TWI477275B - 新抗癌劑，該藥劑之製備及該藥劑之治療用途 - Google Patents

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Description

新抗癌劑，該藥劑之製備及該藥劑之治療用途
本發明係關於吡咯并[1,4]苯并二氮呯(PBD)二聚體結合物、包含其之組合物及其治療應用，詳言之用作抗癌劑。本發明亦係關於製備該等結合物之方法、其用作抗癌劑之應用及該等二聚體自身。
吡咯并[1,4]苯并二氮呯二聚物為抗癌劑，其藉由共價鍵結至細胞之DNA上起作用。此等衍生物已描述於申請案WO 00/12508 及WO 2005/085260 中，及以下公開案中：Eur. J. Med. Chem., 2005 ,40 ,641-654；Tetrahedron Letters, 1988 ,29 (40),5105-5108。
結合物化學多年前即已知曉且已應用於若干細胞毒性劑家族，諸如類美登素(maytansinoid)(WO 04103272 )、紫杉烷(taxan)(WO 06061258 )、來普黴素(leptomycin)(WO 07144709 )或CC-1065 及其類似物(WO 2007102069 )；關於結合物亦參見Monneret C.等人，Bulletin du Cancer ,2000 ,87 (11),829-38；Ricart A.D.等人，Nature Clinical Practice Oncology, 2007 ,4 ,245-255；Singh R.及Rickson H.K.,Therapeutic Antibodies: Methods and Protocols ,2009 ,525,445-467。
吡咯并[1,4]苯并二氮呯二聚體結合物已描述於申請案WO 07085930 或WO 2009/016516中。 所使用之二聚體更特定而言具有下式：
其中T可表示經-G-D-(Z)p -SZa 或-G-D-(Z)p -C(=O)Zb Rb 取代之芳基或雜芳基。G表示單鍵或雙鍵或者-O-、-S-或-NR-。D表示單鍵或者以下基團之一：-E-、-E-NR-、-E-NR-F-、-E-O-、-E-O-F-、-E-NR-CO-、-E-NR-CO-F-、-E-CO-、-CO-E-、-E-CO-F、-E-S-、-E-S-F-、-E-NR-CS-、-E-NR-CS-F-，其中E及F係選自-(OCH2 CH2 )i 烷基(OCH2 CH2 )j -、-烷基(OCH2 CH2 )i -烷基-、-CH2 CH2 )i -、-(OCH2 CH2 )i 環烷基(OCH2 CH2 )j -、-(OCH2 CH2 )i 雜環基(OCH2 CH2 )j -、-(OCH2 CH2 )i 芳基(OCH2 CH2 )j -、-(OCH2 CH2 )i 雜芳基(OCH2 CH2 )j -、-烷基-(OCH2 CH2 )i 烷基(OCH2 CH2 )j -、-烷基-(OCH2 CH2 )i -、-烷基-(OCH2 CH2 )i 環烷基(OCH2 CH2 )j -、-烷基(OCH2 CH2 )i 雜環基(OCH2 CH2 )j -、-烷基-(OCH2 CH2 )i 芳基(OCH2 CH2 )j -、-烷基(OCH2 CH2 )i 雜芳基(OCH2 CH2 )j -、-環烷基-烷基-、-烷基-環烷基-、-雜環基-烷基-、-烷基-雜環基-、-烷基-芳基-、-芳基-烷基-、-烷基-雜芳基-、-雜芳基-烷基-。i及j表示在0至2000範圍內之整數。Z表示烷基且p為值為0或1之整數。
表徵本發明之一些化合物的基團L2 =-CH2 C(=O)NR3 -(CH2 CH2 O)i -ALK-包含醯胺單元(-CONR3 -)且可僅對應於WO 07085930 或WO 2009/016516 中之單元-E-CONR-F-，其中E=烷基且F=-(CH2 CH2 O)i -烷基-。然而，在此兩個專利申請案中未描述或提出連接至苯基或吡啶環且連接至L2 之基團L1 。特定言之，其可僅對應於單元G。實際上，G可僅為(單、雙、參)鍵或者-O-、-S-或-NR-。關於特徵在於連接基團-O-ALK-NR3 -ALK-S-(CH2 CH2 O)i -ALK-的本發明之其他化合物，WO 07085930 或WO 2009/016516 之單元D皆不提供胺基NR3 與鍵-S-之組合。以下二聚體描述於WO 2009/016516 中：
但此等二聚體皆不包含與本發明中所述者類似之連接基團(尤其無-ALK-S-單元)。
因此，兩個申請案WO 07085930 及WO 2009/016516 皆未描述或提出本發明化合物。
 [技術問題]
本發明欲解決之技術問題為提供新穎的吡咯并[1,4]苯并二氮呯二聚體結合物。
[定義]
以下術語具有隨附意義：
●結合物：細胞毒性化合物之至少一個分子共價連接至細胞結合劑；
●細胞結合劑：對生物目標具有親和力之分子：其可例如為配位體、蛋白質、抗體，更特定言之為單株抗體、蛋白質或抗體片段、肽、寡核苷酸或寡醣。結合劑之作用為引導諸如細胞毒性劑之生物活性化合物朝向生物目標；
●生物目標：較佳位於癌細胞或與此腫瘤有關之基質細胞之表面處的抗原(或抗原群組)；此等抗原可能例如為生長因子受體、致癌基因產物或突變之「腫瘤抑制劑」基因產物、血管生成相關分子或黏著分子；
●烷基：藉由自烷烴移除氫原子而獲得之飽和脂肪烴基團。烷基可為直鏈或分支鏈。可提及之實例為甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、第三丁基、戊基、2,2-二甲基丙基或己基；
●環烷基：在環狀結構中包含3至8個碳原子之環狀烷基。可提及之實例為環丙基、環丁基、環戊基或環己基；
●芳基：不包含雜原子之單環或雙環芳族基團。更特定言之涉及苯基及萘基；
●雜芳基：環中包含至少一個雜原子(O、S、N)且其連接至碳原子形成環的單環或雙環芳族基團。更特定言之涉及吡啶基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基或三唑基；
●雜環烷基：環中包含至少一個雜原子(O、S、N)且其連接至碳原子形成環的環烷基；
●烷氧基：-O-烷基，其中烷基如上文所定義；
●烷醯基氧基：-O-CO-烷基，其中烷基如上文所定義；
●伸烷基：具有經驗式-Cm H2m -之飽和二價基團，其藉由自烷烴移除兩個氫原子而獲得。烷烴可為直鏈或分支鏈。可提及之實例為亞甲基(-CH2 -)、伸乙基(-CH2 CH2 -)、伸丙基(-CH2 CH2 CH2 -)、伸丁基(-CH2 CH2 CH2 CH2 -)、伸異丁基()或伸己基(-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -)。更特定言之，直鏈伸烷基可具有式-(CH2 )m -，m表示整數；
●在值之範圍中，包括極限值(例如，「i在1至6之範圍內」之範圍類型包括極限值1及6)。
所使用之縮寫
AcOEt：乙酸乙酯；ALK：(C1 -C12 )伸烷基，更特定言之(C1 -C6 )伸烷基；TLC：薄層層析法；DAR：藥物抗體率；DBU：1,8-二氮雙環[5.4.0]十一碳-7-烯；DCC：N,N'-二環己基碳化二亞胺；DCM：二氯甲烷；DEAD：偶氮二甲酸二乙酯；DIC：N,N'-二異丙基碳化二亞胺；DIPEA：N,N-二異丙基乙胺；DMA：二甲基乙醯胺；DMAP：4-二甲基胺基吡啶；DME：二甲氧基乙烷；DMF：二甲基甲醯胺；DMSO：二甲基亞碸；e：莫耳消光係數；EEDQ：2-乙氧基-1-乙氧羰基-1,2-二氫喹啉；EDCl：N-(3-二甲基胺基丙基)-N'-乙基碳化二亞胺；EDTA：乙二胺四乙酸；Fmoc：茀基甲氧基羰基；PG：保護基；Hal：鹵素原子；HOBt：1-羥基苯并三唑；HEPES：4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸；LG：離去基；NHS：N-羥基丁二醯亞胺；NMP：N-甲基吡咯啶酮；RP：減壓；Rf：滯留因子；SEC：空間排阻層析法；AT：環境溫度；TBDMS：第三丁基二甲基矽烷基；TEA：三乙胺；TFA：三氟乙酸；TIPS：三異丙基矽烷基；THF：四氫呋喃；rt：滯留時間。
本發明係關於下式之化合物：
其中：
●　表示單鍵或雙鍵，其條件為若表示單鍵，則：
　----表示單鍵；
　相同或不同之U及 /或U'相互獨立地表示H；
　相同或不同之W 及/或W' 相互獨立地表示：OH、-OR、-OCOR、-COOR、-OCOOR、-OCONRR'、N10與C11包括於一環中之環狀胺基甲酸酯基、-NRCONRR'、-OCSNHR、N10與C11包括於一環中之環狀硫代胺基甲酸酯基、-SH、-SR、-SOR、-SOOR、-SO3 - 、-NRSOOR'、-NRR'、N10與C11包括於一環中之環狀胺、-NROR'、-NRCOR'、-N3 、-CN、Hal或三烷基鏻基或三芳基鏻基；
●　相同或不同 之R 1 、R 2 、R 1 ' 及R 2 ' 相互獨立地表示：H、Hal或視情況經一或多個選自以下之取代基取代之(C1 -C6 )烷基：Hal、CN、NRR'、CF3 、OR、芳基或雜芳基，或S(O)q R，其中q=0、1或2；
或者
●　R 1 與R 2 及/或R 1 ' 與R 2 ' 分別一起形成雙鍵=CH2 或=CH-CH3 ；
●　相同或不同之Y 及Y' 相互獨立地表示H或OR；
●　M 表示CH或N；
●　相同或不同之ALK 及ALK' 相互獨立地表示(C1 -C6 )伸烷基；
●　R 及R' 相互獨立地表示H或視情況經一或多個選自以下之取代基取代之(C1 -C6 )烷基或芳基：Hal、CN、NRR'、CF3 、OR或芳基或雜芳基；
●　L 表示：
　-L 1 -L 2 - 基團，其中L 1 經由ALK或OALK基團連接至包含M 之芳環，且表示以下基團之一：
-ALK-S-
-O-ALK-NR3 -ALK-S-
且L 2 表示經由-CH2 C(=O)-連接至L 1 之-CH2 C(=O)-NR3 -(CH2 CH2 O)i -ALK-基團；
或者
　經由OALK基團連接至包含M 之芳環的-O-ALK-NR3 -ALK-S-(CH2 CH2 O)i -ALK-基團；
●R 3 表示H或(C1 -C6 )烷基；
●i 表示在1至40、更適當地1至20、較佳1至10範圍內之整數；
●Z b 表示單鍵、-O-或-NH-，且R b 表示H或(C1 -C6 )烷基、(C3 -C7 )環烷基、芳基、雜芳基或(C3 -C7 )雜環烷基，或者Z b 表示單鍵且R b 表示Hal。
式(I)化合物(包括所例示者)可以鹼形式或與醫藥學上可接受之酸之加成鹽形式以及此等鹼或此等鹽之水合物或溶劑合物形式存在。
更特定言之，連接至苯基或吡啶基核之兩個ALK及ALK'基團皆表示亞甲基：
更特定言之，在式(I)化合物中，挑選出式(IA )或(IB )：
Y 及Y' 更特定言之表示(C1 -C4 )烷氧基，尤其甲氧基。R 及R' 更特定言之可相互獨立地表示H或(C1 -C6 )烷基。根據特定形式，U=U'及/或W=W'及/或R1 =R1 '及/或R2 =R2 '及/或Y=Y'及/或連接至苯基或吡啶基核之兩個ALK及ALK'基團相同。
更特定言之，L可選自以下之一：
-ALK-S-CH2 C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)i -CH2 CH2 -
-O-ALK-NR3 -ALK-S-CH2 C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)i -CH2 CH2
-O-ALK-NR3 -ALK-S-(CH2 CH2 O)i -CH2 CH2 -。
其中，ALK更特定言之表示(C1 -C4 )伸烷基。詳言之，ALK可為以下之一：-CH2 CH2 -、-CH2 CMe2 -或-CH2 CH2 CMe2 -。L亦可為下表I 或表II 中所述之一。
i 表示在1至40、更適當地1至20、較佳1至10範圍內之整數。i 可為在1至40範圍內之每一值；詳言之，i可具有值3、4、5、6、7、8、9或10。
表1 描述式(IA) 之化合物之代表性實例。此表之每一化合物可以M =CH(苯)或M =N(吡啶)之形式存在。M =N之化合物更可溶於水。
本發明之化合物包含化學基團-C(=O)Zb Rb (RCG1)，其對於結合劑上存在之反應性化學基團(RCG2)具有反應性。RCG1與RCG2之間的反應確保藉由形成共價鍵而使化合物連接至結合劑上。因此，化合物能夠結合至結合劑上。更特定言之，Zb 表示O；在此情況下，RCG1表示酸官能基(Rb =H)或酯官能基。更特定言之，-C(=O)Zb Rb 表示-COOH、-COO(C1 -C6 )烷基，尤其-COOCH3 或-COOCH2 CH=CH2 。在酯官能基中，較佳為對於RCG2基團(尤其對於抗體中存在之胺基)展示優良反應性的「活性」酯。活性酯之實例為以下：其中IG 表示至少一個誘導基(inductive group)，諸如-NO2 或-Hal，尤其-F。可涉及以下基團，例如或。另一類型-C(=O)Zb Rb 基團為以下：
