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Diagnosis of diseases associated with metabolism

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US20040067491A1 US10240454 US24045403A US20040067491A1 US 20040067491 A1 US20040067491 A1 US 20040067491A1 US 10240454 US10240454 US 10240454 US 24045403 A US24045403 A US 24045403A US 20040067491 A1 US20040067491 A1 US 20040067491A1
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Alexander Olek
Christian Piepenbrock
Kurt Berlin
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Epigenomics AG
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Epigenomics AG
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    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Hybridisation probes
    • C12Q1/6883Hybridisation probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703Inhibitors; Suppressors
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82Translation products from oncogenes
    • C12Q1/00Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876Hybridisation probes
    • C12Q1/6883Hybridisation probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886Hybridisation probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154Methylation markers
    • C12Q2600/00Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156Polymorphic or mutational markers


Chemically modified genomic sequences of genes associated with metabolism, to oligonucleotides and/or PNA-oligomers for detecting the cytosine methylation state of genes associated with metabolism which are directed against the sequence are disclosed. In addition, a method for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism is disclosed.


  • [0001]
    The levels of observation that have been well studied by the methodological developments of recent years in molecular biology, are the genes themselves, the translation of these genes into RNA, and the resulting proteins. The question of which gene is switched on at which point in the course of the development of an individual, and how the activation and inhibition of specific genes in specific cells and tissues are controlled is correlatable to the degree and character of the methylation of the genes or of the genome. In this respect, pathogenic conditions may manifest themselves in a changed methylation pattern of individual genes or of the genome.
  • [0002]
    The present invention relates to nucleic acids, oligonucleotides, PNA-oligomers and to a method for the diagnosis and/or therapy of diseases which have a connection with the genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism and, in particular, with the methylation status thereof.
  • [0003]
    Metabolism is the sum of chemical changes that occur in living organisms. The thousands of different chemical reactions are carried out simultaneously by a cell are closely coordinated. A variety of control mechanisms regulate the activities of key enzymes in response to changing conditions in the cell. One very common form of regulation is a rapidly reversible feedback inhibition exerted on the first enzyme by the final product of that pathway. A longer lasting form of regulation involves the chemical modification of one enzyme by another. Combinations of regulatory mechanisms can produce major and long lasting changes in the metabolism of the cell. Common metabolic diseases are diabetes, cancer, hyperlipidaemia and atherosclerosis. Cancer, for example, is a multistep disease with a multifactorial aetiology. For some genotoxic carcinogens the sequence of events leading to tumour formation is well understood from exposure, to metabolism and ultimately to specific mutations in transformation-associated genes. In the widespread field of metabolic diseases, enzymes, which play a central role in glucose metabolism, like Human hexokinase, are contributing to diseases like pre-non-insulin-dependent diabetes mellitus (Diabetes 1995 March;44(3):347-53 Identification of four amino acid substitutions in hexokinase II and studies of relationships to NIDDM, glucose effectiveness, and insulin sensitivity. Echwald S M, Bjorbaek C, Hansen T, Clausen J O, Vestergaard H, Zierath J R, Printz R L, Granner D K, Pedersen O). Other metabolism based disorders are peroxisomal disorders (Enzyme 1987;38(1-4):161-76 Genetic diseases caused by peroxisomal dysfunction. New findings in clinical and biochemical studies. Schutgens R B, Wanders R J, Nijenhuis A, van den Hoek C M, Heymans H S, Schrakamp G, Bleeker-Wagemakers E M, Delleman J W, Schram A W, Tager J M, et al.). Those disorders are a group of genetic diseases caused by peroxisomal dysfunction. Alcohol-induced oxidative stress, another metabolic disease, is linked to the metabolism of ethanol (J Biomed Sci 2001 January-February;8(1):59-70, Oxidative stress, metabolism of ethanol and alcohol-related diseases. Zima T, Fialova L, Mestek O, Janebova M, Crkovska J, Malbohan I, Stipek S, Mikulikova L, Popov P). Three metabolic pathways of ethanol have been described in the human body so far. Some other described metabolic diseases are hereditary tyrosinemia type I, which is the most severe metabolic disease of the tyrosine catabolic pathway mainly affecting the liver (FASEB J 1999 December;13(15):2284-98 Cyclin B-dependent kinase and caspase-1 activation precedes mitochondrial dysfunction in fumarylacetoacetate-induced apoptosis. Jorquera R, Tanguay R M), methylmalonic acidemia (Hum Gene Ther 1994 September;5(9):1095-104 Overexpression of human methylmalonyl CoA mutase in mice after in vivo gene transfer with asialoglycoprotein/polylysine/DNA complexes. Stankovics J, Crane A M, Andrews E, Wu C H, Wu G Y, Ledley F D) or propionic acidemia (Hum Genet 1991 May;87(1):41-4 Genetic heterogeneity of propionic acidemia: analysis of 15 Japanese patients. Ohura T, Miyabayashi S, Narisawa K, Tada K Department of Pediatrics, Tohoku University School of Medicine, Sendai, Japan).
  • [0004]
    The high incidence of metabolic diseases has given rise to the development of methods of treatment and diagnosis targeted specifically to metabolic pathways. The further development of such methods would have considerable benifits. For example, cancer where current therapies may have unwanted side effects or fail to provide effective treatment. Conventional methods such as chemotherapy, which with their massive side effects, sometimes result in unacceptable morbidity or lead up to the death of the patient. In practice, the unwanted side effects associated with cancer therapies frequently limit the treatment which could help a patient.
  • [0005]
    5-methylcytosine is the most frequent covalent base modification in the DNA of eukaryotic cells. It plays a role, for example, in the regulation of the transcription, in genetic imprinting, and in tumorigenesis. Therefore, the identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. Moreover, the epigenetic information carried by 5-methylcytosine is completely lost during PCR amplification.
  • [0006]
    A relatively new and currently the most frequently used method for analyzing DNA for 5-methylcytosine is based upon the specific reaction of bisulfite with cytosine which, upon subsequent alkaline hydrolysis, is converted to uracil which corresponds to thymidine in its base pairing behavior. However, 5-methylcytosine remains unmodified under these conditions. Consequently, the original DNA is converted in such a manner that methylcytosine, which originally could not be distinguished from cytosine by its hybridization behavior, can now be detected as the only remaining cytosine using “normal” molecular biological techniques, for example, by amplification and hybridization or sequencing. All of these techniques are based on base pairing which can now be fully exploited. In terms of sensitivity, the prior art is defined by a method which encloses the DNA to be analyzed in an agarose matrix, thus preventing the diffusion and renaturation of the DNA (bisulfite only reacts with single-stranded DNA), and which replaces all precipitation and purification steps with fast dialysis (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 Dec. 15 ;24(24):5064-6). Using this method, it is possible to analyze individual cells, which illustrates the potential of the method. However, currently only individual regions of a length of up to approximately 3000 base pairs are analyzed, a global analysis of cells for thousands of possible methylation events is not possible. However, this method cannot reliably analyze very small fragments from small sample quantities either. These are lost through the matrix in spite of the diffusion protection.
  • [0007]
    An overview of the further known methods of detecting 5-methylcytosine may be gathered from the following review article: Rein, T., DePamphilis, M. L., Zorbas, H., Nucleic Acids Res. 1998, 26, 2255.
  • [0008]
    To date, barring few exceptions (e.g., Zeschnigk M, Lich C, Buiting K, Doerfler W, Horsthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus. Eur J Hum Genet. 1997 March-April;5(2):94-8) the bisulfite technique is only used in research. Always, however, short, specific fragments of a known gene are amplified subsequent to a bisulfite treatment and either completely sequenced (Olek A, Walter J. The preimplantation ontogeny of the H19 methylation imprint. Nat Genet. 1997 November;17(3):275-6) or individual cytosine positions are detected by a primer extension reaction (Gonzalgo M L, Jones P A. Rapid quantitation of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE). Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15;25(12):2529-31, WO Patent 95/00669) or by enzymatic digestion (Xiong Z, Laird P W. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation assay. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15;25(12):25324). In addition, detection by hybridization has also been described (Olek et al., WO 99/28498).
  • [0009]
    Further publications dealing with the use of the bisulfite technique for methylation detection in individual genes are: Grigg G, Clark S. Sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioessays. 1994 June;16(6):431-6, 431; Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Doerfler W. Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method. Hum Mol Genet. 1997 March;6(3):387-95; Feil R, Chariton J, Bird A P, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb. 25;22(4):695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio M C, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5′ region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(1-2):261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 and WO 97/45560.
  • [0010]
    An overview of the Prior Art in oligomer array manufacturing can be gathered from a special edition of Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999), published in January 1999, and from the literature cited therein.
  • [0011]
    Fluorescently labeled probes are often used for the scanning of immobilized DNA arrays. The simple attachment of Cy3 and Cy5 dyes to the 5′-OH of the specific probe are particularly suitable for fluorescence labels. The detection of the fluorescence of the hybridized probes may be carried out, for example via a confocal microscope. Cy3 and Cy5 dyes, besides many others, are commercially available.
  • [0012]
    Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-TOF) is a very efficient development for the analysis of biomolecules (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem. 1988 Oct 15;60(20):2299-301). An analyte is embedded in a light-absorbing matrix. The matrix is evaporated by a short laser pulse thus transporting the analyte molecule into the vapor phase in an unfragmented manner. The analyte is ionized by collisions with matrix molecules. An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, the ions are accelerated at different rates. Smaller ions reach the detector sooner than bigger ones.
  • [0013]
    MALDI-TOF spectrometry is excellently suited to the analysis of peptides and proteins. The analysis of nucleic acids is somewhat more difficult (Gut I G, Beck S. DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Current Innovations and Future Trends. 1995, 1; 147-57). The sensitivity to nucleic acids is approximately 100 times worse than to peptides and decreases disproportionally with increasing fragment size. For nucleic acids having a multiply negatively charged backbone, the ionization process via the matrix is considerably less efficient. In MALDI-TOF spectrometry, the selection of the matrix plays an eminently important role. For the desorption of peptides, several very efficient matrixes have been found which produce a very fine crystallization. There are now several responsive matrixes for DNA, however, the difference in sensitivity has not been reduced. The difference in sensitivity can be reduced by chemically modifying the DNA in such a manner that it becomes more similar to a peptide. Phosphorothioate nucleic acids in which the usual phosphates of the backbone are substituted with thiophosphates can be converted into a charge-neutral DNA using simple alkylation chemistry (Gut I G, Beck S. A procedure for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. Apr. 25, 1995;23(8):1367-73). The coupling of a charge tag to this modified DNA results in an increase in sensitivity to the same level as that found for peptides. A further advantage of charge tagging is the increased stability of the analysis against impurities which make the detection of unmodified substrates considerably more difficult.
  • [0014]
    Genomic DNA is obtained from DNA of cell, tissue or other test samples using standard methods. This standard methodology is found in references such as Fritsch and Maniatis eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
  • [0015]
    The object of the present invention is to provide the chemically modified DNA of genes associated with metabolism, as well as oligonucleotides and/or PNA-oligomers for detecting cytosine methylations, as well as a method which is particularly suitable for the diagnosis and/or therapy of genetic and epigenetic parameters of genes associated with metabolism. The present invention is based on the discovery that genetic and epigenetic parameters and, in particular, the cytosine methylation pattern of genes associated with metabolism are particularly suitable for the diagnosis and/or therapy of diseases associated with metabolism.
  • [0016]
    This objective is achieved according to the present invention using a nucleic acid containing a sequence of at least 18 bases in length of the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto. In the table, after the listed gene designations, the respective data bank numbers (accession numbers) are specified which define the appertaining gene sequences as unique. GenBank was used as the underlying data bank, which is located at the National Institute of Health at the internet address
  • [0017]
    The chemically modified nucleic acid could heretofore not be connected with the ascertainment of genetic and epigenetic parameters.
  • [0018]
    The object of the present invention is further achieved by an oligonucleotide or oligomer for detecting the cytosine methylation state in chemically pretreated DNA, containing at least one base sequence having a length of at least 13 nucleotides which hybridizes to a chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto. The oligomer probes according to the present invention constitute important and effective tools which, for the first time, make it possible to ascertain the genetic and epigenetic parameters of genes associated with metabolism. The base sequence of the oligomers preferably contains at least one CpG dinucleotide. The probes may also exist in the form of a PNA (peptide nucleic acid) which has particularly preferred pairing properties. Particularly preferred are oligonucleotides according to the present invention in which the cytosine of the CpG dinucleotide is the 5th-9th nucleotide from the 5′-end of the 13-mer; in the case of PNA-oligomers, it is preferred for the cytosine of the CpG dinucleotide to be the 4th-6th nucleotide from the 5′-end of the 9-mer.
  • [0019]
    The oligomers according to the present invention are normally used in so called “sets” which contain at least one oligomer for each of the CpG dinucleotides of the sequences of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto. Preferred is a set which contains at least one oligomer for each of the CpG dinucleotides from one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto.
  • [0020]
    Moreover, the present invention makes available a set of at least two oligonucleotides which can be used as so-called “primer oligonucleotides” for amplifying DNA sequences of one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto, or segments thereof.
  • [0021]
    In the case of the sets of oligonucleotides according to the present invention, it is preferred that at least one oligonucleotide is bound to a solid phase.
  • [0022]
    The present invention moreover relates to a set of at least 10 n (oligonucleotides and/or PNA-oligomers) used for detecting the cytosine methylation state in chemically pretreated genomic DNA (Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto). These probes enable diagnosis and/or therapy of genetic and epigenetic parameters of genes associated with metabolism. The set of oligomers may also be used for detecting single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto.
  • [0023]
    According to the present invention, it is preferred that an arrangement of different oligonucleotides and/or PNA-oligomers (a so-called “array”) made available by the present invention is present in a manner that it is likewise bound to a solid phase. This array of different oligonucleotide- and/or PNA-oligomer sequences can be characterized in that it is arranged on the solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice. The solid phase surface is preferably composed of silicon, glass, polystyrene, aluminium, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold. However, nitrocellulose as well as plastics such as nylon which can exist in the form of pellets or also as resin matrices are possible as well.
