TWI387602B - 與上皮生長因子受體（ｅｇｆｒ）結合之抗原結合分子，編碼該抗原結合分子之載體及其用途 - Google Patents

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Description

與上皮生長因子受體(EGFR)結合之抗原結合分子，編碼該抗原結合分子之載體及其用途
本發明係關於抗原結合分子(ABM)。在特別實施例中，本發明係關於對於人類上皮生長因子受體(EGFR)具有特異性之包括嵌合抗體、靈長類化或人化抗體之重組單株抗體。另外，本發明係關於編碼此等ABM之核酸分子，及包含此等核酸分子之載體及宿主細胞。本發明進一步係關於產生本發明之ABM之方法，且係關於在治療疾病中使用此等ABM之方法。另外，本發明係關於具有經改良治療性質之具有經修飾糖基化之ABM，其包括具有增加Fc受體結合及增加效應功能之抗體。
 EGFR與抗－EGFR抗體
人類上皮生長因子受體(亦稱為HER－1或Erb－B1，且在本文稱作"EGFR")係藉由c－erbB原致癌基因編碼之170 kDa跨膜受體，且展現固有酪胺酸激酶活性(Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996)；Herbst及Shin，Cancer 94：1593－1611(2002))。SwissProt資料庫輸入P00533提供EGFR之序列。亦存在EGFR之同功異型物及變異體(例如，替代性RNA轉錄物、截斷型式、多態現象等)，包括(但不限於)藉由Swissprot資料庫輸入號P00533－1、P00533－2、P00533－3及P00533－4鑑定之彼等同功異型物及變異體。已知EGFR為結合配位體，其包括上皮生長因子(EGF)、轉化生長因子－α(TGf－α)、雙調蛋白、肝素結合－EGF(hb－EGF)、β－纖維素及上皮調節素(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002)；Mendelsohn及Baselga,Oncogene 19 ：6550－6565(2000))。EGFR經由酪胺酸激酶介導之訊號轉導途徑調節眾多細胞過程，該等細胞過程包括(但不限於)活化控制細胞增殖、分化、細胞存活、凋亡、血管生成、有絲分裂發生及新陳代謝之訊號轉導途徑(Atalay等人，Ann.Oncology 14：1346－1363(2003)；Tsao及Herbst,Signal 4：4－9(2003)；Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002)；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996))。
已報告EGFR過度表現於眾多人類惡性病症(包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌及腎癌)中(Atalay等人，Ann.Oncology 14：1346－1363(2003)；Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002)；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996))。在許多此等病症中，EGFR之過度表現與病患之較差預後相關或關聯(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002)；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996))。EGFR亦在正常組織之細胞中表現，特別在皮膚、肝臟及胃腸道之上皮組織，儘管其通常以比在惡性細胞中之表現更低之水平表現(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。
非共軛單株抗體(mAb)可係治療癌症之有用藥物，如U.S.Food and Drug Administration核准之如下藥物所證明：用於治療晚期乳癌的曲妥珠單抗(Trastuzumab)(HerceptinT M ；Genentech Inc,)(Grillo－Lopez,A.－J.等人，Semin.Oncol.26 ：66－73(1999)；Goldenberg,M.M.,Clin.Ther.21 ：309－18(1999))、用於治療CD20陽性B細胞低度或濾泡性非霍奇金淋巴瘤(Non－Hodgkin's lymphoma)之利妥昔單抗(Rituximab)(RituxanT M ；IDEC Pharmaceuticals,San Diego,CA及Genentech Inc.,San Francisco,CA)、用於治療復發急性骨髓性白血病之吉妥單抗(Gemtuzumab)(MylotargT M ,Celltech/Wyeth－Ayerst)、及用於治療B細胞慢性淋巴細胞性白血病之阿來組單抗(Alemtuzumab)(CAMPATHT M ,Millenium Pharmaceuticals/Schering AG)。此等產品之成功不僅取決於其功效，亦取決於其突出之安全概況(Grillo－Lopez,A.J.等人，Semin.Oncol.26 ：66－73(1999)；Goldenberg,M.M.,Clin.Ther.21 ：309－18(1999))。儘管已取得此等藥物之成績，但目前仍存在對於獲得較通常藉由非共軛mAb治療獲得之特異性抗體活性更高之特異性抗體活性的極大關注。
許多研究結果提出Fc受體依賴機制大體上有助於細胞毒性抗體抗腫瘤之作用，且指出最佳抗腫瘤抗體應優先結合至活化Fc受體且最低限度地結合至抑制搭配物FcγRIIB(Clynes,R.A.等人，Nature Medicine 6(4) ：443－446(2000)；Kalergis,A.M.及Ravetch,J.V.,J.Exp.Med.195(12) ：1653－1659(June 2002))。舉例而言，至少一項研究之結果提出在FcγRIIIa受體中之多態現象尤其與抗體治療之功效強烈相關(Cartron,G.等人，Blood 99(3) ：754－757(2002年二月))。該研究顯示對FcγRIIIa純合之病患較雜合之病患對於利妥昔單抗具有更佳反應。作者推斷該較高反應係由於抗體對FcγRIIIa之更佳活體內結合，其導致更佳抗淋巴瘤細胞之ADCC活性。(Cartron,G.等人，Blood 99(3) ：754－757(2002年二月))。
已報告多種靶向EGFR及阻斷EGFR訊號途徑之策略。如吉非替尼(gefitinib)、埃羅替尼(erlotinib)及CI－1033之小分子酪胺酸激酶抑制劑阻斷EGFR在細胞內酪胺酸激酶區域中之自體磷酸化，藉此抑制下游訊號事件(Tsao及Herbst,Signal 4：4－9(2003))。另一方面，單株抗體靶向EGFR之細胞外部分，其導致阻斷配位體結合且藉此抑制諸如細胞增殖之下游事件(Tsao及Herbst,Signal 4：4－9(2003))。
已產生若干鼠科單株抗體，其達成此活體外阻斷且已評估其對於影響在小鼠異種移植模型中之腫瘤生長能力(Masui等人，Cancer Res .46：5592－5598(1986)；Masui等人，Cancer Res .44：1002－1007(1984)；Goldstein等人，Clin.Cancer Res .1：1311－1318(1995))。舉例而言，EMD 55900(EMD藥物)係鼠科抗－EGFR單株抗體，培養其用於抗人類上皮癌瘤細胞株A431且將其在患喉或下嚥部晚期鱗狀細胞癌瘤之病患的臨床研究中測試(Bier等人，Eur.Arch.Otohinolaryngol. 252：433－9(1995))。另外，結合EGFR之細胞外域之大鼠單株抗體ICR16、ICR62及ICR80已顯示在抑制EGF與TGF－α受體時有效(Modjtahedi等人，Int.J.Cancer 75：310－316(1998))。鼠科單株抗體425係培養用於抗人類A431癌瘤細胞株之另一Mab，且發現其結合至在人類上皮生長因子受體之外部域上之多肽抗原決定部位(Murthy等人，Arch.Biochem.Biophys.252(2) ：549－560(1987))。在治療學治療中使用鼠科抗體之一潛在問題係非人類單株抗體可被人類宿主識別為異種蛋白；因此，重複注射此等異種抗體可導致誘發導致有害過敏反應之免疫反應。對於基於鼠科之單株抗體而言，此常稱作人類抗小鼠抗體反應或"HAMA"反應，或人類抗大鼠抗體或"HARA"反應。另外，此等"異種"抗體可受宿主之免疫系統攻擊使得其在到達其靶位點前實際上受壓製。此外，非人類單株抗體(例如，鼠科單株抗體)通常缺乏人類效應功能性，意即其尤其不能經由抗體依賴細胞毒性或Fc受體介導之噬菌作用介導補體依賴溶解或溶解人類靶細胞。
已發展作為"共軛"抗體替代物之包含來自兩個或兩個以上不同物種(例如，小鼠與人類)之抗體部分的嵌合抗體。舉例而言，美國專利第5,891,996號(Mateo de Acosta del Rio 等人)論述一種針對性抗－EGFR之小鼠/人類嵌合抗體R3，且美國專利第5,558,864號論述產生嵌合及人化形式之鼠科抗－EGFR MAb 425。同樣，IMC－C225(Erbitux；ImClone)係嵌合小鼠/人類抗－EGFR單株抗體(基於小鼠M225單株抗體，其在人類臨床試驗中導致HAMA反應)，已報告其在多種人類異種移植模型中顯示抗瘤功效。(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。IMC－C225之功效歸因於若干機制，包括抑制藉由EGFR訊號途徑及可能藉由增加抗體依賴細胞毒性(ADCC)活性調節之細胞事件(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。IMC－C225亦用於包括與放射療法及化學療法組合之臨床試驗中(Herbst及Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。近來，Abgenix,Inc.(Fremont,CA)發展用於癌症治療之ABX－EGF。ABX－EGF係完全人類抗－EGFR單株抗體。(Yang等人，Crit.Rev.Oncol. /Hematol.38 ：17－23(2001))。
抗體糖基化
寡醣組份可顯著影響與治療糖蛋白之功效相關之性質，該等性質包括物理穩定性、蛋白酶攻擊耐受性、與免疫系統之相互作用、藥物動力學及特定生物活性。此等性質可不僅取決於寡醣存在與否，而且取決於寡醣之特定結構。可對於寡醣結構與糖蛋白功能之間進行一些歸納。舉例而言，某些寡醣結構經由與特定碳水化合物結合蛋白相互作用來介導迅速清除來自血流之糖蛋白，而其他結構可藉由抗體結合且觸發不期望之免疫反應。(Jenkins等人，Nature Biotechnol. 14：975－81(1996))。
哺乳動物細胞係用於產生治療糖蛋白之較佳宿主，此歸因於其糖基化處於對於人類應用最適合形式之蛋白的能力。(Cumming等人，Glycobiology 1 ：115－30(1991)；Jenkins等人，Nature Biotechnol. 14：975－81(1996))。細菌極少糖基化蛋白，且與其他類型之一般宿主(諸如酵母、絲狀真菌、昆蟲及植物細胞)相似，產生與自血流迅速清除相關之糖基化模式、不期望之免疫反應及在一些特定情況下，降低之生物活性。在哺乳動物細胞中，在過去二十年期間最常使用中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。除提供適合之糖基化模式外，此等細胞允許一致產生遺傳穩定、高產之無性繁殖細胞株。其可在簡單生物反應器中使用無血清培養基培養為高密度，且允許發展安全且可再生生物工藝。其他一般使用之動物細胞包括仔倉鼠腎(BHK)細胞、NS0－與SP2/0－小鼠骨髓瘤細胞。最近，亦已測試自轉基因動物產生。(Jenkins等人，Nature Biotechnol .14：975－81(1996))。
所有抗體皆在重鏈恆定區之保守位置含有碳水化合物結構，各同種型皆擁有一N－聯接碳水化合物結構之獨特陣列，其可變地影響蛋白組合、分泌或機能活性。(Wright,A.及Morrison,S.L.,Trends Biotech.15 ：26－32(1997))。附著之N－聯接碳水化合物結構取決於處理程度而顯著變化，且其可包括高甘露糖、多分支且雙觸錯合寡醣。(Wright,A.及Morrison,S.L.,Trends Biotech.15 ：26－32(1997))。通常，存在異質處理附著於一特別糖基化位點之核心寡醣結構甚至使得單株抗體如多重糖型般存在。同樣，已顯示在抗體糖基化中主要差異出現在細胞株之間，且對於在不同培養條件下生長之特定細胞株而言，甚至僅可見較小差異。(Lifely,M.R.等人，Glycobiology 5(8) ：813－22(1995))。
如Umaa,P.等人，Nature Biotechnol.17 ：176－180(1999)及美國專利第6,602,684號中所述，一獲得潛力極大增加同時保持簡單產生過程且潛在地避免顯著、不期望之副作用之途徑係藉由設計其寡醣組份來增強單株抗體之天然、細胞介導效應功能，該等文獻之內容全文以引用之方式併入本文中。IgG1型抗體(在癌症免疫療法中最常使用之抗體)係在各CH2域之Asn297處具有一保守N－聯接糖基化位點之糖蛋白。附著至Asn297之兩錯合雙觸寡醣隱藏於CH2域之間，與多肽主鏈形成廣泛接觸，且其存在對於抗體介導效應功能(諸如抗體依賴細胞毒性(ADCC))係必要的(Lifely,M.R.等人，Glycobiology 5 ：813－822(1995)；Jefferis,R.等人，Immunol Rev.163 ：59－76(1998)；Wright,A.及Morrison,S.L.,Trends Biotechnol.15 ：26－32(1997))。
Umaa等人先前已展示之β(1,4)－N－乙醯基葡糖胺基轉移酶III("GnTIII")(催化形成對分寡醣之糖基轉移酶)在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中之過度表現顯著地增加藉由經設計之CHO細胞產生之抗神經母細胞瘤嵌合單株抗體(chCE7)之活體外ADCC活性。(見Umaa,P.等人，Nature Biotechnol.17 ：176－180(1999)；及國際公開案WO 99/54342，該等案之全部內容以引用的方式併入本文中)。抗體chCH7屬於非共軛mAb之一大類，其具有高腫瘤親和力及特異性，但當以缺乏GnTIII酶之標準工業細胞株產生時具有極小之臨床應用潛力(Umana,P.等人，Nature Biotechnol.17 ：176－180(1999))。該研究首次顯示藉由設計表現GnTIII之抗體產生之細胞可獲得ADCC活性的極大增加，該設計亦導致恆定區(Fc)關聯之對分寡醣(包括對分、非岩藻糖基化寡醣)比例的增加，該比例高於在天然產生之抗體中之含量。
仍存在對於治療靈長類細胞增殖病症之靶向EGFR之增強治療方法的需要，該靈長類包括(但不限於)人類，其中此等病症藉由EGFR表現特別為異常表現(例如，過度表現)來表徵，該等病症包括(但不限於)膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌及腎癌。
認識到具有大鼠ICR62抗體結合特異性(例如，結合相同抗原決定部位)及經糖基化設計以增強Fc受體結合親和力及效應功能之抗原結合分子(ABM)的巨大治療潛力，本發明者發展一種產生此等ABM之方法。其中，此方法涉及產生重組、嵌合抗體或其嵌合片段。此等ABM之功效藉由設計抗體Fc區之糖基化概況而進一步增強。
因此，在一態樣中，本發明係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含：(a)一選自由以下各序列組成之群之序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：122及SEQ ID NO：124；(b)一選自由以下各序列組成之群之序列：SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106及SEQ ID NO：126；及(c)SEQ ID NO：108。在另一態樣中，本發明係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含：(a)一選自由SEQ ID NO：112與SEQ ID NO：114組成之群之序列；(b)一選自由SEQ ID NO：116與SEQ ID NO：118組成之群之序列；及(c)SEQ ID NO：119。在一實施例中，任意此等聚核苷酸皆編碼融合多肽。
在另一態樣中，本發明係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含一選自由以下各序列組成之群之序列：SEQ ID No：2、SEQ ID No：4、SEQ ID No：6、SEQ ID No：8、SEQ ID No：10、SEQ ID No：12、SEQ ID No：14、SEQ ID No：16、SEQ ID No：18、SEQ ID No：20、SEQ ID No：22、SEQ ID No：24、SEQ ID No：26、SEQ ID No：28、SEQ ID No：30、SEQ ID No：32、SEQ ID No：34、SEQ ID No：36、SEQ ID No：38、SEQ ID No：40及SEQ ID No：120。在另一態樣中，本發明係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含一選自由SEQ ID No：44、SEQ ID No：46、SEQ ID No：50及SEQ ID No：52組成之群之序列。在一實施例中，此等聚核苷酸編碼融合多肽。
本發明進一步係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含一與選自由以下各序列組成之群之序列具有至少80%、85%、90%、95%或99%相同性的序列：SEQ ID No：2、SEQ ID No：4、SEQ ID No：6、SEQ ID No：8、SEQ ID No：10、SEQ ID No：12、SEQ ID No：14、SEQ ID No：16、SEQ ID No：18、SEQ ID No：20、SEQ ID No：22、SEQ ID No：24、SEQ ID No：26、SEQ ID No：28、SEQ ID No：30、SEQ ID No：32、SEQ ID No：34、SEQ ID No：36、SEQ ID No：38、SEQ ID No：40及SEQ ID No：120，其中該聚核苷酸編碼融合多肽。在另一態樣中，本發明係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含一與選自由SEQ ID No：44、SEQ ID No：46、SEQ ID No：50及SEQ ID No：52組成之群之序列具有至少80%相同性之序列，其中該聚核苷酸編碼融合多肽。
本發明亦係針對於一種編碼具有SEQ ID No：1序列之嵌合多肽的經分離聚核苷酸。在一實施例中，該聚核苷酸包含一編碼具有SEQ ID No：1序列之嵌合多肽的序列；及一編碼具有來自除大鼠外物種之抗體Fc區或其片段之序列之多肽的序列。本發明亦係針對於一種編碼具有選自由下列各序列組成之群之序列之嵌合多肽的經分離聚核苷酸：SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ ID No：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ ID No：39及SEQ ID No：121。在一實施例中，該聚核苷酸包含一編碼具有選自由下列各序列組成之群之序列之多肽的序列：SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ ID No：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ ID No：39及SEQ ID No：121；及一編碼具有來自除大鼠外物種之抗體Fc區或其片段之序列之多肽的序列。
在又一態樣中，本發明係針對於一種編碼具有SEQ ID No：43序列之嵌合多肽的經分離聚核苷酸。在一實施例中，該聚核苷酸包含一編碼具有SEQ ID No：43序列之嵌合多肽的序列；及一編碼具有來自除大鼠外物種之抗體Fc區或其片段之序列之多肽的序列。在又一態樣中，本發明係針對於一種編碼具有一選自由SEQ ID No：45、SEQ ID No：49及SEQ ID No：51組成之群之序列之嵌合多肽的經分離聚核苷酸。在一實施例中，該聚核苷酸包含一編碼具有一選自由SEQ ID No：45、SEQ ID No：49及SEQ ID No：51組成之群之序列之多肽的序列，及一編碼具有來自除大鼠外物種之抗體輕鏈恆定區(CL)或其片段之序列之多肽的序列。
本發明亦係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含一編碼具有ICR62抗體或其功能變異體之VH區之多肽的序列，及一編碼具有來自除大鼠外物種之抗體Fc區或其片段之序列之多肽的序列。在另一態樣中，本發明係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含一編碼具有ICR62抗體或其功能變異體之VL區之多肽的序列，及一編碼具有來自除大鼠外物種之抗體CL區或其片段之序列之多肽的序列。
本發明進一步係針對於一種包含任意上述經分離聚核苷酸之表現載體，且係針對於一種包含此表現載體之宿主細胞。在另一態樣中，本發明係針對於一種包含任意上述經分離聚核苷酸之宿主細胞。
在一態樣中，本發明係針對於一種經分離多肽，其包含：(a)一選自由以下各序列組成之群之序列：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：123及SEQ ID NO：125；(b)一選自由以下各序列組成之群之序列：SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105及SEQ ID NO：127；及(c)SEQ ID NO：107。其中該多肽係融合多肽。在另一態樣中，本發明係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含(a)一選自由SEQ ID NO：111與SEQ ID NO：113組成之群序列；(b)SEQ ID NO：115及(c)SEQ ID NO：117，其中該多肽係融合多肽。
本發明亦係針對於一種包含SEQ ID NO：1序列之嵌合多肽或其變異體。本發明進一步係針對於一種包含SEQ ID NO：43序列之嵌合多肽或其變異體。在一實施例中，任一此等多肽另外包含一人類Fc區及/或一人類CL區。本發明亦係針對於一種包含一選自由以下各序列組成之群之序列之嵌合多肽或其變異體：SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ ID No：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ ID No：39及SEQ ID No：121。本發明進一步係針對於一種包含一選自由SEQ ID No：45、SEQ ID No：49及SEQ ID No：51組成之群之序列的嵌合多肽或其變異體。在一實施例中，任一此等多肽另外包含一人類Fc區及/或一人類CL區。在一實施例中，該人類Fc區包含IgG1。
在一態樣中，本發明係針對於一種包含一源於ICR62抗體之序列及一源於異種多肽之序列之多肽，且係針對於一種包含此多肽之抗原結合分子。在一實施例中，該抗原結合分子係抗體。在一較佳實施例中，該抗體係嵌合的。在另一較佳實施例中，該抗體係人化或靈長類化的。
在另一態樣中，本發明係針對於一種ABM，其能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合EGFR，且其係嵌合的。在一實施例中，該ABM係抗體或其片段。在另一實施例中，該ABM係重組抗體，其包含一具有一胺基酸序列之VH區，該胺基酸序列係選自由以下各序列組成之群：SEQ ID NO：1、SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ ID No：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ ID No：39及SEQ ID No：121。在另一實施例中，該ABM係重組抗體，其包含一具有一胺基酸序列之VL區，該胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：43、SEQ ID No：45、SEQ ID No：49及SEQ ID No：51組成之群。在另一實施例中，該ABM係靈長類化重組抗體。在又一實施例中，該ABM係人化重組抗體。在另一實施例中，該ABM係包含一人類Fc區之重組抗體。在另一實施例中，任意上文討論之ABM均可共軛一諸如毒素或放射性標記之部分。
本發明進一步係關於一種本發明之ABM，該ABM具有經修飾寡醣。在一實施例中，與未經修飾寡醣相比較，該經修飾寡醣具有減少之岩藻糖基化作用。在其他實施例中，該等經修飾寡醣係雜合物或錯合物。在另一實施例中，該ABM在該等分子之Fc區具有增加之非岩藻糖基化寡醣或對分非岩藻糖基化寡醣比例。在一實施例中，該等對分非岩藻糖基化寡醣係雜合物。在另一實施例中，該等對分非岩藻糖基化寡醣係錯合物。在一實施例中，該多肽之Fc區中之至少20%寡醣係非岩藻糖基化或對分非岩藻糖基化寡醣。在更佳實施例中，至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%或75%以上之寡醣係非岩藻糖基化或對分非岩藻糖基化寡醣。
本發明進一步係關於一種編碼任意上文討論之ABM之聚核苷酸，且係關於包含此聚核苷酸之表現載體及細胞。
本發明進一步係關於一種產生ABM之方法，該ABM能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合EGFR，且其中該ABM係嵌合的，該方法包含：(a)在允許表現編碼本發明之ABM之聚核苷酸之條件下，在培養基中培養包含該編碼該ABM之聚核苷酸之宿主細胞；及(b)自所得培養物中回收該ABM。
在另一態樣中，本發明係關於一種醫藥組合物，其包含本發明之ABM。本發明涵蓋該醫藥組合物可另外包含醫藥學上可接受載劑、佐劑或其組合。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療疾病之方法，該疾病藉由EGFR表現(例如，EGFR異常或過度表現)來表徵。該方法包含對需要此治療之受檢者(較佳為哺乳動物受檢者且更佳為人類)投與治療有效劑量之本發明之ABM。在一較佳實施例中，該疾病藉由投與ABM來治療，該ABM係嵌合(例如人化)抗體或抗體之嵌合片段。在一實施例中，該ABM係以約1.0 mg/kg至約15.0 mg/kg之量投與。在另一實施例中，該ABM係以約1.5 mg/kg至約12.0 mg/kg之量投與。在另一實施例中，該ABM係以約1.5 mg/kg至約4.5 mg/kg之量投與。在另一實施例中，該ABM係以約4.5 mg/kg至約12.0 mg/kg之量投與。在另一實施例中，該ABM係以選自由約1.5 mg/kg、約4.5 mg/kg及約12.0 mg/kg組成之群的量投與。
在又一態樣中，本發明係關於一種宿主細胞，其經設計以在足以修飾處於藉由宿主細胞產生之ABM之Fc區中之寡醣的量下表現至少一種編碼具有GnTIII活性之多肽的核酸，其中該ABM能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合EGFR，且其中該ABM係嵌合的。在一實施例中，該具有GnTIII活性之多肽係融合多肽。在另一實施例中，該藉由宿主細胞產生之ABM係抗體或抗體片段。在一實施例中，該抗體或抗體片段係人化的。在另一實施例中，該ABM包含一相當於人類IgG之Fc區的區。
本發明亦係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含至少一個(例如一、二、三、四、五或六個)大鼠ICR62抗體互補決定區或其至少含有該互補決定區之特異性決定殘基之變異體或截斷形式，其中該經分離聚核苷酸編碼融合多肽。較佳地，此等經分離聚核苷酸編碼係抗原結合分子之融合多肽。在一實施例中，該聚核苷酸包含三個大鼠ICR62抗體互補決定區或其至少含有各該等三個互補決定區之特異性決定殘基之變異體或截斷形式。在另一實施例中，該聚核苷酸編碼嵌合(例如人化)抗體之輕鏈或重鏈的整個可變區。本發明進一步係針對於藉由此等聚核苷酸編碼之多肽。
在另一實施例中，本發明係針對於一種抗原結合分子，其包含至少一個(例如一、二、三、四、五或六個)大鼠ICR62抗體互補決定區或其至少含有該互補決定區之特異性決定殘基之變異體或截斷形式，且包含一源自異種多肽之序列。在一實施例中，該抗原結合分子包含三個大鼠ICR62抗體互補決定區或其至少含有各該等三個互補決定區之特異性決定殘基之變異體或截斷形式。在另一態樣中，該抗原結合分子包含一抗體輕鏈或重鏈之可變區。在一特別有用之實施例中，該抗原結合分子係嵌合(例如人化)抗體。本發明亦係針對於製造此等抗原結合分子之方法，及其在治療疾病中之用途，該等疾病包括惡性疾病，諸如膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、皮膚癌及腎癌。
本發明之宿主細胞可係選自包括(但不限於)以下各物之群：HEK293－EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞。在一實施例中，本發明之宿主細胞另外包含經轉染聚核苷酸，該經轉染聚核苷酸包含編碼大鼠ICR62抗體或其變異體之VL區之聚核苷酸，及編碼一相當於人類免疫球蛋白Fc區之區的序列。在另一實施例中，本發明之宿主細胞另外包含經轉染聚核苷酸，該經轉染聚核苷酸包含一編碼大鼠ICR62抗體或其變異體之VH區之聚核苷酸，及一編碼一相當於人類免疫球蛋白Fc區之區的序列。
在另一態樣中，本發明係針對於一種產生ABM之宿主細胞，作為修飾ABM寡醣之結果，該ABM展示增加之Fc受體結合親和力及/或增加之效應功能。在一實施例中，該增加之結合親和力係對於Fc受體而言，特別係對於FcγRIIIA受體而言。本文預期之效應功能可係選自包括(但不限於)以下各效應功能之群：增加之Fc介導細胞毒性、增加之對NK細胞之結合、增加之對巨噬細胞之結合、增加之對多形核細胞之結合、增加之對單核細胞之結合、增加之直接訊號誘導之凋亡、增加之神經樹突細胞成熟及增加之T細胞引動。
在另一實施例中，本發明之宿主細胞包含至少一種編碼具有GnTIII活性之多肽之核酸，其可操作地聯接至一構成型啟動子元件。
在另一態樣中，本發明係針對於一種在一宿主細胞中產生ABM之方法，其包含：(a)在允許產生該ABM與允許修飾存在於該ABM之Fc區上之寡醣的條件下，培養一宿主細胞，設計其以表現至少一個編碼具有GnTIII活性之融合多肽的聚核苷酸；及(b)分離該ABM；其中該ABM能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合EGFR且其中該ABM係嵌合的(例如，人化的)。在一實施例中，該具有GnTIII活性之多肽係融合多肽，其較佳包含GnTIII催化域及異種高爾基體固有多肽之高爾基體定位域，該等高爾基體定位域係選自由甘露糖苷酶II之定位域、β(1,2)－N－乙醯基葡糖胺基轉移酶I("GnTI")之定位域、甘露糖苷酶I之定位域、β(1,2)－N－乙醯基葡糖胺基轉移酶II("GnTII")之定位域及α1－6核心岩藻糖基轉移酶定位域組成之群。較佳地，該高爾基體定位域係來自甘露糖苷酶II或GnTI。