可提及之RCG2之實例為藉由存在於抗體表面處之離胺酸殘基之側鏈載運的離胺酸之ε胺基、鉸鏈區之醣基或藉由鏈內二硫鍵之還原所得的半胱胺酸之硫醇基(Garnett M.C.等人，Advanced Drug Delivery Reviews, 2001 ,53 ,171-216)。最近，已考慮其他方法，諸如藉由突變引入半胱胺酸(Junutula J.R.等人，Nature Biotechnology, 2008 ,26 ,925-932;WO 09026274 )，或引入非天然胺基酸，使得可能實現其他化學類型(de Graaf A.J.等人，Bioconjugate Chem .,2009 ,2009年2月3日(綜述)；DOI: 10.1021/bc800294a；WO 2006/069246，及根據 Chin J.W.等人，JACS, 2002 ,124 ,9026-9027(technology))。對抗體使用之此等連接方法可根據抗體之結構應用於所有已知結合劑。
因此本發明之化合物可用於製備結合劑，下式之二聚體在M 之對位處共價連接至該結合劑：
更特定言之，結合劑為抗體。更特定言之，二聚體具有下式：
製備式(I)化合物之方法
式(I)化合物可根據流程1 來製備：
化合物P 1 、P' 1 及P 2 一起反應得到P 3 。LG 及LG' 表示離去基。L 3 可表示-L-C(=O)Zb Rb 基團；在此情況下，P 3 因而表示式(I)化合物。在P 3 不表示-L-C(=O)Zb Rb 基團之情況下，必須使用一或多個反應將L 3 轉化成-L-C(=O)Zb Rb 基團。詳言之，在-C(=O)Zb Rb =之情況下，可能引入由-C(=O)Zb Rb 基團=-C(=O)O-(C1 -C4 )烷基或-C(=O)O-烯丙基封端之L 3 基團，該-C(=O)Zb Rb 基團隨後轉化成-C(=O)OH基團，其最終與碳酸N,N'-二丁二醯亞胺酯或NHS反應。-COO烷基/烯丙基向-COOH之轉化可藉由用氫氧化鋰處理來進行。特定言之，尤其宜使用甲酯。與碳酸N,N'-二丁二醯亞胺酯之反應係在例如DIPEA之鹼存在下進行；與NHS之反應係在例如DCC之偶合劑存在下進行。同樣，在-C(=O)Zb Rb =之情況下，可能引入-C(=O)Zb Rb 基團=-COOH，其隨後與N,N’-羰基二咪唑反應(JACS, 1958 ,80 ,4423；JACS, 1960 ,82 ,4596)。
化合物P 1 及P' 1 描述於專利申請案WO 00/12508 、WO 00/12507 、WO 2005/040170 、WO 2005/085260 、WO 07085930 或WO 2009/016516 中或可藉由全合成獲得(Mori M.等人Tetrahedron ,1986 ,42 ,3793-3806)。在P 1 及/或P' 1 表示下式之托馬黴素的情況下：
，後者可使用黃色鏈黴菌(Streptomyces croceus )菌株根據FR 1516743 之教示或者藉由全合成來製備(參見J. Antibiotics, 1983 ,XXXVI (3),276-282,Z. Tozuka,「Studies on tomaymycin. Total syntheses of the antitumor antibiotics E- and Z- tomaymycins」)。亦存在商業性P 1 /P' 1 化合物。為引入W/W'基團，亞胺官能基(=雙鍵)上能夠添加各種HW/HW'化合物(例如H2 O或醇ROH)。
關於式P 2 之化合物
此等化合物具有下式：
其中：
■L、M、ALK、ALK'、Zb 及Rb 係如上文所定義；
■E及E'相互獨立地表示-OH基或離去基。
L 可更特定地表示流程2、2'、3、3'、3"、4、5、5'、6、6'、6"、7中所述之一者。
亦挑選出下式之中間體：
其中L*係選自：-ALK-SH；-O-ALK-NR3 -ALK-SH；
在本發明中，術語「離去基」表示在P 2 與P 1 或P' 1 之間的異質反應中離開同時帶走連接ALK與LG或LG'之共價鍵的電子對之原子或原子團。離去基更特定地選自鹵素原子(尤其氯或溴)、或甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、硝基苯磺酸酯基或-OPPh3 + 基。
對於下文其他流程，為簡單起見，使用以下簡略形式：
製備P 2
P 2 係根據實例3之教示自式之相應鹵化二醇獲得(流程2' )：
i.使用諸如第三丁基二甲基矽烷氧基(TBS)之保護基保護兩個醇官能基；
ii.分別使用n-BuLi或鎂來製備相應有機鋰或有機鎂衍生物；
iii.與酮親核加成以形成醇官能基；
iv.經由形成相應硫乙酸酯來製備硫醇(參見實例3.7及3.8)；
v.脫除保護基；
vi.引入LG 及LG' 。在甲磺酸酯基之情況下，在諸如三級胺(例如TEA或DIPEA)之鹼存在下使用甲磺醯氯；參見實例1.4。
鹵化二醇及相應經保護二醇之實例為WO 2009/016516 第48頁之流程1中所描述者(流程1之化合物2及3)。經保護二醇之兩個實例為CAS第181225-40-1號及第181225-41-2號之化合物。
鹵化二醇可藉由還原相應二酸或二酯化合物(例如CAS第193010-40-1號之化合物)獲得。在吡啶(M=N)之情況下，亦參見：Liebigs Annalen der Chemie, 1991 ,10 ,987-988或Tetrahedron, 2005 ,61 (7),1755-1763(流程1之化合物3)。
製備P 4 ALK=CH 2 CH 2 之情況
R 3 =H之情況
步驟(i)： 醯胺之形成及酸之活化；此兩個步驟在諸如DCM之極性非質子性溶劑中連續進行：在胺官能基與N-羥基丁二醯亞胺基鹵乙酸酯之間反應，隨後當場添加諸如DIC之偶合劑。
R 3 ≠H之情況
步驟(ii)： 以甲酯形式保護羧酸及以三氟乙醯胺形式保護胺；該反應在諸如DCM之極性非質子性溶劑中以兩個連續步驟進行：藉由在甲醇存在下用三甲基矽烷基重氮甲烷處理來保護酸，隨後藉由添加三氟乙酸酐及諸如TEA之鹼來保護胺；
步驟(iii)： 胺之烷基化及酯之皂化；該反應在諸如THF之無水極性非質子性溶劑中以兩個連續步驟進行：藉由在具有離核基團之反應物(諸如烷基鹵化物R3 Hal)存在下用諸如NaH之鹼處理來進行胺之烷基化，隨後添加氫氧化鋰及水；
步驟(i)： 在步驟(iii)之後，對於R3 =H之情況，重複步驟(i)之反應。
ALK≠CH 2 CH 2 之情況
R 3 =H之情況
R 3 ≠H之情況
步驟(iv)： PEG鏈之伸長；在諸如THF或DMF之無水極性非質子性溶劑中藉由用由NaH或鉀萘(potassium naphthalenide)之作用產生之二苯甲酮/亞胺/PEG醇的醇鹽處理鹵化酯來進行該反應(如WO 2007/127440 中所述)；
步驟(v)： 根據Wessjohann L.等人，Synthesis, 1989 ,5 ,359-63，在鈀/木炭存在下藉由氫化作用進行亞胺之選擇性斷裂；
步驟(vi)： 藉由添加三氟乙酸酐及諸如TEA之鹼來保護胺。
胺基/PEG醇為可購得的(例如，i=3、4、7、8)或可根據US 7230101 中所述之程序自可購得之PEG二醇製備(i=3至12)。二苯甲酮對胺官能基之保護可藉由在諸如BF3 醚合物之路易斯酸(Lewis acid)存在下共沸脫水進行。
製備P 2
i.在諸如DMF、THF或MeCN之極性溶劑中，在諸如K2 CO3 之鹼存在下，-OH官能基之一(另外兩個經表示為保護基之PG及PG'保護)與經式Br-ALK-NHBoc之Boc保護之溴胺之間的親核反應(參見例如WO 07085930 中第63頁之條件)。
根據替代形式，可能由式之羥基二酯進行溴胺之親核取代且隨後例如用硼氫化鈉還原酯官能基得到-CH2 OH官能基；對此，可能應用WO 2007/085930 中第62-63頁中提供之親核取代及還原之條件；
ii.脫除保護基；
iii.在異丙醇鈦存在下，用式HC(=O)-ALK-SSMe之醛進行還原胺化；該反應在諸如THF之無水極性非質子性溶劑中在環境溫度下進行；
iv.形成中間體複合物，其經諸如氰基硼氫化鈉之還原劑當場還原；
v.引入LG及LG' 。在甲磺酸酯基之情況下，在諸如三級胺(例如TEA)之鹼存在下使用甲磺醯氯；參見實例1.4。
流程3" 中表述之替代形式在於，尤其在由Kitagawa T.等人，JACS, 2006 ,128(45),14448-14449所述之用於將乙醯硫烷基鏈引入二級胺上的方法之啟發下，將-ALK-SSMe基團引入NHBoc基團上：
根據此替代形式，使用中間體Hal-ALK-SCOMe(例如Hal=I)來進行烷基化，且隨後藉由在鹼性介質中處理來釋放硫醇：
vi.在諸如DMF之極性非質子性溶劑中，在碳酸銫存在下由具有硫乙醯基之烷基鹵化物進行烷基化；
vii.在弱鹼性介質中乙醯基之選擇性斷裂；
viii.藉由中間體硫醇與MeSSO2 Me反應而形成-SSMe基團；
ix.保護基PG及PG'之斷裂；
x.羥基轉化成離核基團LG/LG'，較佳甲磺酸酯基。
在合成之不同步驟可能將R3 基團=(C1 -C4 )烷基引入NH基團上(流程3''' 中提供一實例)。其例如藉由利用使用醛之瓦拉赫反應(Wallach reaction)來進行(參見實例1.5，其中烷基化反應NHNMe使用甲醛)。
關於P 5
Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL 61105,USA,Jenkem Technology USA Inc.,2033 W. McDermott Dr,Allen,TX 75013-4675,USA，及Quanta BioDesign Ltd.,195 West Olentangy Street,Suite O,Powell,Ohio 43065-8720,USA銷售通式之化合物，其表示為NHS-PEG-順丁烯二醯亞胺。更特定言之可涉及CAS第756525-99-2號之化合物。
向順丁烯二醯亞胺單元中添加硫醇之反應係描述於「Bioconjugate Techniques」,Greg T. Hermanson，第2版，Elsevier Inc.(ISBN-13: 978-0-12-370501-3;ISBN-10:0-12-370501-0)的第721頁。
L 1 =-O-ALK-NR3 -ALK-S-且L 2 =-CH2 C(=O)-NR3 -(CH2 CH2 O)i -ALK-
該製備類似於流程3 中所述者，P 5 由P 4 替換。
流程4' 中所述之替代形式對應於流程2 及2' 中所述之類似製備。
i.藉由二硫化物還原來脫除保護基
製 備P 2
使用下式之化合物P 2 ：，根據以下流程5' 獲得其：
i.藉由在哌嗪之1位單保護及在4位藉由離核LG基團進行末端位置之烷基鏈官能化，從而使芳環之羥基烷基化。較佳地，離核基團為甲磺酸酯基且威廉森反應(Williamson reaction)係在諸如THF或DMF之無水極性非質子性溶劑中在氫化物存在下進行；
ii.較佳在酸性介質中脫除Boc、PG及PG'保護基，舉例而言，當PG及PG'基團為TBDMS時，在鹽酸或TFA存在下進行。
根據步驟i及ii之替代形式，可能進行由式之羥基二酯親核取代溴胺，且隨後例如用硼氫化鈉還原酯官能基得到-CH2 OH官能基；對此，可能應用WO 2007/085930 中第62-63頁中提供之親核取代及還原之條件；
iii.　在酸之初始活化之後進行偶合，得到NHS酯；
iv.　引入離去基LG 及LG' 。在甲磺酸酯基之情況下，在諸如三級胺(例如TEA)之鹼存在下使用甲磺醯氯。
且L 2 =-CH2 C(=O)-NR3 -(CH2 CH2 O)i -ALK-
製備P 2
使用下式之化合物P 2 ：，藉由根據以下流程6' 進行之還原胺化獲得其。
v.藉由例如在氰基硼氫化鈉及異丙醇鈦存在下進行還原胺化引入-ALK-SSMe基團。
流程6" 中提供類似於流程3" 中所表述之替代形式且使用Kitagawa T.等人，JACS, 2006 ,128(45),14448-14449中所述之烷基化方法：
i.藉由經單保護之哌嗪進行烷基化(參照流程5' 之步驟i)；
vi.在酸性介質中選擇性脫除Boc保護基；
vii.在諸如DMF之極性非質子性溶劑中，在碳酸銫存在下經具有硫乙醯基之烷基鹵化物進行烷基化；
viii.在弱鹼性介質中乙醯基之選擇性斷裂，及藉由在諸如TEA之鹼存在下中間體硫醇與MeSSO2 Me反應而形成-SSMe基團；
ix.保護基PG及PG'之斷裂，及羥基之L =-O-ALK-NR3 -ALK-S-(CH2 CH2 O)i -ALK-轉化，較佳經甲磺醯氯轉化成甲磺酸酯。
此流程自先前流程3 得到啟發。化合物P 6 可例如為根據WO 03068144 (參照圖7之化合物10a)製備的CAS第564476-32-0號之化合物，或者CAS第309916-91-4號之化合物。可以相應PEG化合物為起始物，根據WO 03068144 之圖7的相同原理製備具有不同鏈長之類似化合物i。
關於P 6
可根據以下流程製備：
ALK=CH 2 CH 2 之情況
ALK≠CH 2 CH 2 之情況
步驟(i)： 將醇活化成甲磺酸酯形式；在諸如DCM之無水極性非質子性溶劑中藉由在諸如TEA之鹼存在下以甲磺醯氯處理進行該反應。
步 驟(ii)： 甲磺酸酯/鹵素交換；以諸如碘化鈉之鹵化鈉在諸如丙酮之極性非質子溶劑之回流下進行該反應。
步驟(iii)： 使用鹽酸溶液(例如在二噁烷中之溶液)或三氟乙酸溶液脫除保護基。
步驟(iv)： 酸之活化；在環境溫度下在諸如DCM之極性非質子性溶劑中，藉由在諸如DCC之偶合劑存在下以NHS處理來進行該反應。
步驟(v)： PEG鏈之伸長；在諸如THF或DMF之無水極性非質子性溶劑中，藉由用呈四氫呋喃(THP)醚形式之經單保護之PEG二醇之醇鹽處理鹵化酯來進行該反應。此類型之經單保護之PEG二醇的製備在以下文獻中充分描述；參見例如Richard A.等人，Chem. Eur. J., 2005 ,11 ,7315-7321或Sakellariou E.G.等人，Tetrahedron, 2003 ,59 ,9083-9090。
