TW202207974A - 生物活性物質用於製備增加膠原蛋白密度、增加肌膚含水量、改善毛孔及改善皺紋的組合物的用途 - Google Patents
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Abstract
一種生物活性物質用於製備增加膠原蛋白密度、增加肌膚含水量、改善毛孔及改善皺紋的組合物的用途。生物活性物質為魚皮原料的胜肽,包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的組合。
Description
本發明涉及一種生物活性物質的用途,特別是關於一種作為生物活性物質的胜肽用於製備抗老化的組合物的用途。
博氏巨鯰,又名巴沙魚(Pangasius bocourti
),為國際重要的食用魚。巴沙魚的營養豐富、養殖週期短、產量高且易於加工。但由於其皮下富含脂肪,易影響魚肉風味。因此,作為國際上流通的食用魚,大多會先去除魚皮後再販售,進而產生大量的魚皮廢棄物。
近年來,為減少資源浪費及避免汙染環境,這些相關的廢棄物也逐漸被重視。並且,由於魚皮富含膠原蛋白,常被用以進行二次加工製作加工食品、明膠等。
膠原蛋白為人體一種非常重要的蛋白質,廣泛存在於結締組織中。膠原蛋白作為人體韌帶、眼睛角膜等組織的主要成分。並且,膠原蛋白更是細胞外基質的主要組成成分。膠原蛋白可使肌膚保持彈性,而隨著膠原蛋白的流失,肌膚會出現皺紋。
然而,膠原蛋白無法被人體直接吸收。
有鑑於此,本發明提供一種以作為生物活性物質的胜肽製備抗老化的組合物的用途。
在一些實施例中,一種生物活性物質用於抗老化的組合物的用途,其中生物活性物質為胜肽,且胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列。各胺基酸序列為魚皮的胜肽片段。
綜上,任一實施例的作為生物活性物質的胜肽,其可製備抗老化的組合物。並且,胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列,且各胺基酸序列為魚皮的胜肽片段。在一些實施例中,作為生物活性物質的胜肽可用以調節抗老化基因及/或提升粒線體活性。在一些實施例中,所製備的組合物可用以調節COL3A1
、COL4A4
、HAS2
及HAS3
基因。並且,所製備的組合物可用於增加膠原蛋白含量、增加膠原蛋白密度、增加肌膚含水量、改善毛孔、改善皺紋或其組合。
在一些實施例中,作為生物活性物質的胜肽能用於製備抗老化的組合物。其中,胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列,且各胺基酸序列為魚皮的胜肽片段。
應理解,「胜肽」為介於胺基酸和蛋白質之間的物質,係由多個胺基酸組成。並且,作為生物活性物質的胜肽可為「經分離的胜肽」或「經合成的胜肽」。其中,「經分離的胜肽」是指從生物體或生物體衍生物中分離出來的胜肽片段,且此胜肽片段具有生物活性。「經合成的胜肽」是指藉由儀器或人工實驗操作依照欲得到的胺基酸序列合成的胜肽片段,且此胜肽片段具有生物活性。並且,本文所述及的用語「經分離的胜肽」等同於「分離的胜肽」或「分離胜肽」,且用語「經合成的胜肽」等同於「合成的胜肽」或「合成胜肽」。
應可理解,本文所述及的用語「蛋白」等同於「蛋白質」,例如用語「膠原蛋白」等同「膠原蛋白質」。
在一些實施例中,作為生物活性物質的胜肽可分離自魚皮的胜肽片段或藉由儀器或人工實驗合成得之。舉例來說,魚皮的胜肽片段的來源包括魚皮細胞、膠原蛋白(下稱魚皮膠原蛋白)及魚肉細胞。由於魚皮中主要的成分為膠原蛋白,且從魚皮中提取魚皮膠原蛋白的過程中,除了主要提取的魚皮膠原蛋白,更會包含魚皮細胞中的蛋白質(即,魚皮細胞蛋白)以及殘留在魚皮上魚肉細胞的蛋白質(即,魚肉細胞蛋白)。應可理解,本文所述及的用語「魚皮的胜肽片段」是指以膠原蛋白為主的胜肽片段,且同時含有魚皮細胞蛋白及魚肉細胞蛋白的胜肽片段。
在一些實施例中,魚皮為巴沙魚的魚皮,因此作為生物活性物質的胜肽是巴沙魚的魚皮的胜肽片段。其中,巴沙魚的魚皮的胜肽片段可包含至少一種膠原蛋白、前膠原蛋白、魚皮細胞蛋白、魚肉細胞蛋白或其組合的胜肽片段。舉例來說,膠原蛋白可為第四型膠原蛋白、第五型前膠原蛋白、第十四型膠原蛋白等。
並且,在一些實施例中,作為生物活性物質的胜肽可以為SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:11所示的6種胺基酸序列中的任意多種胺基酸序列藉由化學(如,酵素水解處理等)或/及物理外力(如,純化、分離、親疏水引力、極性非極性溶劑等)混合在一起的胜肽群組。
舉例來說,可將巴沙魚魚皮的膠原蛋白胜肽原料進行分離以得到SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列,且此膠原蛋白胜肽原料包括魚皮膠原蛋白的胜肽片段、魚皮細胞蛋白的胜肽片段及/或魚肉細胞蛋白的胜肽片段。在一實施例中,膠原蛋白胜肽原料可以為市售巴沙魚的魚皮膠原蛋白胜肽粉(購自Italgelatin, 義大利),或是將巴沙魚的魚皮提取出的膠原蛋白經由酵素水解處理後並乾燥形成的膠原蛋白胜肽粉。
在一些示範例中,作為生物活性物質的胜肽可藉由儀器(如,快速蛋白質液性層析儀及高效液相層析系統)自巴沙魚魚皮膠原蛋白胜肽粉分離得之。並且,上述分離步驟是利用胜肽性質(例如分子量、親疏水性、極性非極性等物理或化學特性)分離出的SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列。
在一些實施例中,各胺基酸序列的分子量介於700道爾吞(Da)至1300Da之間。在一些實施例中,各胺基酸序列的胺基酸數量為8至13個。
在一些實施例中,當胜肽包括SEQ ID NO:4至SEQ ID NO:5中所示的至少一胺基酸序列時,其能用以提升至少一抗老化基因表現,且所製備的組合物亦可用以提升至少一抗老化基因的表現,進而提高肌膚抗老化的功能。舉例來說,至少一抗老化基因包括Atg8
、CCT2
、CCT5
、CCT6A
、CCT7
、CCT8
、Pink1
、STIR1
及Ubl-5
