TWI731028B - 用以篩選核酸適體之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明關於一種用以篩選核酸適體之方法,其包含下述步驟:(a)使固定於固相載體上之標的分子與核酸適體候選者接觸、(b)藉由毛細管電泳,分取與標的分子結合之核酸適體候選者、(c)藉由PCR而放大核酸適體候選者。

Description

用以篩選核酸適體之方法
本發明係關於用以篩選核酸適體之方法。
核酸適體係指具備分子辨識能力之單股DNA或RNA,於1990年由Ellington等人、與Tuerk等人首先報告。核酸適體可藉由稱為Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment(SELEX)之進化工程學的方法獲得,亦被報告有多數之具有與抗體匹敵之結合能力或特異性者。進一步地,對於以蛋白質或細胞為首,不易取得抗體之低分子化合物等各種標的,能夠取得適體,期待對於治療藥或診斷藥之應用。但是,相對於抗體之獲得機率被認為有90%以上,目前核酸適體之獲得機率被認為係30%以下。換言之,核酸適體之獲得機率技術的提昇,可說是今後為了使核酸適體廣為於產業上利用的主要課題。
核酸適體係作為取代抗體之新穎的分子辨識單元而受到注目,但核酸適體之獲得率被認為係30%以下,期望高效率之適體獲得法的開發。CE-SELEX為利用 毛細管電泳之優良分離能力的核酸適體之迅速的篩選法。但是,由於有實驗條件設定(分取區域之設定)的難度、或作為標的之分子必須為與ssDNA庫結合時電泳移動度有大幅變化之一定以上的大小等限制,故通用性的缺乏係無法否認。
於CE-SELEX中,分取區域的設定,為左右適體獲得率的重要之要素。必須分取沒有混入對標的不具結合能力的ssDNA庫、且確實含有與標的形成複合體之ssDNA庫的區域。理想的分取區域,為來自ssDNA庫與標的之複合體的峰值範圍。但是,標的分子係如MutS蛋白質般,容易與ssDNA相互作用、且若不用高感度的螢光檢測器,則不易檢測ssDNA庫與標的之複合體。至今為止,有進行用以最佳化分取區域之各種設計,例如將標的蛋白質藉由螢光修飾予以可見化、或藉由即時定量PCR預測標的/適體複合體之檢測位置等。但是,複合體之檢測仍為困難,一般而言係將自標的分子之檢測位置起直到檢測到ssDNA庫之前作為分取區域。該分取區域之設定法,係有於途中解離之結合能力低的序列亦容易包含於分取區域中之問題點(圖1A)。
又,以低分子化合物等之小的分子為標的時,幾乎無法期待與ssDNA庫結合時之電泳移動度變化,因此被認為CE-SELEX之適用係困難的。藉由CE-SELEX而獲得對於低分子化合物之適體的例子,至目前為止僅有一例,由此亦可知其困難度(非專利文獻1)。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1] Yang, J. & Bowser, M. T. Capillary Electrophoresis-SELEX Selection of Catalytic DNA Aptamers for a Small-Molecule Porphyrin Target. Anal. Chem. 85, 1525-1530 (2013)。
本發明提供在發揮CE-SELEX之長處的同時,解決了實驗條件設定之困難或可適用之標的分子種類少等缺點的新穎之CE-SELEX。具體而言,係關於組合了粒子與CE-SELEX的用以篩選核酸適體之方法。至今為止雖有報告組合了粒子與毛細管電泳之RNA或抗原的定量解析法,但組合了粒子與CE-SELEX之方法則尚未被報告。
本發明者等人深入研究之結果,發現藉由組合粒子與CE-SELEX,可解決以往之課題,而完成了本發明。
本發明係關於以下者。
[1]一種用以篩選核酸適體之方法,其包含下述步 驟:(a)使固定於固相載體上之標的分子與核酸適體候選者接觸、(b)藉由毛細管電泳,分取與標的分子結合之核酸適體候選者、(c)藉由PCR而放大核酸適體候選者;[2]如[1]之方法,其進一步包含(d)將經放大之PCR產物單股化;[3]如[1]或[2]之方法,其中固相載體為粒子;[4]如[1]~[3]中任一項之方法,其中粒子之粒徑的最小值為0.05μm;[5]如[1]~[4]中任一項之方法,其中標的分子為蛋白質或低分子量化合物;[6]如[1]~[5]中任一項之方法,其中核酸適體候選者為單股DNA庫;[7]如[2]~[6]中任一項之方法,其中重複步驟(a)~(d)最大3次。