步驟(vi)： 使用0.1 N鹽酸溶液(例如在二噁烷或乙醇中之溶液)脫除保護基。
熟習此項技術者可自下文所述實例之操作條件中得到啟發。
製備結合物之方法
藉由以下方法獲得結合物：
(i)使視情況經緩衝之結合劑水溶液與式(I)化合物之溶液接觸並反應；
(ii)且隨後視情況將步驟(i)中形成之結合物與未反應之式(I)化合物及/或結合劑及/或與可能形成之聚集體分離。
根據另一替代形式，步驟(i)中形成之結合物在步驟(ii)中與未反應之結合劑及溶液中可能存在之聚集體分離。根據另一替代形式，步驟(i)之結合物在步驟(ii)中僅與未反應之式(I)化合物以及與可能形成之聚集體分離，且使可能未反應之結合劑留在溶液中。
式(I)化合物較佳包含活性官能基-C(=O)Zb Rb ，其對於RCG2基團，尤其對於抗體上存在之胺基具有反應性。很容易使用熟習此項技術者已知之一或多種化學反應，使相對不起反應或反應性不夠之化學基團轉化成具較大反應性之基團；例如-COOH+N-羥基丁二醯亞胺→ 或者-COO(C1 -C6 )烷基→ -COOH→ -COOH+N-羥基丁二醯亞胺→
實例1中提供適用於抗體及式(I)化合物的方法之實例。
可使用例如緩衝劑(諸如磷酸鉀或N-(2-羥基乙基)哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES緩衝劑))來緩衝結合劑之水溶液。緩衝劑視結合劑之性質而定。將式(I)化合物溶於極性有機溶劑(例如DMSO或DMA)中。
反應通常在20℃與40℃之間的溫度下進行。反應持續時間可在1小時與24小時之間變化。結合劑與式(I)化合物之間的反應可由具有折射偵測器及/或紫外線偵測器之SEC監測，以便由此確定進展狀況。若接枝度不充分，則可使反應進行更長時間及/或可進一步添加式(I)化合物。關於結合可使用之特定條件的更多細節，可參考實例部分中提供之一般方法。
熟習此項技術者可利用各種層析技術用於步驟(ii)之分離：結合物可藉由以下方法純化，例如：空間排阻層析法(SEC)、吸附層析法(諸如離子交換層析法，IEC)、疏水相互作用層析法(HIC)、親和性層析法、混合載體(諸如陶瓷羥基磷灰石)上之層析法、或HPLC。亦可使用透析或透析過濾進行純化。
應瞭解術語「聚集體」意謂可在兩種或兩種以上結合劑之間形成之組合，該等結合劑已經過結合改質或未經過結合改質。聚集體能夠在許多參數影響下形成，諸如溶液中結合劑之高濃度、溶液之pH值、高剪切力、接枝二聚體之數目及其疏水性、或溫度(參見J. Membrane Sci., 2008 ,318,311-316之序言中所引用之參考文獻)，有些參數之影響往往未明確闡明。在蛋白質或抗體之情況下，可參考AAPS Journal ,「Protein Aggregation and Bioprocessing」,2006 ,8(3),E572-E579。可使用已知技術測定聚集體含量，諸如SEC(在此情況下，參見 Analytical Biochemistry, 1993 ,212(2) ,469-480)。
在步驟(i)或(ii)之後，可使結合物溶液經歷步驟(iii)之超濾及/或透析過濾。因此在此等步驟結束時獲得呈水溶液之結合物。
抗體
抗體(在此情況下，參見Janeway等人，「Immunobiology」，第5版，2001,Garland Publishing,New York)尤其可選自申請案WO 04043344 、WO 08010101 、WO 08047242 及WO 05009369 (抗CA6)中所述者。抗體尤其可為單株、多株或多特異性。亦可涉及抗體片段。亦可涉及鼠類、人類、人類化或嵌合抗體。
結合物
結合物通常包含大約1至10個連接至結合劑之吡咯并[1,4]苯并二氮呯二聚體(此為接枝度或藥物抗體比率(DAR))。此數字根據結合劑及二聚體之性質以及結合所用之操作條件而變化(例如二聚體相對於結合劑之當量數、反應時間、溶劑性質及可能之共溶劑之性質)。使結合劑與二聚體接觸產生包含以下之混合物：因DAR不同而彼此個別不同之若干結合物；視情況存在之未反應之結合劑(在不完全反應之情況下)；及可能之聚集體。因此例如藉由UV光譜法對最終溶液所測定之DAR相當於平均DAR。
在結合劑為抗體之情況下，UV光譜法可為用來測定DAR之方法。此方法自Antony S. Dimitrov(編)，LLC,2009,「Therapeutic Antibodies and Protocols」，第525卷，445,Springer Science中所表述得到啟發。其在於在兩個波長(表示為LO1及LO2)下在分離步驟(ii)之後量測結合物之溶液的吸光度。使用以下在結合之前量測的裸抗體及吡咯并[1,4]苯并二氮呯二聚體之莫耳消光係數。
結合物溶液在LO1及LO2處之吸光度(ALO1 及ALO2 )係根據SEC光譜之相應峰來量測(由此可能計算「DAR(SEC)」)或藉由使用習知UV分光光度計來量測(由此可能計算「DAR(UV)」)。吸光度可以如下形式表示：
ALO1 =(cD ×eD LO1 )+(cA ×eA LO1 )
ALO2 =(cD ×eD LO2 )+(cA ×eA LO2 )
對於該方程式：
●　cD 及cA 分別表示溶液中與吡咯并[1,4]苯并二氮呯二聚體有關之結合物之部分及與抗體有關之結合物之部分的濃度；
●　eD LO1 及eD LO2 分別表示結合之前在兩個波長LO1及LO2下吡咯并[1,4]苯并二氮呯二聚體之莫耳吸光係數；
●　eA LO1 及eA LO2 分別表示在兩個波長LO1及LO2下裸抗體之莫耳吸光係數。
應瞭解術語「裸抗體」意謂未與吡咯并[1,4]苯并二氮呯二聚體連接之抗體，亦即結合步驟之前之抗體。
此兩個方程式之求解過程得到：
cD =[(eA LO1 ×ALO2 )-(eA LO2 ×ALO1 )]/[(eD LO2 ×eA LO1 )-(eA LO2 ×eD LO1 )]
cA =[ALO1 -(cD ×eD LO1 )]/eA LO1
平均DAR則等於cD /cA 。在吡咯并[1,4]苯并二氮呯二聚體之情況下，涉及兩個波長LO1=280 nm及LO2=320 nm。根據SEC光譜量測之平均DAR較佳介於1與10之間，較佳介於1.5與7之間。
結合物可用作抗癌劑。由於存在結合劑，致使結合物對腫瘤細胞而非健康細胞呈現高度選擇性。由此可能引導具有抗癌活性之式(I)化合物朝向此等腫瘤細胞之近旁周圍或直接進入此等腫瘤細胞內部(在此情況下，參見以下出版物，其描述治療癌症時使用單株抗體之結合物：「Antibody-drug conjugates for cancer therapy」,Carter P.J.等人，Cancer J., 2008 ,14 ,154-169；「Targeted cancer therapy: conferring specificity to cytotoxic drugs」,Chari R.,Acc. Chem. Res., 2008 ,41 ,98-107)。可能治療實體或非實體癌症。
結合物以通常介於1與10 mg/ml之間的濃度調配成經緩衝之水溶液形式。此溶液可原樣以輸注形式注射或可經再稀釋以形成輸注溶液。
[實例]
化學位移(δ，單位為ppm)係以ppm表示。
方法A：高壓液相層析-質譜法(LCMS)
該光譜係在正及/或負電噴霧模式(ES+/-)下之Waters UPLC-SQD裝置上獲得。層析條件：管柱：ACQUITY BEH C18 1.7 μm-2.1×50 mm；溶劑：A：H2 O(0.1%甲酸)，B：CH3 CN(0.1%甲酸)；管柱溫度：50℃；流動速率：1 ml/min；梯度(2分鐘)：在0.8分鐘內自5至50% B；1.2分鐘：100% B；1.85分鐘：100% B；1.95分鐘：5% B。
方法B：高壓液相層析-質譜法(LCMS)
該光譜係在正及/或負電噴霧模式(ES+/-)下之Waters ZQ裝置上獲得。層析條件：管柱：XBridge C18 2.5 μm 3×50 mm；溶劑：A：H2 O(0.1%甲酸)，B：CH3 CN(0.1%甲酸)；管柱溫度：70℃；流動速率：0.9 ml/min；梯度(7分鐘)：在5.3分鐘內自5至100% B；5.5分鐘：100% B；6.3分鐘：5% B。
方法C：質譜法(MS)
該光譜係使用化學電離(反應氣體：氨氣)在WATERS GCT裝置(無LC而直接引入)上記錄。
方法D：高壓液相層析-質譜法(LCMS)
該光譜係在正及/或負電噴霧模式(ES+/-)下之Waters UPLC-SQD裝置上獲得。層析條件：管柱：ACQUITY BEHC18 1.7 μm-2.1×50 mm；溶劑：A：H2 O(0.1%甲酸)，B：CH3 CN(0.1%甲酸)；管柱溫度：70℃；流動速率：1 ml/min；梯度(2分鐘)：在1分鐘內自5至50% B；1.3分鐘：100% B；1.45分鐘：100% B；1.75分鐘：5% B。
方法E：高壓液相層析-質譜法(LCMS)
該光譜係以電噴霧電離模式在正及/或負模式(ES+/-)下之Waters UPLC-SQD裝置上獲得。層析條件：管柱：ACQUITY BEH C18 1.7 μm -2.1×50 mm；溶劑：A：H2 O(0.1%甲酸)，B：CH3 CN(0.1%甲酸)；管柱溫度：70℃；流動速率：1 ml/min；梯度(4分鐘)：在3.15分鐘內自5至100% B；3.75分鐘：5% B。
方法F：高壓液相層析-質譜法(LCMS)
該光譜係以電噴霧電離模式在正及/或負模式(ES+/-)下之Waters UPLC-SQD裝置上獲得。層析條件：管柱：ACQUITY BEH C18 1.7 μm-2.1×30 mm；溶劑：A：H2 O(0.1%甲酸)，B：CH3 CN(0.1%甲酸)；管柱溫度：45℃；流動速率：0.6 ml/min；梯度(2分鐘)：在1分鐘內自5至50% B；1.3分鐘：100% B；1.45分鐘：100% B；1.75分鐘：5% B。
方法G：結合物之去糖基化及質譜法(HRMS)
去糖基化為使用醣苷酶進行酶促消化之技術。其以500 μl結合物+100 μl Tris HCl 50 mM緩衝液+10 μl聚糖酶-F(glycanase-F)(100單位凍乾酶/100 μl水)為起始物進行。使混合物渦旋且維持在37℃下隔夜。由此準備好去糖基化樣品以供HRMS分析之用。視情況，樣品之HRMS分析亦可在無先前去糖基化之情況下進行。在該兩種情況下，質譜皆在正電噴霧模式(ES+)下之Waters Q-Tof-2裝置上獲得。層析條件：管柱：4 μm BioSuite 250 URH SEC 4.6×300 mm(Waters)；溶劑：A：25 mM甲酸銨+1%甲酸，B：CH3 CN；管柱溫度：30℃；流動速率：0.4 ml/min；等位溶劑：70% A+30% B(15分鐘)。
在式(I)化合物之製備中主張本專利申請案中所述之所有中間體化合物之用途。更特定言之，在各別式(I)化合物之製備中主張各實例中所描述之所有中間體化合物之用途。
實例1 1.1.　製備結合物
藉由使hu2H11(在WO 2008010101 第15頁中亦稱為hu53 2H11；其為包含胺基酸序列為SED ID No. 24之VH之抗體)與3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)-2,5-二側氧基吡咯啶-1-基]丙醯基胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯反應來製備結合物。
將516 μg 3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)-2,5-二側氧基吡咯啶-1-基]丙醯基胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯於540 μl DMA中之溶液添加至8.19 mg hu2H11於2.16 ml pH=8的含水緩衝液中，該緩衝液含有0.05 M濃度之N-(2-羥基乙基)哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、0.05 M濃度之NaCl及2 mM濃度之乙二胺四乙酸(EDTA)。在AT下攪拌3小時後，將混合物經由MillexR -SV 0.45 μM(PVDF Durapore Millipore)過濾且在藉由添加HCl而使pH=6.5之磷酸鹽緩衝鹽水中預平衡之SuperdexTM 200製備級管柱(HiloadTM 26/60 GE管柱)上純化。合併所關注之溶離份且在Amicon Ultra-15(Ultracel 50k Millipore)上濃縮，接著經由在具有10 mM濃度之組胺酸的含水緩衝液中預平衡之Sephadex G-25(NAP-5及NAP-10 GE管柱)過濾，該含水緩衝液包含10%蔗糖及5% NMP。
藉由分光光度法使用4-{2-[甲基(2-甲基-2-巰基丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶之消光係數(e319 nm =8848 M-1 cm-1 且e280 nm =8634 M-1 cm-1 )及hu2H11之消光係數(e280 nm =208 380 M-1 cm-1 )來定量測定所獲得之結合物(2.5 ml)：在1.52 mg/ml之濃度下測定每個抗體分子平均有3.8個托馬黴素二聚體。