其中的至少一項基因。藉此,選用SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5中所示的任一種或多種胺基酸序列來製備組合物時,此組合物可用以提升至少一抗老化基因的表現。
在一些實施例中,當胜肽包括SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列時,其能用以提升細胞粒線體活性,且其所製備的組合物亦可用以提升細胞粒線體活性,進而維持細胞的健康狀態。舉例來說,選用為SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:6所示的任一種或多種胺基酸序列來製備組合物時,此組合物可用以提升細胞粒線體活性。
在一些實施例中,當胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列時,其能用於製備抗老化的組合物。並且,所製備的組合物可用以增加膠原蛋白密度、增加肌膚含水量、改善毛孔、改善皺紋或其組合。
在一些實施例中,以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列的胜肽所製備的組合物能用以改善肌膚狀況。舉例來說,以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列的胜肽所製備的組合物可具有下列至少一種功用:增加膠原蛋白含量、增加膠原蛋白密度、增加肌膚含水量、改善毛孔及改善皺紋。
舉例來說,當組合物包括用以調節COL3A1
及COL4A4
基因中至少一項基因的胜肽時,此組合物可用以促進肌膚膠原蛋白質生成、提升肌膚膠原蛋白質密度、減少肌膚毛孔或其組合。當組合物包括用以調節HAS2
及HAS3
基因中至少一項基因的胜肽時,此組合物可用以提高肌膚含水量。當組合物包括COL3A1
、COL4A4
、HAS2
及HAS3
基因中至少一項基因時,此組合物可用以改善皺紋。
在一些實施例中,以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列的胜肽所製備的組合物可以為食品組合物、保健食品組合物、或醫藥組合物等。舉例來說,以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列的胜肽所製備的組合物可為口服型的膠原胜肽粉。因此,藉由服用組合物可使其內包含的胜肽調節肌膚細胞的基因表現,進而改善肌膚細胞狀況。
範例一:經分離的胜肽的製備
首先,秤取100毫克巴沙魚魚皮的膠原胜肽粉(購自Italgelatin,義大利),並將其溶解於5毫升的緩衝液A,以得到膠原胜肽液。其中,緩衝液A係以50毫莫耳濃度(mM)的Tris/HCl緩衝液(pH 8.0)及100mM 氯化鈉(NaCl)配置。
接著,使用快速蛋白質液性層析儀(FPLC純化儀,廠牌ÄKTA GE Healthcare Life Sciences,以下稱為純化儀器)進行膠原胜肽液的粗略分離,以得到初分離胜肽混合物。其中,純化儀器內裝設的分離管柱為分子篩膠體純化管柱(sephadex G-25,2.6 cm× 10 cm,53毫升)。純化儀器的流速設定為每分鐘流一毫升(1 mL/min)且用以觀察的紫外光波長為220奈米(nm)及280奈米。並且,將波峰測量值為5kDa以下的初分離胜肽混合物於-80℃下進行冷凍抽乾(儀器廠牌EYELA;型號:FD-1000)12小時,以得到固態的初分離胜肽混合物。
取30毫克固態的初分離胜肽混合物溶解於2毫升含有0.1%三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)的二次去離子水中,以得到預分離胜肽混合物。接著,以高效液相層析(HPLC)系統(機型Hitachi Chromaster HPLC system, 廠牌Hitachi, Tokyo, Japan)(下稱HPLC系統)將預分離胜肽混合物進行分離,以得到多組次分離胜肽。其中,HPLC系統內裝設分子篩C18高壓管柱(型號TSKgel G2000SWXL, 廠牌Tosoh, 30 cm × 7.8 mm, 5 μm)。HPLC系統的設定值中,以緩衝溶液A(0.1% TFA溶於100%去離子水)及緩衝溶液B(0.1% TFA溶於100%ACN)依照分離梯度進行混合,且分離梯度為5%乙腈(Acetonitrile, ACN)/0.1%TFA 到100% 乙腈/0.1%TFA(即,於0.1%TFA溶液環境中將ACN的濃度由5%拉梯度至100%)、流速設定為每分鐘流一毫升(1 mL/min)及管柱溫度設定為40℃。
於此,初分離胜肽混合物中的胜肽會隨不同極性及分子量於的HPLC溶液沖提出來,進而得到多組分離胜肽。並且,將多組分離胜肽於-80℃下進行冷凍抽乾(儀器廠牌EYELA;型號:FD-1000)12小時,以得到多組固態的分離胜肽。
範例二:胜肽鑑定
將範例一的多組分離胜肽進行蛋白質身分鑑定。首先,多組固態的分離胜肽以去離子水配置為20mg/ml的濃度後,以液相層析質譜儀(LC-MS/MS)進行蛋白質鑑定。並且,液相層析質譜儀(LC-MS/MS)為四級棒-飛行時間式串聯質譜儀系統(Q-TOF),其中液相層析系統(LC system)的型號為UltiMate 3000 RSLCnano LC Systems (廠牌Thermo Fisher Scientific),且質譜儀(Mass Spectrometer)的型號為TripleTOF® 6600 System(廠牌Applied Biosystems Sciex)。
液相層析系統內裝設的分離管柱號為C18分離管柱(Acclaim PepMap C18, 75 μm I.D. x 25 cm nanoViper, 2 μm, 100 Å(Thermo Fisher Scientific))。液相層析質譜儀所使用的溶液系統為緩衝溶液A(0.1% TFA溶於100%去離子水)及緩衝溶液B(0.1% TFA溶於100%ACN)。液相層析質譜儀設定的分離梯度為5%緩衝溶液B到拉梯度到90% 緩衝溶液B、流速設定為每分鐘流300奈升(300 nl/min)及拉梯度30分鐘。
