TW201809272A - 自限性、性別特異性基因及其使用方法 - Google Patents

自限性、性別特異性基因及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種用於所關注基因之性別特異性剪接及表現的剪接控制模組。在某些實施例中，基於dsx之剪接控制模組用於在昆蟲中表現以性別特異性方式剪接之致死基因，從而賦予雌性昆蟲而非雄性昆蟲致死性。

Description

自限性、性別特異性基因及其使用方法
交替剪接在範圍介於性別決定至細胞凋亡之許多發育過程中的基因表現調控方面發揮關鍵作用(Black, D. L. (2003)Annu. Rev. Biochem. 72, 291-336)，且交替剪接中之缺陷已與許多人類病症有關(Caceres, J. F.及Kornblihtt, A. R. (2002)Trends Genet. 18, 186-193)。一般而言，交替剪接係藉由與前體mRNA締合且用於增強或抑制剪接體識別側接經調控外顯子之剪接位點之能力的蛋白質調控(Smith, C. W.及Valcarcel, J. (2000)Trends Biochem. Sci. 25, 381-388)。 交替剪接涉及一或多個內含子之移除及側接外顯子之接合。此反應係由剪接體催化，剪接體為由包括小核RNA之五個RNA及蛋白質顆粒(snRNP)構成之大分子機器，其與前體mRNA組裝，藉由自真核生物核RNA移除內含子以實現RNA剪接，由此產生隨後在核糖體中轉譯成蛋白質的mRNA (Jurica, M. S.及Moore, M. J. (2003)Mol. Cell 12, 5-14；Smith, C. W.及Valcarcel, J. (2000)Trends Biochem. Sci. 25, 381-388)。交替剪接由單個基因產生多個mRNA，由此增加蛋白質組多樣性(Graveley, B. R. (2001)Trends Genet. 17, 100-107)。 每一個細胞中之成熟RNA是否將包括或排除特定替代性外顯子被認為由多種正剪接調控因子及負剪接調控因子之相對濃度及此等因子與前體mRNA及剪接體組分之相互作用而決定(Smith, C. W.及Valcarcel, J. (2000)Trends Biochem. Sci. 25, 381-388)。 登革熱(Dengue fever)為主要由蚊子埃及伊蚊(Aedes aegypti )傳播之病毒性疾病，據估計每年發生3.9億感染(Bhatt等人, 2013)。由於無特異性藥物可用且核准的疫苗Dengvaxia®的分佈有限(Villar等人, 2015, Constenia & Clark, 2016)，所以努力減少傳播主要取決於基於殺昆蟲劑之病媒防治(WHO-TDR, 2009)。埃及伊蚊亦傳播其他危險疾病，諸如黃熱病、基孔肯雅(chikungunya)及寨卡(Zika)。在殺昆蟲劑抗性可能散佈之情況下，研發轉殖基因病媒可提供藉由減小病媒群體之密度或病媒容量而有效限制疾病傳播之方法。 吾等已研發及測試賦予可抑制表型之自限性技術，藉以在不存在四環素類似物之情況下，使攜載轉殖基因複本之所有蚊子在早期幼蟲階段因由正反饋迴路產生之tTAV蛋白的累積而死亡。選擇及釋放不叮咬或傳播疾病之雄性蚊子與野生雌性交配，且因此遺傳自限性基因之子代因環境中缺乏四環素而無法存活至成蟲期。在產生用於釋放之蚊子時，使幼蟲及蛹在四環素存在下生長，其中蚊子蛹可成熟至成蟲期。然而，為了僅選擇雄性，蛹必須在羽化之前按性別分類。 目前，伊蚊屬(Aedes )蚊子之性別分離係藉由手動/機械程序進行。雖然程序非常有效，但其為極端勞動密集型的且人類錯誤可導致性別鑑定錯誤。其為中等至大規模操作程序中之低效方法。吾等已開創機械性別分類器的研發及用於自蛹將幼蟲分類之方法以便於大規模性別分類，但此等過於需要人們及品質控制而無法確保高效及精確的雄性產生。早期及非勞動密集型去除雌性可進一步增強成本節約效益，可由與目前可能相同的飼養環境產生可能兩倍多的雄性。 在此項技術中需要自選分離程序以提高雄性/雌性分離之準確度及效率。
本發明提供一種剪接控制模組，用於在生物體中差異表現所關注基因。 本發明提供一種雙性(dsx )剪接控制模組聚核苷酸，其自5'至3'包含： a.dsx 之外顯子4； b.dsx 之截短內含子4，包含dsx 內含子4之5'端片段及dsx 內含子4之3'片段； c.dsx 之外顯子5a； d.dsx 之內含子5； e.dsx 之經修飾之外顯子5b； f.dsx 之截短內含子6，包含dsx 內含子6之5'端片段及dsx 內含子6之3'片段；及 g. 外顯子6之5'片段。 在一些實施例中，dsx 剪接來源於埃及伊蚊(Aeadsx )。 在一些實施例中，dsx 剪接控制模組具有經修飾之外顯子5b，其中創建用於整個外顯子之開放閱讀框架。在一些實施例中，經修飾之外顯子5b包含至少一個取代、插入及/或缺失以形成用於整個外顯子之開放閱讀框架。 本發明提供一種dsx 剪接控制模組，其中當引入至昆蟲中時，在性別特異性基礎上發生剪接。在一些實施例中，昆蟲屬於選自由雙翅目(Diptera)或麗蠅科(Calliphoridae)組成之群之目。在一些實施例中，昆蟲為選自由以下組成之群之雙翅目昆蟲：地中海實蠅(Ceratitis capitata )、墨西哥實蠅(Anastrepha ludens )、東方實蠅(Bactrocera dorsalis )、橄欖實蠅(Bactrocera oleae)、瓜實蠅(Bactrocera cucurbitae )、納塔爾實蠅(Ceratitis rosa )、櫻桃實蠅(Rhagoletis cerasi )、昆士蘭實蠅(Bactrocera tyroni)、桃實蠅(Bactrocera zonata )、加勒比實蠅(Anastrepha suspensa )或西印度實蠅(Anastrepha obliqua )。 在一些實施例中，雙翅目昆蟲為選自由以下組成之群之屬的蚊子：覆蚊亞屬(Stegomyia )、伊蚊屬、按蚊屬(Anopheles )及庫蚊屬(Culex )。在特定實施例中，蚊子為選自由以下組成之群之物種：埃及伊蚊(Stegomyia aegyptae /Aedes aegypti )、白紋伊蚊(Stegomyia albopicta/Aedes albopictus )、斯氏按蚊(Anopheles stephensi )、淡色按蚊(Anopheles albimanus )及岡比亞按蚊(Anopheles gambiae )。 在其他實施例中，昆蟲為選自由以下組成之群之麗蠅科昆蟲：新大陸螺旋蠅(嗜人錐蠅(Cochliomyia hominivorax ))、舊大陸螺旋蠅(蛆症金蠅(Chrysomyabezziana ))及澳大利亞羊麗蠅(銅綠蠅(Lucilia cuprina ))。在其他實施例中，昆蟲為選自由以下組成之群之鱗翅目(Lepidoptera)昆蟲：蘋果蠹蛾(Cydia pomonella )、蠶(Bombyx mori )、棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella )、小菜蛾(Plutella xylostella )、舞毒蛾(Lymantria dispar )、臍橙螟(Amyelois transitella )、桃條麥蛾(Anarsia lineatella )、水稻三化螟(Tryporyza incertulas )及夜蛾(例如實夜蛾亞科(Heliothinae ))。 在其他實施例中，昆蟲為選自由以下組成之群之鞘翅目(Coleoptera)昆蟲：日本麗金龜(Popilla japonica )、白緣象甲(白緣象甲屬(Graphognatus spp. ))、棉鈴象甲(Anthonomous grandis )、玉米根蟲(根螢葉甲屬(Diabrotica spp .))及科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata )。 在某些特定實施例中，昆蟲為蚊子埃及伊蚊。 本發明亦提供一種基因表現系統，其包含具有本發明之雙性(dsx )剪接控制模組之聚核苷酸及編碼異源蛋白質之聚核苷酸。在一些實施例中，dsx 剪接控制模組來源於埃及伊蚊(Aeadsx )。 在一些實施例中，本發明之基因表現系統另外包含可操作地連接於該剪接控制模組之3'的編碼有害、致死或不育基因之聚核苷酸。在一些實施例中，基因為合成性四環素抑制性轉錄活化蛋白(tTAV)。在一些實施例中，基因表現系統另外包含與編碼該tTAV之該聚核苷酸的5'端同框融合的編碼融合前導多肽(例如泛素)之聚核苷酸序列。在一些實施例中，基因表現系統另外包含可操作地連接該剪接控制模組之5'的5'非轉譯區(5'UTR)。在一些實施例中，5'UTR包含在昆蟲中可操作之啟動子。在一些實施例中，啟動子為黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )最小HSP70啟動子(DmHsp70)。在一些實施例中，5'UTR另外包含四環素反應性操縱子(例如TetOx7)。在一些實施例中，基因表現系統另外包含可操作地連接該tTAV之3'的3'非轉譯區(3'UTR)。在一些實施例中，3'UTR為SV40 3'UTR。 本發明亦提供一種表現載體質體，其包含本發明之基因表現系統。在一些實施例中，表現載體質體另外包含編碼螢光標記蛋白(例如DsRed2)之聚核苷酸。在一些實施例中，編碼該螢光標記蛋白之聚核苷酸可操作地連接於啟動子(例如IE1啟動子)。在一些實施例中，表現載體質體另外包含piggyBac轉位元件端以引導該表現載體質體併入至生物體染色體中。 本發明亦提供一種經基因工程改造之昆蟲，其包含併入至該昆蟲之染色體中的基因表現系統，該基因表現系統包含具有以下之聚核苷酸構築體： a. 雙性(dsx )剪接控制模組，其中該剪接控制模組自5'至3'包含以下組件： b. 外顯子4； c.dsx 之截短內含子4，包含dsx 內含子4之5'端片段及dsx 內含子4之3'片段； d. 外顯子5a； e.dsx 之內含子5； f. 該dsx 之經修飾之外顯子5b； g.dsx 之截短內含子6，包含dsx 內含子6之5'端片段及dsx 內含子6之3'片段；及 h. 外顯子6之5'片段； i. 與位於該剪接控制模組之3'的編碼tTAV之聚核苷酸的5'端同框融合的編碼泛素之聚核苷酸；及 j. 位於該剪接控制模組之5'的5'UTR，其中該5'UTR包含四環素反應性操縱子(TetO x7)及啟動子。 在一些實施例中，經基因工程改造之昆蟲為蚊子，諸如選自由伊蚊屬、按蚊屬及庫蚊屬組成之群之屬中之一者。在一些實施例中，蚊子為埃及伊蚊。 在一些實施例中，經基因工程改造之昆蟲另外包含編碼螢光蛋白(例如DsRed2)之聚核苷酸。在一些實施例中，螢光蛋白可操作地連接於啟動子(例如IE1啟動子)。 本發明亦提供一種產生經基因工程改造之昆蟲的方法，其包含藉由插入基因表現系統修飾昆蟲之染色體，其中該基因表現系統包含： a. 雙性(dsx )剪接控制模組，其中該剪接控制模組自5'至3'包含以下組件： b. 外顯子4； c.dsx 之截短內含子4，包含dsx 內含子4之5'端片段及dsx 內含子4之3'片段； d. 外顯子5a； e.dsx 之內含子5； f. 該dsx 之經修飾之外顯子5b； g.dsx 之截短內含子6，包含dsx 內含子6之5'端片段及dsx 內含子6之3'片段；及 h. 外顯子6之5'片段； i. 與位於該剪接控制模組之3'的編碼tTAV之聚核苷酸的5'端同框融合的編碼泛素之聚核苷酸；及 j. 位於該剪接控制模組之5'的5'UTR，其中該5'UTR包含四環素反應性操縱子(TetO x7)及啟動子。 在本發明方法之一些實施例中，昆蟲為選自由伊蚊屬、按蚊屬及庫蚊屬組成之群之屬的蚊子。在一些實施例中，蚊子為埃及伊蚊。 在本發明方法之一些實施例中，基因表現系統另外包含編碼螢光蛋白(例如DsRed2)之聚核苷酸。在一些實施例中，螢光蛋白可操作地連接於啟動子(例如IE1啟動子)。 本發明亦提供一種選擇性飼養經基因工程改造之雄性昆蟲的方法，其包含在不存在四環素之情況下飼養本發明之經基因工程改造之昆蟲。 本發明亦提供一種藉由本發明方法產生之經基因工程改造之雄性昆蟲。 本發明亦提供一種減少野生昆蟲群體之方法，其包含使該野生昆蟲群體與複數個本發明之經基因工程改造之雄性昆蟲接觸，其中該經基因工程改造之雄性昆蟲與相同物種之野生雌性昆蟲交配。在一些實施例中，昆蟲為選自由伊蚊屬、按蚊屬及庫蚊屬組成之群之屬的蚊子。在一些實施例中，蚊子為埃及伊蚊。