1.2.　3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)-2,5-二側氧基吡咯啶-1-基]丙醯基胺基} 乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯
將9.82 mg 4-{2-[甲基(2-甲基-2-巰基丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶於50 μl DMA中之溶液及6.8 mg 3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-二側氧基-2,5二氫吡咯-1-基)丙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯於50 μl DMA中之溶液添加至3.3 mg負載於樹脂上之二異丙基乙胺中(3.72 mmol/g)。在AT下將所獲得之混合物攪拌24小時，且接著使用0至10%甲醇於DCM中之梯度經由二氧化矽(Interchrom Puriflash Silica 15/35U 2G)過濾。合併包含所要產物之溶離份，在RP下濃縮，且接著藉由二氧化矽(Interchrom Puriflash Silica 15/35U 2G)上之急驟層析，使用0至10% MeOH於DCM中之梯度進行純化。合併包含所要產物之溶離份且在RP下濃縮。由此獲得1.16 mg 3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)-2,5-二側氧基吡咯啶-1-基]丙醯基胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯。LC/MS(E): rt=1.38 min;[M+H]+ : m/z 1322。
1.3.　4-{2-[甲基(2-甲基-2-巰基丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶
將40 mg參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽及36.6 mg NaHCO3 於680 μl水中之溶液添加至40 mg 4-{2-[甲基(2-甲基-2-甲基二硫烷基丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶於2.1 ml甲醇及930 μl DMF中之溶液中。將混合物在AT下攪拌45分鐘，接著在RP下濃縮，且藉由二氧化矽(Merck SuperVarioFlash 15 g管柱，Si60 15-40 μm)上之急驟層析，使用0至10% MeOH於DCM/乙腈9:1混合物中之梯度進行純化。合併包含所要產物之溶離份且在RP下濃縮。由此獲得21 mg 4-{2-[甲基(2-甲基-2-巰基丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶。LC/MS(E): rt=1.28 min;[M+H]+ : m/z 809;[M+H2 O+H]+ : m/z 827。
1.4.　4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫烷基)丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶
將19.6 μl甲磺醯氯添加至冷卻至-25℃的22 mg 4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫烷基)丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙(羥基甲基)吡啶及53 μl TEA於0.5 ml DCM中之溶液中。攪拌30分鐘後，使混合物水解且有機相以水洗滌，隨後經MgSO4 乾燥且在RP下濃縮。將由此獲得之殘餘物(22 mg)以及30 mg K2 CO3 及12 mg KI添加至20 mg托馬黴素於0.7 ml DMF中之溶液中。將混合物在30℃下攪拌2小時，且接著用4 ml水來水解。所得沈澱用水洗滌，在真空下乾燥，隨後溶於DCM中，在RP下濃縮且藉由二氧化矽(Merck SuperVarioFlash 15 g管柱，Si60 15-40 μm)上之急驟層析，使用0至5% MeOH於DCM中之梯度進行純化。合併包含所要產物之溶離份且在RP下濃縮。由此獲得8 mg 4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫烷基)丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶。1 H NMR(500 MHz,d-氯仿): 1.28(s,6 H);1.76(d,J=6.4 Hz,6 H);2.39(s,3 H);2.43(s,3 H);2.60(s,2 H);2.91(s,2 H);2.97(s,4 H);3.91(d,J=4.2 Hz,2 H);4.00(s,6 H);4.09(s,2 H);4.27(s,4 H);5.27(s,4 H);5.61(q,J=6.4 Hz,2 H);6.85(s,2 H);7.00(s,2 H);7.56(s,2 H);7.65(d,J=4.2 Hz,2 H)。LC/MS(A): rt=0.74 min;[M+H]+ : m/z 855;[M-H]- : m/z 853。
1.5.　4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫烷基)丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙(羥基甲基)吡啶
將365 μl甲酸添加至冷卻至0℃的322 mg 4-[2-(2-甲基-2-(甲基二硫烷基)丙基胺基)乙氧基]-2,6-雙(羥基甲基)吡啶於262 μl甲醛中之懸浮液中。將混合物在100℃下加熱小時。降回至環境溫度之後，使混合物水解，且接著添加5 N氫氧化鈉水溶液直至實現pH=12。水相經AcOEt萃取3次，且合併之有機相經MgSO4 乾燥並在RP下濃縮。由此獲得310 mg 4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫烷基)丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙(羥基甲基)吡啶。
1 H NMR(300 MHz,d6 -DMSO): 1.26(s,6 H);2.39(s,3 H);2.40(s,3 H);2.60(s,2 H);2.88(t,J=5.7 Hz,2 H);4.13(t,J=5.7 Hz,2 H);4.45(d,J=6.0 Hz,4 H);5.31(t,J=6.0 Hz,2 H);6.85(s,2 H)。LC/MS(A): rt=0.22 min;[M+H]+ : m/z 333;[M+HCO2H-H]- : m/z 377。
1 .6.　4-[2-(2-甲基-2-(甲基二硫烷基)丙基胺基)乙氧基]-2,6-雙(羥基甲基)吡啶
將270 μl 2-(甲基二硫基)異丁醛及730 μl異丙醇鈦添加至390 mg 4-[2-胺基乙氧基]-2,6-雙(羥基甲基)吡啶(自WO 07085930 第101頁中所述之4-(2-(第三丁氧羰基胺基)乙氧基)-2,6-雙(羥基甲基)吡啶上脫除Boc保護基之後所製備)於2 ml THF中之懸浮液中。20分鐘後，添加另外270 μl 2-(甲基二硫基)異丁醛及另外730 μl異丙醇鈦且將混合物在AT下攪拌2小時。接著添加6 ml乙醇至混合物中，將混合物在AT下攪拌20分鐘，且隨後添加124 mg氰基硼氫化鈉至混合物中。攪拌45分鐘之後，添加另外124 mg氰基硼氫化鈉，且在攪拌1小時之後，在RP下濃縮混合物且將殘餘物在AcOEt及水中稀釋。濾出所得沈澱且將其溶於1 M HCl水溶液中。所獲得之水相經5 M氫氧化鈉水溶液調至鹼性pH值，並用DCM萃取三次，且合併之有機相在RP下濃縮。由此獲得322 mg 4-[2-(2-甲基-2-(甲基二硫烷基)丙基胺基)乙氧基]-2,6-雙(羥基甲基)吡啶。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 1.26(s,6 H);1.81(寬峰m,1 H);2.39(s,3 H);2.67(寬峰s,2 H);2.94(寬峰t,J=5.7 Hz,2 H);4.11(t,J=5.7 Hz,2 H);4.45(d,J=5.5 Hz,4 H);5.32(t,J=5.5 Hz,2 H);6.85(s,2 H)。LC/MS(A): rt=0.24 min;[M+H]+ : m/z 347。
實例2 2.1.　製備結合物
如關於實例1所述，藉由使hu2H11與3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯反應來製備結合物。藉由分光光度法，使用4-{2-[甲基(2-甲基-2-巰基丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶之消光係數(e319 nm =8848 M-1 cm-1 ，e280 nm =8634M-1 cm-1 )及hu2H11之消光係數(e280 nm =208 380 M-1 cm-1 )來定量測定所獲得之結合物：測定每個抗體分子平均有5.6個托馬黴素二聚體。
2.1.　3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯
將5.5 mg碳酸N,N’-二丁二醯亞胺酯及15 μl DIPEA添加至12 mg 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸於1 ml THF及1 ml DCM中之溶液中。在AT下3小時之後，添加4 ml DCM且用水洗滌所得有機相兩次，經MgSO4 乾燥且在RP下濃縮，且藉由二氧化矽(Interchrom Puriflash Silica 15/35U 2G)上之急驟層析，使用3至8%甲醇於DCM中之梯度純化殘餘物。由此獲得8 mg 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯。LC/MS(E)：rt=1.36 min;[M+2 H2 O+Na]+ : m/z 1270;[M+H2 O+Na]+ : m/z 1252;[M+H2 O+H]+ : m/z 1229;[M+H]- : m/z 1211。
2.2.　3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸
將17.5 μl氫氧化鋰水溶液及100 μl水添加至18 mg 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯於270 μl THF中之溶液中。2小時之後，於DCM中稀釋混合物且添加磷酸鹽緩衝液至pH=3。所得水相經DCM萃取3次，合併之有機相經MgSO4 乾燥且在RP下濃縮，且藉由二氧化矽(Interchrom Puriflash Silica 15/35U 2G)上之急驟層析，使用3至15%甲醇於DCM中之梯度純化殘餘物。由此獲得11.5 mg 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸。LC/MS(D): rt=0.88 min;[M+H2 O+Na]+ : m/z 1154;[M+H2 O+H]+ : m/z 1133;[M+H]+ : m/z 1115。
2.3.　3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯
根據實例1自3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙(羥基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基]甲基胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯來製備：
LC/MS(D): rt=0.93 min;[M+H2 O+H]+ : m/z 1146;[M+H]+ :m/z 1128。
2.4.　3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙(羥基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯
將73.7 mg 3-[2-(2-{2-[2-(2-碘乙醯基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲酯於1 ml DMF及39 μl DIPEA中之溶液添加至45 mg 4-{2-[(2-巰基-2-甲基丙基)(甲基)胺基]乙氧基}-2,6-雙(羥基甲基)吡啶於1 ml DMF中之溶液中。在AT下24小時之後，在RP下濃縮混合物，且藉由二氧化矽(Analogix Super Flash SiO2 SF25-8g)上之急驟層析，使用0至10%甲醇於DCM中之梯度進行純化。由此獲得53 mg 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙(羥基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 1.21(s,6 H);2.40(s,3 H);2.50-2.56(m,4 H);2.87(t,J=5.8 Hz,2 H);3.15-3.23(m,4 H);3.40(t,J=5.8 Hz,2 H);3.47-3.52(m,12 H);3.59(s,3 H);3.62(t,J=6.2 Hz,2 H);4.13(t,J=5.8 Hz,2 H);4.45(d,J=5.8 Hz,4 H);5.31(t,J=5.8 Hz,2 H);6.85(s,2 H);7.98(t,J=5.8 Hz,1 H)。LC/MS(A): rt=0.35 min;[M+H]+ : m/z 620;[M+2H]2+ : m/z 310.5(基峰);[M-H+HCO2 H]- : m/z664。
