TW202014515A - 用於改良痘病毒產量之方法 - Google Patents

Abstract

一種以提高之生長率及/或子代病毒效價在細胞中產生痘病毒之方法，該方法包括：使宿主細胞與有效量之核質轉運抑制劑接觸；使該宿主細胞與所關注痘病毒在容許該所關注痘病毒吸附在該宿主細胞表面的條件下接觸；及培養該宿主細胞，以產生所關注之子代痘病毒。

Description

用於改良痘病毒產量之方法

本發明係關於痘病毒且尤其係關於在活體外以高產量產生痘病毒之方法。

諸如來自病毒之痘病毒科 (Poxviridae )家族的溶瘤病毒(Oncolytic virus)為哺乳動物病毒，其係基於其選擇性感染及殺滅經轉型癌細胞之能力且藉由其活化宿主之不僅抵禦病毒且亦抵禦腫瘤抗原之免疫系統的能力而進行設計及/或選擇(參見例如，Lichty BD, Breitbach CJ, Stojdl DF, Bell JC. 2014.Going viral with cancer immunotherapy . Nature Reviews Cancer 14:559-567)。病毒之痘病毒科 家族的成員為多組較大且複雜的雙股DNA病毒組，該等病毒可在經感染細胞之細胞質中複製。大部分痘病毒之基因組長度為約150,000至300,000個鹼基對且編碼大致150至300個蛋白質。此等病毒蛋白質約一半在不同痘病毒成員之間為高度保守性的且執行基本功能，如細胞結合及進入、基因組複製、轉錄及病毒粒子組裝(Upton, C.,等人,Poxvirus orthologous clusters : toward defining the minimum essential poxvirus genome . J Virol, 2003. 77(13): 第7590-600頁)。其他病毒蛋白質參與躲避許多宿主防禦功能(Smith, G.L.,等人,Vaccinia virus immune evasion : mechanisms , virulence and immunogenicity . J Gen Virol, 2013. 94(Pt 11): 第2367-92頁)。痘病毒基因可以不同階段表現。舉例而言，早期基因產物可包括為病毒DNA複製所必要且在複製DNA之前表現的蛋白質。另一方面，在DNA複製期間或之後表現的中間/晚期基因產物可包括為病毒粒子成熟所需之結構蛋白質。此複雜病毒複製方法之所有步驟(自使基因組脫殼開始、早期基因表現、DNA複製、晚期基因表現及甚至更複雜的病毒粒子成熟方法)均可排他性地出現在經感染細胞之細胞質中。

在一些態樣中，本文中揭示一種用於複製痘病毒之方法，其包含：在容許痘病毒吸附至宿主細胞之表面的條件下將宿主細胞暴露至有效量之核質轉運抑制劑及痘病毒；及在培養基中培育經感染宿主細胞以使得痘病毒複製。

在一些實施例中，該方法進一步包含收集在宿主細胞中所產生之痘病毒。在一些實施例中，痘病毒經基因改造。在一些實施例中，痘病毒為野兔痘病毒(Leporipoxvirus)。在一些實施例中，野兔痘病毒為黏液瘤病毒(myxoma vitus)。在一些實施例中，痘病毒為正痘病毒(Orthopoxvirus)。在一些實施例中，正痘病毒為痘瘡病毒(vaccinia virus)。在一些實施例中，痘瘡病毒為選自由以下組成之群的痘瘡病毒株：Lister、Wyeth、Western Reserve、經改造安卡拉痘瘡病毒(Modified Vaccinia virus Ankara)及LC16m系列。在一些實施例中，正痘病毒為浣熊痘病毒(Raccoonpox virus)。在一些實施例中，痘病毒為山羊痘病毒(Capripox virus)。在一些實施例中，山羊痘病毒為羊傳染性膿皰病毒(Orf virus)。在一些實施例中，核質轉運抑制劑係選自由以下組成之群：來普黴素A (Leptomycin A)、來普黴素B、拉塔酮A (Ratjadone A)、拉塔酮B、拉塔酮C、拉塔酮D、似蛇黴素A (Anguinomycin A)、哥納香內酯(Goniothalamin)、蓽茇亭鹼(piperlongumine)、白花丹素(plumbagin)、薑黃素(curcumin)、戊曲酯(valtrate)、乙醯氧基佳咪酚乙酸酯(acetoxychavicol acetate)、異戊烯香豆素蛇床子素(phenylcoumarin osthol)、KOS 2464、PKF050-638、CBS9106及賽琳克斯(Selinexor)。在一些實施例中，該方法進一步包含在使宿主細胞感染痘病毒之前使宿主細胞與核質轉運抑制劑接觸。在一些實施例中，該方法進一步包含在使宿主細胞感染痘病毒之後使宿主細胞與核質輸送抑制劑接觸。在一些實施例中，該方法進一步包含將宿主細胞同時暴露至核質轉運抑制劑及痘病毒。在一些實施例中，痘病毒係以比不存在核質轉運抑制劑之情況下的複製速率快至少30%的速率複製。在一些實施例中，核質轉運抑制劑在感染後24小時之後使痘病毒之複製增加達至少3倍。在一些實施例中，使宿主細以低於2.0之感染倍率(MOI)與痘病毒接觸。在一些實施例中，核質轉運抑制劑之有效量在約0.0005 µM至約0.5 µM範圍內。在一些實施例中，培養基包含核質轉運抑制劑。在一些實施例中，宿主細胞為永生化人類或靈長類細胞。在一些實施例中，宿主細胞來自用於在藥品優良製造規範(GMP)下製造痘病毒之細胞株。在一些實施例中，宿主細胞為人類A549細胞、海拉(HeLa)細胞、239細胞或靈長類非洲綠猴腎細胞(Vero cell)。在一些實施例中，該方法進一步包含移除未吸附痘病毒。

在一些態樣中，本文中揭示一種以提高之生長率及/或效價在細胞中產生痘病毒之方法，該方法包含：使宿主細胞與有效量之核質轉運抑制劑接觸；使宿主細胞與所關注痘病毒在容許所關注痘病毒吸附至宿主細胞之表面的條件下接觸；及培養宿主細胞以產生所關注痘病毒之子代。