  • [0024]
    Therefore, a further subject matter of the present invention is a method for manufacturing an array fixed to a carrier material for analysis in connection with diseases associated with metabolism in which method at least one oligomer according to the present invention is coupled to a solid phase. Methods for manufacturing such arrays are known, for example, from U.S. Pat. No. 5,744,305 by means of solid-phase chemistry and photolabile protecting groups.
  • [0025]
    A further subject matter of the present invention relates to a DNA chip for the analysis of diseases associated with metabolism which contains at least one nucleic acid according to the present invention. DNA chips are known, for example, for U.S. Pat. No. 5,837,832.
  • [0026]
    Moreover, a subject matter of the present invention is a kit which may be composed, for example, of a bisulfite-containing reagent, a set of primer oligonucleotides containing at least two oligonucleotides whose sequences in each case correspond or are complementary to an 18 base long segment of the base sequences specified in the appendix (Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto), oligonucleotides and/or PNA-oligomers as well as instructions for carrying out and evaluating the described method. However, a kit along the lines of the present invention can also contain only part of the aforementioned components.
  • [0027]
    The present invention also makes available a method for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with the cycle cell by analyzing cytosine methylations and single nucleotide polymorphisms, including the following steps:
  • [0028]
    In the first step of the method, a genomic DNA sample is chemically treated in such a manner that cytosine bases which are unmethylated at the 5′-position are converted to uracil, thymine, or another base which is dissimilar to cytosine in terms of hybridization behavior. This will be understood as ‘chemical pretreatment’ hereinafter.
  • [0029]
    The genomic DNA to be analyzed is preferably obtained from usual sources of DNA such as cells or cell components, for example, cell lines, biopsies, blood, sputum, stool, urine, cerebral-spinal fluid, tissue embedded in paraffin such as tissue from eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lung, breast or liver, histologic object slides, or combinations thereof.
  • [0030]
    The above described treatment of genomic DNA is preferably carried out with bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) and subsequent alkaline hydrolysis which results in a conversion of non-methylated cytosine nucleobases to uracil or to another base which is dissimilar to cytosine in terms of base pairing behavior.
  • [0031]
    Fragments of the chemically pretreated DNA are amplified, using sets of primer oligonucleotides according to the present invention, and a, preferably heat-stable polymerase. Because of statistical and practical considerations, preferably more than ten different fragments having a length of 100-2000 base pairs are amplified. The amplification of several DNA segments can be carried out simultaneously in one and the same reaction vessel. Usually, the amplification is carried out by means of a polymerase chain reaction (PCR).
  • [0032]
    In a preferred embodiment of the method, the set of primer oligonucleotides includes at least two olignonucleotides whose sequences are each reverse complementary or identical to an at least 18 base-pair long segment of the base sequences specified in the appendix (Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto). The primer oligonucleotides are preferably characterized in that they do not contain any CpG dinucleotides.
  • [0033]
    According to the present invention, it is preferred that at least one primer oligonucleotide is bonded to a solid phase during amplification. The different oligonucleotide and/or PNA-oligomer sequences can be arranged on a plane solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice, the solid phase surface preferably being composed of silicon, glass, polystyrene, aluminium, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold, it being possible for other materials such as nitrocellulose or plastics to be used as well.
  • [0034]
    The fragments obtained by means of the amplification can carry a directly or indirectly detectable label. Preferred are labels in the form of fluorescence labels, radionuclides, or detachable molecule fragments having a typical mass which can be detected in a mass spectrometer, it being preferred that the fragments that are produced have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer. The detection may be carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI).
  • [0035]
    The amplificates obtained in the second step of the method are subsequently hybridized to an array or a set of oligonucleotides and/or PNA probes. In this context, the hybridization takes place in the manner described in the following. The set of probes used during the hybridization is preferably composed of at least 10 oligonucleotides or PNA-oligomers. In the process, the amplificates serve as probes which hybridize to oligonucleotides previously bonded to a solid phase. The non-hybridized fragments are subsequently removed. Said oligonucleotides contain at least one base sequence having a length of 13 nucleotides which is reverse complementary or identical to a segment of the base sequences specified in the appendix, the segment containing at least one CpG dinucleotide. The cytosine of the CpG dinucleotide is the 5th to 9th nucleotide from the 5′-end of the 13-mer. One oligonucleotide exists for each CpG dinucleotide. Said PNA-oligomers contain at least one base sequence having a length of 9 nucleotides which is reverse complementary or identical to a segment of the base sequences specified in the appendix, the segment containing at least one CpG dinucleotide. The cytosine of the CpG dinucleotide is the 4th to 6th nucleotide seen from the 5′-end of the 9-mer. One oligonucleotide exists for each CpG dinucleotide.
  • [0036]
    In the fourth step of the method, the non-hybridized amplificates are removed.
  • [0037]
    In the final step of the method, the hybridized amplificates are detected. In this context, it is preferred that labels attached to the amplificates are identifiable at each position of the solid phase at which an oligonucleotide sequence is located.
  • [0038]
    According to the present invention, it is preferred that the labels of the amplificates are fluorescence labels, radionuclides, or detachable molecule fragments having a typical mass which can be detected in a mass spectrometer. The mass spectrometer is preferred for the detection of the amplificates, fragments of the amplificates or of probes which are complementary to the amplificates, it being possible for the detection to be carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI).
  • [0039]
    The produced fragments may have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer. The aforementioned method is preferably used for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism.
  • [0040]
    The oligomers according to the present invention or arrays thereof as well as a kit according to the present invention are intended to be used for the diagnosis and/or therapy of diseases associated with metabolism by analyzing methylation patterns of genes associated with metabolism. According to the present invention, the method is preferably used for the diagnosis and/or therapy of important genetic and/or epigenetic parameters within genes associated with metabolism.
  • [0041]
    The method according to the present invention is used, for example, for the diagnosis and/or therapy of solid tumors and cancer
  • [0042]
    The nucleic acids according to the present invention of Seq. ID No.1 through Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto and/or oligonucleotide- and/or a chemically pretreated DNA of genes according to the sequences of genes according to table 1 and sequences complementary thereto can be used for the diagnosis and/or therapy of genetic and/or epigenetic parameters of genes associated with metabolism.
  • [0043]
    The present invention moreover relates to a method for manufacturing a diagnostic agent and/or therapeutic agent for the diagnosis and/or therapy of diseases associated with metabolism by analyzing methylation patterns of genes associated with metabolism, the diagnostic agent and/or therapeutic agent being characterized in that at least one nucleic acid according to the present invention is used for manufacturing it, possibly together with suitable additives and auxiliary agents.
  • [0044]
    A further subject matter of the present invention relates to a diagnostic agent and/or therapeutic agent for diseases associated with metabolism by analyzing methylation patterns of genes associated with metabolism, the diagnostic agent and/or therapeutic agent containing at least one nucleic acid according to the present invention, possibly together with suitable additives and auxiliary agents.
  • [0045]
    The present invention moreover relates to the diagnosis and/or prognosis of events which are disadvantageous to patients or individuals in which important genetic and/or epigenetic parameters within genes associated with metabolism said parameters obtained by means of the present invention may be compared to another set of genetic and/or epigenetic parameters, the differences serving as the basis for a diagnosis and/or prognosis of events which are disadvantageous to patients or individuals.
  • [0046]
    In the context of the present invention the term “hybridization” is to be understood as a bond of an oligonucleotide to a completely complementary sequence along the lines of the Watson-Crick base pairings in the sample DNA, forming a duplex structure. To be understood by “stringent hybridization conditions” are those conditions in which a hybridization is carried out at 60° C. in 2.5×SSC buffer, followed by several washing steps at 37° C. in a low buffer concentration, and remains stable.
  • [0047]
    The term “functional variants” denotes all DNA sequences which are complementary to a DNA sequence, and which hybridize to the reference sequence under stringent conditions and have an activity similar to the corresponding polypeptide according to the present invention.
  • [0048]
    In the context of the present invention, “genetic parameters” are mutations and polymorphisms of genes associated with metabolism and sequences further required for their regulation. To be designated as mutations are, in particular, insertions, deletions, point mutations, inversions and polymorphisms and, particularly preferred, SNPs (single nucleotide polymorphisms).
  • [0049]
    In the context of the present invention, “epigenetic parameters” are, in particular, cytosine methylations and further chemical modifications of DNA bases of genes associated with metabolism and sequences further required for their regulation. Further epigenetic parameters include, for example, the acetylation of histones which, however, cannot be directly analyzed using the described method but which, in turn, correlates with the DNA methylation.
  • [0050]
    In the following, the present invention will be explained in greater detail on the basis of the sequences and examples with respect to the accompanying figure without being limited thereto.
  • [0051]
    Sequences having odd sequence numbers (e.g., Seq. ID No. 1, 3, 5, . . . ) exhibit in each case sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of different genes associated with metabolism.
  • [0052]
    [0052]FIG. 1
  • [0053]
    [0053]FIG. 1 shows the hybridisation of fluorescent labelled amplificates to a surface bound olignonucleotide. Sample I being from a pilocytic astrocytoma tumor sample and sample II being from an oligodenrogliome grade II tumor sample. Flourescence at a spot shows hybridisation of the amplificate to the olignonucleotide. Hybridisation to a CG olignonucleotide denotes methylation at the cytosine position being analysed, hybridisation to a TG olignonucleotide denotes no methylation at the cytosine position being analysed. It can be seen that Sample I had a higher degree of methylation than Sample II at position 514.
  • [0054]
    Sequence ID Nos. 1 to 64
  • [0055]
    Sequence ID Nos. 1 to 64 show sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of different genes associated with metabolism. In particular, sequences having odd sequence numbers (e.g., Seq. ID No. 1, 3, 5, . . . ) exhibit in each case sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of different genes associated with metabolism. Sequences having even sequence numbers (e.g., Seq. ID No. 2, 4, 6, . . . ) exhibit in each case the sequences of the chemically pretreated genomic DNAs of genes associated with metabolism which are complementary to the preceeding sequences (e.g., the complementary sequence to Seq. ID No.1 is Seq. ID No.2, the complementary sequence to Seq. ID No.3 is Seq. ID No.4, etc.).
  • [0056]
    Seq. ID No. 65 to seq. ID No. 68 show specific oligonucleotide sequences as used in Example 1.
  • [0057]
    The following example relates to a fragment of a gene associated with metabolism, in this case, OAT in which a specific CG-position is analyzed for its methylation status.
  • EXAMPL 1 Methylation Analysis of the Gene OAT Associated with Metabolism.
  • [0058]
    The following example relates to a fragment of the gene OAT in which a specific CG-position is to be analyzed for methylation.
  • [0059]
    In the first step, a genomic sequence is treated using bisulfite (hydrogen sulfite, disulfite) in such a manner that all cytosines which are not methylated at the 5-position of the base are modified in such a manner that a different base is substituted with regard to the base pairing behavior while the cytosines methylated at the 5-position remain unchanged.
  • [0060]
    If bisulfite solution is used for the reaction, then an addition takes place at the non-methylated cytosine bases. Moreover, a denaturating reagent or solvent as well as a radical interceptor must be present. A subsequent alkaline hydrolysis then gives rise to the conversion of non-methylated cytosine nucleobases to uracil. The chemically converted DNA (sequence ID 159) is then used for the detection of methylated cytosines. In the second method step, the treated DNA sample is diluted with water or an aqueous solution. Preferably, the DNA is subsequently desulfonated (10-30 min, 90-100° C.) at an alkaline pH value. In the third step of the method, the DNA sample is amplified in a polymerase chain reaction, preferably using a heat-resistant DNA polymerase. In the present case, cytosines of the gene OAT are analyzed. To this end, a defined fragment having a length of 572 bp is amplified with the specific primer oligonucleotides TGGAGGTGGATTTAGAGGTA (Sequence ID 65) and AACCAAAACCCCAAAACAAC (Sequence ID No. 66). This amplificate serves as a sample which hybridizes to an oligonucleotide previously bonded to a solid phase, forming a duplex structure, for example GTGTATTCGGTTGTTTTT (Sequence ID No. 67), the cytosine to be detected being located at position 514 of the amplificate. The detection of the hybridization product is based on Cy3 and Cy5 fluorescently labelled primer oligonucleotides which have been used for the amplification. A hybridization reaction of the amplified DNA with the oligonucleotide takes place only if a methylated cytosine was present at this location in the bisulfite-treated DNA. Thus, the methylation status of the specific cytosine to be analyzed is inferred from the hybridization product.
  • [0061]
    In order to verify the methylation status of the position, a sample of the amplificate is further hybridized to another oligonucleotide previously bonded to a solid phase. Said olignonucleotide is identical to the oligonucleotide previously used to analyze the methylation status of the sample, with the exception of the position in question. At the position to be analysed said oligonucleotide comprises a thymine base as opposed to a cytosine base i.e GTGTATTTGGTTGTTTTT (Sequence ID No. 68). Therefore, the hybridisation reaction only takes place if an unmethylated cytosine was present at the position to be analysed. The procedure was carried out on cell samples from 2 patients, sample I being from a pilocytic astrocytoma tumor sample and sample 11 being from an oligodenrogliome grade II tumor sample.
  • [0062]
    From the results (FIG. 1) it can be seen that Sample I had a higher degree of methylation than Sample II at position 514.
  • EXAMPLE 2 Diagnosis of Diseases Associated with Metabolism
  • [0063]
    In order to relate the methylation patterns to one of the diseases associated with metabolism, it is initially required to analyze the DNA methylation patterns of a group of diseased and of a group of healthy patients. These analyses are carried out, for example, analogously to Example 1. The results obtained in this manner are stored in a database and the CpG dinucleotides which are methylated differently between the two groups are identified. This can be carried out by determining individual CpG methylation rates as can be done, for example, in a relatively imprecise manner, by sequencing or else, in a very precise manner, by a methylation-sensitive “primer extension reaction”. It is also possible for the entire methylation status to be analyzed simultaneously, and for the patterns to be compared, for example, by clustering analyses which can be carried out, for example, by a computer.
