique de patients séropositifs pour VIHl. L'apoptose, qui est une forme de mort cellulaire fondamentalement différente de la mort cellulaire pathologique aiguë (appelée communément "nécrose") est jusqu'ici reconnue comme représentant un important test physiologique auquel répondent la plupart des cellules aussi bien des tissus en développement que des tissus à maturité. Le suicide cellulaire induit par une activation et dû à l'apoptose a été identifié comme étant un mécanisme de mort cellulaire auquel sont soumis les lymphocytes T humains infectés par le virus d'immunodéficience humaine de type 1 (VIHl) tant in vitro que in vivo. D'autre part des données provenant d'études récentes ont souligné que les ganglions lymphatiques étaient des sites privilégiés pour une interaction cellulaire d'immunisation contre VIH sur toute la période de latence clinique. Il est donc plausible qu'une mort cellulaire apoptotique inappropriée induite par le virus ait lieu dans les tissus lymphoïdes, contribuant ainsi à la destruction progressive de la masse de cellules T CD4+ durant l'infection. Il est ainsi apparu utile de pouvoir bloquer l'apoptose dynamique chez des sujets séropositifs vis-à-vis de VIH, afin de restaurer autant que faire se peut un état d'équilibre cinétique normal dans lequel la production de CD4 soit équivalente à leur destruction.
Bien que les stratégies destinées à supprimer le virus dans le corps soient a priori les meilleures voies pour l'élimination de l'infection, les médicaments antiviraux tels que la zidovudine (AZT) se sont avérés décevants, du fait du développement rapide et de la fréquence croissante d'apparition de souches virales résistantes aux médicaments. Ainsi, des médicaments ayant pour cible le processus de mort pathogène des cellules T par apoptose déclenchée par VIHl semblent constituer une autre approche pour la prévention de la perte progressive de cellules T CD4+.
Ainsi qu'on l'a montré plus haut, les gluco- corticoïdes, qui sont les agents anti-inflammatoires les plus largement utilisés ayant des potentiels vitaux de protection du corps contre de nombreux types de stimuli nuisibles, se sont avérés être aptes à sauver les thymocytes murins et les hybridomes de cellules T d'une mort cellulaire induite par une activation, bien que les GCC seuls provoquent une apoptose de ces cellules en l'absence de stimulateurs. Etant donné que les lymphocytes T circulants des patients infectés par VIH subissent une apoptose lors d'une stimulation médiée in vitro par des agents mitogènes ou le récepteur des cellules CD3/T (TCR) , il convenait d'examiner si les GCC étaient efficaces pour inhiber l'apoptose induite par une activation dans les cellules T humaines infectées par VIHl.
Pour ce faire, on a tout d'abord utilisé des cellules mononucléaires de sang périphérique frais (PBMC) fortement infectées (in vitro) par VIHl pour évaluer l'effet des GCC sur la mort cellulaire apoptotique. Après inoculation de PBMC de donneur avec du virus primaire, on a ajouté de l'hydrocortisone ou de la prednisolone aux cellules infectées par VIHl en même temps que les cellules étaient stimulées avec de la phytohémagglutinine (PHA) ou un anticorps monoclonal pour CD3 (anti-CD3). Les GCC inhibaient très fortement la mort cellulaire par apoptose induite par activation (Fig. la). L'analyse des cellules non traitées par GCC recueillies finalement par cytométrie par écoulement a révélé une perte très préoccupante de la fraction du phénotype de CD4 (Fig. lb), comme le laissait prévoir un enrichissement de près de 90% du phénotype des CD8, ce qui indique une réelle perte de cellules T CD4+ par apoptose, plutôt que la possibilité d'une régulation négative de l'expression des cellules CD4 de la surface des cellules. Cela a été confirmé par des expériences utilisant des cellules T CD4+ purifiées (> 99%) par sélection positive.
Selon l'invention, une telle déplétion agressive des lymphocytes CD4+ T par le virus est apparue réellement bloquée par les GCC (Fig. lb) . Cette activité de blocage de la mort cellulaire était dépendante de la dose et se range bien dans les intervalles de concentrations pharmacologiques des GCC (Figs. le et ld) . Bien que les thymocytes et les hybridomes de cellules T non stimulés aient donné lieu à une apoptose après traitement avec des GCC, il s'est avéré que les GCC ne peuvent induire une apoptose dans les PBMC humaines quiescentes (voir Figs. la et lb) . La cyclosporine A (CSA), puissant agent immuno- suppresseur, peut bloquer la mort cellulaire apoptotique à un stade initial par suppression des signaux d'activation. Dans les expériences effectuées qui seront relatées plus loin, l'effet anti-apoptotique observé de la CSA sur les PBMC infectées par VIH (Fig. 1) est apparu associé à son aptitude sélective à bloquer l'activation/prolifération dépendante de 1*interleukine-2 (IL2) des cellules T, comme l'ont montré une inhibition à 50% tant de la transformation cellulaire (Fig. 2al) que de l'expression du récepteur d'IL2 (Fig. 2a2), ainsi qu'une suppression de 90% de la fixation de la [3H]-thymidine (Fig. 2a3 et 2a4) dans des lymphocytes T stimulés avec de la lectine (PHA) ou de l'antigène de rappel (influenza A) traités avec de la CSA. Au contraire, des doses anti-apoptotiques de GCC ne supprimaient pas significativement ces marqueurs d'activation dans les PBMC stimulées par la lectine ou l'antigène de rappel (Fig. 2al à 2a4). Ainsi, le sauvetage par les GCC des cellules CD4 qui auraient sinon subi une mort cellulaire induite par une activation résulte très vraisemblablement d'un processus dans lequel les GCC interfèrent plus directement avec le signal intracellulai¬ re apoptotique, plutôt que de l'altération des signaux cellulaires dirigés vers les stimuli antigéniques ou régulateurs .
