TW491890B - Process for preparing lower alkyl fatty acid esters and in particular biodiesel - Google Patents

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491890 A7 B7 五、發明說明（） 發明領域 本發明係關於一種提昇固定化脂肪分解酵素（lipase)的 活性的技術，以及有關一種將失活的固定化脂肪分解酵素 加以再生的技術，其中該固定化脂肪分解酵素特別有用於 一種通過三酸甘油酯與一低碳數醇的轉酯化反應來生產生 化柴油的方法。 發明背景 在歐洲、美國、日本等國家已有利用強鹼做催化劑來 生產生化柴油的工業化製程（例如美國專利5^4,878)。有 數十萬噸的大規模工業生產。雖然如此，強鹼製程還是有 一些嚴重的缺點，強鹼製程無法順利的處理雜質含量較高 的油及脂，這裡所說的雜質主要是指在廢食用油、廢動物 油脂、食用油精製過程中的廢油或廢脂中常含有的水分和 游離脂肪酸，這些雜質的存在會使強鹼製程產生許多不要 的副產物（肥皂），造成生化柴油的轉化率下降及產品純化 困難。所以現有的商業上生化柴油強鹼製程幾乎都只使用 純的植物油爲原料。 目前要使用脂肪分解酵素來生產生化柴油有兩個主要 關鍵難題，第一個是酵素製程的轉化速率不夠，在Watanabe 等人提出的報告中[“Continuous Production of Biodiesel Fuel from Vegetable Oil Using Immobilized Candida antarctica Lipase”，JAOCS，voL 77, pp. 355-360, 2000]可以看到，酵素 製程需要36小時來完成反應，比強鹼製程的1個小時高出甚 -4- 一本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） "" "" I:---:---------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) •線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 491890 A7 B7 五、發明說明（2 ) -I ^-------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 多；另一個難題是酵素的價格高出強鹼製程所使用的氫氧 化鈉（NaOH)太多，除非使用可被回收再循環使用的固定化 脂肪分解酵素（Immobilized Lipase)，且酵素的活性可維持 一段長的時間，否則將很難在成本上和強鹼製程競爭。但 很不幸的固定化脂肪分解酵素會受到反應物中的低碳數醇 類所毒害，當該醇類的濃度太高即會使酵素完全失活。所 以要使得利用固定化脂肪分解酵素的製程在經濟上可行， 甚而取代傳統的強鹼製程，如何將固定化脂肪分解酵素活 性及壽命提高，及如何將部份或完全失活的固定化脂肪分 解酵素有效的再生便成爲重要的課題。 本發明的一目的在於提供一種合適的方法來提高固定 化脂肪分解酵素的活性。 本發明的另一目的在於提供一種在固定化脂肪分解酵 素活性下降時加以再生活化方法。 線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本發明的又一目的在於提供一種利用依本發明方法預 處理的或再生的固定化脂肪分解酵素來催化一脂肪酸甘油 酯或一游離脂肪酸與一低碳醇的轉酯化反應或酯化反應， 來製備脂肪酸低碳酯的方法，尤其是生化柴油的製備方 法。 發明要旨 本案發明人認爲固定化脂肪分解酵素於一脂肪酸甘油 酯與一低碳醇的轉酯化反應中活性的降低大部分來自於物 理性的因素。亦即甲醇或乙醇和脂肪酸甘油酯不互溶。所 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 491890 Α7 Β7 五、發明說明（ 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 以當甲醇或乙醇吸附到固定化脂肪分解酵素的孔洞中時， 將會阻絕脂肪酸甘油酯進入，使反應無法進行。