於質譜儀的設定值中,檢視質譜掃描(survey scan)設定為掃描在400m/z(質荷比)至1200m/z範圍內的所有離子化的分離的胜肽。在資料依靠收集模式(information dependent aquisition, CID)中,設定胜肽的偵測範圍是100-5000道爾頓(dalton, Da)。接著,分析這些分離胜肽並對應產生多個MS/MS圖譜,並利用Mascot分析程式將這些MS/MS圖譜於資料庫(NCBI 及UniProt)中進行檢索,進而得到這些分離胜肽的胺基酸序列及身分鑑定資訊,如表1及表2所示。
表1
序列編號 | 序列 | 分子量 |
SEQ ID NO:1 | KGWPGTPG | 798.40 |
SEQ ID NO:2 | PGAPGSSGPKG | 910.4509 |
SEQ ID NO:3 | VAEGAQGNIGPA | 1083.5196 |
SEQ ID NO:4 | NPGPHGQPGPPGP | 1224.5524 |
SEQ ID NO:5 | DKPLIPEGP | 964.5229 |
SEQ ID NO:6 | GPLGPIGPPGLP | 1070.6124 |
由表1可知,在一些實施例中,分離胜肽的胺基酸序列的分子量介於700Da至1300Da之間。在一些實施例中,分離胜肽的胺基酸序列的胺基酸數量為8~13個。
表2
序列編號 | 身分鑑定資訊 (中文/英文) |
SEQ ID NO:1 | 第四型膠原蛋白α-1鏈狀/ collagen alpha-1(IV) chain-like |
SEQ ID NO:2 | 第十四型膠原蛋白 / Collagen type XIV |
SEQ ID NO:3 | 致動蛋白家族成員21B / Kinesin family member 21B |
SEQ ID NO:4 | 持續神經叢 / Persistent plexus |
SEQ ID NO:5 | 肌原纖維蛋白,串聯重複2/ Titin, tandem duplicate 2 |
SEQ ID NO:6 | α1第五型前膠原蛋白/ Procollagen, type V, alpha 1 |
並且,由表2可知,分離胜肽的胺基酸序列為巴沙魚魚皮的胜肽片段。其中,SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2為巴沙魚魚皮的至少一膠原蛋白(Collagen)的胜肽片段、SEQ ID NO:6為前膠原蛋白(Procollagen)的胜肽片段、SEQ ID NO:3為致動蛋白家族成員21B(Kinesin family member 21B)的胜肽片段、SEQ ID NO:4為持續神經叢(Persistent plexus)的胜肽片段,以及SEQ ID NO:5為肌原纖維蛋白(Titin, tandem duplicate 2)的胜肽片段。於此可知,巴沙魚的魚皮膠原蛋白胜肽原料包含上述分離出來的6種胜肽的胺基酸序列,即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6。
範例三:胜肽合成
為驗證範例二所鑑定到的6種分離胜肽的胺基酸序列對於肌膚細胞的功效,於範例三中依據前述範例二鑑定所得的胺基酸序列(即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6)的胺基酸排列順序製備合成胜肽。使用合成方法為固相合成法(Fmoc-Solid Phase Peptide Synthesis),且使用的儀器為胜肽合成儀(型號Focus XC III 0,美國,廠牌AAPPTEC)。
以下以SEQ ID NO:6的胺基酸序列為例,已知SEQ ID NO:6的胺基酸序列為Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Pro-Gly-Leu-Pro。
步驟(1):首先,於反應管中置入樹脂,並依照每1公克樹脂加入15毫升的二氯甲烷(DCM),將樹脂浸泡在二氯甲烷中30分鐘以使樹脂於溶液中膨脹。
步驟(2):去除反應管內的二氯甲烷,並依照每1公克樹脂加入15毫升的20%呱啶二甲基甲醯胺(呱啶DMF)溶液至反應管中與樹脂反應5分鐘,接著去除反應管內溶液。再次依照每1公克樹脂加入15毫升的20%呱啶二甲基甲醯胺溶液至反應管中再次與樹脂反應15分鐘,以去除樹脂上保護基,得到去保護基的樹脂。
步驟(3):於再次去除反應管內的溶液後,從反應管內取出十幾粒樹脂進行檢測。首先,將樹脂以乙醇清洗三次,並加入茚三酮、苯酚溶液各一滴。於105℃至110℃加熱5分鐘,當茚三酮及苯酚溶液和樹脂反應皆變成深藍色時,為陽性反應,代表此時反應管內的樹脂為去保護基的樹脂,並可與胺基酸結合。
步驟(4):將去保護基的樹脂依照每1公克樹脂加入10毫升的二甲基甲醯胺至反應管內重複清洗6次。
步驟(5):將三倍過量的保護甘胺酸(Fmoc-Gly)及三倍過量的羥基苯並三唑(HOBt)以少量的二甲基甲醯胺溶解後,加入裝有去保護基的樹脂的反應管內反應90分鐘。
步驟(6):於90分鐘反應後,依照每1公克樹脂加入10毫升的二甲基甲醯胺至反應管內重複清洗3次接有胺基酸的樹脂。
接著,重複上述步驟(2)至(6),直到將其餘胺基酸(Pro、Leu、Gly、Pro、Ile、Gly、Pro、Pro、Gly、Leu、Pro)依序接起以形成胺基酸序列為SEQ ID NO:6的初合成胜肽。
步驟(7):依照每1公克樹脂加入10毫升的二甲基甲醯胺至反應管內重複清洗初合成胜肽3次、接著依照每1公克樹脂加入10毫升的二氯甲烷至反應管內清洗初合成胜肽3次,以及最後依照每1公克樹脂加入10毫升的乙醇至反應管內清洗初合成胜肽3次。
步驟(8):將清洗後的初合成胜肽以10克裂解液(86%三氟乙酸、4%苯甲硫醚、3%水、5%乙二硫醇(EDT)及2%苯酚)反應120分鐘,以分離初合成胜肽與樹脂。
