TWI494566B - 膀胱癌特異性配體肽 - Google Patents
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Description
本申請案主張美國臨時申請案第61/245,492號(2009年9月24日提出申請)之權益,彼之整體內容現以參照方式納入本文以適合所有目的。
本發明關於包含胺基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO:1)之膀胱癌特異性配體肽類及彼等於例如膀胱診斷之造影偵測、腫瘤定位以引導經尿道之膀胱癌切除、造影偵測膀胱癌以供初步治療後之追蹤以取代或補充昂貴之膀胱鏡檢查、造影偵測轉移性膀胱癌及標靶治療表淺性及轉移性膀胱癌之使用方法。
膀胱癌在男性是第四常見之癌症,在女性排名第九(Jemal,et al.,Cancer J Clin,(2008)58:71-96)。大約75%之病患被診斷時屬於非侵入期(Fleming,et al.,AJCC(American Joint Committee on Cancer)Cancer Staging Manuel,5th ed.,5th edition.Philadelphia:Lippincott-Raven,1997)。治療通常採用經尿道切除膀胱腫瘤(TURBT),然後經膀胱灌注卡介苗(BCG)或絲裂黴素C以減少復發。雖然接受此治療,20-80%之病患將復發,25%的疾病將續進展(Herr,et al.,J Clin Oncol,(1995)13:1404-1408;
Herr,et al.,J Urol,(1989)141:22-29及Cookson,et al.,J Urol,(1997)158:62-67)。所有這些病患需要長期追蹤尿液細胞學及膀胱鏡檢查。尿液細胞學檢查之敏感性介於29至74%,整體敏感性約為35%(Eissa,et al.,Curr Opin Obstet Gynecol,(2003)15:395-403;van Rhijn,et al.,Eur Urol,(2005)47:736-748及Lotan,et al.,Urology,(2003)61:109-118)。膀胱鏡檢查是侵入性、令人不適且昂貴之檢查。由於長期存活及終生監測之需求,每個膀胱癌病例之花費是所有癌症類型中最高的一種,每病例需要自96,000至187,000美金(2001年資料)(Riley,et al.,Med Care,(1995)33:828-841;Botteman,et al.,Pharmacoeconomics,(2003)21:1315-1330)。
本發明某種程度上係根據使用組合式化學技術以發展供膀胱癌診斷、治療及追蹤期間之造影及標靶治療用之膀胱癌特異性配體。一珠一化合物之組合式肽分子庫技術(OBOC)(Lam,et al.,Nature,(1991)354:82-84,1991及Lam,et al.,Chem Rev,(1997)97:411-448)係用於識別膀胱癌特異性配體。採用「分配-混合」合成方法以建構該組合式分子庫時,產製含數百萬顆珠(直徑90微米)之隨機分子庫。每顆珠最高攜帶1013個具有相同胺基酸序列之配體。在每一輪之篩選,可對數百萬計之分子庫珠(配體)平行篩選特異性目標(受體、抗體、酶、病毒及全細胞等)。目標陽性之珠可利用與西方墨點法類似之酶連接比色測定識別,或由細胞附著於珠表面之證據證實(Songyang,et al., J Biol Chem,(1995)270:14863-14866及Liu,et al.,J Am Chem Soc,(2002)124:7678-7680)。非天然胺基酸、D-胺基酸或甚至非肽基團可被納入該分子庫以製備對蛋白水解具抗性及結合親和性增加之分子。藉由篩選OBOC分子庫所識別之配體先導物可被進一步最佳化以產製具高親和性及專一性之癌特異性配體(Peng,et al.,Nat Chem Biol,(2006)2:381-389)。
本發明提供選擇性地與膀胱癌組織結合且極少地或不與正常膀胱組織或非膀胱組織結合之肽類。因此,在一態樣中,本發明提供一種包含胺基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO:18)之肽,其中X1及X5係任何胺基酸,其中該肽之長度不超過10個胺基酸且與膀胱癌細胞結合。在一些實施態樣中,該肽之長度不超過9個胺基酸。在一些實施態樣中,該肽之長度不超過8個胺基酸。在一些實施態樣中,該肽之長度不超過7個胺基酸。
在一些實施態樣中,該肽不與正常細胞結合,包括正常膀胱細胞。
在相關實施態樣中,本發明提供一種包含胺基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO:18)之融合蛋白,其中X1及X5係任何胺基酸及第二多肽(對該肽為異源性)。在一些實施態樣中,該第二多肽係免疫球蛋白(例如IgG)之Fc部分。在一些實施態樣中,該第二多肽係人IgG1、IgG2、IgG3
及IgG4同型之Fc區。在一些實施態樣中,該第二多肽係細胞毒素。
在相關實施態樣中,本發明提供一種包含胺基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO:18)之多肽,其中X1及X5係任何胺基酸,其中該多肽之長度不超過300個胺基酸,例如長度不超過250、200、150、100、75、50或25個胺基酸,且與膀胱癌細胞結合。
在相關實施態樣中,本發明提供一種包含胺基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO:1)之多肽或肽,其中:i)一或多個胺基酸殘基係D-胺基酸;ii)該多肽或肽在N-端或C-端中之一或二者包含保護基;iii)該多肽或肽係完全地或部分地逆反;iv)該多肽或肽包含2或多個(例如3、4、5、6或多個)胺基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO:1)之重複;v)該多肽或肽係環狀;vi)一或多個胺基酸殘基係附著於擬肽骨架;vii)一或多個胺基酸殘基係β胺基酸殘基;或viii)該多肽或肽係由羥連結(hydrocarbon staple)加以穩定。
在一些實施態樣中,X1係麩醯胺酸、甘胺酸或丙胺酸(SEQ ID NO:19)。在一些實施態樣中,X5係甲硫胺酸、離胺酸、甘胺酸、丙胺酸或甘胺酸-甘胺酸(SEQ ID NO:3)。在一些實施態樣中,X1係麩醯胺酸、甘胺酸或丙胺酸且X5係甲硫胺酸、離胺酸、甘胺酸、丙胺酸或甘胺酸-甘
胺酸(SEQ ID NO:4)。
在一些實施態樣中,該肽具有胺基酸序列QDGRMGF(SEQ ID NO:5)。在一些實施態樣中,該肽具有胺基酸序列QDGRKGF(SEQ ID NO:6)。在一些實施態樣中,該肽具有胺基酸序列QDGRKGGF(SEQ ID NO:7),其中KG係指彼之側鏈被甘胺酸殘基附著之離胺酸殘基。該等肽類可任意選擇地在N-端及/或C-端毗鄰D-半胱胺酸殘基,及可任意選擇地為環狀。
在一些實施態樣中,該肽不與正常膀胱組織結合。
在一些實施態樣中,該肽與整合素α5β3結合。在一些實施態樣中,該肽與整合素α5β5結合。
在一些實施態樣中,該肽在胺基及/或羧基端另包含1至5個毗鄰胺基酸殘基,例如在胺基及/或羧基端之1、2、3、4或5個胺基酸殘基。在一些實施態樣中,該肽在胺基及/或羧基端另包含1至5個毗鄰胺基酸殘基(SEQ ID NO:8)。在一些實施態樣中,該肽在胺基及/或羧基端另包含2個毗鄰胺基酸殘基(SEQ ID NO:9)。在一些實施態樣中,該肽具有胺基酸序列cX1DGRX5GFc(SEQ ID NO:20),其中X1及X5係任何胺基酸,且c係D-半胱胺酸。在一些實施態樣中,該肽係環狀。
在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性配體肽(或彼之重複)可被包埋或位處於較長之多肽序列(例如融合序列或另一非天然發生之多肽序列)之內。在一些實施態樣中,該肽係與一或多個額外多肽連接(例如經由化學鍵結或融
合),例如在該胺基及/或羧基端。在一些實施態樣中,該肽係與一或多個治療性基團或可偵測之標記連接(例如經由化學鍵結或融合)。
在一些實施態樣中,該肽係與治療性基團連接,例如細胞毒素、抗癌劑、放射性同位素或免疫球蛋白(“Ig”)例如IgG之Fc部分。在一些實施態樣中,該肽係與人IgG1、IgG2、IgG3及IgG4同型之Fc區連接。在一些實施態樣中,該抗癌劑係包封於脂質體中。在一些實施態樣中,該肽係與可偵測之標記連接,例如造影標記、珠、染料、螢光團、化學發光基團、磁性顆粒(例如氧化鐵顆粒)、金屬顆粒(例如金顆粒)、放射性同位素(例如3H、32P、125I、123I、11C、13N、15O、18F、82Rb、鎝-99m(Tc-99m)、鉈-201)。
在相關態樣中,本發明提供包含如此處所述之膀胱癌特異性多肽或肽配體及醫藥上可接受之載劑之組成物。在一些實施態樣中,該等膀胱癌特異性肽類係經調製為奈米粒子。
在另一態樣中,本發明提供偵測膀胱癌存在之方法,該方法包含使膀胱細胞或膀胱組織(或疑似包含膀胱癌轉移之組織)與本發明之膀胱癌特異性肽接觸,及測定該肽與該細胞或組織之結合,其中偵測到該肽與該細胞或組織之結合表示膀胱癌或膀胱癌轉移之存在。該膀胱癌特異性肽之實施態樣係如此處所述。
在相關態樣中,本發明提供偵測膀胱癌存在之方法,
該方法包含使尿液樣本中之膀胱細胞與膀胱癌特異性多肽或肽配體接觸,該多肽或肽配體如此處所述地與可偵測之標記連接,及測定該肽與該膀胱細胞之結合,其中偵測到該肽與該膀胱細胞之結合表示膀胱癌或膀胱癌轉移之存在。在一些實施態樣中,該等方法另包含濃縮該尿液樣本中之膀胱細胞。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽係與經標記之珠共軛。舉例來說,該珠可能以螢光標記、化學發光標記或量子點標記標示。該膀胱癌特異性肽之其他實施態樣係如此處所述。
在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽結合之信號係可偵測的,表示膀胱癌之存在。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽結合之信號係不可偵測的,表示膀胱癌不存在。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽結合之信號係高於閥值,表示膀胱癌之存在。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽結合之信號係低於閥值,表示膀胱癌不存在。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽結合之信號係高於該膀胱癌特異性肽與正常對照組織(例如膀胱細胞或膀胱組織)結合之信號,表示膀胱癌之存在。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽結合之信號係大約等於或低於該膀胱癌特異性肽與正常對照組織(例如膀胱細胞或膀胱組織)結合之信號,表示膀胱癌不存在。
在另一態樣中,本發明提供於有此需要之個體體內抑制、減少或預防膀胱癌細胞生長之方法,該方法包含使該膀胱癌細胞或膀胱組織(或包含膀胱癌轉移之組織)與膀胱
癌特異性多肽或肽接觸,該多肽或肽如此處所述地與治療性基團連接,其中該肽與膀胱癌細胞結合,且該治療性基團抑制、減少或預防膀胱癌細胞生長或殺死膀胱癌細胞。該膀胱癌特異性肽之實施態樣係如此處所述。
該膀胱癌特異性肽配體本身亦具有治療效果,因為彼等可被用於阻斷、抑制、減少或預防膀胱癌細胞之生長、移動及轉移。因此,在相關態樣中,本發明提供於有此需要之個體體內抑制或預防膀胱癌細胞生長之方法,該方法包含使該膀胱癌細胞或膀胱組織(或包含膀胱癌轉移之組織)與此處所述之膀胱癌特異性多肽或肽接觸,其中該肽與膀胱癌細胞結合且阻斷、抑制、減少或預防膀胱癌細胞之生長、移動及轉移。該膀胱癌特異性肽之實施態樣係如此處所述。
在另一態樣中,本發明提供原位偵測組織中之膀胱癌之方法,該方法包含使該組織與此處所述之膀胱癌特異性多肽或肽配體接觸,其中該肽與該組織中之膀胱癌細胞結合,藉以原位偵測組織中之膀胱癌細胞。該組織可在疑似罹患或已知罹患膀胱癌之個體體內。該組織可為膀胱組織或另一組織,例如疑似包含膀胱癌轉移。此可被進行以達成例如造影或協助腫瘤切除之目的。在一些實施態樣中,該等方法另包含捕捉及/或紀錄組織中膀胱癌細胞之影像,例如基於偵測膀胱癌特異性肽配體之結合。在一些實施態樣中,該等方法另包含自該組織移除、切除或切掉膀胱癌細胞,例如基於偵測膀胱癌特異性肽配體之結合。
在一些實施態樣中,該膀胱癌細胞或膀胱組織係於活體外。舉例來說,在一些實施態樣中,該肽係與尿液樣本中之膀胱細胞接觸。
在一些實施態樣中,該膀胱癌細胞或膀胱組織係於活體內,意即在個體體內。
在一些實施態樣中,該個體係哺乳動物,例如人、非人靈長動物或犬。
在一些實施態樣中,該肽係經靜脈內、腫瘤內或尿道內對該個體投予。
本發明另提供包含如此處所述之膀胱癌特異性配體之套組。
「毒性基團」係嵌合性分子之部分,該部分使該嵌合性分子對感興趣之細胞具有細胞毒性。
用語「效應基團」或「治療性基團」係指嵌合性分子之部分,該部分意圖對被標靶基團(意即肽配體PLZ4)鎖定之細胞具有效應或識別該免疫共軛物之存在。
用語「嵌合性分子」包括指涉效應分子共價連接至本發明之膀胱癌特異性肽。
用語「細胞毒素」通常包括指涉相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒蛋白(ricin)、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒毒素或彼等之經修飾之毒素。舉例來說,PE及DT係高度毒性化合物,通常經由肝毒性造成死亡
。然而,藉由移除該毒素之天然瞄準(targeting)成分(例如PE之結構域Ia或DT之B鏈)並以不同之瞄準基團(諸如抗體)取代,該經修飾之PE及DT可作為免疫毒素之形式使用。
用語「接觸」包括指涉放置於直接物理關聯。
此處所使用之「多肽」、「肽」及「蛋白質」可交換使用,包括指涉胺基酸殘基之聚合物。此處所使用之用語「肽」係以彼之最廣泛之意義使用,係指習用之肽類(意即包含L或D-胺基酸之短多肽)以及保留該所欲之功能活性之肽相等物、肽類似物及擬肽類。肽相等物可藉由以相關有機酸(諸如PABA)、胺基酸或該類似物取代一或多個胺基酸,或取代或修飾側鏈或官能基而與習用肽類不同。該等用語適用於其中一或多個胺基酸殘基係對應之天然發生胺基酸之人工化學類似物之胺基酸聚合物以及天然發生之胺基酸聚合物。該等用語亦適用於包含保守性胺基酸取代以使該蛋白維持功能性之聚合物。
用語「肽相等物」、「肽類似物」、「肽擬似物」及「擬肽」可交換使用,除非另外說明。肽類似物經常用於醫藥工業以作為具有與該等模板肽類似之性質的非肽藥物。(Fauchere,J.(1986)Adv.Drug Res.15:29;Veber and Freidinger(1985)TINS p.392及Evans et al.(1987)J.Med.Chem 30:1229)。肽類似物通常藉由電腦分子模型發展。與治療有效肽類結構上類似之肽擬似物可被用於產生相等之治療或預防效應。通常,肽擬似物與典範多肽(意即具