  • [0064]
    Subsequently, it is possible to allocate the examined patients to a specific therapy group and to treat these patients selectively with an individualized therapy.
  • [0065]
    Example 2 can be carried out, for example, for metabolic diseases, solid tumours and cancer.
    TABLE 1
    List of preferred genes associated with metabolism
    according to the invention
    Genbank Entry No.
    Gen (
    DUSP2 NM_004418
    EPHX2 NM_001979
    QDPR NM_000320
    SGSH NM_000199
    SHMT2 NM_005412
    SLC7A2 NM_003046
    SLC7A4 NM_004173
    TYMS NM_001071
  • Diagrams
  • [0066]
    [0066]FIG. 1
  • [0067]
    [0067]FIG. 1 shows the hybridisation of fluorescent labelled amplificates to a surface bound olignonucleotide. Sample I being from a pilocytic astrocytoma tumor sample and sample II being from an oligodenrogliome grade II tumor sample. Flourescence at a spot shows hybridisation of the amplificate to the olignonucleotide. Hybridisation to a CG olignonucleotide denotes methylation at the cytosine position being analysed, hybridisation to a TG olignonucleotide denotes no methylation at the cytosine position being analysed. It can be seen that Sample I had a higher degree of methylation than Sample II at position 514.
  • 1 68 1 6149 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 1 gtgttgggat tataggtttg agttattata tttggttttt aagagatata ttagagtttt 60 aattcgaagt atttatgaat gtgattattt ggaaatagag aatttgtagg tgtaattaaa 120 ttaagatgag gttataattg gatttggatg ggttttaaat ttaatgatta gtgtttttat 180 agtaagagtg gagaaaaagt tatatatagg ggagaagata ggggttggat tgatgttttt 240 ataaagttag gaatattaag gatttttaat aattattacg attttggaga gaggtatgga 300 atagattttt cgttagaatt tatagaaaga attaattttg ttaatatttg gattttggat 360 tttagttttt agaattgtaa gaaaatatat tttttttgtt ttaagttatt tagttggtgg 420 taatttgttg ttgtaatttt aggaaataaa tatagatttt ggtattgaaa agtggggtgt 480 tgttatatta atatatataa atatggaagt gtttttatta atagattggg gtgatgggta 540 gaggaagaag tttgaggtat atgatagatt aagtttagat tgttttgaag agaaagtggg 600 tggaaatgtg agtgttttat ttttataaaa aataaaaatt aggtgggtat ggtgatatac 660 gtgtagtttt agttatttgg aaggttgagg taggaggatt atttgagttt aggaggttgt 720 agtgagttat gatcgtatta ttgtatttta gtttgggtga tagagtaagg ttttgttttt 780 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gtggtttata tttgtaattt tagtattttg ggagattgag ggaggattgt ttgggtttag 1680 gagttggaga ttagtttggg taatatagtg agaatttgtg tttattaaaa tattagtatt 1740 aataataata aattttaaaa tataaataaa aataattttt ttttaattgt atttaatttt 1800 tattttaata ttttattttt attttataga agaaatgtta atttagttat tttttttttt 1860 ttttttgaga cggagtttcg ttttgttatt taggttgtag tgtagtgata cgattttggt 1920 ttattgtaag tttcgttttt tgggtttacg ttattgtttt attttagttt tttaggtagt 1980 tgggattata ggtggttttt tttatgttta gttaattttt tgtattttta gtagagatag 2040 ggttttatcg tgttaggatg gtttcgattt tttgattttg tgattcgttt gttttggttt 2100 tttaaagtgt tgggattata ggcgtgagtt atcgcgttcg gttaagtttt agatttttaa 2160 atgaaattat tagttatatt tttgtttggt gtttatattg gtgataaagt tatttttatt 2220 tttttgaagt ttagttttaa agagtagttt gtttgttgta gttttagaaa taaatgtatt 2280 attttttttt ttttaatgtt tttaaatgtt tttgaatttt tttagaagtt gttttgatga 2340 atatagtggt attttttttt ggtagtgttt ttgatggtag aattgtttaa ttatagttga 2400 tttttatgtt tttagttagg ttttttttag ggtaggtgtt ttttaagata taattagtgt 2460 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ggttttagtt ggagtggttg aaggttgggg attggaatta tttgaggttt tttatttata 4200 tttgtatttg gattgagttt ggaatttgat tgttttaaaa tatttttacg gttgggtgtg 4260 atggtttacg ttcgttattt tcgtattttg agaggttgag tttggttttt tgtttgagtt 4320 tcggagttag ttattcgttt atggttatat agggagattt agtttttatt aaaaaaaaaa 4380 aatataataa tttgttgggc gtggtcgttt gcgtttgtaa ttttagtatt ttgggaggtc 4440 gaggagggag gtttatttga gtttaggagt ttaagattag tttggttaat atggtgaaat 4500 ttcgttttta taaaaaatat aaaattattt ggttgtggag gttttcgttt gtagttttag 4560 ttattgggat ggttggggag ggaggatcgt ttgagttttg atggtcgaga ttatagtgag 4620 ttgtggttac gttattgtat ttagtttggg tgatagagtg agattttttt tttaaaaaaa 4680 aaaaaaaatt ttaaaatatt tttatgagtt tgtgttgggt aggtttaagg gaaatatgtt 4740 tagtaaatcg aaaaatttcg gattatatat aaattatcgg tttcggtagg ttagatttgg 4800 tggatacggg agttagtagc gtgttaggtg ttcgttgatt ttagcgttag tgtttttatt 4860 tacgtttttt attcgttaat tttttttggt ttaggttgcg gtgttttagc gttaggtttc 4920 gtttcgtttt tggttgtcgg ttaatcgtcg tcgattgaga ggcgattatt ggaggaagcg 4980 ggatgggcgg tgttcgcgtc gggtcgttag gggtgcgggg ttggggagga ggtcgttagt 5040 ttacgtttgt ggagtcgata tttagttttt tgcgattatg gttgtgttgg cggtattttt 5100 gcgtagcggc gttcgtagtc gtagtttttt gtttcggagg ttggtgtagg tgagcggggt 5160 tcgtttttat agtatttaga ttcgggatgc gaggagtttt cgtttcggaa gtttttagtt 5220 cgcggtcgtt gcggttttcg cggttcgggc gcgcggttta ggttttagga tagttacgcg 5280 acgggttttg gtttaaaaat cgtttaagtg tttcgataat atttaggatt cgtttatttt 5340 tatagcgcgt ttttattttt aaggtttcgg cgtaattatt ttaatgagcg ttattggtgt 5400 gttaaataag ggtacgtgtt tgggcgggta ggatcgttag gattggcgtt ggttcggttt 5460 gagcggtggg atcggggaga gtttttttgt aggtttgtgt agttgttttc gagatttttt 5520 ttaaaatata tttgtgtgcg ttattgttag gagaggtttt tttttttttt taatataata 5580 gataattatt gggtatataa ggggagaggg tattatgtga ttataataga tgttttttgg 5640 agtagtttga aatttattag ggaaaataaa tgattattta gataatataa taaattatat 5700 ttgatatatg agtaaagttt atatattgag ggcgttttaa gggttgtcgt ttttttgatc 5760 gttgtgttta gggaatatag taggggtaga gttttaaaga atttattttt tatatgcgta 5820 agtaagggag tacgtattat agattgttag gtaaagtttt aggaataggt agagattttt 5880 agggtgtggt tggtgaagtt tgagtttttt aggtcgatgg gggtaataag tttggagatt 5940 tagttatgtt gtgagtatgg atttgatttt agttaagtag ggattgttga tatgtttgtt 6000 tttgttgtaa tggtaggtta ttttagtttt tacgtttggg cgtagaataa tattatttgt 6060 ataagggtgt tggcggtagg agttttgtaa gagattgtaa aagaattagt ttaggatttg 6120 ataattaggg agtgagggtg cgaagttaa 6149 2 6149 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 2 ttggtttcgt atttttattt tttaattgtt aagttttaga ttggtttttt tataattttt 60 tgtaaagttt ttatcgttag tatttttgtg taagtaatgt tattttacgt ttagacgtaa 120 gaattagagt gatttattat tgtaataaaa ataaatatat taataatttt tatttaatta 180 gggttaagtt tatatttata atataattgg atttttaagt ttattgtttt tatcgattta 240 gaaaatttaa gttttattaa ttatattttg aaggttttta tttatttttg aggttttgtt 300 tgataatttg tggtgcgtat ttttttgttt acgtatgtgg agaataaatt ttttgagatt 360 ttgtttttgt tgtgtttttt aaatataacg gttagaagag cgatagtttt tggaacgttt 420 ttagtatgtg agttttgttt atatgttaag tataatttat tgtattattt gagtagttat 480 ttgttttttt tgataaattt taggttgttt taaaaaatat ttgttatgat tatatggtgt 540 tttttttttt tgtatgttta atgattattt attgtattaa aaaagaaaag gaattttttt 600 tgataataac gtatataaat atgttttaaa gaaaatttcg ggagtagttg tataggtttg 660 taaagagatt tttttcgatt ttatcgttta ggtcgggtta gcgttaattt tggcggtttt 720 gttcgtttag atacgtgttt ttgtttgata tattagtaac gtttattaag atgattacgt 780 cgagattttg gaagtagaaa cgcgttgtaa aaataggcga gttttgggtg ttatcggagt 840 atttaggcgg tttttggatt agaattcgtc gcgtgattgt tttggggttt aagtcgcgcg 900 ttcgggtcgc gggagtcgta acggtcgcgg gttggaagtt ttcgaggcgg ggatttttcg 960 tatttcgggt ttgagtgttg tggggacgaa tttcgtttat ttgtattagt tttcggagta 1020 gggggttgcg gttgcgggcg tcgttgcgta gaagtgtcgt tagtatagtt atggtcgtag 1080 agggttgagt atcggtttta taggcgtaga ttagcggttt tttttttaat ttcgtatttt 1140 tagcggttcg gcgcgggtat cgtttatttc gtttttttta atagtcgttt tttagtcggc 1200 ggcgattggt cggtagttaa gggcggggcg gagtttggcg ttgggatatc gtagtttggg 1260 ttaggaaagg ttgacgagtg aaggacgtgg atggagatat tggcgttggg gttaacgagt 1320 atttgatacg ttgttggttt tcgtgtttat taagtttaat ttgtcggggt cggtggttta 1380 tgtgtaattc gagatttttc gatttattga gtatgttttt tttaggttta tttagtataa 1440 atttatgaaa atattttagg attttttttt ttttttggaa aaagggtttt attttgttat 1500 ttaagttgag tgtagtgacg tgattatagt ttattgtaat ttcgattatt agggtttaag 1560 cgattttttt tttttagtta ttttagtagt tgagattata ggcgaaagtt tttataatta 1620 gataattttg tattttttgt ggagacgggg ttttattatg ttggttagat tggttttgaa 1680 tttttggatt taagtgagtt ttttttttcg gttttttaaa gtgttgggat tataggcgta 1740 ggcgattacg tttagtaaat tgttgtattt tttttttttg gtagagatta ggttttttta 1800 tgtggttata ggcgggtggt tgatttcggg gtttaagtag agggttagat ttagtttttt 1860 aaagtgcggg gataacgggc gtgagttatt atatttagtc gtgaaaatat tttgaagtaa 1920 ttaaatttta ggtttagttt agatataaat atgggtaaaa ggttttaggt gattttagtt 1980 tttaattttt aattatttta gttgagattt tagatattat ggagtagaga taagttatat 2040 ttattatgtt gtttgaattt atggtttata gaaacgagag aaaataatgg gttgttattt 2100 taggttatta tgttttggag tatttttttt ttttaagata 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ttagtgttta aattttgtgt 3000 gtgtgtgtgt gtgagagaga gagagagaga gagaaataga tatttttaat tgaaaaagtt 3060 gaattgttaa agaaatgatt tagaaaatta aaggtttggt tttatagaga ttattagttg 3120 tgagaggtta aagttgatga ttagggtatt atatagtaaa agatgattgg ttaggttggg 3180 cgtggtcgtt tacgtttgta attatagtat tttgggaggt ttaggtgagt ggattatttg 3240 aagttaggag ttaaaagtag tttggttaat atagtaaaat tttattttta ttaaaaatat 3300 aaaaattagt tgggtatggt agtgggtatt tgtgatttta gttatttagg aggttgaggt 3360 aggagaattg tttaaatttg ggaggtggag gttgtagtga attgagatta tattattgta 3420 ttttagtttg ggtaatagaa tgagattgtg ttttaaaaaa agaagaaaaa aaaaaagatt 3480 ggttatatag ttatgtatat agtttttaat atgaattagt ttttttatag tttaatttta 3540 atttttttaa aaatttattg aattagggag tagtattatt tatatttttt agaagtttgt 3600 ttaagggtat aaagttagta gttagtgata tagttgtaat tggaatttag gtagtttggt 3660 tgttaggttt aggtttttag gtatttatta tattagttgt gttttaggag atatttgttt 3720 taggagaaat ttaattagga atatagaagt tagttgtaat tggataattt tgttattaga 3780 ggtattatta ggaaaaagtg ttattatgtt tattaggata 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nnnaaaaggt aatatataga atggatgtga gaaaatattt gtaaattatt 1140 tatttaatta gggatttaga atgtatagaa tttttaaaat ttaataataa aaaaataaat 1200 aattttattt aaaaaggggt aaaagagttg aatagatatt tatataaaag tatatatgaa 1260 gggttaataa ttatatgaaa agatgtttaa tattattaat tattagaaaa atgtaaatta 1320 aaattataat aagatattat tttaaattta ttaggatgat tattaataaa aaattagaaa 1380 ataataattg ttagtaagga tgtgttgaaa ttgaaatttt tgtgtattgt tagtggtaat 1440 ataaaatagt atagttattg taaaaaatag tatggtagtt atttaaaaaa ttaaaaatag 1500 gacgggtgtt gttattttag tattttggaa gattaaggtc ggtgtattat ttgaggttaa 1560 gagttcgaga ttagtttgat taatatggta aaattttgtt tttattaaaa atataaaata 1620 attaggtgtg gtggtaggcg tttgtaattt tagttattta ggaggttgag gtaggagaat 1680 tgtttgaatt taggaggtgg aagttatagt gagttaagat tatattattt tatttttttt 1740 tgggcgatag agtgagattt tgtttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaattaaa aatataatga 1800 ttatttaatt tatttttggg tatataattg aattttaaaa taattaaaag taggatttta 