TW202317608A - 雙特異性融合蛋白 - Google Patents

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丁曉然
繆仕偉
談彬
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Abstract

本申請關於一種雙特異性融合蛋白，其包含第一結合域和第二結合域，其中該第一結合域包含特異性結合PD-L1的抗體，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈和兩條抗體重鏈，該抗體輕鏈和該抗體重鏈藉由二硫鍵連接；該第二結合域包含一個VEGFR1的Ig樣結構域和一個VEGFR2的Ig樣結構域；該VEGFR1的Ig樣結構域的N端或該VEGFR2的Ig樣結構域的N端分別與該抗體重鏈的C端直接或間接連接。本申請還關於包含該雙特異性融合蛋白的醫藥組成物及其製藥用途。本申請所述的雙特異性融合蛋白可以有效安全地殺傷腫瘤細胞。

Description

雙特異性融合蛋白
本申請關於生物醫藥領域，具體的關於一種雙特異性融合蛋白。
目前，腫瘤疾病日益嚴重，免疫檢查點PD-1/PD-L1和VEGF都已成為治療腫瘤的重要靶點。
PD-L1在多種惡性腫瘤中過表達，並且經常與預後不良相關。PD-1以及藉由與PD-1相互作用傳遞信號的其它分子(例如PD-L1和PD-L2)的治療性靶向是腫瘤治療的熱門領域。
VEGF是血管內皮細胞強有力和特有的促有絲分裂原，可促進血管生成過程的所有環節。各VEGF受體(VEGFR)的作用有所不同。VEGFR-2起著調節內皮生長、分化、滲透性的作用；而VEGFR-1則與調節內皮細胞移動、聚集有關，並且藉由VEGFR-2抑制信號的傳導。VEGF與VEGFR結合，使VEGFR二聚體化、自我磷酸化，藉由多個細胞內途徑傳遞信號，最終發揮作用。
目前亟需可以有效抑制腫瘤生長的新型融合蛋白。
本申請提供了一種雙特異性融合蛋白及其相應的多核苷酸、載體、細胞、製備方法、醫藥組成物和用途。本申請所述的雙特異性融合蛋白具有以下至少一種性質：1)特異性結合PD-L1；2)阻斷PD-1與PD-L1結合；3)特異性結合VEGF；4)阻斷VEGF與VEGFR結合；5)抑制(體內)腫瘤生長；6)激活免疫細胞(例如T細胞)；7)促進免疫細胞(例如T細胞)分泌細胞因子(例如干擾素和/或細胞因子)；和/或，8)抑制腫瘤新生血管發生、促進血管正常化。
一方面，本申請提供了一種雙特異性融合蛋白，其包含第一結合域和第二結合域，其中，該第一結合域包含特異性結合PD-L1的抗體，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈和兩條抗體重鏈，該抗體輕鏈和該抗體重鏈藉由二硫鍵連接；該第二結合域包含一個VEGFR1的Ig樣結構域和一個VEGFR2的Ig樣結構域；其中該VEGFR1的Ig樣結構域的N端或該VEGFR2的Ig樣結構域的N端分別與該抗體重鏈的C端直接或間接連接。
在某些實施方式中，該第一結合域特異性結合人PD-L1。
在某些實施方式中，該第二結合域特異性結合人VEGF家族。
在某些實施方式中，該第二結合域特異性結合選自下組的蛋白質：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PLGF。
在某些實施方式中，該VEGFR1的Ig樣結構域包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VEGFR2的Ig樣結構域包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該VEGFR1的Ig樣結構域和VEGFR2的Ig樣結構域直接連接。
在某些實施方式中，該第二結合域包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該間接連接為藉由連接子連接。
在某些實施方式中，該連接子包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該抗體輕鏈包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含LCDR1-3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：4、10中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR2包含SEQ ID NO：5、11中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR3包含SEQ ID NO：6、12中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該LCDR1-3包含選自下組的胺基酸序列：
(1)該LCDR1包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列；
(2)該LCDR1包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該抗體輕鏈包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：16-17中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該抗體輕鏈包含輕鏈恆定區，其中輕鏈恆定區源自選自下組蛋白的輕鏈恆定區：Igκ和Igλ。
在某些實施方式中，該抗體重鏈包含重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含HCDR1-3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：7、13中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該HCDR2包含SEQ ID NO：8、14中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該HCDR3包含SEQ ID NO：9、15中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該HCDR1-3包含選自下組的胺基酸序列：
(1)該HCDR1包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列；
(2)該HCDR1包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該抗體重鏈包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：18-19中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該抗體重鏈包含Fc區域。
在某些實施方式中，該Fc區域源自選自下組蛋白的Fc：IgG1和IgG4。
在某些實施方式中，該Fc區域在選自下組的胺基酸位置處包含胺基酸突變：N298、D357和L359。
在某些實施方式中，該Fc區域包含選自下組的胺基酸突變：N298A、D357E和L359M。
在某些實施方式中，該Fc區域包含SEQ ID NO：20-22中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該雙特異性融合蛋白為由兩拷貝的第一多肽鏈和第二多肽鏈組成的多聚體，其中該第一多肽鏈包含該抗體輕鏈，其中該第二多肽鏈自N端依次包含該抗體重鏈、該連接子和該第二結合域。
在某些實施方式中，該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：23-24中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：25-27中任一項所示的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列；或者，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；或者，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
另一方面，本申請提供一種多核苷酸，其編碼本申請所述的雙特異性融合蛋白。
另一方面，本申請提供一種載體，其包含本申請所述的多核苷酸。
另一方面，本申請提供一種細胞，其包含本申請所述的載體。
另一方面，本申請提供本申請所述的雙特異性融合蛋白的製備方法，其包括在適於表達本申請所述的雙特異性融合蛋白的情況下，培養本申請所述的細胞。
另一方面，本申請提供一種醫藥組成物，其包含本申請所述的雙特異性融合蛋白，以及視需要地藥學上可接受的載體。
另一方面，本申請提供一種藥物分子，其包含本申請所述的雙特異性融合蛋白。
另一方面，本申請提供一種本申請所述的雙特異性融合蛋白、所述的多核苷酸、所述的載體、所述細胞、所述的醫藥組成物和/或所述的藥物分子在製備治療疾病的藥物中的應用，其中該疾病包括腫瘤。
在某些實施方式中，該疾病包括實體瘤和非實體瘤。
在某些實施方式中，該疾病包括PD-L1陽性腫瘤。
在某些實施方式中，該疾病包括肺癌、結直腸癌、宮頸癌、肝癌、胃癌和/或腎癌。
另一方面，本申請提供了一種抑制血管生長的方法，其包括施用有效量的本申請所述的雙特異性融合蛋白、所述的多核苷酸、所述的載體、所述的細胞、所述的醫藥組成物和/或所述的藥物分子。
另一方面，本申請提供了一種抑制VEGF受體配體活性的方法，其包括施用有效量的本申請所述的雙特異性融合蛋白、所述的多核苷酸、所述的載體、所述的細胞、所述的醫藥組成物和/或所述的藥物分子。
另一方面，本申請提供了一種抑制PD-L1活性的方法，其包括施用有效量的本申請所述的雙特異性融合蛋白、所述的多核苷酸、所述的載體、所述的細胞、所述的醫藥組成物和/或所述的藥物分子。
所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本申請的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的圖式和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。