在另一態樣中，本發明係針對於一種修飾藉由宿主細胞產生之抗－EGFR ABM之糖基化概況的方法，其包含將至少一種本發明之核酸或表現載體引入該宿主細胞中。在一實施例中，該ABM係抗體或其片段；較佳包含一IgG之Fc區。或者，該多肽係融合蛋白，其包含一相當於人類IgG之Fc區的區。
在一態樣中，本發明係針對於一種重組、嵌合抗體或其片段，其能夠與大鼠ICR62抗體競爭結合EGFR且具有減少之岩藻糖基化作用。
在另一態樣中，本發明係關於一種藉由使用具有GnTIII活性且包含異種高爾基體固有多肽之高爾基體定位域之融合多肽來修飾本發明之重組抗體或其片段之糖基化的方法。在一實施例中，本發明之融合多肽包含GnTIII之催化域。在另一實施例中，該高爾基體定位域係選自由以下各定位域組成之群：甘露糖苷酶II之定位域、GnTI之定位域、甘露糖苷酶I之定位域、GnTII之定位域及α1－6核心岩藻糖基轉移酶之定位域。較佳地，該高爾基體定位域係來自甘露糖苷酶II或GnTI。
在一實施例中，本發明之方法係針對於以經修飾寡醣來產生重組、嵌合抗體或其片段，其中與未經修飾寡醣相比較，該經修飾寡醣具有減少之岩藻糖基化作用。根據本發明，該等經修飾寡醣可係雜合物或錯合物。在另一實施例中，本發明之方法係針對於產生在該多肽之Fc區中具有增加之對分、非岩藻糖基化寡醣比例的重組、嵌合(例如人化)抗體或其片段。在一實施例中，該等對分非岩藻糖基化寡醣係雜合物。在另一實施例中，該等對分非岩藻糖基化寡醣係錯合物。在另一實施例中，本發明之方法係針對於產生重組、嵌合抗體或其片段，該等抗體或其片段在該多肽之Fc區中具有至少20%寡醣係對分、非岩藻糖基化的。在另一較佳實施例中，至少30%在該多肽之Fc區中之寡醣係對分、非岩藻糖基化的。在另一較佳實施例中，其中至少35%在該多肽之Fc區中之寡醣係對分、非岩藻糖基化的。
在另一態樣中，本發明係針對於一種重組、嵌合抗體或其片段，作為修飾其寡醣之結果，其展示增加之Fc受體結合親和力及/或增加之效應功能。在一實施例中，該增加之結合親和力係對於Fc活化受體而言。在另一實施例中，該Fc受體係Fcγ活化受體，特別係FcγRIIIA受體。本文預期之效應功能可係選自包括(但不限於)以下各效應功能之群：增加之Fc介導細胞毒性、增加之對NK細胞之結合、增加之對巨噬細胞之結合、增加之對多形核細胞之結合、增加之對單核細胞之結合、增加之直接訊號誘導之凋亡、增加之神經樹突細胞成熟及增加之T細胞引動。
在另一態樣中，本發明係針對於一種重組、嵌合(例如人化)抗體片段，其具有大鼠ICR62抗體結合特異性且含有Fc區，設計其以具有藉由本發明之任意方法產生之增加之效應功能。
在另一態樣中，本發明係針對於一種包括一多肽之融合蛋白，該多肽具有一選自由下列各序列組成之群之序列：SEQ ID No：1、SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ ID No：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ ID No：39及SEQ ID No：121及一相當於免疫球蛋白之Fc區且經設計以具有藉由本發明之任意方法產生之增加之效應功能的區。
在另一態樣中，本發明係針對於一種包括多肽之融合蛋白，該多肽具有一選自由SEQ ID NO：43、SEQ ID No：45、SEQ ID No：49及SEQ ID No：51組成之群之序列及一相當於免疫球蛋白之Fc區且經設計以具有藉由本發明之任意方法產生之增加之效應功能的區。
在一態樣中，本發明係針對於一種醫藥組合物，其包含藉由本發明之任意方法產生之重組、嵌合(例如人化)抗體及醫藥學上可接受之載劑。在另一態樣中，本發明係針對於一種醫藥組合物，其包含藉由本發明之任意方法產生之重組、嵌合(例如人化)抗體片段及醫藥學上可接受之載劑。在另一態樣中，本發明係針對於一種醫藥組合物，其包含藉由本發明之任意方法產生之融合蛋白及醫藥學上可接受之載劑。
在另一態樣中，本發明係針對於一種活體內或活體外靶向表現EGFR之細胞之方法。在一實施例中，本發明係針對於一種在受檢者中靶向表現EGFR之細胞之方法，其包含對該受檢者投與包含本發明之ABM之組合物。
在又一態樣中，本發明係針對於一種活體內或活體外偵測樣品中存在之EGFR之方法，例如，用於診斷與EGFR表現相關之病症。在一實施例中，該偵測藉由在允許於ABM與EGFR之間形成錯合物之條件下使待測試樣品與本發明之ABM相接觸(視情況地以對照樣品與本發明之ABM相接觸)來執行。接著偵測該錯合物形成(例如藉由ELISA或此項技術中已知之其他方法)。當與該測試樣品一起使用對照樣品時，在比較測試樣品與對照樣品時，ABM－EGFR錯合物之形成中之任意統計上之顯著差異皆預示EGFR存在於測試樣品中。
本發明進一步係針對於一種治療與EGFR表現相關之病症、尤其細胞增殖病症之方法，該等病症中表現EGFR，且更特定言之，該等病症中異常表現(例如過度表現)EGFR，該等病症包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、皮膚癌及腎癌，該方法包含對需要此治療之人類受檢者投與治療有效量之藉由本發明之任意方法產生之重組、嵌合(例如人化)抗體或其片段。
除非如下文所另外定義，否則本文使用之術語如此項技術通常使用之術語。
如本文所使用，術語抗體意欲包括包含單株抗體、多株抗體及多物種(例如雙物種)抗體之全部抗體分子，以及具有Fc區且保持結合特異性之抗體片段及包括一相當於免疫球蛋白Fc區之區且保持結合特異性之融合蛋白。亦涵蓋保持結合特異性之抗體片段，該等抗體片段包括(但不限於)VH片段、VL片段、Fab片段、F(ab')2 片段、scFv片段、Fv片段、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體(參見，例如，Hudson及Souriau，Nature Med. 9：129－134(2003))。亦涵蓋人化抗體、靈長類化抗體及嵌合抗體。
如本文所使用，術語Fc 區意欲指一IgG重鏈之C－末端區。儘管IgG重鏈之Fc區的界線可輕微變化，但人類IgG重鏈Fc區通常界定為自在Cys226位置之胺基酸殘基延伸至羧基終點。
如本文所使用，使用相當於免疫球蛋白之Fc區之區 意欲包括免疫球蛋白之Fc區之天然產生之對偶基因變異體及具有產生取代、添加或缺失但實質上不降低免疫球蛋白介導效應功能之能力(諸如抗體依賴細胞毒性)之經改變變異體。舉例而言，可自免疫球蛋白之Fc區之N－末端或C－末端缺失一或多個胺基酸，而實質上未損失生物功能。該等變異體可根據此項技術中已知之一般規則選擇以最小地影響活性。(參見，例如，Bowie,J.U.等人，Science 247 ：1306－1310(1990))。
如本文所使用，術語EGFR 係指人類上皮生長因子受體(亦稱為HER－1或Erb－B1)(Ulrich,A.等人，Nature 309：418－425(1984)；SwissProt登記號P00533；第二登記號：O00688、O00732、P06268、Q14225、Q92795、Q9BZS2、Q9GZX1、Q9H2C9、Q9H3C9、Q9UMD7、Q9UMD8、Q9UMG5)，以及其天然產生之同功異型物及變異體。該等同功異型物及變異體包括(但不限於)EGFRvIII變異體、替代性拼接產物(例如，如藉由SwissProt登記號P00533－1、P00533－2、P00533－3、P00533－4所鑑定)、變異體GLN－98、ARG－266、Lys－521、ILE－674、GLY－962及PRO－988(Livingston,R.J.等人，NIEHS－SNPs,environmental genome project,NIEHS ES15478,Department of Genome Sciences,Seattle,WA(2004))，及藉由以下登記號所鑑定之其他同功異型物及變異體：NM_005228.3、NM_201282.1、NM_201283.1、NM_201284.1(REFSEQ mRNA)；AF125253.1、AF277897.1、AF288738.1、AI217671.1、AK127817.1、AL598260.1、AU137334.1、AW163038.1、AW295229.1、BC057802.1、CB160831.1、K03193.1、U48722.1、U95089.1、X00588.1、X00663.1；H54484S1、H54484S3、H54484S2(MIPS組合)；DT.453606、DT.86855651、DT.95165593、DT.97822681、DT.95165600、DT.100752430、DT.91654361、DT.92034460、DT.92446349、DT.97784849、DT.101978019、DT.418647、DT.86842167、DT.91803457、DT.92446350、DT.95153003、DT.95254161、DT.97816654、DT.87014330、DT.87079224(DOTS組合)。
如本文所使用，術語EGFR配位體 係指結合於及/或活化EGFR之多肽。該術語包括膜結合前驅體形式之EGFR配位體以及可蛋白分解加工之可溶形式之EGFR配位體。
如本文所使用，術語EGFR之配位體活化 係指藉由EGFR配位體結合介導之訊號轉導(例如，藉由EGFR受體之細胞內激酶域磷酸化處於EGFR中之酪胺酸殘基或基質多肽引起)。
如本文所使用，術語藉由異常活化或產生EGFR或EGFR配位體表徵之疾病或病症或與EGFR表現相關之病症 係指如下病症：其可涉及或不涉及惡性腫瘤或癌症，其中在患有或傾向於患有該疾病或病症之受檢者細胞或組織中存在EGFR及/或EGFR配位體之異常活化及/或產生。
如本文所使用，術語過度表現 ，當其連同細胞表現EGFR使用時，係指與相同組織類型之正常細胞相比在細胞表面具有可量測之更高含量EGFR的細胞。該過度表現可藉由基因擴增或藉由轉錄或轉譯增加引起。EGFR表現(及因此過度表現)可在診斷或預後性檢定中藉由此項技術中已知之技術(例如，經由免疫組織化學檢定、免疫螢光檢定、免疫酶檢定、ELISA、流式細胞術、放射免疫檢定、西方墨點法(Western blot)、配位體結合、激酶活性等)評估存在於細胞表面上或細胞溶胞物中之EGFR含量來測定。(通常參見，CELL BIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK,Celis,J.編，Academic Press(第二版，1998)；CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE,Coligan,J.E.等人編，John Wiley & Sons(1995－2003)；亦參見，Sumitomo等人，Clin.Cancer Res. 10：794－801(2004)(描述西方墨點法、流式細胞術及免疫組織化學)該等文獻之全部內容均以引用的方式併入本文中)。或者或另外，可(例如)經由螢光原位雜交、南方墨點法或PCR技術來量測細胞中EGFR編碼之核酸分子的含量。將在正常細胞中之EGFR含量與受細胞增殖病症(例如，癌症)影響之細胞之該等含量相比較以測定EGFR是否過度表現。
如本文所使用，術語抗原結合分子 係指最廣泛意義之分子，其特異結合抗原決定子。更明確地，"結合EGFR之抗原結合分子"係特異性結合至170 kDa之跨膜受體的分子，該跨膜受體通常命名為上皮生長因子受體(EGFR)，但亦稱為HER－1或ErbB1。"特異性結合"意味該結合對於抗原係選擇性的，且可加以區分不期望或非特異性之相互作用。
如本文所使用，術語融合與嵌合 ，當關於諸如ABM之多肽使用時，係指包含源於兩個或兩個以上異種多肽之胺基酸序列的多肽，諸如來自不同物種之抗體的部分。對於嵌合ABM而言，例如，非抗原結合組份可源於包括諸如黑猩猩及人類之靈長類之廣泛多種物種。嵌合ABM之恆定區與天然人類抗體之恆定區最佳大體上相同；嵌合抗體之可變區與具有鼠科可變區之胺基酸序列之重組抗－EGFR抗體的可變區最佳大體上相同。人化抗體係特別較佳形式之融合或嵌合抗體。
如本文所使用，具有GnTIII活性之多肽 係指能夠將處於β－1－4聯接之N－乙醯基葡糖胺(GlcNAc)殘基催化加成為N－聯接寡醣之三甘露糖基核心之β－聯接甘露糖苷的多肽。如於特別生物檢定中在有或無計量依賴性之情況下所量測，此包括展示與β(1,4)－N－乙醯基葡糖胺基轉移酶II(根據國際化學與分子生物學聯盟(International Unionof Biochemistry and Molecular Biology)(NC－IUBMB)亦稱為β－1,4－甘露糖基－糖蛋白4－β－N－乙醯基葡糖胺基轉移酶(EC 2.4.1.144))活性相似(但未必相同)之酶活性之融合多肽。在劑量依賴性確實存在之情況下，其未必需要與GnTIII之劑量依賴性相同，而僅需在與GnTIII相比時，在特定活性下具有大體上相似之劑量依賴性(意即，該候選多肽應展現更大活性或與GnTIII相比展示不超過約25倍且較佳不超過約10倍之較低活性且最佳不超過約3倍之較低活性)。
如本文所使用，術語變異體 (或類似物 )係指一使用(例如)重組DNA技術創造之藉由胺基酸插入、缺失或取代不同於本發明之特別引用之多肽的多肽。本發明之ABM之變異體包括嵌合、靈長類化或人化抗原結合分子，其中一或若干個胺基酸殘基藉由以大體上不影響抗原(例如EGFR)結合親和力之方式取代、添加及/或缺失來修飾。決定哪些胺基酸殘基可經置換、添加或缺失而不消除重要活性的導引可藉由比較該特別多肽之序列與同源多肽之序列及最小化在高同源區(保守區)作出之胺基酸序列變化之數量或藉由以一致序列替代胺基酸來建立。
或者，可藉由使用遺傳密碼中之"冗餘"來合成或選擇編碼該等相同或相似多肽之重組變異體。可引入諸如產生多種限制位點之沉默改變之多種密碼子取代以優化選殖入質體或病毒載體中或在特別原核或真核系統中表現。在聚核苷酸序列中之突變可反映於多肽或添加至該多肽中以修飾該多肽之任意部分之性質的其他多肽之域中，以改變諸如配位體結合親和力、鏈間親和力或降解/轉換率之特徵。
較佳地，胺基酸"取代"係以另一具有相似結構及/或化學性質之胺基酸置換一胺基酸之結果(意即保守胺基酸置換)。"保守"胺基酸取代可基於涉及殘基之極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性及/或兩親性質之相似性而進行。舉例而言，非極性(疏水性)胺基酸包括丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色胺酸及蛋胺酸；極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、酥胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸及麩胺醯胺；正電性(鹼性)胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸；且負電性(酸性)胺基酸包括天冬胺酸與麩胺酸。"插入"或"缺失"較佳在約1至20個胺基酸範圍內，更佳為1至10個胺基酸。允許之變化可係藉由使用重組DNA技術在多肽分子中系統地使胺基酸插入、缺失或取代及檢定所得重組變異體之活性來實驗地測定。
如本文所使用，術語人化 係用來指源於非人類抗原結合分子之抗原結合分子(例如，鼠科抗體)，其保持或大體上保持母體分子之抗原結合性質，但其在人體內具有較少免疫原性。此可藉由包括下列之多種方法來達成：(a)將完全非人類可變域移植至人類恆定區上以產生嵌合抗體，(b)在保留或不保留關鍵框架殘基(例如，對於保持較好抗原親和力或抗體功能之彼等殘基)的情況下，僅將非人類CDR移植至人類框架區與恆定區，或(c)移植完全非人類可變區，但藉由置換表面殘基來以類人類部分將其"掩蓋"。此等方法在如下文獻中揭示：Jones等人，Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci., 81：6851－6855(1984)；Morrison及Oi，Adv.Immunol. ,44：65－92(1988)；Verhoeyen等人，Science,239：1534－1536(1988)；Padlan,Molec.Immun. ,28：489－498(1991)；Padlan,Molec.Immun. ,31(3)：169－217(1994)，所有該等文獻之全文均以引用的方式併入本文中。在抗體之各重鏈及輕鏈可變域中通常存在3個互補決定區或CDR(CDR1、CDR2與CDR3)，其在抗體之各重鏈及輕鏈可變域中藉由四個框架亞區(意即FR1、FR2、FR3及FR4)側接：FR1－CDR1－FR2－CDR2－FR3－CDR3－FR4。人化抗體之討論尤其可在美國專利第6,632,927號及公開之美國申請案第2003/0175269號中發現，二者之全文皆以引用的方式併入本文中。
相似地，如本文所使用，術語靈長類化 係用於指源於非靈長類抗原結合分子(例如鼠科抗體)之抗原結合分子，其保持或大體上保持母體分子之抗原結合性質，但其在靈長類中具有較少免疫原性。
在術語存在此項技術內使用及/或接受之兩種或兩種以上之定義的情況下，除非明確規定相反情況，否則本文所用之術語之定義意欲包括所有此等意義。一特別實例係使用術語"互補決定區"("CDR")以描述在重鏈與輕鏈多肽之可變區內發現之非鄰近抗原結合位點。此特別區已由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequences of Proteins of Immunological Interest"(1983)及由Chothia等人，J.Mol.Biol. 196：901－917(1987)描述(該等文獻以引用的方式併入本文中)，其中當彼此間比較時，該等定義包括胺基酸殘基之重疊或子集。然而，任一定義指抗體或其變異體之CDR之應用意欲在本文所定義及使用之術語的範疇內。涵蓋如藉由各上文引用之參考所定義之CDR的適合胺基酸殘基作為比較列於下文表1中。涵蓋特別CDR之確切殘基數應取決於CDR之序列及尺寸而變化。熟習此項技術者應常規地確定哪些殘基包含給定抗體之可變區胺基酸序列的特別CDR。
1 在表1中所有CDR定義之編號係根據Kabat等人提出之編號規約(見下文)。2 "AbM"係指如藉由牛津分子"AbM"抗體模型軟體所定義之CDR。
Kabat等人亦定義一種用於可應用於任意抗體之可變域序列的編號系統。在不需依靠該序列自身外之任意實驗資料的情況下，普通熟習此項技術者可明確地將此"Kabat編號"系統指定給任意可變域序列。如本文所使用，"Kabat編號"係指藉由Kabat等人，U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of Immunological Interest"(1983)提出之編號系統。除非另外規定，否則編號在一ABM中之特別胺基酸殘基位置之參考係根據Kabat編號系統。序列列表之序列(意即SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：127)並非根據Kabat編號系統編號。然而，如上所述，普通熟習此項技術者完全可基於本文所呈現之序列之編號確定在序列表中之任意可變區序列的Kabat編號方案。
具有與本發明之參考核苷酸序列至少(例如)95%"相同"之核酸或聚核苷酸，其意味除該聚核苷酸序列可包括該參考核苷酸序列之每各100核苷酸至多5點突變外，該聚核苷酸之核苷酸序列與該參考序列相同。換言之，為獲得具有與參考核苷酸序列至少95%相同之核苷酸序列的聚核苷酸，在參考序列中至多5%之核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代；或在該參考序列中許多核苷酸(至多5%之總核苷酸)可得以嵌入參考序列中。
實際上，任意特別核酸分子或多肽(無論其係至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%與本發明之核苷酸序列或多肽序列相同)皆可使用已知電腦程式習知地確定。可使用基於Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6 ：237－245(1990)之演算法之FASTDB電腦程式來確定用於確定查詢序列(本發明之序列)與目標序列之間之最佳整體匹配的較佳方法，該方法亦稱作整體序列比對(global sequence alignment)。在序列比對中，查詢序列與目標序列為DNA序列。RNA序列可藉由轉變U's為T's來比較。該整體序列比對結果係呈百分比之相同性。在DNA序列之FASTDB比對中使用以計算百分比相同性之較佳參數為：矩陣＝單元、k－元組＝4、錯配罰分＝1、接合罰分＝30、隨機化組長度＝0、截斷分數＝1、空位罰分＝5、空位尺寸罰分0.05、窗口尺寸＝500或更短之目標核苷酸序列之長度。
若由於5'或3'缺失而並非由於內部缺失使目標序列較查詢序列短，則必須對結果進行手動修正。此係由於當計算百分比相同性時，FASTDB程式並不說明目標序列之5'及3'截斷。對於在5'或3'末端截斷之目標序列而言，相對於查詢序列，該百分比相同性藉由計算查詢序列之鹼基(其係該目標序列之5'與3'，其並不匹配/對準)數為該查詢序列之總鹼基百分比來修正。藉由FASTDB序列比對結果來確定核苷酸是否係匹配/對準的。接著自藉由使用特別參數之上文FASTDB程式計算之百分比相同性中減去此百分數以達成最終百分比相同性分數。此經修正分數係用於本發明之目的之分數。出於手動調整百分比相同性分數之目的，僅計算如FASTDB比對所顯示之與查詢序列不匹配/對準之目標序列5'及3'鹼基外之鹼基。
舉例而言，將90鹼基目標序列與100鹼基查詢序列比對以確定百分比相同性。缺失出現在目標序列之5'末端，且因此FASTDB比對不顯示在5'末端處之最初10個鹼基的匹配/對準。該等10個未成對鹼基代表10%之序列(在5'與3'末端不匹配之鹼基數/在查詢序列中之總鹼基數)，因此自藉由FASTDB程式計算之百分比相同性分數中減去10%。若其餘90個鹼基係完全匹配的，則最終百分比相同性應為90%。在另一實例中，將90鹼基目標序列與100鹼基查詢序列相比較。此次，該等缺失為內部缺失，以致不存在與查詢序列不相匹配/對準之在目標序列之5'或3'上之鹼基。在此情況下，藉由FASTDB計算之百分比相同性並非為經手動修正的。再次，僅與查詢序列不相匹配/對準之目標序列之5'及3'鹼基為經手動修正的。對於本發明之目的而言，不必進行其他手動修正。
具有與本發明之查詢胺基酸序列至少(例如)95%"相同性"之胺基酸序列的多肽，其意味除該目標多肽序列可包括該查詢胺基酸序列之每各100個胺基酸至多5個胺基酸改變外，該目標多肽之胺基酸序列與該查詢序列相同。換言之，為獲得具有與查詢胺基酸序列至少95%相同性之胺基酸序列之多肽，在該目標序列中至多5%之胺基酸殘基可經插入、缺失或經另一胺基酸取代。該等參考序列之改變可出現在該參考胺基酸序列之胺基末端或羧基末端位置或在彼等末端位置之間之任意位置，其單獨地散佈於參考序列中之殘基中或在參考序列內之一或多個鄰近群中。
實際上，任意特別多肽(無論其係至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%與參考多肽相同)皆可使用已知電腦程式習知地確定。可使用基於Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6 ：237－245(1990)之演算法之FASTDB電腦程式來確定用於確定查詢序列(本發明之序列)與目標序列之間之最佳整體匹配的較佳方法，該方法亦稱作整體序列比對。在序列比對中，查詢序列與目標序列皆為核苷酸序列或皆為胺基酸序列。該整體序列比對之結果係呈百分比之相同性。在FASTDB胺基酸比對中使用之較佳參數為：矩陣＝PAM 0、k－元組＝4、錯配罰分＝1、接合罰分＝30、隨機化組長度度＝0、截斷分數＝1、窗口尺寸＝序列長度、空位罰分＝5、空位尺寸罰分＝0.05、窗口尺寸＝500或更短之目標胺基酸序列之長度。
若由於N－末端或C－末端缺失而並非由於內部缺失使目標序列較查詢序列短，則必須對結果進行手動修正。此係由於當計算整體百分比相同性時，FASTDB程式並不說明目標序列之N－末端與C－末端截斷。對於在N－末端與C－末端截斷之目標序列而言，相對於查詢序列，百分比相同性藉由計算查詢序列之殘基(其係該目標序列之N－末端與C－末端，其並不與相應目標殘基匹配/對準)數為該查詢序列之總鹼基的百分比來修正。藉由FASTDB序列比對之結果來確定殘基是否相匹配/對準。接著自使用特別參數之上文之FASTDB程式計算之百分比相同性中減去此百分數以達成最終百分比相同性分數。此最終百分比相同性分數係用於本發明之目的之分數。出於手動調整百分比相同性分數之目的，僅考慮與查詢序列不相匹配/對準之目標序列之N末端與C末端的殘基。換言之，僅考慮在目標序列之最遠N－末端與C－末端殘基外之查詢殘基位置。
舉例而言，將90胺基酸殘基目標序列與100殘基查詢序列比對以確定百分比相同性。缺失出現在目標序列之N－末端，且因此FASTDB比對不顯示在N－末端處之最初10個殘基的匹配/對準。該等10未成對殘基代表10%之序列(在N－末端與C－末端不匹配殘基數/在查詢序列中之總殘基數)，因此自藉由FASTDB程式計算之百分比相同性分數中減去10%。若其餘90個殘基係完全匹配的，則最終百分比相同性應為90%。在另一實例中，將90殘基目標序列與100殘基查詢序列相比較。此次，該等缺失為內部缺失，因此不存在與查詢序列不相匹配/對準之在目標序列之N－末端或C－末端處之殘基。在此情況下，藉由FASTDB計算之百分比相同性並非為經手動修正的。再次，僅手動修正如在FASTDB比對中所顯示與查詢序列不相匹配/對準之目標序列N－終端及C－終端外之殘基位置。對於本發明之目的而言，不必進行其他手動修正。
如本文所使用，"在嚴格條件下雜交 "成本發明之核苷酸序列之核苷酸係指在如下條件下雜交聚核苷酸：在包含50%甲醯胺、5x SSC(750 mM NaCl、75 mM檸檬酸鈉)、50 mM磷酸鈉(pH 7.6)、5x丹哈特溶液(Denhardt's solution)、10%硫酸葡聚糖及20 μg/ml變性、剪切之鮭魚精子DNA溶液中在42℃下隔夜培育，接著在約65℃下在0.1x SSC中洗滌過濾器。
如本文所使用，術語高爾基體定位域 係指負責在該高爾基錯合物內之定位中錨定高爾基體固有多肽之胺基酸序列。通常，定位域包含酶之胺基末端"尾巴"。
如本文所使用，術語效應功能 係指可歸因於抗體之Fc區(天然序列Fc區或胺基酸序列變異體Fc區)之彼等生物活性。抗體效應功能之實例包括(但不限於)Fc受體結合親和力、抗體依賴細胞毒性(ADCC)、抗體依賴細胞噬菌作用(ADCP)、細胞因子分泌、免疫錯合物介導之藉由抗原呈現細胞之抗原遞呈、細胞表面受體下調等。
如本文所使用，認為術語設計、經設計、設計及糖基化設計 包括天然產生或重組多肽或其片段之糖基化模式之任意操作。糖基化設計包括細胞糖基化機制的代謝設計，包括寡醣合成途徑之遺傳操作以達成在細胞中表現之糖蛋白的糖基化改變。此外，糖基化設計包括突變與細胞環境對糖基化之影響。在一實施例中，糖基化設計係改變糖基轉移酶活性。在一特別實施例中，該設計導致葡糖胺基轉移酶活性及/或岩藻糖基轉移酶活性改變。
如本文所使用，術語宿主細胞 涵蓋任意類型之細胞株統，其可經設計以產生本發明之多肽與抗原結合分子。在一實施例中，設計宿主細胞以允許產生具有經修飾糖基化形式之抗原結合分子。在一較佳實施例中，該抗原結合分子係抗體、抗體片段或融合蛋白。在某些實施例中，已對該等宿主細胞進行進一步操作以表現增加含量之一或多種具有GnTIII活性之多肽。宿主細胞包括經培養細胞，例如(僅列舉幾個)哺乳動物經培養細胞(諸如CHO細胞、HEK293－EBNA細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞)、酵母細胞、昆蟲細胞及植物細胞，亦包括包含於轉基因動物、轉基因植物或經培養植物或動物組織內之細胞。
如本文所使用，術語Fc－介導細胞毒性 包括抗體依賴細胞毒性與藉由含有人類Fc區之可溶Fc－融合蛋白介導之細胞毒性。其係導致"藉由人類免疫效應細胞"溶解"抗體靶向細胞"之免疫機制，其中：人類免疫效應細胞 係在其表面展示Fc受體之白血球群體，藉此其結合至抗體或Fc－融合蛋白之Fc區且執行效應功能。此群體可包括(但不限於)周邊血液單核細胞(PBMC)及/或自然殺手(NK)細胞。
抗體靶向細胞 係藉由抗體或Fc－融合蛋白結合之細胞。該等抗體或Fc融合蛋白經由Fc區蛋白部分N－末端結合至靶細胞。
如本文所使用，術語Fc－介導之細胞毒性 增加係定義為在給定時間內、在給定抗體或Fc融合蛋白濃度下、在靶細胞環境之培養基中，藉由上文定義之Fc－介導細胞毒性機制溶解之"抗體靶向細胞"數量增加；及/或在給定時間內、在靶細胞環境之培養基中藉由Fc－介導細胞毒性機制達成溶解給定數量之"抗體靶向細胞"所需抗體或Fc－融合蛋白濃度減少。Fc－介導細胞毒性增加係相對於藉由相同抗體或Fc－融合蛋白介導之細胞毒性而言，該等相同抗體或Fc－融合蛋白係使用相同標準之產生、純化、調配及儲存方法(該等方法對於熟習此項技術者已知)藉由相同類型之宿主細胞產生，但其並非藉由本文描述之方法藉由經設計表現糖基轉移酶GnTIII之宿主細胞產生。
具有增加之抗體依賴細胞毒性(ADCC)之抗體 意味如本文所界定之術語抗體具有如藉由普通熟習此項技術者已知之任意適合方法所確定之增加之ADCC。一可接受之活體外ADCC檢定係如下：1)該檢定使用已知表現藉由抗體之抗原結合區識別之靶抗原的靶細胞；2)該檢定使用自隨機選擇之健康供體血液分離之人類周邊血液單核細胞(PBMC)作為效應細胞；3)該檢定根據以下協議執行：i)使用標準密度離心程序分離PBMC，且將其以5×106 細胞/毫升懸浮於RPMI細胞培養基中；ii)將該等靶細胞藉由標準組織培養方法生長，自具有高於90%之生存力之指數生長期收集，以RPMI細胞培養基洗滌，以100微居裏之51Cr標記，以細胞培養基洗滌兩次，且在細胞培養基中以105細胞/毫升之濃度再懸浮；iii)將100微升上文之最終靶細胞懸浮液轉移至96孔微量滴定盤；iv)在細胞培養基中將抗體自4000 ng/ml連續稀釋至0.04 ng/ml，且將50微升所得抗體溶液添加至96孔微量滴定盤中之靶細胞中，重複三次測試涵蓋上文所有濃度範圍之各種抗體濃度；v)對於最大釋放(MR)對照組而言，在含有標記靶細胞之盤中之3個額外孔接受50微升之2%(v/v)非離子清潔劑水溶液(Nonidet,Sigma,St.Louis)，而非抗體溶液(上文之點iv)。
vi)對於自發釋放(SR)對照組而言，在含有標記靶細胞之盤中之3個額外孔接受50微升之RPMI細胞培養基，而非抗體溶液(上文之點iv)；vii)隨後以50 x g離心96孔微量滴定盤1分鐘且在4℃培育1小時；viii)將50微升PBMC懸浮液(上文之點i)添加至各孔中以產生25：1之效應細胞與靶細胞的比率且將該等盤置於在37℃下5% CO2 氣氛下之恆溫箱中歷時4小時；ix)收集來自各孔之無細胞上清液且使用γ計數器量化實驗釋放放射能(ER)；x)對於各抗體濃度根據(ER－MR)/(MR－SR)×100計算特異性溶解百分數，其中ER係對該抗體濃度所量化之平均放射能(見上文點ix)，MR係對該等MR對照組(見上文點v)所量化之平均放射能(見上文點ix)，且SR係對該等SR對照組(見上文點vi)所量化之平均放射能(見上文點ix)；4)"ADCC增加"係定義為在上文測試之抗體濃度範圍內所觀察之特異性溶解之最大百分數的增加，及/或為達成在上文測試之抗體濃度範圍內所觀察之特異性溶解最大百分數一半所需要之抗體濃度的減少。ADCC之增加係相對於使用相同標準之產生、純化、調配及儲存方法(該等方法對於熟習此項技術者已知)、藉由相同類型之宿主細胞產生、藉由相同抗體介導、以上文檢定量測之ADCC而言，但該ADCC並非藉由經設計以過度表現GnTIII之宿主細胞產生。