2.5.　3-[2-(2-{2-[2-(2-碘乙醯基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲酯
將117.4 mg碘乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯於3 ml DCM中之溶液添加至100 mg 3-(2-{2-[2-(2-胺基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸中。在AT下2小時之後，添加330 μl MeOH且將混合物冷卻至0℃。添加360 μl三甲基矽烷基重氮甲烷於己烷中之2 M溶液。1小時之後，藉由添加50 μl乙酸中和混合物，且接著添加飽和NaHCO3 水溶液直至實現pH=8。有機相經MgSO4 乾燥且在RP下濃縮，且藉由二氧化矽(Interchrom Puriflash Silica 15/35U 10G)上之急驟層析，使用0至10%甲醇於DCM中之梯度純化殘餘物。由此獲得132 mg 3-[2-(2-{2-[2-(2-碘乙醯基胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲酯。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 2.54(t,J=6.4 Hz,2H);3.20(q,J=5.8 Hz,2H);3.41(t,J=5.8 Hz,2 H);3.48-3.53(m,12H);3.60(s,3H);3.63(t,J=6.4 Hz,2 H);3.65(s,2 H);8.27(寬峰t,J=5.8 Hz,1H)。LC/MS(A): rt=0.54 min;[M+H]+ : m/z 448;[M+HCO2 H-H]- : m/z 492。
2.6.　4-{2-[(2-巰基-2-甲基丙基)(甲基)胺基]乙氧基}-2,6-雙(羥基甲基)吡啶
將198 mg參(2-羧乙基)膦鹽酸鹽於730 μl水中之溶液添加至80 mg 4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫烷基)丙基)胺基]乙氧基}-2,6-雙(羥基甲基)吡啶於1.95 ml甲醇中之溶液中。在AT下2小時之後，將混合物在RP下濃縮且將殘餘物溶解於10 ml水中。藉由添加氫氧化鈉水溶液使水相達至pH=8，且接著用AcOEt萃取2次。合併之有機相經飽和NaCl水溶液洗滌且在RP下濃縮。獲得68 mg 4-{2-[(2-巰基-2-甲基丙基)(甲基)胺基]乙氧基}-2,6-雙(羥基甲基)吡啶。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 1.28(s,6H);2.43(s,3H);2.54(s,2H);2.62(s,1H);2.91(t,J=5.7 Hz,2 H);4.15(t,J=5.7 Hz,2 H);4.45(d,J=5.8 Hz,4 H);5.30(t,J=5.8 Hz,2 H);6.85(s,2 H)。LC/MS(A): rt=0.11 min;[M+H]+ : m/z 301。
實例3 3.1.　製備結合物
如關於實例1所述，藉由使hu2H11與3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]苯基-4-基)-1-甲基乙基硫烷基]乙醯基胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯反應來製備結合物。
藉由分光光度法，使用1-(1-甲基-1-(甲基二硫烷基)乙基)-3,5-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]苯之消光係數(e319 nm =8460 M-1 cm-1 且e280 nm =10 531 M-1 cm-1 )及hu2H11之消光係數(e280 nm =208 380 M-1 cm-1 )來定量測定所獲得之結合物：測定每個抗體分子平均有4.2個托馬黴素衍生物。
3.2.　3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]苯基-4-基)-1-甲基乙基硫烷基]乙醯基胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯
如關於實例2所述，自3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]苯基-4-基)-1-甲基乙基硫烷基]乙醯基胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸來製備：
LC/MS(F): rt=1.27 min;[M+H]+ : m/z 1123。
3.3.　3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]苯基-4-基)-1-甲基乙基硫烷基]乙醯基胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸
如關於實例2所述，自3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]苯基-4-基)-1-甲基-乙基硫烷基]乙醯基胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲酯來製備：
LC/MS(F): rt=1.19 min;[M+H]+ : m/z 1026。
3.4. 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]苯基-4-基)-1-甲基乙基硫烷基]乙醯基胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲酯
如關於實例2所述，自3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-雙(羥基甲基)苯基)-1-甲基乙基硫烷基]乙醯基胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲酯來製備：
LC/MS(F): rt=1.28 min;[M+H]+ : m/z 1040。
3.5. 3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-雙(羥基甲基)苯基)-1-甲基乙基硫烷基]-乙醯基胺基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲酯
如關於實例2所述，自3,5-雙(羥基甲基)-1-(1-巰基-1-甲基乙基)苯來製備：
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 1.64(s,6 H);2.53 (t,J=6.2 Hz,2 H);2.93(s,2 H);3.15(q,J=6.0 Hz,2 H);3.37(t,J=6.0 Hz,2 H);3.49(m,12 H);3.59(s,3 H);3.62(t,J=6.2 Hz,2 H);4.49(d,J=5.6 Hz,4 H);5.13(t,J=5.6 Hz,2 H);7.14(s,1 H);7.32(s,2 H);7.84(t,J=6.0 Hz,1 H)。LC/MS(B): rt=2.98 min;[M+H]+ ：m/z 532；基峰：m/z 354;[M-H+HCO2 H]- : m/z 576。
3.8. 3,5-雙(羥基甲基)-1-(1-巰基-1-甲基乙基)苯
將43 mg 5-羥基甲基-1-(1-巰基-1-甲基乙基)-3-[(第三丁基)二甲基矽烷基氧基甲基]苯於1 ml乙酸/THF/水(3/1/1)混合物中之溶液在AT下攪拌4.5小時且在RP下濃縮，接著將殘餘物溶解於3 ml水中。藉由添加10% Na2 CO3 水溶液使水相之pH值達到7，且接著用AcOEt萃取水相。有機相經MgSO4 乾燥且在RP下濃縮。由此獲得18 mg 3,5-雙(羥基甲基)-1-(1-巰基-1-甲基乙基)苯。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 1.76(s,6 H);3.19(s,1 H);4.48(d,J=5.9 Hz,4 H);5.14(t,J=5.9 Hz,2 H);7.13(s,1 H);7.36(s,2 H)。MS(C): CI:[M+NH4 ]+ : m/z 230。
3.9. 5-羥基甲基-1-(1-巰基-1-甲基乙基)-3-[(第三丁基)二甲基矽烷基氧基甲基]苯
將114 μl水合肼添加至336 mg硫乙酸1-{3-[(第三丁基)二甲基矽烷基氧基甲基]-5-(羥基甲基)苯基}-1-甲基乙酯於3.7 ml乙腈中之溶液中。在AT下3小時之後，在RP下濃縮混合物且藉由二氧化矽(Biotage 25+M)上之急驟層析，使用0至55% AcOEt於庚烷中之梯度純化殘餘物。由此獲得230 mg 5-羥基甲基-1-(1-巰基-1-甲基乙基)-3-[(第三丁基)二甲基矽烷基氧基甲基]苯。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 0.08(s,6 H);0.92(s,9 H);1.76(s,6 H);3.19(s,1H);4.48(d,J=5.7 Hz,2 H);4.71(s,2 H);5.14(t,J=5.7 Hz,1 H);7.10(s,1 H);7.33 to 7.42(m,2H)。MS(C): CI:[M+NH4 ]+ : m/z 344。
3.10. 硫乙酸1-[3-[(第三丁基)二甲基矽烷基氧基甲基]-5-(羥基甲基)苯基]-1-甲基乙酯
將404 μl硫乙酸及376 mg碘化鋅添加至1 g 1-(1-羥基-1-甲基乙基)-3,5-雙[(第三丁基)二甲基矽烷基氧基甲基]苯於4.7 ml 1,2-二氯乙烷中之溶液中。將混合物在50℃下加熱40分鐘。降回至AT後，藉由過濾移除鹽，在RP下濃縮有機相且藉由二氧化矽(Biotage 40+M)上之急驟層析，使用0至30% AcOEt於庚烷中之梯度純化殘餘物。由此獲得248 mg硫乙酸1-[3-[(第三丁基)二甲基矽烷基氧基甲基]-5-(羥基甲基)苯基]-1-甲基乙酯。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 0.08(s,6 H);0.91(s,9 H);1.79(s,6 H);2.17(s,3H);4.48(d,J=5.6 Hz,2 H);4.70(s,2 H);5.16(t,J=5.6 Hz,1 H);7.11(s,1 H);7.33(s,1 H);7.35(s,1H)。LC/MS(A): rt=1.23 min;[M+Na]+ : m/z 391。
3.11. 1-(1-羥基-1-甲基乙基)-3,5-雙[(第三丁基)二甲基矽烷基氧基甲基]苯
將10.5 ml n-BuLi於己烷中之1.6 M溶液逐滴添加至冷卻至-71℃的4.32 g 1-溴-3,5-雙[(第三丁基)二甲基矽烷基氧基甲基]苯(G.T. Crisp及P.D. Turner,Tetrahedron ,2000 ,56(42) ,8335)於150 ml THF中之溶液中。1小時30分鐘之後，逐滴添加4.27 ml丙酮。使混合物回復至AT，接著用飽和NH4 Cl水溶液水解。水相經100 ml AcOEt萃取，合併之有機相經MgSO4 乾燥並在RP下濃縮，且藉由二氧化矽(Biotage 65+M)上之急驟層析，使用0至20% AcOEt於庚烷中之梯度純化殘餘物。由此獲得2.48 g 1-(1-羥基-1-甲基乙基)-3,5-雙[(第三丁基)二甲基矽烷基氧基甲基]苯。
1 H NMR(400 MHz,d-氯仿): 0.11(s,12 H);0.96(s,18 H);1.59(s,6H);1.69(s,1 H);4.76(s,4 H);7.21(s,1 H);7.33(s,2 H)。LC/MS(B): rt=6.43 min;[M+Na]+ : m/z 447；基峰: m/z 407。
實例4 4.1.　製備結合物
如關於實例1所述，藉由使hu2H11與3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-側氧基丁基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯反應來製備結合物。藉由分光光度法，使用托馬黴素二聚體之消光係數e320 nm= 7876 M-1 cm-1 且e280 nm= 4334 M-1 cm-1 及hu2H11之消光係數e280 nm =208380 M-1 cm-1 來定量測定所獲得之結合物：測定每個抗體分子平均有3.13個托馬黴素二聚體。
