TW202039497A - 7-(甲基胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺衍生物 - Google Patents

7-(甲基胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺衍生物 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種式I化合物：
Figure 108143067-A0101-11-0001-1
其中R為
Figure 108143067-A0101-11-0001-2
或

Description

7-(甲基胺基)吡唑并[1,5-A]嘧啶-3-甲醯胺衍生物
本發明係關於結合至TYK2之假激酶結構域(JH2)且抑制某些細胞介素信號傳導(尤其係IL-23及IFNα信號傳導)的某些新穎化合物、包含該等化合物之醫藥組合物、使用該等化合物治療諸如牛皮癬之某些自體免疫疾病之方法以及適用於合成該等化合物之中間體及方法。
本發明處於治療據認為藉由某些促炎性細胞介素之TYK2信號傳導而被介導之牛皮癬及/或其它自體免疫疾病(諸如糖尿病)的領域(參見例如J.S.Tokarski等人,J. Biol. Chem. , 第290(17)卷, 第11061-11074頁(2015)；及L.Marroqui等人,Diabetes , 第64卷, 第3808-3817頁(2015))。牛皮癬為慢性皮膚病，其經估計影響大約2%之普通人群。牛皮癬之治療選擇包括例如局部治療，諸如皮質類固醇；光電療法，諸如紫外線B (UVB)光照；及全身性治療，諸如甲胺喋呤及阿普斯特(apremilast)。不幸地，此類藥劑並不始終提供有效治療且可能與各種不良副作用相關。因此，在治療諸如牛皮癬、全身性紅斑性狼瘡症(SLE)及糖尿病之自體免疫疾病方面存在未滿足之需求，且需要新的治療選擇。
WO 2017/087590揭示某些咪唑并噠嗪化合物，其適用於藉由作用於TYK2以引起信號轉導抑制，經由調節IL-12、IL-23及/或IFNα來治療自體免疫病狀，諸如牛皮癬或SLE。美國專利第7,557,110號揭示作為激酶抑制劑之某些吡唑并[1,5-a]嘧啶衍生物，其適用於治療激酶介導之病症，諸如發炎性疾病及自體免疫疾病。R. Moslin等人,Med. Chem. Commun. , 第8卷, 第700-712頁(2017)揭示了某些咪唑并[1,2-b]噠嗪TYK2假激酶配位體，其作為TYK2信號傳導之強效及選擇性抑制劑。
需要對TYK2 JH2結構域起作用且抑制IL-23及IFNα之信號轉導的額外化合物。本發明提供結合至TYK2 JH2結構域之某些新穎化合物。另外，本發明提供抑制IL-23及IFNα信號傳導之某些新穎化合物。因此，本發明提供適用於治療諸如牛皮癬及SLE之自體免疫疾病之某些新穎化合物。
因此，本發明提供一種式I化合物：
Figure 02_image010
式I 其中R為
Figure 02_image012
； 或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明亦提供一種治療需要此類治療之患者之牛皮癬的方法，其包含向該患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。本發明進一步提供一種治療需要此類治療之患者之SLE的方法，其包含向該患者投與有效量之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。本發明進一步提供一種治療需要此類治療之患者之選自由以下組成之群的疾病的方法：發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克隆氏病(Crohn's Disease)、牛皮癬性關節炎、類風濕性關節炎(RA)、斑禿、異位性皮炎、軸向脊椎關節炎、多發性硬化症(MS)、1型糖尿病、2型糖尿病及成人隱匿性自身免疫糖尿病(LADA)，該方法包含向患者投與有效量之式I化合物或其藥學上可接受之鹽。此外，本發明提供一種用於療法(尤其用於治療牛皮癬)之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。另外，本發明提供一種用於治療SLE之式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽。本發明亦提供一種式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療選自由以下組成之群的疾病：發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克隆氏病、牛皮癬性關節炎、RA、斑禿、異位性皮炎、軸向脊椎關節炎、MS、1型糖尿病、2型糖尿病及成人隱匿性自身免疫糖尿病(LADA)。
本發明亦提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造治療牛皮癬之藥物。另外，本發明提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造治療SLE之藥物。本發明亦提供式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造治療選自由以下組成之群的疾病之藥物：發炎性腸病、潰瘍性結腸炎、克隆氏病、牛皮癬性關節炎、RA、斑禿、異位性皮炎、軸向脊椎關節炎、MS、1型糖尿病、2型糖尿病及成人隱匿性自身免疫糖尿病(LADA)。
本發明另外提供一種醫藥組成物，其包含式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明進一步提供一種用於製備醫藥組合物之方法，該方法包含混合式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。本發明亦包涵合成式I化合物之新穎中間體及方法。
本申請案主張2018年12月10日申請之美國臨時申請案第62/777,395序列號之35 U.S.C. §119(e)下之權益；其揭示內容以引用之方式併入本文中。
如本文中所使用，術語「治療(treating/treatment)」或「以治療(to treat)」包括限制、減緩、遏止或逆轉現有症狀或病症之進展或嚴重程度。
如本文中所使用，術語「患者」係指哺乳動物，尤其人類。
如本文中所使用，術語「有效量」係指當向患者投與單一或多種劑量時，在診斷或治療下於患者中提供所要效果之本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽的量或劑量。
有效量可由熟習此項技術者藉由使用已知技術且藉由在類似情況下獲得的觀測結果來確定。在確定用於患者之有效量中，主治診斷醫師考慮多個因素，包括(但不限於)：患者之物種；其體型、年齡及一般健康狀況；所涉及之特定疾病或病症；涉及程度或疾病或病症之嚴重程度；個別患者之反應；所投與之特定化合物；投與模式；所投與之製劑之生物可用性特徵；所選擇之劑量方案；伴隨藥療之使用；及其它相關情況。
