TW202505021A - 移植方法、培養載體基材、包裝體、附有細胞片之培養載體基材、附有細胞片之培養載體基材的製造方法、冷凍保存方法及附有細胞片之培養載體基材的冷凍物 - Google Patents

移植方法、培養載體基材、包裝體、附有細胞片之培養載體基材、附有細胞片之培養載體基材的製造方法、冷凍保存方法及附有細胞片之培養載體基材的冷凍物 Download PDF

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中西由貴
濱野公一
上野耕司
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Abstract

本發明之移植方法係包含：培養工序，於培養載體基材之培養面培養細胞片；以及移植工序，將形成於培養載體基材之培養面的細胞片貼附於被移植部位之後，自細胞片剝離培養載體基材；者。

Description

移植方法、培養載體基材、包裝體、附有細胞片之培養載體基材、附有細胞片之培養載體基材的製造方法、冷凍保存方法及附有細胞片之培養載體基材的冷凍物
本發明係關於移植方法、培養載體基材、包裝體、附有細胞片之培養載體基材、附有細胞片之培養載體基材的製造方法、冷凍保存方法及附有細胞片之培養載體基材的冷凍物。
至今已對於構成移植技術之技術要件的細胞片之「培養」與「運送」進行了各式各樣的開發。作為此種技術，已知有例如專利文獻1所記載之技術。
專利文獻1之先前技術記載有為將細胞片移植至作為目標之患部，變得需要透過溫度變化使在溫度響應性材料之上培養的細胞片剝離、於所獲得之細胞片蓋上另外準備的薄片、在使細胞片附著於該薄片的狀態下自容器取出、運送至患部、移植（貼附）於此患部等一連串的操作。
對此，專利文獻1之請求項1或段落0007等記載有如下技術作為使於具有溫度響應性高分子層之細胞培養容器中培養的細胞片運送的方法：在附著有細胞片之狀態下就此剝離細胞培養容器之底部，使附著於底部的細胞片與剝離的底部一同運送。
『專利文獻』 《專利文獻1》：日本專利公開第2016-013111號公報
然而，本發明人研究的結果，可明白在活用專利文獻1之技術的移植方法中，由於必須在自溫度響應性高分子層剝離細胞片時透過低溫處理來解除細胞片與基材的密合狀態，或者透過低溫處理來降低基材與細胞片的密合性，故不易在使於具有溫度響應性高分子層之細胞培養容器中培養的細胞片附著於具有溫度響應性高分子層之細胞培養容器的狀態下冷凍保存。
本發明人潛心研究的結果，想到將個別研究的細胞片之「培養」與「運送」統合的新概念，將移植方法及培養載體基材等具體化，臻至完成本發明。
根據本發明之一態樣，可提供以下之移植方法、培養載體基材、包裝體、附有細胞片之培養載體基材、附有細胞片之培養載體基材的製造方法、冷凍保存方法及附有細胞片之培養載體基材的冷凍物。
1. 一種移植方法，其包含： 培養工序，於培養載體基材之培養面培養細胞片；以及移植工序，將形成於前述培養載體基材之前述培養面的前述細胞片貼附於被移植部位之後，自前述細胞片剝離前述培養載體基材。
2. 如1.所記載之移植方法，其中前述培養載體基材的基材厚度為5 μm以上且250 μm以下， 前述培養載體基材係聚醚醚酮薄膜或聚對酞酸乙二酯薄膜，前述培養載體基材之前述培養面經親水化處理。
3. 如1.或2.所記載之移植方法，其中前述培養載體基材的基材厚度超過10 μm，在前述培養工序中，前述培養載體基材不固著於培養容器之內部即發揮作為自立膜之功能。
4. 如1.～3.之任一者所記載之移植方法，其在前述移植工序中，自貼附之後至剝離的時間為10分鐘以下。
5. 如1.～4.之任一者所記載之移植方法，其中透過前述培養工序獲得之前述細胞片的面積為0.3 cm 2以上。
6. 一種培養載體基材，其係使用於運送在培養面培養之細胞片的培養載體基材，其中 該培養載體基材的基材厚度為5 μm以上且250 μm以下。
7. 如6.所記載之培養載體基材，其中前述培養載體基材的基材厚度超過10 μm，在前述細胞片之培養中不固著於培養容器之內部即發揮作為自立膜的功能。
8. 如6.或7.所記載之培養載體基材，其中前述培養面經親水化處理。
9. 如8.所記載之培養載體基材，其中前述親水化處理經電漿處理。
10. 如6.～9.之任一者所記載之培養載體基材，其中該培養載體基材係聚醚醚酮薄膜或聚對酞酸乙二酯薄膜。
11. 如6.～10.之任一者所記載之培養載體基材，其中前述培養面不含溫度響應性聚合物。
12. 一種包裝體，其係將如請求項6.～11.之任一者所記載之培養載體基材以包裝材料包裝者。
13. 一種附有細胞片之培養載體基材，其具有如6.～11.之任一者所記載之培養載體基材與細胞片的堆疊體，其中 前述細胞片係被覆前述培養載體基材之在前述培養面側上的表面之至少50%的狀態。
14. 如13.所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中前述細胞片的面積為0.3 cm 2以上。
15. 一種附有細胞片之培養載體基材的製造方法，其包含： 培養工序，於培養容器之內部導入多個細胞、培養基及如6.～11.之任一者所記載之培養載體基材，於前述培養載體基材之培養面培養細胞片；以及取出工序，自前述培養容器取出附有前述細胞片之前述培養載體基材。
16. 如15.所記載之附有細胞片之培養載體基材的製造方法，其在前述培養工序中，不將前述培養載體基材固著於培養容器之內部來培養前述細胞片。
17. 如15.或16.所記載之附有細胞片之培養載體基材的製造方法，其在前述取出工序中，不需要自前述培養容器將前述培養載體基材透過物理上的手段分離的操作。
18. 一種冷凍保存方法，其包含：冷卻工序，將包含培養載體基材與形成於前述培養載體基材之表面之細胞片的附有細胞片之培養載體基材在冷凍保存液中予以冷卻。
19. 如18.所記載之冷凍保存方法，其在前述冷卻工序中，將前述附有細胞片之培養載體基材在冷凍保存液中使用非貫流式之冷卻裝置予以冷卻。
20. 如18.或19.所記載之冷凍保存方法，其在前述冷卻工序中，在0～－5℃的冷卻速度為0.1℃／分鐘以上且15℃／分鐘以下。
21. 如18.～20.之任一者所記載之冷凍保存方法，其在前述冷卻工序之後包含：冷凍保存工序，於－196～－60℃保存前述附有細胞片之培養載體基材。
22. 一種附有細胞片之培養載體基材的冷凍物，其包含： 培養載體基材與形成於前述培養載體基材之表面的細胞片，其中前述培養載體基材及前述細胞片係冷凍保存狀態。
23. 如22.所記載之附有細胞片之培養載體基材的冷凍物，其係－196℃～－60℃之冷凍保存狀態。
24. 如22.所記載之附有細胞片之培養載體基材的冷凍物，其係－196℃～－135℃之冷凍保存狀態。
25. 如22.所記載之附有細胞片之培養載體基材的冷凍物，其係－134℃～－60℃之冷凍保存狀態。
26. 一種包裝體，其係將如22.～25.之任一者所記載之冷凍物以包裝材料包裝者。
根據本發明，可提供能夠進行細胞片之培養與運送之兩者的移植方法、培養載體基材、包裝體、附有細胞片之培養載體基材、附有細胞片之培養載體基材的製造方法、冷凍保存方法及附有細胞片之培養載體基材的冷凍物。
以下使用圖式以說明本發明之實施之方式。此外，在所有圖式中，對於相同的構成要件標注相同的符號，並適當省略說明。並且，圖係概略圖，與實際之尺寸比率並不一致。
〈移植方法〉
本實施型態之移植方法包含：培養工序，於培養載體基材之培養面培養細胞片；以及移植工序，將形成於培養載體基材之培養面的細胞片貼附於被移植部位之後，自細胞片剝離培養載體基材。
被移植部位可列舉例如：在哺乳類、鳥類、兩生類、魚類、昆蟲、植物、微生物等移植對象者中的身體之至少一部分。作為哺乳類及鳥類之具體例，可列舉例如：人類、猿猴、黑猩猩、牛、馬、豬、綿羊、山羊、兔、狗、貓、天竺鼠、倉鼠、小鼠、大鼠、雞等。惟被移植部位亦可排除人類的身體之內部及外部。作為移植對象者以外的被移植部位，可列舉例如：其他細胞片、醫療器具等器具、自移植對象者分離之狀態的單個組織或單個器官等。作為單個組織或單個器官之例，可列舉：皮膚、口腔內組織、食道、氣管、支氣管、肺、肺葉、胃、十二指腸、胰臟、脾臟、小腸、大腸、肌肉組織、骨頭等（惟排除為了治療與自移植對象者所採取之物同一人而放回者）。
茲使用圖1以具體說明本實施型態之移植方法。
圖1係示意繪示移植方法之工序之一例的工序剖面圖。圖1中，（a）繪示細胞接種、（b）繪示細胞培養、（c）繪示冷凍保存／解凍、（d）繪示取出、（e）繪示貼附之各製程。（c）之冷凍保存／解凍係任意製程。於此，說明未實施（c）的移植方法，（c）之細節將在於後所述之〈冷凍保存方法〉中予以說明。
培養工序亦可包含：圖1之（a）所示之細胞接種工序及圖1之（b）所示之細胞培養工序。圖2繪示在培養工序中獲得之附有細胞片之培養載體基材50之一例的剖面示意圖。
在圖1之（a）的細胞接種工序中，使包含細胞的培養液30接觸設置於培養容器20中的培養載體基材10。細胞亦可預先懸浮於培養液30，但亦可將包含細胞的細胞懸浮液加入至培養液30。
培養載體基材10在培養工序中亦可做成其一部分或整體浸漬於培養液30中的狀態。具體而言，在細胞接種工序中，亦可將培養液30滴下至培養載體基材10之表面之一部分，但亦可以培養載體基材10之培養面12及側面之各者的至少一部分成為接觸培養液30的狀態之方式，將培養載體基材10浸漬於培養液30中。後者的浸漬方法相比於前者的滴下方法，其變得能夠穩定維持下個細胞培養工序中的培養環境及／或變得能夠圖求培養載體基材10之培養面12的大面積化。
在圖1之（b）的細胞培養工序中，在適當的培養條件下進行培養，於培養載體基材10之培養面12上形成細胞片40。於培養時亦可加蓋（未圖示）來培養。
在細胞培養工序中，可不將培養載體基材10固著於培養容器20之內部來培養細胞片40。此時，培養載體基材10在細胞培養時會發揮作為自立膜之功能。由於培養載體基材10未固著，故在取出工序中，變得能夠簡便取出來自培養容器20的附有細胞片之培養載體基材50。並且，亦可抑制在取出時之細胞片40的破損。於此，所謂固著，係謂密合成在取出時需要透過物理上的手段撕下之操作之程度的狀態。以自身重量以外的荷重壓住而做成不會移動的固定手段，不包含在於此所謂的「固著」手段。
在本說明書中，所謂物理上的手段，可列舉例如：一邊抓持薄膜一邊撕下的方法或以刀具等毀傷而撕下的方法等。
此外，作為不使培養載體基材10固著來浸漬於培養液30中的方法之一，亦可採取：使培養載體基材10之比重較培養液30還大的方法、對於培養載體基材10之培養面12之一部分透過重物來荷重固定的方法，或將培養載體基材10透過器具來位置固定的方法等之一者或二者以上。亦即，在上述細胞培養工序中透過荷重固定及／或位置固定，可在將培養載體基材10浸漬於培養液30中的狀態下進行細胞培養。
移植工序亦可包含：圖1之（d）所示之附有細胞片之培養載體基材50的取出工序及圖1之（e）所示之細胞片40的貼附工序。
在圖1之（d）的取出工序中，自培養容器20取出附有細胞片之培養載體基材50，使之運送至例如被移植部位等期望之地點。
在本實施型態的取出工序中，取出方法並不特別受限，但可列舉例如：將構成附有細胞片之培養載體基材50的培養載體基材10捏起取出的方法、使培養載體基材10接觸吸引噴嘴一邊吸引一邊上提的方法、將培養載體基材10掛繩而上提的方法等。
在圖1之（e）的貼附工序中，將附有細胞片之培養載體基材50的細胞片40貼附於被移植部位70之後，自細胞片40剝離培養載體基材10。