在一態樣中，本發明係關於一種具有大鼠ICR62結合特異性(意即，大體上結合至相同抗原決定部位)之抗原結合分子，且係關於發現其效應功能可藉由改變之糖基化來增強。在一實施例中，該抗原結合分子係嵌合抗體。在一較佳實施例中，本發明係針對於一種嵌合抗體或其片段，其包含任意SEQ ID NO：53－108及/或SEQ ID NO：122－127之一或多個(例如一、二、三、四、五或六個)CDR。特定而言，在一較佳實施例中，本發明係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含：(a)一選自由以下各序列組成之群之序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：122及SEQ ID NO：124；(b)一選自以下各序列組成之群之序列：SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106及SEQ ID NO：126；及(c)SEQ ID NO：108。在另一較佳實施例中，本發明係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含：(a)一選自由SEQ ID NO：112與SEQ ID NO：114組成之群之序列；(b)一選自由SEQ ID NO：116與SEQ ID NO：118組成之群之序列；及(c)SEQ ID NO：119。在一實施例中，任意此等聚核苷酸皆編碼融合多肽。
在另一實施例中，該抗原結合分子包含藉由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2編碼之大鼠ICR62抗體或其變異體之VH 域；及一非鼠科多肽。在另一較佳實施例中，本發明係針對於一種抗原結合分子，其包含藉由SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44編碼之大鼠抗體或其變異體之VL 域及一非鼠科多肽。
在另一態樣中，本發明係針對於一種抗原結合分子，其包含一或多個(例如一、二、三、四、五或六個)ICR62之經截斷CDR。該等經截斷CDR應至少含有給定CDR之特異性決定胺基酸殘基。"特異性決定殘基"意味在與抗原相互作用中所直接涉及之彼等殘基。通常，在給定CDR中僅約五分之一至三分之一殘基參與結合至抗原。在特別CDR中之特異性決定殘基可藉由(例如)根據Padlan等人，FASEB J.9(1) ：133－139(1995)所描述方法計算來自三維模型分子間接觸及確定在給定殘基位置處之序列可變性來鑑定，該文獻之全部內容以引用的方式併入本文中。
因此，本發明亦係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含至少一個(例如，一、二、三、四、五或六個)大鼠ICR62抗體之互補決定區或其至少含有該互補決定區之特異性決定殘基之變異體或截斷形式，其中該經分離聚核苷酸編碼融合多肽。較佳地，此等經分離聚核苷酸編碼係抗原結合分子之融合多肽。在一實施例中，該聚核苷酸包含三個大鼠ICR62抗體互補決定區或其至少含有各該等三個互補決定區之特異性決定殘基之變異體或截斷形式。在一實施例中，該聚核苷酸包含至少一個在下表2－5中闡述之CDR。在另一實施例中，該聚核苷酸編碼嵌合(例如人化)抗體之輕鏈或重鏈的整個可變區。本發明進一步係針對於藉由此等聚核苷酸編碼之多肽。
在另一實施例中，本發明係針對於一種抗原結合分子，其包含至少一個(例如一、二、三、四、五或六個)大鼠ICR62抗體互補決定區或其至少含有該互補決定區之特異性決定殘基之變異體或截斷形式，且包含一源自異種多肽之序列。在一實施例中，該抗原結合分子包含三個大鼠ICR62抗體互補決定區或其至少含有各該等三個互補決定區之特異性決定殘基之變異體或截斷形式。在一實施例中，該抗原結合分子包含至少一個在下表2－5中闡述之CDR。在另一態樣中，該抗原結合分子包含抗體輕鏈或重鏈區之可變區。在一特別有用之實施例中，該抗原結合分子係嵌合(例如人化)抗體。本發明亦係針對於製造此等抗原結合分子之方法，及其在治療疾病中之用途，該等疾病特別為其中表現EGFR之細胞增殖疾病，特別為與相同細胞類型之正常組織相比其中異常表現EGFR(例如，過度表現)之細胞增殖疾病。此等疾病包括(但不限於)膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、皮膚癌及腎癌。EGFR表現水平可藉由此項技術中已知之方法及本文描述之彼等方法(例如經由免疫組織化學檢定、免疫螢光檢定、免疫酶檢定、ELISA、流式細胞術、放射免疫檢定、西方墨點法、配位體結合、激酶活性等)來確定。
本發明亦係針對於一種活體內或活體外靶向表現EGFR之細胞之方法。可靶向表現EGFR之細胞用於治療目的(例如，治療可藉由(例如)經由阻斷配位體結合而中斷EGFR－介導之訊號或藉由靶向經由免疫系統破壞之EGFR－表現細胞來治療的病症)。在一實施例中，本發明係針對於一種在一受檢者中靶向表現EGFR之細胞之方法，其包含對該受檢者投與包含本發明之ABM之組合物。亦可靶向表現EGFR之細胞以用於診斷目的(例如，確定其是否表現EGFR，正常表現或異常表現)。因此，本發明亦係針對於活體內或活體外偵測EGFR或表現EGFR之細胞存在的方法。根據本發明，一偵測EGFR表現之方法包含：在允許於ABM與EGFR之間形成錯合物之條件下使待測試樣品與本發明之ABM相接觸(視情況以對照樣品與本發明之ABM相接觸)來執行。接著偵測該錯合物形成(例如藉由ELISA或此項技術中已知之其他方法)。當與該測試樣品一起使用對照樣品時，在比較測試樣品與對照樣品時，ABM－EGFR錯合物形成中之任意統計上之顯著差異皆預示EGFR存在於測試樣品中。
已知在抗－EGFR抗體之治療功效中涉及若干機制，其包括阻斷配位體(例如，EGF、TGF－α等)與EGFR結合及隨後之活化訊號途徑、抗體依賴細胞毒性(ADCC)及誘導生長停止或最終分化。
在PCT出版號WO 95/20045中討論大鼠單株抗體ICR62(IgG2b)，該案之全文以引用的方式併入本文中。其係針對於EGFR之C抗原決定部位，且顯示抑制配位體結合、抑制表現EGFR之鱗狀細胞癌瘤的活體外生長及在無胸腺小鼠中誘發腫瘤異種移植退化(WO 95/20045；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996))。作為完全齧齒動物抗體，即使按照單一劑量將ICR62大鼠單株抗體投與至人類引起在一些病患中之HARA反應。(WO 95/20045；Modjtahedi等人，Br.J.Cancer 73：228－235(1996))。
已描述嵌合小鼠/人類抗體。參見(例如)Morrison,S.L.等人，PNAS I1：6851－6854(l984年11月)；歐洲專利公開案第173494號；Boulianna ,G.L等人，Nature 312：642(1984年12月)；Neubeiger,M.S.等人，Nature 314：268(1985年3月)；歐洲專利公開案第125023號；Tan等人，J.Immunol. 135：8564(1985年11月)；Sun,L.K等人，Hybridoma 5(1)：517(1986)；Sahagan等人，J.Immunol. 137：1066－1074(1986)。通常參見Muron,Nature 312：597(1984年12月)；Dickson,Genetic Engineering News 5(3)(1985年3月)；Marx,Science 229：455(1985年8月)及Morrison,Science 229：1202－1207(1985年9月)。IMC－C225(Erbitux,Imclone)係針對性抗－EGFR且具有一小鼠可變區及一人類恆定區之嵌合單株抗體(參見Herbst與Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。IMC－225之鼠科部分係源於M225，發現其結合EGFR且抑制EGF－誘發之酪胺酸激酶依賴磷酸化以及誘發在過度表現EGFR之腫瘤細胞株中之凋亡(Herbst與Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。然而，在第I階段臨床實驗中M225引起以該抗體治療之病患之HAMA反應(Herbst與Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。已將IMC－225在活體內與活體外進行測試，且將其與放射療法與化學療法組合用於許多腫瘤類型中，該等腫瘤類型包括與較差預後相關聯之彼等類型(Herbst與Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。然而，在臨床實驗中，在投與IMC－225抗體之病患中IMC－225與諸如過敏及皮膚反應之毒性相關聯(Herbst與Shin,Cancer 94：1593－1611(2002))。
在一特別較佳實施例中，本發明之嵌合ABM係人化抗體。用於人化非人類抗體之方法在此項技術中已知。舉例而言，本發明之人化ABM可根據Winter之美國專利第5,225,539號、Queen等人之美國專利第6,180,370號、Adair等人之美國專利第6,632,927號或Foote之美國專利申請公開案第2003/0039649號之方法製備，各該等案之全部內容均以引用的方式併入本文中。較佳地，人化抗體具有一或多個自非人類源引入之胺基酸殘基。此等非人類胺基酸殘基常稱作"輸入"殘基，其通常取自"輸入"可變域。人化可大體上按照Winter及合作者之方法(Jones等人，Nature ,321：522－525(1986)；Riechmann等人，Nature ,332：323－327(1988)；Verhoeyen等人，Science ,239：1534－1536(1988))藉由取代高可變區序列為相應之人類抗體序列來執行。因此，此等"人化"抗體係嵌合抗體(美國專利第4,816,567號)，其中大體上小於完整人類可變域已藉由來自非人類物種之相應序列取代。實際上，人化抗體通常係人類抗體，其中部分高可變區殘基及可能一些FR殘基經來自齧齒動物抗體中之類似位點之殘基取代。該主題人化抗－EGFR抗體應包含人免疫球蛋白之恆定區。
用於製造人化抗體之人類輕鏈可變區與重鏈可變區的選擇對於減少抗原性非常重要。根據所謂之"最適"方法，針對全部已知人類可變域序列庫篩選齧齒動物抗體之可變域序列。接著，接受最接近於齧齒動物序列之人類序列作為人化抗體之人類框架區(FR)(參見Sims等人，J.Immunol. ,151：2296(1993)；Chothia等人，J.Mol.Biol. ,196：901(1987))。選擇人類框架序列之另一方法係針對相應於齧齒動物之框架亞區(例如，如藉由Kabat編碼確定)之已知人類可變區序列庫來比較整個齧齒動物框架之各單獨亞區(意即FR1、FR2、FR3及FR4)或該等亞區(例如，FR1與FR2)之一些組合的序列，且選擇最接近齧齒動物序列之各亞區或組合之人類序列(Leung，美國專利申請公開案第2003/0040606A1號，2003年2月27日公開)(其全部內容以引用的方式併入本文中)。另一方法使用一源於輕鏈或重鏈特別亞類之所有人類抗體的一致序列的特別框架區。相同框架可用於若干不同人化抗體(Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci. USA,89：4285(1992)；Presta等人，J.Immunol. ,151：2623(1993))(該等文獻之全部內容以引用的方式併入本文中)。
保持高抗原親和力及其他有利生物學性質之人化抗體更重要。為達成此目的，根據一較佳方法，人化抗體藉由使用親本序列與人化序列之三維模型分析親本序列與多種概念上之人化產物之方法來製備。三維免疫球蛋白模型可使用熟習此項技術者所熟悉之電腦程式(例如InsightII,Accelrys,Inc.(從前為MSI)或在http：//swissmodel.expasy.org)而產生。此等電腦程式可示意性說明且顯示所選候選免疫球蛋白序列之大概三維構形結構。該等顯示之檢查允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列機能中之可能作用，意即分析影響候選免疫球蛋白結合至其抗原之能力的殘基。以此方式，可選擇FR殘基，且將FR殘基自接受者與輸入序列中組合使得達成諸如增加之對該(等)靶抗原之親和力之所要抗體特徵。通常，高可變區殘基係直接且大體上涉及影響抗原結合。
在另一實施例中，本發明之抗體包含一人類Fc區。在一特別實施例中，該人類恆定區係如SEQ ID NO：109與110所闡述之IgG1，且於下文闡述：IgG1核苷酸序列(SEQ ID NO：110)ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
IgG1胺基酸序列(SEQ ID NO：109)TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
然而，人類Fc區之變異體與同功異型物亦係涵蓋於本發明中。舉例而言，適用於本發明中之變異體Fc區可根據在如下文獻中所教示之方法來產生：Presta之美國專利第6,737,056號(具有歸因於一或多種胺基酸修飾之經改變效應功能之Fc區變異體)，或美國專利申請第60/439,498、60/456,041、60/514,549號，或WO 2004/063351(具由歸因於胺基酸修飾之經增加結合親和力之變異體Fc區)，或美國專利申請第10/672,280號或WO 2004/099249(具有歸因於胺基酸修飾之對FcγR經改變結合性之Fc變異體)，各文獻之全部內容均以引用的方式併入本文中。
在另一實施例中，根據(例如)在Balint等人之美國專利申請公開案第2004/0132066號中揭示之方法設計本發明之抗原結合分子以使其具有增強之結合親和力，該文獻之全部內容以引用的方式併入本文中。
在一實施例中，本發明之抗原結合分子共軛至諸如放射性標記或毒素之額外部分。此等共軛ABM可藉由眾多此項技術中熟知之方法產生。
多種放射性核可應用於本發明，且熟習此項技術者應具備容易地確定在多種情況下哪一放射性核最適合之能力。舉例而言，1 3 1 碘係用於靶向免疫療法之熟知放射性核。然而，1 3 1 碘之臨床可用性可藉由包括下列因素之若干因素限定：八日物理半衰期；在血液與腫瘤位點中碘化抗體之脫鹵素作用；及對於在腫瘤中定位劑量沉積最不理想之發射特徵(例如，大γ組份)。隨著優良螯合劑的出現，將金屬螯合基附著於蛋白之機會增加應用諸如諸如1 1 1 銦及9 0 釔之其他放射核的機會。對於在放射性免疫治療應用中應用而言，9 0 釔提供若干優勢：9 0 釔之64小時半衰期對於允許藉由腫瘤積累抗體係足夠長，且與(例如)1 3 1 碘不同，9 0 釔係在組織中100至1000細胞直徑範圍內於其衰減中不伴隨γ輻射之高能量的純 發射體。此外，最小量貫穿輻射允許對於門診病患投與9 0 釔標記抗體。另外，對於殺死細胞不需要標記抗體內化，且電離輻射之局部發射應對於缺乏靶抗原之鄰近腫瘤細胞係致命的。
9 0 釔標記抗－EGFR抗體之有效單一治療劑量(意即，治療有效劑量)範圍在約5與約75 mCi之間，更佳在約10與約40 mCi之間。1 3 1 碘標記抗－EGFR抗體之有效單一治療非髓去除劑量範圍在約5與約75 mCi之間，更佳在約5與約40 mCi之間。1 3 1 碘標記抗－EGFR抗體之有效單一治療去除劑量(意即，可需要自體性骨髓移植)範圍在約30與約600 mCi之間，更佳在約50與小於約500 mCi之間。結合嵌合抗－EGFR抗體，由於與鼠科抗體相比更長之循環半衰期，1 3 1 碘標記之嵌合抗－EGFR抗體之有效單一治療非髓去除劑量範圍在約5與約40 mCi之間，更佳為小於約30 mCi。對於例如1 1 1 銦標記之成像基準通常小於約5 mCi。
對於放射性標記抗－EGFR抗體而言，用其之療法亦可使用單一療法治療或使用多重治療來進行。由於放射核組份，較佳在治療前，對於潛在經歷輻射引起之致命骨髓毒性之病患"收集"周邊幹細胞("PSC")或骨髓("BM")。使用標準技術收集BM及/或PSC，且接著淨化且冷凍以用於可能之再輸注。另外，最佳在治療前，對病患使用診斷標記抗體(例如，使用1 1 1 銦)進行診斷劑量測定研究，其目的係確保治療標記抗體(例如使用9 0 釔)將不會不必要地在任意正常器官或組織中"集中"。
在一較佳實施例中，本發明係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含一編碼具有在下表7中之胺基酸序列之多肽的序列。在一較佳實施例中，本發明係針對於一種經分離聚核苷酸，其包含一在下表6中所示之序列。本發明進一步係針對於一種經分離核酸，其包含一與在下表6中所示之核苷酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同之序列。在另一實施例中，本發明係針對於一種經分離核酸，其包含一編碼多肽之序列，該多肽具有與表7中之胺基酸序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同之胺基酸序列。本發明亦涵蓋一種經分離核酸，其包含一編碼多肽之序列，該多肽具有具保守胺基酸取代之表7中之任意結構的胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明係針對於一種表現載體及/或一種宿主細胞，其包含一或多個本發明之經分離聚核苷酸。
通常，可使用任意類型之培養細胞株來表現本發明之ABM。在一較佳實施例中，使用HEK293－EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞作為本底細胞株以產生本發明之經設計宿主細胞。
本發明之ABM的治療功效可藉由在另外表現一編碼具GnTIII活性之多肽之聚核苷酸的宿主細胞中產生其來增強。在一較佳實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含高爾基體固有多肽之高爾基體定位域之融合多肽。在另一較佳實施例中，本發明之ABM於表現編碼具有GnTIII活性之多肽之聚核苷酸的宿主細胞中之表現導致ABM具有增加之Fc受體結合親和力及增加之效應功能。因此，在一實施例中，本發明係針對於一種宿主細胞，其包含(a)經分離核酸，其包含一編碼具有GnTIII活性之多肽的序列；及(b)經分離聚核苷酸，其編碼結合人類EGFR之諸如嵌合、靈長類化或人化抗體之本發明ABM。在一較佳實施例中，具有GnTIII活性之多肽係包含GnTIII催化域之融合多肽且高爾基體定位域係甘露糖苷酶II之定位域。用於產生此等融合多肽及使用其以產生具有增加之效應功能之抗體的方法係在美國臨時專利申請案第60/495,142號及美國專利申請公開案第2004/0241817 A1號中揭示，各文獻之全部內容均以引用的方式清楚併入本文中。在另一較佳實施例中，該嵌合ABM係具有大鼠ICR62抗體結合特異性之嵌合抗體或其片段。在一特別較佳實施例中，該嵌合抗體包含人類Fc。在另一較佳實施例中，該抗體係靈長類化或人化抗體。
在一實施例中，編碼本發明之ABM之一或若干種聚核苷酸可在構成型啟動子或者調節表現系統控制下得以表現。適合之調節表現系統包括(但不限於)四環素調節表現系統、蛻皮激素可誘發之表現系統、lac－switch表現系統、糖皮質激素可誘發之表現系統、溫度可誘發之啟動子系統及親金屬蛋白金屬可誘發之表現系統。若編碼本發明之ABM之若干不同核酸包含在宿主細胞株統中，則一些核酸可在構成型啟動子控制下得以表現，而其他核酸則在調節啟動子控制下得以表現。最大表現水平理解為對細胞生長速率無顯著不利影響之穩定多肽表現的可能最高水平，且應使用常規實驗確定。表現水平藉由此項技術者通常已知之方法確定，該等方法包括使用對於ABM具有特異性之抗體或對於融合至該ABM中之肽標記具有特異性之抗體的西方墨點法分析及北方墨點法分析。在另一選擇中，該聚核苷酸可操作地聯接至一報導基因；具有大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性之嵌合(例如，人化)ABM的表現水平藉由量測與該報導基因之表現水平有相互關係之訊號來確定。該報導基因可連同編碼該融合多肽之該(等)核酸轉錄為單一mRNA分子；其各自編碼序列可藉由內部核糖體進入位點(IRES)或藉由帽依賴轉譯強化子(CITE)聯接。該報導基因可連同至少一個編碼具有大鼠ICR62抗體大體上相同之結合特異性之嵌合(例如，人化)ABM的核酸轉譯，使得形成一單一多肽鏈。編碼本發明之AMB之核酸可在單一啟動子之控制下可操作地聯接至報導基因，使得編碼融合多肽之核酸與報導基因轉錄為RNA分子，其選擇地拼接至兩單獨信使RNA(mRNA)分子中；所得之mRNA中之一個轉譯為該報導蛋白，且另一個轉譯為該融合多肽。
可使用熟習此項技術者熟知之方法以構建含有具有大鼠ICR62抗體大體上相同之結合特異性之ABM之編碼序列連同適合之轉錄/轉譯控制訊號的表現載體。此等方法包括活體外重組DNA技術、合成技術及活體內重組/基因重組。參見(例如)在Maniatis等人，MOlecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1989)與Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y(1989)中描述之技術。
可應用多種宿主表現載體系統以表現本發明之ABM之編碼序列。較佳地，使用哺乳動物細胞作為宿主細胞系統，其以含有重要蛋白之編碼序列及融合多肽之編碼序列的重組質體DNA或黏質體DNA表現載體轉染。最佳地，使用HEK293－EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞作為宿主細胞系統。表現系統與選擇方法之一些實例在以下參考文獻及其中之參考文獻中描述：Borth等人，Biotechnol.Bioen. 71(4)：266－73(2000－2001)；Werner等人，Arzneimittelforschung /Drug Res. 48(8)：870－80(1998)；Andersen與Krummen，Curr.Op.Biotechnol. 13：117－123(2002)；Chadd與Chamow,Curr.Op.Biotechnol. 12：188－194(2001)及Giddings,Curr.Op.Biotechnol. 12：450－454(2001)。在一替代實施例中，可使用其他真核宿主細胞系統，其包括以含有本發明之ABM之編碼序列的重組酵母表現載體轉化之酵母細胞，諸如在美國專利申請第60/344,169號及WO 03/056914(用於在非人類真核宿主細胞中產生類人類糖蛋白的方法)中所教示之表現系統(各文獻之全部內容以引用的方式併入本文中)；以含有具有大鼠ICR62抗體大體上相同之結合特異性之嵌合ABM之編碼序列的重組病毒表現載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統；以重組病毒表現載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)干擾或以含有本發明之ABM之編碼序列的重組質體表現載體(例如，Ti質體)轉化的植物細胞系統，該等植物細胞系統包括(但不限於)在美國專利第6,815,184號(用於自經基因設計之浮萍表現及分泌生物活性多肽的方法)、WO 2004/057002(藉由引入糖基轉移酶基因在苔蘚植物細胞中產生糖基化蛋白)及WO 2004/024927(在苔蘚原生質體中產生細胞外異種非植物蛋白之方法)及美國專利申請第60/365,769號、第60/368,047號及WO 2003/078614(在包含功能性哺乳動物GnTIII酶之轉基因植物中進行糖蛋白加工)中所教示之表現系統(各文獻之全部內容均以引用的方式併入本文中)；或以重組病毒表現載體(例如，腺病毒、牛痘病毒)感染之動物細胞系統，該等動物細胞系統包括經設計以含有在雙微小染色體中穩定擴增(CHO/dhfr)或不穩定擴增之編碼具有大鼠ICR62抗體大體上相同之結合特異性之嵌合ABM之DNA多重複本的細胞系(例如鼠科細胞系)。在一實施例中，包含編碼本發明之ABM之該(等)聚核苷酸的載體係多順反子性的。同樣，在一實施例中，上文討論之ABM係抗體或其片段。在一較佳實施例中，ABM係人化抗體。
對於本發明之方法而言，穩定表現通常對於瞬時表現較佳，因為其通常達成更可再生結果且亦係更服從大規模產生。勝於使用含有複製病毒源之表現載體，宿主細胞可以藉由適合之表現控制元素(例如，啟動子、強化子、序列、轉錄終止子、多腺苷醯位點等)及可選擇標記控制之各自編碼核酸轉化。繼引入外來DNA之後，可允許經設計細胞在一濃縮培養基中生長1－2日，且接著轉換至一選擇培養基。在重組質體中之可選擇標記對選擇賦予抗性，且允許選擇已穩定整合該質體至其染色體中且生長以形成結合可經選殖且擴展為細胞株之變異區的細胞。
可使用許多選擇系統，其包括(但不限於)單純疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11 ：223(1977))、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Szybalska & Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48 ：2026(1962))及腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(Lowy等人；Cell 22 ：817(1980))基因，其各自可用於tk細胞、hgprt細胞或aprt細胞中。同樣，可使用抗代謝物抗性作為對dhfr、gpt、neo及hygro基因選擇之基礎，dhfr賦予對於胺甲喋呤(methotrexate)之抗性(Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA 77 ：3567(1989)；O'Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78 ：1527(1981))；gpt賦予對於黴酚酸之抗性(Mulligan & Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78 ：2072(1981))；neo賦予對於胺基糖苷G－418之抗性(Colberre－Garapin等人，J.Mol.Biol.150 ：1(1981))；hygro賦予對於潮黴素(hygromycin)之抗性(Santerre等人，Gene 30 ：147(1984))。近來，已描述額外之可選擇基因，即trpB、hisD、麩醯胺酸合成酶系統及ODC，trpB允許細胞利用吲哚代替色胺酸；hisD允許細胞利用甲胺乙吡啶醇(histinol)代替組胺酸(Hartman & Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ：8047(1988))；ODC(鳥胺酸脫羧酶)賦予對於鳥胺酸脫羧酶抑制劑2－(二氟甲基)－DL－鳥胺酸DFMO之抗性(McConlogue,在：Current Communications in Molecular Biology ,Cold Spring Harbor Laboratory ed.(1987))。
本發明進一步係針對於一種修飾藉由宿主細胞產生之本發明ABM的糖基化概況之方法，其包含在該宿主細胞中表現編碼本發明之ABM的核酸及編碼具有GnTIII活性之多肽的核酸或包含此等核酸之載體。較佳地，該經修飾多肽係IgG或其包含Fc區之片段。在一特別較佳實施例中，該ABM係人化抗體或其片段。
作為修飾之結果，藉由本發明之宿主細胞產生之經修飾ABM展示增加之Fc受體結合親和力及/或增加之效應功能。在一特別較佳實施例中，該ABM係人化抗體或其含有Fc區之片段。較佳地，增加之Fc受體結合親和力係對於諸如FcγRIIIa受體之Fc活化受體之結合增加。增加之效應功能較佳係一或多種以下之功能效應的增加：增加之抗體依賴細胞毒性、增加之抗體依賴細胞噬菌作用(ADCP)、增加之細胞因子分泌、增加之免疫錯合物介導之藉由抗原表現細胞之抗原遞呈、增加之Fc介導細胞毒性、增加之對NK細胞之結合、增加之對巨噬細胞之結合、增加之對多形核細胞(PMN)之結合、增加之對單核細胞之結合、增加之靶向結合抗體之交聯、增加之直接訊號誘導之凋亡、增加之神經樹突細胞成熟及增加之T細胞引動。
本發明亦係針對於用於一種在一宿主細胞中產生具有經修飾寡醣之本發明ABM的方法，其包含(a)在允許產生根據本發明之ABM的條件下，培養一宿主細胞，其經設計以表現至少一個編碼具有GnTIII活性之多肽的核酸，其中該具有GnTIII活性之多肽係以足以修飾處於藉由該宿主細胞之產生之該ABM之Fc區中之寡醣的量表現；及(b)分離該ABM。在一較佳實施例中，該具有GnTIII活性之多肽係包含GnTIII之催化域之融合多肽。在一特別較佳實施例中，該融合多肽另外包含一高爾基體固有多肽之高爾基體定位域。
較佳地，該高爾基體定位域係甘露糖苷酶II或GnTI之定位域。或者，該高爾基體定位域係選自由以下各定位域組成之群：甘露糖苷酶I之定位域、GnTII之定位域及α1－6核心岩藻糖基轉移酶之定位域。藉由本發明之方法產生之ABM具有增加之Fc受體結合親和力及/或增加之效應功能。較佳地，該增加之效應功能係一或多種以下之效應功能：增加之Fc介導細胞毒性(包括增加之抗體依賴細胞毒性)、增加之抗體依賴細胞噬菌作用(ADCP)、增加之細胞因子分泌、增加之免疫錯合物介導之藉由抗原表現細胞的抗原遞呈、增加之對NK細胞之結合、增加之對巨噬細胞之結合、增加之對單核細胞之結合、增加之對多形核細胞之結合、增加之直接訊號誘導之凋亡、增加之靶向結合抗體之交聯、增加之神經樹突細胞成熟或增加之T細胞引動。該增加之Fc受體結合親和力較佳係對於諸如FcγRIIIa之Fc活化受體結合之增加。在一特別較佳實施例中，該ABM係人化抗體或其片段。
在另一實施例中，本發明係針對於一種藉由本發明之方法產生之具有大鼠ICR62抗體大體上相同結合特異性的嵌合ABM，其在該多肽之Fc區中具有增加之對分寡醣比例。預期此ABM涵蓋包含Fc區之抗體及其片段。在一較佳實施例中，該ABM係人化抗體。在一實施例中，在ABM之Fc區中之對分寡醣之百分數為總寡醣之至少50%，更佳為至少60%、至少70%、至少80%或至少90%，且最佳為至少90－95%。在又一實施例中，作為藉由本發明之方法修飾其寡醣之結果，藉由本發明產生之ABM在Fc區具有增加之非岩藻糖基化寡醣之比例。在一實施例中，非岩藻糖基化寡醣之百分數為至少50%，較佳為至少60%至70%，最佳為至少75%。該等非岩藻糖基化寡醣可係雜交類型或錯合物類型。在一特別較佳實施例中，藉由本發明之宿主細胞與方法產生之ABM在Fc區具有增加之對分、非岩藻糖基化寡醣之比例。該對分、非岩藻糖基化寡醣可係雜合物或錯合物。特別而言，本發明之方法可用於產生ABM，其中在ABM之Fc區中至少15%、更佳至少20%、更佳至少25%、更佳至少30%、更佳至少35%之寡醣係對分、非岩藻糖基化寡醣。本發明之方法亦可用於產生多肽，其中在多肽之Fc區中至少15%、更佳至少20%、更佳至少25%、更佳至少30%、更佳至少35%之寡醣係對分雜交非岩藻糖基化寡醣。
在另一實施例中，本發明係針對於一種藉由本發明之方法產生之經設計以具有增加之效應功能及/或增加之Fc受體結合親和力之具有大鼠ICR62抗體大體上相同結合特異性的嵌合ABM。較佳地，該增加之效應功能係一或多種以下之效應功能：增加之Fc介導細胞毒性(包括增加之抗體依賴細胞毒性)、增加之抗體依賴細胞噬菌作用(ADCP)、增加之細胞因子分泌、增加之免疫錯合物介導之藉由抗原表現細胞的抗原遞呈、增加之對NK細胞之結合、增加之對巨噬細胞之結合、增加之對單核細胞之結合、增加之對多形核細胞之結合、增加之直接訊號誘導之凋亡、增加之靶向結合抗體之交聯、增加之神經樹突細胞成熟或增加之T細胞引動。在一較佳實施例中，該增加之Fc受體結合親和力係對於Fc活化受體、最佳對於FcγRIIIa之結合的增加。在一實施例中，該ABM係抗體、含有Fc區之抗體片段或包括一相當於免疫球蛋白之Fc區之區的融合蛋白。在一特別較佳實施例中，該ABM係人化抗體。