步驟(9):藉由砂芯漏斗將含有初合成胜肽之裂解液與樹脂分離,接著將含有初合成胜肽之裂解液中加入相對前述裂解液八倍體積的乙醚中以進行反應。接著,以布氏漏斗進行抽濾分離以初合成胜肽及裂解液,並於抽乾含有裂解液的乙醚後以乙醚清洗初合成胜肽三次,此時初合成胜肽為固體。並且,於常溫中待乙醚揮發後得到乾燥的初合成胜肽。
步驟(10):取1毫克的乾燥的初合成胜肽以0.5毫升去離子水回溶後,取20毫升回溶後的初合成胜肽以HPLC系統(機型Hitachi Chromaster HPLC system, 廠牌Hitachi, Tokyo, Japan)進行分離並純化,以得到純合成胜肽。其中。於HPLC系統中設置C18管柱(廠牌Gemini-NX)並設定檢測長為220nm,並且HPLC系統中以緩衝溶液A(0.1% TFA溶於100%去離子水)及緩衝溶液B(0.1% TFA溶於100%ACN)依照線分離梯度進行混合以沖堤並分離出合成胜肽。分離梯度的設定值從為10%緩衝溶液B拉線性梯度到 90% ACN(溶於0.1%TFA)、流速設定為每分鐘流一毫升(1 mL/min)且分離時間設定為30分鐘。並且,依據HPLC色譜圖中計算各合成胜肽的鋒面積可得出合成胜肽之純度皆達95%以上。於此,可得到胺基酸序列為SEQ ID NO:6的合成胜肽。
同理,其餘胺基酸序列(即,SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5)亦依照前述流程,於步驟(1)後,重複上述步驟(2)至步驟(6)直到胺基酸接起形成對應的胺基酸序列。接著再進行步驟(7)至步驟(10)進行清洗、純化以得到乾淨(純度高達95%)的合成胜肽(即,SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:5)。
為進一步確認個別胺基酸序列對於細胞基因表現的影響,以人類纖維母細胞(CCD-966SK)與個別合成胜肽共同培養後分析細胞的基因表現。將6種合成胜肽分別進行細胞實驗,且6種合成胜肽的胺基酸序列分別為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6。於圖式中以序列編號SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6作為組別稱呼,以便於說明。
(一)實驗材料及實驗組別
細胞基因表現測試係將人類纖維母細胞(購自食工所)與待測物(如胜肽或組合物)進行共培養後,再收取細胞內的RNA進行分析。請參閱表3,細胞基因表現測試的組別分為8組,其中6組為胜肽實驗組(實驗組A至實驗組F)、1組為組合物實驗組(實驗組G),以及1組為控制組。並且,每一個組別係與1X105
個人類纖維母細胞共培養於裝有2毫升細胞培養基(X-VIVOTM 10)的細胞培養盤中。實驗組A至實驗組F分別對應6組各自加入範例三製成之6種合成胜肽(SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6)的6組胜肽實驗組。實驗組G為加入組合物的組合物實驗組,且此組合物是經範例二鑑定出來的6種胜肽(即SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6)的巴沙魚的魚皮膠原胜肽粉(購自Italgelatin, 義大利)。控制組則不添加胜肽或組合物。
表3
細胞基因表現測試組別 | 細胞培養基 (2 ml) | 測試細胞 (1X105 個) | 待測物 | |
SEQ ID NO:1胜肽實驗組 | 實驗組A | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入50 μg SEQ ID NO:1胜肽 |
SEQ ID NO:2胜肽實驗組 | 實驗組B | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入50 μg SEQ ID NO:2胜 |
SEQ ID NO:3胜肽實驗組 | 實驗組C | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入50 μg SEQ ID NO:3胜肽 |
SEQ ID NO:4胜肽實驗組 | 實驗組D | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入50 μg SEQ ID NO:4胜肽 |
SEQ ID NO:5胜肽實驗組 | 實驗組E | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入50μg SEQ ID NO:5胜肽 |
SEQ ID NO:6胜肽實驗組 | 實驗組F | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入50 μg SEQ ID NO:6胜肽 |
組合物實驗組 | 實驗組G | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入200 mg組合物 |
控制組 | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 不添加胜肽或組合物 |
(二)實驗設計
胜肽實驗組(對應實驗組A至實驗組F)係依照每一毫升細胞培養基中加入25微克(μg)合成胜肽的比例於37℃下培養人類纖維母細胞24小時、組合物實驗組(對應實驗組G)為每一毫升細胞培養基中加入100毫克(mg)的組合物的比例培養人類纖維母細胞24小時,而控制組不添加胜肽或組合物並以純細胞培養基培養人類纖維母細胞24小時。接著,於培養24小時後,各組去除含有胜肽的細胞培養基或純培養基,並以磷酸鹽緩衝液(PBS)清洗各組細胞以去除殘餘的培養基。取下清洗後的細胞並以細胞裂解液(購自Geanaid公司,台灣)破細胞後,再以RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司,台灣)萃取各組細胞內的RNA,接著以cDNA合成試劑(購自Geneaid公司,台灣)將萃取後的RNA翻轉錄成cDNA,並以聚合酶連鎖反應(PCR)儀器配合不同的引子(Primer)(如表4所示)觀察細胞內基因表現。此外,引子先以SYBR green Dye綠色螢光染劑(Applied Biosystem)反應,並使用2-ΔΔCt方法進行基因定量。需要特別說明的是,圖式中的基因表現以相對倍數、比率或百分比呈現,其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差,並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗(Student t-test)分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05,「**」代表p值小於0.01,以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時,代表統計上的差異越顯著。