Dans les cellules subissant une apoptose, l'ADN est dégradé en oligomères correpondant à des fragments de la taille d'un oligonucléosome, révélés par un schéma (tracé) de dégradation d'ADN en multiples de 200 paires de bases (dénommée fragmentation) . Une électrophorèse sur gel d'ADN de PBMC fortement infectées par VIHl à la suite de l'activation avec de l'anti-CD3 présentait un tracé caractéristique correspondant. Lorsque soit le stimula¬ teur, soit le virus étaient enlevés, l'ADN cellulaire ne produisait plus de caractéristique discernable d'un tel tracé d'ADN dégradé, ce qui suggérait que l'apoptose dépende tant de l'activation que de l'infection. La fragmentation de l'ADN n'est pas apparue lorsque la cyclosporine A ou l 'hydrocortisone/prednisolone était ajoutée au moment de l'activation. L'addition de GCC deux à six heures après activation maintenait la suppression de la fragmentation de l'ADN (Fig. 2b). Au contraire, lorsque la CSA était ajoutée aux celllules deux heures après l'activation, elle n'empêchait pas la fragmentation de l'ADN (Fig. 2b). Ces observations étayent le point de vue selon lequel les GCC régulent la mort cellulaire apoptotique à un point d'action se situant après son initiation.
Malgré l'absence de diminution significative de transformation cellulaire dépendante de l'iL2, la stimulation par anti-CD3 des celllules T CD4+ infectées par VIHl traitées avec de la prednisolone ne provoquait pas de prolifération cellulaire (méthode à la [3H]- thymidine) . Les GCC présentaient un effet anti-apoptotique sur les cellules infectées sans moduler en quoi que ce soit l'aptitude à la réponse des cellules. Ainsi, le processus de sauvetage des cellules CD4 de l'apoptose par GCC n'est pas impliqué dans l'altération du signal de prolifération intracellulaire.
Ayant ainsi montré que les GCC suppriment efficacement l'apoptose induite par une activation dans des PBMC primaires infectées de façon aiguë par VIHl, on se posait encore la question de savoir si de tels effets anti-apoptotiques peuvent être attribués ou associés à un impact potentiel des GCC sur la régulation virale. Une réaction en chaîne par polymérase (PCR) quantitative a démontré que, bien que la PBMC soit apparue être infectée par un nombre égal de copies d'ARN de VIH, l'ARN génomique total de VIH (incluant les formes extrachromosomiques et le provirus intégré) était fortement abaissé (de 10 à 100 fois) par un prétraitement des cellules avec de la CSA, ce qui indiquait un blocage de la transcription inverse virale. Toutefois, cela ne s'est pas produit lorsque la prednisolone a été utilisée pour prétraiter les cellules. Des déterminations virales quantitatives à la fois de la protéine de core virale p24 et de la production d'ARN associé au virion ont révélé que les GCC ne conféraient pas une régulation significative aux cinétiques de replication virale, alors que la CSA révélait une inhibition notable (> 10 fois) de la production virale. On n'a pas non plus observé d'inhibition de la production de protéine p24 de VIH avec des cellules CD4 infectées par VIH traitées par la PDN.
A condition qu'une inhibition apparente de la transformation et de la prolifération des lymphocytes T dépendants de l'lL2 ait été atteinte par prétraitement des cellules avec la CSA, il est concevable que les effets observés de la CSA sur les cinétiques de transcription inverse virale et de replication virale soient la conséquence de son effet pharmacologique bien connu sur l'empêchement de l'activation cellulaire qui est requise pour que s'accomplissent la transcription inverse virale, l'intégration d'ADN proviral et la production de virus de descendance. Au contraire, les GCC, qui présentent peu d'effets sur l'activation in vitro (voir Fig. lb) , n'ont aucune influence sur l'infection des PBMC par le virus.