在本實施型態中，於貼附工序中能夠將自貼附至剝離的時間短時間化。藉由短時間化，而不會以異物之形式長時間留置，故會減低對於基材薄膜發生免疫性排斥反應的風險，減低細胞死亡的可能性，操作變得簡便。亦可使用於如開胸而將細胞片貼附於體內的手術。
自貼附至剝離的時間以10分鐘以下為佳，以5分鐘以下為較佳，以3分鐘以下為更佳，以1分鐘以下進一步為佳。
詳細的機制雖未定，但可推想係因培養載體基材10之培養面12與細胞片40之表面的密合為適度的強度，故即使在細胞片40對於被移植部位70生物性結合之前亦能夠自細胞片40剝離培養載體基材10。
並且，在本實施型態中，可抑制剝離後於培養載體基材10之上殘存細胞片40。剝離後之培養載體基材10上之細胞片40的殘存率，以面積比換算計，以50%以下為佳，以30%以下為較佳，以10%以下為更佳。
細胞移植療法係抑制、防止細胞、組織、臟器之缺損及功能障礙、功能不全相關聯的症狀之發病及復發者。作為細胞移植療法的對象疾患，可列舉例如：脊髓損傷、膝關節軟骨損傷、缺血性心臟病、老年黃斑部病變、角膜上皮幹細胞缺乏症、再生不良性貧血、急性下肢缺血、難治性皮膚潰瘍、術後併發症預防（例如各種臟器的縫合不全、支氣管殘端瘻管、胰液瘻管、膽汁瘻管）、熱傷等。
並且，使用於細胞移植療法的細胞亦可為自體衍生細胞、同種非自體衍生細胞、異種衍生細胞。作為良佳之細胞，就臨床應用及安全性之觀點而言為自體衍生細胞，就臨床應用及生產性之觀點而言為非自體衍生細胞。
以下說明在移植方法之各工序中的要件。
（培養容器）
培養容器20係用以在培養液中培養細胞的容器，只要係適於培養之細胞的種類及用途者，即非特別受限者。
作為培養容器20，可列舉例如：碟、培養碟、組織培養用碟、多碟、燒瓶、組織培養用燒瓶、微量盤、微孔盤、多盤、多孔盤、腔室載玻片、培養皿、試管、槽、培養袋、滾瓶等。
並且，培養容器20可為經表面處理之經賦予細胞附著性的培養容器（附著細胞用），亦可為未經表面處理的培養容器（懸浮細胞用）。培養容器20之表面處理的有無並不影響培養載體基材10。之後在未特別註記的情況下，任一者皆可使用。
作為培養容器20之素材，只要係不會使培養液30穿透者，即非特別受限者，但可列舉例如：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯醇、聚對酞酸乙二酯、聚縮醛、聚氯乙烯、丙烯酸樹脂、聚碳酸酯、聚醚醚酮、聚醚碸、聚四氟乙烯、聚醯亞胺、聚醯胺、纖維素、聚矽氧、耐綸6,6、玻璃、不鏽鋼或鋁等金屬等。
培養容器20的面積並非特別受限者，但只要係已市售之培養容器的面積即可無礙進行培養。舉例而言，為0.3 cm 2以上且1000 cm 2以下。作為下限值，以0.35 cm 2以上為較佳，以1.0 cm 2以上為更佳，以1.9 cm 2以上為尤佳。另一方面，作為上限值，以900 cm 2以下為較佳，以800 cm 2以下為更佳，以500 cm 2以下為尤佳。
（細胞）
細胞係用以治療或預防細胞、組織、臟器之缺損及功能障礙、功能不全相關聯之症狀的臨床上有用之細胞、在非臨床試驗等中使用之能夠培養的細胞，只要係自生物體分離的細胞，即非特別受限者。
作為細胞，可列舉例如：生物體組織細胞、具有分化成屬於間葉系組織之細胞之能力的間葉系幹細胞、具有分化成各式各樣之生物體組織之能力的富潛能幹細胞、分化誘導的幹細胞或前驅細胞等。此外，細胞可為附著細胞，亦可為懸浮細胞。
作為生物體組織細胞之具體例，可列舉例如：纖維母細胞、肌纖維母細胞、角膜上皮細胞、網膜細胞、神經細胞、肌肉細胞、心肌細胞、肌母細胞、骨細胞、骨母細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肝細胞、胰細胞、腎細胞、牙齦細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、內皮細胞等。
作為間葉系幹細胞之具體例，可列舉例如：源自脂肪組織之間葉系幹細胞、源自骨髓之間葉系幹細胞、源自臍帶血之間葉系幹細胞、源自臍帶之間葉系幹細胞等。
作為富潛能幹細胞之具體例，可列舉例如：誘導性富潛能幹細胞、胚胎幹細胞、核移植胚胎幹細胞、胚胎腫瘤細胞、胚胎生殖細胞等。
並且，此等細胞可單獨培養，亦可組合二種以上培養。對於此等細胞，因應細胞之用途等自眾所周知者適當設定即可。
此外，細胞的來源並非特別受限者，但可列舉例如：哺乳類、鳥類、兩生類、魚類、昆蟲、植物、微生物等。作為哺乳類及鳥類之具體例，可列舉例如：人類、猿猴、黑猩猩、牛、馬、豬、綿羊、山羊、兔、狗、貓、天竺鼠、倉鼠、小鼠、大鼠、雞等。
（培養條件）
細胞培養並非特別受限者，可使用在醫療、醫藥品、準醫藥品、化妝品、食品、動物用藥品等技術領域及再生醫療、生物工學等基礎技術領域中使用的通常手段。
培養條件只要係可將培養細胞做成作為目標之狀態者，即非特別受限者。作為一般的培養條件，舉例而言，係使用所製備之基礎培養液的37℃、5%CO 2之環境下。
細胞培養之期間只要係培養細胞成為作為目標之狀態者，即非特別受限者。作為細胞培養之期間，舉例而言，為28天以內、21天以內、14天以內、7天以內、5天以內、3天以內。長期培養時，亦可交換培養基。交換培養基的頻率與方法並非特別受限者。一般而言，以每1天～7天交換一次為佳。尤佳為1天～5天。此時，可交換全部量的培養基，亦可殘留一部分培養基而加入新的培養基。
培養之細胞的密度只要係適於培養之細胞、培養容器、培養細胞之用途者，即非特別受限者，但舉例而言，為5×10 2細胞／cm 2以上且1×10 9細胞／cm 2以下。作為細胞密度的下限值，以1×10 3細胞／cm 2以上為較佳，以5×10 3細胞／cm 2以上為更佳，以5×10 4細胞／cm 2以上為尤佳。另一方面，作為細胞密度的上限值，以1×10 8細胞／cm 2以下為較佳，以5×10 7細胞／cm 2以下為更佳，以1×10 7細胞／cm 2以下為尤佳。
培養之細胞的密度，舉例而言，為5×10 2細胞／cm 2以上且1×10 9細胞／cm 2以下、5×10 2細胞／cm 2以上且1×10 8細胞／cm 2以下、5×10 2細胞／cm 2以上且5×10 7細胞／cm 2以下、5×10 2細胞／cm 2以上且1×10 7細胞／cm 2以下、1×10 3細胞／cm 2以上且1×10 9細胞／cm 2以下、1×10 3細胞／cm 2以上且1×10 8細胞／cm 2以下、1×10 3細胞／cm 2以上且5×10 7細胞／cm 2以下、1×10 3細胞／cm 2以上且1×10 7細胞／cm 2以下、5×10 3細胞／cm 2以上且1×10 9細胞／cm 2以下、5×10 3細胞／cm 2以上且1×10 8細胞／cm 2以下、5×10 3細胞／cm 2以上且5×10 7細胞／cm 2以下、5×10 3細胞／cm 2以上且1×10 7細胞／cm 2以下、5×10 4細胞／cm 2以上且1×10 9細胞／cm 2以下、5×10 4細胞／cm 2以上且1×10 8細胞／cm 2以下、5×10 4細胞／cm 2以上且5×10 7細胞／cm 2以下、5×10 4細胞／cm 2以上且1×10 7細胞／cm 2以下。
（培養液）
培養液30只要係適於培養之細胞者，即非特別受限者。作為培養液成分，可列舉例如：醣類、胺基酸、維他命類、無機鹽、微量金屬、添加物等。
並且，此等培養液成分可單獨摻合，亦可組合二種以上摻合。對於此等培養液成分，因應培養之細胞等自眾所周知者適當設定即可。
作為醣類之具體例，可列舉例如：葡萄糖或果糖、甘露糖、半乳糖等單醣類、蔗糖或蔗糖素、繭糖、麥芽糖、乳糖等雙醣類、葡萄糖苷基蔗糖或乳果寡糖、棉子糖等三醣類、醣祿或麥芽四糖等四醣類、環糊精、寡醣等。
作為胺基酸之具體例，可列舉例如：L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-精胺酸、L-胱胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白胺酸、L-離胺酸、L-甲硫胺酸、L-苯丙胺酸、L-絲胺酸、L-蘇胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸、L-丙胺酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬胺酸、L-半胱胺酸、L-羥補胺酸等。
作為維他命類之具體例，可列舉例如：L-抗壞血酸鈉、L-抗壞血酸二磷酸、膽鹼、葉酸、菸鹼酸、生物素、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺、胸苷、維他命B12等。
作為無機鹽之具體例，可列舉例如：氯化鈉、氫氧化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鉀、氫氧化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、氯化鈣、硫酸鈣、硝酸鈣、磷酸鈣、碳酸鈣、氯化鎂、硫酸鎂、硝酸鎂、磷酸鎂、碳酸鎂等。
作為微量金屬之具體例，可列舉例如：硫酸鐵、硝酸鐵、硫酸銅、硝酸銅、硫酸鋅等。
作為添加物之具體例，可列舉例如：牛血清或馬血清、人類血清等血清、FGF2或EGF、HGF、VEGF、PDGF等生長因子、白蛋白等蛋白質、麩胱甘肽或抗壞血酸、抗壞血酸衍生物等抗氧化劑、青黴素或鏈黴素等抗生素、HEPES等pH調整劑、乳酸或丙酸等有機酸、膽固醇等脂質、次亞麻油酸等脂肪酸、乙醇胺或腐胺等胺類、巰乙醇或3-巰基-1,2-丙二醇等還原劑、藻酸鈉或聚乙烯吡咯啶酮、羧甲纖維素、聚三葡萄糖等增稠劑、酚紅等pH指示劑等。
作為含有上述培養液成分的培養液30，可列舉例如：AIM V medium、HFDM-1 Medium、Dulbecco磷酸緩衝食鹽液（D-PBS）或Hanks平衡鹽溶液（HBSS）等平衡緩衝液、DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）或EMEM（Eagle’s Minimum Essential Medium）、α-MEM（Minimum Essential Medium alpha Modification）、IMDM（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）、GMEM（Glasgow’s MEM）、Ham’s F-10 medium、Ham’s F-12 medium、Ham’s F-12K medium、RPMI medium 1640、M-199 medium、L-15 medium、McCoy’s 5A Medium、MC DB105 medium、MCDB107 medium、MCDB131 medium、MCDB153 medium、MCDB201 medium、NCTC109 medium、NCTC135 medium、Waymouth’s MB752/1 medium、CMRL-1066 medium、Williams’ medium E、Brinster’s BMOC-3 Medium、E8 medium等基礎培養液等。
並且，此等基礎培養液可單獨使用，亦可組合二種以上使用。再者，基礎培養液亦可因應細胞之種類或狀態對培養液成分進行追加、去除、增量、減量。對於此等基礎培養液，因應培養之細胞等自眾所周知者適當設定即可。
（細胞片）
細胞片40係細胞彼此中介接合分子、細胞外基質等物理性、功能性連結而具有薄片結構者。
細胞片40可為由1個細胞層構成的單層結構，亦可為由2個以上之細胞層構成的堆疊結構。作為堆疊結構，並非特別受限者，但可列舉2層、3層、4層、5層等多層結構。
