TWI702224B

TWI702224B - 牙周病原體表面蛋白之適體及其用途

Info

Publication number: TWI702224B
Application number: TW107142878A
Authority: TW
Inventors: 吳炳慶; 謝達斌; 鄭豐裕; 陳玉玲
Original assignee: 國立成功大學
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2020-08-21
Also published as: TW202021978A

Abstract

在此揭示可專一性結合牙周病原體表面蛋白之適體。再者，本揭示內容亦提供偵測與牙周病相關病原菌的套組和方法，其係利用本揭示內容之適體，分析從個體口腔所採集的樣本。

Description

牙周病原體表面蛋白之適體及其用途

本揭示內容關於一種偵測牙周病原體的試驗套組。具體而言，本發明是關於可以專一性結合至牙周病原體表面蛋白的一種適體，基於此特性該些適體能夠用於診斷或預測牙周病病程風險。

牙周病(如，牙周炎)為人類齒列主要疾病。在牙周病中，牙齒上所附著的牙菌斑通常累積大量的細菌在牙齦線的上方（齦上）和下方（齦下）。所述牙菌斑會在深處鈣化，形成所謂的結石。結石沉積和相關的牙菌斑可在牙齒和牙齦間形成「囊袋」，此為本疾病的特徵。牙周病的發展被認為是一種是對於齦下細菌所產生的慢性發炎反應，造成牙齒支撐組織的破壞。所述行為是循環的，且在早期難以被發現。

導致牙周病發生和發展的致病細菌包括但不限於牙齦卟啉單胞菌( Porphyromonas gingivalis)、福賽斯擬桿菌( Bacteroides forsythus)、放線共生放線桿菌( Aggregatibacter actiomycetemcomitans)、伴放線放線桿菌 ( Actinobacillus actinomycetemcomitans)、齒垢密螺旋體( Triponema denticola)和中間普氏菌( Prevotella intermedia)。活性細菌產生有毒產物（如毒素和酵素），利於在牙周囊袋中生存。細菌活性上升期間，所產生的有毒產物有助於破壞牙齒支持組織，並且降低宿主的防禦系統。

現今牙醫師是藉由探測牙周囊袋的深度、檢查附著在牙槽骨上的牙齒之X光影像，以及檢測過程的出血狀況來評估牙周炎。風險因素包括吸煙習慣、壓力和牙周炎的家族史。目前的檢測方法主要還是需依賴牙醫師的主觀專業知識。然而，探測囊袋的深度只是量測附連喪失的歷程，因此對未來實際發生牙周炎幾乎沒有幫助。探測時的出血可作為癒合過成的指標，而非破壞。為了作出準確的診斷，目前必須結合放射線造影和詳細臨床觀察，以進行評估。有時採集微生物樣本送到至實驗室進行分析，無論是透過培養還是DNA技術。然而，所述試驗需至少一周的時間才能產生結果。

有鑑於此，本領域亟需一種快速且經濟實惠的測試系統和/或方法來鑑定牙周病原菌。再者，本領域也亟需一種方便且操作容易的測試系統和/或方法，供牙醫師和/或臨床技師使用。所述測試系統和/或方法在患者病徵的評估、合適治療方法的選擇，以及監控治療有效性上具有重大價值。

牙周病(如，牙周炎)係人類齒列主要疾病。在牙周病中，附著在牙齒上的牙菌斑通常會累積大量的細菌在牙齦線的上方（齦上）和下方（齦下）。所述牙菌斑會在深處鈣化，形成所謂的結石。結石沉積和牙菌斑可能在牙齒和牙齦間形成「囊袋」，為本疾病的特徵。牙周病的發展被認為是一種是對於齦下細菌所產生的慢性發炎反應，造成牙齒支撐組織的破壞，且該過程具循環性，在早期難以被發現。

造成牙周病發生和發展的致病細菌包括但不限於牙齦卟啉單胞菌 (Porphyromonas gingivalis)、福賽斯擬桿菌 (Bacteroides forsythus)、放線共生放線桿菌 ( A. actiomycetemcomitans)、伴放線放線桿菌 (Actinobacillus actinomycetemcomitans)、齒垢密螺旋體 (Triponema denticola)和中間普氏菌 (Prevotella intermedia)。活性細菌產生的有毒產物（如毒素和酵素），有利於細菌在牙周囊袋中生存。細菌活性上升期間，所產生的有毒產物有助於破壞牙齒支持組織，並且降低宿主的防禦系統。

現今技術下牙醫師係藉由探測牙周囊袋的深度、檢查附著在牙槽骨上的牙齒之X光影像，以及檢測過程的出血狀況來評估牙周炎。風險因素包括吸煙習慣、壓力和牙周炎的家族史。目前的檢測方法主要還是依賴牙醫師的主觀專業知識。然而，探測囊袋的深度只是量測附連喪失的歷程，因此對未來實際發生牙周炎的預測幾乎沒有幫助。探測時的出血可作為癒合過程的指標，而非破壞過程。為了作出準確的診斷，目前必須結合放射線造影和詳細臨床觀察，以進行評估。有時需採集微生物樣本送到至實驗室進行分析，透過培養或DNA技術判定。然而，所述試驗需至少一周的時間才能產生結果。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容之目的在於克服現有技術的缺點，並提供一種含有能夠專一性結合至牙周病原菌表面蛋白之適體的探針和/或試劑盒。因此，本發明可用於協助牙醫師和牙科衛生師測定患者是否感染牙周病原體，或監測牙周治療的進展。再者，本揭示內容的另一目的在於提供一種偵測從患者口中採集的樣本內牙周病原體(如，牙齦卟啉單胞菌或放線共生放線桿菌 )的方法，且所述方法不需要培養細菌標本。本揭示內容所述的探針、套組和/或方法能夠用於篩檢疑似患有牙周病的牙齒、追蹤先前的治療、選擇合適的抗生素，並向患者傳達良好日常牙齒衛生的重要性。