Ayant ainsi démontré que les effets anti- apoptotiques des GCC étaient indépendants de l'activation cellulaire et de la replication virale dans des lymphocytes T infectés de façon aiguë par VIH, on a en outre recherché si les GCC pouvaient également empêcher l'apoptose des cellules T CD4+ naturellement infectées. D'après une observation précédente, la déplétion majeure des CD4 dans toute culture donnée de PBMC infectées de façon aiguë par VIH est associée à un pic de production virale. Par conséquent, une évaluation a été faite des effets des GCC sur la déplétion des CD4 (ex vivo) des PBMC infectées naturellement durant le pic de production virale. Là encore, les GCC se sont révélés aptes à éviter l'apoptose de cellules T CD4+ infectées naturellement, prélevées sur 5 individus différents à séropositivité due à VIHl, asymptomatiques. Ni la transformation cellulaire associée à l'IL2, ni la production virale n'étaient influencées significativement par les GCC.
De même que les PBMC infectées in vitro, les PBMC de patients stimulés par anti-CD3 ont donné lieu à une déplétion apoptotique des CD4 d'une manière dépendante de la charge en virus. Tout comme l'ont montré les essais in vivo relatés plus haut, de fortes concentrations en cellules sanguines portant du VIHl infectieux correspondent à une déplétion rapide de la numération en cellules T CD4+ périphériques. Dans des PBMC de patients non stimulés, on a observé un niveau d'apoptose plus élevé que dans les PBMC infectées de manière aiguë. La mort cellulaire apoptotique a atteint 20% des cellules CD4 dans 3 cas (patients 1-3) avec la charge virale la plus élevée, contre seulement 7% et 5% dans les deux cas (patients 4 et 5) avec la charge virale moindre. Cela peut être le reflet de la fraction des lymphocytes T CD4+ activés in vivo subissant l'apoptose spontanément dans des PBMC exprimant l'ARN viral, du fait que les GCC n'ont pas d'effet anti- apoptotique lorsqu'ils sont ajoutés à une culture produisant déjà de la protéine p24 virale. Cela est d'autant plus vrai que le pourcentage du phénotype DR+ (qui est un marqueur d'activation in vivo) dans la population de cellules T CD4+ était plus élevé chez les patients 1-3 (40%, 48% et 37%) que chez les patients 4 et 5 (13% et 17%) . Cette apoptose spontanée des cellules T des patients procure une explication pour l'observation selon laquelle le sauvetage des cellules CD4 de l'apoptose par les GCC est apparue être moins efficace dans les cellules infectées naturellement que dans les PBMC infectées de façon aiguë.
Si une apoptose déclenchée par VIH était bien impliquée dans la déplétion progressive des CD4 pendant la période de latence clinique, il convenait alors de vérifier si le traitement de patients cliniquement latents, mais biologiquement actifs avec des GCC les aide à restaurer leur pool ou capital de CD4 et à préserver la fonction normale des cellules T. On a donc élaboré une étude pilote pour évaluer les effets anti-apoptotiques d'une prise journalière de glucocorticoïdes (dans l'exemple relaté ci-desous, de la prednisolone, PDN) à raison de 0,5 mg/kg. L'étude a porté sur 50 individus asymptomatiques séropositifs pour VIHl (30 au stade II CDC et 20 au stade III CDC; numération des cellules CD4: 426 ± 145/μl, 207 - 775/μl); voir Fig. 3 et légende.
En contraste flagrant avec les effets connus des
GCC (qui entraînent d'ordinaire une lymphocytopénie en T CD4+ chez l'humain normal), on a observé un accroissement étonnant de la numération cellulaire en CD4, sans modification de la sous-population de CD8, au 15eme jour aussi bien qu'au 120ème jour (voir Figs. 3a et 3b). On a noté une numération accrue en cellules CD4 (20-200%) chez 36 des 50 sujets (soit 72%) après 15 jours et chez 29 sur 44 (68%) après 120 jours de traitement, tandis qu'une diminution d'au moins 20% de la numération des CD4 a été observée dans 5 cas(10%) au ÎS6111® jour et dans 4 cas (9%) au 120®me jour (Figs. 3a3 et 3a4). Sur les 5 patients manifestant une diminution de plus de 20% de la numération des CD4 après 15 jours, 4 ont été l'objet d'un suivi à 120 jours et un seul est resté avec une numération des cellules CD4 abaissée de plus de 20%. Cliniquement tous les patients restaient asymptomatiques pendant toute la période de traitement. Seul l'un d'entre eux, qui a souffert de troubles gastriques, a été retiré du traitement par la PDN un mois après le début de celui-ci. Sur les 20 sujets montrant une lymphadénopathie généralisée persistante (en abrégé LGP) au stade III CDC, le renflement nodal a diminué (< 1 cm) ou disparu chez 6 sujets (30%) vers le 15ème jour (P = 0,014) et chez 14 (70%) vers le 120eme jour (P < 0,001). Aucun des 30 sujets sans LGP initiale (stade II CDC) n'est parvenu à un stade III CDC. Il n'est pas apparu de différence dans l'augmentation des CD4 entre les 11 patients recevant de l'AZT (500 mg/d) avant et pendant le traitement par PDN et les 39 autres, qui ne recevaient pas d'AZT.