在細胞片40擁有多層結構的情況下，有時候會在於培養載體基材10中培養時獲得多層結構，亦可將擁有單層結構的細胞片堆疊而獲得。尤其，藉由準備多個本發明之附有細胞片之培養載體基材50，於某細胞片之上重合另一細胞片，自另一細胞片剝下培養載體基材，可獲得擁有多層結構的細胞片。
細胞片40的厚度並非特別受限者，但舉例而言，為0.001 mm以上且2.0 mm以下。作為細胞片40的厚度之下限值，以0.01 mm以上為較佳，以0.03 mm以上為更佳，以0.05 mm以上為尤佳。另一方面，作為細胞片40的厚度之上限值，以1.5 mm以下為較佳，以1.2 mm以下為更佳，以1.0 mm以下為尤佳。細胞片40的厚度，舉例而言，為0.001 mm以上且2.0 mm以下、0.001 mm以上且1.5 mm以下、0.001 mm以上且1.2 mm以下、0.001 mm以上且1.0 mm以下、0.01mm以上且2.0 mm以下、0.01 mm以上且1.5 mm以下、0.01 mm以上且1.2 mm以下、0.01 mm以上且1.0 mm以下、0.03 mm以上且2.0 mm以下、0.03 mm以上且1.2 mm以下、0.03 mm以上且1.0 mm以下、0.05 mm以上且2.0 mm以下、0.05 mm以上且1.5 mm以下、0.05 mm以上且1.2 mm以下、0.05 mm以上且1.0 mm以下。藉由將細胞片40的厚度做成上述範圍，可發揮在細胞片40內之高的細胞活性率及對細胞移植有利之優異的形狀維持能力。
細胞片40的面積並非特別受限者，但舉例而言，為0.3 cm 2以上且1000 cm 2以下。作為細胞片40的面積之下限值，以0.6 cm 2以上為較佳，以1.6 cm 2以上為更佳，以8 cm 2以上為尤佳，亦可為3 cm 2以上、6 cm 2以上或10 cm 2以上。另一方面，作為細胞片40的面積之上限值，以900 cm 2以下為較佳，以800 cm 2以下為更佳，以500 cm 2以下為尤佳，亦可為100 cm 2以下、50 cm 2以下或20 cm 2以下。舉例而言，細胞片40的面積為0.6 cm 2以上且900 cm 2以下、1.6 cm 2以上且800 cm 2以下、3 cm 2以上且500 cm 2以下、6 cm 2以上且100 cm 2以下、8 cm 2以上且50 cm 2以下或10 cm 2以上且20 cm 2以下。以往在單獨移植細胞片時，由於細胞片的強度低，故在大面積的情況下運送時破損的可能性高，但在本揭露中，由於細胞片40為培養載體基材所支撐，故可防止在移植時細胞片破裂，因此可將細胞片40的大小增大為8 cm 2以上。並且，亦可製作大的細胞片，適當調整成患部之尺寸來使用。
此外，培養載體基材的形狀在圖1中繪示了圓形，但亦可為圓形以外之適宜的形狀，舉例而言，亦可為正方形、正五邊形、正六邊形、正八邊形等正多邊形或長圓形、矩形等。
〈培養載體基材〉
本實施型態之培養載體基材10使用於用以培養細胞而形成細胞片40的細胞片支架與搬運所培養之細胞片40的細胞片支撐體之兩者，係在將細胞片貼附於被移植部位之後會自前述細胞片剝離的基材。
培養載體基材10的面積並非特別受限者，但期望小於培養容器且與細胞片相同或大於之。舉例而言，為0.3 cm 2以上且1000 cm 2以下。作為培養載體基材10的面積之下限值，以0.6 cm 2以上為較佳，以1.6 cm 2以上為更佳，以8 cm 2以上為尤佳，亦可為3 cm 2以上、6 cm 2以上或10 cm 2以上。另一方面，作為培養載體基材10的面積之上限值，以900 cm 2以下為較佳，以800 cm 2以下為更佳，以500 cm 2以下為尤佳，亦可為100 cm 2以下、50 cm 2以下或20 cm 2以下。在大於培養容器的情況下，有可能會無法獲得細胞片。舉例而言，培養載體基材10的面積為0.6 cm 2以上且900 cm 2以下、1.6 cm 2以上且800 cm 2以下、3 cm 2以上且500 cm 2以下、6 cm 2以上且100 cm 2以下、8 cm 2以上且50 cm 2以下或10 cm 2以上且20 cm 2以下。
培養載體基材10的基材厚度並不特別受限，但以5 μm以上且250 μm以下為佳。作為基材厚度之下限值，以6 μm以上為較佳，以8 μm以上、10 μm以上、12 μm以上為更佳。另一方面，作為基材厚度之上限值，以50 μm以下、30 μm以下、25 μm以下為較佳，以20 μm以下為更佳。舉例而言，培養載體基材10的基材厚度為6 μm以上且50 μm以下、8 μm以上且30 μm以下或10 μm以上且20 μm以下。
藉由做成上述下限值以上，可防止培養載體基材10在運送時破裂或蜷曲，提升操作性。藉由做成上述上限值以下，可提升在移植時對患部的追隨性。尤其若將基材厚度做成20 μm以下，可提高對曲率較高之患部的追隨性，舉例而言，亦可應用於透過手術將體內的器官縫合之處等。
並且，就發揮作為在培養時之自立膜的功能之觀點而言，培養載體基材10的基材厚度之下限以超過10 μm為佳，以11 μm以上為較佳，以12 μm以上為更佳。藉此，透過使用基材厚度超過10 μm的培養載體基材10，變得能夠在細胞培養工序時，於不將培養載體基材10固定或固著於培養容器20之內部的狀態下製造細胞片40。
所謂自立膜，良佳為培養載體基材10之培養面12的平面狀態在培養液30中亦維持之膜，較佳為於在培養面12上形成有細胞片40之後平面狀態亦維持。由於培養面12的平面狀態維持，故不會蜷曲的培養載體基材10可不固著即提高在培養液30中的細胞培養特性。
並且，此自立膜亦可為在以鑷子將一端捏起來時可以一定程度保持薄片形狀者。此時，培養載體基材10的面積以1.6 cm 2以上為佳。
培養載體基材10之培養面12以施加有親水化處理為佳。藉此，可提升細胞密合性。此親水化處理，可列舉例如：UV臭氧處理、電漿處理等。
其中，良佳為使用培養面12經電漿處理的培養載體基材10。
在本說明書中，所謂經親水化之面，意謂以θ／2法量測到之水滴接觸角θ之上限為70°以下的表面。另一方面，經親水化之面的水滴接觸角θ之下限以3°以上為佳，但並不受限於此。水滴接觸角θ，在25℃環境下將2 μL之純水置於基材，以遵循ISO 19403-2:2017的θ／2法利用接觸角計量測水滴與基材所夾之角。
並且，經親水化處理之培養面的表面粗糙度Ra之下限為0.3 nm以上，以0.5 nm以上為佳，且上限為100 nm以下，以10 nm以下為佳，以2 nm以下為較佳。
此外，於此之所謂表面粗糙度Ra，係指使用以原子力顯微鏡（AFM）量測到之表面形狀資料，在一邊100 nm之正方形的區域中之算術平均粗糙度。
作為構成培養載體基材10的材料，可列舉：聚醚醚酮（PEEK）、聚對酞酸乙二酯（PET）、聚對酞酸丁二酯（PBT）、聚苯乙烯（PS）、聚碳酸酯（PC）、改質聚苯醚（mPPE）、聚苯硫醚（PPS）、聚碸（PSU）、聚芳酯（PAR）、液晶聚合物（LCP）、聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）等樹脂材料。
培養載體基材10之一例亦可由於主成分包含此等樹脂材料之至少一者的薄膜所構成，以聚醚醚酮薄膜或聚對酞酸乙二酯薄膜為佳，以聚醚醚酮薄膜為較佳。
培養載體基材10以包含1層或2層以上之由上述樹脂材料而成之樹脂層者為佳。2層以上之樹脂層亦可包含彼此相異之種類的材料。
培養載體基材10可為由包含由上述材料而成之樹脂層的樹脂基材而成之構成，亦可為由包含由上述材料而成之樹脂層與由其他材料而成之無機層的疊合基材而成之構成。惟於樹脂層可不含透過聚對二甲苯等之化學蒸鍍形成之層體或溼式塗布層。並且，在疊合基材中的無機層以不含玻璃層為佳，亦可包含金屬箔。並且，培養載體基材10以於培養面12側不含不織布及纖維基材為佳。
包含PEEK的培養載體基材10若由低線膨脹係數、耐溶劑性、耐熱性之觀點來綜合討論，則其相比於包含PET之情形為佳。
並且，培養載體基材10以由比重較培養液30還高的材料所構成者為佳。
其係在以雷射顯微鏡量測培養載體基材10之培養面12時，於100 μm見方之範圍中直徑1 μm以上且100 μm以下並且深度0.5 μm以上且100 μm以下之孔洞為3個以下的培養載體基材。前述孔洞之直徑，舉例而言，為1 μm以上且100 μm以下，以2 μm以上且50 μm以下為佳，以3 μm以上且30 μm以下為較佳。前述孔洞之深度，舉例而言，為0.5 μm以上且100 μm以下，以1 μm以上且50 μm以下為佳，以2 μm以上且20 μm以下為較佳。
孔洞之直徑與孔洞之深度的範圍之組合，舉例而言，孔洞之直徑為1 μm以上且100 μm以下並且孔洞之深度為0.5 μm以上且100 μm以下、孔洞之直徑為1 μm以上且100 μm以下並且孔洞之深度為1 μm以上且50 μm以下、孔洞之直徑為1 μm以上且100 μm以下並且孔洞之深度為2 μm以上且20 μm以下、孔洞之直徑為2 μm以上且50 μm以下並且孔洞之深度為0.5 μm以上且100 μm以下、孔洞之直徑為2 μm以上且50 μm以下並且孔洞之深度為1 μm以上且50 μm以下、孔洞之直徑為2 μm以上且50 μm以下並且孔洞之深度為2 μm以上且20 μm以下、孔洞之直徑為3 μm以上且30 μm以下並且孔洞之深度為0.5 μm以上且100 μm以下、孔洞之直徑為3 μm以上且30 μm以下並且孔洞之深度為1 μm以上且50 μm以下、孔洞之直徑為3 μm以上且30 μm以下並且孔洞之深度為2 μm以上且20 μm以下。
並且，培養載體基材10的空隙率之上限，舉例而言，為15%以下，以10%以下為佳，以5%以下為較佳。另一方面，培養載體基材10的空隙率之下限並不特別受限，但亦可為0%以上。
藉由培養面12的上述孔洞為3個以下及／或將培養載體基材10的空隙率做成上述上限值以下，可將與細胞片40的密合力做成適度者。
此外，孔洞的有無亦可以培養載體基材10形成於培養面12側的樹脂層之表面為量測對象。
空隙率係由理論密度與實測密度算出。具體而言，透過空隙率＝［1－（實測密度／理論密度）］×100之計算式來算出。
並且，培養載體基材10之培養面12亦可以不含溫度響應性聚合物之方式構成。藉此，可抑制在冷凍保存工序等低溫環境下細胞片40與培養載體基材10的密合性降低一事。
溫度響應性聚合物係在培養細胞時之溫度下發揮細胞附著性且藉由自此進行溫度變化而變得能夠發揮細胞不附著性以輕易剝離細胞片的材料。若溫度響應性聚合物發揮細胞附著性的溫度區域為10℃～45℃──尤其係33℃～40℃──之範圍，則可穩定培養細胞而為佳。並且，若溫度響應性聚合物發揮細胞不附著性的溫度區域為1℃～36℃──尤其係4℃～32℃──之範圍內，則由於可減少對細胞片之剝離造成的損害故佳。作為構成溫度響應性聚合物的材料，具體可列舉：聚-N-異丙基丙烯醯胺（PNIPAAm）、聚-N-正丙基丙烯醯胺、聚-N-正丙基甲基丙烯醯胺、聚-N-乙氧乙基丙烯醯胺、聚-N-四氫呋喃基丙烯醯胺、聚-N-四氫呋喃基甲基丙烯醯胺及聚-N,N-二乙基丙烯醯胺等溫度響應性高分子，其中，以PNIPAAm、聚-N-正丙基甲基丙烯醯胺、聚-N,N-二乙基丙烯醯胺為佳。
使用於細胞片之培養之前的培養載體基材10可做成包裝於包裝材料的包裝體。藉由做成密封的包裝體，可使之保存、流通而不會汙損培養面。並且，此包裝體亦可滅菌。滅菌方法可列舉：電子束滅菌、伽瑪射線滅菌、EOG滅菌、高壓蒸氣滅菌等。