相關申請案之交叉引用 本申請案主張2016年8月12日申請之名稱為「自限性、性別特異性基因及其使用方法(A SELF-LIMITING, SEX-SPECIFIC GENE AND METHODS OF USING)」的美國臨時專利申請案62/374,415、2016年11月10日申請之名稱為「自限性、性別特異性基因及其使用方法」的美國臨時專利申請案62/420,270的優先權，且其內容以全文引用的方式併入本文中用於所有目的。定義 本說明書含有對各種雜誌文章、專利申請案及專利之引用。此等如同各自在本文中闡述一般以全文引用的方式併入本文中。 如本文所用，術語「外顯率」係指攜載特定基因變異體之個體亦表現與該變異體相關之表型性狀的比例。因此，相對於本發明，「外顯率」係指表現致死表型之轉型生物體的比例。 如本文所用，術語「構築體」係指用於插入至宿主生物體中以便對該宿主生物體進行基因修飾之人工構築的DNA區段。構築體之至少一部分插入至宿主生物體之基因組中且改變宿主生物體之表型。構築體可形成載體之一部分或為載體。 如本文所用，術語「轉殖基因」係指包含有待插入至宿主生物體之基因組中以改變宿主生物體之表型的第一及第二基因表現系統之聚核苷酸序列。含有有待表現之基因的質體載體部分(例如，如圖 1 中所示)在本文中稱為轉移DNA或重組DNA (rDNA)。 如本文所用，術語「基因表現系統」係指有待表現之基因以及表現該有待表現之基因所需的任何基因及DNA序列。 如本文所用，術語「剪接控制序列」係指與基因相關之DNA序列，其中該DNA序列連同剪接體介導該基因之RNA產物的交替剪接。較佳地，剪接控制序列連同剪接體介導相關基因之RNA轉錄本的剪接以產生編碼功能蛋白之mRNA，且介導該RNA轉錄本之交替剪接以產生至少一個編碼非功能蛋白之替代性mRNA。「剪接控制模組」可含有多個剪接控制序列，其接合多個外顯子以形成多肽編碼核酸。 如本文所用，術語「轉錄活化活性」係指活化轉錄因子之活性，其使得基因表現增加。活化轉錄因子可結合可操作地連接於該基因之啟動子或操縱子，由此活化啟動子且因此增強該基因之表現。或者，活化轉錄因子可結合與該啟動子相關之強化子，由此經由該強化子提昇該啟動子之活性。 如本文所用，術語「致死基因」係指如下基因，其表現產物在足夠數量下對體內表現致死基因之生物體具有致死效應。 如本文所用，術語「致死效應」係指有害或不育效應，諸如能夠殺死生物體自身或其後代、或能夠減少或毀壞其某些組織(其中生殖組織尤其較佳)之功能，以使得生物體或其後代不育的效應。因此，一些致死效應，諸如毒物，將在相對於其壽命之短時限內殺死生物體或組織，而其他可簡單地減少生物體之功能，例如生殖。 如本文所用，術語「tTAV基因變異體」係指編碼功能性tTA蛋白、但在核苷酸序列方面有差異之聚核苷酸。此等核苷酸可編碼不同tTA蛋白序列，諸如tTAV2及tTAV3。 如本文所用，術語「啟動子」係指一般直接在編碼序列上游、基因之基礎及/或調控轉錄所需之DNA序列。具體而言，啟動子足以使得轉錄起始，一般具有轉錄起始開始位點及RNA聚合酶轉錄複合體之結合位點。 如本文所用，術語「最小啟動子」係指如上文所定義之啟動子，其一般具有轉錄起始開始位點及聚合酶複合體之結合位點，且一般另外具有足夠的附加序列以允許此兩者有效。可例如缺乏其他序列，諸如決定組織特異性之序列。 如本文所用，術語「外源控制因子」係指宿主生物體中未天然發現且宿主生物體之天然棲息地中未發現之物質，或宿主生物體之天然棲息地中未發現之環境條件。因此，外源控制因子之存在受轉型宿主生物體之操控者控制，以便控制基因表現系統之表現。 如本文所用，術語「tetO元件」係指串聯定位之一或多個tetO操縱子單元。如本文所用，例如術語「tetOx(數目)」係指由指示數目之tetO操縱子單元組成之tetO元件。因此，提及「tetOx7」指示由七個tetO操縱子單元組成之tetO元件。類似地，提及「tetOx14」係指由14個tetO操縱子單元組成之tetO元件，諸如此類。 如本文所用，術語「tra內含子」係指由tra蛋白(例如其結合)單獨或與TRA2組合(亦即，當複合時)調控RNA轉錄本之交替剪接的剪接控制序列。 當提及特定核苷酸或蛋白質序列時，應瞭解，此包括對其具有與其實質上等效生物活性之任何突變體或變異體的提及。較佳地，突變體或變異體與參考序列具有至少85%、較佳至少90%、較佳至少95%、較佳至少99%、較佳至少99.9%且最佳至少99.99%序列一致性。 然而，應瞭解，儘管存在上述序列同源性，但必須保留某些元件，尤其側接核苷酸及剪接分支位點，以便系統之高效運行。換言之，儘管部分可缺失或以其他方式改變，但應保留與野生型相比至少30%、較佳50%、較佳70%、更佳90%且最佳95%之交替剪接功能或活性。此亦可藉由例如適當工程改造結合交替剪接因子或與剪接體相互作用之位點而與野生型相比增加。 如本文所用，「剪接控制模組」意謂如下聚核苷酸構築體，其併入至載體中，當引入至昆蟲中時進行差異性剪接(例如階段特異性、性別特異性、組織特異性、生殖系特異性等)且因此若剪接控制模組以性別特異性方式賦予差異性剪接，則在雌性中形成與雄性不同的轉錄本。 如本文所用，雙性 (dsx )係指在雄性及雌性昆蟲(諸如雙翅目)中進行交替剪接之基因。 如本文所用，「5'UTR」係指RNA轉錄本之非轉譯區，其為轉錄本之轉譯部分之5'且通常含有啟動子序列。 如本文所用，「3'UTR」係指RNA轉錄本之非轉譯區，其為轉錄本之轉譯部分之3'且通常含有聚腺苷酸化序列。A. 技術概述 本發明提供用於在昆蟲中以性別特異性方式差異表現蛋白質之構築體及方法，以使得雄性昆蟲或雌性昆蟲將表現蛋白質而另一者將不表現。本發明之構築體已經剪接控制模組工程改造，該剪接控制模組在雄性昆蟲中以與雌性昆蟲不同的方式剪接。剪接控制模組可操作地連接於編碼異源蛋白質之聚核苷酸，以使得當引入至昆蟲物種中時，以性別特異性方式表現所關注之異源蛋白質。本發明之構築體亦可含有其他元件用於調控在昆蟲中之表現，用於鑑別在基因組中具有整合構築體之昆蟲，及用於選擇轉型細胞，例如下文將更充分地描述。i. 剪接控制模組 因此，在第一態樣中，本發明提供一種剪接控制模組聚核苷酸序列，其提供生物體中之差異性剪接(例如性別特異性、階段特異性、生殖系特異性、組織特異性等)。具體而言，本發明提供一種剪接控制模組，其提供足夠有用的表現所關注基因之雌性特異性。在本發明之某些實施例中，所關注基因為賦予有害、致死或不育效應之基因。為方便起見，本說明書將係指致死效應，然而應瞭解，剪接模組可用於其他所關注基因，如下文中所進一步詳述。 轉殖基因之顯性致死基因之表現可為性別特異性的，或為性別特異性及階段特異性、生殖系特異性或組織特異性之組合，歸因於每一個基因表現系統中存在至少一個剪接控制模組可操作地連接於有待差異表現之所關注基因。在一些實施例中，性別特異性表現為雌性特異性的。每一個基因表現序列中之剪接控制模組允許附加控制水準的蛋白質表現，啟動子除外。 剪接控制模組之基因包含蛋白質或多肽之編碼序列，亦即至少一個外顯子及較佳兩個或大於兩個外顯子，從而能夠編碼多肽，諸如蛋白質或其片段。較佳地，將不同外顯子差異剪接在一起以提供替代性mRNA。較佳地，該等交替剪接之mRNA具有不同編碼潛能，亦即編碼不同蛋白質或多肽序列。因此，編碼序列之表現係藉由交替剪接而調控。 系統中之每一個剪接控制模組包含至少一個剪接受體位點及至少一個剪接供體位點。供體及受體位點之數目可視有待剪接在一起之序列區段之數目而變化。 在一些實施例中，剪接控制模組藉助於內含子及外顯子核苷酸調控交替剪接。應瞭解，在交替剪接中，序列可在一些情形下為內含子(亦即在剪接掉內含子之一些交替剪接變異體中)，但在其他情形下為外顯子。在其他實施例中，剪接控制模組為內含子剪接控制模組。換言之，較佳的是該剪接控制序列實質上來源於形成內含子之一部分的聚核苷酸且因此藉由剪接自初級轉錄本切除，以使得此等核苷酸不保留在成熟mRNA序列中。 如上文所提及，外顯子序列可參與介導交替剪接之控制，但較佳的是，至少一些內含子控制序列參與介導交替剪接。 剪接控制模組可藉由剪接自前體RNA移除或保留，從而編碼至少一部分有待差異表現之所關注基因的融合蛋白。較佳地，剪接控制模組不會導致所產生之剪接變異體的讀框轉移。較佳地，此為編碼全長功能蛋白之剪接變異體。 剪接控制模組與細胞剪接機器(例如剪接體)之相互作用引起或介導一連串、較佳至少50個連續核苷酸自初級轉錄本移除及初級轉錄本中不連續之核苷酸序列接合(剪接)在一起(因為該等核苷酸序列或若考慮反義序列，其互補序列，在轉錄初級轉錄本之原始模板序列中不連續)。該一連串至少50個連續核苷酸包含內含子。此介導較佳以性別特異性、更佳雌性特異性方式作用，以使得在不同性別中且視情況亦在不同階段、組織類型等中之等效初級轉錄本傾向於移除不同大小或序列之內含子，或在一些情況下，可在一種情況下移除內含子，但其他情況不移除。此現象，亦即在不同情形中移除不同大小或序列之內含子或在不同情形中差異性移除給定大小或序列之內含子，稱為交替剪接。交替剪接為自然界中所熟知的現象，且已知許多實例。 當交替剪接之介導為性別特異性的時，編碼有待在生物體中表現之功能蛋白之剪接變異體較佳為F1剪接變異體，亦即F表示其僅或主要在雌性中發現(但此並非必需的)之剪接變異體。 當欲移除外顯子核苷酸時，若需要避免讀框轉移，則此等外顯子核苷酸必須以三之倍數(完整密碼子)移除，但若需要誘導讀框轉移，則以單核苷酸或二之倍數(亦非三之倍數)形式移除。應瞭解，若僅移除一個或二之特定倍數個核苷酸，則此可能導致在mRNA之剪接點處或周圍編碼完全不同的蛋白質序列。 在一系統實施例中，其中卡匣外顯子用於中斷一些剪接變異體而非其他剪接變異體中之開放閱讀框架，諸如在例如tra ，尤其Cctra 中(參見下文)，情況尤其如此。 相應地，對於功能性開放閱讀框架之全部或一部分在卡匣外顯子上之組態，此卡匣外顯子較佳包括於僅或主要在雌性中發現之轉錄本中，且此類轉錄本較佳單獨或組合為雌性中發現之最豐富的變異體，但此並非必需的。 在一個較佳實施例中，序列包括於雜交或重組序列或構築體中，該等序列來源於天然存在之內含子序列，其自身在其天然或原始情形中進行交替剪接。因此，內含子序列可視為在天然類似物之至少一個交替剪接變異體中形成內含子之一部分的序列。因此，設想與天然存在之內含子序列的單個連續片段對應的序列，以及此類序列之雜交序列，包括來自兩種不同天然存在之內含子序列之雜交序列，以及相對於天然存在之內含子序列的單個連續片段具有缺失或插入的序列及其雜交序列。該等來源於天然存在之內含子序列的序列本身可在本發明中與本身並非任何天然存在之內含子之一部分的序列相關聯。若此類序列經轉錄且較佳保留在至少一個剪接變異體之成熟RNA中，則其可隨後視為外顯子。 亦應瞭解，提及「讀框轉移」可亦指終止密碼子之直接編碼，其亦可能產生非功能蛋白，如同核苷酸之插入或缺失將引起所剪接之mRNA序列的破壞一般。除兩個或大於兩個不同蛋白質或多肽序列(其中一或多個具有未預計或不可辨別的功能)之產物外，亦設想兩個或大於兩個具有差異性功能之不同蛋白質或多肽序列之不同剪接變異體的產物。亦設想兩個或大於兩個具有類似功能，但亞細胞定位、穩定性或結合於或與其他蛋白質或核酸締合的能力不同之不同蛋白質或多肽序列之不同剪接變異體的產物。 此較佳實例包括經修飾之dsx 內含子。在此情況下，如吾等已在實例中進行，可較佳使交替剪接之內含子缺失相當大量、例如在一些情況下90%或大於90%之內含子，而仍保留交替剪接功能。因此，儘管設想大量缺失，但亦設想較少、例如甚至單個核苷酸插入、取代或缺失亦為較佳的。ii. 剪接模組之實例 a.Tra 序列 如上文所提及，在一些實施例中，交替剪接之方式或機制為性別特異性的、較佳雌性特異性的，且可使用任何適合之剪接控制序列。在一些實施例中，至少一個剪接控制模組來源於tra 內含子。來自性別轉換基因(transformer gene)之地中海實蠅tra 內含子首先由Pane等人 (2002)Development 129:3715-3725表徵。舉例而言，在昆蟲中，tra 蛋白在不同性別中差異表現。