有生物或藥理活性之多肽)之結構類似,諸如天然發生之受體結合多肽,但具有一或多個可任意選擇地藉由該領域已知之方法被選自下列之鍵結取代之肽鍵結:-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-(順式及反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-或--CH2SO-,另於下列參考文獻描述:Spatola,A.F.in“Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides,and Proteins,”B.Weinstein,eds.,Marcel Dekker,New York,p.267(1983);Spatola,A.F.,Vega Data(March 1983),Vol.1,Issue 3,“Peptide Backbone Modifications”(general review);Morley,J.S.,Trends Pharm Sci(1980)pp.463-468(general review);Hudson,D.et al.,Int J Pept Prot Res(1979)14:177-185(---CH2NH-,CH2CH2-);Spatola,A.F.et al.,Life Sci(1986)38:1243-1249(-CH2S);Hann,M.M.,J Chem Soc Perkin Trans I(1982)307-314(-CH-CH-,cis and trans);Almquist,R.G.et al.,J Med Chem(1980)23:1392-1398(-COCH2-);Jennings-White,C.et al.,Tetrahedron Lett(1982)23:2533(-COCH2-);Szelke,M.et al.,European Appln.EP45665(1982)CA:97:39405(1982)(-CH(OH)CH2-);Holladay,M.W.et al.,Tetrahedron Lett(1983)24:4401-4404(--C(OH)CH2-);and Hruby,V.J.,Life Sci(1982)31:189-199(--CH2-S-)。肽骨架之部分或全部亦可被構型約束之環烷基或芳基取代基取代,以限制此處指定之功能性胺基酸側鏈之移動,如以下參考文獻所述:1.Bondinell et
al.Design of a potent and orally active nonpeptide platelet fibrinogen receptor(GPIIb/IIIa)antagonist.Bioorg Med Chem 2:897(1994).2.Keenan et al.Discovery of potent nonpeptide vitronectin receptor(alpha v beta 3)antagonists.J Med Chem40:2289(1997).3.Samanen et al.Potent,selective,orally active 3-oxo-1,4-benzodiazepine GPIIb/IIIa integrin antagonists.J Med Chem 39:4867(1996)。
本發明之肽類可藉由已知方法產製,諸如該領域廣為周知之重組及合成方法。重組技術大致描述於Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,(3rd ed.)Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory,(2001)。合成肽之技術係廣為周知且包括該些於Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2456(1963)、Atherton,et al.,Solid Phase Peptide Synthesis:A Practical Approach,IRL Press(1989)及Merrifield,Science 232:341-347(1986)中描述者。
用語「殘基」或「胺基酸殘基」或「胺基酸」包括指涉被納入蛋白質、多肽或肽(總稱為「肽」)之胺基酸。該胺基酸可為天然發生之胺基酸,除非另外限制,可包含與天然發生之胺基酸以類似方式作用之天然胺基酸之已知類似物。
此處所指涉之胺基酸及類似物以下表A中之縮寫表示:
描述蛋白時,「保守性取代」係指該蛋白之胺基酸組成物的變化,該變化不實質改變該蛋白之活性。因此,特定胺基酸序列之「保守性修飾之變異」係指該些對蛋白質活性
不重要之胺基酸的胺基酸取代,或以其他具有類似性質(例如酸性、鹼性、帶正電或負電、極性或非極性等)之胺基酸取代胺基酸以使即使取代重要胺基酸亦不實質改變活性。保守性取代表提供該領域所廣為周知之功能類似之胺基酸。下表B中之六個族群各包含彼此互為保守性取代之胺基酸:
表B
1)丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T);2)天冬胺酸(D)、麩胺酸(E);3)天冬醯胺酸(N)、麩醯胺酸(Q);4)精胺酸(R)、離胺酸(K);5)異白胺酸(I)、白胺酸(L)、甲硫胺酸(M)、纈胺酸(V);及6)苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)、色胺酸(W)。
亦見Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties,W.H.Freeman and Company,New York(2nd Ed.,1992)。
在肽之上下文中用語「實質上類似」表示包含與參考序列在7至10個胺基酸之比較窗中具有至少95%、96%、07%、98%、99%序列一致性之序列的肽。序列一致性之百分比係由比較比較窗中二個最佳排比之序列加以測定,其中為使該二個序列達到最佳排比,在比較窗中之多核苷酸序列之部分相較於參考序列(不包含添加或刪除)可能包含
添加或刪除(意即缺口)。百分比之計算係藉由測定二個序列中出現相同之核酸鹼基或胺基酸殘基之位置的數目,以得到匹配位置之數目,將該匹配位置之數目除以比較窗中之位置總數,並將該結果乘以100以得到序列一致性之百分比。
此處所使用之用語「逆反肽」係指通常包含與具有L-胺基酸之肽相同之胺基酸序列的肽,但是彼之序列係部分地或完全地由D-胺基酸組成,因此與利用L-胺基酸合成之肽具有相反之立體化學。藉由利用反向順序之D-胺基酸(意即該序列係由左至右、自C-端至N-端胺基酸表示,與L-胺基酸之例中所寫或表示之自N-端至C-端相反,見下)建構肽,可得到恢復與該親代L-胺基酸肽相同側鏈立體化學之逆反肽。使用逆反肽序列最小化酶降解,因此能延長該肽基團之生物半衰期。另外,該等序列可能有利地改變由正常L-胺基酸序列所製備之類似共軛物的潛在免疫原性性質。該等逆反序列(如游離肽或共軛物)係特別有用於該些需要或偏好口服活性劑之應用(由於對酶解作用之抗性)。就本發明之目的而言,逆反肽係以“ri”表示,並以由左至右、自C-端至N-端胺基酸書寫,例如與典型L-肽表示法相反。在一實施態樣中,本發明之逆反肽包括所有D異構物胺基酸。當該逆反肽包括所有D異構物胺基酸,該肽被稱為「D-逆肽」。
當用語「實質上純的」或「經分離之」被用於描述肽類,係指與彼等天然相關聯或在合成期間相關聯之蛋白質或其
他汙染物分離之肽。在一實施態樣中,肽或多肽佔包含該肽之組成物中之總多肽含量之至少50%、在一實施態樣中佔總多肽含量之至少60%、在一實施態樣中佔至少75%、在一實施態樣中佔至少90%或在一實施態樣中佔至少95%。
用語「共軛」、「聯結」、「鍵結」或「連接」係指使二個多肽變成一個連續多肽分子。在本發明之內文中,該等用語包括指涉聯結抗體基團與效應分子(EM)。該鍵結可藉由化學裝置或重組裝置進行。化學裝置係指在抗體基團與效應分子之間的反應,可使該二個分子之間形成共價鍵以形成一個分子。
用語「活體內」包括指涉可自彼獲得細胞之有機體的身體之內。「活體外(“Ex vivo”及“in vitro”)」係指可自彼獲得細胞之有機體的身體之外。
用語「惡性細胞」或「惡性病」係指具侵入性及/或能進行轉移之腫瘤或腫瘤細胞,意即癌性細胞。
此處所使用之「哺乳動物細胞」包括指涉源自哺乳動物之細胞,包括人、大鼠、小鼠、天竺鼠、黑猩猩或獼猴。該等細胞可能在活體內或活體外培養。
用語「選擇性反應」係指就抗原而言,配體(此處係指膀胱癌特異性肽配體)與帶有該抗原之細胞或組織整體或部分地優先關聯,但不與缺乏該抗原之細胞或組織關聯。當然會發現分子與非目標細胞或組織之間可能發生某些程度之非特異性交互作用。然而,選擇性反應可被區別為經
特異性辨識該抗原所媒介者。雖然選擇性反應配體與抗原結合,彼等之結合親和性可能不高。另一方面,特異性結合導致該配體與帶有該抗原之細胞之間相較於該結合配體與缺乏該抗原之細胞之間更為強烈之關聯。特異性結合通常導致高於2倍、較佳地高於5倍、更佳地高於10倍及最佳地高於100倍之配體與帶有目標抗原之細胞或組織結合相較於與缺乏該目標抗原之細胞或組織結合之量(每單位時間)。在該等條件下與蛋白特異性結合需要篩選對特定蛋白具特異性之配體。多種測定格式適用於篩選與特定蛋白具特異性免疫反應之配體。舉例來說,固相測定通常被用於與抗原特異性結合之配體。見Harlow & Lane,ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Publications,New York(1988),該手冊說明可用於測定特異性結合反應之測定格式及條件。
用語「閥值」係指預先決定之信號(此處指膀胱癌特異性肽與膀胱細胞或膀胱組織結合)之量,超過該量表示結合及膀胱癌之陽性診斷,低於該量表示未結合及膀胱癌之陰性診斷。該信號之量可根據源自個體族群之測定值。
用語「病患」、「個體(“subiect,”“individual”)」可交換地指哺乳動物,例如人或非人靈長動物、家養哺乳動物(例如犬或貓)、農業哺乳動物(例如牛、豬、綿羊、馬)、實驗室哺乳動物(小鼠、大鼠、倉鼠、兔)。
用語「共投」係指在個體血液中同時存在二種活性劑。共投之活性劑可同時或依序遞送。
用語「有效量」或「有效之量」或「治療有效量」包括指涉足以產生所欲結果之治療劑之劑量,該所欲結果諸如抑制、減少或預防膀胱癌細胞生長或腫瘤生長;增進膀胱腫瘤減少或消除;或阻斷、減少、抑制或預防膀胱癌生長、移動或轉移。關於醫藥組成物所使用之用語「有效量」通常指為達成所欲目標所需要之活性成份(例如本發明之肽)之量。舉例來說,在治療應用中,有效量將為需要被投予至病患以導致治療該尋求治療之特定疾病(例如膀胱癌)之量。用語「治療疾病」表示減少或消除特定疾病之症狀。有效量通常將依該疾病之性質、所使用之肽、投予模式及病患之大小及健康而定。在一實施態樣中,本發明之肽的有效量介於70公斤病患1微克至1克之肽,及一實施態樣介於1微克至10毫克。在一實施態樣中,經投予之肽(或肽類似物)的濃度介於0.1微莫耳至10毫莫耳,一實施態樣介於5微莫耳至1毫莫耳,一實施態樣介於5微莫耳至100微莫耳,及一實施態樣介於5微莫耳至40微莫耳。
此處所使用之用語「治療(“treating”及“treatment”)」係指延遲該用語所應用之疾病或狀況(例如膀胱癌)或該疾病或狀況之一或多個症狀之發生、減緩或逆轉彼等之進展或減輕或預防彼等。
關於腫瘤或癌生長或進展之用語「抑制」、「減少」、「降低」係指以該領域中任何已知方法可測量之量抑制個體體內之腫瘤或癌的生長、擴散、轉移。若腫瘤負荷相較於共投本發明之肽(例如為嵌合性分子之部分)之前的腫瘤負
荷至少減少約10%、20%、30%、50%、80%或100%,則該腫瘤或癌之生長、進展或擴散係經抑制、減少或降低。在一些實施態樣中,腫瘤或癌之生長、進展或擴散相較於投予該肽之前的腫瘤負荷係經抑制、減少或降低至少約1倍、2倍、3倍、4倍或更多。
1.介紹
大部分膀胱移行細胞癌病例係於非侵入階段被診斷。非侵入性膀胱癌係理想的標靶治療目標,因為其易由經膀胱灌注接近、相對於其他人體為獨立之部分而且只有少量混雜細胞。高通量篩選一珠一化合物之組合式肽分子庫係經進行,且範例性膀胱癌特異性配體PLZ4係經識別(胺基酸序列:cQDGRMGFc;SEQ ID NO:12)。PLZ4可選擇性地與膀胱癌細胞系及來自病患之原發性膀胱癌細胞結合,但不與正常尿路細胞、來自膀胱檢體之正常細胞混合物、纖維母細胞及血液細胞結合。其可與所有五種測試之犬膀胱癌細胞系結合。此配體可與經pH 6.0之尿液處理之腫瘤細胞結合,但不與自四名經膀胱卡介苗療法積極治療之病患的尿液所收集之細胞結合。靜脈內注射與近紅外光型染料Cy5.5連接之PLZ4顯示小鼠異種移植中之螢光攝取,該異種移植係發展自經切除之人原發性膀胱癌檢體。因此,該配體可被用於膀胱癌之造影偵測及標靶治療。PLZ4與表現αvβ3整合素但非其他整合素之K562細胞結合。利
用丙胺酸行走及彩虹珠編碼系統測定對細胞結合重要之胺基酸。結構分析顯示細胞結合需要二種結構域。此處所描述之膀胱癌特異性肽配體(包括PLZ4)可於例如膀胱癌之診斷及追蹤/監視之造影偵測及標靶治療中使用。
本發明有部分係根據以肽PLZ4(cQDGRMGFc(SEQ ID NO:12)為例之膀胱癌特異性配體,該配體於活體外與人膀胱移行細胞癌(TCC)細胞系及來自臨床病患之膀胱癌細胞特異性結合,且於活體內集中於小鼠體內發展自病患膀胱切除檢體之腫瘤異種移植內(Zhang,et al,Urologic Oncology:Seminars and Original Investigations(2010)印刷中)。另外,臨床前試驗顯示該等膀胱癌特異性配體用於人及其他哺乳動物之診斷性及標靶治療性目的之潛力。
由於攜帶TCC之犬被用來作為人TCC之自發性、遠交系、免疫競爭性、大型動物模型,且因膀胱TCC係犬最常見之泌尿系統癌(所有病例中之87%)(Fink,et al.,Cancer Res(1997)57:1841-1845),因此測定膀胱癌特異性配體可否與犬膀胱癌結合。由於該膀胱癌特異性配體發生結合,因此具有天然發生之犬膀胱癌之犬係於人治療及診斷之臨床前試驗中使用之重要模型(Deborah,et al.,Urologic Oncology(2000)5:47-59;Dhawan,et al.,Urologic Oncology(2009)27:284-292),因為犬之膀胱腫瘤具有與人之肌肉侵入性膀胱TCC類似之組織病理學外觀、分子特徵、生物學行為及對化學療法之反應(Patrick,et al.,J Comp Pathol(2006)135:190-199 and Mutsaers,et al.,J Vet Intern Med(2003)17:136-144)。本發明之膀胱癌特異性配體具有處理膀胱癌之診斷性及治療性目的之用途。
2.膀胱癌特異性肽配體
本發明提供優先地且特異性地與膀胱癌組織結合之肽配體,且該等肽配體極少地或不與正常膀胱組織或非膀胱組織結合。通常,該膀胱癌特異性肽配體包含胺基酸序列X1DGRX5GF,其中X1及X5係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(例如A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)(SEQ ID NO:1)。該等肽類之長度通常約為7至10個或7至9個胺基酸。在一些實施態樣中,該肽之長度不超過10個胺基酸。在一些實施態樣中,該肽之長度不超過9個胺基酸。在一些實施態樣中,該肽之長度不超過8個胺基酸。在一些實施態樣中,該肽之長度不超過7個胺基酸。
在不同之實施態樣中,該多肽包含胺基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO:18),其中X1及X5係任何胺基酸,其中該多肽之長度不超過300個胺基酸,例如長度不超過250、200、150、100、75、50或25個胺基酸,且與膀胱癌細胞結合。
在不同之實施態樣中,該多肽或肽包含胺基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO:1),其中:i)一或多個(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或所有)胺基酸殘基係D-胺基酸;
ii)該多肽或肽在N-端或C-端中之一或二者包含保護基(例如該N端可被乙醯化且該C端可具有胺基);iii)該多肽或肽係完全地或部分地逆反;iv)該多肽或肽包含2或多個(例如3、4、5、6或多個)膀胱癌特異性肽胺基酸序列之重複,例如X1DGRX5GF(SEQ ID NO:1);v)該多肽或肽係環狀;vi)一或多個胺基酸殘基係附著於擬肽骨架;vii)一或多個胺基酸殘基係β胺基酸殘基;或viii)該多肽或肽係由羥連結(hydrocarbon staple)加以穩定。