固相載體,可使用可於其表面上固定標的分子之任意者。例如,可列舉層狀之石墨烯、碳奈米管、富勒烯及粒子。粒子可使用以往公知之任意粒子。例如,可列舉二氧化矽珠、聚苯乙烯珠、乳膠珠、金屬膠體。本發明之粒子可為磁性粒子。粒子之平均粒徑的最大值,可依毛細管之內徑來決定。較佳為100μm、更佳為10μm、又更佳為1μm。粒子之平均粒徑的最小值,較佳為100nm、 更佳為10nm、又更佳為1nm。粒子之平均粒徑,可使用公知之任意方法來決定。例如,可列舉過篩法、顯微鏡法、沈降法、雷射繞射散射法、電檢測法。較佳為顯微鏡法。
為了不使用高價格的螢光檢測器,而使用可見區之吸光度檢測器,粒子為了被可見光之散射所檢測,必須為充分的粒徑。此時之粒子之平均粒徑的最小值,較佳為0.05μm、更佳為0.5μm、又更佳為5μm。
本發明中,標的分子係指於利用核酸適體之檢測方法等當中,作為檢測標的之分子。標的分子的化學物種並無特殊限制,可包含低分子化合物、高分子化合物、及生體來源物質等各種化學物種。又,標的分子可固定於固相載體之表面。更具體而言,例如可列舉糖類、脂質類、寡肽、蛋白質、及核酸。標的分子機能,例如可列舉抗原、抗體、配位子、受體、相互作用蛋白質等。
本發明中,核酸適體,係指為核酸分子,且對特定標的分子之親和性高,可特異性結合的分子。具有如此性質之核酸分子係稱為核酸適體,若無特別指明,不受鹼基序列、分子大小、分子之立體構造等所限定。核酸適體較佳為單股之RNA或DNA。
本發明中,固定於固相載體上之標的分子,係指標的分子藉由疏水性相互作用或靜電相互作用、共價鍵、配位鍵、非共價鍵性之分子間相互作用(生物素-鏈黴卵白素等)等而固定於固相載體表面。
本發明中,核酸適體候選者,係指由複數個RNA及/或DNA所構成之群(pool)。較佳為由單股核酸所構成之單股核酸庫、更佳為由單股之DNA所構成之單股DNA庫。再者,單股核酸之全部或一部分鹼基藉由互相對合所形成的雙股核酸亦可包含於其一部分當中。
本發明中,毛細管電泳,係指於毛細管內充滿水溶液,導入含有目標物之水溶液,置於電場中,藉以使電荷之移動與親和性或電滲透流等產生作用,而變得能夠分離純化者。毛細管之內徑可使用任意者。
本發明中,係藉由毛細管電泳,分取與標的分子結合之核酸適體候選者。於毛細管電泳系統中設置預先進行過前處理的毛細管。之後,注入混合有ssDNA庫與經固定化標的物質的粒子之樣品後,於電泳緩衝液中進行電泳。電泳中,例如可藉由二極體陣列檢測器經時測定於195、260、280、550nm等之波長的吸光度,以所得之峰值為指標來進行磁性粒子部分的回收((a)步驟及(b)步驟)。
本發明中,將所分取之核酸適體候選者藉由PCR來放大。PCR係指聚合酶連鎖反應,其可藉由於試管內重複以DNA合成酵素進行DNA合成反應,將其特定的DNA區域放大為數10萬倍。此時所使用之引子,雖依所使用之DNA庫的固定序列(與引子序列互補的序列)而異,但例如可列舉AGCAGCACAGAGGTCAGATG(順向引子)、TTCACGGTAGCACGCATAGG(反向引子)等。藉由將 DNA聚合酶、Tris-HCl、KCl、MgCl2、及dNTPs與引子及所分取的核酸適體候選者混合,以熱循環器調整加熱溫度、時間,並重複該循環,可放大DNA區域((c)步驟)。
本發明中,係依情況,將經放大之PCR產物單股化。例如,對使用生物素化引子所放大的PCR產物混合鏈黴卵白素固定化磁性粒子(例如magnosphere MS300/Streptavidin(Invitrogen)等),適當重複上清之除去、洗淨的步驟。之後,添加適當濃度之NaOH,使目標之ssDNA由磁性粒子表面溶出,並予以回收((d)步驟)。
本發明中,可任意重複上述步驟(a)~(d)。較佳為重複上述步驟(a)~(d)最大3次。