具體而言，已知tra 蛋白大部分存在於雌性中且因此，以一定方式介導交替剪接以使得編碼序列以性別特異性方式表現，亦即在一些情況下，蛋白質僅在雌性中表現或與在雄性中相比以高得多的水準在雌性中表現，或者在其他情況下，蛋白質僅在雄性中表現或與在雌性中相比以高得多的水準在雄性中表現。用於達成此由tra 蛋白或TRA/TRA-2複合體介導之性別特異性交替剪接的機制為已知的且論述於例如Pane等人 (2002)Development 129:3715-3725中。 應瞭解，其他物種中存在來自性別轉換基因之地中海實蠅tra 內含子的同源物，且其可易於在該等物種中以及其不同屬中鑑別出。因此，當提及tra 時，應瞭解，此亦關於其他物種中之tra 同源物。因此，在一些實施例中，交替剪接機制各自獨立地來源於地中海實蠅tra 內含子(Cctra )或另一直系同源物或同源物。在一些實施例中，直系同源物或同源物來自節肢動物，諸如雙翅目、諸如實蠅科之昆蟲。在其他實施例中，直系同源物或同源物來自錐蠅屬(Cochliomyia )、舌蠅屬(Glossina )、綠蠅屬(Lucilia )、家蠅屬(Musca )、蠟實蠅屬(Ceratitis )、果實蠅屬(Bactrocera )、按實蠅屬(Anastrepha )或繞實蠅屬(Rhagoletis )。在其他實施例中，直系同源物或同源物來自納塔爾實蠅或桃實蠅。在其他實施例中，直系同源物或同源物來自桃實蠅，且此直系同源物或同源物在本文中稱為Bztra (GenBank寄存編號BzTra KJ397268)。直系同源物亦可來自膜翅目(Hymenoptera)或鞘翅目。實例包括(但不限於)中華蜜蜂(Apis cerana )、大蜜蜂(Apis dorsata )、小蜜蜂(Apis florea )、意大利蜜蜂(Apis mellifera )、美洲大頭切葉蟻(Atta cephalotes )、北美熊蜂(Bombus impatiens )、歐洲熊蜂(Bombus terrestris )、佛羅里達弓背蟻(Camponotus floridanus )、蘭花蜜蜂(Euglossa hemichlora) 、印度跳蟻(Harpegnathos saltator )、阿根廷蟻(Linepithema humile )、扁平麥蜂(Melipona compressipes )、苜蓿切葉蜂(Megachile rotundata )、吉氏金小蜂(Nasonia giraulti )、長角金小蜂(Nasonia longicornis )、麗蠅蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis )、紅收穫蟻(Pogonomyrmex barbatus )、紅火蟻(Solenopsis invicta )及赤擬穀盜(Tribolium castaneum )。 具體而言，Cctra 中之剪接模式非常保守，其中在雄性中發現之彼等轉錄本相對於F1轉錄本含有額外外顯子物質，以使得此等轉錄本不編碼全長功能性tra 蛋白。相比之下，F1轉錄本的確編碼全長功能性tra 蛋白；此轉錄本在大部分生命週期階段為實質上雌性特異性的，但據推測兩種性別之極早期胚可含有少量此轉錄本。吾等將自F1轉錄本而非雄性特異性或非性別特異性轉錄本剪接掉的序列描述為tra 內含子或甚至tra F1內含子。因此，Cctra 基因中所發現之此序列的版本為Cctra 內含子。 因此，tra 基因係由性別特異性交替剪接部分調控，而其關鍵產物tra 蛋白本身參與交替剪接。在昆蟲中，由tra 蛋白或包含tra 蛋白及TRA2蛋白之複合體介導的性別特異性交替剪接包括雙翅目昆蟲的來源於雙性(dsx )基因之剪接控制序列以及tra 內含子本身，但此將不包括主要由果蠅屬(Drosophila )中之Sxl 基因產物而非tra 或TRA/TRA2複合體介導的來自果蠅屬之tra 內含子(Dmtra )。在果蠅屬外，Sxl 基因產物未在不同性別中差異表現。Sxl 未被認為在非果蠅屬昆蟲中之性別特異性交替剪接之介導方面起作用。 應瞭解，在提及tra 內含子時，「來源於」係指序列近似於或精確複製tra 內含子，在此情況下如由Pane等人 (2002), 見上文描述於此項技術中。然而，應瞭解，由於此等為內含子序列，可添加或缺失或取代一些核苷酸而無實質性功能損失。 若將大於一個剪接控制模組併入至本發明之基因表現系統中，則剪接控制模組可相同或不同。在一些實施例中，剪接控制模組較佳來源於不同物種以降低重組之風險。因此，在一些實施例中，第一及第二剪接控制序列中之一者為Cctra 且另一者來源於不同物種。在一個實施例中，第一及第二剪接控制序列中之一者為Cctra 且另一者為Bztra (GenBank寄存編號BzTra KJ397268)。 在一特定實施例中，第一剪接控制序列為Cctra 且第二剪接控制序列為Bztra (GenBank寄存編號BzTra KJ397268)。來源於tra 內含子之剪接控制序列的精確長度並不重要，只要其能夠調節交替剪接即可。在此方面，據認為大約55至60個核苷酸為經修飾之tra 內含子的最小長度，但來自地中海實蠅之野生型tra 內含子(F1剪接變異體)為約1345個核苷酸長。b. 肌動蛋白 -4 在其他實施例中，剪接控制序列中之至少一者來源於自節肢動物、較佳實蠅科獲得之肌動蛋白 -4 基因的交替剪接機制。在大於一個剪接序列來源於肌動蛋白 -4 之實施例中，該等剪接序列可來源於相同或不同實蠅科物種。在一些實施例中，肌動蛋白 -4 基因各自獨立地來源於蠟實蠅屬、果實蠅屬、按實蠅屬或繞實蠅屬之物種。在其他實施例中，第一及第二肌動蛋白 -4 基因獨立地來源於地中海實蠅、橄欖實蠅、納塔爾實蠅或桃實蠅。在一些實施例中，第一及第二肌動蛋白 -4 基因中之至少一者來源於地中海實蠅。在大於一個剪接控制序列來源於肌動蛋白 -4 之實施例中，剪接控制序列可來源於相同物種。然而，剪接控制序列較佳來源於不同物種以減少重組。c. 雙性 在一些實施例中，剪接控制序列中之至少一者包含來源於節肢動物、諸如實蠅科之雙性 (dsx )基因之至少一個片段。在一些實施例中，大於一個剪接控制序列(例如第一及第二剪接控制序列)來源於dsx ，且dsx 基因來源於相同或不同物種。在一些實施例中，dsx 基因來源於雙翅目之物種，諸如(但不限於)伊蚊屬、按蚊屬、錐蠅屬、庫蚊屬、果蠅屬、舌蠅屬、綠蠅屬、羅蛉屬(Lutzomyia )、蠟實蠅屬、果實蠅屬、按實蠅屬、麥癭蚊屬(Mayetiola )、異蚤蠅屬(Megaselia )、家蠅屬、白蛉屬(Phlebotomus )及繞實蠅屬之物種。在一些實施例中，dsx 基因獨立地來源於埃及伊蚊、按蚊屬、岡比亞按蚊、按實蠅屬、地中海實蠅、橄欖實蠅、東方實蠅、桃實蠅、番石榴實蠅(Bactrocera correcta )、昆士蘭實蠅、納塔爾實蠅、嗜人錐蠅、腐敗錐蠅(Cochliomyia macellaria )、致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus )、美洲果蠅(Drosophila Americana )、埃瑞克塔果蠅(Drosophila erecta )、海德氏果蠅(Drosophila hydei )、毛里塔尼亞果蠅(Drosophila mauritania )、黑腹果蠅、塞克爾果蠅(Drosophila sechellia )、擬果蠅(Drosophila simulans )、大果蠅(Drosophila virilis )、刺舌蠅(Glossina morsitans )、銅綠蠅、絲光綠蠅(Lucilia sericata )、長鬚羅蛉(Lutzomyia longipalpis )、黑森癭蚊(Mayetiola destructor )、蛆症異蚤蠅(Megaselia scalaris )、家蠅(Musca domestica )及靜食白蛉(Phlebotomus papatasi )。 在一些實施例中，dsx 基因來源於毛虱目之物種，諸如人體虱(pediculus humanus corporis )。 在一些實施例中，dsx 基因來源於半翅目之物種，包括諸如(但不限於)豌豆長管蚜(Acyrthosiphon pisum )及長紅獵蝽(Rhodnius prolixus )之物種。 在一些實施例中，dsx 基因來源於膜翅目之物種，包括(但不限於)蜜蜂屬(Apis )、切葉蟻屬(Atta )、熊蜂屬(Bombus )、弓背蟻屬(Camponotus )、蘭花蜜蜂屬(Euglossa )、鐮猛蟻屬(Harpegnathos )、直殖臭蟻屬(Linepithema )、麥蜂屬(Melipona )、切葉蜂屬(Megachile )、金小蜂屬(Nasonia )、收穫蟻屬(Pogonomyrmex )及火蟻屬(Solenopsis )之昆蟲。適合之物種之實例包括(但不限於)中華蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、意大利蜜蜂、美洲大頭切葉蟻、北美熊蜂、歐洲熊蜂、佛羅里達弓背蟻、蘭花蜜蜂、印度跳蟻、阿根廷蟻、扁平麥蜂、苜蓿切葉蜂、吉氏金小蜂、長角金小蜂、麗蠅蛹集金小蜂、紅收穫蟻、紅火蟻。 在一些實施例中，dsx 基因來源於鱗翅目之物種，包括(但不限於)柞蠶屬(Antheraea )、家蠶蛾屬(Bombyx )、斑蝶屬(Danaus )、袖蝶屬(Heliconius )及稈野螟屬(Ostrinia )之昆蟲。適合之物種之實例包括(但不限於)琥珀蠶(Antheraea assama)、印度柞蠶(Antheraea mylitta )、蠶、黑脈金斑蝶(Danaus plexippus )、紅帶袖蝶(Heliconius Melpomene )、小菜蛾、棉紅鈴蟲及豆稈野螟(Ostrinia scapulalis )。 在一些實施例中，dsx 基因來源於鞘翅目之物種，包括(但不限於)大小蠹屬(Dendroctonus )、嗡蜣螂屬(Onthophagus )及擬穀盜屬(Tribolium )之昆蟲。適合之物種之實例包括(但不限於)中歐山松大小蠹(Dendroctonus ponderosae )、斯里蘭卡蜣螂(Onthophagussagittarius )、角蜣螂(Onthophagus taurus )及赤擬穀盜。 在一些實施例中，dsx 基因來源於撚翅目(Strepsiptera)之物種，包括(但不限於)撚翅蟲屬(Mengenilla) 之昆蟲(例如撚翅蟲(Mengenilla moldrzyki) )。 在一些實施例中，第一及第二dsx 基因中之至少一者來源於相同昆蟲，諸如埃及伊蚊。在大於一個剪接控制序列來源於dsx 之實施例中，剪接控制序列可來源於相同物種。在其他實施例中，剪接控制序列來源於不同物種。 在一個實施例中，本發明提供一種雙性(dsx )剪接控制模組聚核苷酸，其中該剪接控制模組包含(自5'至3')：dsx 之外顯子4之至少一部分、較佳完整外顯子(如SEQ ID NO: 13所示之埃及伊蚊之實例)；dsx 之截短內含子4，包含至少一個含有內含子4之5'端之至少一部分的dsx 內含子4之5'端片段(如SEQ ID NO: 12所示之埃及伊蚊之實例)及含有內含子4之3'端之至少一部分的dsx 內含子4之3'片段(如SEQ ID NO: 11所示之埃及伊蚊之實例)；dsx 之外顯子5a之至少一部分、較佳完整外顯子5a (如SEQ ID NO: 6所示之埃及伊蚊之實例)；dsx 之內含子5之至少一部分、較佳完整內含子5 (如SEQ ID NO: 10所示之埃及伊蚊之實例)；dsx 之經修飾之外顯子5b (如SEQ ID NO: 7所示之埃及伊蚊之實例)；截短內含子6，含有dsx 之內含子6之5'端之至少一部分(如SEQ ID NO: 9所示之埃及伊蚊之實例)連接於dsx 之內含子6之3'片段之至少一部分(如SEQ ID NO: 8所示之埃及伊蚊之實例)形成截短內含子6；及dsx 之外顯子6之5'區之至少一部分(如SEQ ID NO: 5所示之埃及伊蚊之實例)。dsx 剪接控制模組允許模組對編碼多肽之聚核苷酸進行性別特異性剪接，以使得多肽以性別特異性方式表現。在一特定實例中，在雌性伊蚊中產生兩種主要轉錄本：轉錄本F1含有外顯子4、5a及內含子5，其充當3' UTR且含有聚腺苷酸化信號；轉錄本F2含有外顯子4、外顯子5b及截短外顯子6連同與轉錄本之其餘部分及外顯子4之5'轉譯起始位點同框的所關注之異源基因。在雄性伊蚊中，剪接形式含有外顯子4及外顯子6，但所關注之異源基因與外顯子4之5'轉譯起始位點不同框(圖 3 )。 