本案發明 人亦觀察到甲醇比油容易被固定化脂肪分解酵素所吸收。 本案發明人首先揭示一種理想的溶劑來沖洗失活的固定化 脂肪分解酵素，這個溶劑必須對酵素沒有毒害，且能和油、 脂、水分、甲醇或乙醇有良好的溶解力，例如碳原子數3 以上（包括3)的酵，較佳的爲異丙醇（iso-Propanol)，2-丁醇 (2 - Butanol)和特丁醇(tert-Butanol)，於是有效的使失活的固 定化脂肪分解酵素恢復活性。本案發明人同時發現以此理 想溶劑對固定化脂肪分解酵素進行浸泡的預處理，可顯著 的提昇酵素的活性。 訂 於本發明的較佳實施例中，一商業上可獲得的固定化 脂肪分解酵素Novozyme 435的活性被提高8-10倍；及失活 的Novozyme 435被成功的再生，恢復未毐害前的活性水 準。 線 圖示簡單說明 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖一爲習知的轉酯化反應的初反應速率對各種直鏈醇 的濃度的作圖，其中方形代表甲醇，圓代表乙醇，三角形 代表正丙醇，及倒三角形代表1-丁醇。 圖二爲習知的轉酯化反應的初反應速率對各種支鏈醇 的濃度的作圖，其中方形點代表異丙醇，三角形點代表2-丁醇，及圓代表異丁醇。 圖三爲轉酯化反應的初反應速率對甲醇的濃度的作 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ^1890 A7 B7 五、發明說明（) 圖，其中黑方形點代表固定化脂肪分解酵素經過本發明的 異丙醇預處理，空心方形點代表習知的黃豆油預處理，三 角形點代表本發明的2-丁醇預處理，及菱形點代表本發明 的特丁醇預處理。 圖四顯示使用過的固定化脂肪分解酵素，在通過黃豆 油淸洗（黑方形點）所再生的酵素在最適甲醇濃度下的轉酯 化反應的初反應速率，及通過本發明的異丙醇淸洗所再生 一次（三角形）及再生二次的初反應速率（空心圓），其中橫軸 的實驗號第1至8號分別代表該使用過的固定化脂肪分解酵 素所催化的轉酯化反應中油對甲醇的莫爾比=8:1，5:1， 3:1， 3:2, 1:1， 2:3, 1:2，及 1:3 。 發明詳細說明 適合使用於本發明的固定化脂肪分解酵素並無特別限 制可爲習知技藝已知者，例如USP 4798793 ; 4940845 ; 5 156963 ; 5342768 ; 5776741 及 W089/01032。 使用固定化脂肪分解酵素催化一脂肪酸甘油酯或一游 離脂肪酸與一低碳醇的轉酯化反應或酯化反應，來製備脂 肪酸低碳酯的方法，包括生化柴油的製備方法，已爲本項 技藝人士所熟知，且非爲本案發明的重點，因此在此處並 不多作贅述。於本發明中，轉酯化反應或酯化反應的較佳 的條件爲一介於室溫至80°C的溫度、及脂肪酸甘油酯或游 離脂肪酸與該低碳醇的莫耳比大於1:1，更佳的約3:1。 本發明一開始先探討甲醇及其他低碳數醇如乙醇、n- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂· --線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 491890 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（5) 丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇（isobutyl alcohol)、特丁醇 (tert_Butanol)對固定化脂肪分解酵素的活性的影響。一定 量的植物油（台糖黃豆油）5.7克加上不同莫爾數比的醇類 (油：醇類=8:1，5:1，3:1，3:2, 1:1，2:3, 1:2, 1:3)，再加上油重 量5%的固定化脂肪分解酵素（商品代號Novozyme 435， ^^(^〇1^1〇1*心$]^公司所生產），其中酵素事先在油中浸泡24小 時。在有蓋試管內反應，在30°C培養箱，震盪速率200rpm， 反應5分鐘後取樣，以高效液相層析儀（HPLC)分析生化柴油 和未反應油的含量，並計算出酵素在不同條件下的初反應 速率，以作爲酵素活性的指標。結果如圖一及二所示。