在一些實施例中，該方法進一步包含收集所關注痘病毒之子代。在一些實施例中，所關注痘病毒經基因改造。在一些實施例中，核質轉運抑制劑包含以下中之一或多者：來普黴素A、來普黴素B、拉塔酮A、拉塔酮B、拉塔酮C、拉塔酮D、似蛇黴素A、哥納香內酯、蓽茇亭鹼、白花丹素、薑黃素、戊曲酯、乙醯氧基佳咪酚乙酸酯、異戊烯香豆素蛇床子素、KOS 2464、PKF050-638、CBS9106或賽琳克斯。在一些實施例中，宿主細胞係在存在有效量之核質轉運抑制劑之情況下培養。在一些實施例中，所關注痘病毒為溶瘤病毒候選株。在一些實施例中，所關注痘病毒為野兔痘病毒。在一些實施例中，野兔痘病毒為黏液瘤病毒。在一些實施例中，所關注痘病毒為正痘病毒。在一些實施例中，正痘病毒為痘瘡病毒。在一些實施例中，痘瘡病毒係選自由以下組成之群的痘瘡病毒株：Lister、Wyeth、Western Reserve、經改造安卡拉痘瘡病毒及LC16m系列。在一些實施例中，正痘病毒為浣熊痘病毒。在一些實施例中，所關注痘病毒為山羊痘病毒。在一些實施例中，山羊痘病毒為羊傳染性膿皰病毒。在一些實施例中，宿主細胞為永生化人類或靈長類細胞。在一些實施例中，宿主細胞來自用於在藥品優良製造規範(GMP)下製造所關注痘病毒之細胞株。在一些實施例中，宿主細胞為人類A549細胞、海拉細胞(HeLa cell)、239細胞或靈長類非洲綠猴腎細胞。在一些實施例中，使宿主細胞以介於約0.01與1.0之間的感染倍率(MOI)與所關注痘病毒接觸。在一些實施例中，該方法進一步包含在培養之前移除未吸附之所關注痘病毒。在一些實施例中，核質轉運抑制劑之有效量介於約0.0005 µM與約0.5 µM之間。

交叉引用

本申請案主張2018年8月8日申請之美國臨時專利申請案第62/716,224號之優先權，該文獻以全文引用之方式併入本文中。 政府支援聲明

本發明係在政府支持下在由美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)授予之授權號R01 AI080607下進行。政府在本發明中享有某些權利。 以引用之方式併入

本說明書中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以引用之方式併入本文中，其引用程度如同特定且個別地將各個別公開案、專利或專利申請案以引用之方式併入一般。

本發明提供增加經轉型人類及靈長類細胞(例如通常用於GMP製造之彼等細胞)中諸如痘病毒之溶瘤病毒產量之方法。大規模製造及純化溶瘤病毒候選株(諸如痘病毒群組之黏液瘤病毒(MYXV)及痘瘡病毒(VACV))存在一些獨特挑戰。由於痘病毒尺寸較大，故痘病毒無法藉由過濾滅菌且由此任何製造過程通常均停止，且純化通常需要裂解經感染細胞及自細胞殘渣純化病毒粒子。本發明涉及以下出人意料的發現：用藥劑(諸如一或多種核質轉運抑制劑)處理宿主細胞株可增加總體感染性痘病毒之複製及極限產量。所揭示之方法因此提供一種增加宿主細胞(諸如用於病毒GMP製造之經轉型人類及靈長類細胞)中痘病毒(諸如MYXV及VACV)之總產量之高效方式。

除非另外指出，否則技術術語根據習知用途來使用。分子生物學中之常見術語的定義可見於Benjamin Lewin, Genes VII, 由Oxford University Press出版, 1999；Kendrew等人(編), The Encyclopedia of Molecular Biology, 由Blackwell Science Ltd.出版, 1994；及Robert A. Meyers (編), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 由VCH Publishers, Inc.出版, 1995；及其他類似參考文獻。

除非另外解釋，否則本文中所使用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般熟習此項技術者通常所理解相同的含義。儘管與本文中所描述類似或等效之方法及材料可用於實踐或測試本發明，但下文仍描述適合的方法及材料。此外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。

提供術語及方法之以下解釋以較佳地描述本發明化合物、組合物及方法，以及在本發明之實踐中指導一般熟習此項技術者。亦應瞭解，本發明中所用之術語僅出於描述特定實施例及實例之目的且並不意欲為限制性的。‎

除非上下文另外明確指示，否則如本文中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該」亦意欲包括複數形式。

如本文中所使用，術語「及/或」係指且涵蓋相關列舉項目中之一或多者之任何及所有可能組合，以及當以替代性(「或」)解釋時缺乏該等組合。

如本文中所使用，「一或多個(種)」或至少一個(種)可意謂一、兩、三、四、五、六、七、八、九、十個(種)或更多個(種)，直至任何數目。

如本文中所使用，術語「包含(comprises/comprising)」意謂「包括」。因此，「包含A或B」意謂包括A、B或A及B。「包含(comprise)」及如本文中所使用之該術語之變化形式，諸如「包含(comprising/comprises/comprised)」意謂可結合採用各種額外組分或步驟。

「有效量」係指化合物或組合物足以產生所需作用(例如痘病毒產生之增加)的量。在此實例中，有效量將隨細胞之類型及所投與之特定藥劑、治療持續時間、任何並行治療之性質及熟習此項技術者之知識及專門知識內之類似因素變化。

如本文中所使用之術語「宿主細胞」或「細胞」包括各種物種(包括人類)中之單個細胞以及複數個細胞或細胞群體(例如，真核細胞或真核細胞群體)。該術語亦包括目標宿主細胞之任何子代。宿主細胞之所有子代可能與親代細胞不相同，此係由於可能在複製期間發生突變。然而，當使用術語「宿主細胞」時，包括此類子代。使藥劑與細胞接觸或將藥劑暴露至細胞包括將藥劑置放於細胞之生長培養基中。

「核質轉運抑制劑」為抑制分子轉運通過細胞核輸出路徑之藥劑。核質轉運抑制劑之實例包括但不限於：來普黴素A、來普黴素B、拉塔酮A、拉塔酮B、拉塔酮C、拉塔酮D、似蛇黴素A、哥納香內酯、蓽茇亭鹼、白花丹素、薑黃素、戊曲酯、乙醯氧基佳咪酚乙酸酯、異戊烯香豆素蛇床子素、KOS 2464、PKF050-638、CBS9106或賽琳克斯。

「病毒」為在活細胞內再生之顯微感染性生物。病毒可基本上由單個由蛋白質外殼包圍之核酸之核心組成，且具有僅在活細胞內複製之能力。「病毒複製」為藉由出現至少一個病毒生命週期來產生額外病毒。病毒可破壞宿主細胞之正常功能，使得細胞以由病毒決定之方式活動。舉例而言，當未感染細胞不可正常產生細胞介素或對細胞介素正常起反應時，病毒感染可致使細胞產生細胞介素或對細胞介素有反應。如本文中所使用之術語「可複製勝任型」係指能夠在特定宿主細胞內感染及複製之病毒。

「痘病毒」為來自痘病毒科 家族之病毒。痘病毒為能夠感染脊椎動物與無脊椎動物兩者之雙股DNA病毒。痘病毒包括例如歸類為以下之一部分的病毒之物種及屬：脊椎動物痘病毒亞科 (Chordopoxvirinae )子族，諸如正痘病毒、副痘病毒(Parapoxvirus)、禽痘病毒、山羊痘病毒、野兔痘病毒、豬痘病毒(Suipoxvirus)、軟疣痘病毒(Molluscipoxvirus)及亞塔痘病毒(Yatapoxvirus)屬；及昆蟲痘病毒亞科 (Entomopoxvirinae )子族，包括甲型昆蟲痘病毒(Alphaentomopoxvirus)、乙型昆蟲痘病毒(Betaentomopoxvirus)及丙型昆蟲痘病毒(Gammaentopoxvirus)屬。