Pour établir mieux encore le mécanisme qui est à la base de l'action in vivo des GCC et de leurs équivalents pharmacologiques, on a procédé à une évaluation plus précise des effets anti-apoptotiques, immunologiques et virologiques des GCC, sur l'exemple de la PDN, sur les échantillons sanguins de 27 des 28 sujets consécutifs (les cellules n'étaient pas disponibles pour un patient) ayant atteint les premiers le 120eme jour de traitement par PDN. Comme on peut le voir sur la Fig. 3bl, le profil de l'accroissement des cellules CD4 sous GCC était identique pour la totalité de la population de patients étudiée, tandis que la numération inchangée des cellules T CD8+ se traduisait par un accroissement du pourcentage des celllules CD4. Dans un système de culture de cellules sur une durée d'une nuit, on a observé une nette diminution de la proportion de PBMC apoptotiques, vis-à-vis d'une stimulation par anti-CD3 in vitro aux deux intervalles de temps où a eu lieu une détection par un examen fondé sur une cytométrie par écoulement (P < 0,001) ou par test classique de fragmentation d'ADN (P < 0,001) (Fig. 3b3). Tout comme avec les résultats in vitro, les effets anti-apoptotiques in vivo se sont produits sans inhibition singificative des signaux d'activation cellulaire (Fig. 3b4) et ne sont pas apparus avoir d'effet régulateur sur l'activité du virus (Fig. 3b5) . Bien que la concentration absolue en virions (déterminée par PCR) soit restée inchangée dans les sérums des patients, on a observé une diminution significative de la concentration en protéine de core p24 de VIH du sérum (par la méthode ELISA) chez les 12 patients traités par PDN (dont 2 recevaient de l'AZT), avec une antigenémie moyenne initiale en p24 (moyenne ± ET: 301 ± 101 pg/ml au début; 174 ± 60 pg/ml au jour 15, P = 0,041; 166 ± 50 pg/ml au jour 120, P = 0,021), tandis que les patients qui étaient initialement négatifs pour l'antigène sérique p24 restaient négatifs sous PDN.
Il n'était pas surprenant que les pourcentages de sous-population de DR+ et de CD25+ dans les CD4 (Fig. 3b4) et les niveaux d'IgA sérique (3 ± 1,9 g/1 au jour 0 et 2,9 ± 2 g/1 au jour 120) et d'IgG sérique (23,3 ± 9,7 g/1 au jour 0 et 17,9 ± 6,6 g/1 au jour 120) aient tendu vers une normalisation (P < 0,05), car ces modifications cellulai¬ res et humorales représentent très vraisemblablement des effets d'immunorégulâtion secondaire in vivo des GCC, dont les causes restent en fait inconnues à ce jour. Toutefois la fraction d'ensemble de la mémoire des cellules T CD4+ (CD45RO+) n'était pas significativement affectée par les GCC (Fig. 3b4), ce qui indiquait une augmentation proportionnelle du sous-groupe de mémoire dans la population de CD4 restaurée par GCC. Afin de déterminer quels étaient les effets des GCC sur les réponses prolifératives des cellules T chez les patients traités, on a procédé à un dosage de la fixation de [3H]-thymidine des lymphocytes T en réponse à une liaison du complexe TCR/CD3 chez les 27 sujets consécutifs et à l'antigène soluble du virus de l'influenza A chez 13 patients (du fait d'un manque d'échantillons de cellules pour les 14 autres) . Il n'est pas apparu d'inhibition significative de la prolifération des cellules T pour les deux stimuli après 15 et 120 jours d'administration de PDN (à raison de 0,5 mg/kg, quotidiennement) (Fig. 3b6) . Cependant, parmi les 2/27 (7%) patients ne donnant initialement pas de réponse à la liaison d'anti-CD3 et les 3/13 (23%) ne donnant initialement pas de réponse à l'antigène de rappel d'influenza (les 2 ne répondant pas à l'anti-CD3 étaient aussi des non-répondants à l'influenza), on a constaté avec surprise une augmentation concordante de la fixation de [3H] -thymidine (> 1000 coups/min) chez les 3 patients sous PDN, mais aucun des 25 répondant à l'anti-CD3 et aucun des 10 répondant à l'influenza ne sont devenus des non-répondants sous PDN. Il était surprenant qu'une telle réponse proliférative restaurée ait été associée à une augmentation notable (> 100%) du phénotype de mémoire total CD45RO+ T et CD45RO+/CD4+ dans les PBMC de ces 3 patients. Cela suggère un effet potentiel des GCC sur l'inversion de l'anergie des cellules T chez les patients infectés par VIH par préservation des populations de cellules T de mémoire.