本發明雖僅為將標的分子固定化於粒子表面的非常簡單之方法,但理論上係有可幾乎解決CE-SELEX至今為止所存在的問題之可能性。首先,使用本發明之磁性粒子的CE-SELEX(以下稱為MB-CE-SELEX)中之分取區域的設定,較以往之CE-SELEX遠為容易。藉由光的散射,可將粒子以吸光檢測器高感度地檢測,因此不需要高價格的螢光檢測器。不管何種標的分子均可將來自磁性粒子之峰值作為分取區域(圖2)。藉由將標的/適體候選者複合體峰值以精確定位來作為分取區域,可排除於途中解離之結合能力低的ssDNA庫,可期待適體獲得率之提高。
又,本發明中,相較於以往之CE-SELEX,具 有優異的獲得率。因此,能夠以更少的回合數,選擇所期望之適體。
以下表示以往之SELEX與本發明之相異點。
Figure 106102762-A0202-12-0008-1
[圖1]圖1表示以往之CE-SELEX與本發明之相異點。
[圖2]圖2表示以SPR感測器所進行的凝血酶適體候選者之結合能力評估(以往之CE-SELEX)。各figure A~J(共10個),表示表3上段所示之10個適體候選者序列的探討結果。
[圖3]圖3表示以SPR感測器所進行的凝血酶適體候選者之結合能力評估(本發明之MB-CE-SELEX)。各figure A~J(共10個),表示表3中段所示之10個適體候選者序列的探討結果。
[圖4]圖4表示以SPR感測器所進行的凝血酶適體候 選者之結合能力評估(本發明之MB-CE-SELEX改良版)。各figure A~J(共10個),表示表3下段所示之10個適體候選者序列的探討結果。
[圖5]圖5表示T_beads_re_apt.1、T_beads_re_apt.5之獨特的解離相。(A)為200nM T_beads_re_apt.1之反應曲線與擴大圖。(B)為200nM T_beads_re_apt.5之反應曲線與擴大圖。
[圖6]圖6表示各選拔法之凝血酶適體的獲得率(僅由上位10個序列算出)。以往之CE-SELEX:23%、MB-CE-SELEX:83%、MB-CE-SELEX(改良版):91%
以下藉由實施例以更詳細說明本發明,但本發明不受此等實施例的任何限定。
[實施例1] 標的分子對磁性粒子之固定化
以表面具有羧基之磁性粒子Dynabeads MyOne(商標)Carboxylic Acid(Invitrogen)作為載體,遵照產品所附之實驗指南(protocol)進行分子的固定化。添加20mM Tris-HCl、10mM NaCl、1mM MgCl2緩衝液(pH7.4)100μl,作為10mg/ml之磁性粒子儲備溶液而於4℃保存。
CE-SELEX條件最佳化 毛細管電泳條件
使用毛細管電泳系統(Agilent 7100:大塚電子)。毛細管係使用長度80.6cm、有效長(至檢測窗為止的長度)72.2cm之75μm內徑氣泡浮選槽熔融二氧化矽毛細管(Agilent technologies)。將毛細管以等長的毛細管由入口側(注入口、陽電極側)與出口側(溶出口、陰極側)的電極之間伸出的方式設置於電泳匣中。藉由施以約1bar之壓力流過0.1M NaOH水溶液10~20分鐘,作為前處理。進一步地,藉由流過電泳緩衝液(100mM硼酸緩衝液、pH8.5)10~20分鐘,使毛細管內平衡化。
結合於標的之ssDNA的分離與分取 樣品之調整
標的蛋白質之凝血酶或ssDNA庫,係以樣品緩衝液(20mM Tris-HCl、10mM NaCl、1mM MgCl2緩衝液、pH 7.4)溶解或稀釋。ssDNA庫,係使用將30mer之隨機序列的兩端(5’側與3’側)以20mer之固定序列包夾之共70mer的合成寡DNA。將樣品緩衝液與100μM ssDNA庫置入PCR管,藉由吸量管吸放(pipetting)進行混合。藉由熱循環器(TAKARA BIO)將ssDNA庫溶液於95℃加熱2分鐘後,以每秒0.1℃之速度冷卻至25℃,藉以進行黏接(annealing)。
樣品之注入
黏接後,添加2μM凝血酶、或5~10mg/ml凝血酶固定化磁性粒子溶液1μl,於室溫(25℃)培置(incubate)30分鐘以上。藉由將標靶/ssDNA庫混合溶液施加100mbar之壓力6~9秒,由毛細管之入口側注入。基於Hagen-poiseuille法則,可由以下之式預測大約的注入量。V表示注入量(nl)、△P表示壓力變化(bar)、d表示毛細管內徑(m)、π表示圓周率、T表示注入時間(s)、η表示溶液黏度、L表示毛細管全長(m)。