4.2. 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]-吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-側氧基丁基硫烷基)乙醯基胺基]-乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯：
根據實例2，自3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-側氧基丁基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸來製備
LC/MS(B): rt=3.27 min;[M+H]+ : m/z 1309;[M+2H]2+ : m/z 655。
4.3. 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-側氧基丁基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸
根據實例2，自3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-側氧基丁基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯來製備
LC/MS(B): rt=3.16 min;[M+H]+ : m/z 1212;[M+2H]2+ : m/z 606。
4.4. 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基]-哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-側氧基丁基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]-乙氧基}丙酸甲酯
根據實例2，自3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-雙(羥基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-側氧基丁基硫烷基)-乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯來製備
1 H NMR(500 MHz,d6 -DMSO): 1.22(s,6 H);1.69(m,8 H);2.37(m,2 H);2.40(m,2 H);2.48(m,2 H);2.53(t,J =6.1 Hz,2 H);2.72(m,2 H);2.92(m,2 H);3.04(m,2 H);3.11(s,2 H);3.19(q,J =5.4 Hz,2 H);3.39(t,J =5.4 Hz,2 H);3.42(m,4 H);3.49(m,12 H);3.59(s,3 H);3.62(t,J =6.1 Hz,2 H);3.86(s,6 H);3.88(m,2 H);4.10(m,4 H);4.22(m,2 H);5.17(d,J =13.0 Hz,2 H);5.22(d,J =13.0 Hz,2 H);5.55(m,2 H);6.94(s,2 H);7.09(s,2 H);7.38(s,2 H);7.77(d,J =3.9 Hz,2 H);8.01(t,J =5.4 Hz,1 H)。LC/MS(B): rt=3.30 min;[M+H]+ : m/z 1225;[M+2H]2+ : m/z 613(基峰)。
4.5. 3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-雙(羥基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-側氧基丁基硫烷基)乙醯基胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯
根據實例2，自4-(2-[4-(4-巰基-4-甲基戊醯基)哌嗪-1-基]乙氧基)-2,6-雙(羥基甲基)吡啶來製備
1 H NMR(500MHz ,d6 -DMSO)：所有信號皆為寬峰：1.22(s,6 H);1.71(m,2 H);2.20-2.58(經部分遮蔽之m,8 H);2.75(m,2 H);3.12(m,2 H);3.19(m,2 H);3.47-3.53(m,18 H);3.60(m,5 H);4.18(m,2 H);4.46(m,4 H);5.31(m,2 H);6.86(s,2 H);8.00(m,1 H)。LC/MS(B): rt=2.20 min;[M+H]+ : m/z 717;[M-H+HCO2 H]- : m/z 761。
4.6. 4-(2-[4-(4-巰基-4-甲基戊醯基)哌嗪-1-基]乙氧基)-2,6-雙(羥基甲基)吡啶
根據實例2，自4-(2-[4-(4-甲基-4-(甲基二硫烷基)戊醯基)哌嗪-1-基]乙氧基)-2,6-雙(羥基甲基)吡啶來製備
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 1.32(s,6 H);1.76(m,2 H);2.36-2.53(經部分遮蔽之m,6 H);2.66(s,1 H);2.75(t,J =5.5 Hz,2 H);3.40-3.52(m,4 H);4.18(t,J =5.5 Hz,2 H);4.46(s,4 H);5.30(極寬峰m,2 H);6.86(s,2 H)。LC/MS(B): rt=0.76 min;[M+H]+ : m/z 398;[M-H]- : m/z 396。
4.7. 4-(2-[4-(4-甲基-4-(甲基二硫烷基)戊醯基)哌嗪-1-基]乙氧基)-2,6-雙(羥基甲基)吡啶
向600 mg 4-[2-(哌嗪-1-基)乙氧基]-2,6-雙(羥基甲基)吡啶於12 ml DMF中之溶液中添加344 μL TEA且接著在攪拌10分鐘後，添加748 mg 4-甲基-4-(甲基二硫烷基)戊酸、417 μl二異丙基碳化二亞胺及69 mg 1-羥基苯并三唑水合物。在AT下15小時之後，在RP下濃縮混合物，添加15 ml水，且用AcOEt進行2次萃取。合併之有機相經MgSO4 乾燥且在RP下濃縮，且藉由二氧化矽(Analogix Super Flash SiO2 SF25-80g)上之急驟層析，使用2至10% MeOH於DCM中之梯度純化殘餘物。由此獲得390 mg 4-(2-[4-(4-甲基-4-(甲基二硫烷基)戊醯基)哌嗪-1-基]乙氧基)-2,6-雙(羥基甲基)吡啶。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 1.26(s,6 H);1.79(m,2 H);2.36(m,2 H);2.39(s,3 H);2.40-253(經部分遮蔽之m,4 H);2.75(t,J=5.6 Hz,2 H);3.45(m,4 H);4.18(t,J=5.6 Hz,2 H);4.46(d,J=5.9 Hz,4 H);5.30(t,J=5.9 Hz,2 H);6.86(s,2 H)。LC/MS(A): rt=0.42 min;[M+H]+ : m/z 444;[M-H+HCO2 H]- : m/z 488。
4.8. 4-[2-(哌嗪-1-基)乙氧基]-2,6-雙(羥基甲基)吡啶
將19 ml HCl於二噁烷中之4 M溶液添加至2.3 g 4-(2-(4-(第三丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基)-2,6-雙(羥基甲基)吡啶於33 ml二噁烷中之溶液中。在AT下12小時之後，藉由在燒結玻璃漏斗上過濾回收所得沈澱，將其溶解於MeOH中，且接著在RP下濃縮，且在40 ml MeOH/水之1/1混合物中稀釋殘餘物。將所得溶液沈積於Mega BE-SCX,25 GM 150 ML(Varian)上。用MeOH洗滌該相之後，以2 N氨之甲醇溶液溶離所關注之產物。在RP下濃縮MeOH/NH3 相。由此獲得1.6 g 4-[2-(哌嗪-1-基)乙氧基]-2,6-雙(羥基甲基)吡啶。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 2.40(m,4 H);2.68(m,6 H);4.15(t,J=5.7 Hz,2H);4.44(m,4 H);5.29(m,2 H);6.85(s,2 H)。LC/MS(A): rt=0.10 min;[M+H]+ : m/z 268;[M+2H]2+ : m/z 134.5；基峰：m/z 113。
4.9. 4-(2-(4-(第三丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基)-2,6-雙(羥基甲基)吡啶
將779 mg硼氫化鈉及2.29 g CaCl2 添加至3.1 g 4-[2-(4-(第三丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基]吡啶-2,6-二甲酸二乙酯於105 ml EtOH中之溶液中。在AT下3小時之後，將混合物水解且在RP下濃縮。添加水至所獲得之殘餘物中，且所得水相經AcOEt萃取4次。合併之有機相經飽和NaCl水溶液洗滌，且隨後在RP下濃縮。由此獲得2.4 g 4-(2-(4-(第三丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基)-2,6-雙(羥基甲基)吡啶。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 1.39(s,9 H);2.43(m,4 H);2.73(t,J=5.6 Hz,2 H);3.30(經部分遮蔽之m,4 H);4.17(t,J=5,6 Hz,2 H);4.45(d,J=5.9 Hz,4 H);5.30(t,J=5.9 Hz,2H);6.86(s,2 H)。LC/MS(A): rt=0.24 min;[M+H]+ : m/z 368。
4.10. 4-[2-(4-(第三丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基]吡啶- 2,6-二甲酸二乙酯
向冷卻至0℃的5 g 1-(第三丁氧基羰基)-4-(2-羥基乙基)哌嗪於102 ml DCM中之溶液中添加4.5 ml TEA，且接著添加2 ml甲磺醯氯。1小時之後，使混合物回復至AT。再攪拌1小時之後，混合物經水解且有機相以水洗滌2次，接著經MgSO4 乾燥且在RP下濃縮。向所得殘餘物(6.7 g)中添加140 ml DMF，且使混合物達到60℃。隨後添加190 mg白屈胺酸之二乙酯(Scrimin P.,Tecilla P.,Tonellato U.及Vendrame T.J.,Org. Chem.,1989 ,54 ,5988)及549 mg K2 CO3 ，且將混合物加熱至80℃歷時20小時。混合物在RP下濃縮之後經水解且以AcOEt萃取3次，合併之有機相以飽和NaCl溶液洗滌且在RP下濃縮，且藉由二氧化矽(Analogix Super Flash SiO2 SF25-150g)上之急驟層析，使用60至85% AcOEt於庚烷中之梯度純化殘餘物。由此獲得3.1 g 4-[2-(4-(第三丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基]吡啶-2,6-二甲酸二乙酯。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 1.34(t,J=7.2 Hz,6 H);1.39(s,9 H);2.44(m,4 H);2.76(t,J=5.7 Hz,2 H);3.30(經部分遮蔽之m,4 H);4.34(t,J=5.7 Hz,2 H);4.38(q,J=7.1 Hz,4 H);7.74(s,2 H)。LC/MS(B): rt=2.81 min;[M+H]+ : m/z 452;[MH+HCO2 H]- : m/z 496。
實例5 5.1. 4-{2-[4-(2-甲基-2-(甲基二硫烷基)丙基)哌嗪-1-基]乙氧基}-2,6-雙(羥基甲基)吡啶
根據實例1，自4-[2-(哌嗪-1-基)乙氧基]-2,6-雙(羥基甲基)吡啶來製備。
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 1.25(s,6 H);2.39(s,3 H);2.40(s,2 H);2.44-2.57(經部分遮蔽之m,8 H);2.69(t,J=5.7 Hz,2 H);4.14(t,J=5.7 Hz,2 H);4.45(d,J=5.7 Hz,4 H);5.29(t,J=5.7 Hz,2 H);6.85(s,2 H)。LC/MS(B): rt=0.51 min;[M+H]+ : m/z 402。
實例6 6.1.　製備結合物
如關於實例1所述，藉由使hu2H11與3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基(甲基)胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯反應來製備結合物。藉由分光光度法，使用托馬黴素二聚體之消光係數e319 nm= 7789 M-1 cm-1 且e280 nm= 4362 M-1 cm-1 及hu2H11之消光係數e280 nm =208 380 M-1 cm-1 來定量測定所獲得之結合物：測定每個抗體分子平均有2.90個托馬黴素二聚體。