雖然在一些實施例中，據設想剪接控制模組來源於同一來源之相同基因或內含子，但在其他實施例中，剪接控制模組來源於同一來源之不同基因或內含子。舉例而言，在一些實施例中，剪接控制模組中之一者來源於tra 內含子且另一剪接控制模組來源於肌動蛋白 -4 基因或dsx 基因。 較佳地，剪接控制模組在起始密碼子之3'。當剪接控制模組在起始密碼子之3'時，其較佳亦在第一同框終止密碼子之5'(亦即在起始密碼子之3'且與起始密碼子同框)，以使得交替剪接產生編碼不同蛋白質或多肽序列之轉錄本。因此，在一較佳實施例中，構築體或聚核苷酸序列以相對於有義股或初級轉錄本之5'至3'順序包含以下元件：轉錄起點、轉譯起點、能夠交替剪接之內含子、全部或部分蛋白質之編碼序列、終止密碼子。iii. 剪接 內含子通常由以下特徵組成(此處按有義DNA序列5'至3'給出)；在RNA中胸腺嘧啶(T)應替換為尿嘧啶(U))： a. 5'端(稱為剪接「供體」)：GT (或可能GC) b. 3'端(稱為剪接「受體」)：AG c. 受體之上游/5' (稱為「分支點」)：A-多嘧啶串，亦即AYYYYY…Yn 緊鄰5'內含子剪接「供體」及3'內含子剪接「受體」之外顯子的末端核苷酸通常為G。 在一些實施例中，剪接控制模組在3'方向上緊鄰起始密碼子，以使得ATG之G在剪接控制模組起點(5'端)之5'。此可為有利的，因為其允許ATG起始密碼子之G成為剪接控制模組之5' G側邊序列。 或者，剪接控制模組在起始密碼子之3'，但在10,000外顯子bp、9,000外顯子bp、8,000外顯子bp、7,000外顯子bp、6,000外顯子bp、5,000外顯子bp、4,000外顯子bp、3,000外顯子bp、2000外顯子bp或1000外顯子bp、較佳500外顯子bp、較佳300外顯子bp、較佳200外顯子bp、較佳150外顯子bp、較佳100外顯子bp、更佳75外顯子bp、更佳50外顯子bp、更佳30外顯子bp、更佳20外顯子bp且最佳10或甚至5、4、3、2或1外顯子bp內。 較佳地，每一個剪接控制序列中包括分支點，如上所述。分支點為剪接供體最初接合的序列，其顯示剪接分兩個階段發生，其中分離5'外顯子且隨後接合至3'外顯子。 所提供之序列可容許一些序列變化且仍正確剪接。已知少數核苷酸為重要的。其為所有剪接均需要的核苷酸。內含子之初始GU及最終AG尤其重要且因此為較佳的，如別處所論述，但實際上~5%之內含子以GC起始。此共同序列為較佳的，但其適用於所有剪接而非特異性針對交替剪接。iv. 所關注之異源基因 系統能夠表現至少一個所關注之蛋白質，亦即有待在生物體中表現之該功能蛋白。該至少一個所關注之蛋白質可具有治療效應，或可為標記(例如DsRed、綠色螢光蛋白(GFP)或其突變體或變異體中之一或多者)或此項技術中所熟知之其他標記，諸如抗藥性基因。其他所關注之蛋白質可為例如具有有害、致死或不育效應之蛋白質。或者，所關注基因可編碼具有抑制效應之RNA分子。有待在生物體中表現之其他蛋白質當然可設想為與該功能蛋白、較佳如下文所論述之致死基因組合。 異源聚核苷酸序列之表現較佳在生物體中引起表型結果。在一些實施例中，功能蛋白不為β-半乳糖苷酶，但可與可見標記(包括螢光)、成活力、生育力、繁殖力、適應度、飛行能力、視覺及行為差異相關聯。當然應瞭解，在一些實施例中，表現系統通常具有條件性，其中表型僅在一些例如限制性條件下表現。 有待在生物體中表現之至少一個異源聚核苷酸序列為異源序列。應理解，「異源」係指將不存在於野生型中、通常發現與至少一個剪接控制序列之至少一個元件或組件相關聯或連接之序列。舉例而言，當剪接控制序列來源於特定生物體且異源聚核苷酸為蛋白質或多肽之編碼序列，亦即為編碼功能蛋白之聚核苷酸序列時，則編碼序列可部分或完全來源於相同生物體之基因，只要轉錄聚核苷酸序列之至少一些部分之來源與至少一個剪接控制序列之來源不相同即可。或者，編碼序列可來自不同生物體且在此情形中，可認為係「外源的」。異源聚核苷酸亦可認為係「重組的」，因為蛋白質或多肽之編碼序列來源於相同基因組(亦即單個物種或亞種之基因組)或不同基因組(亦即來自不同物種或亞種之基因組)內之不同位置或合成來源。 異源可指除剪接控制序列以外之序列且因此可關於以下事實：啟動子及諸如5' UTR及/或3'UTR之其他序列可與有待在生物體中表現之聚核苷酸序列異源，其限制條件為未發現該聚核苷酸序列與野生型、亦即該聚核苷酸序列之天然情形(若存在)中之啟動子、5' UTR及/或3'UTR相關聯或可操作地連接。 應理解，異源亦適用於不來源於特定生物體但基於不同生物體之數個組件的「設計物」或雜交序列，因為此亦將滿足序列及剪接控制序列之至少一個組件在野生型中未連接或發現關聯之要求，即使發現雜交序列之一個部分或元件如此，只要至少一個部分或元件並非如此即可。亦應理解，天然存在之序列的合成型式為設想的。除非此類合成序列屬於與在野生型或天然情形中將通常發現與至少一個剪接控制序列之至少一個元件或組件相關聯或連接之序列一致的序列，否則其亦視為異源的。 此同樣適用於當異源聚核苷酸為干擾RNA之聚核苷酸時。 在一個實施例中，當有待表現之聚核苷酸序列包含蛋白質或多肽之編碼序列時，應瞭解提及在生物體中表現係指提供一或多個轉錄RNA序列、較佳成熟mRNA，但此可較佳亦指該生物體中之轉譯多肽。a. 致死基因 在一些實施例中，有待在生物體中表現之功能蛋白具有致死、有害或不育效應。當在本文中提及致死效應時，應瞭解此延伸至有害或不育效應，諸如能夠殺死生物體本身或其後代、或能夠減少或毀壞其某些組織(其中生殖組織尤其較佳)之功能，以使得生物體或其後代不育的效應。因此，一些致死效應，諸如毒物，將在相對於其壽命之短時限內殺死生物體或組織，而其他可簡單地減少生物體之功能，例如生殖。 導致不育的致死效應尤其較佳，因為此允許生物體在自然環境中(「在野外」)與野生型生物體競爭，但不育昆蟲隨後無法產生可存活的後代。以此方式，本發明在昆蟲中實現與諸如不育昆蟲技術(SIT)之技術類似或更佳的結果，而無與SIT相關聯之問題，諸如成本、對使用者之危險及經輻照生物體之競爭力下降。 較佳地，系統包含至少一個正反饋機制，亦即至少一個有待經由交替剪接差異表現之功能蛋白及至少一個其對應的啟動子，其中有待表現之基因的產物充當至少一個啟動子之正轉錄控制因子，且由此產物或產物之表現為可控的。較佳地，強化子與啟動子相關聯，基因產物用於經由強化子增強啟動子活性。 本發明允許選擇性控制第一及/或第二顯性致死基因之表現，由此提供致死表型之表現的選擇性控制。因此，應瞭解每一個致死基因編碼功能蛋白，諸如WO2005/012534中所述。 每一個致死基因具有條件性致死效應。適合之條件的實例包括溫度，以使得在一種溫度下表現致死，但在另一種溫度下不表現或程度較小。適合之條件的另一個實例為物質之存在或不存在，由此在該物質之存在或不存在(而非兩者)下表現致死。致死基因之效應較佳為條件性的且不在需要生物體之自然環境中不存在的物質存在的容許條件下表現，以使得致死系統之致死效應發生在生物體之自然環境中。 每一個致死基因系統可作用於特異性細胞或組織或對整個生物體施加其效應。亦設想不嚴格致死但施加相當大適應度代價的系統，例如導致失明、不能飛(對於可能通常飛行的生物體)或不育。亦設想干擾性別決定的系統，例如使所有或部分生物體自一種性別類型轉換或傾向於轉換成另一種。 在一些實施例中，至少一個致死基因之產物較佳為細胞凋亡誘導因子，諸如Candé等人 (2002)J. Cell Science 115:4727-4734)中所述之AIF蛋白質或其同源物。AIF同源物發現於哺乳動物中且甚至發現於無脊椎動物中，包括昆蟲、線蟲、真菌及植物，意味著AIF基因已保留在整個真核生物界。在其他實施例中，至少一個致死基因之產物為Hid，亦即黑腹果蠅之頭部退化缺陷基因的蛋白質產物，或Reaper (Rpr )，亦即果蠅屬之reaper基因之產物或其突變體。Hid 之用途係由Heinrich及Scott (2000)Proc. Natl Acad. Sci USA 97:8229-8232)描述。突變體衍生物HidAla5 之用途係由Horn及Wimmer (2003)Nature Biotechnology 21:64-70)描述。Rpr 之突變體衍生物RprKR 之用途描述在本文中(亦參見White等人 (1996);Science 271(5250):805-807；Wing等人 (2001)Mech. Dev. 102(1-2):193-203；及Olson等人 (2003)J. Biol. Chem. 278(45):44758-44768。Rpr 及Hid 均為促細胞凋亡蛋白質，據認為結合至IAP1。IAP1為非常保守的抗細胞凋亡蛋白質。因此預期Hid 及Rpr 在整個寬譜系學範圍內起作用(Huang等人 (2002)；Vernooy等人 (2000)J. Cell Biol. 150(2):F69-76)，儘管其自身序列並不非常保守。 在一些實施例中，採用Nipp1Dm ，亦即哺乳動物Nipp1 之果蠅屬同源物(Parker等人 (2002)Biochemical Journal368:789-797；Bennett等人, (2003)Genetics 164:235-245)。如熟習此項技術者應理解，Nipp1Dm 若在適合水平下表現，則為具有致死效應之蛋白質的另一個實例。實際上，具有致死效應之蛋白質的許多其他實例應為熟習此項技術者已知。 在其他實施例中，致死基因為tTA 或tTAV 基因變異體，其中tTA表示『四環素可抑制性轉活化因子』且V表示『變異體』。tTAV為tTA 之類似物，其中tTA 之序列已經修飾以增強與所需昆蟲物種之相容性。tTAV之變異體可能編碼tTA蛋白，以使得tTAV 基因產物具有與tTA 基因產物相同的功能性。因此，tTAV 基因之變異體包含相比於tTA 核苷酸序列及彼此經修飾之核苷酸序列，但編碼具有相同功能之蛋白質。因此，tTAV 基因變異體可用於代替tTA 。在一些實施例中，tTA變異體蛋白含有胺基酸取代、添加或缺失。可使用致死基因之任何組合，且在一些實施例中，致死基因為相同的，但在其他實施例中，致死基因為不同的。致死效應之外顯率提高及致死性較早發作係藉由致死產物之累積來達成。 在特定實施例中，第一及第二致死基因各自獨立地為tTA或tTAV基因變異體。在一些實施例中，第一及第二致死基因各自獨立地為tTAV (SEQ ID NO:3)、tTAV2 (SEQ ID NO:27)及tTAV3 (SEQ ID NO:28)中之一者。在其他實施例中，第一及第二致死基因為相同的。在其他實施例中，第一及第二致死基因中之一者為tTAV (SEQ ID NO:3)，且另一基因為tTAV3 (SEQ ID NO:28)。然而，可使用tTAV 變異體之任何組合；因此，在一些實施例中，第一及第二基因中之一者為tTAV (SEQ ID NO:3)且另一者為tTAV2 (SEQ ID NO:27)，而在另一個實施例中，第一及第二基因中之一者為tTAV2 (SEQ ID NO:27)且另一基因為tTAV3 (SEQ ID NO:28)。在其他實施例中，第一致死基因為tTAV (SEQ ID NO:3)且第二致死基因為tTAV3 (SEQ ID NO:28)。b. RNAi 有待表現之聚核苷酸序列可包含干擾RNA (RNAi)之聚核苷酸。在一些實施例中，當有待表現之聚核苷酸序列包含干擾RNA之聚核苷酸時，亦應理解提及在生物體中表現係指干擾RNA之聚核苷酸或其轉錄本在RNAi路徑中例如藉由結合Dicer (RNA Pol III類酶)或形成小干擾RNA (siRNA)之相互作用。此類序列能夠提供例如較佳呈初級轉錄本形式之雙股RNA (dsRNA)的一或多個片段，其繼而能夠藉由Dicer處理。此類片段包括例如可形成環之單股RNA的片段，諸如短髮夾RNA (shRNA)中所發現之彼等片段，或具有實質上自我互補之較長區的片段。 實際上，干擾RNA之聚核苷酸尤其較佳包含siRNA序列且因此，較佳為20-25個核苷酸長，尤其當生物體為哺乳動物時。 尤其在昆蟲及線蟲中，較佳例如藉由髮夾形成提供部分dsRNA，其可隨後藉由Dicer系統處理。哺乳動物細胞一般針對長dsRNA序列產生干擾素反應，因此對於哺乳動物細胞，提供較短序列(諸如siRNA)更常見。亦設想與作為天然存在之靶向蛋白質3' UTR之RNA分子的微RNA具有同源性的反義序列或序列作為根據本發明之一實施例的RNAi序列。 