表4
引子 | 序列編號 | 序列 |
COL3A1-F | SEQ ID NO:7 | TGGTTGCACGGTAGGAAACAT |
COL3A1-R | SEQ ID NO:8 | ACAGCCTTGCGTGTTCGATA |
COL4A4-F | SEQ ID NO:9 | CTGGGTGCTGTGTGTTTTGA |
COL4A4-R | SEQ ID NO:10 | TGAGTCTTGTTTTGCCCTGC |
HAS2-F | SEQ ID NO:11 | CGGTGCTCCAAAAAGGCAAA |
HAS2-R | SEQ ID NO:12 | ACACAATGAGTTGGGCGAGA |
HAS3-F | SEQ ID NO:13 | CACCCATGGGGGCTTAACTT |
HAS3-R | SEQ ID NO:14 | CTGCAGGTCCCAGTTCACAT |
Atg8-F | SEQ ID NO:15 | CCGCAGTAGGTGGCAAAGTA |
Atg8-R | SEQ ID NO:16 | GGAGTCGGAGAGGATTGCTG |
CCT2-F | SEQ ID NO:17 | CACTGGTGCGATTATTTG |
CCT2-R | SEQ ID NO:18 | CCCAGCAAATATCAGAAG |
CCT5-F | SEQ ID NO:19 | ATAAATGTGAGGCTGAATC |
CCT5-R | SEQ ID NO:20 | ACTTGTCACTTGTGGCAC |
CCT6A-F | SEQ ID NO:21 | TGTGTATCTTAATCCAGACTC |
CCT6A-R | SEQ ID NO:22 | CGTTTCACCTAAGAGTTGTC |
CCT7-F | SEQ ID NO:23 | GATTGGCCATTTAAGAAAC |
CCT7-R | SEQ ID NO:24 | CCATACCCAAACCTAAGC |
CCT8-F | SEQ ID NO:25 | ACCCGGAGGTGGAGCAA |
CCT8-R | SEQ ID NO:26 | GGACATGTCTCTCCATATGATGTGA |
Pink1-F | SEQ ID NO:27 | GTGGAACATCTCGGCAGGTT |
Pink1-R | SEQ ID NO:28 | CCTCTCTTGGATTTTCTGTAAGTGAC |
SIRT1-F | SEQ ID NO:29 | TGCTGGCCTAATAGAGTGGCA |
SIRT1-R | SEQ ID NO:30 | CTCAGCGCCATGGAAAATGT |
Ubl-5-F | SEQ ID NO:31 | CCTCTTCCTCGTTCTACCGC |
Ubl-5-R | SEQ ID NO:32 | CTAGCTGGAGCTCGAATCGC |
(三)胜肽實驗組對於抗老化基因的基因表現分析
首先,將6組胜肽實驗組(即實驗組A至實驗組F)與控制組進行抗老化基因測試,如圖1及表4所示。並且,肌膚的抗老化相關基因包括Atg8
基因(Gene ID:11345)、CCT2
基因(Gene ID:10576)、CCT5
基因(Gene ID:22948)、CCT6A
基因(Gene ID:908)、CCT7
基因(Gene ID:10574)、CCT8
基因(Gene ID:10694)、Pink1
基因(Gene ID:65018)、SIRT1
基因(Gene ID:23411)及Ubl-5
基因(Gene ID:59286)。
應理解,如表3所列,於圖式中標示為SEQ ID NO:1的等同於下文中所示的實驗組A,並以此類推,圖式中標示為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:6分別對應等同於下文中標示的實驗組A至實驗組F。
研究發現當線蟲的CCT2
、CCT5
、CCT6A
、CCT7
及CCT8
基因對應的mRNA增加時,會使線蟲的細胞回復成未分化之幹細胞,進而延長線蟲壽命。因此,當CCT2
、CCT5
、CCT6A
、CCT7
及CCT8
基因的表現量增加時,代表細胞的抗老化能力增加。再者,研究發現當突變DNA累積於細胞時會加速細胞老化,而提升Atg8
及Pink1
基因的表現量,有利於清除突變的DNA。因此,當Atg8
及Pink1
基因的表現量提升,可使細胞保持年輕的狀態。再者,研究發現SIRT1
基因可啟動粒線體的生合成並使細胞維持健康狀態。研究發現動物實驗證實Ubl-5
基因可回復粒線體活性,使年老的小鼠回復年輕時的狀態。
請參閱圖1。將實驗組A至實驗組F及控制組製作的cDNA,分別以Atg8-F HAS2-F(SEQ ID NO:15)及Atg8-R(SEQ ID NO:16)分析細胞內的Atg8
基因的表現、以CCT2-F(SEQ ID NO:17)及CCT2-R(SEQ ID NO:18)分析細胞內的CCT2
基因的表現、以CCT5-F(SEQ ID NO:19)及CCT5-R(SEQ ID NO:20)分析細胞內的CCT5
基因的表現、以CCT6A-F(SEQ ID NO:21)及CCT6A-R(SEQ ID NO:22)分析分析細胞內的CCT6A