「接觸」意謂以直接物理聯繫來放置。接觸包括分子(諸如抑制劑)與細胞之間的接觸，例如藉由使藥劑與細胞有直接物理聯繫，諸如將藥劑與細胞一起培養。

「抑制」意謂降低至可量測程度。例如減少細胞核輸出路徑中之運轉。「抑制劑」為能夠例如將細胞核輸出路徑中之運轉抑制達一定的可量測程度之物質。

用於本發明之實踐或測試的適合方法及材料描述如下。此類方法及材料僅為說明性的且並不意欲為限制性的。可使用其他與本文中所描述類似或等效之方法及材料。舉例而言，與本發明有關之此項技術中所熟知之習知方法描述於各種通用及更特定參考文獻中，該等參考文獻包括例如，Sambrook等人,Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 第 2d 版 , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989；Sambrook等人 ,Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 第 3d 版 , Cold Spring Harbor Press, 2001；Ausubel等人 ,Current Protocols in Molecular Biology , Greene Publishing Associates, 1992 (及2000年之增刊)；Ausubel等人 ,Short Protocols in Molecular Biology : A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology , 第4版, Wiley & Sons, 1999；Harlow及Lane,Antibodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990；及Harlow及Lane,Using Antibodies : A Laboratory Manua l, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999。此外，材料、方法及實例僅為說明性的且並不意欲為限制性的。

痘病毒為可在經感染細胞之細胞質內排他性地複製的較大DNA病毒。其可編碼為DNA及mRNA合成所需之所有蛋白質。除參與痘病毒複製之病毒蛋白質之外，約一半痘病毒基因組編碼已顯示為抑制或操縱在細胞質及細胞核中起作用之不同胞內抗病毒信號傳導路徑所需之蛋白質。然而，有跡象表明來自細胞質及細胞核區室之宿主細胞蛋白質至少參與一些痘病毒複製步驟。然而，在此上下文中，在痘病毒感染及複製期間穿梭在細胞質區室與細胞核區室之間的細胞核蛋白質之作用並未充分理解。已在一些步驟中記錄宿主細胞蛋白質在此整個複製週期期間之作用，例如，細胞核蛋白質ATR、RPA、INTS7及Chk1自細胞核募集至病毒工廠以用於最佳病毒基因組複製(Postigo, A.,等人,Cytoplasmic ATR Activation Promotes Vaccinia Virus Genome Replication . Cell Rep , 2017. 19(5): 第1022-1032頁)。在另一研究中，顯示高基體(Golgi)相關聯之逆行蛋白質(GARP)複合物為形成痘瘡病毒(VACV)之胞外病毒(EV)所需(Realegeno, S.,等人,Monkeypox Virus Host Factor Screen Using Haploid Cells Identifies Essential Role of GARP Complex in Extracellular Virus Formation . J Virol, 2017. 91(11))。已發現核轉錄因子YY1、Sp1及TATA結合蛋白與VACV複製複合物的位置相同(Oh, J.及S.S. Broyles,Host cell nuclear proteins are recruited to cytoplasmic vaccinia virus replication complexes . J Virol, 2005. 79(20): 第12852-60頁)。

許多不同細胞蛋白質及信號傳導路徑已涉及保護細胞免於痘病毒之感染及複製。此點即為超過一半基因組編碼之痘病毒蛋白質參與此等宿主抗病毒路徑之特異性抑制或調節的原因(Smith, G.L.,等人,Vaccinia virus immune evasion : mechanisms , virulence and immunogenicity . J Gen Virol, 2013.94 (Pt 11): 第2367-92頁；Seet, B.T., 等人,Poxviruses and immune evasion . Annu Rev Immunol, 2003.21 : 第377-423頁)。在一些情況下，病毒所編碼蛋白質之功能為宿主特異性，且決定所指定之痘病毒是否將能夠成功地在宿主之特定物種中感染及複製(McFadden, G.,Poxvirus tropism . Nat Rev Microbiol, 2005.3 (3): 第201-13頁)。痘病毒之成員，例如黏液瘤病毒(MYXV)(係一種野兔痘病毒)及痘瘡病毒(VACV)(係一種正痘病毒)可發展為用於治療人類癌症之溶瘤病毒(Chan、W.M.及G. McFadden,Oncolytic Poxviruses . Annu Rev Virol, 2014. 1(1): 第119-141頁)。在此上下文中，重要的是理解痘病毒編碼之蛋白質如何在不同於其天然宿主之宿主中抵抗免疫系統。舉例而言，重要的是理解在病毒複製過程期間在細胞核區室與細胞質區室之間穿梭之宿主細胞核蛋白質的作用。

出乎意料地發現，許多抑制細胞核輸入/輸出路徑級別之藥物可在常用於GMP製造此等病毒之人類細胞中增加痘病毒產量。

MYXV為兔特異性病原體，已發展用於治療人類癌症之溶瘤免疫治療。MYXV可為屬於可勝任複製之痘病毒之野兔痘病毒物種的任何病毒。MYXV可為MYXV之野生型菌株或其可為MYXV之經基因改造之菌株。在一些實例中，MYXV為洛桑(Lausanne )菌株。在一些實例中，MYXV為在南美森林兔(Sylvilagus brasiliensis )中傳播之南美MYXV菌株。在一些實例中，MYXV為在叢毛棉尾兔(Sylvilagus bachmani )中傳播之加州MYXV菌株。在一些實例中，MYXV為6918，係一種減毒西班牙區域菌株，其包含基因M009L、M036L、M135R及M148R (Genbank寄存編號EU552530，其特此以引用之方式併入，如GenBank在2019年7月27日所提供)之修飾。在一些實例中，MYXV為6918VP60-T2 (GenBank寄存編號EU552531，其特此以引用之方式併入，如GenBank在2019年7月27日所提供)。在一些實例中，MYXV為稱為標準實驗室菌株(Standard laboratory Strain，SLS)之菌株。

在一些實例中，MYXV包含與在Cameron, 等人, 「The complete DNA sequence of Myxoma Virus」, Virology 264: 298-318 (1999) (其以全文引用之方式併入本文中)中所揭示之序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%，諸如在95%與98%、95%與99%之間，包括90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列一致性。在一些情況下，MYXV包含在Cameron, 等人, 「The complete DNA sequence of Myxoma Virus,」 Virology 264: 298-318 (1999)中所揭示之序列。