因此，當系統為DNA時，干擾RNA之聚核苷酸為去氧核糖核苷酸，其在轉錄成前體RNA核糖核苷酸時，提供一段dsRNA，如上文所論述。 當干擾RNA之聚核苷酸經定位以使對交替剪接的干擾減至最小時，該等聚核苷酸尤其較佳。此可藉由自交替剪接控制序列遠端、較佳控制序列之3'定位此等聚核苷酸來達成。在另一較佳實施例中，實質上自我互補區可藉由一或多個介導交替剪接之剪接控制序列(諸如內含子)彼此分隔。較佳地，自我互補區排列為一連串兩個或大於兩個反向重複序列，每一個反向重複序列由剪接控制序列、較佳內含子分隔，如別處所定義。 在此組態中，不同交替剪接之轉錄本的實質上自我互補區可由成熟(交替剪接後)轉錄本中不同長度之非自我互補序列分隔。應瞭解，實質上自我互補區為例如由於序列之部分能夠與序列之其他部分鹼基配對而能夠形成髮夾之彼等區。此兩個部分不一定彼此精確互補，因為可存在一些錯配或容許各部分中存在彼此無法鹼基配對的片段。此類片段可能不會在另一部分中具有同等物，因此而喪失對稱性及形成「凸起」，如同一般鹼基對互補作用已知者。 在另一較佳實施例中，相對於至少一個剪接控制序列，定出實質上與初級轉錄本之另一部分互補的一或多個序列區段之位置，以使其不包括於所有藉由初級轉錄本之交替剪接產生之轉錄本中。藉由此方法，產生一些傾向於產生dsRNA之轉錄本，而其他轉錄本則不會產生；藉由介導交替剪接，例如性別特異性介導、階段特異性介導、生殖系特異性介導、組織特異性介導及其組合，可依性別特異性、階段特異性、生殖系特異性或組織特異性方式或其組合產生dsRNA。v. 融合前導序列 在一些實施例中，希望所關注之功能蛋白不含剪接控制模組蛋白質序列。在一些實施例中，剪接控制模組可操作地連接於編碼多肽之聚核苷酸，以刺激所轉譯多肽(聚核苷酸之「融合前導序列」及所編碼多肽之「融合前導多肽」)之蛋白質裂解。此類融合前導序列之實例為編碼泛素之聚核苷酸。此類融合前導序列可操作地同框連接於剪接控制模組之3'端且可操作地同框連接於所關注之蛋白質編碼基因(亦即5'至3'：剪接控制模組-融合前導序列-所關注基因)。在此情況下，藉由細胞中之特異性蛋白酶，而自所關注之蛋白質裂解剪接控制模組/融合前導多肽。除泛素以外，可得到任何其他類似融合物來代替泛素，其應具有刺激N端剪接控制模組裂解之效應。vi. 啟動子及 5 'UTR 每一個致死基因可操作地連接於啟動子，其中該啟動子能夠由轉錄活化因子活化或由基因編碼之轉活化亦包括於基因表現系統中之至少一者中。較佳地設想啟動子及剪接控制模組之任何組合。啟動子較佳特異性針對具有短時間或受限空間效應、例如細胞自主效應之特定蛋白質。 啟動子可為大或複雜的啟動子，但其在引入至非宿主昆蟲中時常常遭遇利用不足或不調和的缺點。因此，在一些實施例中，較佳採用最小啟動子。應瞭解，最小啟動子可直接自已知來源之啟動子獲得，或來源於較大的天然存在的或以其他方式已知的啟動子。適合之最小啟動子及其如何獲得將為熟習此項技術者顯而易見的。舉例而言，適合之最小啟動子包括來源於Hsp70之最小啟動子、P最小啟動子、CMV最小啟動子、基於Acf5C之最小啟動子、BmA3啟動子片段及Adh核心啟動子(Bieschke, E.等人 (1998)Mol. Gen. Genet. , 258:571-579)。並非所有最小啟動子將必需在所有昆蟲物種中加以研究，但關於如何確保啟動子具有活性為熟習此項技術者顯而易見的。本發明中所存在之可操作地連接之啟動子中之至少一者較佳在宿主生物體之早期發育期間且尤其較佳在胚期具有活性，以確保致死基因在生物體之早期發育期間得以表現。 在一些實施例中，啟動子可藉由環境條件、例如存在或不存在特定因子(諸如本文所述之tet系統中之四環素)來活化，以使得所關注基因之表現可易於由熟習此項技術者操縱。或者，適合之啟動子的較佳實例為hsp70熱休克啟動子，其允許使用者利用例如宿主在實驗室中或在野外所暴露之環境溫度的變化來控制表現。溫度控制之另一較佳實例描述於Fryxell及Miller (1995)J. Econ. Entomol. 88:1221-1232中。 在一些實施例中，啟動子為來自黑腹果蠅之sryα胚特異性啟動子(Horn及Wimmer (2003)Nat. Biotechnol. 21(1):64-70)或其同源物，或來自其他胚特異性或胚活性基因之啟動子，諸如果蠅屬慢吞吞基因(slam)之啟動子或其來自其他物種之同源物。 或者，啟動子可特異性針對更廣類別之具有長期及/或廣泛系統效應之蛋白質或特異性蛋白質，諸如激素、正或負生長因子、形態發生素或其他分泌性或細胞表面信號傳導分子。此將允許例如表現模式更廣泛，以使得形態發生素啟動子與階段特異性交替剪接機制之組合可致使形態發生素僅在達到特定生命週期階段後表現，但超過該生命週期階段仍將感覺到形態發生素之效應(亦即形態發生素可仍起作用且具有效應)。較佳實例將為形態發生素/信號傳導分子Hedgehog、無翅/WNT、TGFβ/BMP、EGF及其同源物，其為熟知的進化保守性信號傳導分子。 亦設想，由一系列蛋白質因子(例如轉活化因子)或具有廣泛全身性效應之蛋白質(諸如激素或形態發生素)活化之啟動子可與交替剪接機制組合使用，以達成組織及性別特異性控制或性別及階段特異性控制，或階段、組織、生殖系及性別特異性控制之其他組合。 亦設想，大於一種啟動子及視情況選用之其對應的強化子可作為用於啟動相同蛋白質轉錄之替代性構件或藉助於基因系統包含大於一種基因表現系統(亦即大於一種基因及其隨附啟動子)之事實用於本發明系統中。 在一些實施例中，至少一個啟動子為最小啟動子，該最小啟動子為熱休克啟動子，諸如Hsp70。在其他實施例中，至少一個啟動子為來自黑腹果蠅之sryα胚特異性啟動子(Horn及Wimmer (2003)Nat. Biotechnol. 21(1):64-70)或其同源物，或來自其他胚特異性或胚活性基因之啟動子，諸如果蠅屬慢吞吞基因(slam)之啟動子或其來自其他物種之同源物。 在一些實施例中，至少一個啟動子為最小啟動子。在一些實施例中，啟動子各自獨立地為桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾(Autographica californica )核型多角體病毒(AcNPV)啟動子IE1、Hsp70、Hsp73或sryα。在較佳實施例中第一及第二啟動子中之一者為Hsp70且另一者為sryα。在一個實施例中，第一啟動子為Hsp70且第二啟動子為sryα。每一個基因表現系統另外包含編碼轉錄活化因子之基因，其中每一個轉錄活化因子活化轉殖基因之致死基因的表現。因此，每一個編碼轉錄活化因子之基因能夠由宿主生物體表現，以產生功能蛋白。具體而言，每一個轉錄活化因子能夠活化至少一個啟動子，其中該啟動子可操作地連接於致死基因。因此，當轉錄活化因子活化啟動子時，可操作地連接於該啟動子之致死基因的表現上調。每一個轉錄活化因子可作用於第一或第二啟動子，或每一個轉錄活化因子可作用於第一及第二啟動子。較佳地，當表現大於一種轉錄活化因子時，活化大於一種啟動子。因此，當表現第一及第二轉錄活化因子時，活化第一及第二啟動子。充當轉錄活化因子之基因產物可以任何適合之方式起作用。舉例而言，轉錄活化因子可結合於經定位接近至少一個啟動子之強化子，由此用於增強在該啟動子處之聚合酶結合。可採用其他機制，諸如抑制因子抵消機制，諸如阻斷轉錄或轉譯抑制劑。轉錄抑制劑可例如藉由使用髮夾RNA或核酶阻斷編碼抑制劑之mRNA的轉譯來阻斷，或產物可直接結合抑制劑，由此防止抑制轉錄或轉譯。vii. 可抑制元件 較佳地，聚核苷酸表現系統為重組顯性致死基因系統，其致死效應為條件性的。舉例而言，適合之條件包括溫度，以使得系統在一種溫度下表現，但在另一種溫度下不表現或程度較小。致死基因系統可作用於特異性細胞或組織或對整個生物體施加其效應。應理解，所有此類系統及結果由如本文所用之術語致死涵蓋。類似地，「殺死」及類似術語係指致死系統之有效表現且由此施加有害或性別扭轉表型，例如死亡。 更佳地，聚核苷酸表現系統為重組顯性致死基因系統，其致死效應為條件性的且不在需要生物體之自然環境中不存在的物質存在的容許條件下表現，以使得致死系統之致死效應發生在生物體之自然環境中。 在一些實施例中，編碼致死之編碼序列連接於系統，諸如WO 01/39599及/或WO2005/012534中所述之tet系統。 實際上，該致死基因之表現較佳在可抑制轉活化蛋白的控制下。表現受交替剪接調控之基因亦較佳編碼轉活化蛋白，諸如tTA。此不與經調控之致死蛋白質不相容。實際上，兩者皆有尤其較佳。在此方面，吾等尤其偏好系統包括正反饋系統，如WO2005/012534中所教示。 較佳地，顯性致死系統之致死效應為可條件性抑制的。 因此，在一或多個顯性致死基因為tTA或tTAV基因變異體之一些實施例中，強化子為包含一或多個tetO操縱子單元之tetO元件。在啟動子之上游，沿任一取向，tetO在由tTA基因或tTAV基因變異體之產物所結合時能夠自與其緊密接近之啟動子增強轉錄水平。在一些實施例中，強化子各自獨立地為tetOxl、tetOx2、tetOx3、tetOx4、tetOx5、tetOx6、tetOx7、tetOx8、tetOx9、tetOx10、tetOx11、tetOx12、tetOx13、tetOx14、tetOx15、tetOx16、tetOx17、tetOx18、tetOx19、tetOx20及tetOx21中之一者。在一些實施例中，強化子各自獨立地為tetOx1、tetOx14及tetOx21中之一者。在包含大於一種強化子之實施例中，第一強化子與第二強化子相同或不同。TetOx7元件之實例展示於SEQ ID NO: 14中。viii. 其他元件 在一些實施例中，系統包含其他上游5'因子及/或下游3'因子用於控制表現。實例包括強化子，諸如來自果蠅屬卵黃蛋白基因之脂肪體強化子，及來自桿狀病毒之同源區(hr)強化子，例如AcNPV Hr5。亦應瞭解，RNA產物將包括例如適合之5'及3' UTR。 應理解，參考起始及終止密碼子，在其兩者之間界定有待在生物體中表現之聚核苷酸序列，但此並不排除至少一個剪接控制序列、其元件或其他序列(諸如內含子)定位在此區域中。實際上，由本發明說明書將顯而易見，在一些實施例中，剪接控制序列可定位於此區域中。 此外，剪接控制序列例如至少可與起始密碼子重疊，在此意義上，ATG之G在一些實施例中可為剪接控制序列之初始5' G。因此，可認為術語「之間」係指自起始密碼子(初始核苷酸之3'，亦即A)、較佳起始密碼子之第二核苷酸之3' (亦即T)開始直至終止密碼子之第一核苷酸之5'側。或者，如由聚核苷酸序列之簡單讀取將顯而易見，亦可包括終止密碼子。ix. 一般且併入允許複製之元件的載體 在本發明之實施例中，系統為或包含質體。如上文所提及，此可為DNA、RNA或兩者之混合物。若系統包含RNA，則其可較佳藉助於逆轉錄酶將RNA逆轉譯成DNA。若需要逆轉錄，則系統亦可包含RT蛋白之編碼序列及其對應的適合之啟動子。或者，RT酶及啟動子因此可提供於另一系統上，諸如病毒。在此情況下，系統將僅在經該病毒感染後活化。熟習此項技術者應清楚，需要包括適用於逆轉錄酶或RNA依賴性RNA聚合酶之順式作用序列。 然而，尤其較佳的是，系統主要為DNA且更佳至少關於有待在生物體中表現之序列，僅由DNA組成。B. 構築體引入至生物體中 關於相關生物體，基因系統構築體之引入或轉型及誘導表現之方法為此項技術中所熟知。應瞭解，系統或構築體較佳以質體形式投與，但一般在整合至基因組中後測試。可藉由此項技術中已知的方法投與，諸如非經腸、靜脈內肌肉內、經口、經皮、跨黏膜遞送等。注射至胚中尤其較佳。質體在投與之前或期間可為線性化的，且並非所有質體可整合至基因組中。當質體僅部分整合至基因組中時，此部分較佳包括至少一個能夠介導交替剪接之剪接控制模組。 質體載體可藉由此項技術中已知之方法引入至所需宿主細胞中，諸如藉由轉染、電穿孔、顯微注射、轉導、細胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沈澱、脂質體轉染(溶酶體融合)、使用基因槍或DNA載體轉運體(參見例如Wu等人, (1992)J. Biol. Chem. 267:963；Wu等人 (1988)J. Biol. Chem. 263:14621；及Hartmut等人之加拿大專利申請案第2,012,311號)。質體載體可藉由任何已知方式整合至宿主染色體中。