1860 aagagatatt tgtatatgta tgtttatagt agtattattt acgatagtta aaatatggaa 1920 gtaatttaag tgtttattaa taaatgaata gaaaagtaaa atgtgatata tatttataat 1980 ggaatattgt tagttttaaa aaggataaaa attatgatat atgtaataat atggatgaat 2040 tttagtaata ttaggttaag tgaaaaaagt tagttataaa aaaatattat ataatgttat 2100 ttatatgaga tatttagaat ggttaaaatt atggagatag aaaatggaac gatagatgtt 2160 aggggatgag gggaaaggga agttggagtt attgtttttt tgttttgttt tgttttgttg 2220 tttgagatag agttttattt ttgttgttta ggttggaatg tagtgatacg gttttagttt 2280 attgtaattt ttgtttttta ggtttaagtg attttcgtgt tttagttttt tgagtagttg 2340 ggattatagg tgtttgttat tatatttggt taattgtttg tatttttagt agagataggg 2400 ttttattatg ttggttaggt tggtttcgaa tttttgattt taggtgattt attcgtttta 2460 gttttttgaa gtgttgggat tataggtata agttatcgtt tcgttttttg gagttgttta 2520 atgggtatag aaaaaatatt atgttttatg ttattaataa aatattattg aaagaaataa 2580 gaaaatgtgt taattggaag tataaattat tgagtgttaa gggatataat ttaattgtgg 2640 tttaaattaa aaagtattat aagaaaatat tttaagatat tttatagtgt ttgaaatgta 2700 aatttagtga ttataatatt ttagtaaatt aaattttttt tagatttttt tttaagtatg 2760 aaaaaaagtg attatggaaa tataaattac gtaattattt tttgtaaaat tttgtggatg 2820 tgttatattt aaattaagat tttaaaatat gtttattgtt ttaaaatatt atttaaaagt 2880 tattaatacg agtaataata tgatatattg tttgagataa aaattgtttg aaatggaaat 2940 aaattattta cggtttgttg taatgttttt tttatttttt aatttattag tcgaatgttt 3000 tttaaaagta atattatttt agttatggtt attttagtgt tgatgtttta tagaaagaga 3060 tttaagggtt aatttttatt aattattagt tataataatg aaagtattaa ttagaaggta 3120 gaaaaaaaga agattgtttt ttttatattt aatgtgtata aataatgtat gttttttaaa 3180 taaaggttta tttttttaaa aattgtttat tcgtttatta tgatgaattt ttttaatttt 3240 tatagtattt aaattttttt ttaatttggt atatagagat atttatatat atatttaaat 3300 atatatatat atatgtatat gtaaatatat atatatatat atatatattt atttatttta 3360 atatatagat atatatatgt atatagtatt ggattgtttt ttattgatcg tattatttaa 3420 ttattagttt tattaatata tgaattggtt tagtattttt tatatagtat ttatagtaat 3480 tagtataatt ttgtatttat agtaggaatt taagtattta gtagaaaatt ttattattaa 3540 attttaatat atagtatttg gtagatgtgg gtaaatggtt agggaatatt aagcgatgtt 3600 tttaaagtgt 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Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 8 agaaaaatta ttattattta tagaaaagtt attgagtatt cgttggttag attatataga 60 ggggaaaaaa aaaaaggaaa ttaattgatt tttaaaggtt agtagttaat atagaaattt 120 aatattttga gttgaataaa ttatgtttgt atttagaatt cggttagtta tttataattt 180 ttgtaatgta tattgtttaa tagaatatta gaattaaatt ttagtgatat atagaagagg 240 gataaaatag tagatggggt aagatgatgt aaaaaaagaa tataattttt ttttattttt 300 attataggat ttatgttgag tatttgggaa agatgaaaga gatgtttttt ttaataaaaa 360 atggtaatat ttataatgat ttgttaaatt aaaatgaatg ttattaagta ttgaattgtt 420 atttagtaat ggttatattt taattgtttt aaagaattgt tggtataagt ttttaaaatt 480 ttttgggtgt attggagaag aaatgagtaa agtgaagtaa atgttttttt ttttgaaaat 540 aggaaagttg agaatgaata ttaagatata aattttttgt tttgtgtgga ggaaatagtg 600 aataaaggaa tttttattta aataaagata aattagagta ttaggaaata attttttata 660 agtagtattt tattagtttt cgatatagtt agtttgttta ttgtaaatgg ttaaatatta 720 agcgtataaa ttgtatgcga tattattatt aattttatag tatttgtgga atgttgataa 780 aaatatagga gattagtatt 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aaaaaaattg ttttagagat aggaagggat tttttcgaag ttataagtag attagaggaa 120 gttggtttaa ggaggtttat ttagatgtta aatttttaag gatagggttt cgggttttat 180 atgttttttt ggtttttttt tattttattt tattttttat atatgttttt tatttagttt 240 tgtatggtta gtgtgaggaa tagttttacg ggtaaagata gcgaatgttt tatgtttgtt 300 tttagtgaaa atatagggtt cggggtttcg aaaattgtat atttttttga tgtggtagga 360 aaataagatt gatcgtatag ggtttttaag atttttgaat tatttttaag agagtggttt 420 ttttattttg agtaggtagg tagagatgtt tagtgcgggt tgagtatgga gttttttttt 480 tagagtttgt agggcgagta tagtttttat ttaagtaagg gagtttgcgt ttttgtttgt 540 tttttattag tgaaaaatat atttatttta tgttatcgtt ttagtagaaa aattaaagat 600 gatggatgtg tagggtattt tttaagtaga agaggtgtta gtgtgagtta ttattcgttg 660 tatgttttga tgcgacgtta tgggatagtt agaagttatt tgtggtttgt tgttgggtgt 720 taattagggg ataggttgtt agggttggag gtgtgtaatt taggaaggag aggggttgta 780 agtttttttt taaggaatta gggttttatc ggagttttga ggatgttttc gttaagtttt 840 tgaggtgagt agggaatggg tttttttcgg tgacgtgttt ttagtgttta gtttaaatag 900 tagttttagt 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tttttttttt tttttttttt ttttttttga gatagagttt tattttgtcg tttaggttgg 780 agggtagtgg tgagattttg gtttattgta attttcgttt ttcgggttta agcgattttt 840 ttgttttagt tttttgagtg gttgggatta taagtatatg ttattattac gttcggttaa 900 tttttgtatt tttagtagag acggggtttt attatgttgg ttaggttgat ttcgaatttt 960 tgattttgtg atttatttat gttggttttt taaagtgtta ggatgatagg cgtgagttat 1020 tgtatttagt tatttttttt tttttttttt ttttagagat agggttttgt tgtgttgttt 1080 aggttggagt agagtgtagt ggcgttatta tggtttattg tagtttcgtt tttttcggtt 1140 taggtaattt ttttattttt tgagtagttg ggattatacg tgtatgttat tatgtttggt 1200 taatttttaa aatttttgta ggggttgggt gtgttggttt atgtttgtaa ttttagtatt 1260 ttgggaggtt aaggtgggtg gattatttaa ggttaggagt ttaagattag tttggttaat 1320 atggtgaaat tatattttta ttgaaaatat aaaaaattag ttgggcgtgg tggcgggcgt 1380 ttgtagtttt agttgtttag gaggttgagg taggagaatc gtttgaattt aggaggtaga 1440 ggttgtagtg agttaagatt ttattattgt attttagttt gggtaataag attgaaattt 1500 cgttttataa aaataaaata aaaaaataaa ttttttgtag atagattttg ttatgtttgg 1560 cgaggttggt 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gttttgtagg ggtttttcgt gaagggttgg ttgtgtagta taagtattac 4140 gtttattgta aataaagaaa ttattaatat aggggtttat atagatagaa gattttgttt 4200 tagttaatga taagttttcg gtgggtagtc gggttggtgt agtaatttat agatggtacg 4260 gttatttttg ttttattttt ttttttattg tttttagtgt ggaggttgtg tttttatagt 4320 tgttgtttta tggttataag atggttgcgg tattttcggg ttttatattt atgttttagg 4380 taagaggaag gagaaggagt aaaaggtcga agagtaaaga gtgagagggt tttttttttg 4440 ttagttttat ttttttattt agaaagggaa ttgtttttta gggatttttg ttttaattta 4500 ttggttagat ttgggttata tggttatttt ggatagtaag gaggtttgga aaatcgaggt 4560 ttttttttgt ttgtttgttt tgtttttgag atggagtttt gtttttgttg tttaggttgg 4620 aatgtaatgg tgtaatttcg gtttattgta atttttgttt ttcgggttta agtgattttt 4680 ttgttttagt tttttgagta gttgggatta tgggtttttg ttattatgtt tggttaattt 4740 tttatatttt tagtagagat ggggttttat tatattggtt aggttggttt tgattttttg 4800 attttaggtg atttatttgt tttatttttt taaagtgttg ggattatagg cgtgagttat 4860 agcgtttggt ttttagaaaa ttaagtttta aaattttgtt ggtttttata gtagaaggag 4920 gaaagggaga 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tgttgttaat aagaatgagt 960 tggttaggta cggtggttcg agtttgtaat tttagtattt tgggaggttg aggcgggtag 1020 gttacgaggt taagagatta agattatttt ggttaatatg gtgaaatttt gtttttataa 1080 aaatataaaa attagttggg tgtggtagcg ggtatttgta attttagtta ttcgggagtt 1140 tgaggtagga gaatcgtttg aatttaggaa gtagaggttg tagtgagttg agattttgtt 1200 attgtatttt agtttgggtg atagagtaag attttgtttt agaaaaataa ataaattaag 1260 ataaaagtaa aaaatatata aaaaagaatg agttaaattg gttgggtata gtggttggag 1320 tttgtaattt agttatttgg aaggttgagg cggtaagatt ttttgaggtt aggagatgga 1380 gattagtatg ggtagtatag tgatattttg ttataaaaaa aaatttttag agattgttga 1440 ttaggtacgg ttgtttacgt ttttaatttt agtattttgg gaggttaagg cgggaatatt 1500 gtttgagttt aggagtttaa gattagtttg ggtaatatga taaaagcgaa attttttttt 1560 tataaaacgt ataaaaatta gttgggtatg gtggtgtatg tttgtagttt taattattta 1620 ggaggttgag agatggaagg attatttgaa tttaggaggt tgaggttgta gtgattcgtg 1680 atcgtcgtat tgtattttag tttgggtgat agagggagat tttgttttaa ataaataaat 1740 tttaaaaatt aaaaaaatta aaatgaatta attatatgta 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gagtgtagtg attatagttt attgtagttt taattattgg 1380 ggtttaagta atttttttat tttagttttt cgagtagttg ggattttagg tatgtattat 1440 tatgtttggt taattttttt ttattatttg tggagatggg gttttgttat gttgtttagg 1500 ttggttttaa atttttgggt ttaagtaatt tatttgcgtt ggttttttaa agtgttggga 1560 ttataggtga tttatttttt aattgtgtta aagaataaag tatttatttt atttgttttt 1620 ttgtatttaa aatggttttt tatattttag atttagaaag ataaatataa gtaaattaat 1680 aagtatttta tttgtattat ttgttgtttt ttaatagttt atatttagtt tatttttgaa 1740 gggtaaagat tattgattgt ttatttaatt tttttatttt gaatttagtg agattttttt 1800 ttatttttta taaatgtatg tttaaaattt gattttagtg tagaattgga attaaaatgt 1860 atgtaatttt attttttata gtaggagtta aatgtttatt aagttttttt ttgagtttag 1920 tattttgtag ttaaatgatt attatttttt agttacgttt ttaaaaaaaa ttatgttggt 1980 ttgtaataaa aattgtattt tttttattag gtaagtgaat tattttgttg ggaagagtat 2040 tttggtttcg agaaaaaaat gattttattt tgaaaggttt tttttttaat ttttttttgt 2100 ataaattttt agtttagtaa tttgttagta ttttggaaaa gtgtattata aaataaaaat 2160 tcgaattaga taaaatatat 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tgggcgaacg agaaggatgt tatgttgata tattgacgtg ttttgttttt ttgtaga 6177 18 6177 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 18 tttgtaagga gatagagtac gttagtgtgt tagtatggta tttttttcgt tcgtttagta 60 ataagtttgt agggaggttt gttacgttcg ttttatttat aaagaaattt aggtttagga 120 aggggaagga ttggtttgga ggtttttatt tagtagtgta ggtaggattt aatttagatt 180 tttggatgat ggttgtttat ttttttgtat ggttttattt tgttttggtt aaggtttttg 240 tttaattaga tatttatgtt ttttttgttt tcgagttatt gttttaggat ggatataggt 300 taaggaaatt tgggtggagt tgaggttttt ttgtttatgg gaatagaatt tgaggaattt 360 atttaaagtt gtgtagttgg gttaagtttt tttttttttt tgtttaaggt tggttatttt 420 tagatagtgg gagttagtga tgatggtaga ggtgttattt tttgtttttt agggggttta 480 aagttttagg tttttgtttt tcgttttata ttttatttag ttggttttat tttaattttt 540 gagtttgtag gggttgggta gtggaagggg ttttaggagt tgaaggtagt attatttttt 600 agttttatcg gttagtaata atgattattt gttatttgag gagggatatt tggttttgtt 660 tttttttttt atttttattt ttattttttt ttatttttaa agttgatgtt ggtaaatttt 720 agatttttga 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(Homo sapiens) 20 gtataatgga taaaagattt gtttcggttg ggtgtagtgg ttaacgtttg taattttagt 60 atttcgggag gttaggcggg cggattattt ttggttagga gttcgagatt agtttgattt 120 ataaggtgaa attttgtttt tattaaaaat ataaaattag tcgggcgggg cgtttgtaat 180 tttagttatt cgggaggttg aggtaggaga atcgtttgaa ttcgggaggc ggaggttgta 240 gtgaatcgag atcgcgttat tgtattttat tttagtttgg gttaaagaga tttcgatttt 300 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagagagaga tttatttcgt tgtagcgtta aaatcgtaag 360 tttagaattt tgtatagacg gtattatttt aaaggttaaa attaggattt tagtaatttt 420 ttattaggtg attttataaa gtgttataaa agttatgatt attattattt tttataattt 480 agtaagcgga gggaagatcg gggagagtcg ggaggtcgtt taggagagga aattattttg 540 ataaaggttg tataattata gaataaaaat taaaaataat tgatagaatt aaaattgatc 600 gtagtttatg tttttggtag taaattttcg tttgagtcga gtaggaataa acgcgttatg 660 tttgaatttt gtgtatatat aatttttttt ttttttgtac ggttcgtttt