本發明之化合物經調配為以任何使得化合物具有生物可用性之途徑投與的醫藥組合物。最佳地，此類組合物用於經口投與。此等醫藥組合物及其製備方法在此項技術中已熟知(參見例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, L.V. Allen, 編者, 第22版, Pharmaceutical Press, 2012)。
式I化合物或其醫藥學上可接受之鹽尤其適用於本發明之治療方法，其中所有組態(包括對映異構體)及其混合物(包括外消旋體)均涵蓋於本發明之範疇內。應瞭解此等組態可適用於本發明之治療方法及化合物。
本發明之化合物包括：
Figure 02_image014
式Ia，
Figure 02_image016
式Ia(i)，
Figure 02_image018
式Ia(ii)，
Figure 02_image020
式Ib，
Figure 02_image022
式Ib(i)，		 及
Figure 02_image024
式Ib(ii)；
及其醫藥學上可接受之鹽。
式Ia(ii)及式Ib(ii)之化合物為較佳的，其中式Ia(ii)之化合物及其醫藥學上可接受之鹽為尤其較佳的。
以下製備中所描述之某些中間物可含有一或多個氮保護基。應理解，保護基可按熟習此項技術者所瞭解，視待執行之特定反應條件及特定變換而變化。保護及去保護條件已為熟習此項技術者所熟知且描述於文獻中(參見例如「Greene' s Protective Groups in Organic Synthesis 」, 第四版本, Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007)。
包括對映異構體之單獨的異構體可由一般熟習此項技術者在合成本發明之化合物中之任何適宜點處藉由諸如選擇性結晶技術或對掌性層析之方法來分離或分解(參見例如 J. Jacques, 等人, 「Enantiomers, Racemates, and Resolutions 」, John Wiley and Sons, Inc., 1981, 及E.L. Eliel及S.H. Wilen,「Stereochemistry of Organic Compounds 」, Wiley-Interscience, 1994)。
本發明化合物之醫藥學上可接受之鹽可例如藉由本發明化合物之適當的游離鹼、於合適溶劑(諸如乙醚)中之適當的醫藥學上可接受之酸在此項技術中所熟知的標準條件下反應形成。另外，可在氮保護基去保護時同時進行此類醫藥學上可接受之鹽之形成。參見例如，Gould, P.L., 「Salt selection for basic drugs」,International Journal of Pharmaceutics ,33 : 201-217 (1986)； Bastin, R.J., 等人, 「Salt Selection and Optimization Procedures for Pharmaceutical New Chemical Entities」,Organic Process Research and Development ,4 : 427-435 (2000)；及 Berge, S.M., 等人, 「Pharmaceutical Salts」,Journal of Pharmaceutical Sciences ,66 : 1-19, (1977)。
某些縮寫定義如下：「BINAP」係指(±)-2,2'-雙(二苯膦基)-1,1'-聯二萘；「BOP」係指(苯并三唑-1-基氧基))參(二甲胺基)六氟磷酸鏻；「BrettPhos」係指二環己基[3,6-二甲氧基-2',4',6'-參(1-甲基乙基)[1,1'-聯苯]-2-基]膦；「第三BuOH」係指第三丁醇(t- butanol)及第三丁醇(t- butyl alcohol)；「BSA」係指牛血清白蛋白；「CDI」係指1,1'-羰基二咪唑；「DCC」係指1,3-二環己基碳化二亞胺；「DCE」係指二氯乙烷；「DCM」係指二氯甲烷；「DEM」係指丙二酸二乙酯；「DIC」係指1,3-二異丙基碳化二亞胺；「DIEA」係指N,N-二異丙基乙胺；「DMAP」係指二甲基胺基吡啶；「DMEM」係指達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)；「DMF」係指N,N-二甲基甲醯胺；「DMSO」係指二甲亞碸；「DPPA」係指疊氮磷酸二苯酯；「EDCI」係指1-(3-二甲基胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽；「EtOAc」係指乙酸乙酯；「EtOH」係指乙醇(ethanol)及乙醇(ethyl alcohol)；「FBS」係指胎牛血清；「格拉布氏催化劑(Grubbs catalyst)第2代」係指(1,3-雙(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑啶亞基)二氯(苯基亞甲基)(三環己基膦)釕；「HATU」係指1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸酯；「HBTU」係指(1H-苯并三唑-1-基氧基)(二甲胺基)-N,N-二甲基甲銨六氟磷酸酯；「HEPES」係指4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸；「HOAt」係指1-羥基-7-偶氮苯并三唑；「HOBt」係指水合1-羥基苯并三唑；「HPLC」係指高效液相層析；「IFNα」係指干擾素α；「IL-12」係指介白素12；「IL-23」係指介白素23；「IPA」係指異丙醇(isopropanol)及異丙醇(isopropyl alcohol)；「JAK」係指JANUS激酶；「LiHMDS」係指雙(三甲基矽烷)胺基鋰；「MeI」係指碘代甲烷；「MeNH2 」係指甲胺「MeOH」係指甲醇(methanol)及甲醇(methyl alcohol)；「MTBE」係指甲基第三丁基醚；「NaOEt」係指乙醇鈉；「Ni NTA」係指鎳-氮基三乙酸；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「Pd(dppf)Cl2 」係指(1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵)二氯化鈀(II)；「Pd(OAc)2 」係指乙酸鈀(II)「PyBOP」係指(苯并三唑-1-基-氧基三吡咯啶基六氟磷酸鏻)；「PyBrOP」係指溴(三-吡咯啶基)六氟磷酸鏻；「RPM」係指轉/分鐘；「RPMI」係指洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute)；「SPA」係指閃爍近接分析(scintillation proximity assay)；「TEA」係指三乙胺；「TFA」係指三氟乙酸；「THF」係指四氫呋喃；「TYK2」係指酪胺酸激酶2；「UVB」係指紫外線B；「STAT」係指信號轉導及轉錄激活蛋白；且「YSI」係指矽酸釔。