在一些實施態樣中,該肽在N端及C端可能具有1至5個毗鄰L-或D-半胱胺酸殘基,例如以允許該肽之環化及/或共軛。舉例來說,該肽配體可包含胺基酸序列CX1DGRX5GFC(SEQ ID NO:17)或cX1DGRX5GFc(SEQ ID NO:10),其中X1及X5係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(例如A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)且c係D-半胱胺酸。在不同之實施態樣中,該肽配體係環狀。
在一些實施態樣中,X1係Q、G或A(SEQ ID NO:2)且X5係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(例如A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。在一些實施態樣中,X1係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(例如A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、
S、T、V、W、Y)且X5係M、K、G、A或GG(SEQ ID NO:21)。在一些實施態樣中,X1係Q、G或A且X5係M、K、G、A或GG(SEQ ID NO:4)。
在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體具有胺基酸序列QDGRMGF(SEQ ID NO:5)。在一些實施態樣中,該肽具有胺基酸序列QDGRKGF(SEQ ID NO:6)。在一些實施態樣中,該肽具有胺基酸序列QDGRKGGF(SEQ ID NO:7),其中KG係指彼之側鏈被甘胺酸殘基附著之離胺酸殘基。額外之胺基酸殘基可被添加至胺基及/或羧基端,例如1至5個胺基酸殘基,例如1、2、3、4或5個胺基酸殘基。半胱胺酸殘基可被添加至胺基及羧基端以允許環化。
在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體具有胺基酸序列X(1-5)X6DGRX7GFX(8-12)(SEQ ID NO:22),其中X(1-5)及X(8-12)係任何胺基酸(意即A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y);X6及X7係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體具有胺基酸序列X1X2X3DGRX4GFX5X6(SEQ ID NO:23),其中X1、X2、X5、X6係任何胺基酸(意即A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y);X3及X4係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。在一
些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體具有胺基酸序列cX1DGRX5GFc(SEQ ID NO:10),其中X1係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y);X5係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y),且c係D-半胱胺酸。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體具有胺基酸序列cQDGRKGFc(SEQ ID NO:11),其中c係D-半胱胺酸。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體具有胺基酸序列cQDGRMGFc(SEQ ID NO:12),其中c係D-半胱胺酸。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體具有胺基酸序列cQDGRK(G1-6)Fc(SEQ ID NO:13),其中c係D-半胱胺酸且其中K(G1-6)係指彼之側鏈被1至6個甘胺酸殘基附著之離胺酸殘基。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體具有胺基酸序列CQDGRMGFC(SEQ ID NO:14)。在一些實施態樣中,該肽係環狀。
該膀胱癌特異性肽中之一或多個胺基酸可為D-胺基酸。在一些實施態樣中,該肽配體中之所有胺基酸殘基係D-胺基酸。在不同之實施態樣中,該肽配體係部分逆反或完全逆反。
通常,該膀胱癌特異性肽係實質上經純化及/或分離。
額外之胺基酸殘基或多肽序列可任意選擇地與該肽配體之胺基及/或羧基端連接(例如經由化學鍵結或融合)。在
一些實施態樣中,此處所述之膀胱癌特異性肽序列可被包埋或位處於較長之多肽序列(例如融合序列或另一非天然發生之多肽序列)之內。舉例來說,在不同之實施態樣中,該等肽類可能與免疫球蛋白之Fc部分(例如以增進抗體依賴性細胞性細胞毒性(ADCC)及/或補體依賴性細胞毒性(CDC))或細胞毒素連接。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體係與IgG抗體之Fc區連接。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體係與人IgG1、IgG2、IgG3及IgG4同型之Fc區連接。
在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體係與治療性劑共軛。在一些實施態樣中,該治療性劑係抗癌劑。示範性抗癌劑包括但不限於烷化劑(順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)及草酸鉑(oxaliplatin))、抗代謝劑(嘌呤或嘧啶擬似物包括例如硫唑嘌呤及巰基嘌呤)、植物生物鹼及類萜(長春花生物鹼及紫杉烷)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)及長春地辛(vindesine))、鬼臼毒素(包括依托泊苷(etoposide)及替尼泊苷(teniposide))、紫杉烷(太平洋紫杉醇(paclitaxel)、紫杉醇(taxol)及多西紫杉醇(docetaxel))、拓撲異構酶抑制劑(第一型抑制劑;喜樹鹼(camptothecin)、伊立替康(irinotecan)及拓撲替康(topotecan);第二型抑制劑:安吖啶(amsacrine)、依托泊苷、依托泊苷磷酸酯及替尼泊苷))、抗癌劑(達克黴素(dactinomycin)、阿黴素(doxorubicin)、表阿黴素(epirubicin)、氟達拉濱
(fludarabine)及博來黴素(bleomycin))。任何被用於治療感興趣癌之化學治療劑可與該膀胱癌特異性肽配體共軛。在不同之實施態樣中,該抗癌劑係包封於脂質體中。
在一些實施態樣中,該治療劑係細胞毒素。可被使用之示範性細胞毒素包括相思豆毒素(abrin)、蓖麻毒蛋白(ricin)、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、肉毒毒素或彼等之經修飾之毒素。其他細胞毒素亦可被使用。
在不同之實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體係與放射性同位素共軛,例如125I、32P、14C、3H、35S、123I、11C、13N、15O、18F、82Rb、鎝-99m(Tc-99m)或鉈-201。在不同之實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體係與磁性顆粒共軛,例如磁性珠或氧化鐵顆粒(例如供磁共振造影(MRI))。
3.包含膀胱癌特異性配體之組成物
該膀胱癌特異性肽配體可被製備成各種供投予病患之醫藥調製劑,包括液體及固體形式製劑。
包含該膀胱癌特異性肽配體之組成物可用於非經腸、局部、經口或區域投予以供預防及/或治療性治療,包括噴霧或經皮投予。該醫藥組成物可依照投予方法而以不同之單位劑型投予。舉例來說,適用於經口投予之單位劑量形式包括粉劑、錠劑、丸劑、膠囊及含錠。已知經口投予本發明之多肽及醫藥組成物時必須防止消化作用。此通常
藉由複合該多肽與組成物以使其能抵抗酸及酶水解或藉由包裝該蛋白於適當之抵抗載體諸如脂質體中加以完成。保護蛋白不被消化之裝置係該領域所廣為周知。
包含該膀胱癌特異性肽配體之組成物特別適用於非經腸投予,諸如靜脈內投予或投予至體腔或器官內腔中(例如膀胱)。用於投予之組成物通常將包含多肽之溶液,該溶液包含該多肽溶解於醫藥上可接受之載劑,較佳為水性載劑。各種水性載劑可被使用,例如經緩衝之鹽水及該類似物。該些溶液係無菌且通常不含非所欲之物質。這些組成物可能藉由習用、廣為周知之滅菌技術滅菌。該組成物可能包含醫藥上可接受之調整生理條件所需之助劑物質,諸如pH調整及緩衝劑、毒性調整劑及該類似物,例如醋酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉及該類似物。這些調製劑中之多肽的濃度可有廣泛差異,主要將根據經選擇之特定投予模式及該病患之需求以液體體積、黏稠度、體重及的類似因素為基礎加以選擇。
液體形式之醫藥製劑可包括溶液、懸浮液及乳液,例如水或水/丙二醇溶液。適合經口服用之水性溶液可藉由使該活性成份溶解於水中及視需要添加適當之色素、香料、穩定劑及增稠劑加以製備。適合經口服用之水性懸浮液可藉由使該經細分之活性成份分散於含有黏稠物質之水中加以製備,該黏稠物質諸如天然或合成膠、樹脂、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉及其他廣為周知之懸浮劑。以非經腸注射而言,液體製劑可被調製為水性聚乙二醇溶液。經
皮投予可利用適當載劑進行。需要時,可採用經設計以利經皮遞送之設備。適當之載劑及設備係該領域所廣為周知,如美國專利第6,635,274、6,623,457、6,562,004及6,274,166號所述。
在一些實施態樣中,該等膀胱癌特異性肽類係經調製為奈米粒子。肽奈米粒子及彼等之製備方法係該領域所知且描述於例如美國專利公開號2006/0251726、美國專利公開號2004/0126900、美國專利公開號2005/0112089、美國專利公開號2010/0172943、美國專利公開號2010/0055189、美國專利公開號2009/0306335、美國專利公開號2009/0156480及美國專利公開號2008/0213377中,彼等各以參照方式完整納入此處以符合所有目的。其他可被使用之奈米粒子調製劑係描述於例如Emerich and Thanos,Curr Opin Mol Ther(2008)10(2):132-9;Kogan,et al.,Nanomedicine(2007)2(3):287-306;Zhang,et al.,Bioconjug Chem(2008)19(1):145-152;Scarberry,et al.,J Am Chem Soc(2008)130(31):10258-10262;及Fraysse-Ailhas,et al.,Eur Cells Materials(2007)14(Suppl.3):115。需要時,胺基酸序列可被添加至該肽配體之N端及C端中之一或二者以允許該肽奈米粒子之組裝及形成。
本發明亦考慮固體形式之醫藥調製劑,該固體形式調製劑意圖在馬上要使用之前被轉換成液體形式製劑以供經口投予。該等液體形式包括溶液、懸浮液及乳液。這些製劑除了活性成份之外,可能包含色素、香料、穩定劑、緩
衝劑、人工及天然甜味劑、分散劑、增稠劑、助溶劑及該類似物。
該醫藥調製劑係較佳地呈單位劑量形式。以這種形式而言,製劑被再分為包含適當量之活性成份的單位劑量。該單位劑量形式可為經包裝之製劑,該包裝包含分離量之製劑,諸如片裝錠劑、膠囊及在小瓶或安瓿中之粉末。另外,該單位劑量形式本身可為膠囊、錠劑、扁錠或含錠,或其可為呈包裝形式之適當數量之任何這些藥劑。
本說明書中所使用之用語「劑量單位形式」係指適用於人個體及動物之單位劑量之物理分離單位,各單位包含經計算以產生該所欲醫藥效果之預先決定量之活性物質以及該所需之醫藥稀釋劑、載劑或載具。本發明之新穎單位劑量形式之規格係由(a)該活性物質之獨特特徵及所欲達成之特定效應及(b)化合該活性物質以用於人及動物之技藝的固有限制所決定及直接相關,如此說明書中所詳細揭示,這些是本發明之特徵。
在一實施態樣中,醫藥組成物係以治療有效劑量對病患投予以預防、治療或控制疾病或惡性狀況,諸如癌。該醫藥組成物或藥物係以足以在病患誘發有效治療或診斷反應之量對病患投予。有效治療或診斷反應係至少部分遏止或延緩該疾病或惡性狀況之症狀或併發症之反應。足以完成此反應之量被定義為「治療有效劑量」。
4.治療及/或預防之方法
a.適合治療及/或預防之個體
此處所描述之膀胱癌特異性肽配體具有治療及預防膀胱癌之用途。膀胱癌係指多種膀胱惡性生長中之任一者。最常見之膀胱癌類型始於膀胱內襯細胞,稱為移行細胞癌(TCC)(有時稱為尿路細胞癌(UCC))。其他膀胱癌類型包括鱗狀細胞癌、腺癌、肉瘤及小細胞癌。在一些實施態樣中,個體罹患膀胱癌或具有發生膀胱癌之風險係因為例如遺傳、生活型態或環境風險因素。在一些實施態樣中,該個體罹患膀胱組織移行細胞癌或具有發生彼之風險。在一些實施態樣中,該個體罹患表現或過度表現整合素α5β3及/或整合素α5β5之膀胱癌或具有發生彼之風險。
該個體可能無症狀或展現膀胱癌之症狀。該個體可能具有膀胱癌之家族史,例如父母、祖父母或兄弟姊妹曾被診斷為膀胱癌。
膀胱癌特異性肽配體可被投予至病患以達抑制、減少、縮小或預防膀胱腫瘤或膀胱癌細胞增生或生長之效果。在有效治療之上下文中,該病患具有膀胱癌或膀胱腫瘤負荷,且投予該膀胱癌特異性肽配體可逆轉、延緩或抑制該疾病之進展。在有效預防之上下文中,該病患可能在緩解中或可能已經進行原發性腫瘤之移除,且投予該膀胱癌特異性肽配體可延緩、減少、抑制或消除轉移之生長。
b.投予多肽之方法
i.投予途徑
此處所描述之膀胱癌特異性肽配體可被調製成醫藥調製劑以供投予病患。醫藥調製劑之投予可藉由多種方法進行。方法可包含系統性投予,其中該多肽或多肽之組成物係經循環系統遞送至身體內之部位,包括醫藥作用之目標部位。系統性投予包括但不限於經口、經尿道及非經腸(意即除了經由消化道以外,諸如肌肉內、靜脈內、動脈內、經皮或皮下)投予。在其他實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體係局部投予,例如直接進入膀胱或腫瘤內。
ii.劑量
膀胱癌特異性肽配體可供預防性及/或治療性治療投予。在治療性應用中,包含該膀胱癌特異性肽配體之組成物係以足以治癒或至少部分遏止該疾病及彼之併發症之量投予至罹患膀胱癌之病患。足以完成此作用之量被定義為「治療有效劑量」。有效達成此用途之量將取決於該疾病之嚴重性及該病患健康之整體狀態,通常進行臨床試驗以決定對給定癌類型之最佳劑量。該化合物之有效量係指提供主觀緩解症狀或由臨床醫師或其他符合資格之觀察者所注意到之客觀可識別之改善之量。
在預防性應用中,包含該膀胱癌特異性肽配體之組成物係經投予至已不呈疾病狀態之病患以預防疾病之發生。該量被定義為「預防有效劑量」。在此用途中,該精確量同樣取決於該病患之健康狀態。
有效量之決定係屬該領域之技藝人士之能力範圍以內