基因的表現、以CCT7-F(SEQ ID NO:23)及CCT7-R(SEQ ID NO:24)分析分析細胞內的CCT7
基因的表現、以CCT8-F(SEQ ID NO:25)及CCT8-R(SEQ ID NO:26)分析分析細胞內的CCT8
基因的表現、以Pink1-F(SEQ ID NO:27)及Pink1-R(SEQ ID NO:28)分析分析細胞內的Pink1
基因的表現、以SIRT1-F(SEQ ID NO:29)及SIRT1-R(SEQ ID NO:30)分析分析細胞內的STIR1
基因的表現,以及以Ubl-5-F(SEQ ID NO:31)及Ubl-5-R(SEQ ID NO:32)分析分析細胞內的Ubl-5
基因的表現。實驗發現,SEQ ID NO:5對應的實驗組E及SEQ ID NO:6對應的實驗組F,相較於控制組的抗老化基因有明顯的提升,提升倍數如表5所示。
表5
抗老化基因 | SEQ ID NO:5 (實驗組E) | SEQ ID NO:6(實驗組F) |
Atg8 基因 | 提升5.13倍 | 提升4.28倍 |
CCT2 基因 | 提升5.86倍 | 提升5.71倍 |
CCT5 基因 | 提升6.03倍 | 提升6.76倍 |
CCT6A 基因 | 提升5.47倍 | 提升5.28倍 |
CCT7 基因 | 提升7.92倍 | 提升7.89倍 |
CCT8 基因 | 提升6.88倍 | 提升6.43倍 |
Pink1 基因 | 提升5.85倍 | 提升6.42倍 |
SIRT1 基因 | 提升6.62倍 | 提升6.52倍 |
Ubl-5 基因 | 提升5.24倍 | 提升5.16倍 |
由表5可知,實驗組E及實驗組F的抗老基因的基因表現量為控制組的抗老基因的基因表現量4至8倍。並且,當抗老化基因的基因表現量上升時,代表胜肽具有抗老化的能力。由於實驗組E及實驗組F中所示的2種胺基酸序列(SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:6)皆具有提高抗老化基因的能力,因此以其中至少一種胺基酸序列製備的組合物亦可用以提高抗老化基因的表現。並且,所製備的組合物可用以改善毛孔、改善皺紋或其組合。
(四)組合物實驗組對於膠原蛋白基因及玻尿酸合成酶基因的基因表現分析
接著,對組合物實驗組(即實驗組G)與控制組進行COL3A1
基因(Gene ID:1281)、COL4A4
基因(Gene ID:1286)、HAS2
基因(Gene ID:3037)及HAS3
基因(Gene ID:3038)的表現進行分析,如圖3及圖4所示。應理解,圖3及圖4所示的實驗組代表組合物實驗組(下稱實驗組G)。
COL3A1
基因為第三型膠原蛋白的基因,而COL4A4
基因為第四型膠原蛋白的基因,因此當二基因表現量提高時,代表對應的膠原蛋白含量提高。HAS2
基因及HAS3
基因為玻尿酸合成酶(Hyaluronan synthase)的基因,因此當二基因提升時,代表HAS含量提升,提高肌膚細胞間質抓水的能力,進而使肌膚含水量增加,達到保濕效果。
請參閱圖3。將實驗組G及控制組製作的cDNA,分別以COL3A1-F(SEQ ID NO:7)及COL3A1-R(SEQ ID NO:8)分析細胞內第三型膠原蛋白的基因表現,並以COL4A4-F(SEQ ID NO:9)及COL4A4-R(SEQ ID NO:10)分析細胞內第四型膠原蛋白的基因表現。實驗發現,實驗組G相對於控制組的比率為2,換言之,實驗組G的第三型膠原蛋白及第四型膠原蛋白的基因表現為控制組的二倍。
請參閱圖4。將實驗組G及控制組製作的cDNA,分別以HAS2-F(SEQ ID NO:11)和HAS2-R(SEQ ID NO:12)、HAS3-F(SEQ ID NO:13)及HAS3-R(SEQ ID NO:14)的二組引子進行HAS蛋白質的基因表現的分析。實驗發現,實驗組G相對於控制組的比率大約在1.5至2.5之間。換言之,實驗組G的HAS蛋白質基因表現高於控制組至少1.5倍。
於此,所製備的組合物可提升COL3A1
基因、COL4A4
基因、HAS2
基因及HAS3
基因的表現,並用以增加膠原蛋白含量、提升膠原蛋白密度、提升肌膚含水量,改善毛孔、改善皺紋或其組合。
接著,為進一步確認個別胺基酸序列對於細胞粒線體活性的影響,以人類纖維母細胞(CCD-966SK)與個別胜肽共同培養後分析細胞的粒線體活性。將6種合成胜肽分別進行細胞粒線體活性測試,且6種合成胜肽的胺基酸序列分別為SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6。於圖式中以序列編號SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6作為組別稱呼,以便於說明。
(五)粒線體活性測試實驗
粒線體活性測試係將人類纖維母細胞與待測物(如胜肽或組合物)進行共培養後,再以粒線體膜電位檢測套組(含有JC-1粒線體染劑,購自BD)處理共培養後的細胞。粒線體活性測試的組別分為7組,其中6組為胜肽實驗組,以及1組為控制組,如表6所示。
表6
粒線體活性測試組別 | 細胞培養基 (2 ml) | 測試細胞 (1X105 個) | 待測物 | |
SEQ ID NO:1胜肽實驗組 | 實驗組H | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入15μg SEQ ID NO:1胜肽 |
SEQ ID NO:2胜肽實驗組 | 實驗組I | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入10μg SEQ ID NO:2胜 |
SEQ ID NO:3胜肽實驗組 | 實驗組J | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入10 μg SEQ ID NO:3胜肽 |