本揭示內容第一態樣是提供一種能夠專一性結合至與牙周病相關細菌表面蛋白的單離適體。

依據一較佳的實施方式，所述單離適體的特徵在於具有序列編號：1之第一多核苷酸序列。再者，在可任選的實施方式中，所述單離適體可更包含序列編號：3和4之第二和第三多核苷酸序列，該些序列分別位於第一多核苷酸的上游處和下游處，形成一序列編號：5之多核苷酸序列。依據本揭示內容較佳實施方式，序列編號：5之多核苷酸序列可專一性結合至牙齦卟啉單胞菌( P. gingivalis)之表面蛋白。

依據另一較佳實施方式，所述單離適體的特徵在於具有一序列編號：2之第四多核苷酸序列。此外，在可任選的實施方式中，所述單離適體可更包含序列編號：3和4之第二和第三多核苷酸序列，其分別位於第四多核苷酸序列的上游處和下游處，形成一序列編號：6之多核苷酸序列。依據本揭示內容的較佳實施方式，序列編號：6之多核苷酸序列可專一性結合至放線共生放線桿菌( A. actiomycetemcomitans)的表面蛋白。

本揭示內容第二態樣是提供一種用以偵測與牙周病相關細菌的探針。所述探針具有一本體，其中本體的一部份附有上述單離適體。此外，在可任選的實施方式中，本發明單離適體是與金奈米顆粒接合，或者是被生物素化。

依據本揭示內容一較佳實施方式，本揭示內容探針本體的一部份附有所述單離適體，並且所述單離適體是與金奈米顆粒接合，而本體其他部份是附有生物素化的單離適體。在較佳的實施方式中，所述單離適體具有一多核苷酸序列，其相對於序列編號：5或 6具有至少85%序列相似度，並且若本探針本體的一部份附有與金奈米顆粒接合的適體，而本探針本體的其他部份則附有生物素化的適體。

依據本揭示內容實施方式所示，與牙周病相關的細菌是牙齦卟啉單胞菌或放線共生放線桿菌。

本揭示內容第三態樣是一種用以偵測個體口腔採集到的樣本內與牙周病相關細菌之套組。所述套組包含本揭示內容探針；以及用以放大單離適體訊號的放大劑或酵素。

依據本揭示內容之實施方式，探針本體的一部份附有本發明與金奈米顆粒接合之單離適體，而所述探針本體的其他部份附有生物素化的單離適體。在較佳的實施方式中，本發明單離適體具有一多核苷酸序列其與序列編號：5或6具有至少85%的序列相似度，並且若探針本體的一部份附有接合金奈米顆粒的適體，而探針本體的其他部份則附有生物素化的適體。

依據本揭示內容之實施方式，所述酵素可以是抗生物素蛋白或鏈親和素，並且可用以放大生物素化適體的訊號。

依據本揭示內容之實施方式，所述放大劑可以放大與金奈米顆粒接合之單離適體的訊號，且包含：一式(I)表面活性劑：

，其中 R ₁是C _12-22烷基； R ₂、R ₃和R ₄分別是C _1-3烷基；以及

是氟、氯、溴或碘；一膠態金前驅物；以及一還原劑。

依據本揭示內容實施方式，在式(I) 表面活性劑中，R ₁是十六烷基； R ₂、R ₃和R ₄分別是甲基；以及

是氯。

依據本揭示內容實施方式，所述還原劑是維他命A、維他命C、維他命E或其組合。在一實施例中，所述還原劑是維他命C。

依據本揭示內容之實施方式，所述膠態金前驅物是HAuCl ₄。

本發明的第四態樣是關於一種用以偵測從一個體口腔採集的一樣本內與牙周病相關細菌的方法。所述方法包含：以本揭示內容探針接觸該樣本；以及偵測該探針上本揭示內容單離適體以及與牙周病相關細菌所形成的複合物，其係作為樣本中是否存在與與牙周病相關細菌的指標。

依據本揭示內容實施方式，本揭示內容單離適體更進一步與金奈米顆粒接合或者是被生物素化。

依據本揭示內容實施方式，本方法更包含施用一放大劑至所述本發明與金奈米顆粒接合的單離適體和與牙周病相關細菌所形成的複合物，且其中放大劑包含：一式(I)表面活性劑：

是氟、氯、溴或碘；一膠態金前驅物；以及一還原劑。

依據本揭示內容實施方式，在式(I)表面活性劑中，R ₁是十六烷基； R ₂、R ₃和R ₄分別是甲基；以及

是氯。

依據本揭示內容實施方式，所述膠態金前驅物是HAuCl ₄。

依據本揭示內容實施方式，所述方法更包含施用一酵素至本發明生物素化單離適體與牙周病相關細菌所形成的複合物，其中所述酵素可以是抗生物素蛋白或鏈親和素。

依據本揭示內容實施方式，本方法能夠偵測與牙周病相關細菌的最低量為10。

依據本揭示內容實施方式，所述放大劑能夠放大複合物的訊號至少1,000倍。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1. 名詞定義