,特別地根據此處所提供之詳細揭示。通常,本發明之一或多種多肽之組合的有效量之決定係藉由先投予低劑量或少量之多肽或組成物,然後逐漸增加該投予之劑量,視需要添加第二或第三藥物,直到在該經治療之個體觀察到所欲之效應,同時伴隨極少或無毒性副作用。用於決定適當劑量及投藥計畫以供投予本發明之組合之可行方法係描述於例如Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,11th Edition,2006,同上;Physicians’Desk Reference(PDR),64th Edition,2010;Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,2006,同上;及Martindale:The Complete Drug Reference,Sweetman,2005,London:Pharmaceutical Press.及Martindale,Martindale:The Extra Pharmacopoeia,31st Edition.,1996,Amer Pharmaceutical Assn,各以參照方式納入此處。
此處所描述之醫藥調製劑之示範性劑量包括每公斤之個體或樣品重量數毫克或微克量之膀胱癌特異性肽配體(例如每公斤約1微克至每公斤約500毫克、每公斤約100微克至每公斤約5毫克,或每公斤約1微克至每公斤約50微克)。另外了解膀胱癌特異性肽配體之適當劑量取決於該組成物在所欲達成效應上之功效。該膀胱癌特異性肽配體被投予至哺乳動物時,醫師、獸醫師或研究人員舉例來說可能先開立相對低劑量,接著增加該劑量直到獲得適當反應。此外,應了解的是,任何特定哺乳動物個體之特定劑量程度將取決於各種因素包括所採用之特定組成物之活
性、該個體之年齡、體重、整體健康、性別及飲食、投予時間、投予途徑、排泄速率、任何藥物組合及所欲調整之表現或活性之程度。
本發明之多肽的適當劑量將隨各種因素改變,包括所選擇之投予途徑、該組成物之調製劑、病患反應、狀況之嚴重性、個體重量及開藥醫師之判斷。該劑量可視個體病患之需求而隨時間增加或減少。通常,先給予病患低劑量,接著增加該劑量至該病患可忍受之有效劑量。
經投予之膀胱癌特異性肽配體之劑量係取決於溫血動物(哺乳動物)之物種、體重、年齡、個別狀況、所欲治療之面積的表面積及投予形式而定。該劑量之高低將由伴隨投予特定化合物至特定個體所發生之任何不良反應之存在、性質及程度決定。投予至約50至70公斤之哺乳動物之單位劑量可包含介於約5至500毫克之活性成份。通常,該膀胱癌特異性肽配體之劑量係足以達成所欲效應之劑量。
組成物之理想劑量、毒性及治療療效可另依個別組成物之相對療效而異,且可由在細胞培養或實驗動物進行之標準醫藥程序決定,例如決定LD50(對50%之族群致死之劑量)及ED50(對50%之族群有效之劑量)。該毒性及治療效應之間的劑量比為治療指數,可由LD50/ED50之比表示。展現高治療指數之組成物係為較佳。雖然展現毒性不良反應之組成物可被使用,但應小心設計遞送系統以使該等組成物瞄準病變組織之部位,以最小化對正常細胞之可能
傷害,藉以減少不良反應。
由例如動物試驗(例如齧齒動物及猴)獲得之資料可被用於調製用於人之劑量範圍。本發明之多肽的劑量較佳地落在包括ED50之循環濃度之範圍之內,該濃度範圍不具毒性或毒性極低。該劑量可在此範圍內依據所採用之劑量形式及投予途徑加以變化。以本發明之方法所使用之任何組成物而言,該治療有效劑量一開始可自細胞培養試驗預估。劑量可在動物模型中調整以達到包括於細胞培養中測定之IC50(達到一半最大症狀抑制之測試化合物的濃度)的循環血漿濃度範圍。該資料可被用於更準確地決定在人之有效劑量。血漿中之量可藉由例如高效液相層析(HPLC)測量。一般來說,多肽或組成物之等效劑量係介於典型個體之約1奈克/公斤至100毫克/公斤。
本發明之典型多肽組成物用於靜脈內投予將為每病患每天約0.1至10毫克/公斤。可使用每病患每天介於0.1至最高約100毫克/公斤之劑量。製備可投予之組成物的實際方法將為該領域之技藝人士所知或顯而易見,且更詳細地描述於諸如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,2006,Lippincott Williams & Wilkins 之公開資料中。
在本發明之一實施態樣中,本發明之醫藥調製劑係以在例如自每公斤個體重量約1毫克之化合物(1毫克/公斤)至約1克/公斤之範圍內的每日劑量投予。在另一實施態樣中,該劑量係自約5毫克/公斤至約500毫克/公斤之範
圍中之劑量。在又一實施態樣中,該劑量係約10毫克/公斤至約250毫克/公斤。在另一實施態樣中,該劑量係約25毫克/公斤至約150毫克/公斤。較佳劑量係約10毫克/公斤。
該醫藥調製劑之示範性劑量可視需要包括100至500毫克之每日劑量。醫藥調製劑可以約25毫克/毫升至約50毫克/毫升之濃度投予。該醫藥調製劑之示範性劑量可包括約50至200毫克/公斤,例如約100毫克/公斤每日劑量。
在成功治療後,可能想要讓該個體進行維持治療以預防該治療之疾病或惡性狀況復發。
iii.計畫
投藥計畫可自個體體內中多肽之測量值計算。通常,劑量係自每公斤體重1奈克至1,000毫克,可視需要或適當地每天、每半周、每周、每二周、每半個月、每月、每二個月或每年給予一次或多次。該領域之一般技藝人士可輕易地決定理想劑量、投藥方法及重複速率。該領域之技藝人士將能決定依照該領域已知及此處所揭示之經建立之程序投予本發明之多肽或多肽組成物至人的理想劑量。
該醫藥調製劑之單次或多次投予可依該病患所需及可耐受之劑量及頻率投予。在任何情況中,該組成物應提供足以有效治療該病患之量的本發明之多肽。較佳地,該劑量係經投予一次但可週期性地施用直到達成治療結果或直
到發生不良反應而需停止治療。通常,該劑量係足以治療或改善疾病之症狀或徵侯且不對病患產生無法接受之毒性。
每日劑量可每天投予一次或分成次劑量及投予多次,例如每天二次、三次或四次。然而,如技藝人士將了解的,此處所描述之組成物可以不同量及在不同的時間投予。該技藝人士亦將了解某些因素可能影響有效治療個體所需之劑量及時間,包括但不限於該疾病或惡性狀況之嚴重性、先前治療、該個體之整體健康及/或年齡及其他存在之疾病。另外,以治療有效量之組成物治療個體可包括單一治療或可較佳地包括連續治療。
因此,彼之用於靜脈內投予之醫藥調製劑將為每病患每天約0.01至100毫克/公斤。每病患每天0.1至約1000毫克/公斤之劑量可被使用,特別是當該藥物係經投予至隔離部位而非進入血流,諸如進入體腔或器官內腔中。製備非經腸投予之組成物的實際方法將為該領域之技藝人士所知或顯而易見,並於諸如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st Ed.,2006,Lippincott Williams & Wilkins之公開資料中更詳細地描述。
為達成該所欲之治療效應,醫藥調製劑可以治療有效之每日劑量投予多天。因此,治療性有效地投予組成物以治療此處所述之個體之疾病或惡性狀況可能需要持續自三天至二周或更久之一段時間的週期性(例如每天)投予。通常,組成物將被投予至少連續三天,通常至少連續五天,
更通常地至少十天及有時候連續投予20、30、40或更多天或視需要地投予更久。雖然每日連續投藥係達成治療有效劑量之較佳途徑,但是治療有益效果仍可被達成即使該化合物或組成物並非每天投予,只要該投予之重複頻率足以維持該組成物於個體體內之治療有效濃度。舉例來說,可每隔一天、每三天或若更高劑量範圍係經採用且可耐受於該個體則每週一次投予組成物。
c.與經建立之抗癌療法之組合治療
i.化學治療
此處所描述之膀胱癌特異性肽配體可與其他劑共投以作為組合治療。
可與膀胱癌特異性肽配體共投之化學治療劑之例包括但不限於烷化劑(順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)及草酸鉑(oxaliplatin))、抗代謝劑(嘌呤或嘧啶擬似物包括例如硫唑嘌呤及巰基嘌呤)、植物生物鹼及類萜(長春花生物鹼及紫杉烷)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春瑞濱(vinorelbine)及長春地辛(vindesine))、鬼臼毒素(包括依托泊苷(etoposide)及替尼泊苷(teniposide))、紫杉烷(太平洋紫杉醇(paclitaxel)、紫杉醇(taxol)及多西紫杉醇(docetaxel))、拓撲異構酶抑制劑(第一型抑制劑:喜樹鹼(camptothecin)、伊立替康(irinotecan)及拓撲替康(topotecan);第二型抑制劑:安吖啶(amsacrine)、依托泊苷、依托泊苷磷酸酯及替尼泊苷))
、抗癌劑(達克黴素(dactinomycin)、阿黴素(doxorubicin)、表阿黴素(epirubicin)、氟達拉濱(fludarabine)及博來黴素(bleomycin))。任何被用於治療感興趣癌之化學治療劑可在組合治療之配方中與該膀胱癌特異性肽配體共投。
ii.放射線
膀胱癌特異性肽配體可與放射線程序一起投予。多種放射線程序可用於疾病治療。任何技藝人士所知之程序可與本發明之多肽組合以治療病患。放射線程序包含使用放射療法以破壞細胞DNA之治療。對細胞DNA之破壞可由光子、電子、質子、中子或離子光直接或間接離子化組成該DNA鏈之原子造成。間接離子化之發生係因水離子化形成自由基,尤其是羥基,該等基團接著破壞DNA。在最常見之放射線治療形式中,大部分之放射效應係透過自由基之作用。由於細胞DNA之修復機制,利用誘導雙股DNA斷裂之劑諸如放射線療法已被證實為非常有效之癌症治療技術。癌細胞通常未經分化及呈幹細胞樣,該等細胞複製快速且修復次致死傷害之能力不及健康、經分化之細胞。另外,DNA傷害會經細胞分裂繼承,導致累積對癌細胞之傷害,誘導較慢之複製及通常死亡。
在放射線治療程序中使用之放射線的量係以戈雷(Gy)測量,該量隨接受治療之癌的種類及階段與該病患健康之整體狀態而異。該劑量範圍亦可受到癌症種類之影響,例如實質上皮腫瘤之典型治療劑量介於60至80Gy,而淋巴
瘤之劑量介於20至40Gy。
預防性(輔助)劑量亦可被投予,通常介於45至60Gy以1.8至2Gy分次投予(用於乳癌、頭頸癌)。許多其他因子係廣為周知且在選擇劑量時會由技藝人士考慮,包括該病患是否接受其他療法(諸如舉例但不限於投予該膀胱癌特異性肽配體、投予化學治療劑及該類似物)、病患合併症、放射治療之時間(例如放射治療在手術前或手術後投予)及任何手術程序之成功程度。
放射線處方劑量之遞送參數可在治療計劃期間由技藝人士決定。治療計畫可利用專科治療計劃軟體在專用電腦上進行。根據放射線遞送方法,數個角度或來源可被用於加總至總需要劑量。通常,計劃係經設計以遞送一致之處方劑量至腫瘤及最小化遞送至周圍健康組織之劑量。
iii.手術
膀胱癌特異性肽配體可與手術移除腫瘤或腫瘤減積一起投予。多種手術程序可用於疾病治療。任何技藝人士所知之程序可與本發明之多肽組合以治療病患。手術程序通常由緊急程度、手術類型、涉及之身體系統、侵入程度及特別儀器設備加以分類。
手術程序之範例可包括緊急手術及預定手術。緊急手術係指必須快速進行以搶救生命、肢體或工作能力之手術。其他手術程序之例可包括探查手術、治療性手術截肢、再植、重建、美容、切除、移植或移除器官或身體部分,
以及其他該領域已知者。探查手術可被進行以協助確診。治療性手術治療先前經診斷之狀態。截肢涉及切掉身體部分,通常為肢體或指頭。再植涉及重新連接經切斷之身體部分。重建手術涉及重新建構受傷、被支解或變形之身體部分。美容手術可用來改善其他方面正常之結構的外觀或修復受傷或因疾病喪失之結構。切除係切掉病患之器官、組織或其他身體部分。移植手術係以來自不同人(或動物)之另一器官或身體部分放入病患體內以取代該器官或身體部分。自活人或動物身體移除器官或身體部分以用於移植亦為一種手術類型。
除了採用大型切口以接近感興趣區域之傳統開放性手術程序以外,手術程序另包括微創手術。微創手術通常涉及較小之外部切口,該等切口係用於供微創器械插入體腔或身體構造中,如腹腔鏡手術或血管成形術。雷射手術涉及使用雷射切割組織以取代解剖刀或類似之手術器械。顯微手術涉及使用手術顯微鏡以供外科醫師看見微細結構。機械人手術利用手術機械手臂(例如達文西機械人(Da Vinci)(加州森尼韋爾直覺外科(Intuit Surgical)公司))以在技藝人士諸如外科醫師的引導下控制器械。
5.監測治療療效之方法
各種方法可被用於測定此處所描述之膀胱癌特異性肽配體之治療性及預防性治療之療效。通常,療效係指產生效果而無顯著毒性之能力。療效代表該治療提供給定干預
之治療性或預防性效應(干預之實例包括但不限於投予醫藥調製劑、使用醫學儀器或採用手術程序)。療效可藉由比較經治療與未經治療之個體或藉由比較該相同個體在治療前及治療後加以測量。治療之療效可利用各種方法測定,包括藥理試驗、診斷試驗、預測試驗及預後試驗。療效指標之實例包括但不限於抑制腫瘤細胞生長及促進腫瘤細胞死亡。
抗癌治療之療效可藉由各種該領域已知之方法加以測定。膀胱癌特異性肽配體可在動物模型中與未經治療或安慰劑對照組比較以篩選預防性或治療性療效。經該等篩選所識別之膀胱癌特異性肽配體接著可被分析其誘導腫瘤細胞死亡或增進免疫系統活化之能力。舉例來說,可在腫瘤細胞系培養中測試血清多重稀釋,及採用標準方法以檢查細胞死亡或細胞生長之抑制。(見例如Maniatis,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Lab.,New York,1982;Ausubel,et al.Editor,Current Protocols in Molecular Biology,USA,1984-2008及Ausubel,et al.Editor,Current Protocols in Molecular Biology,USA,1984-2008;Bonifacino,et al.,Editor,Current Protocols in Cell Biology,USA,2010;所有文獻以參照方式整體納入此處)。
本發明之方法提供在罹患或易感各種癌之病患中偵測疾病抑制。各種方法可被用於監測有症狀病患之治療性治療及無症狀病患之預防性治療。
監測方法可意味著在投予膀胱癌特異性肽配體之前測定病患體內之腫瘤負荷的基準值,並分別比較此值與治療後腫瘤負荷之值。
關於使用膀胱癌特異性肽配體之療法,腫瘤負荷值之顯著降低(意即大於相同樣本之重複測量值中之實驗誤差的典型界線,以該等測量值之平均值的一個標準差表示)代表陽性治療後果(意即投予膀胱癌特異性肽配體已阻斷或抑制或減少腫瘤生長及/或轉移之進展)。在一些實施態樣中,例如比較治療前及治療後個體體內之腫瘤負荷,若該接受治療之個體體內的腫瘤負荷減少至少約10%,例如減少至少約20%、30%、40%或50%,或完全消除該腫瘤負荷,該膀胱癌特異性肽配體治療被認為有效。
在其他方法中,腫瘤負荷之對照值(例如平均值及標準差)係自接受膀胱癌特異性肽配體治療之對照個體族群決定。比較病患之腫瘤負荷的測量值與該對照值。若病患之測量值與對照值並無顯著差異(例如超過一個標準差),治療可以停止。若病患之腫瘤負荷量係顯著高於對照值,可以持續投予藥劑。
在其他方法中,目前無接受治療但先前曾經接受療程之病患係經監測腫瘤負荷以決定是否需要恢復治療。該病患之腫瘤負荷測量值可與過去該病患在先前療程結束後所達到之腫瘤負荷值比較。腫瘤負荷相較於先前測量值顯著降低(意即高於相同樣本之重複測量值中之誤差的典型界線)表示可恢復治療。選擇性地,病患測量值可與在接受
療程後之病患族群所測定之對照值(平均值加標準差)比較。選擇性地,該病患測量值可與接受預防性治療而仍無疾病症狀之病患族群,或與接受治療性治療而顯示疾病特徵改善之病患族群的對照值比較。在所有這些情況中,腫瘤負荷相較於對照值顯著增加(意即超過一個標準差)係為病患之治療應恢復之指標。
供分析之組織樣本通常為來自病患之血液、血漿、血清、黏液、組織活體檢查、腫瘤、腹水或腦脊髓液。可分析樣本中瘤之跡象。瘤或腫瘤負荷可利用該領域已知之任何方法偵測,例如由合格病理學家目視觀察活體樣本,或其他視覺化技術例如放射線攝影、超音波、磁共振造影(MRI)。
6.診斷方法
a.受診斷之病患
膀胱癌特異性肽配體之結合具有偵測及診斷個體之膀胱癌之用途。本發明之膀胱癌特異性配體可與細胞表面上之整合素α5β3及整合素α5β5結合。膀胱癌特異性肽配體之結合量可在疑似為癌性之膀胱組織上測定。為了測定該膀胱癌特異性肽配體是否與膀胱組織結合,可取下膀胱組織之組織活體樣本。在其他實施態樣中,測定膀胱癌特異性肽配體與尿液樣本中之膀胱細胞之結合。