SEQ ID NO:4胜肽實驗組 | 實驗組K | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入10 μg SEQ ID NO:4胜肽 |
SEQ ID NO:5胜肽實驗組 | 實驗組L | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入10 μg SEQ ID NO:5胜肽 |
SEQ ID NO:6胜肽實驗組 | 實驗組M | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 加入25 μg SEQ ID NO:6胜肽 |
控制組 | X-VIVOTM 10 | 人類纖維母細胞 | 不添加胜肽或組合物 |
應理解,實驗組H至實驗組M分別對應並等同於SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6。
首先,每一個組別(實驗組H至實驗組M及控制組)係與1X105
個人類纖維母細胞共培養於裝有2毫升細胞培養基(X-VIVOTM 10)的細胞培養盤中,接著依照表6中各組的待測物加入對應的培養盤中,並與人類纖維母細胞於37℃共培養24小時。控制組則以未添加胜肽的培養基於相同條件下共培養24小時。
再進行粒線體活性測試前,先配置JC-1粒線體染劑。首先,將10倍JC-1測定緩衝液以37℃預熱後,以1倍磷酸鹽緩衝溶液(PBS,購自Gibco)稀釋為1倍JC-1測定緩衝液,並於混合均勻後保持在37℃。於乾燥冷凍的JC-1試劑中加入130μl二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide, DMSO)以製備JC-1原液。接著,以1倍JC-1測定緩衝液將JC-1原液稀釋為千分之一(1/1000)以製備JC-1工作液。
於共培養24小時後,去除培養盤內的細胞培養基,並以PBS潤洗共培養後的細胞二次,以去處殘留的細胞培養基。以胰蛋白酶將細胞從培養盤中切下並收集製1.5毫升的微量離心管中,以400xg
離心5分鐘,以形成初次上清液及初次細胞沉澱物。去除初次上清液後,以PBS重新懸浮初次細胞沉澱物形成初次細胞液並將其轉移至1.5毫升離心管中。再次以400xg
離心5分鐘,以將初次細胞液分離為二次上清液及二次細胞沉澱物。接著,去除二次上清液後,加入100μl的JC-1工作液並與二次細胞沉澱物進行充分震盪混合形成二次細胞液,並避光室溫培育二次細胞液15分鐘。
於避光培育後,以400xg
離心二次細胞液5分鐘。接著重複以1倍JC-1測定緩衝液回溶及400xg
離心5分鐘二次以形成實驗組H至實驗組M的待測物。最後,將實驗組H至實驗組M的6組待測物及控制組的待測物以流式細胞儀(購自Beckman)進行粒線體活性測試分析,實驗結果如圖2所示。將結果以Excel軟體之STDEV公式計算標準差,並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗(Student t-test)分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05,「**」代表p值小於0.01,以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時,代表統計上的差異越顯著。
請參閱圖2。實驗發現SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6對應的實驗組I至實驗組M均提高細胞粒線體活性。舉例來說,相對於控制組,SEQ ID NO:2提高32.7%粒線體活性、SEQ ID NO:3提高25.6%粒線體活性、SEQ ID NO:4提高32.9%粒線體活性、SEQ ID NO:5提高26.7%粒線體活性,以及SEQ ID NO:6提高68.9%粒線體活性。當粒線體活性提高時,可使細胞維持健康狀態。因此,胺基酸序列為SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的胜肽皆可提高粒線體活性。因此,當組合物選用SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:6中至少一種或多種胺基酸序列的胜肽製備時,亦可提高粒線體活性。
因此,胜肽為SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列時,所製備抗老化的組合物可提升細胞粒線體活性。並且,所製備的組合物可用以改善肌膚狀態,如改善毛孔、改善皺紋或其組合。
為進一步確認以組合物對於人類肌膚的影響。以包括6種胺基酸序列(即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的6種胺基酸序列)的胜肽製備組合物。並且,以下測試人體功效的實驗所使用的組合物是經由範例一及範例二鑑定包含有6種胺基酸序列(即SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6)的胜肽的巴沙魚的魚皮膠原胜肽粉(購自Italgelatin, 義大利)。
(六)實驗組別與實驗設計
透過受試者每日服用組合物或市售魚膠原蛋白,並觀察4周後,以儀器(VISIA Complexion Analysis (Canfield Scientific, Inc., USA)及DermaLab®
Combo膠原蛋白探頭儀器)觀察受試者的肌膚狀況(皺紋、肌膚含水量及膠原蛋白密度),進而觀察組合物或市售魚膠原蛋白對於肌膚的影響。
受試者有13人,服用組合物的實驗組(7人)及服用市售魚膠原蛋白的對照組(6人)。並且,受試者須每日服用3g的組合物或市售魚膠原蛋白並連續服用4周。此外,需要特別說明的是,所稱「市售魚膠原蛋白」並非以巴沙魚的魚皮製備。
(七)人體功效