taaaatgtat 720 ttatcgttat tttttatgga atttttagcg ggttttgggg gtagttagaa ttttttaaac 780 gaggaagttg aggatcggtt tagaattttg aattttgagg ggagtgagat ttgggttttt 840 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tattagaaag gtgatattta atggaatttt agaatgtaag tagggatttt tgtgataaaa 14100 tgaaaaggat tattaatttt ataggatttt ttatttatgt attttagttt ttatttattt 14160 tttatttggg aaatttgttt tttttttttt ttttgttttt tgtttttttt ttatgtttta 14220 ttttttggat tagttttttt taggttttgt ttgttttttt tataggagtt ttttttatga 14280 aaggtatttg tagtagaaat tgttttttat gttatttatt ttttatgtat tattttagta 14340 agagtgtttt tgagatttag ttgggtatat ggttatttag cgaaaggttg taatagttag 14400 ttttttttat aacgaggtgt agcgttatga ttaaggtttg gaatgtaagg attgtgtttt 14460 ttatgttttt ttttttttta tttaaataaa gatttatatt ttttaatttt tattgtagta 14520 agggtgttta ttaagatttg gttattaagt tttggttaat gggatataag tataagtgat 14580 atagataatt tttgggttat atttttaaag ggaaaggttt gttttttatt tgtttttttt 14640 ttttttttag tttgttagaa tgtggatatt atagtggagg taaagttgtt attttagatg 14700 ataagaagga agttaggtga tcggggagat aaaataatat attaggagtt tttagtgttt 14760 gattttgtgg agtcgttacg ttaattttgg agtgttttgt ttagattttt atgtaagtaa 14820 gaaaaatatt gtattttgtt taagttattg tattgtgttt ttttgttttg 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ttttttaaag tgttgggatt ataggcgtga gttattgttt taagttagaa 660 gatagaaatt tttaagtttt gttttattag tgaggattta ggttattaag aagtgaaaag 720 atttgtaata tttatttata gtttataaga ttttagtata gtgtttatta aggatggggt 780 tttgttttaa gtgtttgata aatattaatt tatataagtt ttatgatagt tagttttatg 840 agatgaatgt tgttattatg ttttatttaa agacgaggaa atcgaagtat agagagttta 900 ggtaaattgt tcgaggttat atagttggta agtcgttgag ttaggatttg agattaggta 960 gattggtgtt agagtttaga tgttaggtcg ttttttcgta ggatagtttt taggttttta 1020 aaggttgttt tcgtttgggg attagttata gaaaatgatt gatagtaatt ttaggttaga 1080 tttattagtg tgtgtttaaa atttttttta ttaaaatatg tattttttta tatattttta 1140 ttggataata gaaagatatg atgggtcgag tgtagtggat tatgtttttg attttagtat 1200 tttgtgaggt tgaggtggga ggatcgtttg agtttaggag ttcgagattt gtttgggtaa 1260 tatagcgaga ttttgttttt attttaaaaa ttatatagaa agatatgttt atatttattg 1320 tggtttattt attttagatt taggaatttc gtgttttttt gaatatatta tggtattttt 1380 ttttattaat tttttttagg attttgttat gagagggtat agtttatttt ttatatttat 1440 aaaatgtaaa gttgatatga 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aatatattta 120 taggtttttt ttttattttg tgtattgtgt ttgtattttt tttggttttt aaaatgaatt 180 tatgttttgg ttaatgaaat aggattattt cgtatttgaa ggtaagtagc gtaaagaggg 240 gtaaaaaata aatttatttt ttgtttttaa agaaattata gtgagaatat aatgaaatta 300 gtggttaaag agattagatt atttgtgagt tgtgtttgtt tatgttattt ttttgtttgt 360 ttgttttgag acggagtttt gtttttatta tttaggttgg agtgtagtgg tgcgatttcg 420 gtttattgta attttcgttt ttcgggttta agtgattttt tttgttttag tttttcgagt 480 agttgggatt ataggtgttt attattacgt tcggttaatt tttatatttt tagtagagat 540 ggggttttat tatgttggtt agtttggttt ttaatttttg attttaggtg atttatttgt 600 tttggttttt taaagtattg ggattgtagg tatgagttat tgcgtttggt ttttttatgt 660 tatttttagt tataattaga tattgtttat tttgagtaag ttaaaattat attttaaata 720 aaattatgat ttaattttta ttttaggtaa acgtgatttt tttattaaat aggatttgta 780 agagaagata ttttaaattg attgaagtat gagataaata ttttagggag ataagataaa 840 agaaaagata tttagtattt tttgatttaa atataatggg tttgagttag ttgttttata 900 atttataatt tgaatagttt aaattttgga taggtttttt ttgaagtttt agtagaaatg 960 ttttttgaaa tattgttttt ttgatgtttg ggtggttgtt attgtttgga ggtaaaaagt 1020 ttggaggcgg ggggtgagaa atgatttttt tttagtttta taattgagta aatttgttta 1080 tagtaaaagt attttatgta atggttaagg tttaggttag attataaaat ttatttagta 1140 gtattattat attattttag tttttttttg ttatattttt atatattgac gtgtaaatta 1200 atatgatttt tttataaaaa gtatatttga tgtgtttata ttttatttaa tttagtattg 1260 gattgatttt ggtgagaaga gttaagattg atttgttaag tatattttgg agtgtataag 1320 ttaataggta gaaagttaat tacgtatatt tttatttttt aatagattat tattggataa 1380 agttaataaa tatagataat gatagtgttg gaggaaaata attgaaatat taggaattag 1440 tgttttagtt aatttatagg tagagatagt ttattaatgt attttagaaa aagtgaagga 1500 aatttaggaa tttgggaaga agtaaagttg agagaaggtg aaatagtaaa ttaatggtta 1560 tatttagtaa ttaaatagat gtgttatttt tggtagttaa taaatatttt gtggggttag 1620 aaatttattg tattgtgaaa taaattttta aatataatta tagaaattgt agtttttgga 1680 aggtaggagt ttaaattagt taggcgatag taatagagaa aaggtaattt tttttttaat 1740 tttagagttg aaataatgag gtaggataat gttatataat aaagagtaag aaggggttta 1800 gtgttgtggt atgcgtttgt aattttgcgt ttgtaaagat taggattgtt agaaagttat 1860 ttagatattt ttttttatgg ttttattatt gtgtatttta aaaataagaa ttattgatat 1920 gagtgaaagg aataaagtta aagaagttaa aagttttatt agaagtgtgt gtgtattatt 1980 tttgagtgag agtttgttga aaagataagt ttattattta ttttttttgg agagttataa 2040 aaagattttt tgttaaatgg gatttttttt tgatagagat tacgaataat ttatttaaat 2100 tttaaaaaat aaaaattagg tcgggtatga tggtttatat ttataatttt tagtattttg 2160 ggaggttagg gtgggaggat tatttgaagt taggagttta aagttagttt gggtaatatg 2220 agatttttat ttttataaaa ataaatatta aaaaattagt taggtatggt ggtatatatt 2280 tgaggttata gtgagttatg attgtgttat tgtattttag tttaaaaaaa aaaattaatt 2340 aaaaaaaagt aaaattttaa ttttttaaat atataggaat tatttatgtg aaagaggaaa 2400 aacgttttaa aaattttaga ttttaatagt gtaaattaaa atttttattt attatttata 2460 aagttaaaat attgttagta aagattttat aaaaggagtt atatagaaat gtaaataata 2520 aaataatatt ttaaatgtat ttaatttttt tttatgaaat aagaattatg aaaattataa 2580 attttattta aaaataaaaa tataattttg atatttattt taaagtttta tattaaatat 2640 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gttttttgat atttgtttgg gtgagtatgt aggtagaaag gagattaaat 1200 aaatacgtat ttagtattta gggaatatta ggtattgtta tatatggaag aatcggatgt 1260 aaattttttt ttgttattta ttagttatat aattttaggt aagtgatttt aaattttaag 1320 ttagtttttt tttttgaaaa ataggggtaa aaatttttat attataaggt tatcgtaagt 1380 ttaaaatgag gttgtttagg taaaattata tggtttaggg ttatgggatg agtttatata 1440 ttagtaataa tttttttttt tttttagtag gaagtaatag aagggtatgt gttttgagag 1500 tttttttttg ttgggttttt gttgggatta attattaatt tttttttttt ttttgtgttt 1560 aaagattagt gttagaaata aggttataat tttagattaa ggttatgatt ttagtgtttt 1620 ttttttttat ttttaatttt tggtgggtag ttttgtgagg tttgatggtt tgaagttttt 1680 gtttggttgt tataggaagg attaaaggta tttataggaa aggagaaatg ttgtgagtga 1740 gttgtagtgg ggtaaagaga gggttaggga ttttagaatt gtgagaggta gatatagaga 1800 tataagttag cgattttaag tatagtttta ttgatatttt agttaatatt aatatttttt 1860 ttaattagcg gtgaggggtt tatggggcgg ggtttgaagg tggattgagg gtttcggttt 1920 tttgttgagt gatgatagtt ttatgttttt tttagtggtt ttgtagtttt tttatttttt 1980 agttttagtc gttattttta gtggggtagg aggagttttt attgttattt ggagattttg 2040 gtagggattt gtttattcga tttatatatt agtagggatt tcggcgttgt ttttgggagg 2100 agcggtattg gagagagagg tatataggtt aggagtgagg ttagaggttt ttagtaggag 2160 aatgagaggg gatatttgag tttgaggatg taaaaatatt tgagcgtttt ttcgggggtt 2220 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttgagatgg agtttcgttt tgtcgttttg 2280 gttggaatgt attggtatga tttttgttta ttgtaatttt tattttttag gtttaagtaa 2340 tttttttgtt ttagtttttt gagtagttgg gattataggt gtatgttatt atatttggtt 2400 aatttttgta atttttaaaa tagatggggt tttattaggt tgtttaggtt gattttgaat 2460 ttttgatttc gtgatttatt agttttggtt ttttaaagtg ttgggattat aggtatgaga 2520 tatcgtattc ggtttagtgt tttttttttt tagttttttt tttttaatta ataaattgtg 2580 tgtattttgt tagtttggaa tagtagtttt taaagtgacg tttttaaatt cggattacga 2640 gggaatatgt tagaaatgta tattgttagg ttttatttta tattttttga attaggaagg 2700 ttgtcggtgg ggtttagtta tttgtgtggt ataagttttt cggaggattt tgatgtttta 2760 agtttaagag ttattgagtt agggtatttt ttaagtgggt ttttttttat agtgtgtggt 2820 tgattatttt 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gaatgattat tgggtaaata atgaaatgaa ggtagaaata aagatgtttt 6120 ttgaaattaa tgagaataaa gatataaagt attagaattt ttgggatata tttaaagtag 6180 tgtgtagagg gaaatttata gtattaa 6207 37 5464 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 37 tattagagtg cgtaaggagg aaatagaggt aaattttggt tttgatgaag aggtagaagg 60 ggttaggagg tttttattat tgtttgtttt ttgtaaggtt atttaaaaag tgaagagata 120 tttttaaagt gagtattgat taaatgttag ttgttttttt agatttttta tggtttaaaa 180 ataaatgaaa agaaaaaagt tttgtttttt tatttaaatt tgagttatat tattaaaggt 240 tttttaggta atggggtttt tatacgtttt agagtaagta gtatatggtg tgtgtatgta 300 tgtttttttt tttttttttt ttttttattt tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 360 tgtgtgtgtg ttagtggaga gagagagaga cgaagaaaag ggaggagtga taattttttt 420 aaacgtatat aagttgtttg tgagaaaaat agtagtaatt ataatatatt aagtttttta 480 ttgttggtaa tgttttttat gtgttttttt agattgttta attttaattt tttaaatgtt 540 ttattttttt ttttatattt tggaaaatta taatatgttg atttaattta aaaaagttat 600 ttgaaatgta gttaaattta tttgattttt tttaatttat tattgtatat 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1500 aatagtaagt tttatagatt tttggttttt ttgtttagtg gagggttatt aagagagagt 1560 atttaatttt ttatagttgg aaattttttt ggttttttta gattatgtaa ttttttaaaa 1620 tgttataggg tagattaagt tttgaatttt atttgtgttt ttgattaggt tttagtttgt 1680 tttatagatt attgtatttt ttgttttttt ttgtgttttt tttatagtgt aggtagtaat 1740 tataatattt tttatagagt gtattatttt gtttttaagg atgttagaaa cgtatggtat 1800 cgatttttat tgtgtattta gataatagta atataagtat agaatattat tttggtatta 1860 tagaagtttt ataattttta agtgttagta gtatattttt tttaaacgtt agtaatttta 1920 atttttggta agaaaaaaaa tagattatgt aatttataat gattttattt tttagtaaaa 1980 ttttattttt ttgtgttcgt tattagaaat ttttatagat atattttagt agttatattt 2040 ttgtttgttt agttagagta agtttagtga ggaagggggt ttgttgttat ttttttttaa 2100 tgatggaaat attgaggagt atatgaggaa ttttatttat tagatgtgtg aggttaagag 2160 atttttgatt atgttattgt tttttagttt gggcgataga gtgagatttt gttttaaaaa 2220 aaaaaaaaaa tgatatgttt atttattaaa aatttttgtt agattatttt tttttataaa 2280 tttttaaatt ttttaatgat ttaataagtt ttatttttat tattgttaaa aaaatttttt 2340 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gttattatta tttcgtagta taatttgaag taaagtaata tgattttttt agttttgtta 4080 tttttgttta ggataatttt gtttttttaa ggtttggtgt tttatataaa ttttaggatt 4140 ttttttttgt ttttgtgaag aatgtttttg gtattttgat aggaattgta ttgaatttgt 4200 agattgtttt aggtaatacg gattttttaa taattttgat ttttttaatt tatgaatata 4260 taatattttt ttattatttg gtgttttttt taattttttt tattaatgtt ttgtagttat 4320 tattatagag attttttatt tattggttaa tttttaggta tttaatttta tgtgtggtta 4380 ttgtaaatgg gattattttt ttattttttt tttatatttt ttattgttgg tatatggaaa 4440 ttttgttgat tttggtatgt tgattttgta ttttgtaatt ttattgaatt tgtttgttag 4500 ttttaatagt tttttagagg agtttttagg ttttatttaa atataagatt ttattattag 4560 taaataagga taatttgatt tttttatttt taatttggat gttttttata tttttttttg 4620 tttggttgtt ttagtaaggt aatatgttga ataatagttg aataatagaa taaaaaaaaa 4680 tttttgtaaa gtaaataaat tttattagtt