因此,可得益於本方法之病患可能已經呈現膀胱癌之症狀。舉例來說,可能存在膀胱癌或腫瘤之證據(藉由目
視檢查或觸診,或藉由掃描技術,例如磁共振造影(MRI)或正電子發射斷層攝影(PET)掃描)。
本發明之診斷方法具有與目前可用之癌診斷試驗一起使用之用途。該病患可能已經被初步診斷為癌症,例如根據血清生物標記、尿液生物標記或基因分析。有利膀胱癌診斷之生物標記係該領域所知,且描述於例如Netto and Epstein,Pathology.(2010)42(4):384-94;Gaston and Grossman,Methods Mol Biol.(2010)641:303-23;Goebell,et al.,Urologe A.(2010)49(4):547-59;Mowatt,et al.,Health Technol Assess.(2010)14(4):1-331;Mitra and Cote,Nat Rev Urol.(2010)7(1):11-20;Bryan,et al.,BJU Int.(2010)105(5):608-13;Apolo,et al.,Future Oncol.(2009)5(7):977-92。在該等病例中,活體樣本可為適當及偵測疑似癌性組織中膀胱癌特異性肽配體之結合量或整合素α5β3及/或整合素α5β5之表現量可確診或牴觸癌之初步診斷。
在其他病例中,病患可能有膀胱癌或另一種泌尿組織癌之個人或家族史。舉例來說,病患可能在成功地治療性治療膀胱癌後之緩解中。病患亦可能被檢測為膀胱癌高風險或膀胱癌復發相關之基因陽性。
b.獲得生物性樣本
從中測量表現量之生物性樣本將依疑似癌性之組織而定。通常,該生物性樣本係來自疑似癌性之組織,例如膀
胱細胞或膀胱組織。
在一些實施態樣中,該生物性樣本係尿液樣本。膀胱細胞可自膀胱組織脫落及隨尿液排出。尿液細胞學可在排尿樣本或在膀胱鏡檢查時進行(「膀胱沖洗))。尿液細胞學依賴在局部腫瘤生長時脫落至尿液中之惡性細胞的病理學分析(Sullivan,et al.,Am J Transl Res.(2010)2(4):412-40;Caraway,et al.,Cancer Cytopathol.(2010)118(4):175-83)。該樣本通常經由排尿獲得或藉由進行內視鏡程序時之膀胱沖洗獲得。尿液細胞學可與尿道膀胱鏡組合使用以偵測被認為是高風險病人之膀胱癌,特別是當尿液分析顯示臨床相關之血尿。在尿液樣本中之膀胱細胞可經濃縮(例如離心),然後與膀胱癌特異性肽接觸。
在一些實施態樣中,該生物性樣本係來自活體檢查。在一些實施態樣中,該生物性樣本係上皮膀胱組織。在某些情況中,例如測定膀胱癌轉移是否存在,該生物性樣本可適當地來自非膀胱組織之組織。
在一些實施態樣中,在不同於疑似癌性之組織的組織中測量膀胱癌特異性配體結合量係適當的,例如為了測定轉移之存在。
c.測定膀胱癌之存在
膀胱癌特異性肽配體之結合量可根據該領域所熟知之方法測量及於此處描述。肽配體結合之量可利用例如經直接或間接標示之偵測劑偵測,例如經螢光、放射性或酶標
示之膀胱癌特異性肽配體。舉例來說,該肽可與經標示之珠共軛,例如可經由螢光標示、化學發光劑標示、量子點標示或任何其他該領域已知之標示被偵測之珠。利用經標示之珠之測定係該領域所廣為周知。
為了提供示範性實施例,自個體取得尿液樣本,使樣本中之細胞經例如離心濃縮。該來自尿液樣本之濃縮細胞(包括膀胱細胞)接著與如此處所述之膀胱癌特異性肽配體接觸。選擇性地,該膀胱癌特異性肽配體被加至未經先濃縮細胞之尿液樣本。該等細胞可在暴露至肽之後濃縮。該等肽類可經直接標示,例如藉由與經標示之珠共軛或接觸。舉例來說,該珠可以螢光團、化學發光基團或量子點或任何其他可偵測之標記標示。與珠共軛之肽有利於偵測該肽配體與尿液樣本中癌細胞之結合及與該肽配體結合之膀胱癌細胞的濃縮。接著可偵測經標示之細胞的存在及定量。舉例來說,包覆與膀胱癌特異性肽配體共軛之珠的細胞可利用顯微鏡或流式細胞儀偵測。
在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性配體係與供抗體結合之已知表位(例如FLAG-標籤或c-myc表位)連接(例如經由化學鍵結或融合)。單獨的肽配體或與抗體表位連接之肽配體可在該領域已知之免疫測定法包括免疫組織化學染色、西方墨點法、ELISA及該類似法中,利用與抗體表位或彼之片段選擇性地結合之抗體測量。利用免疫測定法中之抗體偵測肽類係該領域所知(見例如Harlow & Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual(1998);Coligan,et al.,eds.,Current Protocols in Immunology(1991-2010);Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(3rd ed.1996)及Kohler & Milstein,Nature 256:495-497(1975))。
該膀胱癌特異性肽配體與疑似癌性之膀胱細胞或膀胱組織結合之量可利用該領域已知之任何方法偵測。示範性方法包括流式細胞法、組織溶解偵測、西方免疫墨點及免疫組織化學法。
為了提供示範性實施例,單獨地或與表位標籤連接之膀胱組織樣本(例如活體樣本)係與抗體在足以允許特異性結合之條件下(意即時間、溫度、樣本濃度)培養,其中該抗體係與該膀胱癌特異性肽配體特異性結合。該組織在與抗體培養之前可任意選擇地被固定(例如於甲醛中)及穿透。該抗-肽之抗體可被暴露至組織樣本約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0小時,或適當時隔夜約8、10或12小時。然而,培養時間可為更長或更短,取決於例如抗原組成物、樣本稀釋倍數及培養溫度而定。使用較少稀釋樣本及較高溫度之培養可在較短的時間內完成。培養通常在室溫(約25℃)或生物物度(約37℃)中進行,且可在冰箱中(約4℃)進行。根據已知之免疫測定方法進行清洗,以在添加二次抗體之前除去未經結合之樣本。
該膀胱癌特異性肽配體可被直接標示或可使用經標示之二次抗體以偵測樣本中已與該肽配體結合之抗體。二次抗體與不同之免疫球蛋白類型或同型-IgM、IgD、IgG、
IgA及IgE的恆定區或C區結合。通常,拮抗IgG恆定區之二次抗體被用於本方法。拮抗IgG亞型例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4之二次抗體亦可被用於本方法。二次抗體可經任何直接或間接偵測之基團標示,包括螢光團(意即螢光素、藻紅素、量子點、Luminex珠、螢光珠)、酶(意即過氧化酶、鹼性磷酸酶)、放射性同位素(例如3H、32P、125I、123I、11C、13N、15O、18F、82Rb、鎝-99m(Tc-99m)、鉈-201)或化學發光基團。標示信號可利用生物素及生物素結合基團之複合物(意即抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白)擴增。螢光標示之抗人IgG抗體可購自奧勒岡州尤金市分子探針(Molecular Probes)公司。經酶標示之抗人IgG抗體可購自密蘇里州聖路易斯市西格瑪奧德里奇(Sigma Aldrich)公司及加州特曼庫拉市佳美工(Chemicon)公司。
偵測樣本中膀胱癌特異性肽配體結合量之方法將對應所選擇之二次抗體的標示。舉例來說,若包含與肽配體結合之組織溶解液被轉移至適合進行免疫墨點分析之膜受質上,該可偵測之信號(意即墨點)可利用數位影像機(使用酶標示時)或x光片顯影劑(使用放射性同位素標示時)定量。同樣的,以免疫組織化學分析之組織樣本可利用免疫螢光顯微鏡或掃描顯微鏡及能偵測及定量螢光、化學發光劑及/或比色信號之自動化掃描軟體評估。該等偵測方法係該領域所廣為周知且於此處描述。
普通免疫測定及免疫組織化學技術係該領域所廣為周知
。最佳化參數之指南可見例如Wu,Quantitative Immunoassay:A Practical Guide for Assay Establishment,Troubleshooting,and Clinical Application,2000,AACC Press;Principles and Practice of Immunoassay,Price and Newman,eds.,1997,Groves Dictionaries,Inc.;The Immunoassay Handbook,Wild,ed.,2005,Elsevier Science Ltd.;Ghindilis,Pavlov and Atanassov,Immunoassay Methods and Protocols,2003,Humana Press;Harlow and Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,1998,Cold Spring Harbor Laboratory Press;Immunoassay Automation:An Updated Guide to Systems,Chan,ed.,1996,Academic Press;Dabbs,Diagnostic Immunohistochemistry:Theranostic and Genomic Applications,2010,Saunders;Renshaw,Immunohistochemistry:Methods Express Series,2007,Scion Publishing Ltd.及Buchwalow and Böcker,Immunohistochemistry:Basics and Methods,2010,Springer。
膀胱癌特異性肽配體結合或結合增加之存在係由免疫測定或免疫組織化學測定中可偵測之信號顯示(意即墨點、螢光、化學發光性、顏色、放射性),其中來自病患之生物性樣本係與和該肽配體或表位標籤特異性結合之抗體或抗體片段接觸。
可偵測之信號可與來自膀胱組織或膀胱細胞之正常或非癌性對照樣本之信號或閥值比較。在一些實施態樣中,例如當測試樣本中肽配體結合量之可偵測信號相較於正常
或非癌性對照樣本之肽配體結合量之信號或預先決定之閥值係高出至少約10%、20%、30%、50%、75%,膀胱癌特異性肽配體結合或結合增加之存在係經偵測且表示癌之存在或風險增加。在一些實施態樣中,當測試樣本中膀胱癌特異性肽配體結合量之可偵測信號相較於正常或非癌性對照樣本之膀胱癌特異性肽配體結合量之信號或預先決定之閥值係高出至少約1倍、2倍、3倍、4倍或更多,膀胱癌特異性配體結合量之增加係經偵測且表示癌之存在或風險增加。通常,該樣本及對照或預先決定之閥值係來自相同之組織類型。
在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體之結合量係與已知為癌性之對照組織或對照細胞中膀胱癌特異性肽配體之結合量比較。在此例中,該測試之生物性樣本中膀胱癌特異性肽配體的結合量等於或大於已知為癌性之陽性對照樣本之該值係表示癌。通常,該樣本及對照或預先決定之閥值係來自相同之組織類型(例如膀胱組織)。
選擇性地,若該測試生物樣本中膀胱癌特異性肽配體之結合量係低於陽性癌性組織對照中膀胱癌特異性肽配體之結合量或預先決定之閥值,通常表示不是癌之診斷。類似地,若該測試生物樣本中膀胱癌特異性肽配體之結合量係等於或低於正常或非癌性對照值或預先決定之閥值,則表示不是癌之診斷。
在一些實施態樣中,膀胱癌特異性肽配體結合量測定之結果係紀錄於有形媒體。舉例來說,該診斷性測定(例
如觀察膀胱癌特異性肽配體結合之存在或存在增加)之結果及決定癌之存在或風險升高與否之診斷可被紀錄於例如紙或電子媒體上(例如錄音帶、電腦磁碟、CD、隨身碟等)。
在一些實施態樣中,該等方法另包含提供診斷給病患之步驟,該診斷係根據膀胱癌特異性肽配體結合量測定之結果以得知病患體內是否存在癌或具有升高之罹癌風險。
在一些實施態樣中,該等方法另包含提供或建議適當療程給病患之步驟,該療程係根據膀胱癌特異性肽配體結合量測定之結果。
根據此處所描述之膀胱癌特異性肽配體與包含膀胱細胞或膀胱組織之生物性樣本的結合以測定個體體內膀胱癌存在之方法可與其他已知之診斷膀胱癌之方法一起進行。
7.原位造影之方法
此處所描述之膀胱癌特異性肽配體可被用於局部視覺化膀胱癌之方法,例如經尿道切除膀胱癌(TURBT)。與螢光染料共軛之膀胱癌特異性肽配體可被用於此應用。
此處所描述之膀胱癌特異性肽配體的另一應用係膀胱癌之造影偵測,該應用可補充或減少侵入性及昂貴之膀胱鏡檢查。磁共振造影(MRI)及正電子發射斷層攝影(PET)可在疑似罹患或已知罹患膀胱癌之個體進行。MRI及PET二種掃描已經被廣泛地運用於診斷惡性病且可被用於診斷及偵測膀胱惡性病。因此,MRI及PET或單光子發射電腦斷
層攝影(SPECT)可被用來協助以此處所述之膀胱癌特異性肽配體所進行之膀胱癌偵測,該肽配體係與造影劑共軛,例如供MRI使用之氧化鐵及供PET/SPECT使用之放射性同位素(例如123I、11C、13N、15O、18F、82Rb、鎝-99m(Tc-99m)、鉈-201)。
為了能進行原位造影,與適當造影劑連接之膀胱癌特異性肽配體係在個體體內與疑似包含或已知包含膀胱癌細胞之組織接觸。藉由對病患進行適當之造影方法,可測定膀胱癌細胞在造影組織中之位置及範圍。
在一些實施態樣中,該等方法另包含自該組織移除、切除或切掉膀胱癌細胞,例如根據偵測到膀胱癌特異性肽配體之結合。與膀胱癌特異性肽配體共軛之磁性顆粒可進一步被用於抽取及移除膀胱癌細胞。磁性奈米粒子-肽共軛物於活體外及活體內瞄準及抽取癌細胞之用途係描述於例如Scarberry,et al.,J Am Chem Soc(2008)130(31):10258-10262。
8.套組
本發明亦提供包含如此處所述之膀胱癌特異性肽配體之套組。套組中之膀胱癌特異性肽配體之實施態樣係如此處所述。在一些實施態樣中,該膀胱癌特異性肽配體係與經標記之珠共軛或連接。
此外,該套組通常將包括揭示該膀胱癌特異性肽配體之使用方式的說明材料。在套組中,該膀胱癌特異性配體
可被調製以供投予,且以一或多個單位劑量提供。該套組亦可能包括額外成份以利為該套組所設計之特定應用。套組可能額外包括緩衝劑及其他例行用於實行特定方法之試劑。該等套組及適當內容物係為該領域之技藝人士所廣為周知。
雖然前述發明已經由說明和示例詳細地描述以供清晰認識,對該領域之一般技藝人士將顯而易見的是可對本發明之揭示進行某些改變及修飾而不背離該隨附之權利要求之精神或範圍。
下列實施例係經提供以說明但不限制該申請專利之發明。
材料及方法
合成初步及聚焦OBOC分子庫
OBOC分子庫係由「分配-混合合成」方法於固相TentaGel S NH2樹脂(德國拉普聚合物公司(Rapp Polymere Gmbh))上合成(Lam,et al.,Nature,(1991)354:82-84;Lam,et al.,Chem Rev,(1997)97:411-448及Peng,et al.,Nat Chem Biol,(2006)2:381-389)。擬肽之肽基團係由標準固相肽合成技術合成,使用9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)化學及N-羥基苯并三唑(HOBt)/N,N’-二異丙基碳二醯亞胺(DIC)偶
合。並且,偶合之完成係由茚三酮試驗證實。珠儲存於4℃之70%乙醇中直到使用。
細胞
四株膀胱癌細胞系包括5637(HTB-9)、SCaBER、TCCSUP(HTB-5)及T24(HTB-4)係購自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)(維吉尼亞州馬納薩斯市)。正常尿路細胞之分離、特徵化及維持係如先前所詳述(Bagai,et al.,J Biol Chem,(2002)277:23828-23837)。正常週邊血液單核細胞係利用菲可帕克(Ficoll-Paque)梯度法自健康捐贈者之週邊血液中製備。將膀胱切除術所獲得之膀胱癌組織切塊,按廠商說明於37℃以膠原酶消化1至2小時,然後經40微米之過濾器過濾以製備單一細胞懸浮液。接著以菲可帕克梯度法分離腫瘤細胞(於4℃以800g離心30分鐘)。收集樣本前,獲得每位病患或健康捐贈者之受試者同意書。