本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽可藉由一般技術者已知之各種程序製備，其中一些在以下流程、製備及實例中加以說明。以下方案中各步驟之產物可利用此項技術中熟知之常規方法回收，包括萃取、蒸發、沈澱、層析、過濾、研磨及結晶。在以下方案中，除非另外指示，否則所有取代基均如先前所定義。試劑及起始材料可為一般熟習此項技術者容易獲得。在不限制本發明之範疇的情況下，提供以下流程、製備方案及實例進一步說明本發明。
流程 1
Figure 02_image026
流程1步驟A描繪將DEM添加至化合物(1)中且隨後在約80℃下在諸如EtOH之溶劑中使用諸如NaOEt或第三丁醇鉀之適合鹼將化合物(1)環化成化合物(2)。
在步驟B中，可在約50-100℃下在諸如乙腈之適合溶劑中使用諸如POCl3 之適合氯源及諸如吡啶之適合有機鹼，將化合物(2)之7-羥基及5-側氧基氯化，以得到化合物(3)。
在步驟C中，可在此項技術中所熟知之條件下使用諸如1-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-甲胺之親核試劑及諸如DIEA之適合有機鹼，在環境溫度下在諸如1,4-二噁烷之適合溶劑中進行化合物(3)之7-氯基上的選擇性親核芳族取代，以得到化合物(4)。
在步驟D中，可在此項技術中所熟知之條件下使用適合催化劑及配位體組合(諸如Pd(OAc)2 與BrettPhos)及適合鹼(諸如碳酸鉀)，在約130℃下在諸如1,4-二噁烷之溶劑中微波加熱，對化合物(4)與胺(諸如二氫苯并哌喃-8-胺鹽酸鹽或6-甲基吡啶-2-胺)進行Buchwald偶合，以形成化合物(5)。
可在諸如1,4-二噁烷及MeOH之溶劑中在約50-80℃下用NaOH水溶液處理化合物(5)，以經由酯之鹼性水解得到化合物(6)，如步驟E中所示。
在步驟F中，可在化合物(6)及胺(諸如(3R)-3-胺基-1-甲基-吡咯啶-2-酮)之間使用適合有機鹼(諸如DIEA)及適合偶合劑(諸如BOP)在適合溶劑(諸如DMF)中進行醯胺偶合，以得到化合物(7)。熟習此項技術者將認識到，存在若干用於由羧酸及胺之反應產生之醯胺形成的適當方法。舉例而言，胺化合物與適當羧酸在具有或不具有有機鹼(諸如DIEA或TEA)之偶合劑存在下之反應可提供步驟F之化合物。偶合試劑包括碳二醯亞胺，諸如DCC、DIC、EDCI或羰基二咪唑，諸如CDI。亦可使用醯胺偶合添加劑(諸如HOBt及HOAt)增強反應。另外，可使用非親核陰離子之脲或鏻鹽(諸如HBTU、HATU、PyBOP及PyBrOP)替代更多的傳統偶合試劑。可以使用諸如DMAP之添加劑增強反應。
在步驟G中，在標準條件下使用適合之酸(諸如TFA)在適合之溶劑(諸如DCE)中在約50℃下脫除化合物(7)之保護基，以得到式I化合物。
流程 2
Figure 02_image028
在流程2步驟A中，使用適合催化劑(諸如Pd(dppf)Cl2 )及適合鹼(諸如碳酸鉀)在約90℃下在諸如1,4-二噁烷之適合溶劑系統中，將化合物(9)之形成展示為介於化合物(8)與乙烯基三氟硼酸鉀之間的鈴木-宮浦交叉偶合。
在步驟B中，在此項技術中所熟知之條件下在約60℃下使用適當鹼(諸如碳酸鉀)而在化合物(9)與烯丙醇之間描繪親核芳族取代，以得到化合物(10)。
化合物(10)之催化閉環複分解展示於步驟C中，其在諸如DCM之適當溶劑中使用適當催化劑(諸如格拉布氏催化劑第2代)，以得到化合物(11)。
在步驟D中，在此項技術中熟知之條件下，在氫氣氛圍下在諸如MeOH及THF之適合溶劑系統中使用諸如10%鈀/碳之適當催化劑來描繪化合物(11)之鈀催化之硝基/烯烴還原，以得到化合物(12)。
流程 3
Figure 02_image030
在流程3步驟A中，如流程1步驟F中一般所述，化合物(14)之形成展示為在此項技術中熟知之條件下的醯胺偶合，其在0-22℃下在諸如DMF之溶劑中在化合物(13)與MeNH2 之間使用諸如DIEA之適合有機鹼及諸如HATU之適合偶合劑。
在步驟B中，向化合物(14)中添加MeI以形成碘化二甲基鋶鹽，隨後在0-22℃下用諸如LiHMDS之適合鹼在諸如THF之適合溶劑中進行處理，可以此得到環化化合物(15)。
在步驟C中，在標準條件下使用適合酸(諸如4-甲基苯磺酸)在適合溶劑(諸如乙腈)中在約55℃下脫除化合物(15)之保護基，隨後添加溶劑(諸如MTBE)以使化合物(16)沈澱。
流程 4
Figure 02_image032
亦可如流程4中所闡述利用一般熟習此項技術者容易瞭解之適當對應的起始物質來製備諸如式Ia(ii)及Ib(ii)之式I化合物。更特定言之，舉例而言，在流程4步驟A中，可在此項技術中所熟知之條件下使用適當親核試劑(諸如MeNH2 )在適合溶劑(諸如THF)中在環境溫度下進行化合物(3)之7-氯基的選擇性親核芳族取代，以得到化合物(17)。
在流程4步驟A中，可在此項技術中所熟知之條件下使用適當親核試劑(諸如MeNH2 )在適合溶劑(諸如THF)中在環境溫度下進行化合物(3)之7-氯基的選擇性親核芳族取代，以得到化合物(17)。
在步驟B中，可在125℃下加熱，在具有化合物(12)之化合物(17)上使用適合催化劑及配位體系統(諸如氯化烯丙基鈀(II)二聚體及BINAP)，用諸如乙酸鉀之適合鹼在諸如1,4-二噁烷及2-甲基-2丁醇之適當溶劑系統中進行Buchwald偶合，以形成化合物(18)。
如步驟C中所示，可在回流下用諸如LiOH水溶液之適合的鹼在諸如MeOH及THF之適合溶劑系統中處理化合物(18)，以經由酯之鹼性水解得到化合物(19)。
步驟D描繪式Ia(ii)之形成，如流程1步驟F中一般所述，其經由在此項技術中熟知之條件下在化合物(19)與化合物(16)之間使用諸如DIEA之適合有機鹼及諸如BOP之適合偶合劑在諸如DMF之溶劑中進行醯胺偶合而形成。
製備 1 7-羥基-5-側氧基-4H-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
Figure 02_image034
流程1步驟A：將5-胺基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(12.5 g，80.6 mmol)及DEM(18.5 mL，121 mmol)溶解於EtOH(90 mL)中。向此混合物中添加NaOEt(21質量%/EtOH，45.1 mL，121 mmol)且在90℃下攪拌反應物24小時。此後，將反應物冷卻至環境溫度。接著用5 N HCl水溶液使混合物呈酸性且過濾所得沈澱，得到呈白色固體狀之標題化合物(11.7 g，65.1%)。ES/MSm/z 224 (M+H)。
替代製備 1 流程1步驟A：在25℃下在氮氣下向含5-胺基-1H-吡唑-4-甲酸乙酯(400 g，2.58 mol)及DEM(584 mL，3.87 mol)之EtOH(6.00 L)溶液中添加第三丁醇鉀(578 g，5.16 mol)。在80℃下攪拌溶液12小時且接著使反應物冷卻至22℃。用0.1 N HCl(2 L)稀釋反應混合物且用5 N HCl將pH調節至3。將混合物過濾並將濾餅用水(800 mL)洗滌。在真空下乾燥固體至恆重，得到呈灰白色固體狀之標題化合物(460 g，81%)。ES/MSm/z 224 (M+H)。
製備 2 5,7-二氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