Les résultats relatés ci-dessus démontrent que les GCC sont des agents qui sont capables de: 1) sauver les cellules T CD4+ d'un suicide cellulaire apoptotique provoqué par VIHl par une activation cellulaire avec médiation par la lectine ou CD3/TCR in vitro;
2) diminuer la déplétion apoptotique chez les patients infectés par VIHl.
Bien que les cellules T CD8+ des individus séropositifs pour VIHl se soient également avérées subir une apoptose lors de la liaison de TCR/CD3 in vitro, ce qui a été démontré plus haut souligne que la destruction de cellules T induite par VIHl est essentiellement restreinte aux cellules CD4 aussi bien in vitro que in vivo. Les effets étonnants des GCC sur la numération des CD4 des patients infectés sont en accord avec le raisonnement selon lequel l'apoptose provoquée par VIH est un processus actif qui prend place dans les organes lymphoïdes et gouverne la déplétion progressive des CD4 constatée tout au long de l'infection, ce qui amène à la nouvelle perspective selon laquelle la destruction pathogène in vivo des cellules T CD4+ induite par le virus peut être atténuée par le traitement des patients infectés avec des agents anti-apoptotiques spécifiques, tels que les GCC.
Les résultats représentés sur les figures 1 à 3 sont commentés ci-après, avec dans chaque cas indication de la méthode par laquelle ils ont été obtenus:
- Fig. 1 montre:
Fig. la: le % de mortalité cellulaire (1 - rapport des cellules viables aux cellules initiales),
Fig. lb: le % de cellules T CD4+ viables dans des PBMC infectées de façon aiguë par VIH et activées par PHA ou anti-CD3, dans chaque cas en présence ou en 1'absence de cyclosporine A, d'hydrocortisone et de prednisolone.
Fig. le: le % de mortalité de CD4 (1 - % de CD4 viables témoins), Fig. ld: % de mortalité cellulaire totale (1 - % de PBMC viables témoins) dans des PBMC infectées de façon aiguë par VIH et activées par anti-CD3, dans chaque cas en présence des concentrations indiquées de cyclosporine A, d'hydrocortisone et de prednisolone. Les données représentent la moyenne ± ET
(écart-type) de mesures faites en triple. Les cellules non-infectées cultivées en parallèle ont servi de témoin.
Méthodes: Des PBMC ont été fraîchement séparées par centrifugation avec gradient de densité Ficoll-Hypaque à partir de sang héparinisé de donneurs normaux négatifs pour VIH. Les cellules (2 x 10^) ont été incubées avec des isolats de VIHl primaires pendant 2 heures à une multiplicité d'infection (MOI) de 2 x 10"4 unités de virus infectieux par cellule (suivant la distribution de Poisson, une unité infectieuse correspond à 63% de cultures positives pour une dilution donnée de stock viral), qui correspond à 1% de cellules poisitves à l'ADN de VIHl (dosage par réaction d'amplification par polymerase ou PCR) dans des PBMC inoculées par analyse quantitative de cellules diluées en série (méthode de dilution limitante) . Au début des expériences, lorsque des unités de MOI identiques de différents isolats primaires étaient utilisées pour infecter les PBMC, on a observé une replication virale et une cytopathicite semblables quels que soient les stades cliniques des patients sur lesquels le virus avait été isolé. Ainsi, il n'a pas été fourni d'information sur les virus primaires particuliers utilisés dans cette étude. Les cellules avec ou sans virus inactivé à chaud (56°C, 40 min) ont servi comme témoins négatifs. Après infection, les cellules ont été lavées trois fois et ont été mises en culture pendant une nuit avec du milieu seul, de la phytohémagglutinine (PHA) (10 μg/ml) ou de l'anticorps monoclonal anti-CD3 (anti-CD3)
(0,5 μg/ml) en présence ou en l'absence de cyclosporine A (1 μg/ml), d'hydrocortisone (10 μg/ml) et de prednisolone
(10 μg/ml) . Les conditions de culture ont été décrites par
Lu W. et Andrieu J.M. dans J. Virol. 66, 334-340 (1992).
Après un lavage additionnel pour éliminer les stimulateurs, les cellules ont été cultivées pendant encore 3 jours en présence ou en l'absence des substances indiquées plus haut, et ensuite récoltées pour le comptage des cellules viables par le test au colorant d'exclusion au bleu trypan. Le pourcentage de cellules CD4+ dans la population cellulaire finale a été analysé par cytométrie par écoulement (FACScan, Becton, Dickinson, Mountain View, CA) après réaction avec un anticorps monoclonal marqué par fluorescence pour CD4 (Leu-3a) .
- Fig. 2 montre: Fig. 2a: les effets des glucocorticoïdes sur des marqueurs d'activation de PBMC infectées de façon aiguë par VIH et stimulées par PHA ou de l'antigène du virus soluble de l'influenza A. Les résultats représentent la moyenne ± ET de mesures faites en triple: 2al: des % de lymphoblastes transformés (cellules blastiques), 2a2: des % de cellules positives au récepteur d'interleukine 2 (IL2), 2a3: de la fixation de [3H]-thymidine à la PHA, 2a4: de la fixation de [3H]-thymidine à
1'influenza, dans la population finale de cellules.