在一些實施例中，MYXV在人類中為非病原性的，但能夠感染且殺滅廣泛範圍之衍生自不同組織之人類癌細胞。在正常初級人類細胞中，MYXV之複製可受多種因素限制，諸如(例如)細胞結合決定子、胞內抗病毒信號傳導路徑及I型IFN及/其他細胞介素介導之細胞抗病毒狀態。在人類癌細胞中，此等自自我防禦細胞路徑通常有缺陷。一些人類癌細胞中之MYXV複製可視細胞RNA解螺旋酶家族蛋白質而定(Rahman, M.M., 等人,Identification of host DEAD - box RNA helicases that regulate cellular tropism of oncolytic Myxoma virus in human cancer cells . Sci Rep, 2017.7 (1): 第15710頁)。不希望受理論所束縛，在細胞之細胞核區室與細胞質區室之間穿梭的RNA解螺旋酶可影響感染病毒之細胞中的MYXV複製。除RNA解螺旋酶之外，其他細胞核蛋白質可有助於複製MYXV及其他痘病毒之週期。舉例而言，細胞核蛋白質可影響經轉型人類宿主細胞株中之痘病毒的複製效率。

在一些實施例中，本文中揭示用於使用核質轉運路徑之藥物抑制劑來增加或增強痘病毒基因表現及子代病毒形成之方法。在一些實施例中，對通常用於痘病毒之GMP製造的永生化人類細胞中之細胞核輸出路徑之抑制可用於增加自此等細胞之病毒產量。因此，本發明提供一種潛在地製造治療性痘病毒之穩固方法。

在一些實施例中，當細胞經有效量之抑制劑治療時，例如剛好在第一次病毒吸附時之前開始，此經增強病毒複製最有效。在一些實施例中，抑制劑之有效量係針對既定細胞培養系統(例如，既定抑制劑、病毒株及宿主細胞株)測定。抑制劑之有效量可例如如本文中所揭示藉由滴定細胞培養系統中抑制劑之量及量化病毒子代之產量來測定。在一些實施例中，有效量之抑制劑可在增加病毒子代之產量的同時，最小化藥物特異性細胞毒性。在一些實施例中，核質轉運抑制劑之有效量為約0.000001 µM至約1 µM、約0.000001 µM至約0.1 µM、約0.00001 µM至約0.1 µM、約0.00005 µM至約0.05 µM，或約0.00005 µM至約0.005 µM。在一些實施例中，核質轉運抑制劑之有效量大於約0.000001 µM、約0.000005 µM、約0.00001 µM、約0.00005 µM、約0.0001 µM、約0.0005 µM、約0.001 µM、約0.005 µM、約0.01 µM、約0.05 µM，或約0.1 µM。在一些實施例中，核質轉運抑制劑之有效量不多於約0.0005 µM、約0.001 µM、約0.0015 µM、約0.002 µM、約0.0025 µM、約0.003 µM、約0.0035 µM、約0.004 µM、約0.0045 µM、約0.005 µM、約0.01 µM、約0.015 µM、約0.02 µM、約0.025 µM、約0.03 µM、約0.035 µM、約0.04 µM、約0.045 µM、約0.05 µM、約0.1 µM、約0.2 µM、約0.25 µM、約0.3 µM、約0.4 µM、約0.5 µM、約0.75 µM、約0.9 µM、約1 µM、約1.25 µM、約1.5 µM、約1.75 µM、約2 µM、約3 µM、約4 µM、約5 µM、約6 µM、約7 µM、約8 µM、約9 µM，或約10 µM。

在一些實施例中，經增強病毒複製在細胞係以有效感染倍率(MOI)感染且接著例如維持連續存在核質轉運抑制劑時發生。針對既定細胞培養系統(例如，給定抑制劑、病毒株及宿主細胞株)之MOI可例如如本文中所揭示藉由滴定細胞培養系統中病毒與宿主細胞之比率，及量化病毒子代之產量來測定。在一些實施例中，有效MOI可在增強病毒之複製且增加病毒子代之產量的同時，使藥物特異性細胞毒性降至最小。

可使宿主細胞與所關注痘病毒在容許所關注痘病毒吸附至宿主細胞之表面的條件下接觸。在某些實施例中，使細胞與所關注痘病毒以在約0.001至2.0或約0.01及1.0之間的感染倍率(MOI)接觸，該等感染倍率為諸如約0.001 MOI、約0.005 MOI、0.01 MOI、約0.02 MOI、約0.03 MOI、約0.04 MOI、約0.05 MOI、約0.06 MOI、約0.07 MOI、約0.08 MOI、約0.09 MOI、約0.1 MOI、約0.15 MOI、約0.2 MOI、約0.25 MOI、約0.3 MOI、約0.35 MOI、約0.4 MOI、約0.45 MOI、約0.5 MOI、約0.55 MOI、約0.6 MOI、約0.65 MOI、約0.7 MOI、約0.75 MOI、約0.8 MOI、約0.85 MOI、約0.9 MOI、約0.95 MOI、約1.0 MOI、約1.1 MOI、約1.2 MOI、約1.3 MOI、約1.4 MOI、約1.5 MOI、約1.6 MOI、約1.7 MOI、約1.8 MOI、約1.9 MOI或約2.0 MOI。在一些實施例中，未吸附之所關注痘病毒在培養細胞之前例如藉由洗滌細胞來移除。在用核質轉運抑制劑處理之後，宿主細胞係在存在藥物之情況下培養以產生所關注痘病毒之子代。可基於特定細胞類型選擇適當培養條件。在一些實施例中，允許將細胞與所關注痘病毒一起培育一段時間，以使所關注痘病毒吸附至宿主細胞之表面，該時間為諸如約20分鐘至約5小時，例如約20分鐘、約25分鐘、約30分鐘、約35分鐘、約40分鐘、約45分鐘、約50分鐘、約55分鐘、約60分鐘、約65分鐘、約70分鐘、約75分鐘、約80分鐘、約85分鐘、約90分鐘、約95分鐘、約100分鐘、約105分鐘、約110分鐘、約115分鐘、約2小時、約2.5小時、約3小時、約3.5小時、約4小時、約4.5小時、約5小時、12小時、18小時、20小時、24小時、30小時、36小時或甚至更長。在某些實施例中，宿主細胞係在存在有效量之核質運轉抑制劑(例如以上文所描述之濃度)之情況下培養。宿主細胞可培養約一至數天，諸如3至5天，隨後收集子代病毒。在一些實施例中，該方法包括收集所關注痘病毒之子代。‎

如本文中所揭示，核質轉運抑制劑可增強在此類細胞中之病毒複製及子代病毒產量。此藥物強化方法提供一種增加痘病毒(諸如MYXV及VACV)之產量的實際方法，可採用該方法以用於此等病毒之大規模GMP產生及臨床用途。在一些實施例中，本發明證明，當應用於永生化人類或靈長類細胞中之痘病毒GMP製造時，核質轉運抑制劑可用於增加痘病毒之產量，該等痘病毒包括溶瘤病毒候選株，諸如痘瘡病毒(VACV)及黏液瘤病毒(MYXV)。使用方法