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型，除非另有指明。

在此所述「適體(aptamer)」一詞是指一種可專一性並緊密結合至牙周病原體表面蛋白之核酸。本揭示內容的適體可以是DNA、RNA或者是由DNA和RNA之組合所構成。在可任選的實施方式中，本揭示內容之適體可更包含非天然核苷酸(non-natural nucleotide)。所述「非天然核苷酸」是指人為建構或經過人為化學修飾的核苷酸，其特性和/或結構與天然核苷酸類似。非天然核苷酸的實例包含去鹼基核苷(abasic nucleoside)、阿拉伯糖核苷（arabinonucleoside）、2’-去氧尿嘧啶(2’-deoxyuridine)、α-去氧核糖核苷(α-deoxyribonucleoside)、β-L-去氧核糖核苷(β-L-deoxyribonucleoside)，以及其他糖化核苷(glycosylated nucleosides)。所述糖化核苷包括具經取代五碳醣糖化核苷(2’-O-甲基核糖、2’-去氧-2’-氟核糖、3’-O-甲基核糖或1’,2’-去氧核糖)、阿拉伯糖、經取代之阿拉伯糖、經取代之六碳糖或α異構體。本揭示內容之非天然核苷可以是人為構建的鹼基類似物或者是經人為化學修飾的鹼基。舉例而言，所述「鹼基類似物」包含2-氧代（1H）-吡啶-3-基團(2-oxo(1H)-pyridin-3-yl group)、5-經取代的2-氧代（1H）-吡啶-3-基團(5-substituted 2-oxo(1H)-pyridin-3-yl group)、2-氨基-6-（2-噻唑基）嘌呤-9-基團(2-amino-6-(2-thiazolyl)purin-9-yl group)，以及2-氨基-6-（2-口咢唑基）嘌呤-9-基團(2-amino-6-(2-oxazolyl)purin-9-yl group)。所述「經修飾的鹼基」包括經修飾的嘧啶（例如，5-羥基胞嘧啶(5-hydroxycytosine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和4-硫尿嘧啶(4-thiouracil)），經修飾的嘌呤（例如，6-甲腺嘌呤(6-methyladenine)和6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanosine)）和其他雜環鹼基。

在此所述「序列相似度」通常是以百分比表示，並且所述「序列相似度」是指在最佳比對時，兩個序列之間相同的核苷酸的百分比。基於本發明之目的，所述序列相似度是由公眾所知的Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)所測定，該測定工具可藉由National Cancer Institute/National Institutes of Health (Bethesda, Maryland)公開取得。序列相似度百分比是透過一比較視窗藉由兩個較佳比對序列計算而得，測定兩個序列中出現相同核酸鹼基的位置的數量，以產生配對位置的數量，將配對位置的數量除以比較視窗中位置的總數，並將結果乘上100則得到序列相似度的百分比。在本揭示內容中，當一核酸是與另一核酸有特定的百分比(如，序列相似度為85%)，意即兩條核酸序列有著相同的序列相似度(即，序列相似度為85%)。在某些實施例中，本發明適體的多核苷酸序列與序列編號：5有至少85%的序列相似度，代表本發明適體和序列編號：5之多核苷酸序列相似度皆為85%。在其他實施例中，本發明的適體的多核苷酸序列與序列編號：6有至少85%的序列相似度，代表本發明適體和序列編號：6之多核苷酸序列相似度皆為85%。

所述「牙周病」一詞廣義解釋而言，包括牙周炎、植體周圍炎(peri-implantatis)(其中支撐植體的組織被破壞)，以及其他形式的牙周疾病和病徵。

所述「牙周病原體」一詞是指口腔以及牙齒和牙齦之間囊袋中常見的病原菌，例如，牙齦卟啉單胞菌、福賽斯擬桿菌、放線共生放線桿菌、伴放線放線桿菌、齒垢密螺旋體和中間普氏菌。這些細菌需要特定生長條件和營養的存在才能變得有活性，並且活性細菌會產生毒性產物（例如，毒素和酵素）以幫助其存活。這些有毒物質將會促使宿主產生發炎反應。在某些實施例中，所述牙周病原體是牙齦卟啉單胞菌( P. gingivalis)。在其他實施例中，所述牙周病原體是放線共生放線桿菌( A. actiomycetemcomitans)

2. 本發明之適體

本揭示內容第一態樣之目的是提供一種新穎能夠專一性並緊密結合至牙周病原體表面蛋白之適體，其中所述病原體可以是牙齦卟啉單胞菌 ( P. gingivalis)和放線共生放線桿菌( A. actiomycetemcomitans)。

本揭示內容之適體如同上述「1.定義」章節所述，可以是如DNA、RNA或其組合所構成的天然核酸。再者，所述核酸可以部份或完全含有非天然核苷酸。在較佳的實施方式中，本揭示內容之適體是DNA適體。

依據本揭示內容之實施方式，所述適體可以在分子內包含一或多個雙股區。「雙股區」是指由核苷酸股構成的核酸分子間連續的鹼基對所形成的區域。連續鹼基對的長度為2至10個鹼基對，例如，2至5個鹼基對、2至6個鹼基對、2至7個鹼基對、2至8個鹼基對、2至9個鹼基對或2至10個鹼基對。適體可包含兩或多個雙股區域。在這種情況下，在雙股區域之間，每一個雙股區域可由相同或不同的鹼基對所構成。可以雙股之間非鹼基配對的結構（如錯配位點、缺口和內部環結構）介入每個雙股區域。或者是，每個雙股區域可以是連續的。