本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。藉由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和圖式能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對圖式簡要說明如下：
圖1顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白的結構。
圖2顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白特異性結合人PD-L1。
圖3顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白特異性結合VEGF165。
圖4顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白同時特異性結合人PD-L1和VEGF165。
圖5顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白阻斷PD-1和PD-L1的相互作用。
圖6顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白阻斷VEGF和VEGFR的相互作用。
圖7顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白阻斷VEGF165和VEGFR2的相互作用。
圖8顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白阻斷VEGF121和VEGFR2的相互作用。
圖9顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白阻斷VEGF C和VEGFR2的相互作用。
圖10顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白抑制HUVEC細胞的增殖。
圖11顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白激活淋巴細胞分泌IFN-γ。
圖12顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白激活淋巴細胞分泌IL-2。
圖13顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白的ADCC活性檢測。
圖14顯示的是本申請所述的雙特異性融合蛋白抑制小鼠結腸癌生長。
以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，所屬技術領域具有通常知識者可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。
術語定義
在本申請中，術語“雙特異性”通常是指本申請所述的融合蛋白可以與兩個不同的配體相互作用的能力。在本申請中，該雙特異性融合蛋白既可以特異性結合PD-L1，又可以特異性結合VEGF。
在本申請中，術語“特異性結合”通常指可測量的和可再現的相互作用，比如靶標和抗體之間的結合，可在分子(包括生物分子)的異質群體存在的情況可決定靶標的存在。例如，特異性結合靶標(其可以為表位)的抗體是以比它結合其它靶標更大的親和性、親合力、更容易、和/或以更大的持續時間結合該靶標的抗體。在一個實施方案中，抗體結合無關靶標的程度小於抗體對靶標的結合的約10%，例如藉由放射免疫分析(RIA)測量的。例如，在本申請中，該雙特異性融合蛋白能夠以<1x10-7M或更低的解離常數(KD)與PD-L1和VEGF相結合。例如，在本申請中，該PD-L1抗體能夠以<1x10-7M或更低的解離常數(KD)與PD-L1相結合。在某些實施方案中，抗體特異性結合蛋白質上的表位，該表位在不同種屬的蛋白質中是保守的。在另一個實施方案中，特異性結合可以包括但不要求排他性地結合。
在本申請中，術語“第一結合域”通常是指可以特異性結合PD-L1的結合域。例如，該第一結合域可以包括特異性結合PD-L1的抗體。
在本申請中，術語“第二結合域”通常是指可以特異性結合VEGF的結合域。例如，該第二結合域可以包含一個VEGFR1的Ig樣結構域和一個VEGFR2的Ig樣結構域。
在本申請中，術語“PD-L1”通常是指程序性死亡配體1蛋白、其功能變體和/或其功能片段。PD-L1也稱為分化簇274(CD274))或B7同源物1(B7-H1)。該PD-L1可以為由CD274基因編碼的蛋白。PD-L1結合其受體，例如程序性死亡1(PD-1)，該PD-1可以在活化的T細胞、B細胞和巨噬細胞中表達(參見Ishida et al.,1992 EMBO J,11：3887-3395；Okazaki et al.,Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 receptor-deficient mice.Science,2001；291：319-22)。PD-L1和PD-1的絡合可以藉由抑制T細胞增殖和產生細胞因子IL-2和IFN-γ發揮免疫抑制作用(參見Freeman et al.,Engagement of PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation,J.Exp.Med.2000,192：1027-1034；Carter et al.,PD-1：PD-L inhibitory pathway affects both CD4(+)and CD8(+)T cells and is overcome by IL-2.Eur.J.Immunol.2002,32：634-643)。術語“PD-L1”可以涵蓋任何脊椎動物來源的任何天然PD-L1，該任何脊椎動物來源可以包括哺乳動物，諸如靈長類(例如，人)和齧齒類(例如，小鼠和大鼠)。該術語涵蓋“全長”、未加工的PD-L1以及由細胞中的加工所產生的任何形式的PD-L1。PD-L1可作為跨膜蛋白或作為可溶性蛋白存在。該術語還可以涵蓋天然存在的PD-L1的變體，例如剪接變體或等位基因變體。PD-L1的基 本結構可以包括4個結構域：胞外Ig樣V型結構域和Ig樣C2型結構域、跨膜結構域以及細胞質結構域。PD-L1序列是本領域已知的。例如可在NCBI Gene ID No.29126下找到關於人PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的信息。又例如可在NCBI Gene ID No.60533下找到關於小鼠PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的信息。又例如可在NCBI Gene ID No.102145573下找到關於食蟹猴PD-L1基因(包括基因組DNA序列)的信息。示例性的全長人PD-L1蛋白的胺基酸序列可在NCBI登錄號NP_054862或UniProt登錄號Q9NZQ7下找到。示例性的全長小鼠PD-L1蛋白序列可在NCBI登錄號NP_068693或Uniprot登錄號Q9EP73下找到。示例性的全長食蟹猴PD-L1蛋白序列可在NCBI登錄號XP_005581836或Uniprot登錄號G7PSE7下找到。
在本申請中，術語“抗體”通常是指免疫球蛋白或其片段或其衍生物，涵蓋包括抗原結合位點的任何多肽，無論其是在體外還是體內產生的。該術語包括但不限於多株的、單株的、單特異性的、多特異性的、非特異性的、人源化的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜化的、突變的和移植的抗體。基本的4鏈抗體單元是由兩個相同的輕(L)鏈和兩個相同的重(H)鏈組成的異四聚體糖蛋白。IgM抗體由5個基本的異四聚體單元與另外一個稱為J鏈的多肽組成，且含有10個抗原結合位點，而IgA抗體包括2-5個可以與J鏈相結合聚合形成多價組合的基本4鏈單元。就IgG而言，4鏈單元一般為約150,000道爾頓。每個L鏈藉由一個共價二硫鍵與H鏈連接，而兩個H鏈藉由一個或多個取決於H鏈同種型的二硫鍵相互連接。每個H和L鏈還具有規則間隔的鏈內二硫化橋鍵。每個H鏈在N末端具有可變結構域(VH)，對於α和γ鏈各自繼之以三個恆定結構域 (CH)、對於μ和ε同種型繼之以四個CH結構域。每個L鏈在N末端具有可變結構域(VL)，在其另一端具有恆定結構域。VL與VH對應，且CL與重鏈的第一恆定結構域(CH1)相對應。特定的胺基酸殘基被認為在輕鏈和重鏈可變結構域之間形成界面。VH和VL配對一起形成單個抗原結合位點。對於不同類別抗體的結構和性質，參見例如Basic and Clinical Immunology,8th Edition,Daniel P.Sties,Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(eds),Appleton & Lange,Norwalk,Conn.,1994，第71頁和第6章。來自任何脊椎動物物種的L鏈可以基於其恆定結構域的胺基酸序列被分為兩種明顯不同的類型中的一種，稱為κ和λ。取決於其重鏈(CH)恆定結構域的胺基酸序列，可以將免疫球蛋白分為不同的類別或同種型。存在五類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分別被命名為α、δ、ε、γ和μ的重鏈。基於CH序列和功能方面的相對小的差異，將γ和α類進一步分成亞類，例如，人表達下述亞類：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgK1。
在本申請中，術語“CDR”通常指抗體可變結構域的區域，其序列是高度可變的和/或形成結構定義環。通常，抗體包括六個CDR；在VH中三個(HCDR1、HCDR2、HCDR3)，和在VL中三個(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。在天然抗體中，HCDR3和LCDR3顯示該六個CDR的大多數多樣性，並且特別地HCDR3被認為在賦予抗體的精細特異性方面起獨特作用。參見，例如Xu et al,Immunity 13：37-45(2000)；Johnson and Wu,in Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,N.J.,2003)。