本發明進一步係針對於包含本發明之ABM及醫藥學上可接受之載劑之醫藥組合物。
本發明進一步係針對於此等醫藥組合物在癌症治療之方法中之用途。特別而言，本發明係針對於一種治療癌症之方法，其包含投與治療有效劑量之本發明之醫藥組合物。
本發明進一步提供產生及使用宿主細胞系統以產生本發明之糖型ABM的方法，該等ABM具有增加之Fc受體結合親和力(較佳增加之對Fc活化受體之結合)及/或具有增加之包括抗體依賴細胞毒性之效應功能。可用於本發明之ABM之糖基化設計方法學在美國專利第6,602,684號、美國專利申請公開案第2004/0241817 A1號、美國專利申請公開案第2003/0175884 A1號、臨時美國專利申請第60/441,307號及WO 2004/065540中已作更詳細描述，各文獻之全部內容均以引用的方式全部併入本文中。根據在美國專利申請公開案第2003/0157108號(Genentech)或在EP 1176 195 A1、WO 03/084570、WO 03/085119及美國專利申請公開案第2003/0115614號、第2004/093621號、第2004/110282號、第2004/110704號、第2004/132140號(Kyowa)中所揭示之技術，本發明之ABM可選擇地經糖基化設計以在Fc區具有減少之岩藻糖殘基。各該等文獻之全部內容均以引用的方式併入本文中。本發明之糖基化設計之ABM亦可在產生經修飾糖蛋白之表現系統中產生，諸如在美國專利申請公開案第60/344,169號及WO 03/056914(GlycoFi,Inc.)或在WO 2004/057002及WO 2004/024927(Greenovation)中教示之彼等表現系統，各文獻之全部內容均以引用的方式併入本文中。
產生用於產生具有經改變糖基化模式之蛋白的細胞系
本發明提供用於產生具有經修飾糖基化模式之本發明ABM之宿主細胞表現系統。詳言之，本發明提供用於產生具有經改良治療價值之本發明之糖型ABM之宿主細胞系統。因此，本發明提供經選擇或設計以表現具有GnTIII活性之多肽的宿主細胞表現系統。在一實施例中，該具有GnTIII活性之多肽係包含異種高爾基體固有多肽之高爾基體定位域的融合多肽。特別而言，可設計此等宿主細胞表現系統以包含編碼具有GnTIII之多肽的重組核酸分子，該重組核酸分子可操作地聯接至一構成或調節啟動子系統。
在一特別實施例中，本發明提供一種經設計以表現至少一個編碼具有GnTIII活性且包含異種高爾基體固有多肽之高爾基體定位域之融合多肽的核酸的宿主細胞。在一態樣中，該宿主細胞係以一包含至少一個編碼具有GnTIII活性且包含異種高爾基體固有多肽之高爾基體定位域之融合多肽之基因的核酸分子設計。
通常，包括上文討論之細胞株之任意類型之培養細胞株皆可用作本底以設計本發明之宿主細胞株。在一較佳實施例中，使用HEK293－EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER.C6細胞或融合瘤細胞、其他哺乳動物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞或植物細胞作為本底細胞株，以產生本發明之經設計宿主細胞。
本發明預期涵蓋表現具有GnTIII活性之多肽之任意經設計宿主細胞，該多肽包括一包含如本文所界定之異種高爾基體固有多肽之高爾基體定位域之融合多肽。
編碼具有GnTIII活性之多肽之一或若干種核酸可在一構成型啟動子或者一調節之表現系統控制下得以表現。此等系統在此項技術中熟知且包括上文討論之系統。若編碼具有GnTII活性且包含異種高爾基體固有多肽之高爾基體定位域之融合蛋白的若干不同核酸包含於該宿主細胞系統內，則一些核酸可在構成型啟動子控制下得以表現，而其他核酸則在調節啟動子之控制下得以表現。具有GnTIII活性之融合多肽之表現水平係藉由此項技術中通常已知之方法來確定，該等方法包括西方墨點法分析、北方墨點法分析、報導基因表現分析或GnTIII活性之量測。或者，可使用結合至GnTIII之生物合成產物的凝集素，例如E4 －PHA凝集素。或者，可使用量測藉由抗體介導之增加之Fc受體結合或增加之效應功能的功能分析，該等抗體藉由以編碼具GnTIII活性之多肽之核酸設計的細胞產生。
鑑定表現具有經修飾糖基化模式之蛋白的轉染物或轉化物
含有具有大鼠ICR62抗體大體上相同結合特異性之嵌合(例如，人化)ABM之編碼序列且表現生物活性基因產物之宿主細胞可藉由以下至少四種通用方法鑑定：(a)DNA－DNA或DNA－RNA雜交；(b)存在或缺乏"標記"基因功能；(c)在宿主細胞中如藉由各自mRNA轉錄物表現量測評估轉錄水平；及(d)如藉由免疫檢定或藉由其生物活性量測偵測基因產物。
在第一方法中，具有大鼠ICR62抗體大體上相同結合特異性之嵌合(例如，人化)ABM之編碼序列與具有GnTIII活性之多肽之編碼序列的存在可使用包含核苷酸序列之探針藉由DNA－DNA或DNA－RNA雜交來偵測，該等核苷酸序列與各自編碼序列、其部分或衍生物係各自同源的。
在第二方法中，重組表現載體/宿主系統可基於某些"標記"基因功能(例如，胸苷激酶活性、對於抗生素之抗性、對於胺甲喋呤之抗性、轉化表型、在桿狀病毒中之包含體形成等)之存在或缺乏來鑑定與選擇。舉例而言，若本發明之ABM之編碼序列或其片段及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列插入載體之標記基因序列內，則含有各自編碼序列之重組體可藉由標記基因功能之缺乏來鑑定。或者，標記基因可與編碼序列在用於控制編碼序列表現之相同或不同啟動子的控制下串聯地放置。響應誘發或選擇而表現標記顯示本發明之ABM之編碼序列及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列的表現。
在第三方法中，本發明之ABM之編碼區或其片段及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列的轉錄活性可藉由雜交檢定來評估。舉例而言，RNA可藉由北方墨點法使用與本發明之ABM之編碼序列或其片段及具有GnTIII活性之多肽之編碼序列或其特別部分同源之探針來分離與分析。或者，可提取與檢定宿主細胞之全部核酸，以與此等探針雜交。
在第四方法中，蛋白產物之表現可作免疫學評估，例如，藉由西方墨點法、諸如放射免疫沉澱、酶聯免疫檢定及類似方式之免疫檢定來評估。然而，表現系統之成功與否的最終測試涉及生物活性基因產物的偵測。
產生與使用具有增加之效應功能(包括抗體依賴細胞毒性)之ABM
在較佳實施例中，本發明提供具有大鼠ICR62抗體大體上相同結合特異性且具有增加之效應功能(包括抗體依賴細胞毒性)之嵌合(例如，人化)ABM的糖型。抗體之糖基化設計先前已進行描述。參見(例如)美國專利第6,602,684號，該案之全文以引用的方式併入本文中。
非共軛單株抗體(mAb)用於治療某些類型癌症的臨床試驗近來已產生鼓舞人心的結果。Dillman,Cancer Biother.& Radiopharm.12 ：223－25(1997)；Deo等人，Immunology Today 18 ：127(1997)。嵌合非共軛IgG1已核准用於低度或濾泡性B－細胞非霍奇金淋巴瘤(non－Hodgkin's lymphoma)。Dillman,Cancer Biother.& Radiopharm.12 ：223－25(1997)。而另一非共軛mAb(靶向實體乳腫瘤之人化IgG1在第III階段臨床試驗中亦已顯示令人期待的效果。Deo等人，Immunology Today 18 ：127(1997)。此等兩種mAb之抗原在其各自之腫瘤細胞中高度表現且該等抗體藉由效應細胞活體內或活體外介導有效之腫瘤破壞。相反，許多其他具良好腫瘤特異性之非共軛mAb不可引發充足有效以至臨床可用的效應功能。Frost等人，Cancer 80 ：317－33(1997)；Surfus等人，J.Immunother.19 ：184－91(1996)。對於某些此等較弱mAb而言，近來已進行測試附屬細胞因子療法。添加細胞因子可藉由增加循環淋巴細胞之活性與數量來刺激抗體依賴細胞毒性(ADCC)。Frost等人，Cancer 80 ：317－33(1997)；Surfus等人，J.Immunother.19 ：184－91(1996)。一旦白血球受體與抗體之恆定區(Fc)結合則誘發ADCC(對抗體靶向細胞之溶解攻擊)。Deo等人，Immunology Today 18 ：127(1997)。
一個增加非共軛IgG1之ADCC活性之不同(但為補充)之方法係設計抗體之Fc區。蛋白設計研究已顯示FcγR與IgG CH2域之更低鉸鏈區相互作用。Lund等人，J.Immunol.157 ：4963－69(1996)。然而，FcγR結合亦需要共價連接於CH2區之保守Asn 297之寡醣的存在。Lund等人，J.Immunol.157 ：4963－69(1996)；Wright與Morrison,Trends Biotech.15 ：26－31(1997)，提出寡醣與多肽二者皆直接有助於相互作用位點，或需要寡醣以保持活性CH2多肽之構形。因此可研究寡醣結構之修飾作為增加相互作用之親和力的方法。
一IgG分子在其Fc區承載兩個N－聯接寡醣，在各重鏈上承載一個。如任意糖蛋白，抗體係作為一共用相同多肽主鏈但具有不同之寡醣連接糖基化位點的糖型群體產生。通常在血清IgG之Fc區發現之寡醣係錯合雙觸型寡醣(Wormald等人，Biochemistry 36 ：130－38(1997)，其具有低含量之終端唾液酸及對分N－乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、及程度可變之終端糖基化及核心岩藻糖基化。一些研究提出對於FcγR結合所需要之最小碳水化合物結構位於寡醣核內。Lund等人，J.Immunol.157 ：4963－69(1996)。
在工業或學術中用以產生非共軛治療mAb的小鼠或倉鼠源細胞株通常將所需要之寡醣決定子連接至Fc位點。然而，在此等細胞株中表現之IgG缺乏於血清IgG中發現之較低量之對分GlcNAc。Lifely等人，Glycobiology 318 ：813－22(1995)。相反，近來觀察到大鼠骨髓瘤產生之人化IgGl(CAMPATH－1H)承載一以其某些糖型之對分GlcNAc。Lifely等人，Glycobiology 318 ：813－22(1995)。但在顯著更低抗體濃度下，如在標準細胞株中產生之CAMPATH－1H抗體，大鼠細胞源抗體達成一相似最大活體外ADCC活性。
CAMPATH抗原通常以高含量存在於淋巴瘤細胞上，且該嵌合mAb在缺乏對分GlcNAc的情況下具有高ADCC活性。Lifely等人，Glycobiology 318 ：813－22(1995)。在N－聯接糖基化途徑中，藉由GnTIII添加對分GlcNAc。Schachter,Biochem.Cell Biol.64 ：163－81(1986)。
先前之研究使用單一抗體產生CHO細胞株，該CHO細胞株先前經設計以用外在調節形式表現經選殖之GnTIII基因酶的不同含量(Umana,P.等人，Nature Biotechnol.17 ：176－180(1999))。該方法首次建立經修飾抗體之GnTIII與ADCC活性表現之間之嚴格相互關係。因此，本發明預期一種具有大鼠ICR62抗體結合特異性、具有由GnTIII活性增加引起之改變之糖基化的重組、嵌合抗體或其片段。GnTIII活性增加導致在ABM之Fc區中之對分寡醣之百分數增加及岩藻糖殘基之百分數下降。該抗體或其片段具有增加之Fc受體結合親和力及增加之效應功能。另外，本發明係針對於包含一相當於免疫球蛋白FC區之區的抗體片段及融合蛋白。在一較佳實施例中，該抗體係人化的。
根據本發明之方法產生之ABM的治療應用
在最廣泛意義上，本發明之ABM可用於活體內或活體外靶向表現EGFR之細胞。可靶向表現EGFR之細胞以用於診斷或治療之目的。在一態樣中，本發明之ABM可用於偵測樣品中之EGFR的存在。在另一態樣中，本發明之ABM可用於抑制或降低EGFR介導之訊號在表現EGFR之細胞表面上之轉導。與相同細胞類型之非腫瘤組織相比，在許多人類腫瘤中EGFR異常表現(例如，過度表現)。因此，本發明之ABM在預防腫瘤形成、根除腫瘤及抑制腫瘤生長中特別有用。藉由阻斷EGFR配位體與EGFR之結合，本發明之ABM抑制EGF依賴腫瘤細胞活化，EGF依賴腫瘤細胞活化包括EGFR酪胺酸磷酸化、增加之細胞外酸化速率及細胞增殖。本發明之ABM亦起阻止細胞循環、引起靶細胞(例如，腫瘤細胞)凋亡及抑制血管生成及/或靶細胞分化的作用。本發明之ABM可用於治療任意表現EGFR之腫瘤。可用本發明之ABM治療之特別惡性腫瘤包括(但不限於)上皮及鱗狀細胞癌瘤、非小細胞肺癌瘤、神經膠質瘤、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳癌、膀胱癌、頭頸癌及腎細胞癌瘤。
本發明之ABM可單獨用於活體內靶向且殺死腫瘤細胞。該等ABM亦可與適合治療劑結合使用以治療人類癌瘤。舉例而言，該等ABM可與諸如化學療法、輻射療法之標準或習知治療方法組合使用或與治療藥物或毒素以及淋巴介質或腫瘤抑制生長因子共軛或聯接以傳遞治療劑至癌瘤位點。最重要之本發明之ABM的共軛物係(1)免疫毒素(ABM與細胞毒素部分之共軛物)及(2)標記(例如，放射性標記、酶標記或螢光物標記)之ABM，其中該標記提供用於鑑定包括標記ABM之免疫錯合物的方法。ABM亦可經由天然補體過程用於誘發溶解，及用於與正常存在之抗體依賴細胞毒素細胞相互作用。
免疫毒素之細胞毒素部分可為細胞毒素藥物或細菌或植物源之酶活性毒素，或此毒素之酶活性片段("鏈")。使用之酶活性毒素及其片段係白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自假單孢菌銅綠菌)、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、蒴蓮素A鏈、－帚麴菌素、油桐蛋白(Aleurites fordii protein)、康乃馨蛋白(dianthin protein)、美洲商陸(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII與PAP－S)、苦瓜抑制劑、麻楓樹蛋白、巴豆毒素、石鹼草(sapaonaria officinalis)抑制劑、天堂果蛋白、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素及依諾黴素。在另一實施例中，該等ABM係與小分子抗癌藥物共軛。使用多種雙官能蛋白偶合劑來製造ABM與此等細胞毒素部分之共軛物。此等試劑之實例係SPDP、IT、諸如二甲基己二醯二胺酯鹽酸鹽之亞胺基酯之雙官能衍生物、諸如辛二酸二琥珀醯亞胺基酯之活性酯、諸如戊二醛之醛、諸如雙(對－疊氮苯甲醯)己二胺)之雙疊氮基化合物、諸如雙－(對－二疊氮鎓苯甲醯基)－乙二胺之雙重氮鎓衍生物、諸如2,6－二異氰酸甲苯酯之二異氰酸酯及諸如1,5－二氟－2,4－二硝基苯之雙活性氟化合物。毒素溶胞部分可連接至ABM之Fab片段。另外適合毒素在此項技術中已知，如在(例如)美國專利申請第2002/0128448號中所公開而證實，該案之全文以引用的方式併入本文中。
在一實施例中，具有大鼠ICR62抗體大體上相同結合特異性之嵌合(例如，人化)、糖基化設計ABM係與蓖麻毒素A鏈共軛。最有利地，該蓖麻毒素A鏈得以去糖基化且經由重組方法產生。製造蓖麻毒素免疫毒素之有利方法係在Vitetta等人，Science 238,1098(1987)中描述，該文獻以參考的形式併入本文中。
當出於診斷目的用於活體外殺死人類癌細胞時，該等共軛物通常應以至少約10 nM之濃度添加至細胞培養基中。對於活體外使用而言，調配物與投藥模式並非關鍵的。通常應使用與培養或灌注培養基相容之水性調配物。細胞毒性可藉由習知之技術讀取以確定癌症之存在或程度。
如上文所討論，用於治療癌症之細胞毒性放射性藥物可藉由將放射性同位素(例如，I、Y、Pr)與具有大鼠ICR62抗體大體上相同結合特異性之嵌合糖基化設計之ABM共軛來製造。如本文所使用，術語"細胞毒素部分"意欲包括此等同位素。
在另一實施例中，將脂質體以細胞毒素藥物填充且將該等脂質體以本發明之ABM塗布。由於在EGFR表現惡性細胞之表面上存在許多EGFR分子，故此方法允許大量藥物向正確細胞類型傳遞。
用於將此等治療劑共軛至抗體之技術係眾所周知的(參見(例如)Arnon等人，"Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy"，於Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 中，Reisfeld等人(編)，第243－56頁(Alan R.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等人，"Antibodies For Drug Delivery"，於Controlled Drug Delivery (第二版)中，Robinson等人(編)，第623－53頁(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review"，於Monoclonal Antibodies'84：Biological And Clinical Applications 中，Pinchera等人(編)，第475－506頁(1985)及Thorpe等人，"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody－Toxin Conjugates",Immunol.Rev .,62：119－58(1982))。
本發明之ABM之其他治療應用包括共軛或聯接(例如，藉由重組DNA技術)至能夠轉化前藥為細胞毒素藥物之酶及使用與該前藥組合之該抗體酶共軛物以在腫瘤位點轉化該前藥為細胞毒素藥劑(參見(例如)Senter等人，"Anti－Tumor Effects of Antibody－alkaline Phosphatase",Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85 ：4842－46(1988)；"Enhancement of thein vitro andin vivo Antitumor Activites of Phosphorylated Mitocycin C and Etoposide Derivatives by Monoclonal Antibody－Alkaline Phosphatase Conjugates",Cancer Research 49：5789－5792(1989)及Senter,"Activation of Prodrugs by Antibody－Enzyme Conjugates：A New Approach to Cancer Therapy,"FASEB J.4 ：188－193(1990))。
本發明之ABM之又一治療用途涉及使用非共軛(在補體存在下)或作為抗體藥物或抗體毒素共軛物之部分以自癌症病患之骨髓移除腫瘤細胞。根據此方法，自體同源骨髓可藉由以抗體處理來活體外淨化，且將骨髓灌輸回病患體內(參見(例如)Ramsay等人，"Bone Marrow Purging Using Monoclonal Antibodies",J.Clin.Immunol. ,8(2)：81－88(1988))。
此外，預期本發明包含單鏈免疫毒素，該單鏈免疫毒素包含允許與大鼠ICR62抗體之大體上相同結合特異性之抗原結合域(例如，包含大鼠ICR62抗體之CDR的多肽)，且另外包含一毒素多肽。本發明之單鏈免疫毒素可用於活體內治療人類癌瘤。
相似地，可使用至少包含連接至至少一種具有抗腫瘤活性之第二蛋白(例如淋巴介質或制瘤素)之官能活性部分之本發明ABM之抗原結合區的融合蛋白，以活體內治療人類癌瘤。
本發明提供一種選擇性殺死表現EGFR之腫瘤細胞的方法。此方法包含使本發明之免疫共軛物(例如，免疫毒素)與該等腫瘤細胞反應。該等腫瘤細胞可係來自人類癌瘤。
另外，本發明提供一種活體內治療癌瘤(例如，人類癌瘤)之方法。此方法包含對受檢者投與治療有效劑量之含有至少一種本發明之免疫共軛物(例如，免疫毒素)的組合物。
在另一態樣中，本發明係針對於一種治療細胞增殖病症之經改良方法，該等病症中表現EGFR，特別異常表現(例如，過度表現)EGFR，該等病症包括膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、皮膚癌及腎癌，該方法包含對需要之人類受檢者投與治療有效劑量之本發明之ABM。在一較佳實施例中，該ABM係具有與大鼠ICR62抗體之結合特異性大體上相同之結合特異性的經糖基化設計抗－EGFR抗體。在另一較佳實施例中，該抗體係人化的。可藉由本發明之ABM來治療之細胞增殖病症之實例包括(但不限於)位於以下部位中之贅瘤：腹部、骨、乳房、消化系統、肝臟、胰腺、腹膜、內分泌腺(腎上腺、副甲狀腺、垂體、睾丸、卵巢、胸腺、甲狀腺)、眼、頭與頸、神經系統(中樞與周邊)、淋巴系統、骨盆、軟組織、脾、胸部及泌尿系統。
相似地，其他細胞增殖病症亦可藉由本發明之ABM來治療。此等細胞增殖病症之實例除包括位於上文所列之器官系統之病症外還包括(但不限於)：高加馬球蛋白血症(hypergammaglobulinemia)、淋巴增殖病症、副蛋白血症、紫瘢、類肉瘤症、賽謝徵候群(Sezary Syndrome)、瓦耳登氏巨球蛋白血症(Waldenstron's Macroglobulinemia)、高切瑞氏病(Gaucher's Disease)、組織細胞增多病及任意其他細胞增殖疾病。
根據本發明之實踐，受檢者可為人類、馬科、豬科、牛科、鼠科、犬科、貓科及鳥類受檢者。其他溫血動物亦可包括在本發明中。
本發明進一步提供抑制人類腫瘤細胞生長、治療受檢者之腫瘤及治療受檢者之增殖型疾病之方法。此等方法包含對該受檢者投與有效劑量之本發明之組合物。
本發明進一步係針對於治療哺乳動物之特徵為異常活化或產生EGFR或一或多種EGFR配位體之非惡性疾病或病症的方法，其包含對該哺乳動物投與治療有效劑量之本發明ABM。該受檢者通常應(例如)在其疾病組織中具有表現EGFR細胞，使得本發明之ABM能夠在該受檢者中結合細胞。
EGFR或EGFR配位體之異常活化或表現可出現於受檢者之細胞中，例如受檢者之疾病組織中。EGFR之異常活化可歸因於EGFR及/或EGFR配位體之放大、過度表現或異常產生。在本發明之一實施例中，應執行診斷或預後性檢定以確定在該受檢者中是否出現EGFR(或EGFR配位體)之異常產生或活化。舉例而言，可確定基因放大及/或EGFR及/或配位體之過度表現。在此項技術中可用用於確定此放大/過度表現之多種檢定，且該等檢定包括IHC、FISH及上文描述之發散抗原檢定。或者或另外地，在樣品中或與樣品相關之諸如TGF－α之EGFR配位體的含量可根據習知程序確定。此等檢定可偵測在待測試樣品中之蛋白及/或編碼其之核酸。在一實施例中，EGFR配位體於一樣品中之含量可使用免疫組織化學(IHC)確定，參見(例如)Scher等人，Clin.Cancer Research 1 ：545－550(1995)。或者或另外地，可(例如)經由FISH、南方墨點法或PCR技術來評估在待測試樣品中EGFR編碼核酸的含量。
此外，EGFR或EGFR配位體之過度表現或放大可使用活體內診斷檢定來評估，(例如)藉由投與結合至待檢測分子且以可檢測標記(例如，放射性同位素)標記之分子(諸如抗體)及最終掃描病患以定位該標記。
或者，在治療前，可偵測在病患中(例如其疾病組織中)之EGFR雜二聚體，特別係EGFR－ErbB2、EGFR－ErbB3或EGFR－ErbB4雜二聚體。多種偵測非共價蛋白－蛋白相互作用或另外顯示重要蛋白間接近性之方法係可用的。偵測EGFR雜二聚體之例示性方法包括(不限於)諸如免疫沉澱反應之基於免疫親和性之方法；螢光共振能量轉移(FRET)(Selvin,Nat.Struct.Biol.7 ：730－34(2000)；Gadella & Jovin,J.Cell Biol 129 ：1543－58(1995)及Nagy等人，Cytometry 32 ：120－131(1998))；使用標準直接或間接免疫螢光技術及共焦雷射掃描顯微方法以ErbB2或ErbB3共定位EGFR；雷射掃描成像(LSI)以偵測抗體結合及以ErbB2或ErbB3以高處理量形式(諸如微孔盤)共定位EGFR(Zuck等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96 ：11122－11127(1999))；或eTag/m檢定系統(Aclara Bio Sciences,Mountain View,Calif.及美國專利申請第2001/0049105號，2001年12月6日公開)。
因此，顯而易見本發明涵蓋用於治療人類惡性腫瘤之醫藥組合物、組合及方法，該等惡性腫瘤為諸如膀胱癌、腦癌、頭頸癌、胰腺癌、肺癌乳癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、皮膚癌及腎癌。舉例而言，本發明包括用於治療人類惡性腫瘤之醫藥組合物，其包含治療有效劑量之本發明之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
本發明之ABM組合物可使用習知之投藥方式投與，該等習知投藥方式包括(但不限於)靜脈內、腹膜內、口服、淋巴管內投藥或直接投藥至腫瘤中。較佳為靜脈內投藥。
在本發明之一態樣中，含有本發明之ABM之治療調配物係藉由將具有所要之純淨程度之抗體與視情況醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第16版，Osol，A.編(1980))混合，以凍乾調配物或水溶液之形式來製備用以儲存。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所使用之劑量及濃度下對受體無毒性，且包括諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸之緩衝液；包括抗壞血酸與甲硫胺酸之抗氧化劑；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨、氯化六甲銨、氯化苄烷銨、苄索氯銨、苯酚、丁醇或苄醇、諸如甲基或丙基帕瑞品(paraben)之烷基帕瑞品、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3－戊醇及間－甲酚)、低分子量(少於約10個殘基)多肽、諸如血清白蛋白、凝膠或免疫球蛋白之蛋白、諸如聚乙烯吡咯啶酮之親水性聚合物、諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、組胺酸、精胺酸或離胺酸之胺基酸、包括葡萄糖、甘露糖或糊精之單醣、二醣及其他碳水化合物、諸如EDTA之螯合劑、諸如蔗糖、甘露糖醇、岩藻糖或山梨醇糖之糖、諸如鈉之成鹽平衡離子、金屬錯合物(例如，鋅蛋白錯合物)及/或諸如TWEENT M 、PLURONICST M 或聚乙二醇(PEG)之非離子表面活性劑。
本發明之ABM可對受檢者單獨或與(例如)化學治療劑及/或輻射療法組合投藥以治療諸如腫瘤之特徵為異常EGFR或EGFR配位體活性之疾病或病症。例示性抗－EGFR抗體調配物在Herbst與Shen,Cancer 94(5) ：1593－1611中描述。適合化學治療劑包括順鉑(cisplatin)、阿黴素、拓朴替康(topotecan)、紫杉醇、長春花鹼、卡波鉑(carboplatin)及足葉乙甙(etoposide)。
適於皮下投藥之凍乾調配物在WO 97/04801中描述。此等凍乾調配物可以適合稀釋劑復水為高蛋白濃度且該經復水調配物可對本文待治療哺乳動物皮下投與。
按所治療特別病症之需要，本文之調配物亦可含有一種以上活性化合物，較佳係彼等具有互補活性彼此無不利影響的化合物。舉例而言，可希望進一步提供一種細胞毒素藥劑、化學治療劑、細胞因子或免疫抑制劑(例如，在T細胞上起作用之細胞因子或免疫抑制劑，諸如環孢子菌素或結合T細胞之抗體，例如，結合LFA－1之抗體)。此等其他藥劑之有效劑量取決於存在於調配物中之拮抗劑的量、疾病或病症或治療的類型及上文討論之其他因素。此等通常以相同劑量且以如上文中使用之投藥路徑或約1至99%之此前所使用之劑量來使用。
活性成份亦可裹入(例如)藉由凝聚技術或藉由界面聚合製備之微膠囊中，例如，各自呈膠狀藥物傳遞系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或微乳液之羥甲基纖維素或凝膠微膠囊及聚(甲基甲酯)微膠囊。此等技術在Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版，Osol,A.編(1980)中揭示。
亦可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有拮抗劑之固體疏水性聚合物的半透性基質，該等基質呈成型物品之形式，例如薄膜或微膠囊。持續釋放基質之實例包括聚酯、水凝膠(例如聚(2－羥乙基－甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利第3,773,919號)、L－麩胺酸共聚物與γ乙基－L－麩胺酸之共聚物、非可降解乙烯－醋酸乙酯、可降解乳酸－乙醇酸共聚物，諸如LUPRON DEPOTTM(包含乳酸－乙醇酸共聚物及醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)之可注射微球體)及聚－D－(－)－3－羥基丁酸。
待用於活體內投藥之調配物必須係消毒的。此藉由經消毒過濾膜過濾來容易地完成。
本發明之組合物可以多種劑型，該等劑型包括(但不限於)液體溶液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、栓劑、聚合微膠囊或微泡、脂質體及可注射或可輸注溶液。較佳形式取決於投藥模式與治療之應用。
本發明之組合物較佳亦包括習知醫藥學上可接受之載劑及此項技術中已知之佐劑(諸如人類血清白蛋白、離子交換劑、氧化鋁、卵磷脂)、緩衝劑物質(諸如磷酸鹽、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀)及鹽或電解質(諸如硫酸魚精蛋白)。
對於本發明之醫藥組合物而言，最有效投藥模式及給藥方案取決於疾病之嚴重性及病程、病患之健康狀態及對治療的反應及治療醫師的判斷。因此，組合物之劑量應根據個別病患來確定。然而，本發明之組合物之有效劑量通常應在約0.01至約2000 mg/kg範圍內。在一實施例中，有效劑量係在約1.0 mg/kg至約15.0 mg/kg範圍內。在一更特別實施例中，該劑量係在約1.5 mg/kg至約12 mg/kg範圍內。在另一實施例中，該劑量係在約1.5 mg/kg至約4.5 mg/kg，或約4.5 mg/kg至約12 mg/kg範圍內。本發明之劑量亦可係在包括(但不限於)以下範圍之此等範圍內之任意劑量：1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、3.0 mg/kg、3.5 mg/kg、4.0 mg/kg、4.5 mg/kg、5.0 mg/kg、5.5 mg/kg、6.0 mg/kg、6.5 mg/kg、7.0 mg/kg、7.5 mg/kg、8.0 mg/kg、8.5 mg/kg、9.0 mg/kg、9.5 mg/kg、10.0 mg/kg、10.5 mg/kg、11.0 mg/kg、11.5 mg/kg、12.0 mg/kg、12.5 mg/kg、13.0 mg/kg、13.5 mg/kg、14.0 mg/kg、14.5 mg/kg或15.0 mg/kg。