所 有的直鏈低碳數醇（甲醇、乙醇、丙醇、丁醇）對固定化脂 肪分解酵素都有明顯的毒害，只是幅度稍有不同，該毒害 程度和碳數肩：負相關，碳數越多的醇類對酵素的毒害程度 越小。圖二則是所使用的支鏈醇類對酵素的毒害情形，可 以看到支鏈的醇類對酵素的毒害程度比直鏈的醇類對酵素 的毒害程度較低。尤其是異丙醇和2-丁醇毒害曲線幾乎呈 現水平，也就是說異丙醇和2-丁醇對酵素沒有明顯的毒 害。另外較特別的是特丁醇（ten-Butanol)，不管在哪一種 濃度之下，它都無法和脂肪酸甘油酯在所使用的酵素催化 下形成鍵結，轉化率爲零。 在以上實驗中有兩個重要的發現，第一、當甲醇、乙 醇對Novozyme 435發生毒害時，Novozyme 435顆粒的外觀 有明顯的改變，從原本金黃色透明的顆粒轉變成灰白不透 明，還伴隨著顆粒膨脹結塊的情形，和未被毒害的 (請先閱讀背面之注意事項再 -裝--- 本頁： 訂· •線· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 491890 A7 B7 五、發明說明（6)

Novozyme 435有很大的不同；第二、甲醇和乙醇和植物油 的互溶性極差，加入超過九分之一理論莫爾數的低碳數醇 (甲醇、乙醇）（醇：油>1:3)，整個混合物成乳化狀態 (Emulsion)，和產生乳化現象的濃度和發生毒害的濃度幾乎 完全相同。越多碳數的碳類則和油的互溶性較好，超過三 個碳以上的醇類（丙醇以上）至少在完全反應所需的理論莫 爾數之內（醇：油幻：1)和植物油可以完全互溶。 基於這兩點，於以下的實施例我們使用對Novozyme 435無明顯毒性的異丙醇（iso-Propanol)和2-丁醇（2-Butanol) 以及對脂肪酸甘油酯完全不反應的特丁醇（ten-Butanol)進 行Novozyme 435的浸泡預處理。結果發現經過這三種溶劑 的浸泡對活性不但沒有毒害，在某些狀況下反而有提高酵 素活性、增加酵素對甲醇和乙醇毒害的抵抗力。另外，以 異丙醇對失活的Novozyme 435淸洗、浸泡，也可以有效恢 復酵素的活性。 實施例1:固定化脂肪分解酵素預處理方式對酵素活性的 影響 將從Novo Nordisk公司買得的Novozyme 435固定化酵 素，稱重0.3公克，置於有蓋試管內，用不同的方式浸泡（不 浸泡、黃豆油、生化柴油、異丙醇、2-丁醇、特丁醇、正 己烷等溶劑浸泡），使酵素顆粒膨潤，浸泡的時間詳見表 一。預處理完的酵素加入5.7公克的黃豆油和0.26毫升的甲 醇在震盪培養箱中進行反應，溫度30°C、震盪速率200rpm、 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Γ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 491890 A7 _____B7_ 五、發明說明（7 ) 反應時間30分鐘。反應結束取樣0.1公克，加入1〇毫升的正 己烷稀釋，用HPLC分析脂肪酸甲酯和未反應油所佔的比 例，結果列於表一。從表一的結果來看酵素的預處理是非 常重要的。經過對酵素無毒害的醇類（異丙醇、2-丁醇、特 丁醇）的浸泡，脂肪酸甲酯的產率比完全未處理高約7倍， 也比用生化柴油浸泡的效果更好，活性比生化柴油浸泡的 方式提高了 40%。在正己烷（η-Hexane)浸泡預處理的組別 中，活性大幅度的下降，活性下降到和完全未處理的酵素 活性差不多，證實了正己烷對Novozyme 435有很高的毒 性。經過我們所提出的預處理方式處理的固定化脂肪分解 酵素酵素不只在初期的活性明顯提高，在下實施例中也發 現經過預處理的固定化脂肪分解酵素對甲醇的毒害有較強 的忍耐力。 