V=△Pd4πT/128ηL×1012[nL]
樣品的電泳
將置入有50μl之電泳緩衝液的小瓶(vial)分別設置於入口側(注入口、+電極側)與出口側(溶出口、-電極側),施加30kV之定電壓進行電泳。電泳中係藉由二極體陣列檢測器,經時測定於195、260、280、550nm之吸光度。藉由假定電泳速度常為一定,由以下之式算出溶出時間,來設定分取時間。T溶出表示溶出時間、T檢測表示檢測時間、L全長表示毛細管全長、L有效長表示毛細管有效長。
T溶出=T檢測×L全長/L有效長
樣品的回收
使用凝血酶固定化磁性粒子之分取樣品,係使用熱循環器於95℃加熱10分鐘,藉以使磁性粒子表面之蛋白質變性,使ssDNA游離。於磁架靜置1分鐘後,回收上清。
以PCR放大分取樣品
將藉由毛細管電泳所分取的ssDNA樣品藉由PCR進行放大。於1.5ml管中置入2×premix 400μl、DEPC處理水192μl、4μM之順向引子80μl、4μM之5’-生物素化反向引子80μl並混合,對8個200μl之PCR管各分注94μl。於6個管中各添加分取樣品6μl,剩餘二個管中分別添加1~10pM ssDNA庫與DEPC處理水各6μl,作為正控制/負控制。使用熱循環器(TAKARA BIO)於94℃加熱1分鐘後,重複「94℃ 15秒、55℃ 5秒、72℃ 20秒」之操作23~28次。PCR結束後,藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE),調查目標大小之DNA有無被放大。將電泳後之凝膠浸漬於染色液中,振盪10分鐘。藉由UV照射器檢測染色後之DNA帶紋。
PCR產物之純化與單股化
將PCR產物單股化,作為下一回合所用之ssDNA庫。使用鏈黴卵白素固定化磁性粒子magnosphere MS300/Streptavidin(Invitrogen),如添附之說明書般進行固定化、洗淨操作。添加預先配製的0.1M NaOH 50μl, 慢慢地以吸量管吸放10~15次予以懸浮後,於常溫靜置4分鐘,藉以將適體候選者游離/萃取。
次世代定序儀之鹼基序列解析 樣品之配製與乳液PCR(emulsion PCR)
遵照附屬之實驗指南配製乳液PCR用之樣品,藉由PAGE確認目標大小之DNA有無被放大。之後,藉由Fast Gene Gel/PCR Extraction Kit(日本Genetics),進行PCR產物之管柱純化。最後使用Ion OneTouchTM 2 system(Life Technologies)與Ion PGM Template OT2 200 Kit(Life Technologies)進行乳液PCR與珠(beads)純化。所參照之附屬的實驗指南為Publication Number MAN0007220,Rev.5.0。
次世代定序儀之大規模序列解析
使用乳液PCR後之純化珠,以Ion PGM system(Life technologies)、半導體晶片Ion 314 chip與Ion 318 chip(Life technologies)、Ion PGM Sequencing 200 Kit v2(Life technologies)進行大規模序列解析。操作係遵照附屬的實驗指南(Publication Number MAN0007273,Rev.3.0)。定序數據係輸出為FASTAQ檔案,以CLC Genomics Workbench(CLC bio)去除DNA庫之primer區域之序列(固定序列),僅抽出28~32 mer之隨機序列。進而亦調查重複序列之計數值,將序列資訊輸出為excel檔案。於Excel (microsoft)上將序列轉換為FASTA形式,輸出為文字檔。藉由Mafft進行序列比對,抽出類似之序列(家族序列)。進而使用MEME suite 4.11.0調查家族序列。
所選拔適體之結合能力評估 標的蛋白質對感測晶片之固定化
藉由Biacore X100(GE healthcare),遵照所附之操作說明,進行標的蛋白質對感測器表面之固定化、以及與適體之相互作用解析。