可使用熟知的基因座特異性插入方法，包括同源重組及重組酶介導之基因組插入。在另一個實施例中，基因座特異性插入可藉由重組酶位點特異性基因插入進行。在一個實例中，piggyBac序列可併入至載體中以驅動載體插入至宿主細胞染色體中。亦可採用其他技術，諸如CRISPR、TALEN、AttP/AttB重組。C. 經基因工程改造之昆蟲 可使用本發明系統之適合之生物體包括非人類哺乳動物，諸如小鼠、大鼠及農畜。魚類亦較佳，諸如鮭魚及鱒魚。植物亦較佳，但宿主生物體尤其較佳為昆蟲、較佳雙翅目或實蠅科。 本發明之載體可用於在廣泛多種屬及物種中產生轉殖基因昆蟲。可用本發明之載體轉型的昆蟲包括(但不限於)雙翅目、尤其高等雙翅目中之昆蟲，諸如實蠅科果蠅，諸如地中海實蠅、墨西哥實蠅、東方實蠅、橄欖實蠅、瓜實蠅、納塔爾實蠅、櫻桃實蠅、昆士蘭實蠅、桃實蠅、加勒比實蠅或西印度實蠅。宿主生物體亦尤其較佳為蚊子，較佳來自覆蚊亞屬、伊蚊屬、按蚊屬或庫蚊屬。尤其較佳為埃及伊蚊、白紋伊蚊、斯氏按蚊、淡色按蚊及岡比亞按蚊。 在雙翅目內，可使用本發明之載體修飾之另一群為麗蠅科，諸如新大陸螺旋蠅(嗜人錐蠅)及舊大陸螺旋蠅(蛆症金蠅)。其他雙翅目物種包括澳大利亞羊麗蠅(銅綠蠅)、苜蓿斑潛蠅(Agromyza frontella ) (alfalfa blotch leafminer)、潛蠅屬(Agromyza spp. ) (潛葉蠅)、斑虻屬(Chrysops spp. ) (斑虻)、康癭蚊屬(Contarinia spp. ) (癭蚊)、葉癭蚊屬(Dasineura spp. ) (癭蚊)、芸苔莢癭蚊(Dasineura brassicae ) (甘藍癭蚊)、地種蠅屬(Delia spp. )、灰地種蠅(Delia platura ) (種蠅)、果蠅屬(醋蠅)、廁蠅屬(Fannia spp. ) (家蠅)、黃腹廄蠅(Fannia canicularis ) (小家蠅)、瘤脛廁蠅(Fannia scalaris ) (灰腹廁蠅)、大馬胃蠅(Gasterophilus intestinalis ) (馬胃蠅)、Gracillia perseae 、騷擾角蠅(Haematobia irritans ) (角蠅)、種蠅屬(Hylemyia spp. ) (根蛆)、紋皮蠅(Hypoderma lineatum ) (common cattle grub)、斑潛蠅屬(Liriomyza spp. ) (斑潛蠅)、芸苔斑潛蠅(Liriomyza brassica ) (蛇形斑潛蠅)、綿羊虱蠅(Melophagus ovinus ) (綿羊蜱)、家蠅屬(蠅科)、秋家蠅(Musca autumnalis ) (面蠅)、家蠅(house fly)、羊鼻蠅(Oestrus ovis ) (sheep bot fly)、瑞典麥稈蠅(Oscinella frit ) (替潛蛆)、甜菜泉蠅(Pegomyia betae ) (甜菜潛葉花蠅)、草種蠅屬(Phorbia spp. )、胡蘿蔔莖蠅(Psila rosae ) (胡蘿蔔莖潛蠅)、蘋果實蠅(Rhagoletis pomonella ) (apple maggot)、麥紅吸漿蟲(Sitodiplosis mosellana ) (橙麥花蚊)、廄螫蠅(Stomoxys calcitrans ) (stable fly)、虻屬(Tabanus spp. ) (馬蠅)及大蚊屬(Tipula spp. ) (大蚊)。 鱗翅目可同樣使用本發明之載體修飾。此等實例包括(但不限於)飛揚阿夜蛾(Achoea janata )、褐帶卷蛾屬(Adoxophyes spp. )、棉褐帶卷蛾(Adoxophyes orana )、地夜蛾屬(Agrotis spp. ) (地老虎)、球菜夜蛾(Agrotis ipsilon ) (小地老虎)、棉葉波紋葉蛾(Alabama argillacea ) (棉葉蟲)、西方酪梨捲葉蟲(Amorbia cuneana )、臍橙螟(Amyelosis transitella ) (navel orangeworm)、Anacamptodes defectaria 、黃麻夜蛾(Anomis sabulifera ) (jute looper)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis ) (velvetbean caterpillar)、果樹黃卷蛾(Archips argyrospila ) (果樹卷葉蟲)、玫瑰黃卷蛾(Archips rosana ) (玫瑰卷葉蟲)、帶卷蛾屬(Argyrotaenia spp. ) (卷蛾)、橙帶卷蛾(Argyrotaenia citrine ) (orange torrid)、丫紋夜蛾(Autograph gamma )、Bongos crunodes 、稻縱卷葉螟(Bourbon cinnabar ) (rice leaf folder)、棉潛蛾(Bucculatrix thurberiella ) (棉葉潛蛾)、麗細蛾屬(Caloptilia spp. ) (潛葉蟲)、菸捲蛾(Capua reticulana )、桃蛀果蛾(Carposina niponensis ) (peach fruit moth)、禾草螟屬(Chilo spp. )、芒果橫線尾夜蛾(Chlumetia transversa ) (果梢斑螟)、薔薇斜條卷葉蛾(Choristoneura rosaceana ) (斜紋卷葉蟲)、錁紋夜蛾屬(Chrysodeixis spp. )、草地卷葉蛾(Cnaphalocerus medinalis ) (草地卷葉蟲)、豆粉蝶屬(Colias spp. )、荔枝爻紋細蛾(Conpomorpha cramerella )、芳香木蠹蛾(Cossus cossus ) (木蠹蛾)、草螟屬(Crambus spp. ) (草地螟)、李小食心蟲(Cydia funebrana ) (梅果蛾)、梨小食心蟲(Cydia molesta ) (東方果蛾)、豆小食心蟲(Cydia nignicana ) (豌豆蛀莢蛾)、蕁麻毛蟲(Darna diducta )、絹野螟屬(Diaphania spp. ) (鑽心蟲)、桿草螟屬(Diatraea spp. ) (條螟)、小蔗螟(Diatraea saccharalis ) (甘蔗螟蟲)、西南玉米螟(Diatraca graniosella ) (southwester corn borer)、鑽夜蛾屬(Earias spp. ) (棉鈴蟲)、埃及鑽夜蛾(Earias insulata ) (埃及棉鈴蟲)、翠紋鑽夜蛾(Earias vitella ) (北方棉鈴蟲)、Ecdytopopha aurantianum 、小玉米莖蛀蟲(Elasmopatpus lignosellus ) (lesser cornstalk borer)、淺褐蘋果蛾(Epiphysias postruttana ) (light brown apple moth)、粉斑螟屬(Ephestia spp. ) (粉蛾)、粉斑螟(Ephestia cautella ) (almond moth)、菸草粉斑螟(Ephestia elutella ) (菸草蛾)、地中海粉螟(Ephestia kuehniella ) (地中海粉蛾)、Epimeces spp. 、斜紋夜蛾(Epinotia aporema )、香蕉弄蝶(Erionota thrax ) (banana skipper)、葡萄螟蛾(Eupoecilia ambiguella ) (grape berry moth)、原切根蟲(Euxoa auxiliaris ) (行軍切葉蟲)、髒切葉蛾屬(Feltia spp. ) (地老虎)、構夜蛾屬(Gortyna spp. ) (蛀莖蟲)、梨小食心蟲(Grapholita molesta ) (東方果蛾)、三紋螟蛾(Hedylepta indicata ) (豆卷葉螟)、鈴夜蛾屬(Helicoverpa spp. ) (夜蛾)、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera ) (cotton bollworm)、玉米穗蟲(Helicoverpa zea ) (螟蛉/玉米穗蟲)、實夜蛾屬(Heliothis spp. ) (夜蛾)、美洲菸葉蛾(Heliothis virescens ) (菸青蟲)、菜螟(Hellula undalis ) (cabbage webworm)、蛀根蟲屬(Indarbela spp. ) (根蛀蟲)、番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella ) (番茄蟯蟲)、茄黃斑螟(Leucinodes orbonalis ) (茄果蛀蟲)、旋紋潛蛾(Leucoptera malifoliella )、細蛾屬(Lithocollectis spp. )、葡萄漿果小卷蛾(Lobesia botrana ) (葡萄果蛾)、豆夜蛾屬(Loxagrotis spp. ) (夜蛾)、豆白隆切根蟲(Loxagrotis albicosta ) (西部豆夜蛾)、窄翅潛葉蛾(Lyonetia clerkella ) (蘋果潛葉蛾)、油棕櫚結草蟲(Mahasena corbetti ) (油棕櫚蓑蛾)、天幕毛蟲屬(Malacosoma spp. ) (天幕毛蟲)、甘藍夜蛾(Mamestra brassicae ) (甘藍黏蟲)、豆莢野螟(Maruca testulalis ) (豆莢蛀蟲)、結草蟲(Metisa plana ) (蓑蛾)、黑點秘夜蛾(Mythimna unipuncta ) (黏蟲)、小番茄蛀蟲(Neoleucinodes elegantalis ) (small tomato borer)、稻三點水螟(Nymphula depunctalis ) (稻縱卷葉螟)、冬尺蛾(Operophthera brumata ) (冬尺蠖蛾)、歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis ) (European corn borer)、Oxydia vesulia 、葡萄褐卷蛾(Pandemis ccrasana ) (常見醋粟卷葉蛾)、蘋褐卷蛾(Pandemis heparana ) (brown apple tortrix)、非洲達摩鳳蝶(Papilio demodocus )、疆夜蛾屬(Peridroma spp. ) (地老虎)、豆雜角夜蛾(Peridroma saucia ) (豆雜色夜蛾)、咖啡潛葉蛾(Perileucoptera coffeella ) (white coffee leafminer)、馬鈴薯塊莖蛾(Phthorimaea operculella ) (potato tuber moth)、柑桔潛葉蛾(Phyllocnisitis citrella )、潛葉蛾屬(Phyllonorycter spp. ) (潛葉蛾)、菜粉蝶(Pieris rapae ) (菜青蟲)、苜蓿綠夜蛾(Plathypena scabra )、印度穀螟(Plodia interpunctella ) (Indian meal moth)、葡萄漿果蛾(Polychrosis viteana ) (grape berry moth)、桔果巢蛾(Prays endocarpa )、油橄欖巢蛾(Prays oleae ) (橄欖蛾)、黏蟲屬(Pseudaletia spp. ) (夜蛾)、一點黏蟲(Pseudaletia unipunctata ) (黏蟲)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens ) (大豆尺蠖)、尺蠖(Rachiplusia nu )、三化螟(Scirpophaga incertulas )、蛀莖夜蛾屬(Sesamia spp. ) (蛀莖蟲)、稻蛀莖夜蛾(Sesamia infercns ) (粉螟)、Sesamia nonagrioides 、銅斑褐刺蛾(Setora nitens )、麥蛾(Sitotroga cerealella ) (Angoumois grain moth)、葡萄長鬚卷葉蛾(Sparganothis pilleriana )、夜蛾屬(Spodoptera spp. ) (黏蟲)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua ) (beet armyworm)、草地貪夜蛾(Spodoptera fugiperda ) (偽黏蟲)、灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis ) (棉葉蟲)、南方夜蛾(Spodoptera oridania ) (南方黏蟲)、透翅蛾屬(Synanthedon spp. ) (根蛀蟲)、鳳梨鑽心蟲(Thecla basilides )、Thermisia gemmatalis 、衣蛾(Tineola bisselliella ) (負袋夜蛾)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni ) (甘藍尺蠖)、番茄斑潛蠅(Tuta absoluta )、巢蛾屬(Yponomeuta spp. )、咖啡豹蠹蛾(Zeuzera coffeae ) (紅枝蟲)、梨豹蠹蛾(Zeuzera pyrina ) (豹蠹蛾)、蘋果蠹蛾(Cydia pomonella ) (蘋果小卷蛾)、蠶(silk worm)、棉紅鈴蟲(pink bollworm)、小菜蛾(diamondback moth)、舞毒蛾(Gypsy moth)、臍橙螟(臍橙蠕蟲)、桃條麥蛾(Peach Twig Borer)、水稻三化螟(水稻螟蟲)及實夜蛾亞科(夜蛾)。 