Figure 02_image036
流程1步驟B：將7-羥基-5-側氧基-4H-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(11.7 g，52.4 mmol)懸浮於乙腈(50 mL)中且用氮氣淨化5分鐘。在50℃下向此混合物中添加POCl3 (14.8 mL，157 mmol)，隨後添加吡啶(4.28 mL，52.4 mmol)，且接著在100℃下攪拌反應物5小時。此後，將反應物冷卻至環境溫度且傾入冰/水混合物中。用飽和碳酸氫鈉水溶液中和此混合物且過濾所得沈澱，得到呈白色固體狀之標題化合物(13 g，95.3%)。ES/MSm/z (35 Cl/37 Cl) 260/262 [M+H]+ 。
替代製備 2 流程1步驟B：在氮氣下，在50℃下向含7-羥基-5-側氧基-4H-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(400 g，1.79 mol)之乙腈(2 L)懸浮液中逐滴添加POCl3 (416 mL，4.48 mol)及吡啶(217 mL，2.69 mol)。在80℃下攪拌反應物12小時。蒸發反應混合物且將殘餘物傾入水(2 L)中。過濾反應混合物且用水(800 mL)洗滌固體。在真空下乾燥固體至恆重，得到呈橙色固體狀之標題化合物(360 g，66%)。ES/MSm/z (35 Cl/37 Cl) 260/262 [M+H]+ 。
製備 3 5-氯-7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
Figure 02_image038
流程1步驟C：將5,7-二氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(5 g，19.2 mmol)溶解於1,4-二噁烷(40 mL)中。向此混合物中添加1-(4-甲氧基苯基)-N-甲基-甲胺(3.5 g，20 mmol)，隨後添加DIEA(6.7 mL，38.4 mmol)且在環境溫度下攪拌反應物2小時。此後，用水(100 mL)將反應物淬滅且用EtOAc(3×100 mL)萃取。接著經硫酸鎂乾燥組合之有機物，過濾且蒸發。此殘餘物經由矽膠層析(0-70% EtOAc/己烷)純化，得到呈黏稠透明油狀之標題化合物，其靜置後固化成白色固體(3.55 g，49.3%)。ES/MSm/z (35 Cl/37 Cl) 375/377 [M+H]+ 。
製備 3a 5-氯-7-(甲胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
Figure 02_image040
流程4步驟A：將5,7-二氯吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(50.0 g，192 mmol)添加至THF(250 mL)中且將溶液冷卻至10℃。接著添加MeNH2 (33% w/w/EtOH)溶液(79 mL，634 mmol)，保持溫度低於20℃。攪拌反應混合物且升溫至22℃，且攪拌4小時。接著添加水(300 mL)且再攪拌混合物1小時。
藉由過濾收集所得固體且用THF/水混合物(2:3)(100 mL)及水(400 mL)洗滌。接著在真空(10 mbar/50℃)下乾燥固體至恆重，得到呈淡棕色固體狀之標題化合物(49.5 g，90%)。ES/MSm/z (35 Cl/37 Cl) 255/257 [M+H]+ 。
製備 4 2-氟-1-硝基-3-乙烯基-苯
Figure 02_image042
流程2步驟A：向燒瓶中充入乙烯基三氟硼酸鉀(17 g，120.6 mmol)、碳酸鉀(40 g，286.5 mmol)及Pd(dppf)Cl2 (2 g，2.7 mmol)。將燒瓶抽成真空且用氮氣回填三次。添加1,4-二噁烷(450 mL)、水(140 mL)及1-溴-2-氟-3-硝基苯(20 g，90.1 mmol)。再次將燒瓶抽成真空且用氮氣回填。將反應混合物加熱至90℃持續3.5小時，且接著使其冷卻至室溫。分離各層且用飽和氯化鈉水溶液洗滌有機層，用硫酸鈉將其乾燥，過濾且蒸發。殘餘物經由矽膠層析(0-10% EtOAc/己烷)純化，得到呈淡黃色油狀之標題化合物(13.1 g，84%)。1 H NMR (d6 -DMSO) δ 8.09-8.03 (m，2H)，7.44 (t，J= 8.0 Hz，1H)，6.91 (dd，J= 11.2，17.7 Hz，1H)，6.08 (d，J= 17.7 Hz，1H)，5.62 (d，J= 11.2 Hz，1H)。
製備 5 2-烯丙氧基-1-硝基-3-乙烯基-苯
Figure 02_image044
流程2步驟B：將烯丙醇(18.8 g，323 mmol)、2-氟-1-硝基-3-乙烯基-苯(12.2 g，69.3 mmol)及碳酸鉀(31 g，224 mmol)之混合物加熱至60℃持續16小時，且接著使其冷卻至室溫。用EtOAc(300 mL)稀釋混合物且濾出固體並將其丟棄。蒸發濾液且經由矽膠層析(0-15% EtOAc/己烷)純化，得到呈油狀之標題化合物(13.4 g，88%)。ES/MSm/z 206 (M+H)。
製備 6 8-硝基-2H-苯并哌喃
Figure 02_image046
流程2步驟C：向含2-烯丙氧基-1-硝基-3-乙烯基-苯(13.4 g，65.3 mmol)之DCM(500 mL)中添加格拉布氏催化劑第2代(300 mg，0.3 mmol)。用氮氣沖洗燒瓶且在室溫下攪拌6小時。接著蒸發混合物且經由矽膠層析(0-20% EtOAc/己烷)純化，得到呈蠟狀黃色固體狀之標題化合物(10.6 g，91%)。ES/MSm/z 178 (M+H)。
製備 7 二氫苯并哌喃-8-胺
Figure 02_image048
流程2步驟D：在室溫下在氫氣氛圍下攪拌含8-硝基-2H-苯并哌喃(22.2 g，125 mmol)及10% Pd/碳(600 mg，0.53 mmol)之MeOH(350 mL)及THF(350 mL)之混合物。在4小時之後，添加含10% Pd/碳(450 mg，0.4 mmol)之EtOAc(15 mL)漿料且在室溫下在氫氣氛圍下再攪拌混合物16小時。過濾混合物且蒸發濾液，得到呈油狀之標題化合物(17.6 g，92%)。ES/MSm/z 150 (M+H)。
製備 8 N-[(1R)-1-(甲基胺甲醯基)-3-甲基磺醯基-丙基]胺基甲酸第三丁酯
Figure 02_image050
流程3步驟A：將含(第三丁氧基羰基)-D-甲硫胺酸(400 g，1.6 mol)、鹽酸甲胺(162.47 g，2.4 mol)及DIEA(700 mL，4.01 mol)之DMF(4 L)溶液冷卻至0℃且添加HATU(732.1 g，1.92 mol)。使反應物升溫至環境溫度。在攪拌2小時之後，蒸發溶劑。接著添加水(10 L)，且用DCM(2×3 L)萃取水溶液。組合有機層，將其用飽和碳酸氫鈉水溶液(3 L)洗滌，經硫酸鈉乾燥且蒸發。藉由矽膠層析將用EtOAc/己烷溶離之所得殘餘物純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(368 g，87%)。ES/MSm/z 263 (M+H)。