包裝材料可列舉例如：鋁、聚對酞酸乙二酯、離子聚合物、聚乙烯、聚氯乙烯、聚二氯亞乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯腈、乙烯―乙酸乙烯酯共聚物、乙烯―乙烯醇共聚物、乙烯―甲基丙烯酸共聚物、全氟烷氧基氟樹脂、耐綸、賽珞凡、紙材等。可單獨使用此等，亦可自此等組合二者以上。在進行如EOG滅菌或高壓蒸氣滅菌之要求透氣性的滅菌之情況下，良佳使用將紙材與上述材料組合的包裝材料。此外，包裝材料亦可做成多重捆包，亦可在滅菌後進一步疊上包裝，包裝體的最外側部分以樹脂之薄膜狀之包裝材料為佳。
藉由在培養載體基材10上培養細胞片40，可獲得包含細胞片40與培養載體基材10之堆疊體的附有細胞片之培養載體基材50。
在附有細胞片之培養載體基材50中，細胞片40成為在培養面12側上之表面之中被覆有例如50%以上且100%以下之能夠堆積細胞之區域的狀態。在採用對於培養載體基材10之培養面12之一部分以重物來荷重固定的方法或將培養載體基材10透過器具來位置固定的方法之情況下，所謂能夠堆積細胞之區域，係未接觸重物或器具等且能夠堆積細胞的區域。並且，在對培養載體基材10之培養面12施加有親水化處理的情況下，所謂能夠堆積細胞之區域，係經親水化處理之區域。細胞片40的被覆面積之下限值以70%以上為佳，以90%以上為較佳。細胞片40的被覆面積之上限值亦可為100%以下，亦可為99%以下，亦可為98%以下。細胞片40的被覆面積，舉例而言，為50%以上且100%以下、50%以上且99%以下、50%以上且98%以下、70%以上且100%以下、70%以上且99%以下、70%以上且98%以下、90%以上且100%以下、90%以上且99%以下、90%以上且98%以下。此外，培養載體基材10的面積良佳為與能夠堆積細胞片40之細胞之區域的面積相同或大於之。藉由做成上述下限值以上，可提升治癒效果。
並且，藉由在培養載體基材上形成細胞片，可降低自培養容器或冷凍保存容器取出細胞片時破裂的可能性，可輕易取出。並且，可在將細胞片貼附於被移植部位之後，輕易自培養載體基材剝離細胞片。由於細胞片的操作變得容易，故變得能夠製作大尺寸的細胞片。
〈附有細胞片之培養載體基材的製造方法〉
本實施型態之附有細胞片之培養載體基材50的製造方法之一例亦可包含例如：培養工序，於培養容器20之內部導入多個細胞、培養基（培養液30）及培養載體基材10，於培養載體基材10之培養面12培養細胞片40；以及取出工序，自培養液30取出附有細胞片之培養載體基材50。
本實施型態之細胞片40係自附有細胞片之培養載體基材50剝離者，可使用於細胞移植療法等治療、預防等。
剝離方法並非特別受限者，可使用在醫療、醫藥品、準醫藥品、化妝品、食品、動物用藥品等技術領域及再生醫療、生物工學等基礎技術領域中使用的通常手段。作為剝離方法，可舉出例如：物理性處理等。
〈冷凍保存方法〉
本實施型態之冷凍保存方法之一例包含：冷卻工序，如圖1之（c）所示，將包含培養容器20之內部之培養載體基材10與形成於培養載體基材10之表面（培養面12）之細胞片40的附有細胞片之培養載體基材50在冷凍保存液60中予以冷卻。於培養容器亦可加上培養用之蓋（未圖示）或防止漏液及微生物混入之蓋（未圖示）來冷凍。在圖1之（c）中，在培養容器20之內部進行附有細胞片之培養載體基材50的冷凍保存，但亦可將附有細胞片之培養載體基材50換移至與培養容器20不同的冷凍保存容器進行冷凍保存。作為冷凍保存容器，並非特別受限者，但可使用例如已在培養容器20中示例者。
在冷卻工序中，附有細胞片之培養載體基材50能夠採用各式各樣的態樣。附有細胞片之培養載體基材50，如圖3之（a）、（b）所示，亦可具有於細胞片40之單側形成有培養載體基材10的結構，如圖3之（c）所示，亦可具備以2片培養載體基材10a、10b包夾細胞片40之兩面的結構。在圖3之（a）中，係以培養載體基材10朝向培養容器20之底面的狀態配置。在圖3之（b）中，係以細胞片40朝向培養容器20之底面的狀態配置。在圖3之（c）中，培養載體基材10a、10b可由相同材料所構成，亦可由彼此不同的材料所構成。舉例而言，培養載體基材10a、10b可為兩者皆係包含PEEK的培養載體基材，亦可為一者係PEEK的培養載體基材而另一者係不含PEEK的培養載體基材。
（冷凍保存液）
冷凍保存液60係用以減低由冷凍保存所致之細胞之損傷的溶液。
冷凍保存液60只要係適於細胞之冷凍保存者，即非特別受限者，但亦可含有培養液所包含之培養液成分、冷凍保護劑等。
對於係為培養液成分的醣類、胺基酸、維他命類、無機鹽、微量金屬、添加物，只要係滿足上述（培養液）之項目的說明者即可。並且，冷凍保存液以凝固起始溫度位於－15℃以上且－5℃以下之範圍者為佳。
冷凍保護劑係使用於減低由冷凍保存時的冷凍或解凍所致之對細胞之損傷的物質。作為冷凍保護劑，可列舉例如：細胞非滲透性冷凍保護劑、細胞滲透性冷凍保護劑。
作為細胞非滲透性冷凍保護劑之具體例，可列舉例如：白蛋白、蔗糖、繭糖、聚葡萄糖、聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚離胺酸等。
作為細胞滲透性冷凍保護劑之具體例，可列舉例如：二甲亞碸（DMSO）、丙三醇、乙二醇、丙二醇等。
並且，此等冷凍保護劑可單獨摻合，亦可組合二種以上摻合。對於此等冷凍保護劑，因應細胞的種類、冷凍保存液的組成等自眾所周知者適當設定即可。
作為不含DMSO的市售之冷凍保存液，可列舉例如：STEM-CELLBANKER（註冊商標）無DMSO之GMP等級（日本全藥工業公司）、BAMBANKER（註冊商標）無DMSO（GC Lymphotec, Inc.）、Cryo Scarless（註冊商標）無DMSO（Bioverde Co., Ltd.）、StemCell Keep（Bioverde Co., Ltd.）、CryoNovo（註冊商標）X12（Akron BioProducts LLC）、CryoNovo（註冊商標）P24（Akron BioProducts LLC）、人類ES／iPS細胞冷凍保存用之無DMSO之細胞冷凍保存液（REPROCELL, Inc.）、Cell Reservoir One（NACALAI TESQUE, Inc.）、ThelioKeep（註冊商標：Bioverde Co., Ltd.）、Cellvation（註冊商標：Protide Pharmaceuticals Inc.）、ReproCryo RM（REPROCELL Inc.）、SOFORO Cryo（SARAYA Co., Ltd）等。並且，作為包含DMSO的市售之冷凍保存液，可列舉例如：STEM-CELLBANKER（註冊商標）GMP等級（日本全藥工業公司）、STEM-CELLBANKER（註冊商標）EX GMP等級（日本全藥工業公司）、BAMBANKER（註冊商標）hRM（GC Lymphotec, Inc.）、BAMBANKER（註冊商標）（GC Lymphotec, Inc.））、iStock（GC Lymphotec, Inc.）、CryoStor CS5（Charles River Labo ratories Cell Solutions, Inc）、CryoStor CS10（Charles River Laboratories Cell Solutions, Inc）等。
（冷卻工序）
良佳為在冷卻工序中，將附有細胞片之培養載體基材50在冷凍保存液中使用非貫流式之冷卻裝置予以冷卻。由於變得能夠在適當的培養載體基材10上對於細胞片40透過非貫流式之冷卻裝置將係為冷卻對象物的細胞片在均勻的溫度下予以冷卻，故對細胞的損害少，可抑制細胞活性率的降低。
在冷卻工序中，在0～－5℃的冷卻速度，舉例而言，為0.1℃／分鐘以上且15℃／分鐘以下，以0.25℃／分鐘以上且12.5℃／分鐘以下為佳，以0.5℃／分鐘以上且10℃／分鐘以下為較佳。
藉由做成上述下限值以上，可減少不必要之液狀之冷凍保護材與細胞的接觸時間。藉由做成上述上限值以下，可抑制細胞內冰晶的形成。
在冷卻工序中，冷凍處理的溫度只要可將培養細胞及冷凍保存液冷凍，即非特別受限者。作為冷凍處理的溫度，舉例而言，為－196℃以上且－25℃以下。作為下限值，以－180℃以上為較佳，以－160℃以上為更佳，以－150℃以上為尤佳。另一方面，作為上限值，以－25℃以下為較佳，以－30℃以下為更佳，以－35℃以下為尤佳。冷凍處理的溫度，舉例而言，為－196℃以上且－25℃以下、－196℃以上且－30℃以下、－196℃以上且－35℃以下、－180℃以上且－25℃以下、－180℃以上且－30℃以下、－180℃以上且－35℃以下、－160℃以上且－25℃以下、－160℃以上且－30℃以下、－160℃以上且－35℃以下、－150℃以上且－25℃以下、－150℃以上且－30℃以下、－150℃以上且－35℃以下。
使用於冷凍處理的冷卻裝置並非特別受限者，可列舉例如：急速冷凍裝置、極低溫冷藏裝置等。作為冷卻裝置，就在均勻的溫度下將細胞冷凍以提高解凍後之細胞的生存率之觀點而言，相較於使傳熱工具接觸培養容器以使培養容器及細胞冷凍，較佳為不與傳熱工具接觸、自多方向而非一方向──良佳為所有方向──對培養容器吹拂冷氣來冷凍的冷凍裝置。作為對培養容器吹拂冷氣來冷凍的冷凍裝置，具體上可舉出透過利用冷卻風扇之冷氣循環來使被冷卻物冷卻的冷卻裝置，例如日本專利公開第2005-127666號公報所揭露之具備冷卻風扇的非貫流方式之冷卻裝置等。此外，上述所謂「非貫流方式」，意謂來自被冷卻物之貫流空氣的大部分不會通過冷卻器的方式。
（冷凍保存工序）
冷凍保存方法良佳為在冷卻工序之後包含冷凍保存工序，所述冷凍保存工序於例如－196～－60℃──良佳為－180～－65℃，較佳為－150～－80℃──下保存附有細胞片之培養載體基材50。藉此，可穩定維持細胞片一段長期間。
冷卻工序的溫度亦可採用冷卻裝置的設定溫度。
冷凍保存只要可將細胞穩定冷凍保存，即非特別受限者。
作為冷凍保存的方法，可列舉例如：與冷卻劑之液相、氣相的接觸、超低溫冷凍庫的使用等。作為良佳之冷凍保存的方法，就溫度的觀點而言，係與冷卻劑之液相、氣相的接觸。
作為冷卻劑，可列舉例如：液態氮、液態乙烷、液態丙烷、液態氦、乾冰等。
冷凍保存的溫度只要可將細胞穩定冷凍保存，即非特別受限者。作為冷凍保存的溫度，舉例而言，亦可為－196℃以上且－60℃以下、－196℃以上且－134℃以下、－134℃以上且－60℃以下之任一範圍內。
冷凍保存的溫度亦可採用成為冷凍對象的細胞片40之表面溫度。表面溫度，舉例而言，可使用K熱電偶來量測。
附有細胞片之培養載體基材50的冷凍物係包含培養載體基材10與形成於培養載體基材10之表面（培養面12）的細胞片40者。附有細胞片之培養載體基材50中，培養載體基材10及細胞片40係冷凍保存狀態。
在上述冷凍物中，培養載體基材10及細胞片40係例如於上已述之冷凍保存的溫度──具體而言，良佳為－60℃以下，較佳為－135℃以下──之冷凍保存狀態。並且，冷凍物亦可做成－134℃以上且－60℃以下之範圍之冷凍保存狀態。此外，冷凍物做成－196℃以上之冷凍保存狀態。
在培養容器或冷凍保存容器之內部中冷凍的附有細胞片之培養載體基材的冷凍物，可於在培養容器內或冷凍保存容器中冷凍的狀態或者自容器取出的狀態下做成以包裝材料包裝的包裝體。藉由做成經密封的包裝體，可防止微生物混入細胞片，並且可使之保存、流通而不會使細胞片汙損。作為一例，藉由將具有附有細胞片之培養載體基材與冷凍保存液的容器在以薄膜狀之包裝材料包裝而密封的狀態下予以冷凍，可獲得冷凍物的包裝體。作為包裝材料，良佳為鋁、聚對酞酸乙二酯、離子聚合物、聚乙烯、聚二氯亞乙烯、聚乙烯醇、聚丙烯、聚酯、聚碳酸酯、聚丙烯腈、乙烯―乙酸乙烯酯共聚物、乙烯―乙烯醇共聚物、乙烯―甲基丙烯酸共聚物、聚醯亞胺、全氟烷氧基氟樹脂或四氟乙烯―六氟丙烯共聚物（FEP）等氟系樹脂、耐綸。可單獨使用此等，亦可自此等組合二者以上。