在本申請中，術語“VEGF”通常是指血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor)。VEGF可以關於調節正常的和異常的血管發生及與腫瘤和眼內病症有關的新血管化(參見Ferrara,N.和Davis-Smyth,T.,Endocr.Rev.18，1997，4-25等)。VEGF可以在胚胎血管生成期間在新血管形成中和在成年期間在血管發生中具有重要的調節功能。VEGF可以促進腫瘤的生長。VEGF是高度保守的同源二聚體糖蛋白。VEGF可以有六個等型(isoforms)：VEGF-A、VEGF-B(包括VEGF-B167以及VEGF-B186)、VEGF-C、VEGF-D以及VEGF-E。在本申請中，該VEGF可以為人VEGF。
在本申請中，術語“VEGFR1”通常是指血管內皮生長因子受體1。VEGFR1是VEGFR的一種。VEGFR屬於受體酪胺酸激酶超家族，是一種膜鑲嵌蛋白。VEGFR的膜外部分大約有750個胺基酸殘基，由7個與免疫球蛋白結構類似的Ig樣結構域組成。VEGFR1的膜外區中第二個Ig結構域是與配體結合的區域。VEGFR1的不同剪接體可以競爭性結合VEGF(例如，可以結合VEGF-A、VEGF-B)，從而阻止VEGF與VEGFR2結合。
在本申請中，術語“VEGFR2”通常是指血管內皮生長因子受體2。VEGFR2的第三個Ig結構域可以對與配體的結合的專一性起作用。VEGFR2可以與VEGF-A、VEGF-E結合。
在本申請中，術語“Ig樣結構域”通常是指VEGFR胞外區中的一個結構，其可以負責與VEGF結合。例如，VEGFR2胞外區中第1個Ig樣結構域是與VEGF結合的必要部位，第2-3個Ig樣結構域是與VEGF 緊密結合的主要部位，受體藉由第4個Ig樣結構域形成同源二聚體的活性形式，而第5-第7個Ig樣結構域與VEGF結合的關係不密切。例如，VEGFR1胞外區具有7個Ig樣結構域，其可以負責與VEGF結合，並促進血管形成。
在本申請中，術語“PLGF”通常是指胎盤生長因子(Placental growth factor)，其可以由PGF基因編碼。該PLGF可以為VEGF亞家族成員。該PLGF可以在人臍靜脈內皮細胞(HUVE)和胎盤中表達。該PLGF可以在滋養細胞的生長和分化中起作用。該PLGF可以與血管生成相關。
在本申請中，術語“直接相連”與術語“間接相連”相對，術語“直接相連”通常是指直接連接。例如，該直接相連可以為物質間沒有間隔子而直接相連的情況。該間隔子可以是連接子。例如，該連接子可以為肽連接子。術語“間接相連”通常是指物質間不直接相連的情況。例如，該間接相連可以為藉由間隔子而連接的情況。例如，在本申請所述的VEGFR1的Ig樣結構域的N端或所述的VEGFR2的Ig樣結構域的N端可以分別與該抗體重鏈的C端連接。例如，本申請所述的一個VEGFR1的Ig樣結構域可以和一個VEGFR2的Ig樣結構域直接連接。
在本申請中，術語“胺基酸突變”通常是指用另一種不同的胺基酸殘基替換至少一個現有的胺基酸殘基。該替換的胺基酸殘基可以是“天然存在的胺基酸殘基”，例如，可以為丙胺酸(Ala)、精胺酸(Arg)、天冬醯胺(Asn)、天冬胺酸(Asp)、半胱胺酸(Cys)、穀胺醯胺(Gln)、谷胺酸(Glu)、甘胺酸(Gly)、組胺酸(His)、異亮胺酸(Ile)：亮胺酸(Leu)、賴胺酸(Lys)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、脯胺 酸(Pro)、絲胺酸(Ser)、蘇胺酸(Thr)、色胺酸(Trp)、酪胺酸(Tyr)和纈胺酸(Val)。該替換的胺基酸殘基也可以是非天然形式存在的胺基酸殘基，例如可以為正亮胺酸、鳥胺酸、正纈胺酸、高絲胺酸、aib和其它胺基酸殘基類似物。本申請中，該胺基酸取代可以為非保守取代。該非保守取代可包括以非保守的形式改變目標蛋白或多肽中的胺基酸殘基，例如將具有某種側鏈大小或某種特性(例如，親水性)的胺基酸殘基變為具有不同側鏈大小或不同特性(例如，疏水性)的胺基酸殘基。本申請中，該胺基酸取代也可以為保守取代。該保守取代可包括以保守的形式改變目標蛋白或多肽中的胺基酸殘基，例如將具有某種側鏈大小或某種特性(例如，親水性)的胺基酸殘基變為具有相同或相似側鏈大小或者相同或相似特性(例如，仍為親水性)的胺基酸殘基。這樣的保守取代通常不會對所產生的蛋白質的結構或功能帶來很大影響。
在本申請中，術語“多聚體”通常是指由單體結合而形成的分子。例如，該多聚體可以為包含至少2個結構相同或結構不同的成分的多聚蛋白質。例如，該多聚體可以為兩條或更多條以共價或非共價締合或者藉由共價或非共價相互作用結合的多肽鏈的分子。例如，該多聚體可以為二聚體，可以為四聚體。
在本申請中，術語“第一多肽鏈”通常是指本申請所述的雙特異性融合蛋白中靶向PD-L1抗體的輕鏈。
在本申請中，術語“第二多肽鏈”通常是指包含本申請所述的雙特異性融合蛋白中靶向PD-L1抗體的重鏈、本申請所述的連接子和本申請所述的靶向VEGF的第二結合域的多肽。例如，該第二多肽鏈可以自N 端依次由本申請所述的雙特異性融合蛋白中靶向PD-L1抗體的重鏈、本申請所述的連接子和本申請所述的靶向VEGF的第二結合域組成。
在本申請中，該“第一”、“第二”並沒有順序上的區別，該“第二”僅作為與“第一”指代不同內容的稱謂。
在本申請中，術語“核酸分子”通常指任何長度的核苷酸(例如，可以為分離形式的核苷酸)，脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或從其天然環境分離的或人工合成的類似物。
在本申請中，術語“載體”通常指可將編碼某蛋白的多聚核苷酸插入其中並使蛋白獲得表達的一種核酸運載工具。載體可藉由轉化、轉導或轉染宿主細胞，使其攜帶的遺傳物質元件在宿主細胞內表達得以表達。舉例來說，載體可以包括：質粒；噬菌粒；柯斯質粒；人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細菌人工染色體(BAC)或P1來源的人工染色體(PAC)；噬菌體如λ噬菌體或M13噬菌體及動物病毒等。用作載體的動物病毒種類有逆轉錄酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒、乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。一種載體可能含有多種控制表達的元件，包括啟動子序列、轉錄起始序列、增強子序列、選擇元件及報告基因。另外，載體還可含有複製起始位點。載體還有可能包括有協助其進入細胞的成分，如病毒顆粒、脂質體或蛋白外殼，但不僅僅只有這些物質。
在本申請中，術語“細胞”通常指可以是或已經是受試者質粒或載體的接受者的單個細胞、細胞系或細胞培養物，其包括本申請所述的核酸分子或本申請所述的載體。細胞可以包括單個細胞的後代。由於天然、 偶然或有意的突變，後代可以不一定與原始母細胞完全相同(在總DNA互補體的形態上或在基因組上)。細胞可包括用本申請所述的載體在體外轉染的細胞。細胞可以是細菌細胞(例如，大腸桿菌)、酵母細胞或其它真核細胞，例如COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、CHO-K1細胞、LNCAP細胞、HeLa細胞、HEK293細胞、COS-1細胞、NS0細胞、人非小細胞肺癌A549細胞、人皮膚鱗癌A431細胞、腎透明細胞腺癌786-O細胞、人胰腺癌MIA PaCa-2細胞、紅白血病K562細胞、急性T細胞白血病Jurkat細胞、人乳腺癌MCF-7細胞、人乳腺癌MDA-MB-231細胞、人乳腺癌MDA-MB-468細胞、人乳腺癌SKBR3細胞、人卵巢癌SKOV3細胞、淋巴瘤U-937細胞、淋巴瘤Raji細胞、人骨髓瘤U266細胞或人多發性骨髓瘤RPMI8226細胞。在某些實施方案中，細胞為哺乳動物細胞。在某些實施方案中，哺乳動物細胞為HEK293細胞。
在本申請中，術語“醫藥組成物”通常指關於適合施用於患者、例如可以為施用於人患者的組成物。例如，本申請所述的醫藥組成物，其可以包含本申請所述的雙特異性融合蛋白、本申請所述的核酸分子、本申請所述的載體和/或本申請所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的佐劑。此外，該醫藥組成物還可以包含一種或多種(藥學上有效的)載劑、穩定劑、賦形劑、稀釋劑、增溶劑、表面活性劑、乳化劑和/或防腐劑的合適的製劑。在本申請中，該醫藥組成物的可接受成分可以在所用劑量和濃度下對接受者無毒。本申請的醫藥組成物的形式可以不限於液體、冷凍和凍乾組合物。
在本申請中，術語“藥學上可接受的佐劑”通常指與藥物給藥相容的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、等滲劑和吸收延遲劑等，通常安全、無毒，且既不是生物學上也非其它方面不合需要的。
在本申請中，術語“藥物分子”通常是指具有所需生物學效力的分子。藥物可以是預防性或治療性的。藥物分子可以包括不限於：蛋白分子，包括但不限於肽、多肽、蛋白質，包括翻譯後修飾的蛋白質、融合蛋白、抗體等，例如，在本申請中，該藥物分子中除了本申請所述的雙特異性融合蛋白以外，還可包含其他的一個或多個胺基酸，例如，該藥物分子中除了本申請所述的雙特異性融合蛋白以外，還可包含其他結構。在本申請中，該藥物分子還可包含小分子結構，包括無機或有機化合物。在本申請中，該藥物分子還可包含核酸分子，包括但不限於雙鏈或單鏈DNA、或雙鏈或單鏈RNA(如反義(分子)、RNAi等)、內含子序列、三螺旋核酸分子和適體。
在本申請中，術語“包含”通常是指包括明確指定的特徵，但不排除其他要素。
在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。
發明詳述
一方面，本申請提供了一種雙特異性融合蛋白，其包含第一結合域和第二結合域，其中，該第一結合域包含特異性結合PD-L1的抗體， 其中該抗體包含兩條抗體輕鏈和兩條抗體重鏈，該抗體輕鏈和該抗體重鏈藉由二硫鍵連接；該第二結合域包含一個VEGFR1的Ig樣結構域和一個VEGFR2的Ig樣結構域；其中該VEGFR1的Ig樣結構域的N端或該VEGFR2的Ig樣結構域的N端分別與該抗體重鏈的C端直接或間接連接。
在本申請中，該第一結合域可以特異性結合人PD-L1。
在本申請中，該第二結合域可以特異性結合人VEGF家族。
在本申請中，該第二結合域可以特異性結合選自下組的蛋白質：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PLGF。
在本申請中，該VEGFR1的Ig樣結構域可以包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
在本申請中，該VEGFR2的Ig樣結構域可以包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