製備 9 N-[(3R)-1-甲基-2-側氧基-吡咯啶-3-基]胺基甲酸第三丁酯
Figure 02_image052
流程3步驟B：在環境溫度下攪拌N-[(1R)-1-(甲基胺甲醯基)-3-甲基磺酸基-丙基]胺基甲酸第三丁酯(368 g，1.40 mol)與MeI(3.68 L，59.11 mol)之混合物18小時。接著，蒸發混合物。將部分所得粗碘化二甲基鋶鹽(210 g，0.52 mol)溶解於THF(4.7 L)中，在氮氣氛圍下冷卻至0℃，且逐滴添加LiHMDS(1.00 M溶液/THF，1.16 L，1.16 mol)。接著使反應混合物升溫至環境溫度。在4小時之後，添加水(2.4 L)且將溶劑蒸發至一半體積。用DCM(2×3 L)萃取混合物。組合且蒸發有機物。藉由矽膠層析將用MeOH/DCM溶離之殘餘物純化，得到呈白色固體狀之標題化合物(50 g)。ES/MSm/z 215 (M+H)。對掌性HPLC：Rt(滯留時間)=9.13分鐘；LC管柱：ChiralPAc IA OD 4.6×250 mm 5 µm；等度：0.1%二乙胺/己烷/乙醇(85/15)；管柱溫度：25℃；流動速率：1.0 mL/min。旋光度：[α]D 20 = +53 ° (C=0.5, MeOH)。
製備 10 (3R)-3-胺基-1-甲基-吡咯啶-2-酮；對甲苯磺醯基鹽
Figure 02_image054
流程3步驟C：在55℃下加熱N-[(3R)-1-甲基-2-側氧基-吡咯啶-3-基]胺基甲酸第三丁酯(46 g，214.69 mmol)與含4-甲基苯磺酸(74.5 g，433 mmol)之乙腈(500 mL)之混合物且攪拌4小時。接著，添加MTBE(1 L)，且使混合物冷卻至22℃。藉由過濾收集所得固體，用額外MTBE洗滌且在真空下乾燥至恆重，得到呈白色固體狀之標題化合物(60 g，95%)。ES/MSm/z 115 (M+H)。旋光度：[α]D 20 = +31.3 ° (C=0.5, MeOH)。
製備 11 5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基)-7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
Figure 02_image056
流程1步驟D：向火焰乾燥之微波小瓶中添加5-氯-7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(400 mg，1.1 mmol)、二氫苯并哌喃-8-胺鹽酸鹽(240 mg，1.2 mmol)、碳酸鉀(450 mg，3.3 mmol)、BrettPhos(60 mg，0.1 mmol)及Pd(OAc)2 (20 mg，0.1 mmol)。將小瓶抽成真空且用氮氣回填三次。添加1,4-二噁烷(4.5 mL)且再次用氮氣沖洗小瓶。將混合物微波至130℃持續25分鐘，冷卻至室溫，用MeOH(20 mL)稀釋，經由矽藻土過濾且蒸發。所得殘餘物經由矽膠層析(0-40% EtOAc/己烷)純化，得到呈油狀之標題化合物(232 mg，42%)。ES/MSm/z 488 (M+H)。
以下化合物以基本上類似於製備11之方法的方式製備。 表1
製備編號 化學名稱 結構 物理數據
12 7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]-5-[(6-甲基-2-吡啶基)胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
Figure 02_image058
 ES/MSm/z 447 (M+H)。
製備 11a 5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基)-7-(甲胺基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯
Figure 02_image060
流程4步驟B：向壓力燒瓶中裝入5-氯-7-(甲胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(14 g，55 mmol)、BINAP(2.1 g，3.3 mmol)、氯化烯丙基鈀(II)二聚體(620 mg，1.7 mmol)及乙酸鉀(10.8 g，110 mmol)，接著用氮氣沖洗。向混合物中添加已用氮氣充氣10分鐘之含二氫苯并哌喃-8-胺(9 g，60 mmol)之1,4-二噁烷(160 mL)溶液，隨後添加2-甲基丁-2-醇(20 mL)。用氮氣沖洗燒瓶且在125℃下加熱。2小時後，將混合物冷卻至室溫且用EtOAc(300 mL)稀釋。經由矽藻土過濾混合物且蒸發。將殘餘物分配於EtOAc與飽和碳酸氫鈉水溶液之間。用飽和氯化鈉水溶液洗滌有機層，經硫酸鈉乾燥，過濾且蒸發得到紅色半固體。向此殘餘物中添加DCM(85 mL)且攪拌混合物5分鐘。收集所得固體，將其用額外DCM洗滌，且在室溫下在真空下乾燥，得到淺桃色材料。將濾液濃縮至60 mL總體積且攪拌5分鐘。收集所得固體，將其用額外DCM洗滌，與先前的一批固體組合，且在真空下乾燥，得到11.2 g產物。經由矽膠層析(0-50% EtOAc/己烷)純化剩餘濾液，得到額外3.8 g產物。組合所有收集之固體，得到標題化合物(15.0 g，74%)。ES/MSm/z 368.0 (M+H)。
製備 13 5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基))-7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸
Figure 02_image062
流程1步驟E：在50℃下攪拌5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基)-7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(232 mg，0.45 mmol)、5 N NaOH(1 mL，5 mmol)、MeOH(4 mL)及1,4-二噁烷(4 mL)之混合物。在16小時之後，使反應物冷卻至室溫且蒸發。向殘餘物中添加DCM(25 mL)、水(10 mL)及5 N HCl(1 mL)。在五分鐘之後，分離各層。用飽和氯化鈉水溶液洗滌有機層，其經硫酸鈉乾燥，過濾且蒸發，得到呈淡黃色固體狀之標題化合物(184 mg，88%)。ES/MSm/z 460 (M+H)。
製備 13a 5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基)-7-(甲胺基)-吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸
Figure 02_image064