在鞘翅目當中，實例包括(但不限於)三齒豆象屬(Acanthoscelides spp. ) (象鼻蟲)、菜豆象(Acanthoscclides obtectus ) (大豆象)、白蠟窄吉丁(Agrilus planipennis ) (綠灰蟲)、錐尾叩甲屬(Agriotes spp. ) (金針蟲)、光肩星天牛(Anoplophora glabripennis ) (亞洲長角甲蟲)、花象屬(Anthonomus spp. ) (象鼻蟲)、棉鈴象甲(Anthonomus grandis ) (棉籽象鼻蟲)、蚜繭蜂屬(Aphidius spp. )、長喙小象屬(Apion spp. ) (象鼻蟲)、甘蔗金龜屬(Apogonia spp. ) (蠐螬)、黑絨金龜(Ataenius spretulus ) (Black Turgrass Ataenius)、甜菜隱食甲(Atomaria linearis ) (pygmy mangold beetle)、守瓜屬(Aulacophore spp. )、甜菜象甲(Bothynoderes punctiventris ) (甜菜象鼻蟲)、豆象屬(Bruchus spp. ) (象鼻蟲)、豌豆象(Bruchus pisorum ) (豌豆象鼻蟲)、Cacoesia spp. 、四紋豆象(Callosobruchus maculatus ) (南方豇豆象鼻蟲)、曲露尾甲(Carpophilus hemipteras ) (乾果露尾甲)、甜菜龜甲(Cassida vittata )、天牛屬(Cerosterna spp )、葉甲屬(Cerotoma spp. ) (金花蟲)、豆葉甲(Cerotoma trifurcata ) (bean leaf beetle)、龜象屬(Ceutorhynchus spp. ) (象鼻蟲)、甘藍籽龜象(Ceutorhynchus assimilis ) (甘藍莢象甲)、甘藍莖象蟲(Ceutorhynchus napi ) (cabbage curculio)、凹脛跳甲屬(Chaetocnema spp. ) (葉甲)、肖葉甲屬(Colaspis spp. ) (土壤甲蟲)、Conoderus scalaris 、Conoderus stigmosus 、李象鼻蟲(Conotrachelus nenuphar ) (梅錐象甲)、黃櫨亮甲(Cotinus nitidis ) (六月綠金龜)、天冬負泥甲(Crioceris asparagi ) (石刁柏葉甲)、鏽赤扁穀盜(Cryptolestes ferrugineus ) (rusty grain beetle)、長角扁穀盜(Cryptolestes pusillus ) (flat grain beetle)、土耳其扁穀盜(Cryptolestes turcicus ) (Turkish grain beetle)、金針蟲屬(Ctenicera spp. ) (金針蟲)、象甲屬(Curculio spp. ) (象鼻蟲)、方頭甲屬(Cyclocephala spp. ) (蠐螬)、向日葵莖象甲(Cylindrocpturus adspersus ) (sunflower stem weevil)、芒果切葉象甲(Deporaus marginatus ) (mango leaf-cutting weevil)、火腿皮蠹(Dermestcs lardarius ) (larder beetle)、白腹皮蠹(Dermestes maculates ) (hide beetle)、根螢葉甲屬(葉甲)、墨西哥豆瓢蟲(Epilachna varivestis ) (Mexican bean beetle)、菸草鑽孔蟲(Faustinus cubae )、蒼白樹皮象(Hylobius pales ) (pales weevil)、細叉葉象屬(Hypera spp. ) (象鼻蟲)、苜蓿葉象甲(Hypera postica ) (alfalfa weevil)、Hyperdoes spp. (Hyperodes weevil)、咖啡果小蠹(Hypothenemus hampei ) (coffee berry beetle)、小蠹屬(Ips spp. ) (小蠹)、菸草甲(Lasioderma serricome ) (cigarette beetle)、科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Colorado potato beetle)、Liogenys futscus 、Liogenys suturalis 、稻象甲(Lissorhoptrus oryzophilus ) (稻水象蟲)、粉蠹屬(Lyctus spp. ) (木甲蟲/粉甲蟲)、Maecolaspis joliveti 、Megascelis spp. 、Melanotus communis 、菜花露尾甲屬(Meligethes spp. )、油菜露尾甲(Meligethes aeneus ) (花甲蟲)、歐洲鰓角金龜(Melolontha mclolontha ) (common European cockchafer)、腓筒天牛(Oberea brevis )、線筒天牛(Oberea linearis )、椰蛀犀金龜(Oryctes rhinoceros ) (棗椰樹甲蟲)、大眼鋸穀盜(Oryzaephilus mercator ) (市場鋸穀盜)、鋸胸粉扁蟲(Oryzaephilus surinamensis ) (鋸穀盜)、耳喙象屬(Otiorhynchus spp. ) (象鼻蟲)、黑角負泥蟲(Oulema melanopus ) (穀葉甲蟲)、稻負泥蟲(Oulema oryzae )、短喙象屬(Pantomorus spp .) (象鼻蟲)、食葉鰓金龜屬(Phyllophaga spp. ) (五／六月甲蟲)、六月金龜(Phyllophaga cuyabana )、條跳甲屬(Phyllotreta spp. ) (葉甲)、蘋虎象屬(Phynchites spp. )、日本麗金龜(Popillia japonica )(Japanese beetle)、大穀蠹(Prostephanus truncates ) (larger grain borer)、穀蠹(Rhizopertha dominica ) (lesser grain borer)、切根鰓金龜屬(Rhizotrogus spp. ) (歐洲金龜子)、棕櫚象屬(Rhynchophorus spp. ) (象鼻蟲)、小蠹屬(Scolytus spp. ) (木蠹)、喙甲屬(Shenophorus spp. ) (喙甲)、豌豆葉象甲(Sitona lineatus ) (pea leaf weevil)、米象屬(Sitophilus spp. ) (穀象)、穀象(Sitophilus granaries )(granary weevil)、米象(Sitophilus oryzae ) (rice weevil)、藥材甲(Stegobium paniceum ) (drugstore beetle)、擬穀盜屬(Tribolium spp .) (麵粉甲蟲)、赤擬穀盜(red flour beetle)、雜擬穀盜(Tribolium confusum ) (confused flour beetle)、花斑皮蠹(Trogoderma variabile ) (倉庫甲蟲)及婪步甲(Zabrus tenebioides )。 另外，半翅目亦可用本發明之載體修飾。可如此修飾之半翅目的非限制性實例包括：喜綠蝽(Acrosternum hilare ) (green stink bug)、多毛長蝽(Blissus leucopterus ) (高粱長蝽)、馬鈴薯盲蝽(Calocoris norvegicus ) (potato mirid)、熱帶臭蟲(Cimex hemipterus ) (tropical bed bug)、溫帶臭蟲(Cimex lectularius ) (床虱)、Dichelops melacanthus (Dallas)、Dagbertus fasciatus 、Dichelops furcatus 、棉黑翅紅蝽(Dysdercus suturellus ) (污棉蟲)、Edessa meditabunda 、穀長蝽(Eurygaster maura ) (穀蟲)、小菜蝽(Euschistus heron )、褐蝽象(Euschistus servus ) (褐臭蝽)、腰果刺盲蝽(Helopeltis antonii )、茶角盲蝽(Helopeltis theivora ) (tea blight plantbug)、蝽屬(Lagynotomus spp. ) (椿象)、大稻緣蝽(Leptocorisaoratorius )、異稻緣蝽(Leptocorisa varicomis )、草盲蝽屬(Lygus spp. ) (盲蝽)、豆莢草盲蝽(Lygus hesperus ) (西部牧草盲蝽)、木槿曼粉蚧(Maconellicoccus hirsutus )、Neurocolpus longirostris 、稻綠蝽(Nezara viridula ) (南方綠椿象)、Paratrioza cockerelli 、植盲蝽屬(Phytocoris spp. ) (盲蝽)、加利福尼亞植盲蝽(Phytocoris californicus )、親植盲蝽(Phytocoris relativus )、荔枝椿象(Piezodorus guildingi )、線椿象(Poecilocapsus lineatus ) (四線葉蟲)、Psallus vaccinicola 、酪梨椿象(Pseudacysta perseae )、栗花椿象(Scaptocoris castanea )、錐蝽屬(Triatoma spp. ) (吸血昆蟲/接吻蟲)及玻璃翅葉蟬(Homalodisca vitripennis )。 可用本發明之載體修飾之其他昆蟲。同翅目(Homoptera )，諸如豌豆蚜(Acrythosiphon pisum ) (pea aphid)、球蚜屬(Adelges spp. ) (球蚜)、甘藍粉虱(Aleurodes proletella ) (cabbage whitefly)、螺旋粉虱(Aleurodicus disperses )、軟毛粉虱(Aleurothrixus floccosus ) (綿粉虱)、Aluacaspisspp. 