本發明適體可以結合至標的物質，例如，病原體表面(即牙周病原體)的多胜肽（較佳為蛋白質），其可作為所述適體能夠結合之標的。本發明適體不受限於長度，只要允許適體與牙周病原體的表面蛋白結合即可。本發明適體每個核苷酸股的長度是由50至80個核苷酸所組成，例如，50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79和80個核苷酸；較佳為52至72個核苷酸，例如，52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71和72個核苷酸；更佳為55至65個核苷酸，例如，55、56、57、58、59、60、61、62、63、64和65個核苷酸。鹼基配對雙股的長度不需一致，換句話說，其中一股可比另一股較長或較短。舉例而言，較長的股中不與其他股配對的單股區域，可透過分子內黏合形成髮夾結構。本揭示內容的雙股區域亦涵蓋髮夾結構中的柄區(stem region)。

本發明適體每個核苷酸股可包含一單股區域，其未和雙股區域中另一股的5’端和/或3’端鹼基配對。雙股核酸還包括閉環形式的啞鈴形核酸，其中兩個核苷酸股通過由單股區域形成的環結構連接。基於啞鈴形核酸對於核酸酶降解的抗性，相較於線型雙股核酸，本揭示內容核酸分子較佳是以啞鈴形核酸呈現。

依據本揭示內容之實施方式，本發明適體對於上述「定義」一節中所指牙周病原體的表面蛋白具有結合親和力。

在某些實施方式中，本發明適體是核酸，其包含序列編號：1之第一多核苷酸序列。再者，在可任選的實施方式中，所述適體可更包含序列編號：3和4之第二和第三多核苷酸序列，分別位於第四多核苷酸序列的上游處和下游處，產生一序列編號：5之多核苷酸序列。

在其他實施方式中，所述適體的特徵在於具有一序列編號：2之第四多核苷酸序列。此外，在可任選的實施方式中，所述適體可更包含序列編號：3和4之第二和第三多核苷酸序列，分別位於第四多核苷酸序列的上游處和下游處，產生一序列編號：6之多核苷酸序列。

在較佳的實施方式中，本發明適體具有一多核苷酸序列，其相對於序列編號：5或6有至少85%序列相似度。舉例而言，本發明適體相對於序列編號5或6有85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列相似度。

依據本揭示內容一較佳實施方式，所述適體具相對於序列編號：5有100%序列相似度之多核苷酸序列，所述適體全長由62個核苷酸(62-mer)所組成，並可以結合至牙齦卟啉單胞菌( P. gingivalis)表面蛋白。在此實例中，所述適體多核苷酸包含四個雙股區域，分別由2、7、3和4個鹼基對所形成，每一個雙股區域間插入有數個錯誤配對區域，以形成5個分子內的環狀結構，以及兩個單股區域位於多核苷酸的3’端和5’端(參見第2A圖)。

依據其他較佳實施方式，本發明適體具相對於序列編號：6有100%序列相似度之多核苷酸序列，其由62個核苷酸(62-mer)所組成，並可以結合至放線共生放線桿菌( A. actiomycetemcomitans)表面蛋白。在此實例中，所述適體多核苷酸包含四個雙股區域，分別由3、5、3和4個鹼基對所形成，每一個雙股區域間插入有數個錯誤配對區域，以形成5個分子內的環狀結構，以及兩個單股區域位於多核苷酸的3’端和5’端(參見第2B圖)。

3. 本發明探針及其套組

本揭示內容第二態樣是關於一種用以偵測與牙周病相關細菌的探針。

請參照第1A圖，該圖式是依據本揭示內容一實施方式所示之探針100的示意圖。所述探針100有一長形本體102，其中本體102的一部份彎曲作為一角度延伸部104，其再次沿著相反的方向彎曲形成一錐狀部106，且錐狀部106尾端形成一尖端105，本體102的另一端為非錐形、非彎曲且為鈍狀(即，鈍端108)。探針100中的角度延伸部104讓使用者操作的過程中有較多的空間，然而，本實施方式所揭露的構型僅為例示不限於此。請參見第1B圖，其繪示本發明另一實施方式所示之探針。不同於第1A圖所示的探針100，在此實施方式中所示之探針100’，其本體102’不包含角度延伸部。如圖所示，本體102’於一方向漸縮呈錐狀，形成錐狀部106，且尾端有一尖端105’，而本體102’其他端仍保持非彎曲且為鈍狀(即，鈍端108’)。

請再參見第1A圖，所述錐狀部106附有能夠偵測牙周病原體的試劑，例如，至少一上述本發明適體。舉例而言，錐狀部106的一部份(即，110)附有能夠結合至牙齦卟啉單胞菌表面蛋白之適體，而錐狀部106的其他部份(即，112)附有能夠結合至放線共生放線桿菌之適體；透過此一方式，所述探針100能夠同時在同一樣本內偵測牙齦卟啉單胞菌和放線共生放線桿菌。此外，在可任選的實施方式中，所述錐狀部106的一部份(即，114)附有緩衝液，此部份作為操作過程的參照點。再者，所述探針(如，錐狀部106)至少某些部份較佳是由多孔材料所製成，以吸收本發明適體和/或偵測試劑。舉例而言，本體102中至少錐狀部106是由纖維素或纖維材料所製成，而探針本體的其他部份(例如探針的非彎曲部分，包括鈍端108)則是由堅硬的材料（如，塑膠、木材等）所製成，讓使用者在操作過程中能夠方便握持。

在實際使用的過程中，牙醫師或牙科衛生師可以使用探針100之錐狀部106，特別是尖端105，直接採集患者口腔樣本，或從疑似患病的牙齒和牙齦間的囊袋採集樣本。然後對探針進行定性分析，如顯色試驗，酵素連接免疫吸附試驗（ELISA）等，讓本探針上與適體結合的細菌可以透過肉眼或在適當的裝置下觀察。因此，本發明適體更進一步與試劑接合，使得細菌適體結合物能夠被觀察。在某些實施例中，本發明適體更進一步與金奈米顆粒相接合。在其他實施例中，本發明適體是被生物素化。