測試結果以第0周及第4周的數值一起比較。第0周係為測試前量測的數值,代表受試者所有人均未服用組合物市售魚膠原蛋白前的肌膚狀態。第4周係為連續服用四周後的數值。需要說明的是,實驗對應的圖式中的肌膚狀況是以相對百分比呈現,其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差,並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗(Student t-test)分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05,「**」代表p值小於0.01,以及「***」代表p值小於0.001。當p值小於0.05代表具有統計上的差異。
請參閱圖5。實驗發現對照組在連續服用4周的市售魚膠原蛋白皺紋並未減少,而實驗組在連續服用組合物後肌膚皺紋顯著下降12.3%。於此,相較於對照組,服用實驗組的組合物可有效改善皺紋(如,減少皺紋)。
此外,進一步比較實驗組及對照組的數值,如毛孔百分比(如圖6所示)、肌膚含水量百分比(如圖7所示)以及肌膚膠原蛋白密度(如圖8所示)。
請參閱圖6,藉由比較實驗組的第0周及第4周的毛孔百分比,可發現實驗組的數值從100%下降到83.3%,代表7位受試者的毛孔減少了16.7%。相反地,比較對照組的第0周及第4周的毛孔百分比時,發現數值從100%提高到108.9%,則代表6位受試者的毛孔百分比增加。於此,相較於對照組,服用實驗組的組合物可有效改善毛孔(如,減少毛孔)。
請參閱圖7,藉由比較實驗組的第0周及第4周的肌膚含水量百分比,可發現數值從100%提高到141.7%,代表7位受試者的肌膚含水量提高41.7%。相反地,比較對照組的第0周及第4周的肌膚含水量百分比時,則發現數值從100%提高到108.6%,則代表6位受試者的肌膚水分流失情形未有顯著改善。
請參閱圖8,藉由比較實驗組的第0周及第4周的胸部膠原蛋白密度百分比,可發現實驗組的第4周的數值相較於第0周提高了5.4%,代表7位受試者的胸部膠原蛋白密度百分比提高。而比較對照組的第0周及第4周的胸部膠原蛋白密度百分比時,則發現其第4周的數值相較於第0周下降了0.9%。換言之,組合物改善肌膚膠原蛋白密度的效果較市售魚膠原蛋白明顯。於此,相較於對照組,服用實驗組的組合物可有效提高膠原蛋白密度百分比。
於此,藉由包含多個胜肽為SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一項的胺基酸序列的胜肽製備抗老化的組合物,此組合物可用以提高抗老化基因表現或/及提升粒線體活性。並且,當組合物以包括6種胜肽(胺基酸序列分別為SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6)的胜肽製備時,此組合物具有提升提升Atg8
基因、CCT2
基因、CCT5
基因、CCT6A
基因、CCT7
基因、CCT8
基因、Pink1
基因、STIR1
基因、 Ubl-5
基因、COL3A1
基因、COL4A4
基因、HAS2
基因及HAS3
基因中至少一項基因表現的能力。並且,以具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列的胜肽所製備的組合物可具有下列至少一種功用:增加膠原蛋白含量、提升肌膚膠原蛋白密度、提高肌膚含水量、改善毛孔及改善皺紋。
綜上,根據本發明任一實施例之作為生物活性物質的胜肽,其可製備抗老化的組合物,且胜肽包括SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6中所示的至少一胺基酸序列。在一些實施例中,作為生物活性物質的胜肽可提升抗老化基因的表現及/或提升粒線體活性。在一些實施例中,作為生物活性物質的胜肽可用以提升Atg8
基因、CCT2
基因、CCT5
基因、CCT6A
基因、CCT7
基因、CCT8
基因、Pink1
基因、STIR1
基因、 Ubl-5
基因中至少一基因的表現及/或提升細胞粒線體活性。並且,所製備的組合物更可用於提升COL3A1
基因、COL4A4
基因、HAS2
基因及HAS3
基因中至少一基因的表現。並且,所製備的組合物具有抗老化、維持細胞健康的能力。並且,組合物更可用於增加膠原蛋白含量、提升肌膚膠原蛋白密度、提高肌膚含水量、改善毛孔或、改善皺紋或其組合。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上,然其並非用以限定本發明,任何熟習此技藝者,在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾,皆應涵蓋於本發明的範疇內,因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
無
圖1係本發明一些實施例中胜肽處理人類細胞後的抗老化基因群組的基因表現的倍數結果圖;
圖2係本發明一些實施例中胜肽處理人類細胞後的粒線體相對活性測試結果圖;
圖3係本發明一些實施例中實驗組及對照組的COL3A1
及COL4A4
基因表現的相對比率結果圖;
圖4係本發明一些實施例中實驗組及對照組的HAS2
及HAS3
基因表現的相對比率結果圖;
圖5係本發明一些實施例中實驗組及對照組於第0周及第4周之皺紋百分比結果圖;
圖6係本發明一些實施例中實驗組及對照組於第0周及第4周之毛孔百分比結果圖;
圖7係本發明一些實施例中實驗組及對照組於第0周及第4周之肌膚含水量百分比結果圖;以及
圖8係本發明一些實施例中實驗組及對照組於第0周及第4周之膠原蛋白密度百分比結果圖。
Claims (4)
- 一種生物活性物質用於製備增加膠原蛋白密度、增加肌膚含水量、改善毛孔及改善皺紋的組合物的用途,其中生物活性物質為魚皮原料的胜肽,該胜肽為SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:6的組合。
- 如請求項1所述之用途,其中該組合物用以調節COL3A1 基因、COL4A4 基因、HAS2 基因及HAS3 基因中至少一項基因。
- 如請求項1所述之用途,其中該魚皮原料為巴沙魚魚皮原料。
- 如請求項1所述之用途,其中該魚皮原料包括魚皮細胞、魚皮膠原蛋白或魚皮上的魚肉細胞。
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