流程4步驟C：向含5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基)-7-(甲胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(21.8 g，59 mmol)之MeOH(200 mL)及THF(25 mL)中添加含LiOH(5.7 g，240 mmol)之水溶液(120 mL)。在氮氣下將混合物加熱至回流持續一小時，且接著使其冷卻至室溫。藉由添加5 N HCl將pH調節至約2。將冰(125 g)添加至混合物中且將燒瓶置放於冰水浴中。在攪拌30分鐘之後，過濾所得固體，用冰冷水(75 mL)將其洗滌，且在室溫下在真空下乾燥，得到呈淡茶色固體狀之標題化合物(18.2 g，90%)。ES/MSm/z 340.0 (M+H)。
製備 14 7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]-5-[(6-甲基-2-吡啶基)胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸
Figure 02_image066
流程1步驟E：在80℃下攪拌7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]-5-[(6-甲基-2-吡啶基)胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸乙酯(538 mg，1.1 mmol)、5 N NaOH(0.8 mL，4 mmol)、MeOH(5 mL)及1,4-二噁烷(5 mL)之混合物。在4小時之後，將混合物冷卻至室溫且攪拌隔夜。接著用水(50 mL)稀釋混合物且用5 N HCl將pH調節至約3。過濾所得固體且將其在室溫下在真空下乾燥，得到呈米色固體狀之標題化合物(493 mg，99+%)。ES/MSm/z 419 (M+H)。
製備 15 5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基)-7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]-N-[(3R)-1-甲基-2-側氧基-吡咯啶-3-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺
Figure 02_image068
流程1步驟F：向含5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基)-7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲酸(188 mg，0.4 mmol)、(3R)-3-胺基-1-甲基-吡咯啶-2-酮(75 mg，0.6 mmol)及DIEA(0.15 mL，0.9 mmol)之DMF(4 mL)之混合物中添加BOP(300 mg，0.7 mmol)。在室溫下攪拌30分鐘之後，使反應混合物分配於EtOAc與水之間。用飽和氯化鈉水溶液洗滌有機層，用硫酸鈉將其乾燥，過濾且蒸發。經由矽膠層析(0-40% MeOH/EtOAc)純化所得殘餘物，得到呈白色固體狀之標題化合物(191 mg，84%)。ES/MSm/z 556 (M+H)。
以下化合物以基本上類似於製備15之方法的方式製備。 表2
製備編號 化學名稱 結構 物理數據
16 7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]-N-[(3R)-1-甲基-2-側氧基-吡咯啶-3-基]-5-[(6-甲基-2-吡啶基)胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺
Figure 02_image070
 ES/MSm/z 515 (M+H)。
製備 17 用於TYK2-JH2示蹤劑結合分析之示蹤劑之製備 (2E)-2-[(2E,4E)-5-[3-[6-[4-[4-[[5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-6-(甲基胺甲醯基)-1,2,4-三嗪-3-基]胺基]吡唑-1-基]-1-哌啶基]-6-側氧基-己基]-3-甲基-5-磺酸根基-1-(3-磺酸根丙基)吲哚-1-鎓-2-基]五-2,4-亞二烯基]-3,3-二甲基-1-(3-磺酸根丙基)吲哚啉-5-磺酸鹽；三乙銨 將2-甲氧基3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺(5.95 g，29.1 mmol)添加至含5-氯-3-甲基磺酸基-1,2,4-三嗪-6-甲酸乙酯(6.8 g，29.0 mmol)之NMP(20 mL)中，且在室溫下攪拌。在90分鐘之後，添加乙醚(100 mL)且攪拌混合物15分鐘。過濾所得固體且用乙醚洗滌。將固體分配於DCM與飽和碳酸氫鈉水溶液之間。進一步用飽和氯化鈉水溶液洗滌有機層，其經硫酸鈉乾燥，過濾且蒸發，得到呈淡黃色固體狀之5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-3-甲基磺醯基-1,2,4-三嗪-6-甲酸乙酯(10.12 g，82%)。ES/MSm/z 402.2 (M+H)。
在室溫下在含2 M MeNH2 之THF(75 mL，150 mmol)中攪拌5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-3-甲基磺醯基-1,2,4-三嗪-6-甲酸乙酯(10.12 g，23.7 mmol) 4小時。添加乙醚(100 mL)且攪拌混合物15分鐘。收集所得固體，用乙醚(50 mL)洗滌，且在真空下乾燥，得到呈淡黃色固體狀之5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三嗪-3-基)苯胺基]-N-甲基-3-甲基磺醯基-1,2,4-三嗪-6-甲醯胺(8.03 g，78%)。ES/MSm/z 387.0 (M+H)。
在0℃下將間氯過氧苯甲酸(703 mg，3.14 mmol)添加至含5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-N-甲基-3-甲基磺醯基-1,2,4-三嗪-6-甲醯胺(500 mg，1.26 mmol)之DMF(12.5 mL)懸浮液中且使其升溫至室溫。在30分鐘之後，添加4-(4-胺基吡唑-1-基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(520 mg，1.89 mmol)且在室溫下攪拌混合物。在24小時之後，將混合物分配於DCM與飽和碳酸氫鈉水溶液之間。有機層經硫酸鎂乾燥，過濾且蒸發。用乙醚研磨所得固體數次且在真空下乾燥，得到呈86%純黃色固體狀之4-[4-[[5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-6-(甲基胺甲醯基)-1,2,4-三嗪-3-基]胺基]吡唑-1-基]哌啶-1-甲酸第三丁酯(720 mg，81%)。ES/MSm/z 605.2 (M+H)。