此外，在可任選的實施方式中，在進行定性分析之前，將合適的試劑施用至探針100錐狀部106上的某些部份(110、112)，以放大細菌適體結合物的訊號，因此，探針100上的細菌適體結合物可以經由肉眼或合適的裝置被觀察。依據某些實施方式，可將含有膠體金前驅物之放大劑施用至錐狀部106某些部份(110、112)，以放大與奈米金顆粒接合適體的訊號；另外，亦可將酵素(如，鏈親和素或抗生物素蛋白)施用至錐狀部106某些部份(110、112)以放大生物素化適體的訊號。探針上的細菌和金奈米顆粒接合適體所形成的複合物和/或細菌和生物素化適體所形成的複合物，是代表來自於個體口腔內的樣本有與牙周病相關細菌(如，牙齦卟啉單胞菌、放線共生放線桿菌或其組合)的存在。

本揭示內容亦可包含偵測個體口腔樣本內牙周病相關細菌的套組。所述套組可包含本揭示內容之探針、放大劑和酵素(如，抗生物素蛋白或鏈親和素)，以放大本發明適體訊號。套組可更包含與套組相關的標示及說明。所述相關標示及說明是用來說明偵測與牙周病相關細菌的探針。可任選的實施方式中，所述套組可包含一緩衝液，例如，一緩衝液，例如，磷酸鹽緩衝溶液或林格氏液。所述套組更包含一指引，用以說明如何利用套組所附的放大劑和酵素放大本發明探針上之適體的訊號。

依據一實施方式，所述套組至少包含：(a) 含本發明探針之第一容器；以及非必要的包含(b)含放大劑之第二容器；非必要的包含(c)含酵素之第三容器(即，鏈親和素或抗生物素蛋白)；非必要的包含(c)含緩衝液之第四容器，以及(c)與套組相關的使用說明。所述說明的形式可以是小冊子、錄音帶、CD、VCD或DVD。

4. 偵測牙周病原體的方法

在第四態樣中是關於一種偵測個體口腔所取得的樣本是否存在與牙周病相關細菌的方法。所述方法包含：以本揭示內容探針接觸該樣本；偵測探針上本發明適體與牙周病相關細菌所形成的複合物，其係作為樣本中是否存在與牙周病相關細菌的指標。

依據本揭示內容之實施方式，利用本揭示內容探針的錐狀部採集人類個體口腔牙齦下牙菌斑(subgingival plaque)樣本或牙齦溝液樣本(gingival cervicular fluid)，其中探針錐狀部附有本發明適體。

此外，在可任選的實施方式中，本發明適體(如，序列編號：5或6)更與金奈米顆粒接合，或者是被生物素化。於接觸樣本後，讓探針直立一足夠的時間形成細菌和金奈米顆粒接合適體複合物或細菌和生物素化適體複合物。再者，視需要地放大與細菌結合適體的訊號，讓肉眼能夠直接觀察所述複合物。舉例而言，所述探針可利用含膠態金前驅物之放大劑處理，進而放大與金奈米顆粒接合適體的訊號；而亦可添加抗生物素蛋白或鏈親和素放大生物素化適體的訊號。

依據本揭示內容之實施方式，所述放大劑包含：一式(I)表面活性劑：

是氟、氯、溴或碘；一膠態金前驅物；以及一還原劑。

依據本揭示內容之實施方式，所述式(I)表面活性劑中的R ₁是十六烷基；R ₂、R ₃和R ₄分別是甲基；以及

是氯。

依據本揭示內容之實施方式，所述還原劑是維他命A、維他命C、維他命E或其組合。在一實施例中，所述還原劑是維他命C。

依據本揭示內容之實施方式，所述膠態金前驅物是HAuCl ₄。

依據本揭示內容之實施方式，本方法能夠偵測與牙周病相關細菌的最低量為10。

依據本揭示內容之實施方式，所述放大劑是能用以放大複合物之訊號至少1,000倍。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。

實施例

材料與方法

培養牙周病原體

牙齦卟啉單胞菌 (Pg) (ATCC® 33277™)被活化並培養於ATCC®培養基2722中，置於厭養箱37℃培養至少4天，接著篩選出單一菌落，再將其培養至一新的培養皿後，於厭養箱中培養備用。放線共生放線桿菌(Aa) (ATCC® 29522™)被活化並培養於ATCC®培養基44中，以含有5% CO ₂的培養箱，於37℃培養兩天備用。緩鏈球菌( Streptococcus mitis,Sm) (ATCC® 49456™)被活化並培養於固態ATCC®培養基44中，以含有5% CO ₂的培養箱，於37℃培養24小時備用。

DNA 適體之製備

1. 從適體資料庫中篩選出 DNA 適體

從DNA資料庫篩選出可結合到牙周病原體表面蛋白的寡核苷酸分子，委託MDBio, Inc(Taiwan, R.O.C.)公司執行，過程中利用 SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法得到能夠對抗牙齦卟啉單胞菌、放線共生放線桿菌或和緩鏈球菌的SELEX衍生單股DNA(SELEX-derived single stranded DNA)分子。簡言之，將SELEX適體(約10 ¹⁵適體)(10 μL)與SELEX緩衝液(90 μL)混合，首先將混合物加熱至95℃持續2分鐘，接著以每分鐘下降2℃的速率冷卻至39℃。將細菌培養液(500 μL，OD = 0.6至 0.7，含約1x10 ⁹細菌)與SELEX緩衝液混合，並利用SELEX緩衝液將總體積添加至1,500 μL。將混合物置於旋轉混合器(rotary mixer)上，於室溫下混合約30分鐘，接著離心5分鐘 (6,000 x g)。去除懸浮液，將沈澱物再懸浮至1,000 μL SELEX緩衝液，接著離心5分鐘 (6,000 x g)。重複所述步驟五次。將沈澱物懸浮至1,000 μL SELEX緩衝液，加熱至95℃，10分鐘，接著離心5分鐘 (6,000 x g)，收集懸浮液。