I-------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂： --線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 外 189〇 A7 B7 五 '發明說明（ 表一、預處理方式對反應活性 的影響 預處理方式 脂肪酸甲酯的產率（％、 钿 __ 2.5 油4 h r 8.6 油過夜 10.0 生化柴油〇.5hr +油4hr 4.1 生化柴油 l.Ohr +油4hr 9.5 生化柴油 1.5hr +油4hr 8.9 生化柴油2.0hr +油4gr 9.1 生化柴油1.0hi:+油 11.1 正己院l.Ohr +油過夜 3.5 異丙醇l.Ohr +油l.Ohr 16.8 2-丁醇 l.Ohr + 油 l.Ohr 17.6 特丁醇 1.0 hr + 油 l.Ohr 17.3 I,-------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂· 實施例2:不同濃度的甲醇對經過預處理的固定化脂肪分 解酵素的毒害情形 將表一中分別經過三種不同無毒害醇類和植物油浸 泡預處理的Novozyme 435 (佔油重量5%)加入一定量的植物 油（台糖黃豆油）5.7克，再加上不同莫爾數比的甲醇（油：甲 醇=8·· 1，5:1，3:1，3··2, 1:1，2:3, 1:2, 1:3)，在震盪培養箱中 進行反應，溫度30°C、震盪速率200rpm、反應時間5分鐘。 反應結束取樣0.1公克，加入10毫升的正己烷稀釋，用HPLC 分析脂肪酸甲酯和未反應油所佔的比例，計算出酵素在不 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -線- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 491890 A7 B7 五、發明說明（9 ) 同條件下的初反應速率，作爲酵素活性的指標。結果如圖 三所示。經過無毒害的醇類浸泡後，在高濃度甲醇存在時， 初反應速率明顯比只用植物油浸泡者要高出很多，醇類浸 泡確實對提高固定化脂肪分解酵素對甲醇的忍受力有幫 助，其中以異丙醇和2-丁純的效果較好，特丁醇略差。 實施例3:被不同濃度甲醇毒害後的固定化脂肪分解酵素 的活性再生 將經過預處理（生化柴油1小時，用黃豆油淸洗後浸泡 黃豆油隔夜）的酵素分別加入固定量的油（台糖黃豆油），再 加入不同濃度的甲醇（油對甲醇的莫爾比=8:1，5:1，3:1， 3:2, 1:1，2:3, 1:2, 1:3)，甲醇添加量的濃度由少到多分別編 號爲實驗1到實驗8，於有蓋試管中震盪混合後室溫靜置24 小時，使酵素部份或完全失活，失活後的酵素進行下列淸 洗的操作，看是否能提高活性。 淸洗操作1 :黃豆油淸洗3次，在30°C培養箱靜置過夜。 淸洗操作2 :先用異丙醇（iso-Propanol)沖洗三次，再用黃 豆油洗去異丙醇，在30°C培養箱黃豆油中浸泡過 夜。 淸洗操作3 :經過淸洗操作2處理，再進行最適甲醇濃度 反應後，再用淸洗操作2淸洗一次。 然後加入最適濃度（由圖一，知道當甲醇添加量爲黃 -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----------------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂· 線· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 外18% A7 B7 五 發明說明（ 豆油莫爾數的三分之一，有最高的轉化率）的甲醇，在震盪 培養箱中進行反應，溫度30°C、震盪速率200rpm、反應時 間5分鐘。反應結束取樣0.1公克，加入10毫升的正己烷稀 釋，用HPLC分析脂肪酸甲酯和未反應油所佔的比例，計算 出酵素在不同條件下的初反應速率。結果如圖四所示，在 所添加的曱醇的莫爾數超過黃豆油的莫爾數的反應中失活 的固定化脂肪分解酵素，明顯可以看出只用黃豆油淸洗無 法使受毒害的酵素回復活性、酵素活性幾乎完全消失（黑方 點的第6、7、8號）。而經過異丙醇的淸洗之後，在第6和第 7號的再生固定化脂肪分解酵素的活性有明顯提高，幾乎回 復到未毒害之前的活性水平。證實了用對酵素無毒害的醇 類沖洗可以讓失活酵素的再生。雖然在第8號的再生酵素的 活性恢復情況不甚理想，但在圖中可以看出用異丙醇淸洗 第二次會讓酵素活性再次提高，表示增加異丙醇淸洗的程 度度活性恢復有正面的影響，淸洗時間和淸洗溫度的最適 化，應該可以進一步提高酵素的活性。除了異丙醇之外， 在我們其他的實驗中也證實了 2-丁醇和特丁醇也有同樣有 再生失活的固定化脂肪分解酵素的效果。 ·1·---:---------裝--- (請先閱讀背面之注音3事項再本頁) · --線· 經 濟 部 智 慧 財 產 局 工 消 費 合 作 社 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