本發明提供一種增加經轉型人類及靈長類細胞中溶瘤病毒(諸如痘病毒)產量之方法，例如通常用於病毒(諸如溶瘤病毒)之GMP製造的彼等細胞。相比於已被提出作為溶瘤病毒候選株之其他病毒，大規模製造及純化痘病毒(諸如MYXV及VACV)存在一些獨特挑戰。作為本質上最大的病毒中之一些病毒，痘病毒可藉由光顯微術顯現，且如Moss, 在Fields' virology B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley, D. E. Griffin, 編(Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001) 第2849-2883頁中所描述量測長度達200-400奈米(nm)，該文獻以全文引用之方式併入本文中。由於痘瘡病毒之尺寸較大，故痘瘡病毒無法藉由過濾滅菌且由此任何製造過程通常均停止。在痘瘡病毒之整個生命週期發生在宿主細胞細胞質內之情況下，大部分感染性粒子不釋放至細胞培養基中，但保持在經感染細胞內，因此，純化需要裂解經感染細胞及自細胞殘渣純化病毒粒子。

在一些實施例中，本文中揭示用抑制細胞核輸出路徑之藥劑(諸如小分子)治療永生化人類細胞株(例如剛好在病毒吸附時之前添加)之方法。在存在藥劑之情況下培養細胞(例如貫穿後續感染循環)可增加總體感染性痘病毒之複製及極限產量。所揭示之方法因此提供一種增加經轉型人類及靈長類細胞中痘病毒(諸如黏液瘤病毒(MYXV)及痘瘡病毒(VACV))之總產量的簡明方式。

使用核質轉運抑制劑增加痘病毒之複製。在一些實施例中，痘病毒係以比不存在核質轉運抑制劑之情況下的複製速率快至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%之速率複製。在一些實施例中，痘病毒係以比不存在核質轉運抑制劑之情況下的複製速率快至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的速率複製。

在一些實施例中，核質轉運抑制劑在感染後24小時之後增加痘病毒之複製達至少30%、50%、70%、90%、2倍、3倍、5倍、7倍、9倍、10倍、12倍或15倍。在一些實施例中，核質轉運抑制劑在感染後24小時之後增加痘病毒之複製達不多於5倍、10倍、12倍、15倍、20倍、30倍、50倍、70倍或100倍。

本發明之態樣係關於一種以提高之生長率及/或效價在細胞中產生痘病毒之方法。在一些實施例中，該方法包括使宿主細胞與有效量之核質轉運抑制劑(其亦可稱為細胞核輸出路徑抑制劑)接觸。抑制劑之濃度可選擇為低於將正常引起任何細胞毒素或抗病毒作用，但仍足以致使所關注痘病毒之產生增加的濃度。在一些實施例中，核質轉運抑制劑之有效量在約0.000001 µM與約0.1 µM之間，諸如約0.000001 µM、約0.00001 µM、約0.0001 µM、約0.0005 µM與約0.05 µM之間，諸如約0.0005 µM、約0.001 µM、約0.0015 µM、約0.002 µM、約0.0025 µM、約0.003 µM、約0.0035 µM、約0.004 µM、約0.0045 µM、約0.005 µM、約0.01 µM、約0.015 µM、約0.02 µM、約0.025 µM、約0.03 µM、約0.035 µM、約0.04 µM、約0.045 µM及約0.05 µM。在某些實施例中，核質轉運抑制劑包括以下中之一或多者：來普黴素A、來普黴素B、拉塔酮A、拉塔酮B、拉塔酮C及拉塔酮D、似蛇黴素A、哥納香內酯、蓽茇亭鹼、白花丹素、薑黃素、戊曲酯、乙醯氧基佳咪酚乙酸酯、異戊烯香豆素蛇床子素；或合成核質轉運抑制劑，諸如KOS 2464、PKF050-638 (N-唑基丙烯酸酯類似物)、CBS9106、賽琳克斯；及見於Mathew及Ghildyal, CRM1 inhibitors for antiviral therapy, Frontiers in Microbiology 2017, 第8卷, article 1171中之彼等核質轉運抑制劑，該文獻具體以引用之方式併入本文中。

在某些實施例中，所關注痘病毒經基因改造。舉例而言，所關注痘病毒可經修飾以攜載任何其他基因(諸如治療性基因)及/或缺失或破壞一或多個內源性病毒基因。在病毒經修飾以治療癌症之情況下，基因將通常經選擇以增強治療之抗癌作用。此類基因可為參與觸發細胞凋亡，或參與靶向經感染細胞以進行免疫破壞的基因，諸如修復對干擾素之反應缺乏或引起刺激抗體反應之細胞表面標記物(諸如細菌細胞表面抗原)之表現的基因。病毒亦可經修飾以表現參與阻斷贅生性或癌症細胞之增殖及生長之基因，藉此防止細胞分裂。同樣，病毒可經修飾以包括治療性基因，諸如參與化學治療劑合成之基因，或其可經修飾以在特定物種之細胞(例如人類細胞)中具有提高之複製量，自該等物種中衍生待抑制或殺滅之細胞。

溶瘤病毒為因其選擇性感染及殺滅經轉型癌細胞之能力且藉由其活化宿主不僅抵禦病毒，且亦抵禦腫瘤抗原之免疫系統的能力而進行設計及/或選擇的哺乳動物病毒(Lichty BD、Breitbach CJ、Stojdl DF、Bell JC. 2014.Going viral with cancer immunotherapy . Nature Reviews Cancer 14:559-567)。黏液瘤病毒(MYXV)可能因為其獨特的生物性而充分適合作為抵禦實體癌症(諸如骨肉瘤)之治療性病毒。MYXV為痘病毒科家族及野兔痘病毒屬之成員(Chan WM、Rahman MM、McFadden G. 2013. Oncolytic Myxoma virus: the path to clinic. Vaccine 31:4252-4258；Chan WM、McFadden G. 2014. Oncolytic poxviruses. Annual review of virology 1:191-214)。因此，在某些實施例中，所關注痘病毒為溶瘤候選株。在某些實施例中，所關注痘病毒為野兔痘病毒，諸如黏液瘤病毒。在某些實施例中，所關注痘病毒為正痘病毒，諸如痘瘡病毒，包括痘瘡病毒之不同菌株，諸如Lister、Wyeth、Western Reserve (WR)、經改造安卡拉痘瘡病毒 (MVA)及LC16m系列；及浣熊痘病毒(RCNV)。在某些實施例中，所關注痘病毒為亞塔痘病毒，諸如塔納痘病毒(Tanapoxvirus；TPV)或Yaba樣病病毒(YLDV)。在某些實施例中，所關注痘病毒為山羊痘病毒，諸如羊傳染性膿皰病毒。

在某些實施例中，宿主細胞為永生化人類或靈長類細胞。在某些實施例中，宿主細胞為用於在藥品優良製造規範(GMP)下製造病毒之細胞株。在特定實施例中，宿主細胞為人類A549細胞、海拉細胞、239細胞或靈長類非洲綠猴腎細胞。實例 實例 1 ：核質轉運抑制劑