2.聚合酶鏈反應( Polymerase Chain Reaction, PCR)放大選擇的DNA適體

將所選擇的適體與PCR試劑混合，於94℃加熱2分鐘，於94℃加熱30秒，於57℃加熱30 秒，以及於72℃加熱20 秒。接著，純化PCR 產物，並利用合適的載體進行複製。

藉由SELEX和PCR分別進行選擇和放大後，鑑別出對抗牙齦卟啉單胞菌的產物（62 bp），其具有序列編號：5之多核苷酸序列。同樣地，鑑別出對抗放線共生放線桿菌的產物（62 bp），其具有序列編號：6之多核苷酸序列。以電腦模擬序列編號：5 和6的二級結構，請參見第2A圖和第2B圖。

利用即時定量聚合酶鏈反應( Real-time Qualitied Polymerase Chain Reaction)測定 DNA 適體的結合親和力及專一性

1. 結合親和力

將適體(48.8 pM)與等量的細菌 (即，牙齦卟啉單胞菌、放線共生放線桿菌或和緩鏈球菌 )混合，接著將混合物(1,500μL)以旋轉混合器於室溫下混合30分鐘，接著離心5分鐘(6,000 x g)。去除懸浮液，將沈澱物以SELEX緩衝液再懸浮至1,000 μL。重複所述步驟5次。將沈澱物再懸浮至1,000 μL SELEX緩衝液，於95℃加熱10分鐘，接著離心5分鐘（ 6,000 x g），收集懸浮液。接著以即時定量聚合酶鏈反應(real time qualitied polymerase chain reaction (RQPCR))放大產物，放大後的產物再利用電泳依據分子量大小進行分離。

2. 結合專一性

適體 (12.5 nM)與等量的細菌(即，牙齦卟啉單胞菌、放線共生放線桿菌或和緩鏈球菌 )混合，並於室溫下旋轉混合30分鐘。所述混合物離心 (6000 x g) 5分鐘，去除懸浮液，在以SELEX緩衝液懸浮沈澱物。重複離心處理五次，最終再以1,000 μL SELEX緩衝液懸浮沈澱物。將混合物於95℃加熱10分鐘，接著離心5分鐘(6,000 x g)，收集懸浮液。收集到的適體接著以PCR放大，再以電泳依據分子量大小進行分離。

以金奈米 顆粒接合適體捕捉牙周病原體

以檸檬酸鈉還原四氯金酸 (HAuCl ₄) 製得金奈米顆粒。接著，將製得的金奈米顆粒 (1 x 10 ^-7nM)接合至經SH修飾適體引子(經授權的合成由MDBi, Inc.提供(台北，台灣))上（莫耳比1：1,000），藉由離心移除未接合的引子。收集沈澱物並且與細菌溶液(1 x 10 ⁹)混合。將混合物置於於旋轉混合器上，接著於室溫下進行接合反應一小時。以穿透式電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy, TEM)檢測所述接合產物。

構建高靈敏度側流檢測條

在三種不同的條帶上分別施用金奈米顆粒接合適體(100μL)至玻璃纖維條的一區域(在此稱為「B區」)上、緩衝液A (即，1% BSA) (100μL)至纖維素樣本墊的一區域(在此稱為「A區」)上，以及鏈親和素和適體-生物素複合物(經授權的合成由MDBi, Inc.提供(台北，台灣))( 0.6 μL)至Hi-Flow Plus 135膜卡的一區域(在此稱為「C區」)上。將所述三條帶相互黏合以形成檢測條(寬度0.4公分)。所述檢測條的示意圖繪製於第5圖中，圖中所示的「A」「B」「C」區分別吸收上述的「緩衝液A」、「金奈米顆粒接合適體」以及「鏈親和素和適體-生物素複合物」。

製備放大劑

將水(9mL)、十六烷基三甲基溴胺(0.36 g)和HAuCl ₄(5 mM)( 1mL)於一容器中混合，持續攪拌混合物直到製得金色澄清溶液；接著，添加維他命C (100 mM)(600 mL)，充分混合直到製得無色澄清溶液。

實施例 1 測定本發明適體對於牙周病原體的結合親和力和專一性

在此實施例中，依據上述「材料和方法」一節中所述步驟測定特定適體對於牙周病原體的結合親和力和專一性。結果請參見第3圖。

如第3圖所示，具序列編號：5之適體對於牙齦卟啉單胞菌(Pg)展現較高的結合專一性(Kd = 4.592 nM)，而對於放線共生放線桿菌(Aa)或和緩鏈球菌(Sm)的專一性較低(第3A圖)；其中具序列編號：6之適體對於放線共生放線桿菌 (Aa)專一性較高(Kd =3.503 nM) ，而對於牙齦卟啉單胞菌(Pg)或和緩鏈球菌 (Sm)的專一性較低(第3B圖)。

實施例 2 以與金奈米顆粒接合的適體捕捉牙齦卟啉單胞菌和放線共生放線桿菌

在此實施例中，序列編號5或序列編號6之適體先與金奈米顆粒接合，接著再用以捕捉牙周病原體。結果以TEM照片呈獻，請參見第4A和4B圖。

第4A圖是序列編號：5之金奈米顆粒接合適體捕捉牙齦卟啉單胞菌之 TEM 照片，以及第4B圖是序列編號：6之金奈米顆粒接合適體捕捉放線共生放線桿菌之 TEM 照片。