（解凍工序）
本實施型態之移植方法在包含上述冷凍保存方法的情況下，冷凍保存方法更包含將附有細胞片之培養載體基材50解凍的解凍工序。
解凍方法並非特別受限者，可使用在醫療、醫藥品、準醫藥品、化妝品、食品、動物用藥品等技術領域及再生醫療、生物工學等基礎技術領域中使用的通常手段。
作為解凍的方法，可舉出例如：水浴、培養箱、加熱板、除霜器等的使用，或浸漬於較冷凍溫度還高之溫度的融解液、靜置於較冷凍溫度還高之溫度環境下等。
解凍時之冷凍物所接觸的環境溫度只要係高於冷凍溫度的溫度且未達50℃，即非特別受限者。上述環境溫度之上限，舉例而言，為49℃以下，以45℃以下為佳，以40℃以下為較佳。另一方面，環境溫度之下限，舉例而言，為0℃以上，以5℃以上為佳，以10℃以上為較佳，以15℃以上為更佳。
解凍時之冷凍物所接觸的環境溫度之範圍，舉例而言，為0℃以上且49℃以下、0℃以上且45℃以下、0℃以上且40℃以下、5℃以上且49℃以下、5℃以上且45℃以下、5℃以上且40℃以下、10℃以上且49℃以下、10℃以上且45℃以下、10℃以上且40℃以下、15℃以上且49℃以下、15℃以上且45℃以下、15℃以上且40℃以下。
此外，在解凍溫度為50℃以上的情況下，由於有可能會於細胞發生熱損害故不樂見。並且，亦可在解凍中暫時儲存於凝固點以下的溫度環境。舉例而言，可在將儲存於－80℃的冷凍物暴露於－30℃之環境溫度之後在凝固點以上之環境溫度下解凍。
冷凍物之解凍所需的時間只要不會對細胞產生由冷凍所致之傷害，即不特別受限。通常只要超過10秒且60分鐘以下，即可無礙解凍。作為冷凍物之解凍所需的時間之下限值，只要超過10秒即可，以20秒以上為佳，以30秒以上為較佳，以1分鐘以上為更佳。作為上限值，只要為60分鐘以下即可，以50分鐘以下為佳，以40分鐘以下為較佳，以30分鐘以下為更佳。舉例而言，解凍所需的時間超過10秒且60分鐘以下、超過10秒且50分鐘以下、超過10秒且40分鐘以下、超過10秒且30分鐘以下、20秒以上且60分鐘以下、20秒以上且50分鐘以下、20秒以上且40分鐘以下、20秒以上且30分鐘以下、30秒以上且60分鐘以下、30秒以上且50分鐘以下、30秒以上且40分鐘以下、30秒以上且30分鐘以下、1分鐘以上且60分鐘以下、1分鐘以上且50分鐘以下、1分鐘以上且40分鐘以下、1分鐘以上且30分鐘以下。
在解凍過快的情況下，會因由溫度差所致之熱衝擊而於冷凍物產生龜裂，有細胞片破損之虞。在解凍過慢的情況下，由於會因冰點下之條件而水分子再結晶，冰晶會變大，會對細胞產生嚴重的傷害，故不樂見。
在上述解凍時間中，上述環境溫度可以成為固定之方式設定，亦可以階段式上升等變動之方式設定。
融解液只要係不會對培養細胞造成損傷者，即非特別受限者。作為融解液所含有的成分，可列舉例如：蔗糖、葡萄糖、麥芽糖、繭糖、果糖等。並且，融解液亦可含有上述（培養液）之項目所記載之成分。
融解液的溫度只要係較冷凍溫度還高之溫度，即非特別受限者。作為融解液的溫度，舉例而言，為0℃以上且45℃以下。作為下限值，以4℃以上為較佳，以25℃以上為更佳，以28℃以上為尤佳。另一方面，作為上限值，以40℃以下為較佳，以39℃以下為更佳，以38℃以下為尤佳。融解液的溫度，舉例而言，為0℃以上且45℃以下、0℃以上且40℃以下、0℃以上且39℃以下、0℃以上且38℃以下、4℃以上且45℃以下、4℃以上且40℃以下、4℃以上且39℃以下、4℃以上且38℃以下、25℃以上且45℃以下、25℃以上且40℃以下、25℃以上且39℃以下、25℃以上且38℃以下、28℃以上且45℃以下、28℃以上且40℃以下、28℃以上且39℃以下、28℃以上且38℃以下。
解凍的細胞片40及培養載體基材10（附有細胞片之培養載體基材50）亦可視需求在解凍處理後立刻以細胞清洗液清洗。細胞清洗液並非特別受限者，亦可含有上述（培養液）之項目所記載之成分。
細胞清洗液的溫度並非特別受限者。作為細胞清洗液的溫度，舉例而言，為0℃以上且45℃以下。作為下限值，以4℃以上為較佳，以25℃以上為更佳，以28℃以上為尤佳。另一方面，作為上限值，以40℃以下為較佳，以39℃以下為更佳，以38℃以下為尤佳。
培養細胞的清洗次數並非特別受限者，為1次或多次（例如2次、3次、4次、5次等）。
在本揭露中，於培養面12不含溫度響應性聚合物，故可抑制在冷凍保存工序等低溫環境下細胞片40自培養載體基材10剝離一事，即使經過冷凍保存工序與解凍工序，亦可獲得維持有細胞片與薄膜之附著性的附有細胞片之培養載體基材50。
以上敘述了本發明之實施型態，但此等係本發明之示例，可採用上述以外之各式各樣的構成。並且，本發明並非受限於於上已述之實施型態者，在可達成本發明之目的之範圍中的變形、改良等包含於本發明。
以下備註參考型態A～J之例。
〈A.培養載體基材〉
茲列舉以下1.～13.作為培養載體基材的參考型態A。
1. 一種培養載體基材，其係使用於運送在培養面培養之細胞片的培養載體基材，其中 該培養載體基材的基材厚度為5 μm以上且250 μm以下。
2. 如1.所記載之培養載體基材，其中前述培養載體基材的基材厚度超過10 μm，在前述細胞片之培養中不固著於培養容器之內部即發揮作為自立膜的功能。
3. 如1.或2.所記載之培養載體基材，其中前述培養面經親水化處理。
4. 如3.所記載之培養載體基材，其中前述親水化處理經UV臭氧處理或電漿處理。
5. 如1.～4.之任一者所記載之培養載體基材，其中該培養載體基材係聚醚醚酮薄膜或聚對酞酸乙二酯薄膜。
6. 如1.～5.之任一者所記載之培養載體基材，其中前述培養面不含溫度響應性聚合物。
7. 如1.～6.之任一者所記載之培養載體基材，其中前述培養載體基材的面積為0.3 cm 2以上且1000 cm 2以下。
8. 如1.～7.之任一者所記載之培養載體基材，其中前述培養載體基材包含1層或2層以上之由樹脂材料而成之樹脂層。
9. 如1.～8.之任一者所記載之培養載體基材，其中在以雷射顯微鏡量測前述培養面時，於100 μm見方的觀測範圍之至少一者中，直徑1 μm以上且100 μm以下並且深度0.5 μm以上且100 μm之孔洞為3個以下。
10. 如1.～9.之任一者所記載之培養載體基材，其中空隙率為15%以下。
11. 如1.～10.之任一者所記載之培養載體基材，其中在前述培養面上的水接觸角為70°以下。
12. 如1.～11.之任一者所記載之培養載體基材，其係使用於將形成於前述培養面的細胞片冷凍保存者。
13. 如1.～12.之任一者所記載之培養載體基材，其係使用於將形成於前述培養面的細胞片貼附於移植部位者。
〈B.附有細胞片之培養載體基材〉
茲列舉以下1.～21.作為附有細胞片之培養載體基材的參考型態B。
1. 一種附有細胞片之培養載體基材，其具有培養載體基材與細胞片的堆疊體，其中 前述細胞片係被覆前述培養載體基材之在前述培養面側上的表面之至少50%的狀態。
2. 如1.所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中前述培養載體基材的基材厚度為5 μm以上且250 μm以下。
3. 如1.或2.所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中前述培養面經親水化處理。
4. 如3.所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中前述親水化處理經UV臭氧處理或電漿處理。
5. 如1.～4.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中前述培養載體基材係聚醚醚酮薄膜或聚對酞酸乙二酯薄膜。
6. 如1.～5.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中前述培養面不含溫度響應性聚合物。
7. 如1.～6.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中前述培養載體基材的面積為0.3 cm 2以上且1000 cm 2以下。
8. 如1.～7.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中前述培養載體基材包含1層或2層以上之由樹脂材料而成之樹脂層。
9. 如1.～8.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中在以雷射顯微鏡量測前述培養面時，於100 μm見方的觀測範圍之至少一者中，直徑1 μm以上且100 μm以下並且深度0.5 μm以上且100 μm之孔洞為3個以下。
10. 如1.～9.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中空隙率為15%以下。
11. 如1.～10.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中在前述培養面上的水接觸角為70°以下。
12. 如1.～11.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其係使用於運送在培養面培養的細胞片者。
13. 如1.～12.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其係使用於將形成於前述培養面的細胞片冷凍保存者。
14. 如1.～13.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其係使用於將形成於前述培養面的細胞片貼附於移植部位者。
15. 如1.～14.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其係使用於細胞移植療法者。
16. 如1.～15.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其中細胞移植療法係包含對細胞、組織、臟器之缺損及功能障礙、功能不全相關聯的症狀之發病及復發予以抑制、防止的至少一種者。
17. 如1.～16.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其係使用於治療脊髓損傷、膝關節軟骨損傷、缺血性心臟病、老年黃斑部病變、角膜上皮幹細胞缺乏症、再生不良性貧血、急性下肢缺血、難治性皮膚潰瘍、術後併發症預防、熱傷之至少一種者。
18. 如1.～17.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材，其係使用於移植方法者，所述移植方法包含：細胞片的培養工序、細胞片的冷凍保存工序、細胞片之冷凍物的解凍工序及細胞片之貼附於被移植部位的工序之至少一者。
19. 一種移植材料，其包含如1.～18.之任一者所記載之附有細胞片之培養載體基材。
20. 如19.所記載之移植材料，其係使用於將細胞片貼附於疾病部位者。
21. 一種治療用之移植材料，其係19.或20.所記載之移植材料， 係用於治療脊髓損傷、膝關節軟骨損傷、缺血性心臟病、老年黃斑部病變、角膜上皮幹細胞缺乏症、再生不良性貧血、急性下肢缺血、難治性皮膚潰瘍、術後併發症預防、熱傷之至少一種者。
上述附有細胞片之培養載體基材亦可包含參考型態A之1.～13.之任一培養載體基材。
〈C.附有細胞片之培養載體基材的冷凍物〉
茲列舉以下1.～8.作為附有細胞片之培養載體基材的冷凍物的參考型態C。
1. 一種冷凍物，其包含 培養載體基材與 形成於前述培養載體基材之表面的細胞片，其中 前述培養載體基材及前述細胞片係冷凍保存狀態。