五株標示為K9TCC、K9TCC-AxA、K9TCC-AxC、K9TCC-Nk及K9TCC-In之犬膀胱移行細胞系係由普渡大學(Purdue)之狄波拉納普(Deborah W.Knapp)熱心提供(Dhawan,et al.,Urol Oncol,(2009)27:284-292)。這些細胞係維持於含10%FBS及2毫莫耳麩醯胺酸之DMEM/F12中,於5%CO2及37℃中培養。
篩選OBOC分子庫中之膀胱癌特異性配體
篩選前以雙蒸水及磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)徹底清洗珠。用胰蛋白酶/EDTA或脫離套組(德國海德堡普馬細胞(PromoCell)公司)使膀胱癌細胞及正常尿路細胞自培養皿脫離,以彼等對應之培養基清洗、重懸於106細胞/毫升後,在培養皿中與OBOC珠於37℃潮濕二氧化碳培養箱中震盪(每分鐘60轉)培養。與細胞結合之珠在顯微鏡下呈現中間之珠被一(多)層細胞覆蓋之玫瑰花簇。在倒置顯微鏡下以微量吸管選取陽性珠,經鹽酸胍(8莫耳,20分鐘)處理以移除珠表面之細胞及蛋白,再與相同細胞培養一次以證實該結合。只有二次培養均顯示細胞結合之珠被送去進行如先前所述之胺基酸定序(Peng,et al.,Nat Chem Biol,(2006)2:381-389)。
合成肽及肽-生物素
供生物測試用之溶液相PLZ4及PLZ4-生物素的合成化學係與使用HOBt/DIC偶合之分子庫類似。使用瑞克(Rink)醯胺樹脂作為製備含羧基醯胺之化合物的固體支持。
螢光顯微鏡
膀胱癌細胞及正常尿路細胞(各孔2×104細胞)被接種於腔室玻片。當細胞長滿超過70%,以PBS清洗細胞並用3%BSA-PBS於4℃封閉1小時,接著在4℃之TBS緩衝液中與肽-生物素共軛物(1微莫耳)培養1小時。細胞接著以
TBS清洗三次及與FITC-鏈黴抗生物素蛋白(0.5微克/毫升)(加州南舊金山賽德(ZYMED)公司)一起培養。清洗細胞,並以奧林巴斯(Olympus)倒置螢光顯微鏡檢查(20X)。
流式細胞分析
下列所有步驟均在冰上完成。以1毫升之冰PBS(pH 7.4)-BSA(1%)清洗5×105 5637細胞3次,以300微升冰BSA(5%)-PBS(pH 7.4)重懸,接著在冰上培養1小時。細胞經過離心並以50微升之800、400、200、100、50、25、10、5、2.5、1、0.1及0微莫耳PLZ4-生物素溶液重懸,在冰上培養1小時。未經PLZ4-生物素處理之細胞被當作對照。以1毫升冰PBS-吐溫(Tween)-20(0.05%)緩衝液清洗6次後,細胞以50微升鏈黴抗生物素蛋白(SA)-PE(1:500於PBS-BSA中,1%)(1毫克/毫升,加州卡斯巴德市英維特基(Invitrogen)公司)重懸,在冰上培養1小時,以PBS(pH 7.4)清洗3次,以500微升PBS(pH 7.4)重懸,及利用Coulter Epics XL-MCL流式細胞儀(貝克曼庫爾特(Beckman Coulter)公司)分析。重複此試驗三次。平均值顯示於圖4。
活體內及活體外小鼠造影
PLZ4-CY5.5共軛物係藉由培養PLZ4-生物素共軛物與鏈黴抗生物素蛋白(SA)-CY5.5(賓州吉伯茨維爾洛克蘭免疫化學(Rockland Immunochemicals)公司)加以製備。一個
鏈黴抗生物素蛋白可與至多4個生物素分子結合。為了確保至少一個PLZ4-生物素分子與SA-CY5.5結合,PLZ4-生物素與SA-Cy5.5係以5:1之莫耳比在4℃混合1小時。該螢光標示係由活體外細胞結合試驗確認。無胸腺裸鼠係購自哈倫實驗室(Harlan Laboratories)(印第安那州印第安納波利斯市)。所有實驗之進行均符合機構準則及遵照實驗計畫。原發性膀胱癌樣本係在獲得病患之受試者同意書後,由病理學家進行膀胱切除術取得。此試驗計畫係經加州大學戴維斯分校人體試驗委員會核准。原發性癌組織被切碎並在37℃中與膠原酶旋轉培養1小時。單細胞懸浮液係藉由通過40微米過濾器之過濾獲得。一些原發性細胞係與OBOC珠一起培養以測定細胞結合(圖3)。按照廠商說明將原發性膀胱癌細胞與基質膠(matrigel)(馬里蘭州斯巴克斯BD生物科技公司(BD Biosciences))混合,經皮下注射至小鼠肩膀一側。造影時所測量之腫瘤直徑約為0.5至1.0公分。利用腹膜內注射苯巴比妥(60毫克/公斤)以麻醉小鼠,使用柯達多模式造影系統IS2000MM(柯達(Kodak))進行造影,激發帶通過濾器為625奈米及發射波長為700奈米。暴露時間為每影像30秒。影像利用造影工作站IS2000MM軟體(紐約州羅徹斯特市柯達公司)分析。活體內造影完成後,以二氧化碳過量使小鼠安樂死。切取腫瘤及其他正常器官及組織,如上述利用柯達造影系統進行造影。
資料處理及統計學
這些試驗重複進行二次或三次。此處顯示的是平均值。為了測定腫瘤對比,腫瘤面積及正常組織面積的平均螢光強度係藉由柯達1D影像分析軟體(柯達公司)之興趣範圍功能計算,接著根據來自NIRF影像之半定量資料藉由整合腫瘤及正常組織區域內之相同面積的螢光強度作偽色圖(圖5)。
結果:
鑑別膀胱癌特異性配體
全細胞珠結合試驗係用來篩選與膀胱癌細胞培養結合之肽分子庫(圖1)。約150,000個分子庫珠(肽)利用4種膀胱癌細胞系(三種移行細胞癌(TCC)細胞系:T24、TCCSUP及5637和一個鱗狀細胞系SCaBER)篩選。用於篩選的二個環狀隨機肽分子庫係7-聚體cX1X2X3X4X5X6X7c(SEQ ID NO:15)及5-聚體c(U/Z)5c(SEQ ID NO:16),其中“c”代表D-半胱胺酸,“X”代表除半胱胺酸以外之19個天然L-胺基酸,“U”代表8個非天然之胺基酸且“Z”代表除精胺酸、半胱胺酸及離胺酸以外之17個L-胺基酸。各肽包含二個在胺基及羧基端之毗鄰D-半胱胺酸殘基。這些肽藉由雙硫鍵形成環狀以更有效地暴露在中間之胺基酸供細胞結合。初期約150,000個分子庫珠(肽)利用各細胞系篩選。具有與癌細胞表面受體結合之配體之珠會被癌細胞包覆。陽性珠(意即被細胞包覆之珠)係經分離並以相同細胞進行
第二輪之篩選以消除偽陽性珠。
由此篩選鑑別出28個可與四種細胞系中之一者結合之肽。從這28個肽當中,挑選21個與膀胱癌細胞結合但不與12個不同來源之細胞系中之大部分結合之肽,這21個肽經原發性正常尿路培養細胞之篩選(Bagai,et al.,J Biol Chem,(2002)277:23828-23837)。其中一個具有序列cQDGRMGFc(SEQ ID NO:12)之配體與所有三種膀胱TCC細胞系結合(圖2A至C),但不與正常尿路細胞結合(圖2D)。此配體被命名為PLZ4。PLZ4不與全血細胞(圖2E)、周邊血液單核細胞(PBMC,圖2F)或纖維母細胞(圖2G)結合,顯示這些在膀胱內之混雜細胞不影響PLZ4與膀胱癌細胞之結合。此與PLZ4不與12個不同來源之細胞系中之10株結合的觀察一致。PLZ4不與自4名連續病患收集之尿液樣本中所分離的細胞結合,該4名病患並無膀胱癌之證據但接受BCG經膀胱療法之積極治療(圖2H)。這表示PLZ4可能不與常見於BCG治療病患中之發炎細胞結合。
包覆PLZ4之珠可與來自病患之膀胱腫瘤細胞結合
株化培養細胞系上之細胞表面分子可能與原發性膀胱癌細胞上之該些分子不同。因此評估PLZ4是否可與來自病患之膀胱癌細胞結合。包覆PLZ4之珠可與來自病患之原發性膀胱癌細胞結合(圖3A及B)。到目前為止,PLZ4可與所有5個測試之新鮮膀胱癌樣本之細胞結合。在一病
患中,來自相同膀胱切除術之樣本同時提供正常組織及膀胱癌組織。包覆PLZ4之珠可與來自癌樣本之細胞結合(圖3B),但無法與來自該相同膀胱正常樣本之細胞結合(圖3C)。
尿液中之酸性環境可能改變配體之三維結構進而影響配體結合。因此我們測試該癌特異性珠是否可與尿液中之5637TCC癌細胞結合。細胞與珠在pH 6.0之尿液中於37℃培養4小時。使用4-小時的培養時間是為了模擬病患體內之活體內尿滯留及允許構型改變及蛋白酶消化。PLZ4仍可與尿液中之細胞結合(圖3D)。
天然發生於犬之膀胱癌通常為侵入性膀胱癌。若PLZ4可與犬膀胱癌細胞結合,在進行人體臨床試驗之前,可在天然發生膀胱癌之犬進行臨床前試驗。五種犬癌細胞系已被測試。PLZ4-FITC複合物可與所有5種犬膀胱癌細胞系結合(圖3E)。當使用非小細胞肺癌細胞系A549細胞,或使用白血病特異性配體取代FITC複合物中之PLZ4時,無可偵測之結合。
以PLZ4進行細胞分選及螢光偵測人膀胱癌細胞
接著,我們測定螢光細胞分選是否可被用來鑑別膀胱癌細胞。經親水性連接子與生物素共軛之PLZ4肽係經合成。生物素基化PLZ4接著與鏈黴抗生物素蛋白-PE一起培養以經由生物素與鏈黴抗生物素蛋白之強烈結合產生PLZ4-PE共軛物。新鮮製備之經胰蛋白酶消化之膀胱癌
5637細胞懸浮液係與PLZ4-PE共軛物一起培養,然後進行流式細胞儀細胞分選。在5637細胞上觀察到濃度依賴性螢光增加(圖4A)。結合親和性(Kd)約為30微莫耳。
接著測定經螢光標示之PLZ4是否可與膀胱癌細胞結合。PLZ4-FITC共軛物係利用和PL4-PE共軛物所用之相同方法製備,及用於染色在腔室玻片生長之5637、TCCSUP、T24及正常尿路細胞。在對照試驗中,在無生物素基化配體下添加鏈黴抗生物素蛋白。相較於對照細胞,在螢光顯微鏡下於5637、TCCSUP及T24細胞中可偵測到強烈螢光信號(圖4B)。在相同染色條件之正常尿路細胞中未觀察到顯著結合。
帶有膀胱癌異種移植之裸鼠的活體內造影
為了探討PLZ4是否可用於活體內膀胱癌偵測及標靶治療,使用帶有膀胱癌異種移植之小鼠以進行活體內光學造影,該異種移植係自切除膀胱之病患的原發性膀胱癌組織發展。近紅外光螢光(NIRF)染料Cy5.5允許造影深層組織,因為近紅外光具有高穿透性、低組織吸收性及散射率。當腫瘤異種移植達到5至10毫米(植入後4至5周),經尾靜脈注射PLZ4-Cy5.5共軛物(7奈莫耳)。小鼠在接種後0、1、2、4、8、16、24小時造影。腫瘤所攝取之PLZ4-Cy5.5遠高於正常組織之攝取量及接受SA-Cy5.5之小鼠腫瘤區域之攝取量(圖5A及B),始於注射後2小時及在4小時達到最大差異。
為了進一步證實活體內攝取PLZ4-Cy5.5複合物,在靜脈內注射後24小時對經切除之腫瘤及器官進行活體外造影。該PLZ4-CY5.5複合物主要累積在腫瘤異種移植及腎臟,然而其他器官包括膀胱皆未觀察到顯著攝取(圖5C及D)。在僅注射SA-CY5.5之對照小鼠的腎臟中偵測到強烈螢光信號(偽白色),這表示PLZ4-Cy5.5複合物於腎臟中之累積可能是繼發於腎之非特異性攝取SA-Cy5.5或SA-Cy5.5被困(圖5D)。組織化學染色係經進行及證實該腫瘤異種移植為膀胱移行細胞。
PLZ4與目標整合素之結合
一些試驗顯示包含NGR模體之肽與整合素結合。因此,表面攜帶PLZ4肽之OBOC珠係與經各種整合素轉染之K562細胞一起培養。K562細胞表現內源性α5β1整合素。PLZ4與經α5β3整合素轉染之K562細胞結合,但不與親代K562細胞或經其他整合素轉染之細胞結合(圖6A)。自初步篩選獲得之一些其他配體亦包含DGR模體。然而,只有PLZ4具膀胱癌特異性,顯示除DGR外還有其他胺基酸決定該結合特異性。為了識別哪些胺基酸涉及決定細胞結合及結合特異性,進行與彩虹珠編碼方法結合之「丙胺酸行走」(Luo,et al.,J Comb Chem,(2008)10:599-604)。胺基酸天冬胺酸(D,X2位置)、精胺酸(R,X4)及苯丙胺酸(F,X7)對細胞結合係為重要。以丙胺酸取代這些胺基酸中之任一者完全阻斷該肽與5637細胞之結合(圖
6B)。在X3及X6位置之甘胺酸殘基(G)對細胞結合係為重要,因為取代該二個胺基酸中之一顯著降低但不阻斷該肽與5637細胞之結合。在X5位置之甲硫胺酸可被取代成許多其他胺基酸而不影響該結合親和性。根據此分析,在N端之三個胺基酸(D、G及R)與在C端之二個胺基酸(G及F)一起決定結合特異性。因此,該結合口袋可能呈三葉草狀:一袋供N端之三個胺基酸、一袋供C端之二個胺基酸及一中間口袋。因此藉由加入不同數量之甘胺酸殘基至X5位置以測試中間結合口袋之深度。二個甘胺酸殘基可被加入以填滿中間口袋而不顯著影響細胞結合(圖6C)。加入超過4個甘胺酸完全阻斷PLZ4與該目標細胞之結合。
討論
膀胱癌特異性配體可改善膀胱癌之診斷及處理。首先,這些配體可被用於腫瘤定位。大約75至80%之膀胱癌病例係於非侵入期診斷且通常以TURBT治療。但是,大約三分之一之病例可發現與泌尿科醫師專業程度無關之不完全切除(Herr,J Urol,(2005)174:2134-2137)。5-胺基酮戊酸(ALA)結合螢光膀胱鏡檢查曾被用於腫瘤定位(Daniltchenko,et al.,J Urol,(2005)174:2129-2133)。非癌性尿路細胞之非特異性攝取ALA,特別是經BCG治療之發炎膀胱,造成干擾膀胱鏡檢查偵測癌之高度背景螢光(Grossman,Society of Urological Oncology Winter Meeting 2005(Podium presentation),Bethesda,Maryland.,
2005)。PLZ4可特異性地與膀胱癌細胞結合,但是不與正常尿路細胞、包含癌之相同膀胱的正常細胞或接受BCG積極治療之病患的細胞結合。試驗顯示經FITC-共軛之PLZ4染色膀胱癌細胞,表示此配體可被用於非侵入性膀胱癌之螢光偵測及腫瘤定位。我們的PLZ4配體可與pH6之尿液中的癌細胞結合,顯示PLZ4可被用於酸性尿液環境。由於膀胱相對地獨立於人體之其他部分,因此經膀胱灌注經螢光團共軛之癌特異性配體將誘發極小或不誘發非所欲之不良反應。
膀胱癌特異性配體可被用於非侵入性及末期膀胱癌之標靶治療。經膀胱灌注BCG或化學療法已被用於減少膀胱癌復發之風險。然而,此療法仍與顯著復發風險有關(Herr,et al.,J Clin Oncol,(1995)13:1404-1408;and Herr,et al.,J Urol,(1989)141:22-29)。PLZ4可與化學療法藥物連接以供標靶治療,不論經由經膀胱灌注或經由靜脈內注射皆可。
膀胱癌特異性配體PLZ4可被用於非侵入性及末期膀胱癌之造影偵測。一旦膀胱癌轉移則預後不佳,膀胱切除術將無法治癒。目前的影像學檢查如電腦斷層(CT)及磁共振造影(MRI)並不具敏感性及/或特異性。雖然18F-FDG-PET已在臨床測試用於膀胱癌分期之目的,該技術尚未被廣泛地用在臨床因為其敏感性及特異性並不令人滿意(Drieskens,et al.,Eur J Nucl Med Mol Imaging,(2005)32:1412-1417;and Liu,et al.,Urol Int,(2006)77:69-75)。
本發明顯示,藉由與NIRF Cy5.5連接,PLZ4可被用於偵測類似轉移性膀胱癌之皮下腫瘤異種移植(圖5)。此影像學檢查僅需7奈莫耳之癌特異性配體。癌特異性配體可增加放射線檢查之偵測特異性及敏感性,藉以取代或補充用於診斷及追蹤膀胱癌之昂貴膀胱鏡檢查程序。
天然發生膀胱癌之犬可為人體臨床試驗之前的優秀研究模型。在大部分之癌試驗中,通常使用在皮下空間具有腫瘤異種移植之癌模型。然而,此模型可能無法反應自然發生之真實狀況。PLZ4與所有測試之5種犬膀胱癌細胞系結合,顯示天然發生之犬膀胱癌可被用於臨床前試驗。亦測試及發現PLZ4可與自一犬病患新鮮切除之原發性犬膀胱癌細胞結合。其他將被進行之試驗為在天然發生犬膀胱癌之犬的PLZ4臨床前試驗。
PLZ4之結合特異性係由DGR及一些其他胺基酸決定。PLZ4包含DGR。RGD反向模體與一些整合素異二聚體包括α5β3及α5β5結合(Ruoslahti,et al.,Annu Rev Cell Dev Biol,(1996)12:697-715)。該DGR模體係另一與分泌型捲曲相關蛋白結合之蛋白的結合模體核心(Chuman,et al.,Peptides,(2004)25:1831-1838)。先前亦被辨識為低親和性整合素結合模體之(D/N)GR模體在腺相關病毒之殼體被發現,在病毒性殼體整合素5β1交互作用及細胞進入上具重要性(Koivunen,et al.,J Biol Chem,(1993)268:20205-20210,1993;Koivunen,et al.,J Cell Biol,(1994)124:373-380及Asokan,et al.,J Virol,(2006)80:
8961-8969)。PLZ4不與表現5β1整合素之親帶K562細胞結合,但與經α5β3整合素轉染之K562細胞結合(圖6A)。異DGR(isoDGR)亦與腫瘤血管中之α5β3結合(Curnis,et al.,Cancer Res,(2008)68:7073-7082)。許多肽包含該相同之DGR模體,但只有PLZ4係膀胱癌特異性。丙胺酸行走證實除了DGR以外,G(甘胺酸,X6)及F(苯丙胺酸,X7)對細胞結合係重要的。改變此二個胺基酸阻斷或大幅降低PLZ4與膀胱癌細胞之結合(圖6B)。
總結來說,OBOC組合式分子庫方法已被用於鑑別PLZ4膀胱癌特異性配體。其臨床應用包括非侵入性及轉移性膀胱癌之腫瘤定位以引導TURBT、造影偵測及標靶藥物遞送。
為了測定PLZ4與犬TCC細胞系之結合,進行全細胞結合試驗。PLZ4係於TentaGel S NH2樹脂珠上合成(德國拉普聚合物公司(Rapp Polymere Gmbh))(Pegram,et al.,J Clin Oncol(1998)16:2659-2671),並與五種不同的犬癌細胞系之單細胞懸浮液(106細胞/毫升)一起培養,包括K9TCC-PU、K9TCC-PU-AxA、K9TCC-PU-In、K9TCC-PU-AxC及K9TCC-PU-Nk(由美國印第安那州西拉法葉普渡大學之狄波拉納普(Deborah Knapp)熱心提供)。陰性對照係得自因非膀胱相關疾病而被安樂死之犬的正常尿路細胞。人膀胱癌細胞系5637被用來作為陽性對照。若PLZ4與懸
浮液中之細胞結合,那麼珠表面會被細胞覆蓋。超過95%之珠表面被5637及K9TCC細胞覆蓋(分別見圖7A-a及b)。相反地,與正常犬膀胱尿路細胞(圖7A-c)或慢性膀胱炎犬膀胱細胞(圖7A-d)一起培養之珠並無細胞結合,僅觀察到圓形平滑之珠表面。
為了繼續評估PLZ4與犬TCC細胞系之結合,進行親和性螢光試驗。PLZ4係經合成及與生物素共軛。犬TCC細胞系於腔室玻片中培養。正常犬尿路細胞係藉由接觸製備抹片製備,其中犬正常膀胱組織與玻片表面接觸及輕輕摩擦。經固定後,該等玻片與PLZ4-生物素一起培養及由鏈黴抗生物素蛋白探測。相較於未與肽培養之對照(圖7B:a),所有五種犬TCC細胞系顯示瀰漫性細胞膜染色(圖7B:b-f)。
為了繼續定量結合親和性,K9TCC-PU及K9TCC-PU-In細胞被接種至96孔盤、經固定及與濃度漸增之PLZ4-生物素然後與抗生物素蛋白-HRP一起培養。如圖8A所示,PLZ4展現對犬TCC細胞系之劑量依賴性結合。PLZ4對K9TCC-PU及K9TCC-PU-In之Kd50值(PLZ4飽和50%細胞表面受體之濃度)分別為21.31及10.29微莫耳。
配體與細胞表面分子之結合可能啟動細胞傳訊及對細胞展現生物效應。測定PLZ4對細胞存活性及增生之影響,因為其可能具有潛在臨床應用。K9TCC、K9TCC-PU-In及K9TCC-PU-Nk細胞被接種於96孔盤,在有或無各種濃度之PLZ4肽的存在下培養。在與PLZ4一起培養48小
時後,按廠商說明進行WST-8細胞增生試驗(美國密西根州安亞伯開曼化學(Cayman Chemical)公司)。與不同濃度之PLZ4培養之這三種細胞系相較於經PBS對照處理之細胞在細胞增生/存活性上無顯著變化(圖8B)。
PLZ4在犬TCC異種移植小鼠模型中之腫瘤特異性歸巢/標靶性質及活體內生物分布/結合特異性亦被測定。與基質膠混合之TCC-PU-In細胞被植入8周齡裸鼠達3至4周。當該異種移植之直徑到達0.5至0.8公分,小鼠被隨機選擇以在麻醉下注射100微升(7奈莫耳)之預先培養之PLZ4-生物素-鏈黴抗生物素蛋白-Cy5.5複合物或鏈黴抗生物素蛋白-Cy5.5染料。在注射後0、1、3、6及12小時拍攝全身影像(圖9a)。信號之大量累積係以時間依賴性方式累積於注射PLZ4-Cy5.5複合物之小鼠的腫瘤部位,最大信號於12小時發現。相反地,在接受鏈黴抗生物素蛋白-Cy5.5之對照小鼠的腫瘤中偵測微不足道之螢光Cy5.5染料攝取。為了測定任何其他重要器官是否非特異性地攝取該注射之染料複合物,小鼠在注射後12小時被安樂死,取下重要器官及癌異種移植以供活體外造影。肝臟及腎臟均顯示可觀信號,即使在接受鏈黴抗生物素蛋白-Cy5.5之對照小鼠,顯示為非特異性攝取(圖9A)。相較於來自經鏈黴抗生物素蛋白-Cy5.5處理之對照小鼠的腫瘤異種移植,接受PLZ4-Cy5.5之小鼠的異種移植在對肝及腎之螢光正常化後累積顯著較高之螢光信號(較肝高3.2倍,p=0.003及較腎高3.8倍,p<0.001)(圖9B)。其他器官包括膀胱均
未觀察到顯著螢光攝取。總結來說,這些資料證實PLZ4對活體內之TCC異種移植展現優異之歸巢特性。
本試驗顯示人膀胱癌特異性配體亦可以犬膀胱TCC細胞為目標。這些發現不僅對供人應用之藥物發展具重要性,對犬膀胱癌之診斷及治療亦為重要。在供人應用之藥物發展上所面臨的一項重要問題是缺乏適當之動物模型。具腫瘤異種移植之免疫不全小鼠是最常被使用之模型。生理上,小鼠異種移植模型根本異於人病患天然發生之癌。最常使用之異種移植模型係皮下異種移植,但是大部分的人癌症即使非常末期也很少轉移至皮下區域。另外,由於異種移植模型之快速腫瘤形成(數周),其局部血管形成及穿透性可能與花上數月至數年所形成之天然發生之癌顯著不同。本試驗顯示PLZ4亦可與活體外及活體內之犬膀胱癌細胞結合(圖7及9)。另外發現PLZ4可與來自一個犬膀胱TCC臨床樣本之癌細胞結合,但無法與來自另一臨床犬之膀胱淋巴樣增生樣本結合(資料未顯示)。這些結果表示膀胱癌特異性配體之臨床前試驗可在天然發生膀胱癌之犬中進行。
PLZ4之一項重要應用係於經尿道切除膀胱癌(TURBT)期間之膀胱癌局部視覺化。膀胱癌之局部視覺化具臨床重要性,因為在高達三分之一的TURBT完成病例中可見不完全切除,導致治療後膀胱癌之高復發率。5-胺基酮戊酸(ALA)之螢光膀胱鏡檢查已被用於此目的(Daniltchenko,et al.J Urol(2005)174:2129-2133)。但是非癌尿路細胞特別
是在發炎膀胱中之非特異性攝取ALA阻礙彼之廣泛臨床應用。我們先前的試驗顯示PLZ4可與pH 6.0之尿液中的膀胱癌細胞結合,且PLZ4不與收集自以卡介苗積極治療之病患的尿液樣本中之細胞結合。因此,與螢光染料共軛之PLZ4係此應用之絕佳候選物。原位小鼠膀胱癌模型已被發展。由於體型之限制,小鼠(甚至大鼠)膀胱鏡檢查之臨床前試驗可能並不可行。膀胱鏡檢查已被例行用於診斷犬之膀胱疾病。PLZ4之Kd50 10.29及21.31微莫耳可藉由局部經膀胱灌注輕易達成。
PLZ4的另一應用係膀胱癌之造影偵測,該應用可補充或減少侵入性及昂貴之膀胱鏡檢查。微型MRI及微型PET可在小鼠中進行。由於原位小鼠膀胱癌模型之尺寸微小,小鼠體內之腫瘤的大小、數量及位置歧異可能完全無法施行及轉用於人病患。另外,由於膀胱位置與體外造影儀器過近、組織吸收及散射過少,小鼠之影像學試驗不適用於大型動物諸如人病患。MRI及PET二種檢查被廣泛運用於診斷犬之惡性病。因此,可以測定MRI及PET或SPECT是否可用於協助與造影劑共軛之PLZ4之膀胱癌偵測,諸如用於MRI之氧化鐵及用於PET/SPECT之放射性同位素。在此活體內試驗中(圖9),僅使用7奈莫耳(相當20毫克之PLZ4於75公斤病患)之PLZ4-Cy5.5,觀察到少量非特異性攝取。此與我們先前發現PLZ4僅與12種不同組織/癌來源之人細胞系中之一者結合,不與任何可能存在膀胱內之混雜細胞諸如正常尿路細胞、全血、周邊血液
單核細胞(PBMC)、纖維母細胞及血管內皮細胞結合之結果一致。此特異性結合有助於PLZ4共軛物之活體內瞄準。
總結來說,本發明之人膀胱癌特異性配體(以PLZ4為示例)亦可與犬膀胱癌細胞結合。因此,以PLZ4作為人診斷及治療劑之臨床前試驗可在天然發生膀胱TCC之犬進行。此處描述之人膀胱癌特異性配體(以PLZ4為示例)亦可被用於處理犬膀胱癌。
應了解此處所描述之實施例及實施態樣僅供示範之目的,各種對於彼等之修飾或改變將由該領域之技藝人士建議且將被納入本申請案之精神與範圍及該隨附之權利要求之範圍內。所有此處引用之公開資料、專利及專利申請案藉此以參照方式整體納入以符合所有目的。
SEQ ID NO:1-X1DGRX5GF,其中X1係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y);X5係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。
SEQ ID NO:2-X1DGRX5GF,其中X1係麩醯胺酸、甘胺酸或丙胺酸;X5係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。
SEQ ID NO:3-X1DGRX5GF,其中X1係任何胺基酸;X5係甲硫胺酸、離胺酸、甘胺酸、丙胺酸或甘胺酸-甘胺酸。
SEQ ID NO:4-X1DGRX5GF,其中X1係麩醯胺酸、甘胺酸或丙胺酸;X5係甲硫胺酸、離胺酸、甘胺酸、丙胺酸或甘胺酸-甘胺酸。
SEQ ID NO:5-QDGRM GF
SEQ ID NO:6-QDGRK GF
SEQ ID NO:7-QDGRKGGF,其中KG係指彼之側鏈被甘胺酸殘基附著之離胺酸殘基。
SEQ ID NO:8-X(1-5)X6DGRX7GFX(8-12),其中X(1-5)及X(8-12)並不存在或為任何胺基酸(意即A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y);X6及X7係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E
、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。
SEQ ID NO:9-X1X2X3DGRX4GFX5X6,其中X1、X2、X5、X6並不存在或為任何胺基酸(意即A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y);X3及X4係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。
SEQ ID NO:10-cX1DGRX5GFc,其中X1係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y);X5係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y),且c係D-半胱胺酸。
SEQ ID NO:11-cQDGRKGFc,其中c係D-半胱胺酸。
SEQ ID NO:12-cQDGRMGFc,其中c係D-半胱胺酸。
SEQ ID NO:13-cQDGRK(G1-6)Fc,其中c係D-半胱胺酸,其中K(G1-6)係指彼之側鏈被1至6個甘胺酸殘基附著之離胺酸殘基。
SEQ ID NO:14-CQDGRMGFC
SEQ ID NO:15-cX1X2X3X4X5X6X7c,其中X係除半胱胺酸以外之任何天然L-胺基酸(意即A、D、E、F、G、
H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y);且c係D-半胱胺酸。
SEQ ID NO:16-c(U/Z)1(U/Z)2(U/Z)3(U/Z)4(U/Z)5c-其中U係非天然胺基酸且Z係除精胺酸、半胱胺酸及離胺酸以外之任何天然L-胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、Y)。
SEQ ID NO:17-CX1DGRX5GFC,其中X1及X5係除半胱胺酸以外之任何胺基酸(意即A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、Y)。
圖1篩選與膀胱癌細胞結合之配體的全細胞結合試驗。在此試驗中,單細胞懸浮液係與OBOC分子庫一起培養。若在珠表面上之肽可與細胞表面分子結合,該些珠被細胞覆蓋。在每幅圖的中央,一個陽性珠被膀胱癌細胞覆蓋,顯示在此珠上之肽可與測試之膀胱癌細胞結合,然而其他珠上之肽無法結合測試細胞。培養時間、細胞及分子庫種類顯示於各圖旁。平均珠直徑約為90微米。
圖2A至H PLZ4可與膀胱腫瘤細胞結合,但不與正常尿路細胞或其他混雜細胞結合。PLZ4與三種膀胱TCC
細胞結合:5637(A)、T24(B)及TCCSUP(C),但不與正常尿路細胞結合(D)。在D圖中正常尿路細胞之細胞大小的異質性顯示存在從尿路基底層(小細胞)至基底上層之細胞。在顯微鏡下未觀察到PLZ4與全血細胞(E)、PBMC(F)、正常纖維母細胞(G)及來自接受BCG經膀胱療法積極治療之病患的細胞(H)之結合。珠直徑約為90微米。
圖3A至E PLZ4與人及犬膀胱癌細胞之結合。來自新鮮切除之人膀胱癌樣本之單細胞懸浮液係與包覆PLZ4之珠一起培養。觀察到與來自人病患之細胞顯著結合(A及B)。來自與B圖相同之病患的正常膀胱細胞不與包覆PLZ4之珠結合(C)。C圖中之細胞被清洗掉以減少細胞與珠之重疊。在pH 6.0之尿中培養4小時後,經PLZ4-包覆之珠可與膀胱癌細胞5637細胞結合(D)。PLZ4-FITC共軛物可與犬膀胱癌細胞結合(E)。珠直徑為90微米。
圖4A至B膀胱癌細胞之螢光染色。A.以流式細胞儀測定PLZ4與5637細胞之結合親和性。該螢光強度隨著PLZ4-PE濃度增加而增加。此圖代表各濃度之三次試驗的平均值。結合親和性(Kd50)約為30微莫耳。B.膀胱癌及正常尿路細胞以經FITC共軛之PLZ4螢光染色。細胞係於腔室玻片中培養,以PLZ4-FITC染色。膀胱癌細胞5637、TCCSUP及T24被染成綠色,正常尿路細胞則未被染色(左邊第一行)。所有細胞核均被DAPI染成藍色(左邊第二及四行)。只有鏈黴抗生物素蛋白-FITC但未添加PLZ4-生物素時,沒有細胞被染成綠色(左邊第三行)。放
大200倍。
圖5A至F腫瘤負荷小鼠之活體內NIRF造影。小鼠腫瘤異種移植係利用來自進行膀胱切除術以切除膀胱癌之病患的原發性膀胱癌組織建立。PLZ4-Cy5.5(7奈莫耳)係經尾靜脈注射。圖A至D近紅外光造影。圖A小鼠僅接受SA-CY5.5。圖B小鼠接受PLZ4-CY5.5共軛物。紅色箭頭指出大量攝取CY5.5之腫瘤異種移植。圖C接受SA-Cy5.5之小鼠的異種移植及器官之活體外造影,顯示腎臟攝取及腫瘤異體移植中之微弱自體螢光。圖D接受PLZ4-Cy5.5之小鼠的異種移植及器官之活體外造影,顯示腫瘤異種移植及腎臟中之螢光。圖E及F分別為圖C及D之光成像。螢光強度係以底部之任意單位顯示。
圖6A至C PLZ4與αvβ3整合素之結合。A.PLZ4與αvβ3整合素結合。包覆PLZ4肽之珠係與經不同整合素次單位轉染之K562細胞一起培養。PLZ4僅可與細胞表面表現αvβ3整合素之K562細胞結合。B丙胺酸行走以測定對細胞結合為重要之胺基酸。PLZ4(SEQ ID NO:5)中之各個胺基酸經丙胺酸取代一次一個,以產製包覆新穎肽之珠(按出現順序分別為SEQ ID NO:24至30)(丙胺酸行走),並測試彼等與5637膀胱癌細胞之結合。半定量系統係用於測定結合活性:++++代表非常強烈之結合,75-100%之珠表面覆蓋細胞;+++代表強烈結合,50-74%之珠表面覆蓋細胞;++表示中度結合,25-49%之珠表面覆蓋細胞;+表示微弱結合,1-24%之珠表面覆蓋細胞;-表示無結合。
C.在X5位置上之甘胺酸殘基對PLZ4與膀胱癌細胞結合之影響。各圖之珠上的肽具有與PLZ4(cQDGRMGFc;SEQ ID NO:12)相同之骨架序列(cQDGRKGFc;SEQ ID NO:11),除了X5位置之M被K取代。一(c)至六個(h)甘胺酸與圖c至h中之K共軛(SEQ ID NO:13)。OBOC珠係與5637TCC細胞一起培養。相較於親代PLZ4配體(a),甲硫胺酸被離胺酸取代時(b)與5637細胞之結合並無顯著變化。僅添加一(c)或二個(d)甘胺酸殘基時,此配體仍可與5637細胞強烈結合。但是加入三(e)或四個(f)甘胺酸使細胞結合顯著下降,添加五(g)及六個(h)甘胺酸時無結合。