本文描述之分子可以多種劑型，該等劑型包括(但不限於)液體溶液或懸浮液、錠劑、丸劑、粉劑、栓劑、聚合微膠囊或微泡、脂質體及可注射或可輸注溶液。較佳形式取決於投藥模式及治療應用。
在一些情況下，本發明之劑量可藉由預報生物標記的使用來確定。預報生物標記係分子標記，其用於確定(意即，觀察及/或量化)腫瘤釋放基因或蛋白之表現及/或活化模式或腫瘤釋放訊號途徑之細胞組份。闡明靶向療法在腫瘤組織中之生物學效應及將此等效應與臨床反應相關聯有助於鑑定在腫瘤中之有效之主要生長與存活途徑，藉此建立可靠回應者概況且相反地為設計克服抗性之策略提供合理性。舉例而言，抗－EGFR療法之生物標記可包含處於導致細胞增殖疾病或病症之EGFR下游訊號途徑的分子，其包括(但不限於)Akt、RAS、RAF、MAPK、ERK1、ERK2、PKC、STAT3、STAT5(Mitchell,Nature Biotech. 22：363－364(2004)；Becker,Nature Biotech 22 ：15－18(2004)；Tsao與Herbst,Signal 4 ：4－9(2003))。抗－EGFR療法之生物標記亦可包含諸如EGFR、ErbB－2(HER2/neu)及ErbB－3(HER3)之生長因子受體，且可係病患對於抗－EGFR療法反應之正性或負性預報因子。舉例而言，生長因子受體ErbB－3(HER3)確定為抗－EGFR抗體ABX－EGF之負性預報生物標記(美國專利申請公開案第2004/0132097 A1號)。
預報生物標記可藉由此項技術中所熟知之細胞檢定來量測，該等細胞檢定包括(但不限於)免疫組織化學、流式細胞術、免疫螢光、俘獲與偵測檢定及逆相檢定及/或在美國專利申請公開案第2004/0132097 A1號中所闡述之檢定，該文獻之全部內容以引用的方式併入本文中。抗－EGFR療法之預報生物標記自身可根據在美國專利申請公開案第2003/0190689A1號中闡明之技術來鑑定，該文獻之全部內容以引的方式併入本文中。
在一態樣中，本發明提供一種治療EGFR相關病症之方法，其包含在以一或複數種偵測諸如癌症之EGFR相關病症之預報生物標記之表現及/或活化的試劑治療前，藉由檢定來自人類受檢者之樣品來預測在需要治療之人類受檢者中對於抗－EGFR療法的反應；確定一或多種預報生物標記之表現及/或活化模式，其中該模式預測該人類受檢者對於該抗－EGFR療法的反應；對預測為對於抗－EGFR治療正性反應之人類受檢者投與治療有效劑量之包含本發明之ABM的組合物。如本文所使用，預測為對於抗－EGFR治療正性反應之人類受檢者 係對於EGFR相關病症抗－EGFR具有可量測之效應(例如，腫瘤退化/收縮)之人類受檢者及對於抗－EGFR療法之益處未被不利效應(例如，毒性)超過之人類受檢者。如本文所使用，樣品意味來自有機體(特別係人類)之任意生物樣品，其包含一或多種包括任意來源之單一細胞之細胞，自器官(乳房、肺、胃腸道、皮膚、子宮頸、卵巢、前列腺、腎、大腦、頭與頸或身體之任意其他器官或組織)移除之組織或活組織樣品及其他身體樣品，其他身體樣品包括(但不限於)塗片、唾液、分泌物、腦脊髓液、膽汁、血液、淋巴液、尿及糞便。
包含本發明之ABM之組合物應以符合較好醫療實踐之方式調配、給藥及投與。在本說明書中考慮之因素包括治療之特別疾病或病症、治療之特別哺乳動物、個別病患之臨床狀況、疾病或病症之病因、藥劑傳遞位點、投藥方法、投藥方案及醫療從業者所已知之其他因素。待投與之治療有效劑量之拮抗劑應藉由此等考慮來調整。
如通常所建議，每劑量非經腸投與之抗體的治療有效劑量應在每日約0.1至與20 mg/kg病患體重範圍內，使用之拮抗劑之通常起始範圍在約2至10 mg/kg範圍內。在一實施例中，該治療有效劑量係在約1.0 mg/kg至約15.0 mg/kg範圍內。在一更特別實施例中，該劑量係在約1.5 mg/kg至約12 mg/kg範圍內。在其他實施例中，該劑量係在約1.5 mg/kg至約4.5 mg/kg或約4.5 mg/kg至約12 mg/kg範圍內。本發明之劑量亦可係在包括(但不限於)以下劑量之此等範圍內之任意劑量：1.0 mg/kg、1.5 mg/kg、2.0 mg/kg、2.5 mg/kg、3.0 mg/kg、3.5 mg/kg、4.0 mg/kg、4.5 mg/kg、5.0 mg/kg、5.5 mg/kg、6.0 mg/kg、6.5 mg/kg、7.0 mg/kg、7.5 mg/kg、8.0 mg/kg、8.5 mg/kg、9.0 mg/kg、9.5 mg/kg、10.0 mg/kg、10.5 mg/kg、11.0 mg/kg、11.5 mg/kg、12.0 mg/kg、12.5 mg/kg、13.0 mg/kg、13.5 mg/kg、14.0 mg/kg、14.5 mg/kg或15.0 mg/kg。
在一較佳實施例中，該ABM係抗體，較佳係人化抗體。此非共軛抗體之適合劑量係(例如)在約20 mg/m2 至約1000 mg/m2 範圍內。舉例而言，對病患可投與一或多種大體上小於375 mg/m2 劑量之抗體，例如，該劑量係在約20 mg/m2 至約250 mg/m2 範圍內，例如約50 mg/m2 至約200 mg/m2 。
此外，可投與一或多種起始劑量之抗體，繼之投與一或多種後續劑量，其中在後續劑量中之抗體之mg/m2 劑量超過起始劑量中之抗體的mg/m2 劑量。舉例而言，起始劑量可在約20 mg/m2 至約250 mg/m2 範圍內(例如，約50 mg/m2 至約200 mg/m2 )且後續劑量可在約250 mg/m2 至約1000 mg/m2 範圍內。
然而，如上文所提示，此等建議之ABM量受大量之治療判斷影響。如上文所指示，在選擇適合劑量與計劃中之關鍵因素係所獲得之結果。舉例而言，對於正發作及急性疾病之治療最初可需要相對更高劑量。為獲得最有效結果，取決於該疾病或病症，拮抗劑盡可能接近於該疾病或病症之第一次病徵、診斷、出現或發生時或疾病或病症緩解期間投與。
在使用抗－EGFR抗體治療腫瘤情況下，最優治療結果通常以足以完全飽和在靶細胞上之EGF受體的劑量來達成。達成飽和之必要劑量應取決於每治療細胞所表現之EGF受體的數量(其在不同腫瘤類型之間可顯著變化)。在治療某些腫瘤時，血清濃度低至30 nM已有效，而對於其他腫瘤，為達成最優治療效應濃度高於100 nM可係必要的。對於特定腫瘤而言，達成飽和之必要劑量可容易地藉由放射免疫檢定或免疫沉澱反應活體外確定。
通常，對於與輻射之組合療法而言，一種適合之治療方案涉及本發明之抗－EGFR ABM以100－500 mg/m2 之負載劑量之八週次輸注，繼之以100－250 mg/m2 之維持劑量，且以70.0 Gy之量、每日2.0 Gy的劑量輻射。對於與化學療法之組合療法而言，一種適合之治療方案涉及與每三週100 mg/m2 劑量之順鉑組合以每週100/100 mg/m2 、400/250 mg/m2 或500/250 mg/m2 的負載/維持劑量投與本發明之抗－EGFR ABM。或者，可使用吉西他濱(gemcitabine)或伊立替康(irinotecan)替代順鉑。
本發明之ABM係藉由任意適合方法投與，該等適合方法包括非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內及(若需要局部免疫抑制治療)局部投藥。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。另外，拮抗劑可適合地藉由脈衝輸注(例如，以降低劑量之拮抗劑)投與。較佳地，給藥係藉由注射進行，最佳係靜脈內或皮下注射，其部分地取決於係短時給藥或長時給藥。
可連同本文之拮抗劑投與其他化合物，諸如細胞毒性劑、化學治療劑、免疫抑制劑及/或細胞因子。組合投藥包括使用單獨調配物或單一醫藥調配物之共投藥，及以任意順序之連續投藥，其中較佳存在一時間週期，兩種(或所有)活性劑同時發揮其生物學活性。
應清楚，為達成治療而所要求之本發明組合物之劑量可隨時程最優化而進一步降低。
根據本發明之實踐，該醫藥載劑可係脂質載劑。該脂質載劑可係磷脂。此外，該脂質載劑可係脂肪酸。該脂質載劑亦可係清潔劑。如本文所使用，清潔劑係改變(通常降低)液體表面張力之任意物質。
在本發明之一實例中，該清潔劑可係非離子清潔劑。非離子清潔劑之實例包括(但不限於)聚山梨醇酯80(亦稱為Tween 80或(聚氧化乙烯山梨糖醇單油酸酯))、Brij及Triton(例如，Triton WR－1339及Triton A－20)。
或者，該清潔劑係離子清潔劑。離子清潔劑之實例包括(但不限於)溴化烷基三甲基銨。
另外，根據本發明，該脂質載劑可係脂質體。如在本說明書中所使用，"脂質體"係任意膜結合泡，其含有任意本發明之分子或其組合。
在又一實施例中，本發明係關於一種ABM，根據本發明其用作藥物，特別用於治療或預防癌症或用於癌變前病症或損害。該癌症可係(例如)肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、支氣管細胞肺癌、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛門區癌、胃癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、輸卵管癌瘤、子宮內膜癌瘤、子宮頸癌瘤、陰道癌瘤、外陰癌瘤、霍奇金病(NSCL)、食道癌、小腸癌、內分泌系統癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎細胞癌瘤、腎盂癌瘤、間皮瘤、肝細胞癌、膽癌、慢性或急性白血病、淋巴細胞淋巴瘤、中樞神經系統(CNS)贅瘤、脊椎腫瘤、腦幹膠質瘤、多型性神經膠母細胞瘤、星形細胞瘤、神經鞘瘤、室管膜瘤、神經管胚細胞瘤、腦膜瘤、鱗狀細胞癌瘤、垂體腺瘤，其包括任意上文癌症之難治癒形式或一或多種上文癌症的組合。癌變前病症或損害包括(例如)由口腔黏膜白斑、光化性角化腫瘤(日光性角化病)、癌變前結腸或直腸息肉、胃上皮發育異常、腺瘤發育異常、遺傳性非息肉結腸癌徵候群(HNPCC)、貝特氏食道症(Barrett's esophagus)、膀胱發育異常及癌變前子宮頸病症組成的群。
較佳地，該癌症係選自由乳癌、膀胱癌、頭頸癌、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌及腦癌組成之群。
又一實施例係根據本發明之ABM用於製造供治療或預防癌症用之藥物的用途。癌症如上文界定。
較佳地，該癌症係選自由乳癌、膀胱癌、頭頸癌、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌及腦癌組成之群。
亦較佳地，該抗原結合分子係以約1.0 mg/kg至約15 mg/kg之治療有效劑量使用。
亦更佳地，該抗原結合分子係以約1.5 mg/kg至約12 mg/kg之治療有效劑量使用。
亦更佳地，該抗原結合分子係以約1.5 mg/kg至約4.5 mg/kg之治療有效劑量使用。
亦更佳地，該抗原結合分子係以約4.5 mg/kg至約12 mg/kg之治療有效劑量使用。
最佳地，該抗原結合分子係以約1.5 mg/kg之治療有效劑量使用。
亦最佳地，該抗原結合分子係以約4.5 mg/kg之治療有效劑量使用。
亦最佳地，該抗原結合分子係以約12 mg/kg之治療有效劑量使用。
製造之物品
在本發明之另一實施例中，提供一種含有用於治療上文描述之病症之物質的製造物品。該製造之物品包含一容器及一在該容器上或與該容器相關聯之標籤或封裝說明書。適合之容器包括(例如)瓶、小瓶、注射器等。該等容器可由諸如玻璃或塑料之多種材料形成。該容器保存對於治療病症有效之組合物且可具有消毒入口(例如，該容器可係靜脈內溶液袋或具有可經皮下注射針刺穿之塞的小瓶)。在組合物中之至少一種活性劑係抗－EGFR抗體。該標籤或封裝說明書指示該組合物係用於治療選擇之病症，諸如非惡性疾病或病症，其中該疾病或病症包括EGFR受體及/或EGFR配位體之異常活化或產生，例如良性高增殖疾病或病症。此外，該製造之物品可包含(a)一第一容器，其中容納組合物，其中該組合物包含結合EGFR且抑制過度表現EGFR之細胞生長的第一抗體；及(b)一第二容器，其中容納組合物，其中該組合物包含結合EGFR且阻斷EGFR受體之配位體活化的第二抗體。在本發明之此實施例中之製造的物品可另外包含一封裝說明書，其指示第一與第二抗體組合物可用於治療來自上文界定部分中之此等疾病或病症之列表的非惡性疾病或病症。此外，該封裝說明書可指示該組合物(包含結合EGFR且阻斷EGFR受體之配位體活性的抗體)之使用者將抗體療法與任意先前部分描述的附屬療法(例如，化學治療劑、EGFR靶向藥物、抗血管生成劑、免疫抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、抗激素化合物、科洛壇特(cardioprotectant)及/或細胞因子)組合。或者或另外地，該製造之物品可另外包含一第二(或第三)容器，該容器包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如用於注射之抑菌水(BWFI)、硫酸鹽緩衝之鹽水、格林氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者之立場需要之其他物質，該等物質包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
下文之實例更詳細地解釋本發明。給出以下製備與實例以使得熟習此項技術者能夠更清楚地理解且實踐本發明。然而，本發明並不限於例示性實施例之範疇，該等實施例僅意欲說明本發明之單一態樣，且功能上相等之方法係在本發明之範疇內。當然，除本文中描述之彼等修改外，熟習此項技術者應自先前描述及隨附圖式中顯而易見本發明之多種修改。此等修改屬於隨附專利申請範圍之範疇內。
本說明書中引用之所有專利、申請案與公開案皆係以引用的方式全部併入本文中。
實例
除非另外規定，否則在以下實例中特別胺基酸殘基位置之編號的參考根據Kabat編號系統進行。除非另外指出，否則用於製造在此等加工實例中描述之抗體之物質及方法係根據在美國專利申請第10/981,738號之實例中闡述的彼等物質及方法，該文獻以引用的方式全部併入本文中。
實例1 物質及方法 高同源受體方法
藉由將大鼠ICR62蛋白序列與人類生殖系序列之集合比對且選擇顯示最高序列相同性之人類序列，同時以相同功能水平保存所有規範殘基來執行高同源抗體受體框架搜尋。在此，選擇來自VBase資料庫內之VH1家族之1－e序列作為重鏈框架受體序列，且選擇來自VBase資料庫之VK1家族之A30序列為輕鏈框架受體。在該等兩受體框架上移植三個互補決定區(CDR)及/或大鼠ICR62重可變域與輕可變域之彼等CDR的特異性決定殘基。因為框架4區並非生殖系基因之可變區的部分，所以對於彼位置之比對個別地執行。對於重鏈選擇JH6區，且對輕鏈選擇JK2區。設計之免疫球蛋白域分子模擬顯示一個在Kabat CDR1外之位置，其在CDR之外潛在需要鼠科胺基酸殘基，而非人類胺基酸殘基。將鼠科胺基酸殘基再引入人類框架將產生所謂之"回復突變"。舉例而言，在Kabat位置27處之人類受體胺基酸殘基(在1－e中之甘胺酸)回復突變為酪胺酸殘基。為顯示該等殘基對於抗原結合之重要性，設計人化抗體變異體，其包括或省略回復突變。人化抗體輕鏈不需任何回復突變。如下文詳述，在設計該等蛋白序列之後，分析編碼此等蛋白之DNA序列。
混合框架方法
為避免在人類受體框架之關鍵位置(對保持較好抗原結合親和力或抗體功能係關鍵的)對引入回復突變的需要，研究在天然人類生殖系序列中之重要殘基位置，功能人化抗體之框架區1(FR1)、框架區1(FR1)與框架區2(FR2)或框架區3(FR3)是否可經已具有供體殘基或功能上與供體殘基相當之胺基酸殘基的人類抗體序列替代。為達成此目的，將大鼠ICR62 VH序列之VH框架1、2及3與人類生殖系序列個別比對。在此，不使用最高序列相同性來選擇受體框架；而是執行匹配若干關鍵殘基之匹配。彼等關鍵殘基包含所謂之規範殘基且亦包括在位置27、28與30(Kabat編碼)處之彼等殘基，其位於Kabat之CDR1定義之外，但常涉及抗原結合。另外，如可使用分子模擬確定，關鍵殘基係顯示與CDR重要相互作用的彼等殘基。選擇IMGT序列IGHV1－58(登記號M29809)、IGHV5－51(登記號M99686)以及來自VH1家族之VBase序列1－02作為適合之用於替代FR1、FR2或FR3的序列。簡言之：IGHV1－58在Kabat位置27至30顯示令人期待之模式，但不滿足規範位置71的標準。IGHV5－51具有一匹配殘基71，故可使用其FR3。其FR1亦接近於所要之FR1序列。
VH1之1－e滿足除位置27外之所有標準。認為序列1－02對於FR1區與FR2區係可接受的，但應需要在FR3中之回復突變。
如下文詳述，在設計該等蛋白序列之後，分析編碼此等蛋白之DNA序列。為保持較好水平之抗原結合，使用此方法，在重鏈之多數結構中回復突變並非必要的。混合框架結構之時序及論證在結果部分解釋。
合成抗體基因
在設計人化抗體V區之胺基酸序列之後，產生DNA序列。個別框架工作區之DNA序列資料係在人類生殖系序列資料庫(例如IMGT或VBase)中發現。CDR區之DNA序列資訊係自大鼠ICR62抗體之公開序列取得(參見，例如PCT公開案WO 95/20045)。以此等序列，實際上已組裝全部DNA序列。以此DNA序列資料，診斷限制位點藉由引入靜止突變、產生限制性核酸內切酶之識別位點而引入實際序列中。為獲得實體DNA鏈，執行基因分析(參見，例如，Wheeler等人1995)。在此方法中，自重要基因設計寡核苷酸，使得自編碼鏈衍生一系列寡核苷酸，且自非編碼鍵衍生一另外系列之寡醣。各寡核苷酸之3'及5'端(除該列中之第一與最後一個外)總顯示對於源自相對鏈之兩引子之互補序列。當將此等寡核苷酸放入適合於任意熱溫度聚合酶之反應緩衝液中，且添加Mg2 ＋ 、dNTP及DNA聚合酶時，各寡核苷酸皆自其3'端延伸。接著一引子之新形成3'端與相對鏈之下一引子一起退火，且在適合模板依賴DNA鏈延長之條件下進一步延伸其序列。將最終產物選殖至習知載體中以在E.coli 中增殖。
抗體產生
為構建嵌合(意即，完全大鼠V區及人類C區)及人化抗－EGFR輕鏈與重鏈鏈表現載體，將人類重鏈及輕鏈引導序列(用於分泌)添加至可變區DNA序列上游。使用標準分子生物學技術將IgG1之重鏈恆定區及輕鏈恆定區添加至可變區下游。所得之完全抗體重鏈及輕鏈DNA序列在MPSV啟動子及合成polyA位點上游之控制下次選殖至哺乳動物表現載體(一者用於輕鏈且一者用於重鏈)中，各載體承載一EBV OriP序列。
藉由使用磷酸鈣轉染方法以哺乳動物抗體重鏈及輕鏈表現載體共轉染HEK293－EBNA細胞來產生抗體。指數生長之HEK293－EBNA細胞藉由磷酸鈣方法轉染。為產生未修飾抗體，僅用抗體重鏈表現載體與抗體輕鏈表現載體以1：1比率轉染該等細胞。為產生糖基化設計抗體，以四種質體(二種用於抗體表現，一種用於融合GnTIII多肽表現且一種用於甘露糖苷酶II表現，各自以4：4：1：1比率)共轉染細胞。使用以10% FCS補充之DMEM培養基使細胞作為黏著單層培養物在T形瓶中生長，且當其50%與80%之間長滿時使其轉染。對於T75瓶轉染而言，轉染前24小時將8百萬個細胞接種至以FCS(以最終10 V/V%)、250 μg/ml新黴素補充之14 ml DMEM培養基中，且將細胞放入具有5% CO2 氣氛之37℃恆溫器中隔夜。對各待轉染之T75瓶而言，藉由混合47 μg在輕鏈表現載體與重鏈表現載體之間等量分開之總質體載體DNA、235 μl之1 M CaCl2 溶液且添加水以至最終體積為469 μl來製備DNA、CaCl2 與水之溶液。向此溶液中添加469 μl pH值為7.05之50 mM HEPES、280 mM NaCl、1.5 mM Na2 HPO4 溶液，立即混合10秒且在室溫下靜置20秒。將懸浮液以12 ml之以2% FCS補充之DMEM稀釋，且將其添加至T75中代替現有之培養基。將該等細胞在37℃、5% CO2 下培養約17至20小時，接著以12 ml DMEM、10% FCS替代培養基。轉染5至7日後收集條件培養基，以1200 rpm下離心5分鐘，繼之以4000 rpm第二次離心10分鐘且在4℃下保存。
藉由蛋白A親和層析，繼之以陽離子交換層析及調換緩衝液為磷酸緩衝液鹽水且收集純化之單體IgG1抗體之於Superdex 200柱上(Amersham Pharmacia)之最終尺寸排阻層析來純化分泌之抗體。使用光譜光度計自280 nm處之吸光率來估計抗體濃度。在pH值為6.7之25 mM磷酸鉀、125 mM氯化鈉、100 mM甘胺酸溶液中調配抗體。
人化抗體之糖基化設計變異體藉由共轉染抗體表現載體連同GnT－III糖基轉移酶表現載體或連同GnT－III表現載體外加高爾基體甘露糖苷酶II表現載體來產生。如上文對非糖基化設計抗體所描述來純化及調配糖基化設計抗體。如下文所描述，附著於抗體Fc區之寡醣藉由MALDI/TOF－MS來分析。
寡醣分析
在抗體固定於PVDF膜上或溶液中之情況下，寡醣藉由PNGaseF消化自抗體酶促釋放。
所得之含有經釋放寡醣的消化溶液直接製備用於MALDI/TOF－MS分析或在製備用於MALDI/TOF－MS分析之樣品前進一步以EndoH糖苷酶消化。
PVDF膜固定抗體之寡醣釋放方法
將以PVDF膜製成之96孔盤(Immobilon P,Millipore,Bedford，馬薩諸塞州)之孔以100 μl甲醇濕潤，且使用應用於多屏真空歧管(Millipore，Bedford，馬薩諸塞州)之真空經由PVDF膜吸取液體。以300 μl水洗滌PVDF膜三次。接著以50 μl RCM緩衝液(8 M Urea、360 mM Tris、3.2 mM EDTA，pH 8.6)洗滌該等孔。將30－40 μg之間的抗體裝載至含有10 μl RCM緩衝液之孔中。藉由應用真空經由膜吸取孔中液體，且隨即以50 μl RCM緩衝液洗滌膜兩次。藉由向RCM中添加50 μl之0.1 M二硫蘇糖醇且在37℃下培育1小時來執行二硫橋鍵的還原。
還原後，應用真空以自孔中移除二硫蘇糖醇溶液。以300 μl水洗滌孔三次之後，藉由向RCM緩衝液中添加50 μl 0.1 M碘乙酸且在黑暗中室溫下培育30分鐘來執行半胱胺酸殘基之羧甲基化。
羧甲基化後，以真空吸取該等孔且隨即以300 μl水洗滌三次。接著藉由在室溫培育100 μl之聚乙烯吡咯啶360 1%水溶液1小時來阻斷該PVDF膜以防止吸附糖苷內切酶。接著藉由溫和真空移除阻斷劑，繼之以300 μl水洗滌三次。
藉由添加2.5 mU肽－N－糖基酶F(重組N聚糖酶，GLYKO,Novato,CA)及0.1 mU唾液酸酶(GLYKO,Novato,CA)以移除任意潛在之帶電單醣殘基以20 mM NaHCO3 中之25 μl之最終體積(pH 7.0)來釋放N－聯接寡醣。在37℃下執行消化3小時。
在溶液中之抗體之寡醣釋放方法
將40與50 μg之間之抗體與2.5 mU之PNGaseF(Glyko，U.S.A.)於2 mM Tris pH值為7.0最終體積為25微升下混合，且將該混合物在37℃下培養3小時。
使用PNGaseF－釋放寡醣之糖苷內切酶H消化以將雜交對分寡醣結構歸於MALDI/TOF－MS中性寡醣峰
隨後以糖苷內切酶H(EC 3.2.1.96)消化PNGaseF釋放寡醣。對於EndoH消化而言，將15 mU EndoH(Roche,Switzerland)添加至PNGaseF消化液(上文方法之溶液中之抗體)中以給出30微升之最終體積，且在37℃下培育該混合物3小時。EndoH在N－聯接寡醣之殼二糖核的N－乙醯基葡糖胺殘基之間裂解。該酶僅可消化寡甘露糖及多數雜交型多糖，而不水解錯合物型寡醣。
MALDI/TOF－MS樣品製備
在添加乙酸以至150 mM之最終濃度之後在室溫下將含有經釋放寡醣之酶消化液另外培育3小時，且隨後使其通過裝入微分子篩(micro－bio－spin)層析管柱(BioRad，瑞士)中之100－200篩目，0.6 ml之陽離子交換樹脂(AG50W－X8樹脂，氫形式，BioRad，瑞士)以移除陽離子及蛋白。將1微升之所得樣品施用於不銹鋼靶盤，且在盤上與1 μl之sDHB基質混合。sDHB基質藉由溶解2 mg 2,5－二氫苯甲酸外加於1 ml乙醇/10 mM水性氯化鈉1：1(v/v)中之0.1 mg 5－甲氧基水楊酸來製備。將樣品空氣乾燥，應用0.2 μl乙醇，且空氣下最終允許樣品再結晶。
MALDI/TOF－MS
用於獲得質譜之MALDI－TOF質譜儀係Voyager Elite(Perspective Biosystems)。在線性組態中以20 kV之加速度及80 ns之延遲操作該裝置。使用寡醣標準品之外部校準用於離子質量數測定。統計200次雷射發射之光譜以獲得最終光譜。
抗原結合檢定
使用基於流式細胞計檢定測試經純化單體人化抗體變異體用於結合至A431人類上皮細胞株上之人類上皮生長因子受體(EGFR，在文獻中亦稱為HER－1或ErbB1)。將180 μl FACS緩衝液(含有2% FCS及5 mM EDTA之PBS)中之200,000個細胞(例如，來自人類A431細胞株)轉移至5 ml聚苯乙烯管中，且添加20 μl 10倍濃縮抗－EGFR抗體(第一抗體)樣品(1－5000 ng/ml最終濃度)或僅添加PBS。輕輕混合樣品後，在4℃下黑暗培育該等管30分鐘。隨後，以FACS緩衝液洗滌樣品兩次，且以300 x g成球化3分鐘。吸去上清且將細胞溶解在50 μl FACS緩衝液中，且添加2 μl第二抗體(抗－FC－特異性F(ab')2 －FITC片段(Jackson Immuno Research Laboratories，USA))，且在4℃下培育該等管30分鐘。以FACS緩衝液洗滌樣品兩次且將其溶解於500 μl FACS中以使用流式細胞計分析。藉由針對抗體濃度繪製幾何平均螢光圖來確定結合。
單體IgG1糖基化變異體對FcγRIIIA表現CHO細胞株之結合
藉由以編碼FcγRIIIA－Val158 α－鏈與γ－鏈之表現載體電穿孔(280 V，950 μF，0.4 cm)轉染CHO細胞。藉由添加6 μg/ml嘌呤黴素來選擇轉染物且穩定選殖藉由對於106個細胞使用10 μl FITC－共軛－抗－FcγRIII 3G8單株抗體(BD Biosciences，Allschwil/瑞士)之FACS來分析。執行IgG1對FcγRIIIA－Val158－表現CHO細胞之結合。簡言之，將抗－FcγRIIIA 3G8 F(ab')2 片段(Ancell，Bayport，MN/USA)以10 μg/ml之濃度添加以競爭結合抗體糖基化變異體(3 μg/ml)。關於結合抗體變異體之螢光強度在FACSCalibur(BD Biosciences，Allschwil/瑞士)上測定。
ADCC檢定
使用人類周邊血液單核細胞(PBMC)作為效應細胞且使用Histopaque－1077(Sigma Diagnostics Inc.,St.Louis,MO63178 USA)大體上遵循廠商說明書來製備。簡言之，以肝素化注射器自健康志願者取得靜脈血液。將該血液以PBS(不含Ca＋ ＋ 或Mg＋ ＋ )稀釋為1：0.75－1.3，且在Histopaque－1077上分層。在室溫(RT)下將梯度以400 x g不間斷離心30分鐘。收集含有PBMC之中間相且以PBS(來自兩梯度之50毫升/細胞群)洗滌，且在RT下藉由以300 x g離心10分鐘來收集。在以PBS再懸浮小球後，計數PBMC且在RT下藉由以200 x g離心10分鐘第二次洗滌。接著將該等細胞再懸浮於適合培養基中以用於隨後程序。
對於PBMC與NK細胞而言，用於ADCC檢定之效應物與目標之比率各自係25：1及10：1。效應細胞在AIM－V培養基中以適合濃度製備以添加圓底96孔盤之每孔50 μl。靶細胞係生長於含有10%FCS之DMEM中之人類EGFR表現細胞(例如，A431、EBC－1或LN229)。將靶細胞於PBS中洗滌，計數且以每毫升300,000個再懸浮於AIM－V中以按每微孔100 μl添加30,000個細胞。將抗體於AIM－V中稀釋，添加50 μl至預先載盤之靶細胞中且允許在RT下結合至該等目標歷時10分鐘。接著添加效應細胞且在37℃下將該盤在含有5% CO2 之濕潤氣氛下培育4小時。藉由使用細胞毒性偵測套組(Roche Diagnostics，Rotkreuz，瑞士)量測自損傷細胞釋放之乳酸脫氫酶(LDH)來評估靶細胞之殺死。培育4小時後，將該等盤以800 x g離心。將來自各孔之100 μl清液轉移至新透明平底96孔盤中。每孔添加100 μl來自該套組之有色基質緩衝液。使用SOFTmax PRO軟體(Molecular Devices，Sunnyvale，CA94089，USA)在ELISA讀數器中在490 nm處確定有色反應之Vm a x 值歷時至少10分鐘。自僅含有靶細胞及效應細胞但無抗體之孔量測自發LDH釋放。自僅含有靶細胞及1% Triton X－100之孔量測最大釋放。特定抗體介導之殺死的百分數按如下計算：((x－SR)/(MR－SR)×100，其中x係在特定抗體濃度下之Vm a x 平均值，SR係自發釋放之Vm a x 平均值且MR係最大釋放之Vm a x 平均值。
實例2 結果與討論
對與嵌合ICR62輕鏈或與人化ICR62輕鏈(I－KA、I－KB或I－KC)及親本嵌合抗體ch－ICR62錯合之抗體變異體I－HHA、I－HHB、I－HHC、I－HLA、I－HLB、I－HLC、I－HLA1、I－HLA2、I－HLA3、I－HLA4、I－HLA5、I－HLA6、I－HLA7、I－HLA8、I－HLA－9、I－HHD、I－HHE、I－HHF及I－HHG之人類EGF－受體結合的比較顯示，所有抗體具有在一對數單位內之相似EC50值。僅I－HHA具有強烈減少之結合親和力(參見圖2)。圖1顯示當各自與人化結構I－HHC及I－KB結合時個別嵌合ICR62(ch－ICR62)多肽鏈之機能活性。在此實驗中，ch－ICR62之輕鏈、重鏈或兩鏈同時藉由上文提及之人化結構替代。此顯示VH/VL界面之形成似乎在齧齒動物抗體中與在人化結構中一樣存在。
如在圖2中顯示，人化重鏈I－HHA不能回復與I－KA或I－KB輕鏈之結合活性。由於I－HLA顯示與I－KA與I－KB之結合，故本發明者推斷I－HHA之重鏈在抗原結合中無機能性。結合圖3，圖1與圖2顯示輕鏈結構I－KA、I－KB及I－KC顯示與齧齒動物對應物不可區分的結合行為。變異體I－KC不具有任意回復突變，且另外部分人化其CDR1，使得殘基24－29可源於人類受體序列(VK1之A30，如先前所提及)。
在I－HHA、I－HHB及I－HHC系列中，僅後面兩種變異體顯示令人滿意之結合行為(圖2及圖3)。I－HHA序列分析顯示三種對此行為起作用之潛在胺基酸殘基：Lys33、His35及Tyr50。具有經酪胺酸置換Lys33之結構及具有經色胺酸置換Tyr50之結構顯示較好結合。僅當此等兩種殘基各自經丙胺酸及甘胺酸置換時，結合喪失。由於I－HHC未顯示較I－HHB更佳之結合，故本發明者推斷殘基Asn60、Glu61、Lys64及Ser65不需要係齧齒動物源；或其各自可經Ala、Gln、Gln及Gly置換。由於胺基酸位置60至65係Kabat CDR界定之部分，但對此抗體不需移植齧齒動物供體殘基，故此程序導致CDR2係更人化之結構。
圖4與圖5比較系列I－HLA1、I－HLA2、I－HLA3、I－HLA4、I－HLA5及I－HLA6之結構。在結構ch－ICR62、I－HLA1及IHLA2中觀察到最佳結合行為，其EC50值係約300 ng/ml。其他結構之此值增加兩倍，且因此具有輕微減少之結合活性。自此資料得到之第一個結論係，在Kabat CDR1內容許Lys33Tyr與Ile34Met取代。此等兩位置位於CDR1之Kabat界定內，但在Chothia CDR界線外(其係基於結構分析而非序列分析)。接著在CDR1之後面部分中，允許至少一些混雜。
第二個結論係，在CDR2內，除上文提及之經非供體殘基置換Asn60與Glu61殘基外，亦允許Asn60Ser、Glu61Pro及Lys62Ser在Kabat CDR內非供體取代。此等殘基源於人類生殖系IGHV5－51受體序列，該人類生殖系IGHV5－51受體序列係用作FR3受體序列。僅藉由移除Phe27Tyr回復突變而使結構I－HLA3及I－HLA4不同於I－HLA1及I－HLA2，且I－HLA3與I－HLA4結構與其親本結構相比失去親和力。因此，比較I－HLA1、I－HLA2、I－HLA3、I－HLA4、I－HLA5及I－HLA6之第三個結論係Phe27經由修飾CDR1之環構形直接或間接涉及抗原結合。