tatttgattt gtattttaaa ttagtgtttt 4740 tggttttttt ttaaaatttt aagtattata aggaaattag ttggaaggga attatgtgtt 4800 gattaagttt ttaaagggta gaaatattta ttgaagtgaa aaggattagt aaagggtgga 4860 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540 attcgaggga agtgaggaaa gtaaagtata tgggttagaa attattggat atattgggag 600 tatagtttgg ttaatgagtt tgaggttttg gattaagtga taagttttat ttggtttttt 660 aataggtaga attgatgtgt taaaaggaga gtttgttggg tagagtaggt gattggtgag 720 gaggagagaa atgataggtt ttaggtttat gagagttgtt tgggggatga gatattgttt 780 ttgtgatagg aacggggtgg gttttttaag ggtgatgtgg atgggggtgt ggtgttttgt 840 gatcgagggt gtggaagtat tttaaatagt ggggttaatt ataggtgcgg gataaggaaa 900 agttgtatgt tttagggtgg gaggtcggag gagtagaaga aggttagaag tttgttagaa 960 gttttggagg ggtttgggtt gatgtgttgg gtattatggg gaatgtggaa gtggagagta 1020 gtgtggagtt ttgaaagaat atttttgttt aggagcggag ttgggtatga aggtaggatt 1080 aagaaagagt gattgaagga aaaggtgttt agggagtaga aaagtggagg ggggttttgg 1140 ggtttggaga tttgtttatt gatttttata atagagattt gggaggattg ggtgggtttt 1200 gaaaatttag gtaaagtaga gtaggttgtt ttaatattaa tttttaaaaa atatgtatgt 1260 ttatttgtta ttattagagt tatttttggt ttagatgaag taatggtagt tgttgggata 1320 tttgttttag ggtattgtta gtttttagtg gtaaggtcga tgagattcga gtaggaggtt 1380 ttggttagtt cggaaaggga tggaggcgat ttttgttgga gtcgtttata gtttgatttt 1440 tattgagttt tttatagagg gggtatagtt tggtgagtat agttgggttt gggtatggtt 1500 tggattagta gtttttattg ttatatttga aataggcgtt aggtggaggt gttttgttag 1560 gaggtttttg tatggagttg tggttttgtg ggtttgtagg gtaaaggtaa gtattggaaa 1620 ttgttttttt tttttatttt ttttattata attgttaaag attttgaagg ttaaattaag 1680 aaggttttat tgtggggttt gagggtcgtt attaattttt tgaagtttgc gttaaatatt 1740 atggtagatt gggtgaggaa ttgaaggttt gaaatagtgg ttttttttgg gttggttggg 1800 tttaggttgg taattttttt atggttttag ttaaataaga gagaaaaagg gttgggtttt 1860 tgttaggatt ttcggtgatt tttgaaagtt ttttatagtt tattatttta tgggtatttt 1920 ttttgagttt tgtaaggaga tatataatta tgaggttttg atggttgtgt ttagaggttt 1980 tgttttgata attttagtgg gggttttggt tgggaattgt ttttgtgtta gtaggttggg 2040 taggagtttg atgatgaatt gtattagtat gtatttgagt tagggtttaa gtacggtgtt 2100 ggttttttgg ggtgagggtg gaagagaaga taagtagttg ttatgttagg ttagtttata 2160 agattgagta aggtattgaa tttttttaat ataagaggta ggattttttg gaaatgaatt 2220 gagttttttg ttagtttgag agagattagt gagggagaag ggaatatgaa ttttaataat 2280 atttttagtt tttgttattt ttcgaagggg gtattttagt attggcgtta aagtacgggt 2340 ggggtatggg ggttaaagat ggtgtcggag ttagtatggg taggagagaa ggaagaagtt 2400 agaaggggtt tttgttgagg gtttgaagag ggaagggggg ttgagttgat aggtattgga 2460 ggatagatac gggtgtaagg tggcgggatg ggtttatagg tttcgtgaga gggttgtaag 2520 gaaggagaat gagtataggt aatgttagag tttttttgag gagaggatgg tataggaaaa 2580 gaagtgggtg atgttggttg ggaagatggt ggttgggaag atggtggttg agaagataat 2640 gaggaagttt ggggagttaa tgaagttggt tgagatggag gggtagggtt tgggaggggt 2700 ggatagtagt ttgttttatt taatgaggaa aaagaggtag ggtcgggagg ataaaggtaa 2760 tgagggcggc gagaatgaag aaggatttga ataggtaagt aagaattgta gaggtcgggt 2820 tgtgatttga gtgtaaaaag gtttggatat aaggaatttt tttttatttt tttagttatt 2880 tgtaataatt gtttaagtta gttaaaattg taaagttgag tgttttattt gcgggttatt 2940 tggattcgtt atttaattta tattgcgatt aggttttatc gtataaaaaa gataaggtat 3000 ttatggtaga tattttgttt gaggtttaag gtttgtagat ttttaatgag gtaggttgga 3060 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taggttatag ttttagtttg gtggttgttg atttattgat 60 tttgttataa tattggaggt taggattttg ggtaaatgaa agagaaaagg aggtagattg 120 agaatgtgat tttataattt tagttttttt aggggttggg tggttagtgt ttttttagta 180 gttttttttc gtaggaagta gaattgtttg taacgttgat ggagttatag taatttttat 240 tttattgagt ttaggatttg tagagttatt aagattttgg agtaattgtt tttagtattt 300 aatagaagtt gttaaaagga ttatgggtta atttatttta gatatttttt ttagatgttt 360 ttatggaaag ttagggttta aattagtggt ttttattttt ggtagtattt gagttttatt 420 tggggaattg ttagaaagtg aaatttggac ggtatttata ttagtttagt ttttgggtgg 480 ggtttggata ttagtatttg tagaagtttt ttaggtggtt ttggtgtagt taggttggaa 540 attattgatt taattaatag aaatgttagg ttgggatttt tttcgaggta tttttttagg 600 ataggttgtg tatgatagtt ttatagtgtt agggttttaa gatgttttaa tggtttaggt 660 attggtttta attttcgttt tttcgttttt tttgagattt taataaattt tatagggttg 720 ggtataatgg tttacgttta taattttagt attttttttt tttttttttt tttttttttt 780 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttga gattgtttta 840 ttttgtcgtt taggttggag tgtagtggta taattttggt 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tatggtgagt aattgttttt ttatattatt ttttaaaata gatatgttat 480 ttatttagaa ttatagtttt ggaagggaat ttatgaatgg tataggtgag gagattgtag 540 attggtttaa ttgagtgatt ggttttagaa tttagttaag tttattaagt aatacgaaag 600 tattagattt ttaaagattg aattatagtt tttattataa atagttaatg ttaaaaatgt 660 taatattttt tttttatttt aaaagagtat ttttaaaata ggtttttata gttttgatag 720 tgagaataat ttgttttatt tttatttatt gaatatttta aaaataattt gtttattgtt 780 aattaagttt tttttttttt ttaggattgt cgaaagaaat ataaagacgt aaaaaggaaa 840 atgaaattaa aataataaat gttagttggt tttgatattg aatgtgaata aggtttattt 900 aaggaaattg atttagaaaa tagttttagt tgataaagaa gaaattttag agtgaaggaa 960 ttttaaaaat ttggttgacg gaatattatt ttggttgtta tttttttttg tggaattttt 1020 ttgtattttt ttttaagtaa ttattttaaa aattaaattt aattttttat aaaggaagaa 1080 taagatagtt tttgaaaata ttttttgtat ataatttttt tgttttttat tttgagtaat 1140 taatggatat ttttttatgt aaggtttata tgaagttttt ttaaataaat gagttaaagt 1200 atttgtattt tttagtttag gttttgtgtg aattataggt tatttgaaat tttatttttg 1260 attatgttaa atatattttt tattttgtta tttttgttta aattgataaa ttataagtta 1320 atattgagtt ttatatttgt gttttggtga atggttaatt gaaatatagg atattttaga 1380 ttaatattat ataagagttt tgtgaggatt aggagaggaa gttaaatata gttattttgt 1440 tattgttttt aggaattaag gaataatatt tagatgtata ttaattttaa aattttagtt 1500 agattaaaag tttatgaaaa atattaagtg tttgaaagat aggtagttat aattaggagt 1560 taggattttg agtttaaata gggaaataga tttaatatta tattaaataa attaatttgt 1620 ttagatttta agatatacgt tttttattaa aatgggtttt gtatgaaata gtattatata 1680 ggtcgggcgt gatggcgtat atttgtaatt ttagtatttt gggaggttaa ggcgggcgga 1740 ttatgaggag gttaggattt taagattagt ttggttaata tggtgaaatt ttatttttat 1800 taaaaatgta aaaattagtt gggtgtggtg gtttatattt gtaattttag ttgttaggga 1860 ggttgatata ggagaattat ttgaatttag gaggtagagg ttgtagtgtt gagattatgt 1920 tgttgtattt tagtttgggt aatagagtga gattttattt taaaaaaaaa aaaaaaaaga 1980 aatagtatta tatagtttta agggattatt attaagttat gatgtgtgta tttaaaatta 2040 gtatttattg atttatttat gttgaatata aatttttaat tgttgggatt ttatttggtg 2100 tgttaattat tatgatttta 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gttttatttt gttggttagg ttggttttaa atttttgatt 4740 ttaggtagtt cgattgtttc ggttttttaa agtgttggga ttataggtgt gagttatcgc 4800 gtttagttta tagttttttt tttttttttt tatttttttt gagatagagt ttcgttttgt 4860 tatttaggtt ggagggtagt ggtgagattt tggtttattg taagttttgt tttttgggtt 4920 tttattattt ttttgtttta gttttttgaa tagttgggat tataggtttt cgttattacg 4980 ttcggttaag tttttgtatt tttagtagag acggggtttt atcgtgttag ttaggatggt 5040 ttcgattttt tgatttcgtg atttatttat tttgtttttt aaagtgttga gattataggc 5100 gtgagttatt acgtttggtt tgatagtttt tatttttaat ttggtatgtt ttataaaagt 5160 ttatgtttgg tcgggtttag tggtttatgt ttgtgatttt agtagtttgg gaggtcgagg 5220 cgggtcgatt atttgaggtt agga 5244 55 815 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 55 gagttttagg attgagatat ttttattata ttttttttat tattttgtat ttttaaaata 60 gtttttaggg tatttttatt tgtttttgtg gaaagattgg taattagagg tagaaaagtg 120 aaataaatgg aaatagtatt atttagggtt gttatattta tatttgtgtt tttgtagtgt 180 taatttgtat tttttgagtg agttattttt atttattttt atagtagtta gtatcgtagt 240 gttttgtata tattatattt ttaatgagta tttgttaatt gattttgtat atgcgtgtga 300 tagtataaat atattatgaa aaatgaggag gttaggtaat aaaagagtta ggattttttt 360 taaaaaaaat atatagcggt ggagtttggt ataaagttta aatgttttta tattttgttt 420 tgtagtattt ttaattaggg gattttgata aggaagttga agggtgatat tatttttgtt 480 tttttattgt aattgaatat attttttagt ttttaggtgg ttttcgttgg ttaatttgtt 540 gtggagtttt taagggtata gaatcgtttt ttatataatt aaaagaagat gttgtttaat 600 ttgaggattt tgttaaataa tgtagttttt agaaatggtt ataattttat ggttcgaaat 660 tttcggtaag tgatggttag agatttgggt ttgatttagg aattatggtg atgtataaaa 720 ttatattttg tagtaaggtt tttttttgta gaatgtagtg ttacgttttg ttttattttt 780 atttgagata gttgttttta attttagtaa agttt 815 56 815 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 56 aagttttgtt ggaattagag gtagttgttt taaataagag taaagtagag cgtggtatta 60 tattttgtag aaagaggttt tattgtagaa tatagtttta tgtattatta tgatttttaa 120 attaaattta agtttttgat tattatttat cgaaaatttc gaattatgaa gttgtgatta 180 tttttaaaag ttgtattgtt taataggatt tttagattaa atagtatttt tttttaattg 240 tgtaaaggac gattttatgt ttttgaaaat tttatagtaa gttagttagc gggggttatt 300 taaaaattaa gaaatgtgtt tagttgtagt gagggagtaa aggtaatatt attttttagt 360 ttttttatta aagttttttg gttagagata ttgtagggta gggtgtagga gtatttgaat 420 tttatgttaa gttttatcgt tgtgtatttt ttttggaaga aattttgatt tttttattgt 480 ttggtttttt tattttttat aatatattta tattgttata cgtatgtata aaattaattg 540 ataagtattt attgaggata taatatatgt aaggtattgc ggtattggtt gttgtgaagg 600 tgagtagaag taatttattt agaaaatgta aattggtatt gtaaaaatat agatgtagat 660 gtgatagttt tgagtagtat tatttttatt tattttattt ttttattttt aattgttagt 720 ttttttataa aaataaatag aagtgttttg gaagttattt tgggggtgta agatgataga 780 gaaggtatag taaaaatatt ttagttttgg ggttt 815 57 762 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 57 gagttttatt ttttgttaaa ttagattatt taattagaaa tagtattaga ttttatagta 60 tgttaaattt aattgtgaat tgtatatgta agggatttag gttgtatgtt tttaatgaaa 120 atttaattag tggaaaaatt gttttttacg aaatcggatt ttggtgataa aaaggttggg 180 gatttcgatt tatggtattt gtggagaatt ttatggttag tatatttggt aaataaattt 240 aaaagaaaac gaattttatt ttattaaaaa tgaatatatt tatatgtata aatataagtt 300 ggaatgggga aatttatgta gttggaaaat agttattaaa tgtaaataaa tataattata 360 gtgtagatta aggattagta atttttttag aggtaataat aatattaatg ttgtatattt 420 attttttttt tttttttttt ttttttttga gacggagttt ggttttgtcg tttaggttgg 480 agtgtagtgg ttcgatttcg gtttattgta acgttcgttt tttaagttta tgttattttt 540 ttggtttagt ttttcgagta gttgggatta taggtattcg ttattacgtt tggcgaattt 600 tttgtatttt tagtagagac ggggttttat cgtgttagtt aggatggttt ggattttttg 660 atttcgtgat ttatttattt cggtttttta aagtgttggg attatagata tgagttatcg 720 cgtttagttt tatttatttt tttttaaaag ttagatttta gg 762 58 762 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 58 tttagggttt gatttttgaa aagggatgaa tagggttggg cgcggtggtt tatgtttgta 60 attttagtat tttaggaggt cgaggtgggt ggattacgag gttaggagat ttagattatt 120 ttggttaata cggtgaaatt tcgtttttat taaaaatata aaaaattcgt taggcgtggt 180 ggcgggtgtt tgtagtttta gttattcgag aggttgagtt aggagaatgg