2. 如1.所記載之冷凍物，其係－196℃～－60℃之冷凍保存狀態。
3. 如1.所記載之冷凍物，其係－196℃～－135℃之冷凍保存狀態。
4. 如1.所記載之冷凍物，其係－134℃～－60℃之冷凍保存狀態。
5. 如1.～4.之任一者所記載之冷凍物，其包含冷凍保存液。
6. 如5.所記載之冷凍物，其中前述冷凍保存液包含培養液成分及冷凍保護劑之至少一者。
7. 如5.或6.所記載之冷凍物，其中前述冷凍保存液不含DMSO。
8. 如1.～4.之任一者所記載之冷凍物，其中前述培養載體基材及前述細胞片之整體係由冷凍保存液所覆蓋的冷凍保存狀態。
在上述附有細胞片之培養載體基材的冷凍物中，亦可包含參考型態A之1.～13.之任一培養載體基材，亦可包含參考型態B之1.～21.之任一附有細胞片之培養載體基材。
〈D.包裝體〉
茲列舉以下1.～6.作為包裝體的參考型態D。
1. 一種包裝體，其具備培養載體基材與包裝前述培養載體基材的包裝材料。
2. 一種包裝體，其具備： 包含培養載體基材與形成於培養載體基材之培養面之細胞片的附有細胞片之培養載體基材，以及 包裝前述附有細胞片之培養載體基材的包裝材料。
3. 一種包裝體，其具備： 包含培養載體基材與形成於培養載體基材之培養面之細胞片的附有細胞片之培養載體基材的冷凍物；以及 包裝前述冷凍物的包裝材料。
4. 如1.～3.之任一者所記載之包裝體，其於前述包裝材料之內部包含培養容器及／或冷凍保存容器。
5. 如1.～4.之任一者所記載之包裝體，其中前述包裝材料之內部係經密封的狀態。
6. 如1.～5.之任一者所記載之包裝體，其係使用於運送及／或儲存者。
在上述包裝體中，亦可包含參考型態A之1.～13.之任一培養載體基材，亦可包含參考型態B之1.～21.之任一附有細胞片之培養載體基材，亦可包含參考型態C之1.～8.之任一附有細胞片之培養載體基材的冷凍物。
〈E.冷凍保存方法或解凍方法〉
茲列舉以下1.～10.作為冷凍保存方法或解凍方法的參考型態E。
1. 一種冷凍保存方法，其包含：冷卻工序，將包含培養載體基材與形成於前述培養載體基材之表面之細胞片的附有細胞片之培養載體基材在冷凍保存液中予以冷卻。
2. 如1.所記載之冷凍保存方法，其在前述冷卻工序中，將前述附有細胞片之培養載體基材在冷凍保存液中使用非貫流式之冷卻裝置予以冷卻。
3. 如1.或2.所記載之冷凍保存方法，其在前述冷卻工序中，在0～－5℃的冷卻速度為0.1℃／分鐘以上且15℃／分鐘以下。
4. 如1.～3.之任一者所記載之冷凍保存方法，其在前述冷卻工序之後包含：冷凍保存工序，於－196～－60℃保存前述附有細胞片之培養載體基材。
5. 如1.～4.之任一者所記載之冷凍保存方法，其透過前述冷卻工序獲得包含前述培養載體基材及前述細胞片的冷凍物。
6. 一種解凍方法，其包含將冷凍物解凍的解凍工序，所述冷凍物包含 培養載體基材與 形成於前述培養載體基材之表面的細胞片， 前述培養載體基材及前述細胞片係冷凍保存狀態。
7. 如6.所記載之解凍方法，其在如1.～4.之任一者所記載之冷凍保存方法的冷卻工序之後包含前述解凍工序。
8. 如6.或7.所記載之解凍方法，其包含：解凍工序，將在如5.所記載之冷凍保存方法中獲得之冷凍物解凍。
9. 如6.～8.之任一者所記載之解凍方法，其在前述解凍工序中，解凍時之環境溫度為0℃以上且未達50℃。
10. 如6.～9.之任一者所記載之解凍方法，其在前述解凍工序中，解凍時間超過10秒且60分鐘以下。
在上述冷凍保存方法或冷凍方法中，亦可包含參考型態A之1.～13.之任一培養載體基材，亦可包含參考型態B之1.～21.之任一附有細胞片之培養載體基材。
在冷凍保存方法中獲得之冷凍物亦可包含參考型態C之1.～8.之任一附有細胞片之培養載體基材的冷凍物。
並且，在冷凍保存方法中獲得之冷凍物及／或在解凍方法中獲得之解凍物可使用於於後所述之移植方法。
〈F.附有細胞片之培養載體基材的製造方法〉
茲列舉以下1.～3.作為附有細胞片之培養載體基材的製造方法的參考型態F。
1. 一種附有細胞片之培養載體基材的製造方法，其包含： 培養工序，於培養容器之內部導入多個細胞、培養基及培養載體基材，於前述培養載體基材之培養面培養細胞片；以及 取出工序，自前述培養容器取出附有前述細胞片之前述培養載體基材。
2. 如1.所記載之附有細胞片之培養載體基材的製造方法，其在前述培養工序中，不將前述培養載體基材固著於培養容器之內部來培養前述細胞片。
3. 如1.或2.所記載之附有細胞片之培養載體基材的製造方法，其在前述取出工序中，不需要自前述培養容器將前述培養載體基材透過物理上的手段分離的操作。
在上述附有細胞片之培養載體基材的製造方法中，亦可包含參考型態A之1.～13.之任一培養載體基材。
〈G.移植方法〉
茲列舉以下1.～25.作為移植方法的參考型態G。
1. 一種移植方法，其包含：移植工序，使用包含培養載體基材與形成於前述培養載體基材之培養面之細胞片的附有細胞片之培養載體基材，將前述細胞片貼附於被移植部位之後，自前述細胞片剝離前述培養載體基材。
2. 如1.所記載之移植方法，其在前述移植工序中使用前述附有細胞片之培養載體基材，所述附有細胞片之培養載體基材具有前述培養載體基材與前述細胞片的堆疊體，前述細胞片係被覆前述培養載體基材之在前述培養面側上的表面之至少50%的狀態。
3. 如1.或2.所記載之移植方法，其在前述移植工序中，自包裝體取出前述附有細胞片之培養載體基材來使用，或者自包裝體取出前述附有細胞片之培養載體基材的冷凍物並將該冷凍物解凍後使用。
4. 如1.～3.之任一者所記載之移植方法，其包含：培養工序，於前述培養載體基材之前述培養面培養前述細胞片，獲得前述附有細胞片之培養載體基材。
5. 如4.所記載之移植方法，其在前述培養工序中，於前述培養載體基材之前述培養面及側面之分別至少一部分接觸培養液的狀態下培養前述細胞片。
6. 如4.或5.所記載之移植方法，其在前述培養工序中，於將前述培養載體基材透過重物來荷重固定的狀態及／或將前述培養載體基材透過器具來位置固定的狀態下培養前述細胞片。
7. 如4.～6.之任一者所記載之移植方法，其在前述培養工序中，培養之細胞的密度為5×10 2細胞／cm 2以上且1×10 9細胞／cm 2以下。
8. 如4.～7.之任一者所記載之移植方法，其中前述培養載體基材的基材厚度超過10 μm，在前述培養工序中，前述培養載體基材不固著於培養容器之內部即發揮作為自立膜之功能。
9. 如1.～8.之任一者所記載之移植方法，其包含：冷卻保存工序，將前述附有細胞片之培養載體基材在冷凍保存液中予以冷卻，獲得前述附有細胞片之培養載體基材的冷凍物。
10. 如1.～9.之任一者所記載之移植方法，其包含：解凍工序，將前述附有細胞片之培養載體基材的冷凍物解凍。
11. 如1.～10.之任一者所記載之移植方法，其中前述培養載體基材的基材厚度為5 μm以上且250 μm以下， 前述培養載體基材係聚醚醚酮薄膜或聚對酞酸乙二酯薄膜， 前述培養載體基材之前述培養面經親水化處理。
12. 如1.～11.之任一者所記載之移植方法，其在前述移植工序中，自貼附之後至剝離的時間為10分鐘以下。
13. 如1.～12.之任一者所記載之移植方法，其中前述細胞片的面積為0.3 cm 2以上。
14. 如1.～13.之任一者所記載之移植方法，其中在前述移植工序之後，在前述剝離後之前述培養載體基材上的前述細胞片之殘存率以面積比換算計為50%以下。
15. 如1.～14.之任一者所記載之移植方法，其中前述細胞片的厚度為0.001 mm以上且2.0 mm以下。
16. 如1.～15.之任一者所記載之移植方法，其中前述培養載體基材的面積為0.3 cm 2以上且1000 cm 2以下。
17. 如1.～16.之任一者所記載之移植方法，其中前述培養載體基材包含1層或2層以上之由樹脂材料而成之樹脂層。
18. 如1.～17.之任一者所記載之移植方法，其使用前述培養載體基材，所述培養載體基材在以雷射顯微鏡量測前述培養面時，於100 μm見方的觀測範圍之至少一者中，直徑1 μm以上且100 μm以下並且深度0.5 μm以上且100 μm之孔洞為3個以下。
19. 如1.～18.之任一者所記載之移植方法，其中前述培養載體基材的空隙率為15%以下。
20. 如1.～19.之任一者所記載之移植方法，其中前述培養載體基材之在前述培養面上的水接觸角為70°以下。
21. 如1.～20.之任一者所記載之移植方法，其係獲得附有細胞片之培養載體基材者，所述附有細胞片之培養載體基材成為在前述培養載體基材之前述培養面上之能夠堆積細胞的區域之中前述細胞片被覆50%以上且100%以下的狀態。
22. 如1.～21.之任一者所記載之移植方法，其係使用於細胞移植療法者。
23. 如22.所記載之移植方法，其中細胞移植療法係包含對細胞、組織、臟器之缺損及功能障礙、功能不全相關聯的症狀之發病及復發予以抑制、防止之至少一種者。
24. 如1.～23.之任一者所記載之移植方法，其在前述移植工序中，將前述細胞片貼附於疾病部位。
25. 如1.～24.之任一者所記載之移植方法，其中前述疾病包含脊髓損傷、膝關節軟骨損傷、缺血性心臟病、老年黃斑部病變、角膜上皮幹細胞缺乏症、再生不良性貧血、急性下肢缺血、難治性皮膚潰瘍、術後併發症預防、熱傷之至少一者。
在上述移植方法，亦可包含參考型態A之1.～13.之任一培養載體基材，亦可包含參考型態B之1.～21.之任一附有細胞片之培養載體基材，亦可包含參考型態C之1.～8.之任一附有細胞片之培養載體基材的冷凍物。
並且，在上述移植方法中，亦可包含參考型態F之1.～3.之任一附有細胞片之培養載體基材的製造方法或其培養工序，亦可包含參考型態E之1.～10.之任一冷凍保存方法或解凍方法。
並且，可舉出包含對細胞、組織、臟器之缺損及功能障礙、功能不全相關聯的症狀之發病及復發予以抑制、防止之至少一者的治療方法作為參考型態H，所述治療方法使用參考型態A之1.～13.之任一培養載體基材、參考型態B之1.～21.之任一附有細胞片之培養載體基材及參考型態C之1.～8.之任一附有細胞片之培養載體基材的冷凍物之至少一者。此治療方法亦可包含於上已述之疾病之至少一者作為此種相關聯的症狀。
並且，可舉出用於治療的參考型態A之1.～13.之任一培養載體基材、參考型態B之1.～21.之任一附有細胞片之培養載體基材及參考型態C之1.～8.之任一附有細胞片之培養載體基材的冷凍物之至少一者的使用作為參考型態I，所述治療係包含對細胞、組織、臟器之缺損及功能障礙、功能不全相關聯的症狀之發病及復發予以抑制、防止之至少一種者。此使用亦可包含於上已述之疾病之至少一者作為此種相關聯的症狀。
並且，可舉出在製造用於治療的治療藥中之參考型態A之1.～13.之任一培養載體基材、參考型態B之1.～21.之任一附有細胞片之培養載體基材及參考型態C之1.～8.之任一附有細胞片之培養載體基材的冷凍物之至少一者的使用作為參考型態J，所述治療係包含對細胞、組織、臟器之缺損及功能障礙、功能不全相關聯的症狀之發病及復發予以抑制、防止之至少一種者。此使用亦可包含於上已述之疾病之至少一者作為此種相關聯的症狀。
『實施例』
以下參照實施例以詳細說明本發明，但本發明並非受此等實施例之記載任何限定者。
［實施例1］
〈培養載體基材的製造〉
對於PEEK薄膜（Shin-Etsu Polymer Co., Ltd.製，聚醚醚酮薄膜，Shin-Etsu Sepla Film（註冊商標）低結晶型12 μm厚）之培養面（表面）實施電漿處理。在電漿處理後的表面粗糙度較電漿處理前還粗面化，其Ra為0.6 nm。此外，如下進行Ra的量測。使用AFM（島津製作所製SPM-9700），探針使用尖端徑小的矽單晶探針（曲率半徑約10 nm）。在範圍1 μm×1 μm中觀察表面。Ra的計算使用附屬於裝置的分析軟體，進行X及Y方向之平滑化處理之後，在避開異物或表面之損傷的範圍100 nm×100 nm中實行表面粗糙度分析。算術平均粗糙度Ra係在基準長度內之自基準線起的距離之平均值。