變異體I－HLA5及I－HLA6具有分別經另一具有天然存在Phe27(意即，IGHV1－58)之生殖系受體序列置換之I－HLA1與I－HLA2的FR1。此僅可藉由同時引入若干其他突變而達成，該等突變係：Val2Met、Ala9Pro及Ala16Thr。藉此，(再)引入Phe27之有利效應再次被取消。
評估I－HLA7結構以確定與ICR62相比，在I－HLA6結構之重鏈CDR1及CDR2中之額外供體殘基的回復是否將回復全部結合活性。如圖6所示，其將不會發生。
如圖7及圖8所示，測試兩種額外結構I－HLA8與I－HLA9以確定與ch－ICR62相比是否可達成全部結合活性。自I－HHB結構起始，FR1區經在Chothia CDR1區內具有最大同源之FR1區替代。I－HLA8結構具有IGHV 1－58序列之FR1，且I－HLA9具有IGHV5－51 FR1區。兩種結構對抗原之結合至少與ch－ICR62抗體一樣好。事實上，隨著EC50降低2倍，I－HLA8結構甚至可更好。I－HLA8結構具有與I－HLA5結構及I－HLA6結構相同之FR1序列，且因此具有相同之非供體殘基(意即，Va12Met、Ala9Pro及Ala16Thr)，暗示此等非供體殘基之存在對結合無不良影響。出現於I－HLA5與I－HLA6中之不利突變係由VH1 FR1與VH5 FR3配對之組合引起，其可潛在地藉由具有相同VH家族的FR1與FR3來補償。
圖8中顯示在CDR內含有非供體殘基之結構。因此，此等結構在CDR內係更進一步人化，因為非供體殘基存在於選擇用於此等結構之人類框架區中。所有I－HHE(His35Ser)、I－HHF(Thr58Asn)及I－HHG(Ser57Ala)結構在人化之CDR1或CDR2內(與I－HHB結構相比)皆具有一個殘基。亦檢定結構I－HHD(Gly24Ala)。I－HHF顯示減少之結合，此指示Thr58之重要性。與Kabat CDR殘基58相比，胺基酸57對取代更耐受，此由於Ser57Ala突變顯然對於結合無影響(圖8)。
由於IGHV5－51之FR3區在I－HLA1與I－HLA2結構中似乎顯示令人期待之性質，且證實相同生殖系序列之FR1區在I－HLA9結構中係有用的，故設計IGHV5－51之FR1、FR2及FR3一起用作環移植之受體。
在人化ICR62結構中規範殘基之分析概況：VL：Kabat位置2：可能需要Ile。Kabat位置71：允許Ile或Phe。
VH：位置24，允許Gly、Thr、Ala、Val、Ser。位置26，允許Gly。位置29，允許Phe、Ile、Leu、Val、Ser。位置34，允許Ile、Met、Leu、Val、Trp、Tyr、Thr。位置71，允許Ala、Leu、Val、Thr。位置94，允許Arg、Gly、Asn、Lys、Ser、His、Thr、Ala。
ADCC實驗結果
圖9顯示對於多種嵌合ICR62抗體之糖型及人化變異體I－HLA4所示之抗體介導細胞毒性(ADCC)之比較。不同糖型藉由指示非糖基化設計(WT)、糖型1(G1)或糖型2(G2)之標記來標記。"G1"係指藉由與GnTIII共表現糖基化設計抗體。"G2"係指藉由與GnTIII及ManII共表現糖基化設計抗體。"WT"係指未經糖基化體設計之抗體。所有人化結構之輕鏈係I－KC變異體，且係未經明顯標記的。
嵌合抗體以及人化抗體藉由兩種不同糖基化設計方法改良其效能與功效。分別對於野生型或糖型，ch－ICR62結構較I－HLA4執行稍好。如在圖4中所見，當比較兩種抗體對其抗原之親和力時，ch－ICR62具有低兩倍之EC50值。該親和力之差異在此反映在功效之差異上。
圖10顯示非糖基化設計("野生型")與G2糖基化形式之人化ICR62抗體結構I－HHB及I－HLA7的抗體介導細胞毒性(ADCC)的比較。將相同抗體應用於兩種不同靶細胞株。在圖10之組A中，使用靶細胞株LN229；且在圖10之組B中，使用細胞株A431。A431細胞較LN229細胞顯然更易受抗體介導細胞殺死影響。更重要地，糖基化設計增強兩種抗體之效能。此效應對於I－HLA7較對於I－HHB似乎更顯著。當使用LN229靶向細胞株時，藉由引入G2糖基化設計變異體，在最大抗體濃度下對於I－HHB之細胞殺死百分數可自約30%至約40%變化。當使用A431細胞株時，此值顯然未變。對於I－HLA7抗體而言，此行為完全不同。藉由引入G2糖基化設計變異體，在最大抗體濃度下對於LN229細胞之靶細胞殺死自約10%至約50%變化，且對於A431細胞之靶細胞殺死自約40%至約70%變化。在此情況下，儘管I－HLA7相對於I－HHB在非糖基化體設計抗體中具有更低活性，但對於糖基化設計抗體活性順序則逆轉。圖11與圖12亦顯示嵌合ICR62抗體與人化ICR62抗體結構I－HHB與I－HLA7之非糖基化體設計形式(WT)與G2糖型的比較。
實例3
藉由對馬來猴靜脈內(快速)投藥進行初步毒性研究－－生物分析
介紹 糖基化設計抗－EGFR檢定
此生物分析描述繼如在下文闡述之協議中所描述對馬來猴靜脈內(快速)投與抗－EGFR(產自轉染哺乳動物細胞之重組、糖基化設計抗－EGFR抗體，如上文所述該等細胞以具有重鏈I－HHB及輕鏈I－KC之基因的抗體表現載體培養，且如上文所述純化)後量測源於馬來猴之樣品中之抗－EGFR。在約－20℃下冷凍儲存總計78個猴血清樣品直至使用。
用於確定抗－EGFR之生物分析方法使用ELISA方法量測抗－EGFR之血清濃度。對於準確度及不準確度而言，接受標準係設定在±20%(低QC為±25%)。
物質與方法
目的：此研究之目的係評估糖基化－mAb(抗－EGFR)對馬來猴靜脈內(快速)投藥繼之8週之恢復期的全身性毒性潛力。
劑量水平選擇之基本原理
對於人類研究而言，1.5－7.5 mg/kg係預期之範圍(在人類中，7.5 mg/kg係相似化合物之相應劑量)。
#根據提供之測試物質表示。
組織學
免疫檢定程序
將一盤以每孔100 μl之塗布溶液(5 μl綿羊抗人類IgG(吸附IgG之猴，the Binding Site，UK))塗布，添加至11495 μl重碳酸鹽緩衝液(0.05 M，pH 9.6)且在室溫下培育大約2小時。將該盤以每孔400 μl洗滌溶液(PBS(Sigma Chemical Co.，UK))0.01v/v% Triton－Xl00(Sigma Chemical Co.，UK))洗滌3次且拍乾。
以每孔200 μl添加檢定緩衝液(1 w/v% BSA，Sigma Chemical Co.，UK)且在室溫下培育大約1小時。將該盤以每孔400 μl之洗滌溶液洗滌3次且拍乾。
以每孔100 μl添加校正標準品、品質對照物(QC)及/或樣品，且在室溫下培育大約2小時，其後將該盤以每孔400 μl之洗滌溶液洗滌3次且拍乾。
以每孔100 μl添加共軛溶液(6 μl山羊抗人類IgG kappa－HRP共軛(Bethyl Laboratories Inc.，USA)添加至12 ml檢定緩衝液中)且在室溫下培育大約1小時。將該盤以每孔400 μl之洗滌溶液洗滌3次且拍乾。
以每孔100 μl添加三甲基聯苯胺(TMB；Europa Bioproducts，Ely，UK)。覆蓋該盤且在室溫下培育大約15分鐘。接著各孔中添加100 μl之停止溶液(0.5 M HCl，Fisher，UK)。在DYNATECH MRX微定量盤式計數器(Mettler Instruments，UK)上在450 nm處讀取吸光率(參考過濾器630 nm)。
結果與討論 測試樣品分析
抗－EGFR之濃度藉由在78個根據上文描述之協議產生之猴血清樣品中進行免疫檢定方法(ELISA)來量測。此等結果在下表19－21中呈現。
sd標準差
BLQ定量下限(<0.195 μg/ml)sd標準差註：BLQ在計算中輸入為0
sd標準差
實例4 藉由對馬來猴靜脈內(快速)投藥進行初步毒性研究－－毒性動力學 概要
在28－日毒性研究之第1、8、15及22日對三群馬來猴(每群1隻雄性及1隻雌性)靜脈內快速給藥抗－EGFR以評估該等動物對抗－EGFR之全身性暴露量。第一次給藥後高達672小時收集之樣品中抗－EGFR之血清濃度藉助於免疫檢定方法來確定。血清濃度－時間資料之藥物動力學分析得到以下藥物動力學參數：
第1日在血清抗－EGFR濃度－時間曲線下之面積(AUC1 6 8 )與劑量水平之間的關係在下面呈現：
在第1日，猴對抗－EGFR之全身性暴露量之比率與範圍(以AUC1 6 8 表徵)與在1.5至4.5毫克/公斤/次之劑量範圍中之劑量增加大致成比例地增加，但與在4.5至12毫克/公斤/次之劑量範圍中之劑量增加以大於比例地增加。在最高劑量(12毫克/公斤/次)下，AUC1 6 8 較藉由線性關係預測者高出大約2.8倍。
雌性猴對抗－EGFR之全身性暴露量範圍(AUC1 6 8 )通常與雄性猴中之暴露量相似。
在重複靜脈內給藥後，抗－EGFR之給藥前血清濃度通常高於單次給藥後之彼等值，且指出在整個研究階段抗－EGFR在血清中積累。
不能對所有動物充分地估計最終半衰期，但其可在32.5至63.1小時範圍內進行估計，且在動物中其似乎隨劑量而增加。在雄性猴與雌性猴中在1.5－4.5毫克/公斤/次範圍時，抗－EGFR之總血清清除似乎不受劑量約束，但在最高劑量水平時降低。
總之，在靜脈內毒性研究之第1日在1.5至12毫克/公斤/次劑量範圍內，馬來猴對抗－EGFR之全身性暴露量範圍似乎表徵為非線性(劑量依賴)動力學。增加抗－EGFR之劑量使之高於4.5毫克/公斤/次可能導致較自線性關係預測之全身性暴露量更高之全身性暴露量，此與能力受排除抗－EGFR過程限制之可能性相符合。
另外，本研究亦提供雄性猴與雌性猴對抗－EGFR之全身性暴露量大體上無差異且在重複靜脈內投藥後存在積累的證據。
介紹
在初步毒性研究之第1、8、15及22日以1.5、4.5及12毫克/公斤/次之劑量水平藉由靜脈內快速注射對三群(一雄性馬來猴及一雌性馬來猴)投與抗－EGFR。繼第1日投藥之後在以下時間點自各動物採集血液樣品：給藥後1、4、12、24、72及120小時。另外，在第1日第一次給藥後第8、15與22日給藥前及給藥後1小時及在第1日給藥後第672小時採集樣品。經分離血清在藉由免疫檢定方法分析抗－EGFR血清濃度前在大約－20℃下冷凍。
縮寫
AUC 至無限時間時在血清濃度－時間曲線下之面積AUC1 6 8 在168小時劑量間隔期間在血清濃度－時間曲線下之面積BLQ 量化界限以下ca 大約CL 總血清清除Cm a x 最大血清濃度F 雌性k 最終速率常數M 雄性最終半衰期Tm a x Cm a x 出現時間Vss 穩定階段分配體積
用於研究之抗體
如上文所述產生、純化且表徵糖基化－mAb(抗－EGFR)，糖基化－mAb係一種經Fc－設計以增加Fc－FcγRIII受體結合親和力且增加ADCC之抗－EGFR抗體。簡言之，抗體藉由以表現I－HHB抗體重鏈、I－KC抗體輕鏈、GnT－III及ManII之質體DNA載體共轉染HEK－293－EBNA細胞來產生。使用上文描述之轉染方法之線性按比例增加型式，轉染於旋轉瓶而非T形瓶中培養之細胞單層。在進行上文描述之尺寸排阻層析步驟之前，立即將使用Q－瓊脂糖基質之額外流過離子交換層析步驟包括於純化過程中。
如上文所述使用酶促釋放之Fc源寡醣之MALDI/TOF－MS光譜測定法來分析經Fc－設計抗體之糖基化模式。寡醣概況在圖23中顯示。
對人類EGFR及猴EGFR之結合係藉由如上文所述分別使用A431與COS－7細胞的全細胞結合及基於FACS之分析來證明。結合曲線分別顯示於圖24及圖25中。
如上文所述，由應用Fc設計引起之FcγRIII受體結合增加使用對經設計以表面表現人類FcγRIII之CHO細胞的全細胞結合及基於FACS之分析來證明。結果在圖26中顯示。另外，經設計抗體具有與在別處(Ferrara,C.等人,J Biol Chem. 2005 Dec 5；[E－印刷前公開])描述之"糖基化－2"抗體(在Fc－寡醣上之75%係非岩藻糖基化類型)相等之Fc設計程度。此等經Fc－設計抗體相對於標準非－Fc設計抗體而言，對人類FcγRIII之結合親和力增加高達50倍(當結合至非－Fc設計人類IgG1抗體時，人類受體之158V多形變異體與158F多形變異體之15與150 nM之平衡解離常數分別比較相同受體變異體之750與5000 nM之平衡解離常數)。
如上文所述使用如下兩種靶細胞株量測ADCC：A549人類肺癌瘤細胞及CYNOM－K1馬來猴角質細胞。結果分別於圖27及圖28中顯示。
資料處理
使用電腦軟體WinNonlin Pro 3.3版(Pharsight Corporation，USA)計算藥物動力學參數。
作為本研究之部分而提供之所有血清濃度皆報告至4位有效數字或小數後3位。藥物動力學參數報告如下：Cm a x 、AUC1 6 8 、CL及Vss至4位有效數字；k至小數後4位；至小數後1位。
在藥物動力學處理中，將BLQ(<0.195 μg/mL)之值輸入為0。
毒性動力學
抗－EGFR之最大血清濃度(Cm a x )及其出現時間(Tm a x )係觀察值。在168小時給藥間隔內在血清抗－EGFR濃度－時間曲線之下的面積(AUC1 6 8 )藉由線性梯形法則來估計。在計算AUC1 6 8 值中，0小時之血清抗－EGFR濃度係基於最初兩次採樣時間藉由外推法使用對數－線性回歸分析來估計，然而，若血清濃度在此時段期間不下降，則將在0小時之血清濃度視為與在第一次採樣時間之濃度相等。藉由下式估計至無限時間之在血清抗－EGFR濃度－時間曲線下之面積(AUC)：AUC＝AUC1 6 8 ＋Clast/k其中，Clast係在最後可計量之採樣點之預測血清濃度且k係最終速率常數。
最終速率常數(k)係藉由擬合對數濃度對時間之線性回歸來估計。對於經認可為可靠之k的估計而言，利用以下標準：1.最終資料點明顯任意分佈在單一直線周圍(直觀檢查)2.對於回歸可用最少3個資料點3.回歸係數大於等於0.95，且變異分數占大於等於0.90 4.包括選擇用於回歸之資料點之間隔至少大於自身半衰期兩倍。
最終半衰期()以ln2/k計算。總血清清除(CL)以劑量/AUC計算。在恆穩態分佈之體積(Vss)以劑量.AUMC/AUC2計算。積累(R)以繼最後給藥(第22日)之後之波谷濃度與繼最初給藥(第1日)之後之波谷濃度的比率(意即672小時血清濃度/168小時血清濃度(在第8日給藥前)來評估。
結果與討論
在第1日給藥後直至120小時、在第8、15與22日給藥前及給藥後1小時及在第1日給藥後672小時採集血液樣品以評估繼在研究之第1、8、15及22日以1.5、4.5及12毫克/公斤/次之劑量水平靜脈內快速投與抗－EGFR之後雄性猴與雌性猴對抗－EGFR之全身性暴露量。直至給藥後168小時採集之樣品中抗－EGFR之血清濃度在表27－29中呈現，且平均血清濃度－時間概況在圖18與圖19中說明。
抗－EGFR之藥物動力學參數在表50中呈現，且AUC1 6 8 值在下面概括：
最大血清濃度出現時間(Tm a x )通常係給藥後1小時(第一採樣點)，但在雌性2F462(4.5 mg/kg)與3F612(12 mg/kg)中出現在給藥後4小時(第二採樣點)。然而，對於兩者此等雌性而言，在給藥後4小時之濃度與在給藥後1小時之彼等濃度極相似，且可能在檢定之變化範圍內。因此，在Tm a x 中之明顯延遲不可能係顯著的。
除在第22日雄性2M461(4.5毫克/公斤/次劑量水平)外，在所有動物中在隨後給藥前抗－EGFR之血清濃度均可計量，因此，一般而言，在給藥間隔期間動物持續地暴露於可計量濃度抗－EGFR中。
在血清抗－EGFR濃度－時間曲線(AUC1 6 8 )下之面積與第一日之劑量水平之間的關係在下面呈現：
在第1日，猴對抗－EGFR之全身性暴露量之比率與範圍(以AUC1 6 8 表徵)與在1.5至4.5毫克/公斤/次之劑量範圍中之劑量增加大致成比例地增加，但在4.5至12毫克/公斤/次之劑量範圍中之劑量增加以大於比例地增加。在最高劑量(12毫克/公斤/次)下，AUC1 6 8 較藉由線性關係預測者高出大約2.8倍(圖20)。
雌性猴對抗－EGFR之全身性暴露量範圍(AUC1 6 8 )通常與雄性猴中之暴露量相似。
在重複靜脈內給藥後，抗－EGFR之給藥前血清濃度通常高於單次給藥後之彼等值(圖21－22)，且說明在整個研究階段抗－EGFR在血清中積累。除在最高劑量水平下外，在雌性中之此積累通常較在雄性中之積累低。繼在第22日最後給藥之後(第1日給藥後672小時)之波谷(給藥前)濃度與繼在第1日最初給藥之後波谷濃度的比率在下面表26中呈現：
在第1日之抗－EGFR之最終速率常數(k)與相應最終半衰期(t)在表30中呈現。不能對所有動物充分地估計最終半衰期，但其可在32.5至63.1小時範圍內進行估計，且在動物中其似乎隨劑量而增加。在雄性猴與雌性猴中在1.5－4.5毫克/公斤/次範圍時，抗－EGFR之總血清清除似乎不受劑量約束，但在最高劑量水平時降低。
總之，在靜脈內毒性研究之第1日在1.5至12毫克/公斤/次劑量範圍內，馬來猴對抗－EGFR之全身性暴露量範圍似乎表徵為非線性(劑量依賴)動力學。增加抗－EGFR之劑量使之高於4.5毫克/公斤/次可能導致較自線性關係預測之全身性暴露量更高之全身性暴露量，此與能力受排除抗－EGFR過程限制之可能性相符合。
另外，本研究亦提供雄性猴與雌性猴對抗－EGFR之全身性暴露量大體上無差異且在重複靜脈內投藥後存在積累的證據。
血液化學與血液學
血液樣品係採集自已於第1、8、15及22日靜脈內快速注射投與糖基化MAB抗－EGFR之馬來猴股靜脈。樣品係繼隔夜禁食(未死)之後採集自未用於給藥之肢。在第二次給藥後三日預處理且在結束時對於以下參數使用馬尿酸鋰作為抗凝血劑來檢查樣品：鹼性磷酸酶丙胺酸胺基轉移酶天冬胺酸胺基轉移酶膽紅素－總尿素肌酸酐葡萄糖膽固醇－總三酸甘油酯鈉鉀氯化物鈣磷總蛋白蛋白電泳圖白蛋白/球蛋白比率
一般正常馬來猴血液化學分析資料在表31中呈現。
用於血液學周邊血液分析之血液係採集自已於第1、8、15及22日靜脈內快速注射投與糖基化MAB抗－EGFR之馬來猴股靜脈。樣品係繼隔夜禁食(未死)之後採集自未用於給藥之肢。在第二次給藥後三日預處理且在結束時對於以下參數來檢查樣品：1)使用EDTA作為抗凝血劑血球容量計血紅蛋白濃度紅血球計數網狀細胞平均細胞血紅蛋白平均細胞血紅蛋白濃度平均細胞體積總白血球計數分化白血球計數血小板計數血液形態學異常紅血球大小不均小紅細胞大紅細胞染色不足染色過度
2)使用檸檬酸鹽作為抗凝血劑凝血酶原時間活化部分促凝血酶原激酶時間
一般正常馬來猴血液學分析資料在表32中呈現。
該等猴之生物化學積累個別值在下表33a－h中呈現：
該等猴之血液學積累個別值在下表34a－1中呈現：
顯微病理學－－治療相關結果
報告在以12毫克/公斤/日給藥之雌性猴中有膽管周圍炎(環繞膽管之結締組織發炎)，但在任何其他雌性猴或雄性猴中皆沒有。此結果可與以糖基化－mAb(抗－EGFR)治療有關，但此等動物數量太小，顯著性並不確定。所有其他結果皆認為係偶然出現的且無毒物學顯著性。
肉眼病理學與組織病理學
對於所有測試動物之組織病理學概要自下表35中闡述：表35組織病理學－對所有動物結果之群體分佈與嚴重性
所有動物之個別結果
對個別動物之病理學觀察在下表36中闡述：
個別馬來猴之體重於下表37中呈現：
結論
在注射位點無治療效應且無臨床結果，認為此與以糖基化－mAb(抗－EGFR)治療有關。體重變化係在正常預期範圍內。以肉眼檢查無認為與治療有關之結果，且動物之器官重量係在正常預期範圍內。總之，在無明顯全身性毒性結果情況下，以1.5、4.5或12毫克/公斤/次治療係較好耐受的。
因為EGFR在多種正常組織(包括肝、腎及皮膚)表面上存在，故其並非腫瘤特異性目標。先前已對人類投與具有人類IgG1 Fc區之抗－EGFR抗體，且已顯示可耐受之副作用概況(Vanhoefer,U.等人，Clin.Oncol. 2004 Jan 1；22(1)：175－84；Needle MN,Semin Oncol. 2002 Oct；29(5 SupPl 14)：55－60)。明顯地，由於可針對諸如肝、腎及皮膚之重要正常組織顯示增強之殺死活性，故應顯著關注向人類或其他哺乳動物投與具有顯著增加之ADCC的抗－EGFR抗體。令人驚訝地，本發明者發現對哺乳動物活體內投與如上述經Fc－設計且具增加高達1000倍之ADCC活性之該抗－EGFR抗體並不導致顯著毒性。抗體之濃度保持大於1微克/毫升歷時至少4週(且對於某些動物大於100微克/毫升)。該等暴露量水平對於抗體療法係典型的。本研究之抗體的最大ADCC已在1微克/毫升濃度下達成。對人類癌症病患給藥40及100 mg之抗－EGFR抗體(親本大鼠ICR62抗體)之單次劑量投藥已顯示活體內特異性靶向腫瘤(Modjtahedi,H.等人，Br J Cancer .1996 Jan；73(2)：228－35.)。馬來猴效應細胞具有高度同源之FcγRIII受體且已顯示對經Fc－設計抗體(及對經糖基化設計以增加在Fc區中非岩藻糖基化寡醣水平之抗體)介導增強之ADCC。ADCC水平增加與對人類效應細胞(PBMC)所觀察之ADCC水平增加極相似。
總之，吾人已發現經Fc設計以增加Fc－FcγRIII結合親和力且增加ADCC之抗－EGFR抗體可投與至哺乳動物以給出大於1微克抗體/毫升血清之濃度持續至少4週之時間，以給出通常與活體內抗體在靶細胞上之顯著積累有關之藥物暴露量，而不導致顯著毒性。
本發明之抗原結合分子之毒性可使用上文描述之任何方法及/或參數(例如，血液化學值、組織病理學指標等)或藉由任何熟習此項技術者已知之方法來量測及/或確定。
實例5 對輕鏈CDR之修飾
使用上文描述之方法，自I－KC輕鏈可變區結構(SEQ ID NO：43與SEQ ID NO：45)產生抗－EGFR輕鏈可變區變異體，其中，在大鼠ICR62 CDR中在多個位置編碼胺基酸殘基之序列經來自人類生殖系可變基因序列之相應胺基酸殘基置換。表38顯示在I－KC輕鏈可變區結構(SEQ ID NO：45)之CDR內進行的取代：
除Y32W交換外，上文鑑定之所有取代殘基皆源於人類VK1_6受體序列，其中在SEQ ID NO：45中在位置32處，相關之人類生殖系序列之W經Y取代。
各I－KC變異體結構(I－KC1至I－KC9)皆與一包含結構I－HHD(SEQ ID NO：16與SEQ ID NO：15)之重鏈可變區配對，且根據在先前實例中描述之方法執行結合檢定。將結構I－KC1至I－KC9在A431靶細胞中對EGFR之結合親和力與I－KC結構(SEQ ID NO：46與SEQ ID NO：45)在A431靶細胞中對EGFR之結合親和力相比較(圖29)。如圖29中所見，僅對殘基34修飾其相應人類序列(N34G)導致結合親和力輕微下降(EC50值增加10倍)。所有其他結構皆保持可與I－KC結構(SEQ ID NO：45)比較的結合活性。因此，當與對EGFR有特異性之嵌合(例如，人化)重鏈結構相配對時，輕鏈可完全係人類輕鏈(例如，來自人類輕鏈V基因序列)且仍保持對EGFR之特異性結合。詳言之，CDR2與CDR3可完全以人類生殖系形式。
包含EGFR特異性CDR之抗原結合分子
因此，本發明預期一種包含嵌合(例如，人化)重鏈可變區之抗原結合分子，該嵌合(例如，人化)重鏈可變區包含與輕鏈可變區配對之EGFR特異性CDR，其中，該輕鏈可變區具有少於10個非人類胺基酸殘基。在其他實施例中，該輕鏈可變區具有少於9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個或1個非人類胺基酸殘基。在較佳實施例中，該輕鏈可變區具有少於2個或少於1個(意即，無)非人類胺基酸殘基。在一實施例中，該輕鏈可變區包含一或多個人類生殖系可變區基因序列。編碼輕鏈可變區之人類生殖系可變區基因序列在此項技術中已知，且可在(例如)IMGT資料庫(可在http：//imgt.cines.fr/home.html 中得到)中發現。在一較佳實施例中，該人類生殖系序列源於VK1_6生殖系序列。在其他實施例中，在該人類生殖系輕鏈可變區胺基酸序列內之胺基酸殘基可經一或多個來自另一人類生殖系輕鏈可變區序列之殘基取代。
在一實施例中，本發明係針對於一種抗原結合分子，其包含一係選自由以下各序列組成之群之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID No：3、SEQ ID No：5、SEQ ID No：7、SEQ ID No：9、SEQ ID No：11、SEQ ID No：13、SEQ ID No：15、SEQ ID No：17、SEQ ID No：19、SEQ ID No：21、SEQ ID No：23、SEQ ID No：25、SEQ ID No：27、SEQ ID No：29、SEQ ID No：31、SEQ ID No：33、SEQ ID No：35、SEQ ID No：37、SEQ ID No：39及SEQ ID No：121，及一包含藉由一或多個人類生殖系可變基因序列編碼之多肽之輕鏈。在一較佳實施例中，該人類生殖系序列源於VK1_6生殖系序列。
在另一實施例中，本發明係針對於一種抗原結合分子，其包含一選自由以下各序列組成之群之序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：122及SEQ ID NO：124；(b)一選自由以下各序列組成之群之序列：SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：106及SEQ ID NO：126；(c)SEQ ID NO：108；及(d)一包含藉由一或多個人類生殖系基因序列編碼之人類輕鏈可變區的多肽。在一特別實施例中，該人類生殖系序列源於VK1_6生殖系序列。在另一實施例中’該人類生殖系可變區基因序列包含VK1_6生殖系基因序列，其一或多個胺基酸密碼子經來自不同人類生殖系輕鏈可變區基因序列之序列取代。
在其他實施例中，本發明之抗原結合分子包含本發明之EGFR特異性重鏈可變區及SEQ ID NO：45之變異體。在一實施例中，該SEQ ID NO：45之變異體包含一在互補決定區(CDR)中之一或多個位置處之胺基酸取代。在特別實施例中，該取代係在選自由以下各位置組成之群之位置處之胺基酸取代：SEQ ID NO：45之胺基酸位置30、SEQ ID NO：45之胺基酸位置32、SEQ ID NO：45之胺基酸位置34、SEQ ID NO：45之胺基酸位置50、SEQ ID NO：45之胺基酸位置51、SEQ ID NO：45之胺基酸位置52、SEQ ID NO：45之胺基酸位置53、SEQ ID NO：45之胺基酸位置56、SEQ ID NO：45之胺基酸位置94及其取代之任意組合。在更特別實施例中，在SEQ ID NO：45中之取代係選自由以下各取代組成之群：在SEQ ID NO：45之位置30處精胺酸(R)取代天冬醯胺酸(N)；在SEQ ID NO：45之位置32處色胺酸(W)取代酪胺酸(Y)；在SEQ ID NO：45之位置34處甘胺酸(G)取代天冬醯胺酸(N)；在SEQ ID NO：45之位置50處酥胺酸(T)取代天冬醯胺酸(N)；在SEQ ID NO：45之位置51處丙胺酸(A)取代酥胺酸(T)；在SEQ ID NO：45之位置52處絲胺酸(S)取代天冬醯胺酸(N)；在SEQ ID NO：45之位置53處絲胺酸(S)取代天冬醯胺酸(N)；在SEQ ID NO：45之位置56處絲胺酸(S)取代酥胺酸(T)；在SEQ ID NO：45之位置94處酪胺酸(Y)取代苯丙胺酸(F)；及其任意組合。在一特別實施例中，在SEQ ID NO：45中之所有此等胺基酸殘基取代皆併入一單一輕鏈變異體中。在較佳實施例中，當輕鏈變異體與包含本發明之重鏈可變區之多肽配對時，包含對ICR62 CDR具有胺基酸取代之輕鏈變異體的抗原結合分子保持對EGFR的特異性結合(與包含輕鏈可變區(包含SEQ ID NO：45序列)之抗原結合分子相比較)。
本發明亦係針對於編碼任何上文之多肽及/或抗原結合分子的聚核苷酸。本發明進一步係針對於與醫藥學上可接受之載劑一起之上文描述之抗原結合分子。
＊ ＊ ＊
在本說明書中提及之所有出版物，諸如教材、期刊文章、基因庫或其他序列資料庫記錄、公開之申請案及專利申請案均以相同範圍以引用的方式併入本文中，如同各個別公開案或專利申請案特別地且個別地指出以引用的方式併入本文。
圖1顯示當與人化ICR62結構I－HHC(重鏈)及I－KB(輕鏈)組合時，個別嵌合大鼠－人類ICR62多肽重鏈與嵌合大鼠－人類ICR62多肽輕鏈之機能活性。rVL代表嵌合輕鏈，且rVH代表嵌合重鏈。"r"命名指示可變域係來自原始大鼠抗體。
圖2顯示人化ICR62抗體之結合活性，該人化ICR62抗體包含重鏈可變區結構I－HHC、I－HHA及I－HLA與以多種組態配對之人化輕鏈可變區結構I－KA及I－KB。
圖3顯示人化ICR62抗體之結合活性，該人化ICR62抗體包含重鏈可變區結構I－HLB、I－HLC及I－HLA與以多種組態配對之人化輕鏈可變區結構I－KA及I－KC。
圖4顯示與嵌合大鼠－人類ICR62抗體相比較時人化ICR62抗體之結合活性，該人化ICR62抗體包含重鏈可變區結構I－HLA2、I－HLA3及I－HLA4與人化輕鏈可變區結構I－KC。
圖5顯示與嵌合大鼠－人類ICR62抗體相比較時人化ICR62抗體之結合活性，該人化ICR62抗體包含重鏈可變區結構I－HLA1、I－HLA3、I－HLA5及I－HLA6與人化輕鏈可變區結構I－KC。
圖6顯示與嵌合大鼠－人類ICR62抗體相比較時人化ICR62抗體之結合活性，該人化ICR62抗體包含重鏈可變區結構I－HLA7、I－HLA6及I－HHB與人化輕鏈可變區結構I－KC。
圖7顯示與嵌合大鼠－人類ICR62抗體相比較時人化ICR62抗體之結合活性，該人化ICR62抗體包含重鏈可變區結構I－HHF、I－HLA9及I－HLA8與人化輕鏈可變區結構I－KC。
圖8顯示人化抗體之結合活性，該人化抗體包含重鏈可變區結構I－HHB、I－HHD、I－HHG、I－HHF、I－HLA7及I－HLA9與人化輕鏈可變區結構I－KC。
圖9顯示多種糖型嵌合ICR62抗體以及人化變異體I－HLA4之抗體介導細胞毒性(ADCC)之比較。"G1"係指藉由GnTIII共表現之抗體之糖基化設計。"G2"係指藉由GnTIII與ManII共表現之抗體之糖基化設計。"WT"係指非糖基化體設計之抗體。人化重鏈結構與I－KC輕鏈結構配對。
圖10顯示人化ICR62抗體結構I－HHB與I－HLA7之非糖基化體設計形式(WT)與G2糖型(意即，藉由GnTIII與ManII共表現之糖基化設計)之ADCC的比較。將相同抗體應用至兩種不同靶細胞株：在組A中，使用靶細胞株LN229；在組B中，使用靶細胞株A431。人化重鏈結構與I－KC輕鏈結構配對。
圖11A與圖11B顯示嵌合ICR62抗體與人化ICR62抗體結構I－HHB與I－HLA7之非糖基化體設計形式(WT)與G2糖型之ADCC的比較。使用靶細胞株A431。人化重鏈結構與I－KC輕鏈結構配對。
圖12顯示嵌合ICR62抗體與人化ICR62抗體結構I－HHB與I－HLA7之G2糖型之72h ADCC的比較。人化重鏈結構與I－KC輕鏈結構配對。
圖13顯示與大鼠ICR62序列相比較，比對人化ICR62重鏈可變區之結構的胺基酸序列。點代表在一特定結構內之特定位置處之胺基酸殘基的相同性。
圖14顯示使用CHO細胞顯示重組人類FcγRIIIa之FcγRIIIa－Fc結合檢定。將經糖基化設計之I－HHB/KC人化抗－EGFR IgG1抗體與非糖基化設計(Wt)之抗體相比較。
圖15顯示用於糖基化設計人化抗－EGFR IgG1抗體I－HHB/KC之MALD/TOF－MS寡醣概況。藉由在抗體產生細胞中過度表現編碼具有GnTIII與高爾基體甘露糖苷酶II活性之酶的基因來達成糖基化設計，產生超過70%非岩藻糖基化Fc－Asn297－聯接寡醣。
圖16顯示確定在1%猴血清基質(猴血清池CMS25/31/33，由HLS提供)中之抗－EGFR之抗－EGFR精確概況(校準範圍n＝6重複)。
圖17顯示確定在1%猴血清基質中之抗－EGFR的代表性抗－EGFR校準曲線。