核孔複合物(NPC)介導所有跨越細胞核外膜之移動。計畫輸入至細胞核中之蛋白質含有稱為核定位序列(NLS)之序列，且計畫自細胞核輸出之蛋白質含有細胞核輸出序列(NES)。此等信號係藉由與Ran GTP酶循環一起運作以協調自細胞核之輸出或輸入之可溶因子辨識(Pemberton、L.F.及B.M. Paschal,Mechanisms of receptor - mediated nuclear import and nuclear export . Traffic, 2005.6 (3): 第187-98頁)。就輸出而言，CRM1/輸出蛋白-1(exportin-1) (染色體區域穩定蛋白1)蛋白質直接結合含有富含白胺酸之NES的蛋白質。已鑑別出天然產物與小型化學分子兩者皆對細胞核輸出過程有抑制性作用(核質轉運抑制劑)。來普黴素B (LMB)為功能在於直接靶向CRM1之核質轉運抑制劑。LMB為自鏈黴菌分離之聚酮(Mutka、S.C., 等人,Identification of nuclear export inhibitors with potent anticancer activity in vivo . Cancer Res, 2009.69 (2): 第510-7頁；Turner、J.G.、J. Dawson及D.M. Sullivan,Nuclear export of proteins and drug resistance in cancer . Biochem Pharmacol, 2012.83 (8): 第1021-32頁)。LMB共價結合至CRM1 NES凹槽中之Cys528。LMB與CRM1之此不可逆結合隨後抑制CRM1與所靶向輸出蛋白質之細胞核輸出信號的相互作用(Kudo, N., 等人,Leptomycin B inhibition of signal - mediated nuclear export by direct binding to CRM1 . Exp Cell Res, 1998.242 (2): 第540-7頁)。LMB抑制細胞週期之G1及G2階段及其他細胞功能。由於此不可逆的相互作用，當投與高濃度LMB時，LMB可對細胞具有毒性。LMB亦已作為抗病毒藥進行測試，此係由於其阻斷某些依賴細胞核輸出之病毒的複製。類似於LMB，來普黴素A (LMA)自鏈黴菌分離且藉由與CRM1結合來抑制細胞核輸出。自黏液菌屬(myxobacterium)纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum )分離之拉塔酮類似物具有類似LMB之結構，且使用相同分子機制來抑制CRM1 (Koster, M., 等人,Ratjadones inhibit nuclear export by blocking CRM1 / exportin 1 . Exp Cell Res, 2003.286 (2): 第321-31頁)。LMB以極低濃度即可使細胞停滯在G1階段(在海拉細胞中為50 pg/ml)。已報導另一種天然化合物(自鏈黴菌物種分離之似蛇黴素)以高於10 nM之濃度關閉CRM1介導之細胞核蛋白質輸出(Dickmanns, A.、T. Monecke及R. Ficner,Structural Basis of Targeting the Exportin CRM1 in Cancer . Cells, 2015.4 (3): 第538-68頁)。其亦依類似LMB的機制與CRM1相互作用。除細胞核輸出之天然抑制劑之外，亦存在可具有較少毒性且可用於相同目的之合成CRM1抑制劑。實例 2 ： 核質轉運抑制劑增強 MYXV 複製 ， 如由人類細胞中之報導基因表現所指示

不同於兔細胞，在初級人類細胞中，黏液瘤病毒(MYXV)之感染及複製通常在複製週期之多個階段受到胞內抗病毒信號傳導路徑限制。許多人類癌細胞係MYXV的容許細胞，因為此等抗病毒路徑在癌細胞中頻繁受損或缺失。類似於其他痘病毒，未明確記錄細胞核蛋白質在初級或經轉型人類細胞中之MYXV複製期間具有何作用。然而，在兩個細胞區室之間穿梭之許多細胞核蛋白質可抑制或上調MYXV複製。為了測試細胞核蛋白質在MYXV複製中之作用，在MYXV複製期間用核質轉運抑制劑抑制細胞蛋白質之細胞核輸出。就此研究而言，來普黴素A (圖1A及圖1B)、來普黴素B (圖2A及圖2B)、拉塔酮A (圖3A及圖3B)或似蛇黴素A (圖4A及圖4B)係作為代表性核質轉運抑制劑而進行測試。人類A549細胞用不同濃度之抑制劑模擬處理或預處理1小時(h)且接著以不同感染倍率(MOI)感染表現GFP報導基因之MYXV (vMyx-GFP)。在螢光顯微鏡下觀測細胞以監測作為病毒複製進展之指示物的GFP的表現。在所有測試抑制劑之某些濃度下，吾人觀測到經增強之GFP表現，其在以低於0.1之MOI感染病毒時，亦增加了MYXV病灶尺寸。公開報告表明抑制劑之此等病毒複製增強濃度與對細胞之最小毒性相關聯(Kalesse, M.,等人,The chemistry and biology of ratjadone . Chembiochem, 2001.2 (9): 第709-14頁)。實例 3 ：核質轉運抑制劑增強 MYXV 子代病毒產生

為定量評估核質轉運抑制劑對病毒報導基因表現(GFP)之所觀測到的作用是否可反映在子代病毒形成中，執行定量病毒滴定檢定。人類A549細胞用兩種不同劑量之抑制劑模擬處理或預處理。在添加抑制劑1小時(h)之後，細胞以1.0、0.1及0.01之MOI再感染vMyx-GFP持續1小時。移除未吸附病毒，且將細胞與含有同一濃度之抑制劑的培養基一起培育。在感染後48及72小時(hpi)收集細胞且在容許兔RK13細胞中滴定子代病毒粒子之形成。在48 hpi，當以低MOI (0.1或0.01)感染且經最大限度地增強了MYXV報導基因表現之藥物濃度(在圖5A-5C中10 nM，在圖5D中100 nM)處理時，所有測試之核質抑制劑使子代MYXV形成顯著增強5至10倍之間。顯示對報導基因表現無作用之較低測試濃度(在圖5A-5C中1 nM，在圖5D中10 nM)對子代病毒形成具有邊際作用。抑制劑之濃度係藉由圖5A-圖5D圖之條柱上方的數字指示。1指示無抑制劑，2指示0.01 µM (10 nM)之抑制劑。3指示0.001 µM (1 nM)之抑制劑，4指示0.1 µM (100 nM)之抑制劑。當細胞係以1.0或更高之MOI感染時，未觀測到經增強後代病毒形成。此等觀測結果表明，在此檢定之條件中，當以低MOI，亦即0.1或更低之MOI感染時，某一濃度之核質轉運抑制劑增強了MYXV複製。來普黴素B相比於其他測試藥物展現最高子代病毒產生增強(圖6A及圖6B)。圖6A及圖6B中之處理係藉由圖之條柱上方的數字指示；1指示模擬處理，2指示來普黴素A，3指示來普黴素B，4指示拉塔酮A，且5指示似蛇黴素A。實例 4 ：核質轉運抑制劑增強 VACV 報導基因表現及後代病毒產生