在本申請中，該VEGFR1的Ig樣結構域可以和VEGFR2的Ig樣結構域直接連接。例如，該第二結合域可以自N端依次包含該VEGFR1的Ig樣結構域和該VEGFR2的Ig樣結構域。例如，該第二結合域可以自N端依次由該VEGFR1的Ig樣結構域和該VEGFR2的Ig樣結構域組成。在本申請中，該第二結合域可以包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在本申請中，該間接連接可以藉由連接子連接。例如，在該雙特異性融合蛋白中，該第二結合域中的該VEGFR1的Ig樣結構域的N端可以藉由該連接子與該抗體重鏈的C端連接。例如，在該雙特異性融合蛋白中，該第二結合域中的該VEGFR2的Ig樣結構域的N端可以藉由該連接子與該抗體重鏈的C端連接。
在本申請中，該連接子可以包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
在本申請中，任何已知的PD-L1抗體只要具有可以特異性結合PD-L1的輕鏈可變區和重鏈可變區，都可以被用於作為該第一結合域中的該抗體。
在本申請中，該抗體輕鏈包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區可以包含LCDR1-3，其中LCDR1可以包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列。
在本申請中，LCDR2可以包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列。
在本申請中，LCDR3可以包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗體輕鏈包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區可以包含LCDR1-3，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列；該LCDR2可以包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列；並且該LCDR3可以包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列；或者，該LCDR1可以包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列；該LCDR2可以包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列；並且該LCDR3可以包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗體輕鏈可以包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區可以包含SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗體輕鏈可以包含輕鏈恆定區，其中輕鏈恆定區可以源自選自下組蛋白的輕鏈恆定區：Igκ和Igλ。
在本申請中，該抗體輕鏈可以包含SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗體重鏈可以包含重鏈可變區，其中該重鏈可變區可以包含HCDR1-3，其中該HCDR1可以包含SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列。
在本申請中，HCDR2可以包含SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列。
在本申請中，HCDR3可以包含SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗體重鏈可以包含重鏈可變區，其中該重鏈可變區可以包含HCDR1-3，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列；該HCDR2可以包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列；且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列；或者，該HCDR1可以包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列；該HCDR2可以包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列；且該HCDR3可以包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗體重鏈可以包含重鏈可變區，該重鏈可變區可以包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗體的輕鏈可變區可以包含SEQ ID NO：16所示的胺基酸序列，並且該抗體的重鏈可變區可以包含SEQ ID NO：18所 示的胺基酸序列；或者，該抗體的輕鏈可變區可以包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，並且該抗體的重鏈可變區可以包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。
在本申請中，該抗體重鏈可以包含Fc區域。
在本申請中，該Fc區域可以源自選自下組蛋白的Fc：IgG1和IgG4。
在本申請中，該Fc區域可以在選自下組的胺基酸位置處包含胺基酸突變：N298、D357和L359。
在本申請中，該Fc區域中N298處的胺基酸突變可以包括N298A，即SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列中第82位的胺基酸N突變為胺基酸A。在本申請中，該Fc區域中D357處的胺基酸突變可以包括D357E，即SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列中第141位的胺基酸D突變為胺基酸E。在本申請中，該Fc區域中L359處的胺基酸突變可以包括L359M，即SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列中第143位的胺基酸L突變為胺基酸M。
在本申請中，該Fc區域可以包含選自下組的胺基酸突變：N298A、D357E和L359M。在本申請中，該Fc區域可以具有胺基酸突變，該胺基酸突變可以由N298A、D357E和L359M組成。
在本申請中，該Fc區域可以包含SEQ ID NO：20-22中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該雙特異性融合蛋白可以為由兩拷貝的第一多肽鏈和第二多肽鏈組成的多聚體，其中該第一多肽鏈可以包含該抗體輕鏈， 其中該第二多肽鏈可以自N端依次包含該抗體重鏈、該連接子和該第二結合域。
在本申請中，該第一多肽鏈可以由該抗體輕鏈組成。例如，該第一多肽鏈和該第二多肽鏈中的該抗體重鏈可以藉由共價鍵(例如二硫鍵)連接；該第一多肽鏈和該第二多肽鏈中的該抗體重鏈可以藉由非共價鍵連接。
在本申請中，兩條該第一多肽鏈可以包含相同的胺基酸序列。例如，兩條該第一多肽鏈可以具有相同的胺基酸序列。
在本申請中，兩條該第二多肽鏈可以包含相同的胺基酸序列。例如，兩條該第二多肽鏈可以具有相同的胺基酸序列。
兩條該第一多肽鏈可以任意地分別和兩條該第二多肽鏈藉由共價鍵和/或非共價鍵連接，從而可以形成本申請所述的雙特異性融合蛋白。
在本申請中，該第一多肽鏈可以包含SEQ ID NO：23-24中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該第二多肽鏈可以包含SEQ ID NO：25-27中任一項所示的胺基酸序列。
在本申請中，該第一多肽鏈可以包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；且該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列；或者，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列；且該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；或者，其中該第一多肽鏈 包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；且該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
在本申請中，該第一多肽鏈的胺基酸序列可以如SEQ ID NO：23所示；且該第二多肽鏈的胺基酸序列可以如SEQ ID NO：25所示。在本申請中，該第一多肽鏈的胺基酸序列可以如SEQ ID NO：24所示；且該第二多肽鏈的胺基酸序列可以如SEQ ID NO：26所示。或者，在本申請中，該第一多肽鏈的胺基酸序列可以如SEQ ID NO：23所示；且該第二多肽鏈的胺基酸序列可以如SEQ ID NO：28所示。
另一方面，本申請提供一種多核苷酸，其編碼本申請所述的雙特異性融合蛋白。
本申請所述的多核苷酸可以為分離的。例如，其可以是藉由以下方法產生或合成的：(i)在體外擴增的，例如藉由聚合酶鏈式反應(PCR)擴增產生的，(ii)藉由選殖重組產生的，(iii)純化的，例如藉由酶切和凝膠電泳分級分離，或者(iv)合成的，例如藉由化學合成。在某些實施方式中，該分離的核酸是藉由重組DNA技術製備的核酸分子。重組DNA和分子選殖技術包括由Maniatis，T.，Fritsch，E.F.，Sambrook，J.：Molecular Cloning.A Iaboratory manual.Cold Spring Harbour Laboratory.Cold Spring Harbour，NY，1982和由T.J.Silhavy,M.L.Bennan和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1984)以及由Ausubel,F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology,pub.by Greene Publishing Assoc.and Wiley-Interscience(1987)描述的那些技術。簡而言之，可從 基因組DNA片段、cDNA和RNA製備該核酸，所有這些核酸可直接從細胞中提取或藉由各種擴增方法(包括但不限於PCR和RT-PCR)重組產生。