圖7A至B PLZ4與犬TCC細胞系結合。A.測定細胞結合及正常犬尿路細胞與PLZ4珠結合之全細胞結合試驗。人膀胱癌細胞系5637及犬K9TCC-PU係經胰蛋白酶消化、清洗及以完全培養基重懸為106細胞/毫升之單細胞懸浮液。正常犬膀胱尿路細胞被輕輕刮下並經消化成為單細胞懸浮液。PLZ4珠亦經水清洗二次及PBS清洗二次,然後加至60毫米培養皿之細胞懸浮液中。在37℃輕微搖晃60分鐘之後,在倒置顯微鏡下直接觀察細胞結合。若PLZ4與溶液中之細胞結合,在顯微鏡檢查下可觀察到珠被展現玫瑰花簇模式之細胞覆蓋。對不同之細胞系重複3次此試驗。正常犬膀胱尿路細胞之細胞結合測定係於2隻不同的犬重複。a.5637人膀胱癌細胞系;b.K9TCC-PU細胞系;c.正常犬尿路細胞系;d.源自慢性膀胱炎之膀胱的細胞。珠之平均直徑為90微米。B.PLZ4肽對犬TCC
細胞系之親和性螢光。犬TCC細胞系、K9TCC-PU、K9TCC-PU-In、K9TCC-PU-AxA、K9TCC-PU-Nk及K9TCC-PU-AxC及人膀胱癌細胞系5637係於腔室玻片上培養。自因非膀胱疾病被安樂死之犬的正常犬膀胱尿路細胞製作接觸製備抹片。玻片在封片前以丙酮固定2分鐘。細胞與1微莫耳之PLZ4-生物素於4℃培養1小時,接著按廠商說明書與1:1000稀釋之鏈黴抗生物素蛋白-Alexa Flour®488共軛物(美國加州卡斯巴德市英維特基(Invitrogen)公司)培養。清洗玻片後,加入含DAPI之培養基以進行核染色,在倒置螢光顯微鏡下觀察。此試驗重複3次。(200x)
圖8A至B PLZ4對犬TCC細胞系之結合親和性及生物效應。A.PLZ4對K9TCC-PU及K9TCC-PU-In之結合親和性。二萬個K9TCC-PU及K9TCC-PU-In被接種於96孔盤。培養24小時後,細胞經固定及與不同濃度之PLZ4-生物素培養1.5小時,然後與抗生物素蛋白-HRP再培養1小時。僅經抗生物素蛋白-HRP處理之細胞作為背景對照。利用TMB受質顯色,藉由ELISA讀取儀判讀。該試驗以三份進行,並重複3次。顯示該3次試驗之平均值。B.PLZ4對犬TCC細胞系之生物效應。一萬個K9TCC-PU-In及K9TCC-PU細胞被接種於96孔盤,並以濃度漸增之PLZ4或PBS處理2天。細胞增生試驗係按廠商說明書以WST-8試驗測定。經PBS處理之細胞被用來作為100%對照。各組以三份進行,重複3次。顯示各濃度之平均值。
圖9A至C PLZ4對小鼠之犬膀胱癌異種移植的歸巢。
A.含PLZ4之犬K9TCC-PU-In異種移植之活體內造影。上圖:注射後不同時間點之活體內近紅外光螢光造影。B.:接受鏈黴抗生物素蛋白-Cy5.5之對照小鼠。PLZ4:接受PLZ4-Cy5.5之小鼠。紅色箭頭指向腫瘤異種移植。下圖:顯示器官螢光強度之活體外造影。特異性攝取螢光係於接受PLZ4-Cy5.5之小鼠的腫瘤異種移植中發現。在對照小鼠及接受PLZ4-Cy5.5之小鼠的腎及肝中亦可觀察到非特異性攝取。C.活體外定量分析腫瘤異種移植之螢光攝取。腫瘤異種移植之螢光強度係經正常化至該相同小鼠之肝及腎之該值(該經正常化之肝及腎之值係定義為1.0)。經正常化後,接受PLZ4-Cy5.5之小鼠的腫瘤異種移植攝取係遠高於來自對照小鼠之異種移植攝取(就經正常化之值而言分別為p=0.003及p<0.001)。
<110> 加州大學董事
<120> 肪胱癌特異性配體肽
<130> UCDVP049TW
<140> TW 099132256
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<151> 2009-09-24
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<223> 有關取代及較佳實施態樣之詳細描述見提出之說明書
<400> 1
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Gln,Gly或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<400> 2
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(6)
<223> 該區可能包含Met,Lys,Gly,Ala或Gly-Gly
<400> 3
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Gln,Gly或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(6)
<223> 該區可能包含Met,Lys,Gly,Ala或Gly-Gly
<400> 4
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 6
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 具側鏈Gly殘基之Lys
<220>
<223> 有關取代及較佳實施態樣之詳細描述見提出之說明書
<400> 7
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(5)
<223> 20個天然胺基酸中之任何胺基酸且此區可能包含1至5個殘基或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
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<223> 20個天然胺基酸中之任何胺基酸且此區可能包含1至5個殘基或不存在
<400> 8
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(2)
<223> 20個天然胺基酸中之任何胺基酸或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(11)
<223> 20個天然胺基酸中之任何胺基酸或不存在
<400> 9
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> D-Cys
<400> 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Cys
<400> 11
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Cys
<400> 12
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 具1至6個Gly殘基側鏈之Lys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> D-Cys
<400> 13
<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 14
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(8)
<223> 除Cys外之20個天然L-胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Cys
<220>
<223> 有關取代及較佳實施態樣之詳細描述見提出之說明書
<400> 15
<210> 16
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(6)
<223> 任何非天然胺基酸或除Arg,Cys域Lys外之20個
天然L-胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> D-Cys
<220>
<223> 有關取代及較佳實施態樣之詳細描述見提出之說明書
<400> 16
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<223> 有關取代及較佳實施態樣之詳細描述見提出之說明書
<400> 17
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何胺基酸
<220>
<223> 有關取代及較佳實施態樣之詳細描述見提出之說明書
<400> 18
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Gln,Gly或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 任何胺基酸
<400> 19
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> D-Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
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<223> 任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> D-Cys
<220>
<223> 有關取代及較佳實施態樣之詳細描述見提出之說明書
<400> 20
<210> 21
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(6)
<223> 該區可能包含Met,Lys,Gly,Ala或Gly-Gly
<400> 21
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(5)
5723> 20個天然胺基酸中之任何胺基酸且此區可能
包含1至5個殘基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(17)
<223> 20個天然胺基酸中之任何胺基酸且此區可能
包含1至5個殘基
<400> 22
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(2)
<223> 20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)..(7)
<223> 除Cys外之20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(11)
<223> 20個天然胺基酸中之任何胺基酸
<400> 23
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 24
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 25
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 26
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 27
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 28
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 29
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:合成肽
<400> 30
Claims (31)
- 一種包含胺基酸序列X1DGRX5GF之肽,其中X1係選自麩醯胺酸、甘胺酸或丙胺酸且X5係非半胱胺酸之任何胺基酸,其中該肽之長度不超過10個胺基酸且與膀胱癌細胞結合。
- 一種包含胺基酸序列X1DGRX5GF之肽,其中X1及X5係非半胱胺酸之任何胺基酸,其中:i)一或多個胺基酸殘基係D-胺基酸;ii)該肽在N端或C端中之一或二者包含保護基;iii)該肽係完全地或部分地逆反;iv)該肽包含2或多個胺基酸序列X1DGRX5GF(SEQ ID NO:1)之重複;或v)該肽係環狀。
- 如申請專利範圍第1至2項中任一項之肽,其中X5係甲硫胺酸、離胺酸、甘胺酸或丙胺酸。
- 如申請專利範圍第1至2項中任一項之肽,其中該肽具有胺基酸序列QDGRMGF(SEQ ID NO:5)或QDGRKGF(SEQ ID NO:6)。
- 如申請專利範圍第1至2項中任一項之肽,其中該肽不與正常膀胱組織結合。
- 如申請專利範圍第1至2項中任一項之肽,其中該肽在胺基及/或羧基端另包含1至3個毗鄰胺基酸殘基。
- 如申請專利範圍第1至2項中任一項之肽,其中該肽在胺基端另包含半胱胺酸殘基且在羧基端另包含半胱胺 酸殘基。
- 如申請專利範圍第1至2項中任一項之肽,其中該肽係與治療性基團或可偵測之標記連接。
- 如申請專利範圍第8項之肽,其中該可偵測之標記係珠、螢光團、化學發光基團、磁性顆粒、金屬顆粒或放射性同位素。
- 如申請專利範圍第8項之肽,其中該治療性基團係免疫球蛋白之Fc部分、細胞毒素或抗癌劑。
- 如申請專利範圍第1至7項中任一項之肽,其中該肽係經調製為奈米粒子。
- 一種偵測膀胱癌存在之方法,該方法包含使膀胱細胞或膀胱組織與連接可偵測之標記的如申請專利範圍第1至7項中任一項之肽接觸,其中該膀胱細胞或膀胱組織係於活體外,及偵測該肽與該膀胱細胞或膀胱組織之結合,其中偵測到該肽與該膀胱細胞或膀胱組織之結合表示膀胱癌。
- 如申請專利範圍第12項之方法,其中該可偵測之標記係選自珠、螢光團、化學發光基團、磁性顆粒、金屬顆粒或放射性同位素。
- 如申請專利範圍第13項之方法,其中該膀胱癌細胞或膀胱組織係於活體外。
- 如申請專利範圍第12項之方法,其中該膀胱細胞或膀胱組織係於尿液樣本中。
- 如申請專利範圍第12項之方法,其中該肽係磁性 奈米粒子-肽共軛物。
- 一種與可偵測之標記連接的如申請專利範圍第1至7項中任一項之肽於製備供偵測個體內膀胱癌存在的藥物之用途,其中該肽與膀胱組織之膀胱癌細胞結合且該可偵測之標記鑑別該個體內存在膀胱癌細胞。
- 如申請專利範圍第17項之用途,其中該可偵測之標記係選自珠、螢光團、化學發光基團、磁性顆粒、金屬顆粒或放射性同位素。
- 如申請專利範圍第17項之用途,其中該膀胱癌細胞或膀胱組織係於活體外。
- 如申請專利範圍第17項之用途,其中該膀胱細胞或膀胱組織係於尿液樣本中。
- 如申請專利範圍第17項之用途,其中該肽係磁性奈米粒子-肽共軛物。
- 一種與治療性基團連接之如申請專利範圍第1至7項中任一項之肽於製備供抑制或預防個體體內膀胱癌細胞生長的藥物之用途,其中該肽與膀胱癌細胞結合且該治療性基團抑制或預防該膀胱癌細胞之生長。
- 如申請專利範圍第22項之用途,其中該個體係哺乳動物。
- 如申請專利範圍第22項之用途,其中該治療性基團係免疫球蛋白之Fc部分、細胞毒素、抗癌劑或放射性同位素。
- 如申請專利範圍第22項之用途,其中與該治療性 基團連接之該肽係經靜脈內、腫瘤內、尿道內或膀胱灌注投予該個體。
- 如申請專利範圍第22項之用途,其中該肽係經調製為奈米粒子。
- 一種醫藥組成物,其包含與治療性基團連接之如申請專利範圍第1至7項中任一項之肽和醫藥上可接受之載劑。
- 如申請專利範圍第27項之醫藥組成物,其中該治療性基團係免疫球蛋白之Fc部分、細胞毒素、抗癌劑或放射性同位素。
- 如申請專利範圍第27項之醫藥組成物,其中與該治療性基團連接之該肽係經調製以供經選自靜脈內、腫瘤內、尿道內或膀胱灌注之途徑投予。
- 如申請專利範圍第27項之醫藥組成物,其中該肽係經調製為奈米粒子。
- 一種醫藥組成物,其包含如申請專利範圍第1至8項中任一項之肽和醫藥上可接受之載劑。
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