Figs. 2b: % moyen d'ADN fragmenté (rapport entre
ADN de faible masse moléculaire et ADN nucléosomique de masse moléculaire élevée) ± ET à partir de cultures faites en triple, auxquelles la cyclosporine A ou les glucocorticoïdes ont été ajoutés respectivement immédiate¬ ment, 2h ou 6h après la stimulation avec de l'anti-CD3.
Méthodes: - Pour 2a: Des PBMC ont été infectées avec du VIHl et activées avec de la PHA ou de l'antigène de virus de l'influenza A (10 μg/ml) en présence de différentes concentrations de cyclosporine A et de glucocorticoïdes comme indiqué sur la légende ci-dessus pour la figure 1. Après encore 3 jours de culture, on a procédé à une numération des cellules blastiques dans un hémocytomètre et les cellules positives pour le récepteur IL2 ont été évaluées par cytométrie par écoulement après leur traitement avec un anticorps monoclonal directement marqué pour fluorescence pour le récepteur d'IL2 (CD 25). On a déterminé la prolifération cellulaire par la technique de la fixation de [3H]-thymidine. A la fin de la culture on a ensemencé 10**** cellules en triple sur des plaques de microculture à 96 alvéoles et puisé avec 1 μCi de [3H]- thymidine pendant 24 heures. Les cellules ont ensuite été récoltées sur des fibres de verre et la [3H]-thymidine incorporée pendant la synthèse de l'ADN a été soumise à un comptage dans un compteur à scintillation pour liquide. Les PBMC seules, seulement stimulées avec de la PHA ou de l'influenza, incubées avec VIHl et stimulées avec de la PHA ou de l'influenza en l'absence des substances susdites, servaient de témoins.
- Pour 2b: Après infection des PBMC et encore 2 autres jours de culture en présence ou en l'absence des substances à activité pharmacologique susdites, les cellules ont été récoltées par centrifugation (700 x g pendant 10 min). L'ampleur de la fragmentation de l'ADN a été évaluée par modification d'une méthode connue (Terai, C, Kornbluth, R.S., Pauza, CD., Richman, D.D. & Carson, D.A., J. Clin. Invest. 87, 1710-1715 (1991) ) .En bref, les cellules ont été lysées dans 5 DM de Tris-HCl (pH 7,4) contenant 0,20% de Triton X-100 et 5 mM d'EDTA à 4°C pendant 20 min. De l'ADN de faible masse moléculaire (incluant des fragments d'ADN extrachromosomique et d'ADN dégradé) a été séparé de l'ADN nucléosomique de masse moléculaire élevée par centrifugation (5000 x g pendant 15 min) . L'ADN a été isolé à la fois du surnageant et des fractions de pastillage au moyen d'un kit de purification d'ADN du commerce. L'ADN surnageant a été soumis à une électrophorèse sur un gel d'agarose à 1% contenant 0,5 μg/ml de bromure d'ethidium à 80 V pendant 2,5 h. Pour déterminer le rapport de 1'ADN du surnageant à 1'ADN des pastilles (% d'ADN fragmenté), on a quantifié les deux fractions par spectrophotométrie. Les PBMC seules, infectées avec VIH ou VIH inactivé par la chaleur (HI) (56°C, 40 min) servaient de témoins.
- Fig. 3 montre:
Figs. 3al et 3a2: Des numérations de cellules T CD4+ et de cellules T CD8+ de sang périphérique de patients séropositifs pour VIHl, avant et sous traitement avec de la prednisolone (PDN) . Les données ont été indiquées sous la forme de la moyenne ± ET des mesures pour des patients à un (n = 35) et deux (n = 22) ans avant début d'utilisation de PDN, au début (n = 50) et aux jours 15 (n = 50) et 120 (n = 44) sous traitement par PDN.
Figs. 3a3 et 3a4: Dans les numérations susdites, le nombre de patients individuels a été utilisé pour l'analyse de la population et sa représentation en diagramme. Fig. B: Des marqueurs immunologiques et virologi- ques ont été utilisés chez 27 patients consécutifs sous traitement avec de la PDN. Des échantillons de sang provenant de 10 donneurs en bonne santé négatifs pour VIH ont servi comme témoin pour chaque essai mis en oeuvre. Les données ont été exprimées par la moyenne ± ET (Figs. 3bl à 3b4 et 3b6) ou par la moyenne géométrique ± ET (Fig. 3b5) des mesures.
Méthodes: - Pour les Figs. 3a: Cinquante sujets ont été sélectionnés et traités comme indiqué plus haut à la rubrique "Patients et Méthodes".