並且，PEEK薄膜的空隙率為5%以下，在以雷射顯微鏡量測培養面時，於100 μm見方之範圍無任何直徑1 μm以上且100 μm以下並且深度0.5 μm以上且100 μm之孔洞，係實心的薄膜。空隙率由「［1－（實測密度／理論密度）］×100」算出。
之後，將所獲得之表面處理過的薄膜裁切成Ø33.5 mm尺寸，獲得圓盤狀之培養載體基材。
〈細胞片的製造〉
將在上述〈培養載體基材的製造〉中製造的培養載體基材依70%乙醇、磷酸緩衝液、培養基之順序清洗之後，分別設置於在細胞培養多孔盤（6孔洞）中的各孔洞之平底。此時，以培養載體基材之培養面面向孔盤之開口之方式──亦即以培養載體基材之背面與孔盤的孔洞部之平底接觸之方式──配置。惟未使培養載體基材與孔盤（培養容器）之內部固著。
將冷凍保存的人類纖維母細胞（源自人類口腔內組織）在37℃下解凍，使用培養基來清洗。將5×10 5個細胞懸浮於含5%血清培養基，於2片碟（60.1 cm 2）各接種2.5×10 5個之後培養3天。回收培養的細胞，懸浮於含5%血清培養基，於4個燒瓶（225 cm 2）各接種2.5×10 5個並繼代之後培養4天。
回收培養的細胞，懸浮於含2%血清培養基，於設置好培養載體基材的細胞培養多孔盤中之各孔洞以55.8×10 4個／cm 2之接種密度接種，在37℃、5%CO 2之環境下培育1天，於培養載體基材之培養面上製作細胞片。
〈移植〉
上述〈細胞片的製造〉之後，自多盤取出附有細胞片之培養載體基材。將取出的附有細胞片之培養載體基材運送至在另一處準備之模擬細胞組織的豬肉片（被移植部位）之上。將細胞片之表面貼附於豬肉片之表面之後，自細胞片剝離培養載體基材。
此外，由於貼附後至剝離之期間未特別進行將基材冷卻一事，故基材的溫度保持在30℃以上。
［實施例2］
除了在上述〈培養載體基材的製造〉中，使用厚度25 μm之PET薄膜（東麗公司製，聚對酞酸乙二酯薄膜，Lumirror（註冊商標））代替聚醚醚酮薄膜以外，比照實施例1實施〈培養載體基材的製造〉、〈細胞片的製造〉及〈移植〉。
［實施例3］
除了在上述〈培養載體基材的製造〉中，將表面處理過的薄膜之裁切尺寸做成Ø14.0 mm代替Ø33.5 mm，在上述〈細胞片的製造〉中，於接種時變更為使用24孔洞／平底之細胞培養多孔盤，並將接種密度變更為27.9×10 4個／cm 2以外，比照實施例1實施〈細胞片的製造〉及〈移植〉。
［比較例1］
除了未使用在上述〈培養載體基材的製造〉中製造的培養載體基材，在〈細胞片的製造〉中於附著細胞用多孔盤的孔洞內之平底上製造細胞片，在〈移植〉中將自此平底剝離細胞片者貼附於豬肉片之表面以外，比照實施例1實施〈細胞片的製造〉及〈移植〉。
［比較例2］
除了在上述〈培養載體基材的製造〉中，未對基材之培養面實施電漿處理以外，比照實施例1實施〈培養載體基材的製造〉、〈細胞片的製造〉及〈移植〉。
［比較例3］
除了在上述〈培養載體基材的製造〉中，未對基材之培養面實施電漿處理以外，比照實施例2實施〈培養載體基材的製造〉、〈細胞片的製造〉及〈移植〉。
對於各實施例、各比較例，針對細胞片的培養及移植進行評價。結果揭示於表1。
『表1』
表1
培養載體基材 評價
基材的材料 表面處理 細胞片培養 移植
實施例1 PEEK 有電漿處理 良好 良好
實施例2 PET 有電漿處理 良好 良好
實施例3 PEEK 有電漿處理 良好 良好
比較例1 ※未使用 良好 不良
比較例2 PEEK 無電漿處理 不良 －
比較例3 PET 無電漿處理 不良 －
實施例1～3在〈細胞片的製造〉中可獲得細胞片被覆基材培養面之100%以上的附有細胞片之培養載體基材。
在〈移植〉中，附有細胞片之培養載體基材由於未固著於多盤，故可輕易取出。此外，在實施例2之PET薄膜中，稍微以鑷子壓著細胞片來剝離基材，但在實施例1及3之PEEK薄膜中，可不壓著細胞片而藉由滑動來更加輕易剝離基材，可知操作容易性優異。
並且，在〈移植〉中，輕易自細胞片取下培養載體基材。具體而言，由於細胞片與豬肉會立刻密合，故自貼附至剝離在1分鐘以內進行。簡言之，由於移植時之操作變得簡便，故變得能夠將操作時間短時間化。此外，〈移植〉之後，無須在豬肉上培養細胞片。
由實施例1～3結果可確認藉由將經電漿處理的PEEK薄膜或經電漿處理的PET薄膜作為培養載體基材使用，可實施細胞片的培養與移植之兩者。
並且，在實施例1～3之〈移植〉的剝離後，殘存於培養載體基材之培養面的細胞片以面積比換算計為1%以下。是故，變得能夠減低移植工序時之細胞片殘留。此外，自細胞片剝離培養載體基材時，不需要對培養前之培養面施加分散酶處理。
在比較例1中，在〈細胞片的製造〉中，可在附著細胞用多孔盤內製造細胞片。然而，在〈移植〉中，以在自附著細胞用多孔盤取出細胞片時細胞片不會因鑷子等而破損之方式自附著細胞用多孔盤之平底剝下細胞片的操作實屬困難。並且，即使可剝下細胞片，亦無法抓持細胞片，細胞片的貼附作業實屬困難。
在比較例2、3中，由於無法製作細胞片，故未實施移植操作。
［實施例4］
〈細胞片的製造〉
除了使用將在實施例1之〈培養載體基材的製造〉中表面處理過的薄膜之裁切尺寸做成Ø14.0 mm代替Ø33.5 mm而獲得之培養載體基材，於接種時變更為使用24孔洞／平底之細胞培養多孔盤，並將接種密度變更為27.9×10 4個／cm 2以外，比照實施例1之〈細胞片的製造〉操作，於培養載體基材之培養面上製造細胞片（附有培養載體基材之細胞片）。
此外，依循下述程序量測冷凍前之細胞活性率。
〈細胞片的冷凍保存〉
上述〈細胞片的製造〉之後，將細胞培養多孔盤設置於冰上，將附有培養載體基材之細胞片以磷酸緩衝液清洗之後，以成為0.3 mL／孔之方式添加冷凍保護劑（STEMCELL-BANKER GMP grade，日本全藥工業公司製）。
之後，將以附有拉鍊之塑膠袋包裝細胞培養多孔盤的包裝體置入降溫至－35℃的非貫流方式之冷卻裝置（3D冷凍器（註冊商標），KSS-40BLW-2400V，KOGASUN Co., Ltd.製）維持30分鐘。此外，在0～－5℃的冷卻速度為3.4℃／分鐘。
之後，將經冷卻處理的包裝體快速置入－80℃之冷凍庫（RDE50086FD型，超低溫冷凍器，thermo scientific公司製）維持1小時。
使用K熱電偶，量測以－80℃之冷凍庫保存的細胞片（附有培養載體基材之細胞片）的溫度，結果為－70℃。
〈細胞片的解凍〉
上述冷凍期間之後，自－80℃之冷凍庫取出包裝體，將位於其中的細胞培養多孔盤於安全櫃內之室溫下解凍。此時的解凍時間為16分鐘。解凍後，細胞片的外觀良好。
解凍後，吸引冷凍保護劑並加入2 mL之含2%血清培養基。之後，在37℃、5%CO 2之環境下培育24小時。培育後，量測細胞活性。其結果，可知將冷凍前之細胞活性定為C0，將冷凍後之細胞活性定為C1時，透過（C1／C0）×100算出之「冷凍前後之細胞活性的變動比例」為89%。並且，回收培養上清液，在－80℃下將上清液冷凍的隔天之後，實施血管內皮細胞生長因子（VEGF）及肝細胞生長因子（HGF）的量測，結果可知上清液中的VEGF為1451 pg，HGF為4608 pg。
（解凍時間的量測方法）
解凍時間係加入冷凍保護劑將冷凍保存的冷凍物解凍所需的時間，自暴露於解凍之環境的時點起，以冷凍物完全成為液態的時點為終點，量測解凍時間。
（細胞活性率的量測）
細胞活性使用活細胞數量測試藥（Cell Count Reagent SF，NACALAI TESQUE, Inc.製）與讀盤儀（iMark，BIO-RAD公司製）來量測。將活細胞量測試藥以培養基稀釋20倍（試藥／培養基＝1／19體積比）製作試驗溶液。吸引包含培養後之細胞片的細胞培養多孔盤之各孔的上清液，以0.5 mL／孔為單位添加試驗溶液，在37℃、5%CO 2之環境下培育1小時。於培育後，於細胞培養多孔盤（96孔洞，CORNING公司製）加入0.1 mL／孔之上清液，以讀盤儀量測此上清液。細胞活性的計算如下。
．細胞活性［Abs.］＝｛量測試樣的吸光度［吸光度（450 nm）－量測試樣的吸光度（630 nm）］｝－｛空白試樣的吸光度［吸光度（450 nm）－空白試樣的吸光度（630 nm）］｝
空白試樣使用試驗溶液。
（血管內皮細胞生長因子（VEGF）及肝細胞生長因子（HGF）的量測）
量測VEGF及HGF作為關於血管新生的細胞介素。此等細胞介素分別使用VEGF, Human, ELISA Kit, Quantikine（96well）（R＆D Systems, Inc.，DVE00）、HGF, Human, ELISA Kit, Quantikine（96well）（R＆D Systems, Inc.，DHG00B）與讀盤儀（iMark，BIO-RAD公司製）來量測。使用方法依循各套件的使用說明書來使用。試驗樣品回收解凍後培養24小時的上清液並冷凍保存。在冷凍隔天以後的量測時將試驗樣品解凍。並且，以附屬於套件的稀釋液將試驗樣品稀釋成2～4倍來進行量測。標準曲線使用附屬於各套件的標準品。各樣品及標準曲線用標準品的吸光度由以下計算式算出，將所獲得之吸光度代入標準曲線算出VEGF及HGF的濃度。
．樣品及標準曲線用標準品的吸光度［Abs.］＝吸光度（450 nm）－吸光度（570 nm）
〈解凍後的移植〉
將解凍後的附有培養載體基材之細胞片自細胞培養多盤取出，將細胞片面往豬肉貼附並剝離基材。此外，由於貼附後至剝離之期間未特別進行將基材加熱或冷卻一事，故基材的溫度保持室溫（23℃）。
［實施例5～11］
除了將上述〈細胞片的冷凍保存〉的冷凍期間變更為表2所示之值以外，比照實施例4操作，實施〈細胞片的製造〉、〈細胞片的冷凍保存〉、〈細胞片的解凍〉及〈解凍後的移植〉。
［比較例4］
在比較例4中，除了未使用培養載體基材且將細胞培養多孔盤變更為培養皿（UpCell（註冊商標），CellSeed Inc.製）以外，比照實施例4操作，實施〈細胞片的製造〉。
［比較例5］
在比較例5中，除了未使用培養載體基材且將細胞培養多孔盤變更為附著細胞用多孔盤（24孔洞）以外，比照實施例4操作，實施〈細胞片的製造〉、〈細胞片的冷凍保存〉及〈細胞片的解凍〉。
對於各實施例、各比較例，針對冷凍保存及解凍後的移植進行評價。結果揭示於表2。
『表2』
表2
  培養載 體基材 冷凍 期間 評價
冷凍 保存 冷凍前後之細胞活性的變動比例(%) 解凍後 的移植 VEGF (pg) HGF (pg)
實施例4 實施例1 1小時 良好 89 良好 1451 4608
實施例5 1天 良好 116 良好 1392 4611
實施例6 7天 良好 97 良好 1293 3478
實施例7 14天 良好 90 良好 1344 4088
實施例8 28天 良好 94 良好 914 5292
實施例9 56天 良好 81 良好 1952 5662
實施例10 70天 良好 71 良好 777 4939
實施例11 86天 良好 66 良好 869 4108
比較例4 ※未使用 － 不良 － － － －
比較例5 ※未使用 86天 良好 36 － 869 3755
在比較例4中，由於在將培養皿冷卻時細胞片自培養皿剝離，故無法將細胞片冷凍保存。是故，未實施冷凍後之細胞活性率的量測及解凍後的移植操作。
在比較例5中，揭示了細胞片可在密合於多孔盤的狀態下冷凍保存，但冷凍前後之細胞活性率的變動比例降低的結果。