實施例 3 利用高靈敏度側流檢測條 (Side-Flow Detection Strips) 測定本發明適體的交叉反應

依據上述「材料和方法」一節中所揭示的步驟建構高靈敏度側流檢測條(參見第5圖)。在一組檢測條中，所述牙齦卟啉單胞菌之金奈米顆粒接合適體，以及鏈親和素與生物素化牙齦卟啉單胞菌適體複合物分別固定在檢測條上。接著，將放線共生放線桿菌（10 ⁹）添加至檢測條上，測定是否產生任何交叉反應。結果顯示，在牙齦卟啉單胞菌(序列編號： 5)之生物素化適體和放線共生放線桿菌之間有輕微的交叉反應。以相同的方式測定，以檢測條偵測放線共生放線桿菌 (序列編號： 6)之適體與牙齦卟啉單胞菌間是否產生交叉反應，結果顯示在放線共生放線桿菌適體(序列編號： 6)和牙齦卟啉單胞菌之間無交叉反應。

實施例 4 本發明適體捕捉牙周病原體的靈敏度

4.1 測定本發明放線共生放線桿菌之適體的靈敏度

在此實施例中，檢測條上分別載有放線共生放線桿菌之3’生物素化適體或5’生物素化適體，接著將不同量之放線共生放線桿菌分別施用至含有適體的區域上。

結果顯示本發明之適體能夠偵測廣範圍之放線共生放線桿菌（即，10至1,000,000）；由此可以得知本發明適體捕捉放線共生放線桿菌的靈敏度高。

4.2 增強本發明與金奈米顆粒接合之適體的訊號

在此實施例中，以習知的放大劑增強金奈米顆粒的訊號，將其應用至實施例4.1的偵測點上，以放大偵測訊號。所述放大劑以「材料和方法」一節所述步驟製備。結果摘要於表1中。

表1放大劑對於偵測放線共生放線桿菌或牙齦卟啉單胞菌的影響

	細菌編號
10 ⁹	10 ⁸	10 ⁷	10 ⁶	10 ⁵	10 ⁴	10 ³	10 ²	10 ¹
未添加放大劑
*A.a*	+	+	+	+	+	-	-	-	-
*P.g*	+	+	+	+	-	-	-	-	-
添加放大劑
*A.a*	+	+	+	+	+	+	+	+	+
*P.g*	+	+	+	+	+	+	+	+	+

+ ：可以肉眼觀察到。 - ：無法以肉眼觀察到。

由上述結果證實，本發明放線共生放線桿菌之適體的靈敏度於添加放大劑後能夠增加至少1,000倍，在先前無法偵測到的細菌 (即，＜10 ⁶)或者是細菌量較低時（即10），以本方法皆能夠測得。

實施例 5 利用本發明適體偵測人類個體中的牙周病原體

在此實施例中，從牙齒表面（含前面、後面或咀嚼面）、齒間和/或沿著牙齦線採集口腔樣本，受測患者共五人（即，患者1至患者5），皆透過書面同意使用本發明偵測探針執行本試驗，且所述探針上固定有牙齦卟啉單胞菌之金奈米顆粒接合適體。結果示於第8圖。

在五個患者中，患者1和患者3經確認有牙菌斑，而患者2、4和5未患有牙菌斑（第8圖）。此外，患者1和3更進一步確認牙齒上存有牙齦卟啉單胞菌，此結果可作為患者1和患者3未來發展成為牙周病風險較高之參考。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

本發明主要元件符號列示如下：探針100、100’ 本體102、102’ 角度延伸部104 尖端105、105’ 錐狀部106 鈍端108、108’ 部份110、112、114 區A、B、C

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖和第1B圖分別是依據本揭示內容實施方式所示之用以偵測與牙周病相關細菌之探針的示意圖；第2A圖和第2B圖分別是依據本揭示內容一實施方式所示之本發明序列編號： 5之適體的第二級結構(第2A圖)和序列編號：6之適體的第二級結構(第2B圖)；第3A圖是依據本揭示內容一實施方式所示牙齦卟啉單胞菌之適體對於牙齦卟啉單胞菌、放線共生放線桿菌或和緩鏈球菌(S. mitis)結合專一性之條狀圖；第3B圖是依據本揭示內容一實施方式所示放線共生放線桿菌之適體對於放線共生放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌或和緩鏈球菌結合專一性之條狀圖；第4A圖是依據本揭示內容一實施方式所示之牙齦卟啉單胞菌表面上結合有與金奈米顆粒接合之牙齦卟啉單胞菌適體的TEM影像；第4B圖是依據本揭示內容一實施方式所示之放線共生放線桿菌表面上結合有與金奈米顆粒接合之放線共生放線桿菌適體的TEM影像；第5圖是依據本揭示內容一實施方式所示高靈敏度側流檢測條，其中「A」、「B」、「C」分別是指偵測條上的區域分別含緩衝液、牙齦卟啉單胞菌金奈米顆粒接合適體，以及鏈親和素與生物素化牙齦卟啉單胞菌適體複合物；以及第6圖是依據本揭示內容一實施方式所示利用本發明牙齦卟啉單胞菌適體偵測健康或患有牙周病個體樣本內的牙齦卟啉單胞菌。