本申請所述的多核苷酸可以包括一條以上不同的核苷酸序列。本申請所述的多核苷酸可以編碼本申請所述雙特異性融合蛋白的一個以上的不同的組分。例如，該多核苷酸可以編碼本申請所述的第一多肽鏈，和/或，該多核苷酸可以編碼本申請所述的第二多肽鏈。例如，該多核苷酸可以編碼該PD-L1抗體的輕鏈；可以編碼該PD-L1抗體的重鏈；可以編碼該第二結合域；可以編碼該連接子；可以編碼該VEGFR1的Ig樣結構域；和/或，可以編碼該VEGFR2的Ig樣結構域。
另一方面，本申請提供了一種載體，其包含本申請所述的多核苷酸。
在本申請中，該載體中可包含一種或多種本申請所述的多核苷酸。例如，該載體可以直接用於表達本申請所述的雙特異性融合蛋白。在本申請中，該載體可以用於表達本申請所述的雙特異性融合蛋白中的任何組成部分。在本申請中，可以使用至少2個該載體表達本申請所述的雙特異性融合蛋白。例如，該載體可以表達本申請所述的第一多肽鏈，和/或，該載體可以表達本申請所述的第二多肽鏈。例如，該載體可以表達該PD-L1抗體的輕鏈，該PD-L1抗體的重鏈，該連接子，該VEGFR1的Ig樣結構域；和/或，該VEGFR2的Ig樣結構域。
在本申請中，該載體中還可包含其他基因，例如允許在適當的宿主細胞中和在適當的條件下選擇該載體的標記基因。此外，該載體還可包含允許編碼區在適當宿主中正確表達的表達控制元件。這樣的控制元 件為所屬技術領域具有通常知識者所熟知的，例如，可包括啟動子、核糖體結合位點、增強子和調節基因轉錄或mRNA轉譯的其他控制元件等。在某些實施方式中，該表達控制序列為可調的元件。該表達控制序列的具體結構可根據物種或細胞類型的功能而變化，但通常可以包含分別參與轉錄和翻譯起始的5’非轉錄序列和5’及3’非翻譯序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非轉錄表達控制序列可包含啟動子區，啟動子區可包含用於轉錄控制功能性連接核酸的啟動子序列。該表達控制序列還可包括增強子序列或上游活化子序列。在本申請中，適當的啟動子可以為SP6、T3和T7聚合酶的啟動子、人U6RNA啟動子、CMV啟動子及其人工雜合啟動子(如CMV)，其中啟動子的某部分可與其他細胞蛋白(如人GAPDH，甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因啟動子的某部分融合，其可包含或不包含另外的內含子。本申請所述的一種或多核苷酸可以與該表達控制元件可操作地連接。該載體可以包括，質粒、黏粒、病毒、噬菌體或者在例如遺傳工程中通常使用的其他載體。例如，該載體為表達載體。
另一方面，本申請提供了一種細胞，其包含或表達本申請所述的雙特異性融合蛋白、本申請所述的多核苷酸或本申請所述的載體。
該細胞可以為原核細胞(例如，細菌細胞)、CHO細胞、NS/0細胞、HEK293T細胞或HEK293A細胞，或者可以為其他真核細胞，例如真菌或酵母細胞。可藉由本領域已知的方法將本申請所述的載體引入該細胞中，例如電穿孔、lipofectine轉染、lipofectamin轉染等。例如，該宿主細胞可以為COS、CHO、NSO、sf9、sf21、DH5a、BL21(DE3)或TG1。
另一方面，本申請提供本申請所述的雙特異性融合蛋白的製備方法，其包括在適於表達本申請所述的雙特異性融合蛋白的情況下，培養本申請所述的細胞。
例如，可藉由使用適當的培養基、適當的溫度和培養時間等，這些方法是所屬技術領域具有通常知識者所瞭解的。在某些情形中，該方法還可包括收穫(例如分離和/或純化)本申請該雙特異性融合蛋白的步驟。例如，可以採用蛋白G-瓊脂糖或蛋白A-瓊脂糖進行親和層析，還可藉由凝膠電泳和/或高效液相色譜等來純化和分離本申請所述的雙特異性融合蛋白。
另一方面，本申請提供一種醫藥組成物，其包含本申請所述的雙特異性融合蛋白，以及藥學上可接受的載體。
該藥學上可接受的載體可以包括緩衝劑、抗氧化劑、防腐劑、低分子量多肽、蛋白質、親水聚合物、胺基酸、糖、螯合劑、反離子、金屬複合物和/或非離子表面活性劑等。
在本申請中，該醫藥組成物可被配製用於口服給藥、靜脈內給藥、肌肉內給藥、在腫瘤部位的原位給藥、吸入、直腸給藥、陰道給藥、經皮給藥或藉由皮下儲存庫給藥。例如，對於口服給藥，醫藥組成物可以被製備成小片、片劑、膠囊、酏劑、混懸液、糖漿或薄片。對於注射製劑，醫藥組成物可以被製備成例如一次劑量的劑型的安瓿瓶，或者例如多劑量容器的單元型劑型。醫藥組成物還可以被製備成溶液、懸浮液、藥片、藥丸、膠囊和長效製劑。
該醫藥組成物的給藥頻率和劑量可以藉由多個相關因素被確定，該因素包括要被治療的疾病類型、給藥途徑、病人年齡、性別、體重和疾病的嚴重程度以及作為活性成分的藥物類型。由於該醫藥組成物具有優良的體內功效和濃度的持續時間，它可以顯著地減少該藥物的給藥頻率和劑量。
另一方面，本申請提供一種藥物分子，其包含該雙特異性融合蛋白。在本申請中，該藥物分子能夠具有該雙特異性融合蛋白的性質和/或功能。在本申請中，該藥物分子還可具有其他性質和/或功能。例如，該藥物分子還可包含其他結構。例如，該藥物分子還可包含其他一個或多個胺基酸。
另一方面，本申請提供一種本申請所述的雙特異性融合蛋白在製備治療疾病的藥物中的應用，其中該疾病包括腫瘤。
本申請所述的雙特異性融合蛋白，和/或本申請所述的醫藥組成物，其用於治療疾病，其中該疾病包括腫瘤。
本申請提供了一種治療疾病的方法，其包括向有需要的受試者施用有效量的雙特異性融合蛋白，和/或本申請所述的醫藥組成物，其中該疾病包括腫瘤。
在本申請中，該腫瘤可以為實體瘤，也可以為非實體瘤。例如，該腫瘤可以包括所屬技術領域具有通常知識者所知曉的各種瘤種，並不限於特定的一種或多種瘤種。例如，該腫瘤可以包括肺癌、結直腸癌、宮頸癌、肝癌、胃癌和/或腎癌。例如，該腫瘤可以包括結直腸癌。
在本申請中，該腫瘤可以為PD-L1陽性(例如，可以為PD-L1過表達)的腫瘤。在某些情況系，該腫瘤也可以為PD-L1陰性。在本申請中，該腫瘤可以與VEGF(例如在血管中)的過表達相關。
另一方面，本申請提供了一種抑制血管(例如人)生長的方法，其包括施用有效量的本申請所述的雙特異性融合蛋白，和/或本申請所述的醫藥組成物。
另一方面，本申請提供了一種抑制VEGF受體配體活性的方法，其包括施用有效量的本申請所述的雙特異性融合蛋白，和/或本申請所述的醫藥組成物。
例如，該VEGF受體配體活性可以包括VEGF和/或VEGFR本身的生物學活性和/或功能。例如，可以包括VEGF與VEGFR的結合。
另一方面，本申請提供了一種抑制PD-L1活性的方法，其包括施用有效量的本申請所述的雙特異性融合蛋白，和/或本申請所述的醫藥組成物。
例如，該PD-L1活性可以包括PD-L1和/或PD-1本身的生物學活性和/或功能。例如，可以包括PD-L1與PD-1的結合。
不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請發明的各個技術方案，而不用於限制本申請發明的範圍。
實施例
本申請涉及的蛋白質的代號有如下的含義：
SG1201：PD-L1抗體1，輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO.16所示；其重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO.18所示；
SG1202：PD-L1抗體2，其輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO.17所示；其重鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO.19所示；
SG1501：VEGFRs(其胺基酸序列如SEQ ID NO.28所示)-Fc(其胺基酸序列如SEQ ID NO.20所示)融合蛋白；
12VF1：其為本申請該雙特異性融合蛋白，其中第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.23所示；且其第二多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.25所示；
12VF2：其為本申請該雙特異性融合蛋白，其中第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.24所示；且其第二多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.26所示；
12VF8：其為本申請該雙特異性融合蛋白，其中第一多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.23所示；且其第二多肽鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO.27所示。
實施例1構建融合蛋白
參照如圖1所示的雙特異性融合蛋白的結構，依次連接PD-L1抗體1序列、連接子(其胺基酸序列如SEQ ID NO.3所示)和VEGFRs，其中VEGFRs的N端和PD-L1抗體1的重鏈的C端連接，得到雙特異性融合蛋白12VF1。
在12VF1基礎上將突變的IgG1 Fc(其胺基酸序列如SEQ ID NO.22所示)替換成IgG4 Fc(其胺基酸序列如SEQ ID NO.21所示)，獲得雙特異性融合蛋白12VF8。
參照如圖1所示的融合蛋白結構，依次連接PD-L1抗體2、連接子(其胺基酸序列如SEQ ID NO.3所示)和VEGFRs，其中VEGFRs的N端和PD-L1抗體2的重鏈的C端連接，獲得雙特異性融合蛋白12VF2。
實施例2與雙抗原結合的活性檢測
(1)以PD-L1抗體為對照，ELISA評價雙功能融合蛋白和PD-L1的結合活性。
將PD-L1(人重組PD-L1蛋白(ECD,His Tag)，購自Sino Biological)包被ELISA板條，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；加入不同濃度的抗體SG1201和SG1202，實施例1製備的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG Fab二抗(Goat Anti-Human IgG(Fab')2(HRP)，Abcam)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；每孔加入100μL TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1~2分鐘；隨後每孔加入100μL 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析雙功能融合蛋白與PD-L1的結合能力。