圖18顯示對雄性馬來猴每週靜脈內投與抗－EGFR之第1日抗－EGFR的血清濃度。
圖19顯示對雌性馬來猴每週靜脈內投與抗－EGFR之第1日抗－EGFR的血清濃度。
圖20顯示對馬來猴每週靜脈內投與抗－EGFR之第1日在血清抗－EGFR濃度－時間曲線下之面積(AUC1 6 8 )與劑量水平之間的關係。
圖21顯示對雄性馬來猴每週靜脈內投與抗-EGFR期間抗-EGFR的血清濃度。
圖22顯示對雌性馬來猴每週靜脈內投與抗-EGFR期間抗-EGFR的血清濃度。
圖23顯示自用於下文實例中描述之活體內猴研究之經Fc-設計(糖基化設計)之抗-EGFR抗體的寡醣MALDI/TOF-MS概況。
圖24顯示對在人類A431上皮癌瘤細胞表面上所表現之EGFR的結合。用於結合研究之抗體係用於下文實例中描述之活體內猴研究的經Fc-設計抗-EGFR抗體(I-HHB結構)。
圖25顯示對在猴COS-7腎細胞表面上所表現之EGFR的結合。所用抗體係抗-EGFR抗體(I-HHB重鏈；I-KC輕鏈)。出於參考之目的，展示對低人類EGFR表現細胞、MCF-7乳癌細胞之結合。
圖26顯示使用完全細胞(經設計以在其表面表現人類FcgRIIIa之CHO細胞)之Fc-FcγRIIIa結合。所用抗體係用於下文實例中描述之活體內猴研究的經Fc-設計(糖基化設計)之抗-EGFR抗體。為進行比較，展示對未經Fc-設計(未經修飾)對照IgG1抗體之結合。
圖27顯示4小時ADCC檢定，其係藉由經Fc-設計(糖基化設計)之抗-EGFR抗體介導之ADCC，且藉由基於LDH釋放之方法量測。靶細胞(T)係A549人類肺癌瘤細胞(效應(T)人類PBMC E：T比率=25：1)。為進行比較，展示對未經Fc-設計(未 經修飾)形式抗體的ADCC活性。
圖28顯示4小時ADCC檢定，其係藉由經Fc-設計(糖基化設計)之抗-EGFR抗體介導之ADCC，且藉由基於LDH釋放之方法量測。靶細胞(T)係CYNOM-K1馬來猴角化細胞株(效應(T)人類PBMCE：T比率=25：1)。為進行比較，展示對未經Fc-設計(未經修飾)形式抗體的ADCC活性。
圖29顯示基於與重鏈I-HHD結構配對之I-KC結構之多種輕鏈結構變異體的EGFR靶向結合。
<110> 瑞士商克雷雅生物公司<120> 與上皮生長因子受體(EGFR)結合之抗原結合分子，編碼該抗原結合分子之載體及其用途<130> 1975.0430000 <140> 095104103 <141> 2006－02－07 <150> 60/650,115 <151> 2005－02－07 <160> 127 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> 鼠屬物種<220> <223> ICR62 VH <400> 1<210> 2 <211> 359 <212> DNA <213> 鼠屬物種<220> <223> ICR62 VH <400> 2<210> 3 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HHA <400> 3<210> 4 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HHA <400> 4<210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HHB <400> 5<210> 6 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HHB <400> 6<210> 7 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HHC <400> 7 <210> 8 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HHC <400> 8<210> 9 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLA <400> 9 <210> 10 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLA <400> 10<210> 11 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLB <400> 11 <210> 12 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLB <400> 12<210> 13 <211> 120<212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLC <400> 13 <210> 14 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLC <400> 14<210> 15 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HHD <400> 15 <210> 16 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HHD <400> 16<210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HHE <400> 17 <210> 18 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HHE <400> 18<210> 19 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HHF <400> 19 <210> 20 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HHF <400> 20<210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HHG <400> 21 <210> 22 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HHG <400> 22<210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLA1 <400> 23 <210> 24 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLA1 <400> 24<210> 25 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLA2 <400> 25 <210> 26 <211> 360 <212> DNA <213>人造<220> <223> I－HLA2 <400> 26<210> 27 <211> 120 <212> PRT <213>人造<220> <223> I－HLA3 <400> 27<210> 28 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLA3 <400> 28<210> 29 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLA4 <400> 29<210> 30 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLA4 <400> 30<210> 31 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLA5 <400> 31<210> 32 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLAS <400> 32<210> 33 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLA6 <400> 33<210> 34 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLA6 <400> 34 <210> 35 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLA7 <400> 35<210> 36 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLA7 <400> 36 <210> 37 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLA8 <400> 37<210> 38 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLA8 <400> 38 <210> 39 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLA9 <400> 39<210> 40 <211> 360 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLA9 <400> 40<210> 41 <211> 19 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 訊號序列<400> 41<210> 42 <211> 57 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 訊號序列<400> 42<210> 43 <211> 108 <212> PRT <213> 鼠屬物種<220> <223> ICR62 VL <400> 43 <210> 44 <211> 324 <212> DNA <213> 鼠屬物種<220> <223> ICR62 VL <400> 44<210> 45 <211> 108 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－KC <400> 45 <210> 46 <211> 324 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－KC <400> 46<210> 47 <211> 22 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 訊號序列<400> 47<210> 48 <211> 66 <212> DNA <213>人造<220> <223>訊號序列<400> 48<210> 49 <211> 109 <212> PRT <213>人造<220> <223> I－KA <400> 49<210> 50 <211> 327 <212> DNA <213>人造<220> <223> I－KA <400> 50 <210> 51 <211> 109 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－KB <400> 51<210> 52 <211> 327 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－KB <400> 52 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 53<210> 54 <211> 15 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 54<210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 55<210> 56 <211> 15 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 56<210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 57<210> 58 <211> 15 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 Kabat <400> 58<210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 Chothia <400> 59<210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 Chothia <400> 60<210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 Chothia <400> 61<210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDRl Chothia <400> 62<210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDRl Chothia <400> 63<210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDRl Chothia <400> 64<210> 65 <211> 10 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDRl AbM <400> 65<210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 66<210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 67<210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 68<210> 69 <211> 10 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 69<210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 70<210> 71 <211> 10 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 71<210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 72<210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 73<210> 74<211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR1 AbM <400> 74<210> 75 <211> 17 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 75<210> 76 <211> 51 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 76<210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 77<210> 78 <211> 51 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 78<210> 79 <211> 17 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 79<210> 80 <211> 51 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 80<210> 81 <211> 17 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 81<210> 82 <211> 51 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 82<210> 83 <211> 17 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 83 <210> 84 <211> 51 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 84<210> 85 <211> 17 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 85<210> 86 <211> 51 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 86<210> 87 <211> 17 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 87 <210> 88 <211> 51 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 88<210> 89 <211> 17 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 89<210> 90 <211> 51 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Kabat <400> 90<210> 91 <211> 8 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 91<210> 92 <211> 24 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 92<210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 93<210> 94 <211> 24 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 94<210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 95<210> 96 <211> 24 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 Chothia <400> 96<210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 97<210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 98<210> 99 <211> 10 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 99<210> 100 <211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 100<210> 101 <211> 10 <212> PRT <213> 人造<220> <223>重鏈CDR2 AbM <400> 101<210> 102 <211> 30 <212> DNA <213>人造<220> <223>重鏈CDR2 AbM <400> 102<210> 103 <211> 10 <212> PRT <213>人造<220> <223>重鏈CDR2 AbM <400> 103<210> 104 <211> 30 <212> DNA <213>人造<220> <223>重鏈CDR2 AbM <400> 104<210> 105 <211> 10 <212> PRT <213>人造<220> <223>重鏈CDR2 AbM <400> 105<210> 106 <211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR2 AbM <400> 106<210> 107 <211> 11 <212> PRT <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR3 Kabat Chothia AbM <400> 107<210> 108 <211> 33 <212> DNA <213> 人造<220> <223> 重鏈CDR3 Kabat Chothia AbM <400> 108<210> 109 <211> 328 <212> PRT <213> 智人<220> <223> IgG1恆定區<400> 109 <210> 110 <211> 987 <212> DNA <213> 智人<220> <223> IgG1恆定區<400> 110<210> 111 <211> 11 <212> PRT <213> 人造<220> <223> Kabat輕鏈CDR1 <400> 111<210> 112 <211> 33 <212> DNA <213> 人造<220> <223> Kabat輕鏈CDR1 <400> 112<210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> 人造<220> <223> Kabat輕鏈CDR1 <400> 113<210> 114 <211> 33 <212> DNA <213> 人造<220> <223> Kabat輕鏈CDR1 <400> 114<210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> 人造<220> <223> Kabat輕鏈CDR2 <400> 115<210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> 人造<220> <223> Kabat輕鏈CDR2 <400> 116<210> 117 <211> 8 <212> PRT <213> 人造<220> <223> Kabat輕鏈CDR3 <400> 117<210> 118 <211> 21 <212> DNA <213> 人造<220> <223> Kabat輕鏈CDR2 <400> 118<210> 119 <211> 24 <212> DNA <213> 人造<220> <223> Kabat輕鏈CDR3 <400> 119<210> 120 <211> 361 <212> DNA <213> 人造<220> <223> I－HLA10 <400> 120 <210> 121 <211> 120 <212> PRT <213> 人造<220> <223> I－HLA10 <400> 121<210> 122 <211> 15 <212> DNA <213> 人造<220> <223> Kabat重鏈CDR1 <400> 122<210> 123 <211> 5 <212> PRT <213> 人造<220> <223> Kabat重鏈CDR1 <400> 123<210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> 人造<220> <223> AbM重鏈CDR1 <400> 124<210> 125 <211> 10 <212> PRT <213> 人造<220> <223> AbM重鏈CDR1 <400> 125<210> 126 <211> 51<212> DNA <213> 人造<220> <223> Kabat重鏈CDR2 <400> 126<210> 127 <211> 17 <212> PRT <213> 人造<220> <223> Kabat重鏈CDR2 <400> 127

Claims (154)

  1. 一種經分離多肽，其包含重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：121。
  2. 如請求項1之經分離多肽，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：15之序列。
  3. 一種經分離多肽，其包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：51。
  4. 如請求項3之經分離多肽，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：45之序列。
  5. 一種特異性地結合EGFR之抗原結合分子，該抗原結合分子包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：(a)選自由以下所組成之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：125；及 (b)SEQ ID NO：79之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3；且其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  6. 如請求項5之抗原結合分子，其中該重鏈可變區包含：(a)選自由以下所組成之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：65；及(b)SEQ ID NO：79之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3；且其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  7. 如請求項6之抗原結合分子，其中該重鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：53之重鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：79之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3；且其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  8. 一種特異性地結合EGFR之抗原結合分子，該抗原結合分 子包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含：(a)選自由以下所組成之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：125；及(b)選自由以下所組成之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103及SEQ ID NO：105；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3；且其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  9. 如請求項8之抗原結合分子，其中該重鏈可變區包含：(a)選自由以下所組成之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：65；及(b)選自由以下所組成之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：91及SEQ ID NO：97；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3；且 其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  10. 如請求項9之抗原結合分子，其中該重鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：59之重鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：91之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3；且其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  11. 如請求項9之抗原結合分子，其中該重鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：65之重鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：97之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3；且其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  12. 一種特異性地結合EGFR之抗原結合分子，該抗原結合分子包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：121；且其中該輕鏈可變區包含選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：51。
  13. 一種特異性地結合EGFR之抗原結合分子，該抗原結合分子包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區包含選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：121；且其中該輕鏈可變區包含選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：51。
  14. 如請求項12或13之抗原結合分子，其中該重鏈可變區包含SEQ ID NO：15之序列；且其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：45之序列。
  15. 如請求項5至13中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子為抗體。
  16. 如請求項5至13中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結 合分子為抗體片段。
  17. 如請求項16之抗原結合分子，其中該抗體片段係選自由scFv片段、Fv片段、F(ab')2 片段、微型抗體、雙功能抗體、三功能抗體及四功能抗體組成之群。
  18. 如請求項5至13中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含人類Fc區。
  19. 如請求項18之抗原結合分子，其中該人類Fc區係人類IgGFc區。
  20. 如請求項18之抗原結合分子，其中該抗原結合分子經糖基化設計以修飾該Fc區之寡醣。
  21. 如請求項20之抗原結合分子，其中與非糖基化設計之抗原結合分子相比較，該Fc區具有減少數量之岩藻糖殘基。
  22. 如請求項20之抗原結合分子，其中與非糖基化設計之抗原結合分子相比較，該經糖基化設計之抗原結合分子在該Fc區中具有增加之GlcNAc殘基對岩藻糖殘基之比率。
  23. 如請求項20之抗原結合分子，其中與非糖基化設計之抗原結合分子相比較，該Fc區具有增加比例之對分寡醣。
  24. 如請求項20之抗原結合分子，其中該經修飾寡醣係對分錯合物。
  25. 如請求項20之抗原結合分子，其中與非糖基化設計之抗原結合分子相比較，該經修飾寡醣在該抗原結合分子之Fc區中具有增加比例之對分、非岩藻糖基化寡醣。
  26. 如請求項25之抗原結合分子，其中該對分、非岩藻糖基化寡醣係雜合物。