相對於此，在實施例4～11中，揭示了細胞片可密合於培養載體基材而就此冷凍保存，冷凍前後之細胞活性率的變動比例或者VEGF及HGF之至少一者變得較比較例5還高的結果。並且，在解凍後的移植中，亦可自細胞片輕易剝離培養載體基材。此外，由於細胞片與豬肉立刻密合，故自貼附至剝離在1分鐘以內進行，無須在豬肉上培養細胞片。
由實施例4～11之結果確認到，藉由將經電漿處理的PEEK薄膜作為培養載體基材使用，能夠將細胞片冷凍、在解凍後移植，並且，解凍後的細胞片即使長期冷凍，亦可維持高的細胞活性率。
［實施例12～23］
除了將上述〈細胞片的冷凍保存〉的冷凍期間變更為表3所示之值，使用作為冷凍保護劑的BAMBANKER（註冊商標）hRM（GC Lymphotec, Inc.），使用－150℃之冷凍庫以外，比照實施例4操作，實施〈細胞片的製造〉、〈細胞片的冷凍保存〉、〈細胞片的解凍〉及〈解凍後的移植〉。此時的解凍時間為18分鐘。解凍後，細胞片的外觀良好。
此外，使用K熱電偶，量測由－150℃之冷凍庫所保存之細胞片（附有培養載體基材之細胞片）的溫度，結果為－140℃。
對於各實施例，針對冷凍保存及解凍後的移植進行評價。結果揭示於表3。
『表3』
表3
培養載 體基材 冷凍 期間 評價
冷凍 保存 冷凍前後之細胞活性的變動比例(%) 解凍後 的移植 VEGF (pg) HGF (pg)
實施例12 實施例1 1天 良好 117 良好 1806 3945
實施例13 7天 良好 108 良好 1794 3250
實施例14 14天 良好 104 良好 1750 3600
實施例15 21天 良好 129 良好 1461 3480
實施例16 28天 良好 119 良好 1416 3644
實施例17 56天 良好 120 良好 1754 4492
實施例18 70天 良好 118 良好 1730 4250
實施例19 84天 良好 114 良好 1368 5397
實施例20 112天 良好 112 良好 1748 4113
實施例21 168天 良好 114 良好 2168 4573
實施例22 252天 良好 113 良好 2679 3989
實施例23 364天 良好 121 良好 3019 5007
在實施例12～23中，揭示了細胞片可密合於培養載體基材就此冷凍保存，冷凍前後之細胞活性率的變動比例或者VEGF及HGF之任一者皆變得較比較例5還高的結果。並且，在解凍後的移植中，亦可自細胞片輕易剝離培養載體基材。此外，由於細胞片與豬肉立刻密合，故自貼附至剝離在1分鐘以內進行，無須在豬肉上培養細胞片。
［實施例24～26］
除了將上述〈細胞片的冷凍保存〉的冷凍期間變更為表4所示之值以外，比照實施例12操作，實施〈細胞片的製造〉、〈細胞片的冷凍保存〉、〈細胞片的解凍〉及〈解凍後的移植〉。
惟如圖3之（a）～圖3之（c）所示構成各實施例之冷凍時的狀態。
在圖3之（a）中，係在以培養載體基材10側朝向培養容器20之底面之方式配置的狀態下，在圖3之（b）中，係在以細胞片40側朝向培養容器20之底面之方式配置的狀態下，在圖3之（c）中，係在以2片培養載體基材10包夾細胞片40的狀態下，實施〈細胞片的冷凍保存〉、〈細胞片的解凍〉。
對於各實施例，針對冷凍保存及解凍後的移植進行評價。結果揭示於表4。
『表4』
表4
冷凍時 的狀態 冷凍 期間 評價
冷凍 保存 冷凍前後之細胞活 性的變動比例(%) 解凍後的移植
實施例24 圖3之(a) 6天 良好 103 良好
實施例25 圖3之(b) 6天 良好 96 良好
實施例26 圖3之(c) 6天 良好 100 良好
在實施例24～26中，揭示了細胞片可密合於培養載體基材就此冷凍保存，冷凍前後之細胞活性率的變動比例變得較比較例5還高的結果。並且，在解凍後的移植中，亦可自細胞片輕易剝離培養載體基材。此外，由於細胞片與豬肉立刻密合，故自貼附至剝離在1分鐘以內進行，無須在豬肉上培養細胞片。
此外，可知PEEK薄膜由於具有低線膨脹特性，故可作為亦有益於冷凍處理的培養載體基材使用。
［實施例27］
除了在實施例12之〈細胞片的解凍〉所示之方法中，將在安全櫃內之室溫下的解凍變更為於除霜器（DEC公司製）之散熱裝置上設置細胞培養多孔盤的解凍以外，比照實施例12操作，實施〈細胞片的製造〉、〈細胞片的冷凍保存〉、〈細胞片的解凍〉及〈解凍後的移植〉。除霜器的設定溫度表示散熱裝置的溫度，設定成37℃來解凍。此時的解凍時間為3分鐘。
此外，使用K熱電偶，量測由－150℃之冷凍庫所保存之細胞片（附有培養載體基材之細胞片）的溫度，結果為－140℃。解凍後，細胞片的外觀良好。
［實施例28］
除了將實施例27之除霜器的設定溫度定為20℃以外，比照實施例26操作，實施〈細胞片的製造〉、〈細胞片的冷凍保存〉、〈細胞片的解凍〉及〈解凍後的移植〉。此時的解凍時間為5分鐘。解凍後，細胞片的外觀良好。
［實施例29］
除了將實施例27之除霜器的設定溫度定為4℃以外，比照實施例26操作，實施〈細胞片的製造〉、〈細胞片的冷凍保存〉、〈細胞片的解凍〉及〈解凍後的移植〉。此時的解凍時間為8分鐘。解凍後，細胞片的外觀良好。
［實施例30］
除了在實施例12之〈細胞片的解凍〉所示之方法中，將在安全櫃內之室溫下的解凍變更為在設定成4℃之冷藏庫內的解凍以外，比照實施例26操作，實施〈細胞片的製造〉、〈細胞片的冷凍保存〉、〈細胞片的解凍〉及〈解凍後的移植〉。此時的解凍時間為37分鐘。解凍後，細胞片的外觀良好。
對於實施例27～30，針對細胞片的外觀、細胞活性率的量測及解凍後的移植進行評價。結果揭示於表5。此外，為了參考，表5再次揭示實施例4及實施例12之結果。
『表5』
表5
實施例 解凍 時間 (分鐘) 評價
解凍後之細胞片的外觀 冷凍前後之細胞活性的變動比例(%) 解凍後的移植
實施例4 16 良好 89 良好
實施例12 18 良好 117 良好
實施例27 3 良好 102 良好
實施例28 5 良好 89 良好
實施例29 8 良好 99 良好
實施例30 37 良好 63 良好
在實施例4、12及27～30中，皆在細胞片的外觀上無問題。並且，實施例4、12及27～30相比於比較例5，揭示了「冷凍前後之細胞活性的變動比例」高的結果。換句話說，可謂可維持高的冷凍後之細胞生存率。其中，實施例4、12及27～29相比於冷凍時間相對長的實施例30，可知其「冷凍前後之細胞活性的變動比例」高。並且，任一實施例的解凍物皆可良好進行解凍後的移植。
在於上已述之實施例1～30中可確認到，即使使用小鼠纖維母細胞代替人類纖維母細胞，亦揭示同樣的結果。
此申請案主張以於2023年7月14日申請之日本專利申請第2023-115623號及2023年12月27日申請之日本專利申請第2023-220506號為基礎案的優先權，將其所揭露之所有內容援引於此。
10,10a,10b:培養載體基材 12:培養面（表面） 14:非培養面（背面） 20:培養容器 30:培養液 40:細胞片 50:附有細胞片之培養載體基材 60:冷凍保存液 70:被移植部位
〈圖1〉係示意繪示本實施型態之移植方法之工序之一例的工序剖面圖。
〈圖2〉係示意繪示本實施型態之附有細胞片之培養載體基材之構造之一例的剖面圖。
〈圖3〉係示意繪示本實施型態之冷凍方法之變形例的工序剖面圖。
10:培養載體基材
20:培養容器
30:培養液
40:細胞片
50:附有細胞片之培養載體基材
60:冷凍保存液
70:被移植部位

Claims (26)

  1. 一種移植方法，其包含：培養工序，於培養載體基材之培養面培養細胞片；以及移植工序，將形成於前述培養載體基材之前述培養面的前述細胞片貼附於被移植部位之後，自前述細胞片剝離前述培養載體基材。
  2. 如請求項1所述之移植方法，其中前述培養載體基材的基材厚度為5 μm以上且250 μm以下，前述培養載體基材係聚醚醚酮薄膜或聚對酞酸乙二酯薄膜，前述培養載體基材之前述培養面經親水化處理。
  3. 如請求項1或2所述之移植方法，其中前述培養載體基材的基材厚度超過10 μm，在前述培養工序中，前述培養載體基材不固著於培養容器之內部即發揮作為自立膜之功能。
  4. 如請求項1或2所述之移植方法，其在前述移植工序中，自貼附之後至剝離的時間為10分鐘以下。
  5. 如請求項1或2所述之移植方法，其中透過前述培養工序獲得之前述細胞片的面積為0.3 cm 2以上。
  6. 一種培養載體基材，其係使用於運送在培養面培養之細胞片的培養載體基材，其中該培養載體基材的基材厚度為5 μm以上且250 μm以下。
  7. 如請求項6所述之培養載體基材，其中前述培養載體基材的基材厚度超過10 μm，在前述細胞片之培養中不固著於培養容器之內部即發揮作為自立膜的功能。
  8. 如請求項6或7所述之培養載體基材，其中前述培養面經親水化處理。
  9. 如請求項8所述之培養載體基材，其中前述親水化處理經電漿處理。
  10. 如請求項6或7所述之培養載體基材，其中該培養載體基材係聚醚醚酮薄膜或聚對酞酸乙二酯薄膜。
  11. 如請求項6或7所述之培養載體基材，其中前述培養面不含溫度響應性聚合物。
  12. 一種包裝體，其係將如請求項6至11之任一項所述之培養載體基材以包裝材料包裝者。
  13. 一種附有細胞片之培養載體基材，其具有如請求項6至11之任一項所述之培養載體基材與細胞片的堆疊體，其中前述細胞片係被覆前述培養載體基材之在前述培養面側上的表面之至少50%的狀態。
  14. 如請求項13所述之附有細胞片之培養載體基材，其中前述細胞片的面積為0.3 cm 2以上。
  15. 一種附有細胞片之培養載體基材的製造方法，其包含：培養工序，於培養容器之內部導入多個細胞、培養基及如請求項6或7所述之培養載體基材，於前述培養載體基材之培養面培養細胞片；以及取出工序，自前述培養容器取出附有前述細胞片之前述培養載體基材。
  16. 如請求項15所述之附有細胞片之培養載體基材的製造方法，其在前述培養工序中，不將前述培養載體基材固著於培養容器之內部來培養前述細胞片。
  17. 如請求項15所述之附有細胞片之培養載體基材的製造方法，其在前述取出工序中，不需要自前述培養容器將前述培養載體基材透過物理上的手段分離的操作。
  18. 一種冷凍保存方法，其包含：冷卻工序，將包含培養載體基材與形成於前述培養載體基材之表面之細胞片的附有細胞片之培養載體基材在冷凍保存液中予以冷卻。
  19. 如請求項18所述之冷凍保存方法，其在前述冷卻工序中，將前述附有細胞片之培養載體基材在冷凍保存液中使用非貫流式之冷卻裝置予以冷卻。
  20. 如請求項18或19所述之冷凍保存方法，其在前述冷卻工序中，在0～－5℃的冷卻速度為0.1℃／分鐘以上且15℃／分鐘以下。
  21. 如請求項18或19所述之冷凍保存方法，其在前述冷卻工序之後包含：冷凍保存工序，於－196～－60℃保存前述附有細胞片之培養載體基材。
  22. 一種附有細胞片之培養載體基材的冷凍物，其包含：培養載體基材與形成於前述培養載體基材之表面的細胞片，其中前述培養載體基材及前述細胞片係冷凍保存狀態。
  23. 如請求項22所述之附有細胞片之培養載體基材的冷凍物，其係－196℃～－60℃之冷凍保存狀態。
  24. 如請求項22所述之附有細胞片之培養載體基材的冷凍物，其係－196℃～－135℃之冷凍保存狀態。
  25. 如請求項22所述之附有細胞片之培養載體基材的冷凍物，其係－134℃～－60℃之冷凍保存狀態。
  26. 一種包裝體，其係將如請求項22至25之任一項所述之冷凍物以包裝材料包裝者。
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