為測試核質轉運抑制劑對MYXV複製之所觀測到的作用是否對其他痘病毒為真實的，痘瘡病毒(VACV)作為正痘病毒屬之代表性成員而進行測試。就此研究而言，測試來普黴素A及來普黴素B以監測此等藥物對同一測試人類細胞中VACV複製之影響。人類A549細胞用不同濃度之抑制劑模擬處理或預處理1小時且接著以0.03之MOI感染表現VACV之GFP (VACV-GFP)。在螢光顯微鏡下觀測細胞以監測作為病毒複製進展之標記物的GFP表現(圖7A及圖7B)。此時，兩種抑制劑在0.01μM (10nM)之濃度下皆增強了GFP表現。亦在最低稀釋度(0.00001 μM或0.01 nM)之抑制劑下觀測到經增強之GFP表現。接著測試核質轉運抑制劑對病毒報導基因表現之所觀測到的作用是否可藉由執行病毒複製檢定反映在經增強VACV子代病毒形成中。人類A549細胞用不同濃度之抑制劑模擬處理或預處理。在添加抑制劑1 h之後，細胞以0.03之MOI再感染VACV-GFP持續1小時。移除未吸附病毒，且將細胞與含有同一濃度之核質轉運抑制劑的培養基一起培育。在感染後24及48小時(hpi)收集細胞且在RK13細胞中滴定子代病毒粒子。來普黴素A與來普黴素B兩者皆以所測試MOI使子代VACV之形成顯著增強5至10倍之間(圖8A及圖8B)。圖8A及圖8B中圖之條柱頂上的數字指示時間點：1指示24 h，而2指示48 h。經增強之病毒效價亦與經增強之病毒報導基因表現相關。此等觀測結果證明，核質轉運抑制劑可增強如VACV之正痘病毒、諸如MYXV之野兔痘病毒及其他痘病毒之複製。

雖然本發明已用強調特定的實施例加以描述，但一般熟習此項技術者將顯而易見可使用特定實施例之變化形式，且本發明意欲可以除本文所特定描述外之方式實施。結合本發明之特定態樣、實施例或實例描述之特徵、特性、化合物或實例應理解為適用於本發明之任何其他態樣、實施例或實例。因此，本發明包括涵蓋於如以下申請專利範圍所定義之本發明之精神及範疇內的所有修改。吾人因此主張本發明全部屬於此等申請專利範圍之範圍及精神。

圖1A及圖1B為一組顯示具有經核質轉運抑制劑來普黴素A增強之黏液瘤病毒(MYXV)複製的人類A549細胞之處理的數位影像，如由報導基因表現(GFP螢光)所指示。A549細胞經不同濃度之來普黴素A預處理1 h且在存在抑制劑之情況下以1.0、0.1或0.01之MOI感染vMyx-GFP。在感染後48 h (圖1A)及72 h (圖1B)使用螢光顯微鏡拍攝螢光影像。

圖2A及圖2B為一組顯示具有經核質轉運抑制劑來普黴素B增強之MYXV複製之人類A549細胞之處理的數位影像，如由報導基因表現(GFP螢光)所指示。A549細胞經不同濃度之來普黴素B預處理1 h且在存在抑制劑下之情況下以1.0、0.1或0.01之MOI感染vMyx-GFP。在感染後48 h (圖2A)及72 h (圖2B)使用螢光顯微鏡拍攝螢光影像。

圖3A及圖3B為一組顯示具有經核質轉運抑制劑拉塔酮A增強之MYXV複製之人類A549細胞之處理的數位影像，如由報導基因表現(GFP螢光)所指示。A549細胞經不同濃度之拉塔酮A預處理1 h且在存在抑制劑下之情況下以1.0、0.1或0.01之MOI感染vMyx-GFP。在感染後48 h (圖3A)及72 h (圖3B)使用螢光顯微鏡拍攝螢光影像。

圖4A及圖4B為一組顯示具有經核質轉運抑制劑似蛇黴素A增強之MYXV複製之人類A549細胞之處理的數位影像，如由報導基因表現(GFP螢光)所指示。A549細胞經不同濃度之似蛇黴素A預處理1 h且在存在抑制劑下之情況下以1.0、0.1或0.01之MOI感染vMyx-GFP。在感染後48 h (圖4A)及72 h (圖4B)使用螢光顯微鏡拍攝螢光影像。

圖5A-5D為一組顯示人類A549細胞中核質轉送抑制劑增強之MYXV複製之條形圖，該等複製產生更高含量之子代病毒。用核質轉運抑制劑來普黴素A (圖5A)、來普黴素B (圖5B)、拉塔酮A (圖5C)或似蛇黴素A (圖5D)處理A549細胞1 h。細胞接著以1.0、0.1或0.01之MOI感染vMyx-GFP持續1 h。在1 h之後，移除未吸附病毒，洗滌且在存在各別抑制劑之情況下與培養基一起培育。在48 h之後收集經感染細胞且在連續稀釋至RK13細胞上之後測定病毒效價。條柱上方之數字指示抑制劑濃度。1指示無抑制劑，2指示0.01 µM (10 nM)之抑制劑。3指示0.001 µM (1 nM)之抑制劑，4指示0.1 µM (100 nM)之抑制劑。

圖6A及圖6B為一組顯示人類A549細胞中核質轉送抑制劑增強之MYXV複製之條形圖，該等複製產生更高含量之子代病毒。用核質轉運抑制劑模擬處理或預處理A549細胞1 h。曲線圖之條柱上方的數字指示該等處理；1指示模擬處理，2指示來普黴素A，3指示來普黴素B，4指示拉塔酮A，且5指示似蛇黴素A。細胞接著以0.1或0.01之MOI感染上vMyx-GFP持續1 h。在1 h之後，移除未吸附病毒，且在存在各別抑制劑之情況下與培養基一起培育。在48 h (圖6A)或72 h (圖6B)之後收集經感染細胞且在連續稀釋至RK13細胞上之後測定病毒效價。

圖7A及圖7B為一組顯示具有經核質轉運抑制劑增強之VACV複製之人類A549細胞之處理的數位影像，如由報導基因表現(GFP螢光)所指示。用不同濃度之來普黴素A (圖7A)或來普黴素B (圖7B)預處理A549細胞1 h且在存在抑制劑之情況下以0.03之MOI感染VACV-GFP。在感染後48 h使用螢光顯微鏡拍攝螢光影像。

圖8A及圖8B為一組顯示人類A549細胞中核質轉送抑制劑增強之VACV複製之條形圖，該等複製產生更高含量之子代病毒。用核質轉運抑制劑來普黴素A (圖8A)或來普黴素B (圖8B)預處理A549細胞1 h。細胞接著以0.03之MOI感染VACV-GFP持續1 h。在1 h之後，移除未吸附病毒，洗滌細胞，且在存在各別抑制劑之情況下與培養基一起培育。在感染後24 h (由圖中條柱上方之「1」所指示)或48 h (由圖中條柱上方之「2」所指示)之後收集經感染細胞且在連續稀釋至RK13細胞上之後測定病毒效價。