Claims (1)

1. 491890

   (請先閱讀背面之注意事項再填 ι· 一種由脂肪酸甘油酯或游離脂肪酸與一匕-匕醇進 行轉酯化反應或酯化反應而製備脂肪酸烷基酯的方 法，其特徵包含使用一預處理的固定化脂肪分解酵素催化 該轉酯化反應及該酯化反應，其中該預處理固定化脂肪分 解酵素係將一固定化脂肪分解酵素浸於一碳原子數不小於 3的醇一段時間而製備。 2.如申請專利範圍第1項的方法，其中該碳原子數不 小於3的醇具有3-8個碳原子數。 訂" 3·如申請專利範圍第1項的方法，其中該碳原子數不 小於3的醇具有3或4個碳原子數。 •線· 4·如申請專利範圍/第3項的方法，其中該碳原子數不 小於3的醇爲1-丙醇、異丙醇、1-丁醇、2-丁醇、異丁醇或 特丁醇。 5 ·如申請專利範圍第1項的方法，其中該段時間介於 0.5-48 少時。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制取 6.如申請專利範圍第5項的方法，其中該段時間〇·5_ 1.5小時。 7 ·如/申i靑專利範圍桌1項的方法，其中該預處理進一 -14-

   491890 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 步包含將浸於該碳原子數不小於3的醇的固定化脂肪分解 酵素取出，再浸於一植物油〇·5-48小時。 (請先閱讀背面之注意事項再15^本頁) 8·如申請專利範圍第丨項的方法，其中該固定化脂肪 分解酵素被固定於一多孔性載體。 9·如申請專利範圍第1項的方法，其中該固定化脂肪 分解酵素來自或Ca/7 W5。 1〇·如申請專利範圍第1項的方法，其中該固定化脂肪 分解酵素是新鮮或失活的固定化脂肪分解酵素。 .線_ 11 ·如申請專利範圍第10項的方法，其中該固定化脂 肪分解酵素是失活的固定化脂肪分解酵素，並且該預處理 固定化脂肪分解酵素係將該失活的固定化脂肪分解酵素以 該碳原子數不小於3的醇加予淸洗而製備。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 12.如申請專利範圍第11項的方法，其中該預處理進 一步包含將淸洗過的固定化脂肪分解酵素浸於一植物油 0.5-48 小時。 13·如申請專利範圍第1項的方法，其中該脂肪酸Ci-C3院基醋係通過該脂肪酸甘油酯與crc3醇進行轉酯化反 應而製備。 -15- 卜紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 491890 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 -------r-------裝--- (請先閱讀背面之注意事項再填頁) 14. 如申請專利範圍第13項的方法，其中該脂肪酸!^-C3烷基酯爲脂肪酸甲酯，且該脂肪酸甲酯通過一包含三酸 甘油酯的油或脂與甲醇的轉酯化反應而被製備。 15. 如申請專利範圍第14項的方法，其中該油或脂爲 植物油。 16. 如申請專利範圍第1項的方法，其中該脂肪酸h-C3烷基酯係通過該脂肪酸甘油酯與CVCJI進行轉酯化反 應及該游離脂肪酸與CrG醇進行酯化反應而製備。 17. 如申請專利範圍第16項的方法，其中該脂肪酸 線· C3烷基酯爲脂肪酸甲酯，且該脂肪酸甲酯通過一包含三酸 甘油酯及游離脂肪酸的油或脂與甲醇的轉酯化反應及酯化 反應而被製備。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 18. 如申請專利範圍第17項的方法，其中該油或脂爲 植物油、動物油脂、回收廢食用油，或食用油精練過程中 產生的廢油或廢脂。 -16 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）