結果如圖2所示。圖2顯示雙特異性融合蛋白12VF1與PD-L1的結合能力略強於12VF8，同抗體SG1201。圖2顯示雙特異性融合蛋白12VF2和抗體SG1202與PD-L1的結合能力相當。
(2)以VEGFRs融合蛋白為對照，ELISA評價雙功能融合蛋白和VEGF165的結合活性。
將VEGF165(Human VEGF165 Protein,His Tag，Acro Biosystems)包被ELISA板條，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛 血清，37℃封閉1小時；加入不同濃度的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8和SG1501，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG Fc二抗(Goat anti-human IgG Fc antibody,horseradish peroxidase(HRP)conjugate,affinity purified，Invitrogen)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；每孔加入100μL TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1~2min；隨後每孔加入100μL 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8與VEGF165結合能力。
結果如圖3所示。圖3顯示雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8與VEGF165的結合能力相當，略弱於融合蛋白SG1501。
實施例3同時與雙抗原結合的活性檢測
以PD-L1抗體和VEGFRs融合蛋白為對照，ELISA評價實施例1製備的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8同時結合雙抗原的生物學活性。
將PD-L1(人重組PD-L1蛋白(ECD,His Tag)，購自Sino Biological)包被ELISA板條，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；分別加入不同濃度的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8，PD-L1抗體SG1201、SG1202，和VEGFRs融合蛋白SG1501，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入生物素標記VEGF165(Biotinylated Human VEGF165 Protein,His,Avitag，Acro Biosystems)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次；加入辣根過氧化物酶標記的親和素(Streptavidin-HRP，嘉暄生物)，37℃反應30分鐘；PBST洗滌5次； 每孔加入100μL TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1~2min；隨後每孔加入100μL 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8與PD-L1和VEGF165同時結合的能力。
結果如圖4所示。圖4顯示雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8可與PD-L1和VEGF165同時結合，PD-L1抗體SG1201和SG1202，VEGFRs融合蛋白SG1501不能同時結合PD-L1及VEGF165。
實施例4阻斷PD-1/PD-L1相互作用的活性分析
以PD-L1抗體SG1201、SG1202為對照，評價雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8阻斷PD-1/PD-L1相互作用的生物學活性。
將PD-L1-his(人重組PD-L1蛋白(ECD,His Tag)，購自Sino Biological)包被酶聯板，1ug/ml，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；分別加入不同濃度的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8和抗體SG1201、SG1202，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入生物素標記PD1(Biotinylated Human PD-1/PDCD1 Protein,Fc,AvitagTM,His Tag，Acro Biosystems)至終濃度2μg/ml，37℃反應30min；PBST洗滌5次；加入辣根過氧化物酶標記的親和素(Streptavidin-HRP，嘉暄生物)，37℃孵育30分鐘；PBST洗5遍，每孔加入100μL TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1-5min；每孔加入100μL 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8對PD-1/PD-L1的阻斷作用。
從圖5中可以看出，雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8與PD-L1抗體SG1201，SG1202一樣可以競爭性阻斷PD-1與PD-L1的結合，且活性相似。其中SG1201的IC50值為0.3968nM，SG1202的IC50值為0.4216nM，12VF1的IC50值為0.393nM，12VF8的IC50值為0.5002nM，12VF2的IC50值為0.4256nM。
實施例5阻斷VEGF/VEGFR相互作用的活性分析
(1)以融合蛋白SG1501為對照，評價實施例1製備的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8阻斷VEGF/VEGFR相互作用的生物學活性。
將VEGFR1(Human VEGF R1/Flt-1 Protein,His Tag，Acro Biosystems)包被酶聯板，1ug/ml，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；分別加入不同濃度的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8和融合蛋白SG1501，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入生物素標記VEGF165(Biotinylated Human VEGF165 Protein,His,Avitag，Acro Biosystems)至終濃度0.05μg/ml，37℃反應30min；PBST洗滌5次；加入辣根過氧化物酶標記的親和素(Streptavidin-HRP，嘉暄生物)，37℃孵育30分鐘；PBST洗5遍，每孔加入100μL TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1-5min；每孔加入100μL 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8對VEGF/VEGFR的阻斷作用。
結果如圖6所示，圖6顯示雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8與融合蛋白SG1501一樣可以競爭性阻斷VEGF與其受體VEGFR1 的結合。其中12VF1的IC50值為3.749nM，12VF2的IC50值為5.049nM，12VF8的IC50值為2.182nM，SG1501的IC50值為1.470nM。
(2)以雙特異性融合蛋白IMM25011(參見專利申請US2020/0172623A1)為對照，評價實施例1製備的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8阻斷VEGF165/VEGFR2相互作用的生物學活性。
將VEGF165(VEGF165 Protein,Human,Cynomolgus,Recombinant,HPLC-verified，Sino Biological)包被酶聯板，1μg/ml，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；分別加入不同濃度的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8和IMM25011，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入生物素標記VEGFR2(VEGFR2/KDR Protein,Human,Recombinant(His Tag),Biotinylated，Sino Biological)至終濃度1μg/ml，37℃反應30min；PBST洗滌5次；加入辣根過氧化物酶標記的親和素(Streptavidin-HRP，嘉暄生物)，37℃孵育30分鐘；PBST洗5遍，每孔加入100μL TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1-5min；每孔加入100μL 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8對VEGF165/VEGFR2的阻斷作用。
結果如圖7所示，圖7顯示雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8均可以阻斷VEGF165與其受體VEGFR2的結合，且活性均強於IMM25011。其中12VF1的IC50值為4.092nM，12VF2的IC50值為3.501nM，12VF8的IC50值為3.422nM，IMM25011的IC50值為6.596nM。