tatgaatttg 240 ggaggcggac gttgtagtga gtcgagatcg ggttattgta ttttagtttg ggcgatagag 300 ttaggtttcg ttttaaaaaa aaaaaaaaag aaagaaaagg atgaatgtat aatattggtg 360 ttattattat ttttgaaaag attgttagtt tttaatttat attataatta tgtttgttta 420 tatttaatag ttatttttta attatataaa tttttttatt ttaatttatg tttgtgtatg 480 taaatatgtt tatttttaat gagataagat tcgttttttt ttgaatttgt ttattaagtg 540 tgttagttat aaaatttttt ataaatgtta tagatcgggg tttttagttt ttttgttatt 600 agggttcggt ttcgtggaag atagtttttt tattagttag atttttatta ggagtatgta 660 atttagattt tttgtatgta tagtttataa ttgggtttgg tatattgtag aatttaatgt 720 tgtttttgat tggataattt gatttgatag gaggtggagt tt 762 59 645 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 59 ttgtagtttt tgttaggttt tgttagtcgg ggcgagggtt gggatgattt tggcggttta 60 tgtttgtgtg ggttgttttt ttcgttgtga attttgtatt tgtttcgtaa gtttttattt 120 aggtagattt tttgggtata aagggtgttt gtttagtagt cgggtatgag ttgtttcgat 180 gggcgaagga ggttgtttat tttatagttg gagagggttt tttttgttta gtgggcgatt 240 tgggttacgg ttaagttgtt attagttagt ttcgtttgaa aattattttt ggtttcgtgg 300 gggatttaag cggtttaagc gagggttttt ttgagcgtcg gagtttatag gtttcgtttt 360 gtttcgaaag ttttcgtaat cgaggcggag gcgatcgagt tttcgatttt tttagaacgt 420 tgttataaga aggggaacgt cggaatagtg tattatcggg cggcggtcgg ggcggcggta 480 ggagggcggg cggggggtag ggtttcgggg gattgggcgg gttatggcgg aggacggcga 540 ggaggcggag ttttatttcg cggcgtttta tataagtggg tagtggtcgg attgcgcgta 600 gatattgatt tttagcgttt cggttcggtt atggcgtttt ttagg 645 60 645 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 60 tttggagggc gttatggtcg agtcgaggcg ttgaaggtta gtgtttgcgc gtagttcggt 60 tattgtttat ttatatagag cgtcgcgaag tggaatttcg ttttttcgtc gtttttcgtt 120 atggttcgtt tagtttttcg gagttttgtt tttcgttcgt ttttttgtcg tcgtttcggt 180 cgtcgttcga tgatgtattg tttcgacgtt tttttttttg tggtaacgtt ttaggagagt 240 cgggggttcg gtcgttttcg tttcgattgc gggggttttc gggataaggc gagatttgtg 300 agtttcggcg tttaggggaa ttttcgtttg gatcgtttga gttttttacg gggttagaag 360 tggtttttaa gcggaattag ttggtggtaa tttggtcgta gtttagatcg tttattgggt 420 agagagggtt ttttttaatt gtggaataga taattttttt cgtttatcgg agtagtttat 480 gttcgattgt tgagtaggta ttttttgtat ttagggagtt tatttgagtg aaaatttgcg 540 ggataaatgt agggtttata gcgggagggg tagtttatat aggtataggt cgttaggatt 600 attttaattt tcgtttcggt tggtaaggtt tggtaggaat tgtag 645 61 3586 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 61 tttagaattg ataggaaaaa taatatggtt atagtattgg agagagagag aaaggagaga 60 ggagaaagga gagagagaga aaggagagag gagagagata gaggagagag agagaggata 120 gagggggaga gagagagagg agagagatag aggagagaga gagaggatag aggggagaga 180 gagggagagg gagagagagg gagagagagg gagagagaga gagagagagg gagagagaga 240 gagaaagaga gagagaggga gagagagaga gagagttttt taacgtgaga tattttataa 300 tgaataaatc gtttagttat taaagtgtag ttatttttag gagttgttag aaaatgtatt 360 aggattatta gagaaaagta ttagaaagat tttttttttt gatacgttgt ataaaataaa 420 taaattgaaa tttaataata tataaggaat tttgtttggg ttttgaagat aatttttttt 480 tgtatattga gttttttaaa tattgtagtt tttttatggt ttttgagaaa taattatttt 540 aaatttataa tttttaatat tttttaaatt tttttaataa gagaagtttt atttttgata 600 ttatttttta tttgtaaggt taaattatta ttagttttgt agtttattaa ttgggtttgt 660 ttaggttagg tattattatt attaatttta ttgttaatat tttaattata agaattaaat 720 tattaatggt gaatagagtt ttttatttta atataggttt attttattgg tgggatacga 780 gttaattcga aagaaaagtt agttatgtgt tttttagagg atgaaagttt aagataaaga 840 ttaaaagtgt ttgatgttgg aggtgggagt ggtattatat aggttttagt taagatatgt 900 gataattatt gtagtagtag ttggaaagag aaatttgtga ttttaattag ttagtttttg 960 tagattttgt gaggattaga ggaagaatgt ttttggttgt tttgtattgt ttgttgtgga 1020 gtttttagat tttcgttggt tattttttta gagtttgtgt tttttttaag aatttgatgg 1080 agaaggaatg ttgtttatcg tggagcgggg ataggagttt ttgtggttag tttttaggta 1140 gaggtttttg ttagaatatt tttttgttta atgtattatt tgggttttaa ttttttttta 1200 taggggtgga tgatcgggag tcgtggtttt tcgtttttta taataggatt tgttagtgtt 1260 ttggtaattt tatgggattt aattgtggaa attgtaagtt tggtttttgg ggattaaatt 1320 gtatagagag acgatttttg gtgagaagaa atattttcga tttgagtgtt ttagagaagg 1380 ataaattttt tgtttatttt attttagtaa agtatattat tagtttagat tatgttattt 1440 ttatagggat ttatggttaa atgaaaaatg gattaatatt tatgtttaac gatattaata 1500 tttatgattt ttttgtttgg atgtattatt atgtgttaat ggatgtattg tttgggggat 1560 ttgaaatttg gagagatatt gattttgttt atgaagtatt agtttttttg ttttggtata 1620 gatttttttt gttgcggtgg gaataagaaa tttagaagtt gataggagat gaaaatttta 1680 ttattttata ttgggattgg cgggatgtag aaaagtgtga tatttgtata gatgagtata 1740 tgggaggtta gtattttata aattttaatt tatttagttt agtattattt tttttttttt 1800 ggtaggtaag atatgttaga tatacgatgt tagagtaggg aggaatttta ataattattt 1860 ttttaggtag ggtataaatt ttttatttga atatttattg tagtttttat taaggataga 1920 aatggtgttt tgttaagaat ttttaatgta ttttgtattt tttttttata gtatatttta 1980 gatatttgtg taattatttg tttaatgatt tttattaggt ttttaaattg taatgaatag 2040 agtatttgat ttattattgt attttttaga atatagtatg gtgtttttaa aaatggtaat 2100 agtgtattat gtattttgtg aattgaataa atgagtgaat gaatgaatat ttggatgatt 2160 aaaaaaataa atgatatata ttaatgtttt tgaaaaataa aattattatt tataatagga 2220 tttatatggt gtataaatta aaaatgtaaa tttttggttt tattttagat taattggtta 2280 gaatttttag gagagagttt cgagaaggta taatttatta aatgtttatg gtgatttttt 2340 taattaggaa tgtttgggaa ataattattg gattagattt ttatttttga aagtatgaag 2400 attttgaggt ttaaataggt aaataatgaa gatggttaat atttattgaa tatttagtat 2460 gtgtaaattt cgtggtaagt gtttttgtgt attcgtttat tttatgtttt tattagtttt 2520 tttttatttt agaggttata aaggtattag gtaatttgta taagattata tagttaataa 2580 gtagtaaaaa aaaaattata tttatttttt aatagtttag ttgtatgatt attgtatttt 2640 atttttaagg atgtgattgt tgtgatattt ttagttaaag gatttggttt attttgtttt 2700 attttttttt taggttgtat tagaagttag tttttttttt tagtttttga aaattttaga 2760 taaaatatga agtattatta tttggaattg aatttttatt ttatttattt gaatttttta 2820 ttttgaatta ggggtaaatg gtaattaaag aaatatgtgt ttaattattt attattttaa 2880 aattatatgt taaaggaatg tttttttgtt tgttttttaa aaatttttaa tatagtattt 2940 ttgattagta atgttttatg aaattaagtt taatatgtga atgggatggg aagaattttg 3000 tatttaattt tttataattt gtagttttga aatgtagatg gtttttttcg tttaattaag 3060 tttgtatttt attttaatgg agtttattga agtttattta aaaaatagtt attgtataat 3120 ttttggtgtt attagttagt tatttattaa atgtaatggg ttttgtgtag gaaaggttag 3180 aaaaaatgtg tttggaaaaa aatttatttt aataagtttt tagatttttt attttaattt 3240 ataatgtgta aatttttatt tagtttttat attttttgtt tttgtttaaa aaattgttag 3300 gattggatat gggattttta gttagttatg atgttttatt taattatgtg gtttaatttg 3360 atttagaaag gttggaggat tgtttaaatt attaaaataa gttgtaatat ttataggaaa 3420 ttttaataga tagatatata ttaattttta attatatgag atgtgtaata ttagatgtta 3480 tttataattg tatgagtatt atttttttaa ttatttatta attgtcgagt agaatttttt 3540 tttttttttt tttttatgaa tgtgtttaat tttaatattt tttaga 3586 62 3586 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 62 tttagagagt attaaaattg aatatattta tgaagagaga aaaaggaaaa agttttgttc 60 gataattaat aagtaattag gaaaataata tttatatagt tgtggatagt atttggtatt 120 atatatttta tgtaattaaa aattaatgtg tatttattta ttaagatttt ttgtggatgt 180 tgtagtttat tttggtaatt tagatagttt tttaattttt ttgggttaag ttaagttata 240 tagttaaata aagtattata attgattgaa aattttatgt ttaattttgg tagtttttta 300 aataggaata gaggatataa gagttagatg agagtttgta tattatagat taaggtagga 360 ggtttgaaag tttattgaaa tagatttttt tttaagtata ttttttttag ttttttttgt 420 ataaaattta ttatatttgg taaatagttg attaataata ttagaaatta tatagtggtt 480 attttttaaa tgaattttag tagattttat tgggatgggg tataaatttg gttgggcgga 540 gaaggttatt tatattttaa aattgtagat tgtgggaaat tgagtgtaag atttttttta 600 ttttatttat atattgggtt taattttata gagtattgtt agttaaaagt gttgtattag 660 aaatttttgg aagataggta gaaaagtatt tttttaatat atggttttaa aatgataaat 720 aattaagtat atattttttt ggttattatt tgtttttaat ttagaatgaa aaatttagat 780 agatgaaata ggaatttaat tttaaatagt aatgttttat attttattta aagtttttaa 840 ggattgagaa agaaagttaa tttttaatgt agtttaaaga aaaagtgaga tagaatgaat 900 tagatttttt agttaaagat attatagtag ttatattttt ggaaatagga tatagtggtt 960 atatagttgg attattagag aataaatgtg attttttttt tgttgtttat tagttgtatg 1020 attttatata agttatttga tatttttata atttttaaaa tagggaaaga ttgataagag 1080 tatgaaatga acgaatgtat aaaaatattt gttacggggt ttgtatatgt tagatgttta 1140 atgaatatta gttattttta ttatttattt gtttaagttt taggattttt atatttttaa 1200 aaatgaagat ttaatttaat aattattttt taaatatttt tgattaaaag aattattata 1260 gatatttagt aaattgtgtt ttttcgggat ttttttttga agattttgat taattagttt 1320 gggataaggt taggaatttg tatttttaat ttgtatatta tatgaatttt gttgtgaata 1380 ataattttat tttttagaga tattagtgta tattatttgt ttttttaatt atttagatat 1440 ttatttattt atttatttat ttaatttata aaatatataa tgtattattg ttatttttaa 1500 aggtattata ttatgttttg ggaaatgtaa taatgaatta agtattttgt ttattgtagt 1560 ttagaaattt agtagaagtt attaaataaa taattatata aatatttaaa gtgtgttata 1620 aaggaaaaat ataagatata ttgagagttt ttaatagggt attatttttg tttttgatgg 1680 gggttgtaat gagtgtttag gtgagaagtt tatattttgt ttgaagaagt gattgttaag 1740 gttttttttt attttgatat cgtatattta gtatatttta tttgttaaga ggagaagaat 1800 gatgttgggt tgagtaagtt aggatttgtg gggtgttgat tttttatgta tttatttgtg 1860 taaatgttat atttttttgt atttcgttag ttttaatatg gaatagtgaa gtttttattt 1920 tttgttagtt tttggatttt ttgtttttat cgtaataaga agagtttatg ttaaggtaga 1980 aaagttggtg ttttatgggt aaaattaatg tttttttaga ttttagattt tttaagtagt 2040 gtatttattg atatataata atgtatttag ataaagaggt tataaatatt gatgtcgtta 2100 aatatgggtg ttgatttatt ttttatttgg ttataggttt ttatggggat gatatagttt 2160 gagttgatgg tatgttttgt taaagtgagg taggtaaaaa atttgttttt ttttggggta 2220 tttaaatcga agatgttttt ttttattaag agtcgttttt ttgtgtagtt tggtttttaa 2280 aagttaaatt tgtagttttt atagttgaat tttatgaagt tgttagagta ttggtaggtt 2340 ttattataaa agacggaagg ttacgatttt cggttattta tttttgtgaa gggaaattga 2400 ggtttaagtg gtgtattgga tagaaggata ttttgatagg aatttttgtt tgaaagttgg 2460 ttatagggat ttttgttttc gttttacggt ggatagtatt ttttttttat taggttttta 2520 gaggagatat aggttttagg gaaatggtta gcggaggttt ggaaatttta tagtaggtag 2580 tataaaatag ttaggagtat ttttttttta gtttttataa ggtttgtagg aattggttaa 2640 ttggagttat agattttttt ttttagttat tattatagtg attattatat gttttggttg 2700 agatttatat aatattattt ttatttttag tattaaatat ttttagtttt tattttaagt 2760 ttttattttt tgaaaagtat atgattgatt tttttttcga attggttcgt attttattag 2820 tgggataggt ttatgttaaa gtgaaaaatt ttatttatta ttaatagttt aatttttatg 2880 gttagaatat taataataag gttagtaata ataatgtttg atttaagtaa atttagttaa 2940 tagattataa aattaatgat gatttgattt tgtaaatgag aggtagtgtt aggaatagag 3000 ttttttttat taagaaagtt taggaagtat taaagattat gggtttaagg tagttatttt 3060 ttagagatta taaagaggtt ataatgtttg aagaatttaa tatgtagaga gagattgttt 3120 ttagagttta gatagaattt tttatatgtt