6.2. 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基(甲基)胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸N-羥基丁二醯亞胺酯
根據實例2，自3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基(甲基)胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸來製備：
LC/MS(F): rt=1.02 min;[M+H]+ : m/z 1225;[M+H2 O+H]+ : m/z 1243。
6.3. 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基(甲基)胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸
根據實例2，自3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基(甲基)胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯來製備：
LC/MS(F): rt=0.97 min;[M+H]+ : m/z 1129。
6.4. 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙[(S)-2-亞-(E)-乙基-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氫吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基(甲基)胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯
根據實例2，自3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙(羥基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基(甲基)胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯來製備：
1 H NMR(500 MHz,d6 -DMSO)：以下吸收峰為寬峰：1.20(s,6 H);1.58-1.73(m,6 H);2.38(s,3 H);2.52-3.07(m,13 H);3.36-3.63(m,23 H);3.67-3.91(m,8 H);4.06-4.26(m,6 H);5.02-5.26(m,4 H);5.33-5.60(m,2 H);6.39-7.42(m,6 H);7.76(m,2 H)。
LC/MS(A): rt=0.77 min;[M+H]+ : m/z 1142;[M+2H]2+ : m/z 571.5(基峰)。
6.5. 3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-雙(羥基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)胺基}-1,1-二甲基乙基硫烷基)乙醯基(甲基)胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯：
根據實例2，自3-{2-[2-(2-{2-[(2-碘乙醯基)(甲基)胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯來製備：
1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 50/50解析度之旋轉異構體：1.22(s,3H);1.24(s,3 H);2.41(s,3 H);2.53(t,J=6.2 Hz,2 H);2.56(m,2 H);2.80(s,1 H);2.88(t,J=5.9 Hz,2 H);3.05(s,2 H);3.35-3.58(m,18 H);3.59(s,3 H);3.62(t,J=6.2 Hz,2 H);4.13(t,J=5.9 Hz,2 H);4.45(d,J=5.9 Hz,4 H);5.29(t,J=5.9 Hz,2 H);6.85(s,2 H)。LC/MS(B): rt=2.18 min;[M+H]+ : m/z 634;[M-H+HCO2 H]- : m/z 678。
6.6. 3-{2-[2-(2-{2-[(2-碘乙醯基)(甲基)胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯
將117.4 mg碘乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯於6.5 ml DCM中之溶液添加至215 mg 3-(2-{2-[2-(2-(甲基胺基)乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲酯中。在AT下2小時之後，在RP下濃縮混合物，且藉由二氧化矽(Analogix Super Flash SiO2 SF25-24g)上之急驟層析，使用0至6% MeOH於DCM中之梯度純化殘餘物。由此獲得210 mg 3-{2-[2-(2-{2-[(2-碘乙醯基)(甲基)胺基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲酯。1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 55/45解析度之旋轉異構體：2.54(t,J=6.2 Hz,2 H);2.83(s,1.35 H);3.02(s,1.65 H);3.36-3.55(m,16 H);3.60(s,3 H);3.63(t,J=6.2 Hz,2 H);3.83(s,1.1 H);3.88(s,0.9 H)。LC/MS(A): rt=0.62 min;[M+H]+ : m/z 462。
6.7. 3-(2-{2-[2-(2-(甲基胺基)乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲酯
將3 ml HCl於二噁烷中之4 M溶液添加至390 mg 3-[2-(2-{2-[2-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲酯於5.3 ml二噁烷中之溶液中。在AT下12小時之後，在RP下濃縮混合物，且將殘餘物溶於最少量之甲醇中，且沈積於Mega BE-SCX,10GM 60ML(Varian)上。用MeOH洗滌該相之後，以2 N氨之甲醇溶液溶離所關注之產物。在RP下濃縮甲醇/NH3 相。由此獲得270 mg 3-(2-{2-[2-(2-(甲基胺基)乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲酯。1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 2.28(s,3 H);2.54(t,J=6.2 Hz,2 H);2.59(t,J=5.9 Hz,2 H);3.44(t,J=5.9 Hz,2 H);3.47 to 3.54(m,12 H);3.60(s,3 H);3.63(t,J=6.2 Hz,2 H)。LC/MS(A)(ELSD): rt=0.30 min;[M+H]+ : m/z 294。
6.8. 3-[2-(2-{2-[2-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲酯
將2 ml三甲基矽烷基重氮甲烷於己烷中之2 M溶液添加至冷卻至0℃的500 mg 3-[2-(2-{2-[2-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸於4.8 ml MeOH中之溶液中。2小時之後，藉由添加120 μl乙酸中和混合物，且接著在RP下濃縮，且藉由二氧化矽(Analogix Super Flash SiO2 SF25-40g)上之急驟層析，使用0至5%甲醇於DCM中之梯度純化殘餘物。由此獲得400 mg 3-[2-(2-{2-[2-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲酯。1 H NMR(400 MHz,d6 -DMSO): 1.38(s,9 H);2.54(t,J=6.2 Hz,2 H);2.80(寬峰s,3 H);3.29(經部分遮蔽之t,J =5.9 Hz,2 H);3.45-3.55(m,14 H);3.59(s,3 H);3.63(t,J=6.2 Hz,2 H)。LC/MS(A): rt=0.84 min;[M+Na]+ : m/z 416(基峰);LC/MS(A): rt=0.84 min;[M+Na]+ : m/z 416(基峰)。
6.9. 3-[2-(2-{2-[2-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸
將85.4 mg NaH逐份添加至冷卻至0℃的520 mg 3-[2-(2-{2-[2-((第三丁氧基羰基)胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸於14 ml THF中之溶液中。攪拌5分鐘之後，添加150 μl碘甲烷。接著在AT下攪拌混合物2小時，且隨後另外添加150 μl碘甲烷。在AT下12小時後，混合物經水解，且接著藉由在0℃下添加乙酸水溶液使其達到酸性pH值。水相經AcOEt萃取3次，合併之有機相經MgSO4 乾燥並在RP下濃縮，且所獲得之粗產物與85 mg NaH及176 μl碘甲烷再次根據相同方案反應另外2小時。由此獲得500 mg 3-[2-(2-{2-[2-((第三丁氧基羰基)(甲基)胺基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸。LC/MS(F): rt=1.01 min;[M+H]+ : m/z 380。
評估式(IA)化合物(其中Z b R b =-OMe且Y=Y’=-OMe)對MDA-MB-231、MDA-A1及HCT116細胞株增殖的抑制作用
以胰蛋白酶處理呈指數級生長相之MDA-MB-231、MDA-A1或HCT116細胞，且再懸浮於其各別培養基中(對於MDA細胞，DMEM/F12 Gibco #21331,10% FCS Gibco #10500-056,2 nM麩醯胺酸Gibco #25030；對於HCT116細胞，DMEM Gibco #11960,10% FCS Gibco #10500-056,2 mM麩醯胺酸Gibco #25030)。將細胞懸浮液以5000個細胞/孔(MDA-MB-231、MDA-A1、HCT116)之密度接種於Cytostar 96-孔培養盤(GE Healthcare Europe,#RPNQ0163)中的含有血清之完全培養基中。培育4小時之後，將托馬黴素二聚體之連續稀釋液添加至各孔中，每種濃度一式三份。在細胞毒性劑存在下，在含有5% CO2 之氛圍下，於37℃下培養細胞3天。在第4天，將10 μl14 C-胸苷溶液(0.1 μCi/孔,Perkin Elmer #NEC56825000)添加至各孔中。使用MicroBeta放射性計數器(Perkin Elmer)在實驗開始之後96小時量測14 C-胸苷之併入。藉由測定經細胞毒性劑處理之細胞所獲得之計數與對照孔之細胞(僅用培養基處理)所獲得之計數之間的比率，以存活%之形式表示數據。
已發現Zb Rb =-OMe之測試化合物的抗癌活性強大；此令人推測特徵在於另一Zb Rb 基團之類似化合物傾向於展示相同活性。
評估hu2H11-細胞毒性劑結合物對MDA-MB-231細胞株增殖之抑制作用
以胰蛋白酶處理呈指數級生長相之MDA-MB-231細胞，且再懸浮於其培養基(DMEM/F12 Gibco #21331,10% FCS Gibco #10500-056,2 nM麩醯胺酸Gibco #25030)中。將細胞懸浮液以5000個細胞/孔之密度接種於Cytostar 96-孔培養盤(GE Healthcare Europe,#RPNQ0163)中的含有血清之完全培養基中。培育4小時之後，將抗體-細胞毒性劑免疫結合物之連續稀釋液以自10-7 降至10-12 M之濃度添加至各孔中(每種濃度一式三份)。在抗體-細胞毒性劑免疫結合物存在下，在含有5% CO2 之氛圍下，於37℃下培養細胞3天。在第4天，將10 μl14 C-胸苷溶液(0.1 μCi/孔,Perkin Elmer #NEC56825000)添加至各孔中。使用MicroBeta放射性計數器(Perkin Elmer)在實驗開始之後96小時量測14 C-胸苷之併入。藉由測定經免疫結合物處理之細胞所獲得之計數與對照孔之細胞(僅用培養基處理)所獲得之計數之間的比率，以存活%之形式表示數據。在某些實驗*中，在實驗開始時將裸抗體hu2H11以1 μM之濃度添加至各孔中，且如上所述量測對增殖之抑制作用。
不可斷裂之托馬黴素二聚體結合物之單體穩定性