電泳緩衝液係使用HBS-EP(HEPES,150mM NaCl、pH7.0)。將經羧基甲基葡聚糖修飾之CM5 sensor chip(GE healthcare)設置於流路,以10μl/min之流速流過EDC/NHS溶液7分鐘,使感測晶片上之羧基活性化。流過經10mM乙酸/乙酸鈉緩衝液、pH6.0稀釋之10~20μg/ml凝血酶溶液7分鐘。最後流過乙醇胺7分鐘,進行阻擋(blocking),使耦合反應結束。
相互作用解析算出解離常數
將適體候選者樣品以電泳緩衝液稀釋為2~4μM。使用熱循環器於95℃加熱2分鐘後,以每秒0.1℃之速度冷卻至25℃,藉以進行黏接。黏接後,以電泳緩衝液進一步稀釋為50~200nM。將凝血酶固定化晶片設置於流路,調查以30μl/min之流速流過經稀釋之適體候選者時有無顯示特異性反應。再生溶液係使用1M NaCl溶液。對於可 得到特異性反應之適體候選者,於6.25~400nM之範圍配製複數種稀釋樣品,進行多動力學(multi-kinetics)解析。惟,對於無法以1M NaCl溶液再生之適體候選者,係進行單動力學(single-kinetics)解析(途中未有再生步驟)。使用Evaluation software算出解離常數。
以次世代定序儀鑑定凝血酶適體候選者序列
以下表示使用次世代定序儀決定凝血酶適體候選者序列之順序/結果。
大規模序列解析
以次世代定序儀(Ion PGM system)解析以往之CE-SELEX、MB-CE-SELEX(第1次)、MB-CE-SELEX(改良版)之各回合(1~3回合)所得到之適體候選者序列。每回合之總領先序列數為90000~800000(表2)。各選拔法所得到之第3回合之序列中,主要針對計數值多的10個序列進行解析。序列名為T_apt.1~10(以往之CE-SELEX)、T_beads_apt.1~10(MB-CE-SELEX)、T_beads_re_apt.1~10(MB-CE-SELEX改良版)。
表2 各回合所選拔之適體候選者序列的總領先數
Figure 106102762-A0202-12-0015-5
算出上位鹼基序列之濃縮效率
首先,調查上位序列之存在率「(各序列之計數值/總領先序列數)×100(%)」後,各選拔法中最為濃縮之序列的存在率,於以往之CE-SELEX為0.16%、MB-CE-SELEX為12%、MB-CE-SELEX(改良版)為5.1%(表3)。依照由Bowser等人所報告之關於使用CE-SELEX取得VEGF適體之論文,其假定以CE-SELEX所獲得的適體富於多樣性,難以濃縮特定序列,實際上於第4回合結束的時間點最為濃縮之序列的存在率為0.8%左右。與本研究之結果比較時,關於以往之CE-SELEX所得到的上位序列之存在率,可見到與先前研究同樣的傾向。另一方面,關於以MB-CE-SELEX進行選拔所得到的上位序列之存在率,相較於以往之CE-SELEX所得到者,顯示出高50~100倍左右的存在率,明顯可知相較於先前研究,顯示出相當高的濃縮效果。MB-CE-SELEX可認為是具備特定結合能力之ssDNA容易被濃縮的條件。
表3 各選拔法之第3回合之上位序列每回合的計數值/存在率
Figure 106102762-A0202-12-0017-3
適體候選者序列之結合能力
使用表面電漿子共鳴(SPR)感測器所算出之各候選者序列對凝血酶的結合能力係如表4所示。
以往之CE-SELEX與MB-CE-SELEX的適體獲得率比較
藉由比較上位序列當中,對凝血酶具有高結合能力之序列的比例,來評估新穎之MB-CE-SELEX的性能。首先,調查以往之CE-SELEX所得到的上位序列(共10序列)之結合能力的有無(圖2)。預備實驗中,ssDNA庫中未觀測到特異性反應的上昇,故明顯可知凝血酶不與ssDNA 進行非特異性的相互作用(圖2A)。T_apt.1~10當中,於T_apt.3、T_apt.4、T_apt.6的3個適體候選者當中可得到特異性反應(圖2B~K)。關於T_apt.1、T_apt.10,雖觀測到少許反應的上昇,但波峰之形狀為箱型,亦即解離非常迅速,故可認為結合能力低(圖2B、K)。作為控制組,對於具有與TBA 15完全相同序列之TBA_like_apt.1亦進行結合實驗後,可得到特異性反應(圖2L)。