- Pour les Figs. 3b: L'apoptose a été évaluée aussi bien par une technique de marquage d'ADN fondée sur une cytométrie par écoulement que par la méthode de fragmentation d'ADN conventionnelle sur des cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) isolées sous gradient selon Ficoll-Hypaque et prélevées sur 27 des 28 sujets consécutifs qui atteignaient les premiers les 120 jours de traitement par PDN (les cellules n'étaient pas disponibles pour un patient) . En bref, les suspensions de cellules ont été divisées en deux parties aliquotes et les pastilles ont été, soit remises doucement en suspension dans 1,5 ml d'une solution d'iodure de propidium (PI, 50 μg/ml dans du citrate de sodium à 0,1% plus Triton X-100 à
0,1%) à 4°C dans l'obscurité, pendant une nuit, pour une cytométrie par écoulement, soit dissoutes dans du tampon de lyse hypotonique pour un examen de fragmentation d'ADN (voir plus haut la rubrique concernant la Fig. 2b) . Une caractérisâtion plus complète de la sous-population de CD4+ (DR+/CD4+, CD25+/CD4+ et CD45RO+/CD4+) a été effectuée sur les PBMC des 27 patients après 15 et 120 jours de traitement par PDN (voir plus haut les rubriques concernant les Figs. 1 et 2a). La concentration des particules de VIH a été mesurée sur les sérums des patients par la méthode de PCR par transcriptase inverse quantitative. En bref, une partie aliquote de 500 μl de chaque sérum a été mise sous forme de pastille par ultracentrifugation. L'ARN viral a été extrait, soumis à une transcription inverse et amplifié par PCR. Le signal de VIH amplifié a été quantifié au moyen de la courbe d'étalonnage obtenue avec des dilutions d'ARN dérivé de virions. L'ADN genomique de VIH a été quantifié dans une PBMC stimulée par PHA pendant une nuit (reflétant l'infection totale des cellules sanguines par le virus) et l'ARN viral a été quantifié dans une PBMC stimulée par PHA pendant 3 jours (représentant le nombre de virus s'exprimant/répliquant dans les cellules du patient). La réponse proliférative des PBMC des patients à une stimulation par anti-CD3 et l'antigène de rappel (d'influenza A) a été obtenue comme indiqué plus haut (voir rubrique concernant la Fig. 2a) . Etant donné que ces expériences ont été effectuées dans une phase avancée de la présente étude, on ne disposait pas d'échantillons de cellules pour une réponse proliférative de rappel pour 14 des 27 patients.
Tableau 1. Paramètres hematologiques sous prednisolone.
Jours de traitement par prednisolone
15 80 125 170
Nombre d<? patients- 27 27 27 11
Hémoglobine (g/dL) Moyenne±SEf: 13,9±0,3 14,2±0,2 14,3±0,3 15±0,3 1S±0.6 Probabilité* 0,164 0,035 0,059 0,083
Plaquettes f/μD Moyenne±SE: 215±11 237±11 234±12 221±22 244±39 Probabilité* 0,002 0,02 0,722 0,753
Globules blancs f/μ!_ Moyenne±SE: 5378±276 7111+408 6607±423 6709±738 6350+490 Probabilité'* <0,001 0,001 0,053 0,028
Neutrophiles (IμL) Moyenne±SE: 2750±221 ' 3919±356 3756±355 3839±609 3282±422 Probabilité* 0,001 0,002 0,051 0,173
Lymphocytes f/μ ') Moyenne±SE: 1820B-117 2302±163 2081±114 2065±212 2356±215 Probabilité* <0,001 0,004 0,062 0,028
* Les données ont été comparées entre le début et le cours du traitement La probabilité a été déterminée par le test dénommé Wilcoxon matched pair singled rank. t SE ≈ erreur type. Tableau 2. Lymphocytes de CD4 et CD8 de sang périphérique sous prednisolone.
N rc de Lymphocytes de CD4/μL % de lympliocylcs de CD4 Lympliocylcs de CD8 tμL % de lympliocylcs de CD8
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0002
Figure imgf000043_0003
Figure imgf000043_0004
Tableau 2. (Suite)
Figure imgf000044_0002
Figure imgf000044_0003
Figure imgf000044_0004
28 32 48 738 744 579 45 34 37
25 30 28 34 40
2 2 2 3 4
Figure imgf000044_0001
0,002 0.041 0,009 0,03
Figure imgf000044_0005
* Les données ont ctc comparées entre le début et le cours du traitement. La probabilité a été déterminée par le test dénomme Wilcoxon matched pair singled rank. t Patients initialement positifs pour l'antigène p24 dans le scrum (ELIS A). t patients sous zidovudinc.
Tableau 3. Phénotypes de lymphocytes de sang pe'riphéirique (PBL) sous prednisolone.
Jours sous prednisolone
80
7±1
8
0,889
85±2
8
0,049
5±1 8 0,012
34±4
5
0,041
9±2
8
Figure imgf000045_0001
0,944
* Les données ont été comparées entre le début et le cours du traitement. La probabilité a été déterminée par le test dénommé Wilcoxon matched pair singled rank. Tableau 4. Marqueurs seroiogiques de l'activation immunitaire sous prednisolone.