(3)以雙特異性融合蛋白IMM25011為對照，評價實施例1製備的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8阻斷VEGF121/VEGFR2相互作用的生物學活性。
將VEGF121(VEGF121 Protein,Human,Recombinant，Sino Biological)包被酶聯板，1μg/ml，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；分別加入不同濃度的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8和IMM25011，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入生物素標記VEGFR2(VEGFR2/KDR Protein,Human,Recombinant(His Tag),Biotinylated，Sino Biological)至終濃度1μg/ml，37℃反應30min；PBST洗滌5次；加入辣根過氧化物酶標記的親和素(Streptavidin-HRP，嘉暄生物)，37℃孵育30分鐘；PBST洗5遍，每孔加入100μL TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1-5min；每孔加入100μL 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8對VEGF121/VEGFR2的阻斷作用。
結果如圖8所示，圖8顯示雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8均可以阻斷VEGF121與其受體VEGFR2的結合，且活性均強於IMM25011。其中12VF1的IC50值為3.536nM，12VF2的IC50值為3.291nM，12VF8的IC50值為2.955nM，IMM25011的IC50值為5.281nM。
(4)以雙特異性融合蛋白IMM25011為對照，評價實施例1製備的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8阻斷VEGF C/VEGFR2相互作用的生物學活性。
將VEGF C(VEGF C Protein,Human,Recombinant(His Tag)，Sino Biological)包被酶聯板，1μg/ml，4℃過夜；PBST洗滌後，加入10%的胎牛血清，37℃封閉1小時；分別加入15μM的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8和IMM25011，37℃反應1小時；PBST洗滌後，加入生物素標記VEGFR2(VEGFR2/KDR Protein,Human,Recombinant(His Tag),Biotinylated，Sino Biological)至終濃度20μg/ml，37℃反應30min；PBST洗滌5次；加入辣根過氧化物酶標記的親和素(Streptavidin-HRP，嘉暄生物)，37℃孵育30分鐘；PBST洗5遍，每孔加入100μL TMB(eBioscience)，室溫(20±5℃)避光放置1-5min；每孔加入100μL 2N H2SO4終止液終止受質反應，酶標儀450nm處讀取OD值，分析雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8對VEGF C/VEGFR2的阻斷作用。
結果如圖9所示，圖9顯示雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8均可以阻斷VEGF C與其受體VEGFR2的結合，從而能夠有效抑制血管生成，且12VF1、12VF2、12VF8的阻斷活性相似。而IMM25011不能阻斷VEGF C與其受體VEGFR2的結合。
因此，相比於IMM25011僅能阻斷VEGF121與VEGFR2的結合，本申請的雙特異性融合蛋白能夠既阻斷VEGF121與VEGFR2的結合，又能夠阻斷VEGF C與其受體VEGFR2的結合，從而更加全面地發揮該信號通路的調節效果，起到更加完全地阻斷腫瘤部位血管生成的效果。
實施例6抑制HUVEC細胞增殖的活性分析
以融合蛋白SG1501為對照，評價雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8抑制HUVEC細胞增殖的生物學活性。
將HUVEC細胞用實驗培養基重新懸浮後加入96孔細胞培養板中，溫箱過夜培養；將VEGF165(ActiveMax® Human VEGF165 Protein,Tag Free(MALS verified)，Acro Biosystems)用實驗培養基稀釋至40ng/mL，再與不同濃度的雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2、12VF8和融合蛋白SG1501等體積混合，37℃預孵育30min，加入96孔細胞培養板中；37℃溫箱培養3天後，取出96孔板室溫平衡10min，每孔加入100μL CellTiter-Lumi試劑(CellTiter-LumiTM Luminescent Cell Viability Assay Kit，碧雲天)，輕搖混勻，避光反應10min後，用酶標儀讀取化學發光的相對螢光強度值(RLU)，分析雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8抑制HUVEC細胞增殖的活性。
從圖10中可以看出，雙特異性融合蛋白12VF1、12VF2和12VF8均可以抑制HUVEC細胞增殖，略弱於融合蛋白SG1501。
實施例7激活T淋巴細胞的活性分析
以PD-L1抗體SG1201和同型對照抗體為對照，評價雙特異性融合蛋白12VF8在混合淋巴細胞反應中激活T淋巴細胞的生物學活性。
用CD14磁珠(CD14 microbeads，Miltenyi)從健康捐贈人的PBMC中分離出單核細胞，並用樹突細胞培養試劑盒(ImmunoCultTM Dendritic Cell Culture Kit，Stemcell)誘導分化為樹突細胞；用CD4+T淋巴細胞分離試劑盒(CD4+ T Cell Isolation Kit，Miltenyi)從另一個健康捐贈人的PBMC中分離出CD4+T淋巴細胞，將CD4+T淋巴細胞與樹突細 胞按照細胞數5：1的比例，加入96孔細胞培養板，再加入不同濃度的雙特異性融合蛋白12VF8，混勻後放37℃培養箱中培養5天；收集細胞上清，使用ELISA試劑盒檢測細胞因子IFN-γ和IL-2的濃度，分析雙特異性融合蛋白12VF8在混合淋巴細胞反應中激活T淋巴細胞的活性。
從圖11及圖12中可以看出，與同型對照組相比，雙特異性融合蛋白12VF8與PD-L1抗體SG1201一樣可以以劑量依賴的方式激活T細胞，促進IFN-γ和IL-2的釋放。
實施例8 ADCC活性分析
以雙特異性融合蛋白IMM25011為對照，PD-L1過表達細胞株CHO-K1/PD-L1為靶細胞，過表達人FcγRIIIa基因及NFAT螢光報告基因的Jurkat細胞(簡稱Jurkat-ADCC細胞)為效應細胞，用報告基因法評價實施例1製備的雙特異性融合蛋白12VF1和12VF8的ADCC活性。
收集CHO-K1/PD-L1細胞，按照每孔2×104個細胞加入96孔細胞培養板中；收集Jurkat-ADCC細胞，按照每管1.2×105個細胞加入96孔細胞培養板中；加入不同濃度的雙特異性融合蛋白IMM25011、12VF1和12VF8，37℃培養箱中孵育6小時；每孔加入100μL螢光素酶檢測溶液，室溫避光反應10min後，用酶標儀讀取化學發光的相對螢光強度值(RLU)，分析雙特異性融合蛋白12VF1和12VF8的ADCC活性。
結果如圖13所示，圖13顯示雙特異性融合蛋白IMM25011具有ADCC活性，而12VF1和12VF8均無ADCC活性。
上述結果表明，12VF1和12VF8的安全性更好。避免對PD-L1陽性的其他正常細胞的殺傷，從而降低了潛在的毒副作用。由於PD-L1 在很多正常免疫細胞也有表達，如髓系的DC、巨噬細胞和淋巴系的T效應細胞、Treg以及NK細胞。12VF1和12VF8在沒有ADCC活性的情況下，可避免對於正常組織的殺傷。
實施例9融合蛋白體內抑制腫瘤活性
小鼠結直腸癌MC38模型，評價雙特異性融合蛋白12VF8抑制腫瘤活性的效果。
將小鼠結直腸癌細胞MC38接種於雄性C57BL/6J小鼠右側前脅肋部皮下，共接種36隻，在腫瘤生長至58mm3左右時分組給藥，共5組，每組6隻，分別為組1：在試驗第17天施用PBS(即作為Vehicle組)，腹腔注射給藥，每週給藥二次，給藥三週；組2：施用SG1201(2mg/kg)，腹腔注射給藥，每週給藥二次，給藥三週；組3：施用SG1501(1.4mg/kg)，腹腔注射給藥，每週給藥二次，給藥三週；組4：同時施用SG1201(2mg/kg)以及SG1501(1.4mg/kg)，腹腔注射給藥，每週給藥二次，給藥三週；組5：施用12VF8(2.7mg/kg)組，腹腔注射給藥，每週給藥二次，給藥三週(施用後的結果依次對應圖14的組1-5)。每週測量腫瘤體積及體重，記錄荷瘤鼠體重和腫瘤體積的變化與給藥時間的關係。末次給藥後2小時採集各組內固定小鼠的血清。實驗結束時，將荷瘤鼠安樂死，剝離腫瘤稱重、拍照。計算腫瘤生長抑制率TGITV(%)並進行統計學分析。
結果顯示，實驗結束時，組2、組3、組4和組5的腫瘤生長抑制率分別為63%、39%、71%、83%，各治療組腫瘤體積均顯著低於對照的組1(p<0.05)，顯示出顯著的抗腫瘤作用，有效地抑制了腫瘤生長，其 中組5處理的腫瘤體積在所有治療組中最小，顯著低於組3(p<0.05)，抑制腫瘤活性優於施用單藥的組2或組3，也優於施用聯合用藥的組4。治療期間，荷瘤鼠對組2-組5的處理均表現出很好的耐受性，各組小鼠體重正常，無異常表現，一般狀態良好。可見12VF8具有給藥安全性。
前述詳細說明是以解釋和舉例的方式提供的，並非要限制所附申請專利範圍的範圍。目前本申請所列舉的實施方式的多種變化對所屬技術領域具有通常知識者來說是顯而易見的，且保留在所附的申請專利範圍和其等同方式的範圍內。
Figure 111122670-A0202-12-0042-1
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Claims (43)

  1. 一種雙特異性融合蛋白，其包含第一結合域和第二結合域，其中，