attgaatttt agtttgttta ttttatataa 3180 cgtattagaa aaaaaaattt ttttgatatt tttttttgat aattttgatg tattttttga 3240 taatttttaa ggatagttgt attttgataa ttgggcgatt tgtttattgt gggatatttt 3300 acgttaaaga gttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3360 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttttttat 3420 tttttttttt ttttttttgt tttttttttt tttttttttt tttttttatt tttttttttt 3480 tttttttgtt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 3540 ttttttttaa tgttgtagtt atattgtttt ttttattaat tttaga 3586 63 600 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 63 ggtagcgacg atttttggag gtggatttag aggtataatt aagtcgcgcg gcgtattagg 60 gtttaagggt atggggtttt cgtagttgtg gttggggtag agttggggtt gttttttttt 120 ttaggagtat aggcggcggt ttagttttac gtttttcgtt tttagttata ttcggttcgc 180 gtagtggggg gtttaataga tttttttttt tcgggtttta gttttttcgt tagtaagggc 240 ggataaggat ttttttcgtt tcgttagagg aggcgatcga ggggtttgag tttaggtata 300 ggtcggcggg tttaggaggc gcgaggcgga tcgaattcgc gggaggagta aagatttttg 360 atgcgcggtc ggagggcggg gcggaggacg ggatttacgc gattggtatt ttgtttttcg 420 ttttagttaa tgagcggcga gggtgttttg ggggcggggt agaattagtt tttaagttgt 480 agtgacgttt cggcgttatt gttgcgtttt atagacgtcg cgtgtattcg gttgttttta 540 ggcgttgtta ggtatcgttt gggcgtcgtt gttttggggt tttggttcgg gtttggtcgg 600 64 600 DNA Artificial Sequence chemically treated genomic DNA (Homo sapiens) 64 tcggttaggt tcgaattaga gttttaggat agcggcgttt agacggtatt tgatagcgtt 60 tgaggataat cgggtatacg cggcgtttat gaagcgtaat agtgacgtcg gagcgttatt 120 gtaatttaaa ggttgatttt gtttcgtttt taagatattt tcgtcgttta ttggttgggg 180 cggagggtag gatattaatc gcgtgggttt cgtttttcgt ttcgtttttc ggtcgcgtat 240 taaggatttt tgtttttttc gcggattcga ttcgtttcgc gttttttgag ttcgtcggtt 300 tgtatttgag tttaggtttt tcggtcgttt tttttggcgg gacgagaaga gtttttgttc 360 gtttttgttg acgagaagat tgaggttcga aaaggaaaag tttgttgggt tttttattgc 420 gcgggtcggg tgtggttgga ggcgagagac gtgaggttgg atcgtcgttt gtgtttttgg 480 agggagggat agttttagtt ttgttttagt tatagttgcg ggagttttat gtttttgaat 540 tttgatgcgt cgcgcggttt agttgtgttt ttgagtttat ttttaaaagt cgtcgttgtt 600 65 20 DNA Artificial Sequence OAT primer 65 tggaggtgga tttagaggta 20 66 20 DNA Artificial Sequence OAT primer 66 aaccaaaacc ccaaaacaac 20 67 18 DNA Artificial Sequence OAT detection oligomer 67 gtgtattcgg ttgttttt 18 68 18 DNA Artificial Sequence OAT detection oligomer 68 gtgtatttgg ttgttttt 18

Claims (32)

1. A nucleic acid comprising a sequence at least 18 bases in length of a segment of the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of the sequences taken from the group of Seq. ID No.1 to Seq. ID No.64 and sequences complementary thereto.
2. A nucleic acid comprising a sequence at least 18 base pairs in length of a segment of the chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to a sequence according to one of the genes DUSP2 (NM004418), EPHX2 (NM001979), QDPR (NM000320), SGSH (NM000199), SHMT2 (NM005412), SLC7A2 (NM003046), SLC7A4 (NM004173), TYMS (NM001071) and sequences complementary thereto.
3. An oligomer, in particular an oligonucleotide or peptide nucleic acid (PNA)-oligomer, said oligomer comprising in each case at least one base sequence having a length of at least 9 nucleotides which hybridizes to or is identical to a chemically pretreated DNA of genes associated with metabolism according to one of the Seq ID Nos 1 to 64 according to claim 1 or to a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2 and sequences complementary thereto.
4. The oligomer as recited in claim 3;
wherein the base sequence includes at least one CpG dinucleotide.
5. The oligomer as recited in claim 3;
characterized in that the cytosine of the CpG dinucleotide is located approximately in the middle third of the oligomer.
6. A set of oligomers, comprising at least two oligomers according to any of claims 3 to 5.
7. A set of oligomers as recited in claim 6,
comprising oligomers for detecting the methylation state of all CpG dinucleotides within one of the sequences according to Seq. ID Nos. 1 through 64 according to claim 1 or a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2, and sequences complementary thereto.
8. A set of at least two oligonucleotides as recited in claim 3,
which can be used as primer oligonucleotides for the amplification of DNA sequences of one of Seq. ID 1 through Seq. ID 64 and sequences complementary thereto and/or sequences of a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2, and sequences complementary thereto and segments thereof.
9. A set of oligonucleotides as recited in claim 8,
characterized in that at least one oligonucleotide is bound to a solid phase.
10. Use of a set of oligomer probes comprising at least ten of the oligomers according to any of claims 6 through 9 for detecting the cytosine methylation state and/or single nucleotide polymorphisms (SNPs) in a chemically pretreated genomic DNA according to claim 1 or a chemically pretreated DNA of genes according to claim 2.
11. A method for manufacturing an arrangement of different oligomers (array) fixed to a carrier material for analyzing diseases associated with the methylation state of the CpG dinucleotides of one of the Seq. ID 1 through Seq. ID 64 and sequences complementary thereto and/or chemically pretreated DNA of genes according to claim 2, wherein at least one oligomer according to any of the claims 3 through 5 is coupled to a solid phase.
12. An arrangement of different oligomers (array) obtainable according to claim 11.
13. An array of different oligonucleotide- and/or PNA-oligomer sequences as recited in claim 12,
characterized in that these are arranged on a plane solid phase in the form of a rectangular or hexagonal lattice.
14. The array as recited in any of the claims 12 or 13,
characterized in that the solid phase surface is composed of silicon, glass, polystyrene, aluminium, steel, iron, copper, nickel, silver, or gold.
15. A DNA- and/or PNA-array for analyzing diseases associated with the methylation state of genes,
comprising at least one nucleic acid according to one of the preceeding claims.
16. A method for ascertaining genetic and/or epigenetic parameters for the diagnosis and/or therapy of existing diseases or the predisposition to specific diseases by analyzing cytosine methylations, characterized in that the following steps are carried out:
a) in a genomic DNA sample, cytosine bases which are unmethylated at the 5-position are converted, by chemical treatment, to uracil or another base which is dissimilar to cytosine in terms of hybridization behavior;
b) fragments of the chemically pretreated genomic DNA are amplified using sets of primer oligonucleotides according to claim 8 or 9 and a polymerase, the amplificates carrying a detectable label;
c) Amplificates are hybridized to a set of oligonucleotides and/or PNA probes according to the claims 6 and 7, or else to an array according to one of the claims 12 through 15;
d) the hybridized amplificates are subsequently detected.
17. The method as recited in claim 16,
characterized in that the chemical treatment is carried out by means of a solution of a bisulfite, hydrogen sulfite or disulfite.
18. The method as recited in one of the claims 16 or 17,
characterized in that more than ten different fragments having a length of 100-2000 base pairs are amplified.
19. The method as recited in one of the claims 16 through 18,
characterized in that the amplification of several DNA segments is carried out in one reaction vessel.
20. The method as recited in one of the claims 16 through 19,
characterized in that the polymerase is a heat-resistant DNA polymerase.
21. The method as recited in claim 20,
characterized in that the amplification is carried out by means of the polymerase chain reaction (PCR).
22. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the labels of the amplificates are fluorescence labels.
23. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the labels of the amplificates are radionuclides.
24. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the labels of the amplificates are detachable molecule fragments having a typical mass which are detected in a mass spectrometer.
25. The method as recited in one of the claims 16 through 21, characterized in that the amplificates or fragments of the amplificates are detected in the mass spectrometer.
26. The method as recited in one of the claims 24 and/or 25, characterized in that the produced fragments have a single positive or negative net charge for better detectability in the mass spectrometer.
27. The method as recited in one of the claims 24 through 26, characterized in that detection is carried out and visualized by means of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI) or using electron spray mass spectrometry (ESI).
28. The method as recited in one of the claims 16 through 27, characterized in that the genomic DNA is obtained from cells or cellular components which contain DNA, sources of DNA comprising, for example, cell lines, biopsies, blood, sputum, stool, urine, cerebral-spinal fluid, tissue embedded in paraffin such as tissue from eyes, intestine, kidney, brain, heart, prostate, lung, breast or liver, histologic object slides, and all possible combinations thereof.
29. A kit comprising a bisulfite (=disulfite, hydrogen sulfite) reagent as well as oligonucleotides and/or PNA-oligomers according to one of the claims 3 through 5.
30. The use of a nucleic acid according to claims 1 or 2, of an oligonucleotide or PNA-oligomer according to one of the claims 3 through 5, of a kit according to claim 29, of an array according to one of the claims 12 through 15, of a set of oligonucleotides according to one of claims 6 through 9 for the diagnosis of metabolic disease, solid tumours and cancers.
31. The use of a nucleic acid according to claims 1 or 2, of an oligonucleotide or PNA-oligomer according to one of claims 3 through 5, of a kit according to claim 29, of an array according to one of the claims 12 through 15, of a set of oligonucleotides according to one of claims 6 through 9 for the therapy of metabolic disease, solid tumours and cancers.
32. A kit, comprising a bisulfite (=disulfite, hydrogen sulfite) reagent as well as oligonucleotides and/or PNA-oligomers according to one of claims 3 through 5.
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