Jours sous prednisolone
Figure imgf000046_0001
* Les données ont été' comparées entre le début et le cours du traitement La probabilité a été déterminée par le test dénommé Wilcoxon matched pair singled rank. t Seule la concentration > 2.4 mg/L a été prise en compte. t Seule la concentration > 20 pg L a été prise en compte.
1 1 Seule la concentration > 10 nM/L a été prise en compte. Tableau 5. Antigenémie de p24 du sérum, Particules virales libres et les cellules portant le virus infectieux sous prednisolone.
Jours sous prednisolone
80
224±113 lt
1100
9
0,011
808±323
122
1
2459
27
0,882
36±20
21
6
112
5
Figure imgf000047_0001
0,715
* Les données ont été comparées entre le début et le cours du traitement La probabilité a été déterminée par le test dénommé Wilcoxon matched pair singled rank. t On a donné aux résultats négatifs la valeur 1 (sensibilité du test ELISA pour p24: 50 pg/mL).

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'au moins un glucocorticoïde pour l'obtention d'un médicament destiné au traitement de l'infection par le VIH et à la prévention du SIDA, notamment chez un patient infecté par le virus VIHl.
2. utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que le glucocorticoïde est choisi parmi l'acétate de f luorocortisone , l'acétate de déhydrocortisone, l'acétate d' hydrocortisone, le cyprinate de cortisone, le sel de sodium du phosphate d 'hydro¬ cortisone, le sel de sodium du succinate d' hydrocortisone, le dipropionate de bêtaméthasone, la bêtaméthasone, le sel de sodium du phosphate de bêtaméthasone, le valérate de bêtaméthasone, l'acétate de cortisone, la dexamethasone, l'acétate de dexamethasone, le sel de sodium du phosphate de dexamethasone, le Flunisolide, la méthylprednisolone, l'acétate de méthylprednisolone, le sel de sodium du succinate de méthylprednisolone, l'acétate de paraméthasone, la prednisolone, l'acétate de prednisolone, le sel de sodium du phosphate de prednisolone, le tébutate de prednisolone, la triamcinolone, l'acétonide de triamcinolone, le diacétate de triamcinolone, 1 ' hexacétonide de triamcinolone, ou des mélanges de ces composés .
3. Moyens pour l'obtention d'un médicament pour le traitement de l'infection par le VIH, et en particulier la prévention et/ou le traitement du SIDA, notamment chez un patient infecté par le virus VIHl, caractérisés en ce qu'ils comprennent une quantité efficace dans l'application considérée d'au moins un glucocorticoïde.
4. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un glucocorticoïde, en tant que principe actif, et présentée et /ou conditionnée pour le traitement de l'infection par le VIH, en particulier la prévention et /ou le traitement du SIDA.
5. Composition pharmaceutique selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'elle comprend comme principe actif au moins un glucocorticoïde et/ou un sel ou autre dérivé pharmacologiquement acceptable de celui-ci.
6. Composition pharmaceutique selon l'une des revendications 4 ou 5, caractérisée en ce qu'elle est sous forme de comprimés, tablettes ou pastilles, éventuellement effervescents, ou sous forme de solutions ou suspensions pour injections intramusculaires ou intraveineuses.
7. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisée en ce qu'elle comporte d'environ 1 mg à 1 g de prednisolone (ou Δ-^-déhydro-cortisol) ou un équivalent pondéral, sur la base de l'effet pharmacologique anti-inflammatoire, de tout autre glucocorticoïde naturel ou synthétique ou de leurs différents sels .
8. Composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisée en ce qu'elle comporte au moins un glucocorticoïde choisi parmi l'acétate de f luorocortisone, l'acétate de dehydrocortisone, l'acétate d' hydrocortisone, le cyprinate de cortisone, le sel de sodium du phosphate d'hydro -cortisone, le sel de sodium du succinate d' hydrocortisone, le dipropionate de bêtaméthasone, la bêtaméthasone, le sel de sodium du phosphate de bêtaméthasone, le valerate de bêtaméthasone, l'acétate de cortisone, la dexamethasone, l'acétate de dexamethasone, le sel de sodium du phosphate de dexamethasone, le Flunisolide, la méthylprednisolone, l'acétate de méthylprednisolone, le sel de sodium du succinate de méthylprednisolone, l'acétate de paraméthasone, la prednisolone, l'acétate de prednisolone, le sel de sodium du phosphate de prednisolone, le tébutate de prednisolone, la triamcinolone, l'acétonide de triamcinolone, le diacétate de triamcinolone, 1 ' hexacétonide de triamcinolone.
9. Composition selon l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisée en ce qu'elle comporte lesdits glucocorticoïdes, à raison de plus de 0,1% en poids d'au moins un glucocorticoïde, en mélange avec un support ou vecteur ou un diluant physiologiquement acceptable.
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