將含4 N HCl之二噁烷(2.5 mL，10 mmol)添加至含4-[4-[[5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-6-(甲基胺甲醯基)1,2,4-三嗪-3-基]胺基]吡唑-1-基]哌啶-1-甲酸第三丁酯(720 mg，1.0 mmol)之MeOH(5 mL)懸浮液中。72小時之後，蒸發混合物。將所得物質分配於DCM(100 mL)與水(20 mL)之間。藉由添加1 N NaOH將水層之pH調節至＞8且用3:1氯仿/異丙醇萃取。組合有機層，將其用硫酸鎂乾燥，過濾且蒸發。用乙醚研磨所得固體且接著在真空下乾燥，得到呈86%純黃色固體狀之5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-N-甲基-3-[[1-(4-哌啶基)吡唑-4-基]胺基]-1,2,4-三嗪-6-甲醯胺(585 mg，97%)。ES/MSm/z 505.0 (M+H)。
將含(2E)-2-[(2E,4E)-5-[3-[6-(2,5-二側氧基吡咯啶-1-基)伸氧基-6-側氧基-己基]-3-甲基-5-磺酸根基-1-(3-磺酸根丙基)吲哚-1-鎓-2-基]五-2,4-亞二烯基]-3,3-二甲基-1-(3-磺酸根丙基)吲哚啉-5-磺酸三乙銨(10 mg，0.008 mmol)之DMSO(1 mL)添加至含5-[2-甲氧基-3-(1-甲基-1,2,4-三唑-3-基)苯胺基]-N-甲基-3-[[1-(4-哌啶基)吡唑-4-基]胺基]-1,2,4-三嗪-6-甲醯胺(4.5 mg，0.008 mmol)及TEA(0.002 mL，0.014 mmol)之DMSO(1 mL)溶液中。將反應小瓶包覆於鋁箔中以防止光照且在室溫下攪拌隔夜。藉由製備型HPLC(Kinetix EVO C18 30 mm×100 mm，5υm)純化用0至20%乙腈/水溶離之所得殘餘物，得到呈亮藍色固體狀之標題化合物(8.5 mg，65%)。ES/MSm/z 673.4 (M+H)。
實例 1 5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基)-7-(甲胺基)-N-[(3R)-1-甲基-2-側氧基-吡咯啶-3-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺
Figure 02_image072
流程1步驟G：向含5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基)-7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]-N-[(3R)-1-甲基-2-側氧基吡咯啶-3-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺(191 mg，0.3 mmol)之DCE(3 mL)中添加TFA(1.5 mL，20 mmol)。將混合物加熱至50℃持續4小時，冷卻至室溫且攪拌隔夜。蒸發混合物且將其分配於DCM與飽和碳酸氫鈉溶液之間。用飽和氯化鈉水溶液洗滌有機層，用硫酸鈉將其乾燥，過濾且蒸發。經由高pH LC/MS純化所得殘餘物，得到呈白色固體狀之標題化合物(31 mg，21%)。ES/MSm/z 436 (M+H)。
用於製備實例 1 之替代程序 5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基)-7-(甲胺基)-N-[(3R)-1-甲基-2-側氧基-吡咯啶-3-基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺 流程4步驟D：向含(3R)-3-胺基-1-甲基-吡咯啶-2-酮4-甲基苯磺酸鹽(15 g，51 mmol)之DMF(200 mL)中添加DIEA(29 mL，166 mmol)。攪拌5分鐘之後，添加5-(二氫苯并哌喃-8-基胺基)-7-(甲胺基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-羧酸(14 g，41 mmol)，隨後添加BOP(24 g，53 mmol)。在攪拌30分鐘之後，添加水(200 mL)，隨後添加飽和碳酸氫鈉溶液(400 mL)，且在冰水浴中冷卻燒瓶。在攪拌90分鐘之後，過濾所得固體，用額外的水洗滌，且在真空下乾燥。將固體溶解於氯仿:異丙醇為3:1之混合物中，用2 N NaOH及飽和氯化鈉水溶液洗滌，經硫酸鈉乾燥，過濾且蒸發。經由矽膠層析(0-8% MeOH/DCM)純化材料，得到呈灰白色固體狀之標題化合物(6.7 g)。ES/MS m/z 436.0 (M+H)。
實例 2 7-(甲胺基)-N-[(3R)-1-甲基-2-側氧基-吡咯啶-3-基]-5-[(6-甲基-2-吡啶基)胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺
Figure 02_image074
流程1步驟G：將TFA(1 mL，13.2 mmol)添加至含7-[(4-甲氧基苯基)甲基-甲基-胺基]-N-[(3R)-1-甲基-2-側氧基-吡咯啶-3-基]-5-[(6-甲基-2-吡啶基)胺基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺(93 mg，0.18 mmol)之DCE(2 mL)中且將混合物加熱至50℃。在1小時之後，將混合物冷卻至室溫且蒸發。向殘餘物中添加DCM及飽和碳酸氫鈉溶液。攪拌混合物10分鐘且收集所得固體。用水及乙醚洗滌固體，接著在真空下乾燥，得到呈米色固體狀之標題化合物(72 mg)。ES/MSm/z 395 (M+H)。
TYK2-JH2 示蹤劑結合分析 具有N端His6標籤之人類JAK(細胞質酪胺酸激酶之傑納斯(Janus)家族)家族酪胺酸激酶2(TYK2)(基因庫NP_003322)之假激酶結構域(JH2)在桿狀病毒中表現且藉由HisPur Ni-NTA親和性及Superdex 200尺寸排阻層析純化。製備17中製備之化合物(Alexa Fluor 647染料(Thermo Fisher Scientific)與適合之TYK2 JH2結合劑之結合物)在本文中稱為「示蹤劑」。在100% DMSO中製備化合物(實例1及實例2)之3倍、10點連續稀釋液，且使用聲學液體處理(acoustic liquid handling)將該連續稀釋液以50奈升/孔轉移至Proxiplate-384F白色培養盤(PerkinElmer 6008280)。用於測定抑制百分比之對照孔含有100% DMSO(50 nL)及含有示蹤劑(2.00 nM最終濃度)(最小值，低FRET)或經稀釋之TYK2-JH2酶(0.200 nM最終濃度)及示蹤劑(2.00 nM最終濃度)(最大值，高FRET)之任一種分析緩衝液。