同樣地,調查MB-CE-SELEX所得到的上位序列(共10序列)之結合能力的有無,結果於T_beads_apt.1、T_beads_apt.3、T_beads_apt.7、T_beads_apt.8之4個適體候選者中可得到特異性反應(圖3)。
最後,調查MB-CE-SELEX(改良版)所得到的上位序列(共10序列)之結合能力的有無,結果於T_beads_re_apt.6、T_beads_apt.9以外之8個適體候選者中,可得到特異性反應(圖4)。特別是關於T_beads_re_apt.1與T_beads_re_apt.5,可得到於其他適體中見不到之獨特反應曲線。此等2個適體,於繪出比較快速的解離曲線後,保持一定高度的反應(圖5)。換言之,可認為係處於一定數目的適體與凝血酶強力地結合而不解離的狀態。
各選拔法之上位序列當中,顯示出高結台能力者的比例,以往之CE-SELEX為3/10、MB-CE-SELEX為4/10、MB-CE-SELEX(改良版)為8/10。由10個之各上位序列的計數值(存在率)算出適體獲得機率(具有高結合能力之序列的計數值之和/調查結合能力之序列的計數值之 和)時,以往之CE-SELEX為23%、MB-CE-SELEX為83%、MB-CE-SELEX(改良版)為91%(圖6)。明顯可知MB-CE-SELEX中,相較於以往之CE-SELEX能夠以更高機率取得凝血酶適體。
凝血酶適體之解離常數的算出
關於可得到特異性反應曲線之序列,藉由多動力學解析或單動力學解析算出結合速度常數(ka)、解離速度常數(kd)、解離常數KD(圖7、表4)。關於T_beads_re_apt.10,解離非常緩慢,且即使於高濃度之NaCl亦不會由凝血酶解離,故藉由單動力學解析算出解離常數(圖7J)。T_beads_re_apt.1與T_beads_re_apt.5雖然具有高結合能力的可能性高,但解離曲線無傾斜,因此難以算出解離速度(kd)(圖A與E),無法以SPR感測器算出解離常數(KD)。
各選拔法之第3回合的上位序列與結合速度常數、解離速度常數、解離常數
Figure 106102762-A0202-12-0020-4
MB-CE-SELEX(改良版)中,適體獲得機率(具有高結合能力之序列的計數值之和/調查結合能力之序列的計數值之和)增高時,主要可取得解離速度常數小(不易解離)的核酸適體。例如,可得到具有無法得到解離曲線之斜率的程度之結合能力的T_beads_re_apt.1與T_beads_re_apt.5,或唯一可藉由單動力學解析算出解離常數的T_beads_re_apt.10。明顯可知特意擴大分取窗之第一次的MB-CE-SELEX、與使分取窗變狹窄的MB-CE- SELEX(改良版)之分取區域僅僅18秒左右之差距,即有助於適體獲得率或解離速度常數。藉由以分取窗之最佳化或來自磁性粒子之波峰成為更銳利的方式進行設計,有更加改善本系統的可能性。
[產業上之可利用性]
本發明係有用於篩選核酸適體。
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Claims (6)

  1. 一種用以篩選核酸適體之方法,其包含下述步驟:(a)使固定於粒子上之標的分子與核酸適體候選者接觸、(b)藉由毛細管電泳,分取與標的分子結合之核酸適體候選者、(c)藉由PCR而放大核酸適體候選者。
  2. 如請求項1之方法,其進一步包含(d)將經放大之PCR產物單股化。
  3. 如請求項1或2之方法,其中粒子之粒徑的最小值為0.05μm。
  4. 如請求項1或2之方法,其中標的分子為蛋白質或低分子量化合物。
  5. 如請求項1或2之方法,其中核酸適體候選者為單股DNA庫。
  6. 如請求項2之方法,其中重複步驟(a)~(d)最大3次。
TW106102762A 2016-01-22 2017-01-20 用以篩選核酸適體之方法 TWI731028B (zh)

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