  27. 如請求項25之抗原結合分子，其中該對分、非岩藻糖基化寡醣係錯合物。
  28. 如請求項20之抗原結合分子，其中與非糖基化設計之抗原結合分子相比較，該抗原結合分子具有增加之效應功能。
  29. 如請求項28之抗原結合分子，其中該增加之效應功能係選自由以下所組成之群：增加之Fc介導細胞毒性、增加之對NK細胞之結合、增加之對巨噬細胞之結合、增加之對單核細胞之結合、增加之對多形核細胞之結合、增加之直接訊號誘發之凋亡、增加之神經樹突細胞成熟及增加之T細胞引動。
  30. 如請求項20之抗原結合分子，其中與非糖基化設計之抗原結合分子相比較，該抗原結合分子具有增加之Fc受體結合。
  31. 如請求項30之抗原結合分子，其中該Fc受體係Fc活化受體。
  32. 如請求項30之抗原結合分子，其中該Fc受體係FcγRIIIa受體。
  33. 如請求項18之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少50%之寡醣係對分的。
  34. 如請求項18之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少70%之寡醣係對分的。
  35. 如請求項18之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少90%之寡醣係對分的。
  36. 如請求項18之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少50%之 寡醣係非岩藻糖基化的。
  37. 如請求項18之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少75%之寡醣係非岩藻糖基化的。
  38. 如請求項18之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少90%之寡醣係非岩藻糖基化的。
  39. 如請求項18之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少20%之寡醣係對分及非岩藻糖基化的。
  40. 如請求項18之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少35%之寡醣係對分及非岩藻糖基化的。
  41. 如請求項18之抗原結合分子，其中在該Fc區中至少70%之寡醣係對分及非岩藻糖基化的。
  42. 如請求項5至13中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含經設計成具有增加之效應功能之Fc區，其係由包含下列之方法製造：(a)在允許產生該抗原結合分子且修飾存在於該抗原結合分子之Fc區上之寡醣的條件下，培養經設計成表現至少一種編碼具有β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III活性之多肽之核酸的宿主細胞；及(b)分離該抗原結合分子。
  43. 如請求項42之抗原結合分子，其中該增加之效應功能係選自由下列所組成之群：增加之Fc介導細胞毒性、增加之對NK細胞之結合、增加之對巨噬細胞之結合、增加之對單核細胞之結合、增加之對多形核細胞之結合、增加之直接訊號誘發之凋亡、增加之神經樹突細胞成熟及增加之T細胞 引動。
  44. 如請求項43之抗原結合分子，其中該增加之效應功能係增加之對NK細胞之結合。
  45. 如請求項42之抗原結合分子，其中該宿主細胞進一步設計成表現編碼具有甘露糖苷酶II活性之多肽之核酸。
  46. 如請求項5至13中任一項之抗原結合分子，其中該抗原結合分子包含經設計成具有增加之Fc受體結合親和性之Fc區，其係由包含下列之方法製造：(a)在允許產生該抗原結合分子且修飾存在於該抗原結合分子之Fc區上之寡醣的條件下，培養經設計成表現至少一種編碼具有β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III活性之多肽之核酸的宿主細胞；及(b)分離該抗原結合分子。
  47. 如請求項46之抗原結合分子，其中該Fc受體係Fc活化受體。
  48. 如請求項46之抗原結合分子，其中該Fc受體係FcγRIIIa受體。
  49. 如請求項46之抗原結合分子，其中該宿主細胞進一步設計成表現編碼具有甘露糖苷酶II活性之多肽之核酸。
  50. 一種特異性地結合EGFR之抗體，該抗體包含：包含SEQ ID NO：15之序列之重鏈可變區、包含SEQ ID NO：45之序列之輕鏈可變區及人類Fc區。
  51. 如請求項50之抗體，其中該抗體經糖基化設計以修飾該Fc區之寡醣。
  52. 如請求項51之抗體，其中與非糖基化設計之抗體相比較，該Fc區具有減少數量之岩藻糖殘基。
  53. 如請求項51之抗體，其中與非糖基化設計之抗原結合分子相比較，該經糖基化設計之抗原結合分子在該Fc區中具有增加之GlcNAc殘基對岩藻糖殘基之比率。
  54. 如請求項51之抗體，其中與非糖基化設計之抗原結合分子相比較，該Fc區具有增加比例之對分寡醣。
  55. 如請求項51之抗體，其中該經修飾寡醣係對分錯合物。
  56. 如請求項51之抗體，其中與非糖基化設計之抗原結合分子相比較，該經修飾寡醣在該抗原結合分子之Fc區中具有增加比例之對分、非岩藻糖基化寡醣。
  57. 如請求項51之抗體，其中該對分、非岩藻糖基化寡醣係雜合物。
  58. 如請求項51之抗體，其中該對分、非岩藻糖基化寡醣係錯合物。
  59. 如請求項51之抗體，其中與非糖基化設計之抗體相比較，該抗體具有增加之效應功能或增加之Fc受體結合。
  60. 如請求項50之抗體，其中在該Fc區中至少50%之寡醣係對分的。
  61. 如請求項50之抗體，其中在該Fc區中至少50%之寡醣係非岩藻糖基化的。
  62. 如請求項50之抗體，其中在該Fc區中至少20%之寡醣係對分、非岩藻糖基化的。
  63. 如請求項50之抗體，其中當將該抗原結合分子以大於1微 克/毫升之血清濃度投與哺乳動物個體時，該抗體在該個體中未引起臨床顯著程度之毒性。
  64. 一種組合物，其包含如請求項5至13中任一項之抗原結合分子或如請求項50至63中任一項之抗體及醫藥學上可接受之載劑。
  65. 如請求項64之組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
  66. 一種經分離聚核苷酸，其編碼包含如請求項5之抗原結合分子之重鏈可變區之多肽。
  67. 如請求項66之聚核苷酸，其中該重鏈可變區包含：(a)選自由以下所組成之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：65；及(b)SEQ ID NO：79之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3。
  68. 如請求項67之經分離聚核苷酸，其中該重鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：53之重鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：79之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3。
  69. 如請求項66之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含：(a)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：124；及(b)SEQ ID NO：80；及 (c)SEQ ID NO：108。
  70. 如請求項69之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含：(a)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：66；及(b)SEQ ID NO：80；及(c)SEQ ID NO：108。
  71. 如請求項70之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：54；及(b)SEQ ID NO：80；及(c)SEQ ID NO：108。
  72. 如請求項66之聚核苷酸，其中該聚核苷酸進一步編碼包含輕鏈可變區之多肽，其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  73. 如請求項72之聚核苷酸，其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  74. 如請求項72之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114；及(b)SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：118；及(c)SEQ ID NO：119。
  75. 如請求項74之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含： (a)SEQ ID NO：114；及(b)SEQ ID NO：118；及(c)SEQ ID NO：119。
  76. 一種經分離聚核苷酸，其編碼包含如請求項6之抗原結合分子之輕鏈可變區之多肽。
  77. 如請求項76之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：114；及(b)SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：118；及(c)SEQ ID NO：119。
  78. 如請求項77之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：114；及(b)SEQ ID NO：118；及(c)SEQ ID NO：119。
  79. 如請求項76之聚核苷酸，其中該聚核苷酸進一步編碼包含重鏈可變區之多肽，其中該重鏈可變區包含：(a)選自由以下所組成之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：125；及(b)選自由以下所組成之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103及SEQ ID NO：105；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3。
  80. 如請求項79之聚核苷酸，其中該重鏈可變區包含：(a)選自由以下所組成之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：65；及(b)選自由以下所組成之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：91及SEQ ID NO：97；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3。
  81. 如請求項80之聚核苷酸，其中該重鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：53之重鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：79之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3。
  82. 如請求項80之聚核苷酸，其中該重鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：59之重鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：91之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3。
  83. 如請求項80之聚核苷酸，其中該重鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：65之重鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：97之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3。
  84. 如請求項79之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含：(a)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：60、 SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：124；及(b)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104及SEQ ID NO：106；及(c)SEQ ID NO：108。
  85. 如請求項84之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含：(a)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：66；及(b)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：92及SEQ ID NO：98；及(c)SEQ ID NO：108。
  86. 如請求項85之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：54；及(b)SEQ ID NO：80；及(c)SEQ ID NO：108。
  87. 如請求項85之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：60；及(b)SEQ ID NO：92；及(c)SEQ ID NO：108。
  88. 如請求項85之聚核苷酸，其中該聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：66；及(b)SEQ ID NO：98；及(c)SEQ ID NO：108。
  89. 一種經分離聚核苷酸，其編碼如請求項1之多肽。
  90. 如請求項89之聚核苷酸，其中該多肽包含含有SEQ ID NO：15之序列之重鏈可變區。
  91. 如請求項89之聚核苷酸，其中該多肽進一步編碼包含輕鏈可變區之多肽，其中該輕鏈可變區包含選自由下列所組成之群之序列：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：51。
  92. 如請求項91之聚核苷酸，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：45。
  93. 一種經分離聚核苷酸，其編碼如請求項3之多肽。
  94. 如請求項93之聚核苷酸，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：45。
  95. 如請求項93之聚核苷酸，其中該聚核苷酸進一步編碼包含重鏈可變區之多肽，其中該重鏈可變區包含選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：121。
  96. 一種載體，其包含如請求項66、76、89及93中任一項之聚核苷酸。
  97. 如請求項96之載體，其中該載體係多順反子性。
  98. 如請求項96之載體，其中該載體係複製選殖載體。
  99. 如請求項96之載體，其中該載體係表現載體。
  100. 一種宿主細胞，其包含如請求項66、76、89及93中任一項之聚核苷酸。
  101. 一種宿主細胞，其包含第一聚核苷酸及第二聚核苷酸，其中該第一聚核苷酸為如請求項66之聚核苷酸，且其中該第二聚核苷酸編碼包含輕鏈可變區之多肽，其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  102. 如請求項101之宿主細胞，其中該第一聚核苷酸編碼包含重鏈可變區之多肽，其中該重鏈可變區包含：(a)選自由以下所組成之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：65；及(b)SEQ ID NO：79之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3，且其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：111或SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及 (c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  103. 如請求項102之宿主細胞，其中該重鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：53之重鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：79之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3，且其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  104. 如請求項101之宿主細胞，其中該第一聚核苷酸包含：(a)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：124；及(b)SEQ ID NO：80；及(c)SEQ ID NO：108，且其中該第二聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114；及(b)SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：118；及(c)SEQ ID NO：119。
  105. 如請求項104之宿主細胞，其中該第一聚核苷酸包含：(a)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：66；及 (b)SEQ ID NO：80；及(c)SEQ ID NO：108，且其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114；及(b)SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：118；及(c)SEQ ID NO：119。
  106. 如請求項105之宿主細胞，其中該第一聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：54；及(b)SEQ ID NO：80；及(c)SEQ ID NO：108，且其中該第二聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：114；及(b)SEQ ID NO：118；及(c)SEQ ID NO：119。
  107. 一種宿主細胞，其包含第一聚核苷酸及第二聚核苷酸，其中該第一聚核苷酸編碼包含重鏈可變區之多肽，其中該重鏈可變區包含：(a)選自由以下所組成之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：125；及(b)選自由以下所組成之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103及SEQ ID NO：105；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3，且其中該第二聚核苷酸為如請求項76之聚核苷酸。
  108. 如請求項107之宿主細胞，其中該重鏈可變區包含：(a)選自由以下所組成之群之重鏈CDR1：SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：59及SEQ ID NO：65；及(b)選自由以下所組成之群之重鏈CDR2：SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：91及SEQ ID NO：97；及(c)SEQ ID NO：107之輕鏈CDR3，且其中該第二聚核苷酸編碼包含輕鏈可變區之多肽，其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  109. 如請求項108之宿主細胞，其中該重鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：59之重鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：91之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3，且其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及 (c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  110. 如請求項108之宿主細胞，其中該重鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：65之重鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：97之重鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：107之重鏈CDR3，且其中該輕鏈可變區包含：(a)SEQ ID NO：113之輕鏈CDR1；及(b)SEQ ID NO：115之輕鏈CDR2；及(c)SEQ ID NO：117之輕鏈CDR3。
  111. 如請求項107之宿主細胞，其中該第一聚核苷酸包含：(a)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：74及SEQ ID NO：124；及(b)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：104及SEQ ID NO：106；及(c)SEQ ID NO：108，且其中該第二聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：114；及 (b)SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：118；及(c)SEQ ID NO：119。
  112. 如請求項111之宿主細胞，其中該第一聚核苷酸包含：(a)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：60及SEQ ID NO：66；及(b)選自由以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：92及SEQ ID NO：98；及(c)SEQ ID NO：108，且其中該第二聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：114；及(b)SEQ ID NO：116或SEQ ID NO：118；及(c)SEQ ID NO：119。
  113. 如請求項112之宿主細胞，其中該第一聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：60；及(b)SEQ ID NO：92；及(c)SEQ ID NO：108，且其中該第二聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：114；及(b)SEQ ID NO：118；及(c)SEQ ID NO：119。
  114. 如請求項112之宿主細胞，其中該第一聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：66；及(b)SEQ ID NO：98；及(c)SEQ ID NO：108，且 其中該第二聚核苷酸包含：(a)SEQ ID NO：114；及(b)SEQ ID NO：118；及(c)SEQ ID NO：119。
  115. 一種宿主細胞，其包含第一聚核苷酸及第二聚核苷酸，其中該第一聚核苷酸為如請求項89之聚核苷酸，且其中該第二聚核苷酸編碼包含輕鏈可變區之多肽，其中該輕鏈可變區包含選自以下所組成之全之序列：SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：49及SEQ ID NO：51。
  116. 一種宿主細胞，其包含第一聚核苷酸及第二聚核苷酸，其中該第一聚核苷酸編碼包含重鏈可變區之多肽，其中該重鏈可變區包含選自以下所組成之群之序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39及SEQ ID NO：121，且其中該第二聚核苷酸為如請求項93之聚核苷酸。
  117. 如請求項115或116之宿主細胞，其中該第一聚核苷酸編碼包含含有SEQ ID NO：15之重鏈可變區的多肽，且其中該第二聚核苷酸編碼包含含有SEQ ID NO：45之輕鏈可變區的多肽。
  118. 如請求項101、107、115及116中任一項之宿主細胞，其中 該宿主細胞經設計表現至少一種編碼具有β(1,4)-N-乙醯基葡糖胺基轉移酶III活性之多肽之核酸。
  119. 如請求項118之宿主細胞，其中該宿主細胞經設計表現編碼具有甘露糖苷酶II活性之多肽之核酸。
  120. 一種產生抗原結合分子之方法，該抗原結合分子能夠與大鼠ICR62單株抗體競爭結合人類EGFR，該方法包含：(a)在允許表現該第一聚核苷酸及該第二聚核苷酸的條件下，在培養基中培養如請求項101、107、115及116中任一項之宿主細胞；及(b)回收該抗原結合分子。
  121. 一種如請求項5至13中任一項之抗原結合分子或請求項50至63中任一項之抗體之用途，其係用於製造引發表現EGFR之腫瘤細胞溶解之藥物，其中該抗原結合分子或抗體係用於以引發腫瘤細胞溶解之有效量與腫瘤細胞接觸，且其中該抗原結合分子或抗體結合至表現於該腫瘤細胞的EGFR且能夠與ICR62抗體競爭結合EGFR。
  122. 如請求項121之用途，其中該抗原結合分子或抗體包含經糖基化設計之Fc區且具有增加之抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性。
  123. 如請求項122之用途，其中該抗原結合分子或抗體具有高達1000倍增加之ADCC活性。
  124. 如請求項121之用途，其中該細胞呈現異常EGFR過度表現或異常增加之EGFR介導之訊號轉導。
  125. 如請求項121之用途，其中該抗原結合分子或抗體共軛至 一標記，且其中該標記提供鑑別結合至EGFR之抗原結合分子或抗體之錯和物之方法。
  126. 如請求項125之用途，其中該標記係選自由放射性標記、酶標記及螢光物標記所組成之群。
  127. 如請求項121之用途，其中該腫瘤細胞係選自由下列所組成之群：乳癌細胞、膀胱癌細胞、頭頸癌細胞、皮膚癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細胞、前列腺癌細胞、腎癌細胞及腦癌細胞。
  128. 如請求項121之用途，其中該抗原結合分子或抗體係用於投與需要之個體，且其中該抗原結合分子或抗體不會導致該個體全身性毒性。
  129. 如請求項128之用途，其中該個體為人類。
  130. 如請求項121之用途，其中該抗原結合分子或抗體係用於投與需要之個體，且其中該抗原結合分子或抗體不會導致該個體肝毒性。
  131. 如請求項130之用途，其中該個體為人類。
  132. 如請求項121之用途，其中該量從約1.0 mg/kg至約15 mg/kg。
  133. 如請求項121之用途，其中該量從約1.5 mg/kg至約4.5 mg/kg。
  134. 如請求項121之用途，其中該量導致該抗原結合分子或抗體之血清濃度為約1 μg/ml至約500 μg/ml達至少四星期之期間。
  135. 如請求項121之用途，其中該抗原結合分子或抗體用於與 化學療法或放射療法併用。
  136. 如請求項121之用途，其中該抗原結合分子或抗體與治療劑共軛，且其中該抗原結合分子或抗體將該治療劑遞送至腫瘤細胞。
  137. 如請求項136之用途，其中該治療劑係選自由下列所組成之群：治療藥物、毒素、放射線同位素、淋巴素及腫瘤抑制生長因子。
  138. 一種如請求項5至13中任一項之抗原結合分子或請求項50至63中任一項之抗體之用途，其係用於製造靶向個體中表現EGRF之細胞之藥物，其中該抗原結合分子或抗體結合細胞上表現之EGRF且能夠與ICR62抗體競爭結合EGFR。
  139. 如請求項138之用途，其中該抗原結合分子或抗體之投與導致該抗原結合分子或抗體之血清濃度為約1 μg/ml至約500 μg/ml達至少四星期之期間。
  140. 如請求項138之用途，其中該抗原結合分子或抗體用於與化學療法或放射療法併用。
  141. 如請求項138之用途，其中該細胞過度表現EGRF。
  142. 如請求項138之用途，其中該靶向係用於治療細胞增生疾病。
  143. 如請求項142之用途，其中該細胞增生疾病為癌症。
  144. 如請求項143之用途，其中該癌症係選自由下列所組成之群：乳癌、膀胱癌、頭頸癌、皮膚癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、結腸癌、前列腺癌、腎癌及腦癌。
  145. 如請求項138之用途，其中該靶向係用於診斷個體中特徵 為EGFR表現之疾病。
  146. 一種如請求項5至13中任一項之抗原結合分子或請求項50至63中任一項之抗體之用途，其係用於製造於活體內或活體外偵測樣品中存在EGFR之偵測劑，其中該抗原結合分子或抗體係用於在允許該抗原結合分子或抗體與EGFR之間形成錯合物之條件下與待測樣品(視情況與對照樣品)接觸；且其中藉由抗原結合分子-EGFR或抗體-EGFR錯合物之偵測指示EGFR之存在。
  147. 如請求項146之用途，其中該待測樣品包含呈現異常之EGRF過度表現或異常增加之EGFR-介導訊號轉導之細胞。
  148. 如請求項146之用途，其中該抗原結合分子或抗體共軛至一標記，其中該標記提供鑑別結合至EGFR之抗原結合分子或抗體之錯和物之方法。
  149. 如請求項148之用途，其中該標記係選自由放射性標記、酶標記及螢光物標記所組成之群。
  150. 如請求項146之用途，其中該待測樣品包含選自由下列所組成之群之腫瘤細胞：乳癌細胞、膀胱癌細胞、頭頸癌細胞、皮膚癌細胞、胰腺癌細胞、肺癌細胞、卵巢癌細胞、結腸癌細胞、前列腺癌細胞、腎癌細胞及腦癌細胞。
  151. 如請求項146之用途，其中活體內之樣品係與該抗原結合分子或抗體接觸，且其中該抗原結合分子或抗體在活體內不會導致活體內全身性毒性。
  152. 如請求項151之用途，其中該樣品為人類樣品。
  153. 如請求項146之用途，其中活體內之樣品係與該抗原結合 分子或抗體接觸，且其中該抗原結合分子或抗體在活體被不會導致活體內肝毒性。
  154. 如請求項153之用途，其中該樣品為人類樣品。
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