將5.0 µL含His標記之TYK2-JH2 (0.402 nM)及LanthaScreen Eu-抗HIS Ab (4.02 nM，LifeTech，PV5597)之分析緩衝液(50 mM HEPES pH 7.5，10 mM氯化鎂，1 mM乙二醇-雙(β-胺基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸、0.01% Brij-35及Milli-Q水)添加至含有50 nL經稀釋之化合物及對照孔之Proxiplate-384培養盤中。將含5.0 µL示蹤劑(2.00 nM最終濃度)之分析緩衝液添加至培養盤中且使其在室溫下平衡30分鐘。在30分鐘之後，在具有以下設置之PerkinElmer Envision上對培養盤計數：激發(340 nm)、示蹤劑發射(665 nm)及LanthaScreen Eu-抗His抗體發射(615 nm)。測定示蹤劑發射(665 nm)相對於LanthaScreen Eu-抗His抗體發射(615 nm)之比率。使用最大及最小對照孔來計算在各抑制劑濃度下之抑制百分比比率，且根據GeneData Screener® 中之四參數非線性邏輯斯蒂方程(logistic equation)擬合，得到＜0.000254 µM (n=2)之實例1化合物之IC50 及＜0.000254 µM (n=1)之實例2化合物之IC50 。此結果證實實例1及實例2之化合物活體外結合至TYK2-JH2假激酶結構域。
TF1 細胞中經由 pSTAT1 之 IFN α 信號傳導之抑制 TF1細胞(ATCC，CL-2003)在補充有10%滲析FBS、0.1 mg/mL安比西林(Ampicillin)及2 ng/mL顆粒球巨噬細胞群落刺激因子之RPMI 1640(GIBCO)中生長。將TF1細胞(每孔100 K)接種於96孔聚-D-離胺酸塗佈之培養盤中的無血清DMEM中，且在37℃下在5% CO2 下培育隔夜。將實例1於DMSO中連續稀釋，添加至細胞中，且在37℃下培育1小時。接著在37℃下用10 ng/mL IFNα2刺激細胞20分鐘。在移除培養基之後，在室溫下將細胞溶解於含有Halt蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合液(Thermo Scientific #78441)之緩衝液中30分鐘。遵循供應商之建議方案，使用AlphaLISA SureFire Ultra p-Stat1(Tyr701)分析套組(Perkin Elmer #ALSU-PST1-A50K)定量作為在615 nm下之光發射之p-Stat1(Tyr701)之量。計算在各抑制劑濃度下之抑制百分比，且使用GeneData Screener® 根據四參數非線性邏輯斯蒂方程擬合，得到0.007 µM(±0.002 µM，n=4)之實例1化合物之IC50 及0.100 µM(±0.014 µM，n=4)之實例2化合物之IC50 ，其表示為具有平均值之標準誤差(SEM)的幾何平均值。此結果表明實例1及實例2之化合物為TF1細胞中經由pSTAT1之IFNα信號傳導之抑制劑。
IL23 pSTAT3 AlphaLISA 分析 用與螢火蟲螢光素酶連接之Lenti STAT3報導子(SABiosciences CLS-6028L)穩定轉導表現內源性IL23受體之IL2-依賴性Kit225細胞(德克薩斯大學安德森癌症中心(University of Texas MD Anderson Cancer Center))。此等細胞用於藉由使用AlphaLISA技術(TGR Biosciences ALSU-TST3-A50K)將在IL2存在下藉由IL23誘導後由STAT3磷酸化引起之基因表現定量來監測TYK2活性。細胞在補充有10% FBS(Invitrogen 10082)、1×青黴素/鏈黴素(Pen/Strep)(Gibco 15140-122)、200 ng/ml嘌呤黴素(Sigma P9620)及新鮮10 ng/ml重組人類IL2(R&D Systems 202-IL-50)之RPMI 1640(Gibco 22400)中生長。
對於分析製備，將細胞在DMEM(Sigma D5796)中以300,000個細胞/孔分配至Biocoat黑色聚-D-離胺酸塗佈之透明底部384孔培養盤(Becton Dickinson Bio-Coat 35-4640)中且將其在37℃下培育隔夜。將溶解於DMSO中之化合物以1:3連續稀釋以產生10點濃度反應曲線(最終DMSO=0.1%)。將細胞與實例1一起在37℃下預培育1小時，接著用IL23(25 ng/mL最終)刺激30分鐘。在2000 rpm下離心10分鐘之後，用1:1溶解緩衝液(TGR Biosciences)及Halt蛋白酶&磷酸酶抑制劑混合液(Thermo Scientific 1861281)之混合物溶解細胞集結粒30分鐘。遵照供應商之建議方案進行AlphaLISA反應，且使用Envision培養盤讀取器(Perkin Elmer)量測螢光素酶含量。使用4參數非線性邏輯斯蒂方程(GeneData Screener 13.0.5)計算相對IC50 ，得到0.007 µM (±0.001 µM，n=3)之實例1化合物之IC50 及0.066 µM (±0.014 µM，n=3)之實例2化合物之IC50 ，其表示為具有平均值之標準誤差(SEM)的幾何平均值。此結果表明實例1及實例2之化合物為基於細胞之分析中之IL-23信號傳導之抑制劑。
Figure 108143067-A0101-11-0002-7

Claims (11)

  1. 一種下式化合物：
    Figure 03_image076
    ， 其中R為
    Figure 03_image078
    ； 或其醫藥學上可接受之鹽。
  2. 如請求項1之化合物，其中R為
    Figure 03_image080
    ， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  3. 如請求項1之化合物，其中R為
    Figure 03_image082
    ， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  4. 如請求項1或請求項2之化合物，其具有下式：
    Figure 03_image084
    ， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  5. 如請求項4之化合物，其具有下式：
    Figure 03_image086
    。
  6. 如請求項1或請求項3之化合物，其具有下式：
    Figure 03_image088
    ， 或其醫藥學上可接受之鹽。
  7. 如請求項6之化合物，其具有下式：
    Figure 03_image090
    。
  8. 一種如請求項1至7中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造治療牛皮癬之藥物。
  9. 一種如請求項1至7中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽之用途，其用於製造治療全身性紅斑性狼瘡症之藥物。
  10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至7中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  11. 一種用於製備醫藥組合物之方法，其包含混合如請求項1至7中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
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