    該第一結合域包含特異性結合PD-L1的抗體，其中該抗體包含兩條抗體輕鏈和兩條抗體重鏈，該抗體輕鏈和該抗體重鏈藉由二硫鍵連接；
    該第二結合域包含一個VEGFR1的Ig樣結構域和一個VEGFR2的Ig樣結構域；
    其中該VEGFR1的Ig樣結構域的N端或該VEGFR2的Ig樣結構域的N端分別與該抗體重鏈的C端直接或間接連接。
  2. 如請求項1所述的雙特異性融合蛋白，其中該第一結合域特異性結合人PD-L1。
  3. 如請求項1或2所述的雙特異性融合蛋白，其中該第二結合域特異性結合人VEGF家族。
  4. 如請求項1至3中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該第二結合域特異性結合選自下組的蛋白質：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PLGF。
  5. 如請求項1至4中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該VEGFR1的Ig樣結構域包含SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該VEGFR2的Ig樣結構域包含SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該VEGFR1的Ig樣結構域和VEGFR2的Ig樣結構域直接連接。
  8. 如請求項1至7中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該第二結合域包含SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列。
  9. 如請求項1至8中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該間接連接為藉由連接子連接。
  10. 如請求項9所述的雙特異性融合蛋白，其中該連接子包含SEQ ID NO：3所示的胺基酸序列。
  11. 如請求項1至10中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該抗體輕鏈包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含LCDR1-3，其中LCDR1包含SEQ ID NO：4、10中任一項所示的胺基酸序列。
  12. 如請求項11所述的雙特異性融合蛋白，其中LCDR2包含SEQ ID NO：5、11中任一項所示的胺基酸序列。
  13. 如請求項11或12所述的雙特異性融合蛋白，其中LCDR3包含SEQ ID NO：6、12中任一項所示的胺基酸序列。
  14. 如請求項11至13中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該LCDR1-3的胺基酸序列選自下述任一組：
    (1)該LCDR1包含SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：5所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：6所示的胺基酸序列；
    (2)該LCDR1包含SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列，該LCDR2包含SEQ ID NO：11所示的胺基酸序列，且該LCDR3包含SEQ ID NO：12所示的胺基酸序列。
  15. 如請求項1至14中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該抗體輕鏈包含輕鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：16-17中任一項所示的胺基酸序列。
  16. 如請求項1至15中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該抗體輕鏈包含輕鏈恆定區，其中輕鏈恆定區源自選自下組蛋白的輕鏈恆定區：Igκ和Igλ。
  17. 如請求項1至16中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該抗體重鏈包含重鏈可變區，其中該重鏈可變區包含HCDR1-3，其中該HCDR1包含SEQ ID NO：7、13中任一項所示的胺基酸序列。
  18. 如請求項17所述的雙特異性融合蛋白，其中HCDR2包含SEQ ID NO：8、14中任一項所示的胺基酸序列。
  19. 如請求項17或18所述的雙特異性融合蛋白，其中HCDR3包含SEQ ID NO：9、15中任一項所示的胺基酸序列。
  20. 如請求項17至19中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該HCDR1-3包含選自下組的胺基酸序列：
    (1)該HCDR1包含SEQ ID NO：7所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：8所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列；
    (2)該HCDR1包含SEQ ID NO：13所示的胺基酸序列，該HCDR2包含SEQ ID NO：14所示的胺基酸序列，且該HCDR3包含SEQ ID NO：15所示的胺基酸序列。
  21. 如請求項1至20中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該抗體重鏈包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：18-19中任一項所示的胺基酸序列。
  22. 如請求項1至21中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該抗體重鏈包含Fc區域。
  23. 如請求項22所述的雙特異性融合蛋白，其中該Fc區域源自選自下組蛋白的Fc：IgG1和IgG4。
  24. 如請求項22或23所述的雙特異性融合蛋白，該Fc區域在選自下組的胺基酸位置處包含胺基酸突變：N298、D357和L359。
  25. 如請求項22至24中任一項所述的雙特異性融合蛋白，該Fc區域包含選自下組的胺基酸突變：N298A、D357E和L359M。
  26. 如請求項22至25中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該Fc區域包含SEQ ID NO：20-22中任一項所示的胺基酸序列。
  27. 如請求項9至26中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其為由兩拷貝的第一多肽鏈和第二多肽鏈組成的多聚體，
    其中該第一多肽鏈包含該抗體輕鏈，
    其中該第二多肽鏈自N端依次包含該抗體重鏈、該連接子和該第二結合域。
  28. 如請求項27所述的雙特異性融合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：23-24中任一項所示的胺基酸序列。
  29. 如請求項27或28所述的雙特異性融合蛋白，其中該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：25-27中任一項所示的胺基酸序列。
  30. 如請求項27至29中任一項所述的雙特異性融合蛋白，其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列；或者，
    其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列；或者，
    其中該第一多肽鏈包含SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列；該第二多肽鏈包含SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列。
  31. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至30中任一項所述的雙特異性融合蛋白。
  32. 一種載體，其包含如請求項31所述的多核苷酸。
  33. 一種細胞，其包含如請求項32所述的載體。
  34. 一種如請求項1至30中任一項所述的雙特異性融合蛋白的製備方法，其包括在適於表達如請求項1至30中任一項所述的雙特異性融合蛋白的情況下，培養如請求項33所述的細胞。
  35. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至30中任一項所述的雙特異性融合蛋白，以及視需要地藥學上可接受的載體。
  36. 一種藥物分子，其包含如請求項1至30中任一項所述的雙特異性融合蛋白。
  37. 一種如請求項1至30中任一項所述的雙特異性融合蛋白、如請求項31所述的多核苷酸、如請求項32所述的載體、如請求項33所述的細胞、如請求項35所述的醫藥組成物、和/或如請求項36所述的藥物分子在製備治療疾病的藥物中的應用，其中該疾病包括腫瘤。
  38. 如請求項37所述的應用，其中該疾病包括實體瘤和非實體瘤。
  39. 如請求項37或38所述的應用，其中該疾病包括PD-L1陽性腫瘤。
  40. 如請求項37至39中任一項所述的應用，其中該腫瘤包括肺癌、結直腸癌、宮頸癌、肝癌、胃癌和/或腎癌。
  41. 一種抑制血管生長的方法，其包括施用有效量的如請求項1至30中任一項所述的雙特異性融合蛋白、如請求項31所述的多核苷酸、如請求項32所述的載體、如請求項33所述的細胞、如請求項35所述的醫藥組成物和/或如請求項36所述的藥物分子。
  42. 一種抑制VEGF受體配體活性的方法，其包括施用有效量的如請求項1至30中任一項所述的雙特異性融合蛋白、如請求項31所述的多核苷酸、如請求項32所述的載體、如請求項33所述的細胞、如請求項35所述的醫藥組成物和/或如請求項36所述的藥物分子。
  43. 一種抑制PD-L1活性的方法，其包括施用有效量的如請求項1至30中任一項所述的雙特異性融合蛋白、如請求項31所述的多核苷酸、如請求項32所述的載體、如請求項33所述的細胞、如請求項35所述的醫藥組成物和/或如請求項36所述的藥物分子。
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