根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。

              序列表
          <![CDATA[<110> 國立成功大學]]>
          <![CDATA[<120> 牙周病原體表面蛋白之適體及其用途]]>
          <![CDATA[<130> P3055-US]]>
          <![CDATA[<160> 6]]>
          <![CDATA[<170> BiSSAP 1.3.6]]>
          <![CDATA[<210> 1]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213> 人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 1]]>
          tgtaactggg agcggaccta ggttacatga                                     30
          <![CDATA[<210> 2]]>
          <![CDATA[<211> 30]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213>人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 2]]>
          cgtatgtgta cccggtgggg cgcgattgac                                     30
          <![CDATA[<210> 3]]>
          <![CDATA[<211> 16]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213>人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 3]]>
          tccctacggc gctaac                                                    16
          <![CDATA[<210> 4]]>
          <![CDATA[<211> 16]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213>人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 4]]>
          gccaccgtgc tacaac                                                    16
          <![CDATA[<210> 5]]>
          <![CDATA[<211> 62]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
          <![CDATA[<213>人工序列]]>
          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223>合成]]>
          <![CDATA[<400> 5]]>
          tccctacggc gctaactgta actgggagcg gacctaggtt acatgagcca ccgtgctaca     60
          ac                                                                    62
          <![CDATA[<210> 6]]>
          <![CDATA[<211> 62]]>
          <![CDATA[<212> DNA]]>
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          <![CDATA[<220> ]]>
          <![CDATA[<223> 合成]]>
          <![CDATA[<400> 6]]>
          tccctacggc gctaaccgta tgtgtacccg gtggggcgcg attgacgcca ccgtgctaca     60
          ac                                                                    62

探針100 本體102 角度延伸部104 尖端105 錐狀部106 鈍端108 部份110、112、114

Claims

一種單離適體，可專一性結合至牙齦卟啉單胞菌(Prophyromonas gingivalis)的表面蛋白，其特徵在於包含一序列編號：1之第一多核苷酸序列。
如請求項1所述之單離適體，更包含一序列編號：3之第二多核苷酸序列和一序列編號：4之第三多核苷酸序列，分別位於序列編號：1之第一多核苷酸序列的上游處和下游處。
一種單離適體，可專一性結合至放線共生放線桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans)的表面蛋白，其特徵在於包含一序列編號：2之第四多核苷酸序列。
如請求項3所述之單離適體，更包含一序列編號：3之第二多核苷酸序列和一序列編號：4之第三多核苷酸序列，分別位於序列編號：2之第四多核苷酸序列之上游處和下游處。
一種用以偵測牙齦卟啉單胞菌或放線共生放線桿菌的探針，其具有一本體，並且該本體至少一部份附有如請求項2或4所述之單離適體。
如請求項5所述之探針，其中該如請求項2或4所述之單離適體被生物素化，或者與一金奈米顆粒接合，其中當如請求項2所述之單離適體被生物素化，則如請求項4所述之單離適體與該金奈米顆粒接合，反之亦然。
一種用以偵測從一個體口腔採集的一樣本內牙齦卟啉單胞菌或放線共生放線桿菌的套組，包含：如請求項6所述之探針；以及一放大劑或一酵素，用以放大如請求項2或4所述之單離適體的訊號。
如請求項7所述之套組，其中該放大劑包含：一式(I)表面活性劑：NR ₁ R ₂ R ₃
X ^-，其中R₁是C_12-22烷基；R₂、R₃和R₄分別是C_1-3烷基；以及 X ^-是氟、氯、溴或碘；一膠態金前驅物；以及一還原劑。
如請求項所8述之套組，其中在該式(I)中，R₁是十六烷基(cetyl)；R₂、R₃和R₄分別是甲基；以及X ^-是氯。
如請求項8所述之套組，其中該還原劑是維他命A、維他命C、維他命E或其組合。
如請求項8所述之套組，其中該膠態金前驅物是HAuCl₄。
如請求項7所述之套組，其中該酵素是鏈親和素或抗生物素蛋白。
一種用以偵測從一個體口腔採集的一樣本內牙齦卟啉單胞菌或放線共生放線桿菌的方法，包含：(1)以如請求項6所述之探針接觸該樣本；(2)將步驟(1)中的該探針以一放大劑或一酵素處理；以及(3)偵測該如請求項6所述之探針上的該如請求項2或4所述之單離適體以及該牙齦卟啉單胞菌或放線共生放線桿菌所形成的複合物，其係作為樣本中是否存在牙齦卟啉單胞菌或放線共生放線桿菌的指標。
如請求項13所述之方法，其中該如請求項2或4所述之單離適體被生物素化或與金奈米顆粒接合，當該如請求項2所述之單離適體被生物素化，則該如請求項4所述之單離適體與該金奈米顆粒接合，反之亦然。
如請求項14所述之方法，其中在該步驟(2)中，該酵素是鏈親和素或抗生物素蛋白。
如請求項15所述之方法，其中該方法能夠偵測牙齦卟啉單胞菌或放線共生放線桿菌的最低量為10。
如請求項13所述之方法，其中在該步驟(2)中，該放大劑包含：一式(I)表面活性劑：NR ₁ R ₂ R ₃
X ^-，其中 R₁是C_12-22烷基；R₂、R₃和R₄分別是C_1-3烷基；以及X ^-是氟、氯、溴或碘；一膠態金前驅物；以及一還原劑。
如請求項17所述之方法，其中在該式(I)中，R₁是十六烷基；R₂、R₃和R₄分別是甲基；以及X ^-是氯。
如請求項17所述之方法，其中該還原劑是維他命A、維他命C、維他命E或其組合。
如請求項17所述之方法，其中該膠態金前驅物是HAuCl₄。
如請求項17所述之方法，其中該放大劑能夠放大該複合物的訊號至少1,000倍。