用國際申請案WO 09016516 之實例3及5中所述之托馬黴素二聚體製備的不可斷裂之hu2H11結合物具有以下傾向：在3-5℃下儲存數月之後其單體純度隨時間降低。特別地，在pH 6.5且含有10%蔗糖及5% NMP的組胺酸濃度為10 mM之含水緩衝液中調配的此等結合物展示每個抗體分子平均有3至3.5個托馬黴素二聚體，其初始單體純度為約97.5%，在6至8個月中單體純度可降低6至15%。未觀察到實例3之結合物有此現象，該結合物每個抗體分子平均具有3.5個托馬黴素二聚體，在相同儲存條件下4個月中保持大於99%之單體純度，由此提示此特定結合物有較佳穩定性。在結合物領域中所期望之一般目標為能夠獲得隨時間變化而保持單體純度之結合物。
評估hu2H11-細胞毒性劑結合物對於具有晚期人類乳腺癌MDA-MB-231之雌性SCID小鼠的抗腫瘤活性
針對皮下移植於雌性SCID小鼠上的可量測乳腺腫瘤MDA-MB-231評估4種劑量的表示為C1(用國際申請案WO 09016516 之實例5中所述之托馬黴素二聚體製備)及C2(實例3之結合物)的相同抗體hu2H11之兩種結合物。對照組未經處理。兩種結合物之劑量係以托馬黴素二聚體(μg)/kg給出。其係對於C1在第13天且對於C2在第24天以80、40、20及10 μg/kg藉由快速式靜脈內注射(IV)來投與。
關於評估結合物之抗腫瘤活性，每日稱重動物且使用卡尺每週兩次量測腫瘤。在最大耐受劑量(MTD)下評估抗腫瘤活性。造成體重最少減輕20%或造成10%(或10%以上)死亡率的與結合物有關之劑量被視為有毒的。動物體重包括腫瘤重量。腫瘤重量係根據下式計算：重量(mg)=[長度(mm)×寬度(mm)2 ]/2。功效參數為消退之平均百分比ΔT/ΔC、部分及完全消退(PR及CR)及研究結束時無腫瘤小鼠之數目(TFM)。
對各腫瘤藉由以下方法來計算各經處理小鼠(T)及對照組小鼠(C)之腫瘤體積變化：在研究開始之日的腫瘤體積減去指定觀察日之腫瘤體積。對於經處理組計算平均ΔT，且對於對照組計算平均ΔC。隨後計算比率ΔT/ΔC，且表示為百分數：ΔT/ΔC=(δT/δC)×100。
ΔT/ ΔC 小於40%之劑量被認為具有治療活性且ΔT/ ΔC 小於10%之劑量被認為極有活性。當ΔT/ ΔC 小於0時，該劑量被認為具有高度活性且隨後計算消退百分數(根據Plowman J.,Dykes D.J.,Hollingshead M.,Simpson-Herren L.及Alley M.C.,Human tumor xenograft models in NCI drug development: Feibig H.H. BA,編輯。Basel: Karger.; 1999 ，第101-125頁)。
腫瘤消退百分數 係定義為在指定觀察日經處理組中腫瘤體積相較於治療第一天其之體積減小的百分數。在指定時間t及對於每一動物計算腫瘤消退百分數。隨後計算該組之平均消退百分數。
部分消退(PR)： 當腫瘤體積減小達到處理開始之時的腫瘤體積之50%時，此種消退係定義為部分消退。
完全消退(CR)： 當腫瘤體積=0 mm3 時獲得完全消退(當腫瘤體積不可量測時，認為存在CR)。
TFM： 無腫瘤小鼠係定義為在研究結束時(處理超過100天)不展示可偵測之腫瘤的小鼠。
縮寫：MTD=最大耐受劑量，TFM=研究結束時之無腫瘤小鼠
根據單劑量投藥方案，經證實在此研究中此等兩種結合物之最高測試劑量(80 μg/kg)有毒，造成體重減輕及死亡。
在MTD(40 μg/kg)下，C1極具活性且造成體重最少減輕9.6%，△T/△C為7%且造成5個SCID小鼠中有3個PR。在20及10 μg/kg之較低劑量下亦觀察到抗腫瘤活性而不造成PR。
在MTD(40 μg/kg)下，C2具有高度活性且造成體重最少減輕5%，且腫瘤消退為96.2%，同時6個小鼠中有6個PR，包括1個TFM。其在20 μg/kg之較低劑量下亦極具活性，且腫瘤消退為66.4%，且6個小鼠中有4個PR。然而，在10 μg/kg之最低劑量下亦觀察到抗腫瘤活性而不造成消退或PR。
總之，發現C2展示強抗癌活性，且在MTD下顯示出在腫瘤消退、PR及TFM(在相同劑量下對於C1未觀察到此等現象)方面比C1更佳之活性。
圖1 ：實例1之結合物在去糖基化之後的高解析度質譜；
圖2 ：實例2之結合物在去糖基化之後的高解析度質譜；
圖3 ：實例3之結合物在去糖基化之後的高解析度質譜；
圖4 ：實例4之結合物在去糖基化之後的高解析度質譜；及
圖5 ：實例6之非去糖基化結合物的高解析度質譜。
此等圖示在解迴旋(deconvolution)之後顯示，各結合物攜帶0至8個托馬黴素(tomaymycin)二聚體之實體的分佈(D0 ：無二聚體；Dx ：x個二聚體)。
(無元件符號說明)

Claims (47)

  1. 一種式(I)化合物， 其中：表示單鍵或雙鍵，其條件為若表示單鍵，則：----表示單鍵；相同或不同之U及/或U'相互獨立地表示H；相同或不同之W及/或W'相互獨立地表示：OH、-OR、-OCOR、-COOR、-OCOOR、-OCONRR'、N10與C11包括於一環中之環狀胺基甲酸酯基、-NRCONRR'、-OCSNHR、N10與C11包括於一環中之環狀硫代胺基甲酸酯基、-SH、-SR、-SOR、-SOOR、-SO3 - 、-NRSOOR'、-NRR'、N10與C11包括於一環中之環狀胺、-NROR'、-NRCOR'、-N3 、-CN、Hal或三烷基鏻基或三芳基鏻基；相同或不同之R1 、R2 、R1 '及R2 '相互獨立地表示：H、Hal或視情況經一或多個選自以下之取代基取代之(C1 -C6 )烷基：Hal、CN、NRR'、CF3 、OR、芳基或雜芳基，或S(O)q R，其中q=0、1或2；或者R1 與R2 及/或R1 '與R2 '分別一起形成雙鍵=CH2 或=CH- CH3 ；相同或不同之Y及Y'相互獨立地表示H或OR；M表示CH或N；相同或不同之ALK及ALK'相互獨立地表示(C1 -C6 )伸烷基；R及R'相互獨立地表示H或視情況經一或多個選自以下之取代基取代之(C1 -C6 )烷基或芳基：Hal、CN、NRR'、CF3 、OR或芳基或雜芳基；L表示：- L1 -L2 -基團，其中L1 經由該ALK或OALK基團連接至包含M之芳環，且表示以下基團之一：- ALK-S- -O-ALK-NR3 -ALK-S- 且L2 表示經由-CH2 C(=O)-連接至L1 之-CH2 C(=O)-NR3 -(CH2 CH2 O)i -ALK-基團；或者經由該OALK基團連接至該包含M之芳環的-O-ALK-NR3 -ALK-S-(CH2 CH2 O)i -ALK-基團； R3 表示H或(C1 -C6 )烷基；i表示在1至40範圍內之整數；Zb 表示單鍵、-O-或-NH-，且Rb 表示H或(C1 -C6 )烷基、(C3 -C7 )環烷基、芳基、雜芳基或(C3 -C7 )雜環烷基，或者Zb 表示單鍵且Rb 表示Hal。
  2. 如請求項1之化合物，其中i表示在1至20範圍內之整數。
  3. 如請求項1之化合物，其中i表示在1至10範圍內之整數。
  4. 如請求項1之化合物，其具有下式
  5. 如請求項1之化合物，其具有式(IA)或(IB)
  6. 如請求項1至5中任一項之化合物，其中Y及Y'表示(C1 -C4 )烷氧基。
  7. 如請求項6之化合物，其中該(C1 -C4 )烷氧基為甲氧基。
  8. 如請求項1至5中任一項之化合物，其中L係選自：-ALK-S-CH2 C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)i -CH2 CH2 - -O-ALK-NR3 -ALK-S-CH2 C(=O)-NH-(CH2 CH2 O)i -CH2 CH2 ；-O-ALK-NR3 -ALK-S-(CH2 CH2 O)i -CH2 CH2 -。
  9. 如請求項1至5中任一項之化合物，其中L係選自：
  10. 如請求項1至5中任一項之化合物，其中L係選自：
  11. 如請求項1至5中任一項之化合物，其中-COZb Rb 表示-COOH、-COO(C1 -C6 )烷基、-COOCH3 、-COOCH2 CH=CH2 、基團，其中IG表示至少一個誘導基。
  12. 如請求項11之化合物，其中該至少一個誘導基為或
  13. 如請求項1之化合物，其係選自以下之一：
  14. 一種製備結合物之方法，其包括：(i)使視情況經緩衝之結合劑水溶液與如請求項1至13中任一項所定義之化合物之溶液接觸並反應；(ii)且隨後視情況將步驟(i)中形成之結合物與未反應之式(I)化合物及/或結合劑及/或與可能形成之聚集體分離。
  15. 如請求項14之方法，其中該-C(=O)Zb Rb 基團對於該結合劑上存在之化學基團具有反應性，以便藉由形成共價鍵而確保該式(I)化合物與該結合劑之連接。
  16. 如請求項15之方法，其中該結合劑上存在之化學基團為抗體上存在之胺基。
  17. 如請求項14至16中任一項之方法，其中步驟(ii)包括：將步驟(i)中形成之該結合物與未反應之結合劑及溶液中可能存在之聚集體分離；或者僅將步驟(i)之該結合物與未反應之式(I)化合物以及可能形成之聚集體分離，且使可能未反應之結合劑留在該溶液中。
  18. 如請求項14至16中任一項之方法，其中該結合劑為配位體、蛋白質或抗體。
  19. 如請求項14至16中任一項之方法，其中該結合劑為單株抗體、蛋白質或抗體片段、肽、寡核苷酸或寡醣。
  20. 如請求項14至16中任一項之方法，其中該反應在20℃與40℃之間的溫度下進行，及/或該反應之持續時間在1小時與24小時之間變化。
  21. 如請求項14至16中任一項之方法，其中在步驟(i)或(ii)之後，使該結合物之溶液經歷步驟(iii)之超濾及/或透析過濾。
  22. 一種能夠藉由如請求項14至21中任一項之方法獲得之結合物。
  23. 如請求項22之結合物，其中該結合劑為抗體，其特徵在於平均DAR介於1與10之間，該DAR係藉由方程式DAR=cD /cA 來計算其中：cD =[(eA LO1 ×ALO2 )-(eA LO2 ×ALO1 )]/[(eD LO2 ×eA LO1 )-(eA LO2 ×eD LO1 )] cA =[ALO1 -(cD ×eD LO1 )]/eA LO1 ALO1 及ALO2 表示該結合物之水溶液在波長LO1及LO2處之吸光度，根據SEC光譜之相應峰來量測，eD LO1 及eD LO2 分別表示結合之前在該兩個波長LO1及LO2下吡咯并[1,4]苯并二氮呯二聚體之莫耳吸光係數；eA LO1 及eA LO2 分別表示在該兩個波長LO1及LO2下裸抗體之莫耳吸光係數， LO1=280nm且LO2=320nm。
  24. 如請求項23之結合物，其中該抗體為單株抗體。
  25. 如請求項23或24之結合物，其中該平均DAR係介於1.5與7之間。
  26. 一種如請求項1至13中任一項之化合物之用途，其係用於製備與下式之二聚體在M之對位共價連接之結合劑：
  27. 如請求項26之用途，其中該結合劑為抗體。
  28. 如請求項27之用途，其中該抗體為單株抗體。
  29. 如請求項26至28中任一項之用途，其中該二聚體具有下式：
  30. 如請求項26至28中任一項之用途，其中Y及Y'表示(C1 -C4 )烷氧基。
  31. 如請求項30之用途，其中(C1 -C4 )烷氧基為甲氧基。
  32. 一種結合劑，其在與如請求項1至13中任一項所定義之化合物反應後與下式之二聚體在M之對位共價連接：
  33. 如請求項32之結合劑，其中該二聚體係如請求項29至31中任一項所定義。
  34. 如請求項33之結合劑，其對於位於與腫瘤有關之癌細胞或基質細胞上之抗原或抗原群組具有親和力。
  35. 如請求項32至34中任一項之結合劑，其為抗體。
  36. 如請求項35之結合劑，其中該抗體為單株抗體。
  37. 一種能夠藉由如請求項14至21中任一項之方法獲得之結合物的溶液。
  38. 如請求項1至5與13中任一項之化合物，其用作抗癌劑。
  39. 如請求項22或23之結合物，其用作抗癌劑。
  40. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至13中任一項之化合物或如請求項22或請求項23之結合物，及至少一種賦形劑。
  41. 一種式P2 化合物 或下式化合物之用途： 其中L*係選自： -ALK-SH；-O-ALK-NR3 -ALK-SH； 在該等式子中：L、M、ALK、ALK'、R3 、Zb 及Rb 係如請求項1至13中任一項所定義；E及E'相互獨立地表示-OH基或離去基；其在製備如請求項1至13中任一項所定義之式(I)化合物時用作中間體。
  42. 如請求項41之用途，其中該離去基係選自鹵素原子或甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基、硝基苯磺酸酯基或-OPPh3 + 基。
  43. 一種化合物之用途，該化合物係選自以下之一： 應瞭解-COOH末端官能基可經-COO(C1 -C6 )烷基末端官能基置換，且-SH末端官能基可經二硫化物官能基置換，該化合物在製備如請求項1至13中任一項所定義之式(I)化合物時用作中間體。
  44. 如請求項43之用途，其中該-COO(C1 -C6 )烷基末端官能基為-COOMe末端官能基。
  45. 如請求項43或44之用途，其中二硫化物官能基為-SSMe官能基。
  46. 一種如請求項1至13中任一項之化合物之用途，其用於 製造抗癌劑。
  47. 一種如請求項22或23之結合物之用途，其用於製造抗癌劑。
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