Claims (44)

1. 一種複製痘病毒之方法，其包括： 在容許該痘病毒吸附至該宿主細胞之表面的條件下，讓宿主細胞暴露在有效量之核質轉運抑制劑與該痘病毒下；及 在培養基中培育經感染宿主細胞，讓該痘病毒複製。
2. 如請求項1之方法，其進一步包括收集該宿主細胞所產生之痘病毒。
3. 如請求項1或請求項2之方法，其中該痘病毒經基因改造。
4. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該痘病毒為野兔痘病毒(Leporipoxvirus)。
5. 如請求項4之方法，其中該野兔痘病毒為黏液瘤病毒。
6. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該痘病毒為正痘病毒(Orthopoxvirus)。
7. 如請求項6之方法，其中該正痘病毒為痘瘡病毒(vaccinia virus)。
8. 如請求項7之方法，其中該痘瘡病毒為選自由以下組成之群的痘瘡病毒株：Lister、Wyeth、Western Reserve、經改造安卡拉痘瘡病毒(Modified Vaccinia virus Ankara)及LC16m系列。
9. 如請求項6之方法，其中該正痘病毒為浣熊痘病毒(Raccoonpox virus)。
10. 如請求項1至3中任一項之方法，其中該痘病毒為山羊痘病毒(Capripox virus)。
11. 如請求項10之方法，其中該山羊痘病毒為羊傳染性膿皰病毒(Orf virus)。
12. 如請求項1至11中任一項之方法，其中該核質轉運抑制劑係選自由以下組成之群：來普黴素A(Leptomycin A)、來普黴素B、拉塔酮A (Ratjadone A)、拉塔酮B、拉塔酮C、拉塔酮D、似蛇黴素A(Anguinomycin A)、哥納香內酯(Goniothalamin)、蓽茇亭鹼(piperlongumine)、白花丹素(plumbagin)、薑黃素(curcumin)、戊曲酯(valtrate)、乙醯氧基佳咪酚乙酸酯(acetoxychavicol acetate)、異戊烯香豆素蛇床子素(prenylcoumarin osthol)、KOS 2464、PKF050-638、CBS9106及賽琳克斯(Selinexor)。
13. 如請求項1至12中任一項之方法，其進一步包括在該宿主細胞感染痘病毒之前，使宿主細胞與核質轉運抑制劑接觸。
14. 如請求項1至13中任一項之方法，其進一步包括在宿主細胞感染痘病毒之後，使宿主細胞與該核質轉運抑制劑接觸。
15. 如請求項1至14中任一項之方法，其進一步包括由宿主細胞同時暴露至該核質轉運抑制劑及痘病毒。
16. 如請求項1至15中任一項之方法，其中該痘病毒的複製速率係比不存在該核質轉運抑制劑之情況下的複製速率快至少30%。
17. 如請求項1至16中任一項之方法，其中該核質轉運抑制劑在感染後24小時之後，使痘病毒之複製提高至少3倍。
18. 如請求項1至17中任一項之方法，其中使宿主細胞以低於2.0之感染倍率(MOI)與痘病毒接觸。
19. 如請求項1至18中任一項之方法，其中該核質轉運抑制劑之有效量在約0.0005 µM至約0.5 µM範圍內。
20. 如請求項1至19中任一項之方法，其中培養基包含該核質轉運抑制劑。
21. 如請求項1至20中任一項之方法，其中宿主細胞為永生化人類或靈長類細胞。
22. 如請求項1至21中任一項之方法，其中該宿主細胞來自用於在藥品優良製造規範(GMP)下製造痘病毒之細胞株。
23. 如請求項1至22中任一項之方法，其中該宿主細胞為人類A549細胞、海拉(HeLa)細胞、239細胞或靈長類非洲綠猴腎細胞(Vero cell)。
24. 如請求項1至23中任一項之方法，其進一步包括在該培養基中培育該經感染宿主細胞之前，先移除未吸附痘病毒。
25. 一種以提高之生長率及/或效價在細胞中產生痘病毒之方法，該方法包括： 使宿主細胞與有效量之核質轉運抑制劑接觸； 使宿主細胞與所關注痘病毒在容許該所關注痘病毒吸附至該宿主細胞之表面的條件下接觸；及 培養宿主細胞以產生所關注痘病毒之子代。
26. 如請求項25之方法，其進一步包括收集所關注痘病毒之子代。
27. 如請求項25或請求項26之方法，其中該所關注痘病毒經基因改造。
28. 如請求項25至27中任一項之方法，其中該核質轉運抑制劑包含以下一或多者：來普黴素A、來普黴素B、拉塔酮A、拉塔酮B、拉塔酮C、拉塔酮D，似蛇黴素A、哥納香內酯、蓽茇亭鹼、白花丹素、薑黃素、戊曲酯、乙醯氧基佳咪酚乙酸酯、異戊烯香豆素蛇床子素、KOS 2464、PKF050-638、CBS9106或賽琳克斯。
29. 如請求項25至28中任一項之方法，其中宿主細胞係在有效量之核質轉運抑制劑存在之情況下培養。
30. 如請求項25至29中任一項之方法，其中該所關注痘病毒為溶瘤病毒候選株。
31. 如請求項25至30中任一項之方法，其中該所關注痘病毒為野兔痘病毒。
32. 如請求項31之方法，其中該野兔痘病毒為黏液瘤病毒。
33. 如請求項25至30中任一項之方法，其中該所關注痘病毒為正痘病毒。
34. 如請求項33之方法，其中該正痘病毒為痘瘡病毒。
35. 如請求項34之方法，其中該痘瘡病毒係選自由以下組成之群的痘瘡病毒株：Lister、Wyeth、Western Reserve、經改造安卡拉痘瘡病毒及LC16m系列。
36. 如請求項33之方法，其中該正痘病毒為浣熊痘病毒。
37. 如請求項25至30中任一項之方法，其中該所關注痘病毒為山羊痘病毒。
38. 如請求項37之方法，其中該山羊痘病毒為羊傳染性膿皰病毒。
39. 如請求項25至38中任一項之方法，其中該宿主細胞為永生化人類或靈長類細胞。
40. 如請求項25至39中任一項之方法，其中該宿主細胞來自用於在藥品優良製造規範(GMP)下製造該所關注痘病毒之細胞株。
41. 如請求項25至40中任一項之方法，其中該宿主細胞為人類A549細胞、海拉細胞、239細胞或靈長類非洲綠猴腎細胞。
42. 如請求項25至41中任一項之方法，其中使該宿主細胞以介於約0.01與1.0之間的感染倍率(MOI)與該所關注痘病毒接觸。
43. 如請求項25至42中任一項之方法，其進一步包括在培養之前先移除未吸附之所關注痘病毒。
44. 如請求項25至43中任一項之方法，其中該核質轉運抑制劑之該有效量介於約0.0005 µM與約0.5 µM之間。

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