、Amrasca bigutella bigutella 、尖胸沫蟬屬(Aphrophora spp. ) (葉蟬)、紅圓蚧(Aonidiella aurantii )(California red scale)、蚜蟲屬(Aphis spp. ) (蚜蟲)、棉蚜(Aphis gossypii ) (cotton aphid)、蠶豆蚜(Aphis fabae ) (蚜蟲)、蘋果蚜(Aphis pomi ) (apple aphid)、馬鈴薯長鬚蚜(Aulacorthum solani ) (毛地黃蚜)、小粉虱屬(Bemisia spp. ) (粉虱)、銀葉粉虱(Bemisia argentifolii )、菸粉虱(Bemisia tabaci ) (甘薯粉虱)、麥雙尾蚜(Brachycolus noxius ) (俄羅斯蚜蟲)、天門冬小管蚜(Brachycorynella asparagi ) (蘆筍蚜蟲)、粉介殼蟲(Brevennia rehi )、甘藍蚜(Brevicoryne brassicae ) (cabbage aphid)、蠟蚧屬(Ceroplastes spp. ) (蚧)、紅蠟蚧(Ceroplastes rubens ) (red wax scale)、雪盾蚧屬(Chionaspis spp. ) (蚧)、褐圓盾蚧屬(Chrysomphalus spp. ) (蚧)、胭脂蟲屬(Coccus spp. ) (蚧)、蘋粉紅劣蚜(Dysaphis plantaginea ) (rosy apple aphid)、小綠葉蟬屬(Empoasca spp. ) (葉蟬)、蘋果綿蚜(Eriosoma lanigerum ) (woolly apple aphid)、柑橘吹綿蚧(Icerya purchasi ) (吹綿蚧)、芒果葉蟬(Idioscopus nitidulus ) (mango leafhopper)、灰飛虱(Laodelphax striatellus ) (小褐飛虱)、牡蠣蚧屬(Lepidosaphes spp. )、長管蚜屬(Macrosiphum spp. )、大戟長管蚜(Macrosiphum euphorbiae ) (馬鈴薯蚜)、麥長管蚜(Macrosiphum granarium ) (英國麥蚜)、薔薇長管蚜(Macrosiphum rosae ) (rose aphid)、翠菊葉蟬(Macrosteles quadrilineatus ) (紫莞葉蟬)、Mahanarva frimbiolata 、薔薇麥蚜(Metopolophium dirhodum ) (rose grain aphid)、長角緣蝽(Mictis longicornis )、桃蚜(Myzus persicae ) (green peach aphid)、黑尾葉蟬屬(Nephotettix spp. ) (葉蟬)、綠葉蟬(Nephotettix cinctipes ) (green leafhopper)、褐稻虱(Nilaparvata lugens ) (brown planthopper)、糠片盾蚧(Parlatoria pergandii ) (chaff scale)、黑片盾蚧(Parlatoria ziziphi ) (ebony scale)、玉米蠟蟬(Peregrinus maidis ) (corn delphacid)、長沫蟬屬(Philaenus spp. ) (沫蟬)、葡萄根瘤蚜(Phylloxera vitifoliae ) (grape phylloxera)、雲杉球蚧(Physokermes piceae ) (spruce bud scale)、臀紋粉蚧屬(Planococcus spp. ) (粉蚧)、粉蚧屬(Pseudococcus spp. ) (粉蚧)、菠蘿粉蚧(Pseudococcus brevipes ) (pine apple mealybug)、梨圓蚧(Quadraspidiotus perniciosus ) (聖約瑟蟲)、縊管蚜屬(Rhapalosiphum spp. ) (蚜蟲)、玉米縊管蚜(Rhapalosiphum maida ) (玉米葉蚜)、禾穀縊管蚜(Rhapalosiphum padi ) (黍縊蚜)、珠蠟蚧屬(Saissetia spp. ) (蚧)、橄欖珠蠟蚧(Saissctia oleae ) (黑蚧)、麥二叉蚜(Schizaphis graminum ) (綠蚜)、麥長管蚜(Sitobion avenae ) (英國麥蚜)、白背飛虱(Sogatella furcifera ) (white-backed planthopper)、彩斑蚜屬(Therioaphis spp. ) (蚜蟲)、龜蚧屬(Toumeyella spp. ) (蚧)、桔蚜屬(Toxoptera spp. ) (蚜蟲)、粉虱屬(Trialeurodes spp. ) (粉虱)、溫室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum ) (greenhouse whitefly)、青麻白粉虱(Trialeurodes abutiloneus ) (結翅白粉虱)、矢尖盾蚧屬(Unaspis spp. ) (蚧)、矢尖盾蚧(Unaspis yanonensis ) (矢尖蚧)及Zulia entreriana 。 在一些實施例中，昆蟲不為果蠅，諸如黑腹果蠅。因此，在一些實施例中，不包括在果蠅中表現。在其他實施例中，剪接控制序列不來源於果蠅、尤其黑腹果蠅之tra 內含子。 可藉由本發明之構築體修飾之蚊子物種包括(但不限於)選自由按蚊屬、庫蚊屬、伊蚊屬及巨蚊屬(Toxorhynchites sp .)組成之群之屬的蚊子。在特定實施例中，蚊子係選自溪流按蚊(Anopheles fluviatilis )、致倦庫蚊、施得按蚊(Anopheles strode )、偽點翅按蚊(Anopheles pseudopuncti )、埃及伊蚊、夏儂按蚊(Anopheles shannoni )、斑腳瘧蚊(Anopheles apicimaculata )、羅莎伊蚊(Aedes rubrithorax )、銀瞼按蚊(Anopheles argyritarsis )、紐麻按蚊(Anopheles neomaculipal )、覆岷按蚊(Anopheles fluminensis )、白環伊蚊(Aedes alboannulatus )、白紋伊蚊、龐瑪按蚊(Anopheles punctimaculata )、安非按蚊(Anopheles anomolophyllus )、維彭按蚊(Anopheles vestitipennis )、淡色按蚊、短鬚巨蚊(Toxorhynchites brevipalpie )、華麗巨蚊(Toxorhynchites splendens )、安博巨蚊(Toxorhynchites ambionensis )、羅迪巨蚊(Toxorhynchites rutilus )及莫祖巨蚊(Toxorhynchites moctezumai )。在特定實施例中，蚊子係選自由以下組成之群：埃及伊蚊、羅莎伊蚊、白紋伊蚊及白環伊蚊。D. 特定實施例 在一特定實施例中，dsx 剪接控制模組用於昆蟲之性別特異性表現。在此實施例中，dsx 剪接控制模組來源於埃及伊蚊且併入來自埃及伊蚊dsx (Aeadsx )之內含子及外顯子。在一較佳實施例中，Aeadsx 剪接控制模組包含dsx 之外顯子4、內含子5、外顯子5a、內含子5、外顯子5b、內含子6及外顯子6。在一尤其較佳實施例中，使用部分內含子及外顯子(保留各自之剪接供體及剪接受體位點)，但截短以減小整個剪接控制模組之尺寸。 在一些實施例中，使用外顯子4之完整序列(135 bp)，但可使用較小片段，其限制條件為序列保留剪接供體位點。Aeadsx 外顯子4顯示為SEQ ID NO: 13。 在一些實施例中，使用內含子4之完整序列，但可使用較小片段，其限制條件為序列保留剪接供體位點。Aeadsx 內含子4較大，因此有利的是藉由移除內含子中間之一部分以截短內含子，使得在內含子之5'端包括剪接供體之核苷酸得以保留且連接於含有剪接受體位點之內含子之3'部分。內含子4之5'端的實例顯示為SEQ ID NO: 12，且內含子4之3'部分的實例顯示為SEQ ID NO: 11。其接合以提供經截短之功能性內含子4。 在一些實施例中，使用外顯子5a之完整序列(雌性特異性外顯子)，但可使用較小片段，其限制條件為序列保留剪接供體位點。Aeadsx 外顯子5a顯示為SEQ ID NO: 6。 在一些實施例中，使用內含子5之完整序列(209 bp)，但可使用較小片段，其限制條件為序列保留剪接供體位點。Aeadsx 內含子5顯示為SEQ ID NO:10。 在一些實施例中，使用外顯子5b (雌性特異性外顯子)之蛋白質編碼部分。在天然外顯子中，僅56個核苷酸編碼蛋白質。在一些實施例中，外顯子5b經工程改造以開放閱讀框架，使得整個序列編碼蛋白質。此可藉由將序列同框安置且保留大量將具有功能性之天然一級胺基酸序列之任何操縱來進行。在一種此類操縱(關於天然埃及伊蚊dsx 基因(顯示為SEQ ID NO: 7)中，進行總共5次核苷酸插入，使單核苷酸缺失及進行單核苷酸改變以獲得編碼蛋白質之外顯子5b。 在一些實施例中，使用內含子6之完整序列，但可使用較小片段，其限制條件為序列保留剪接供體位點。Aeadsx 內含子6較大，因此有利的是藉由移除內含子中間之一部分以截短內含子，使得在內含子之5'端包括剪接供體之核苷酸得以保留且連接於含有剪接受體位點之內含子之3'部分。內含子6之5'端的實例顯示為SEQ ID NO: 9，且內含子6之3'部分的實例顯示為SEQ ID NO: 8。其接合以提供經截短之功能性內含子6。 在一些實施例中，使用外顯子6之完整序列(共用外顯子)，但可使用較小片段，其限制條件為序列保留剪接受體位點。在其他實施例中，僅使用外顯子6之5'部分。可使用之外顯子6之5'部分的實例顯示為SEQ ID NO: 5。 在一特定實例中，剪接控制模組為Aeadsx ，其包含外顯子4 (SEQ ID NO:13)、截短內含子4 (由SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13構成)、外顯子5a (SEQ ID NO:6)、內含子5 (SEQ ID NO:10)、經修飾之外顯子5b (SEQ ID NO:7)、截短內含子6 (由SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 8構成)及外顯子6 (SEQ ID NO:5)。 如同本文中論述之所有核苷酸序列，除非另外顯而易見，否則較佳設想特定程度之序列同源性。因此，Aeadsx 剪接控制模組之元件較佳與參考序列SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12及SEQ ID NO: 13具有至少80%、85%、90%、95%、99%或99.9%序列同源性。諸如BLAST之適合算法可用於確定序列同源性。若與野生型相比缺失大量序列，則可相對於野生型之全長或具有類似同源性之比對序列進行序列比較。 在本發明之一特定實施例中，控制因子為tTA基因產物或其類似物，且其中一或多個tetO操縱子單元可操作地與啟動子連接且為強化子、tTA或其用於經由tetO增強啟動子活性之類似物。功能蛋白較佳編碼tTAV或tTAV產物且啟動子較佳在正轉錄控制因子不存在之情況下實質上無活性。適用於此系統、較佳最小之啟動子可選自：hsp70、P最小啟動子、CMV最小啟動子、基於Act5C之最小啟動子、BmA3啟動子片段、來自hunchback之啟動子、Adh核心啟動子及Act5C最小啟動子或其組合。在一些實施例中，功能蛋白本身為轉錄轉活化因子，諸如tTAV系統。E. 生物控制方法 在另一態樣中，亦提供一種在生物體的天然環境中控制該生物體族群之方法，其包括： i) 繁育生物體之良種，該生物體攜載包含根據本發明系統(其為顯性致死基因系統)的基因表現系統， ii) 將該良種動物分佈至族群控制所在地之環境中；及 iii) 利用由該良種個體與野生族群之相反性別個體的異種交配造成在後代中表現之致死系統，經由早期致死性達成族群控制。 較佳地，早期致死性為胚期或在性成熟前，較佳在發育早期，最佳在早期幼蟲或胚生活期。 較佳地，致死系統之致死效應具有條件性且經由致死基因之表現發生在該天然環境中，該致死基因之表現係在可抑制性轉活化蛋白之控制下，該繁育係在物質存在下之容許條件下，該天然環境沒有該物質時即能夠抑制該轉活化。 較佳地，致死效應表現在該後代之胚中。較佳地，生物體為無脊椎多細胞動物或如別處所論述者。 亦提供一種生物控制方法，其包括： i) 在容許條件下繁育經根據本發明之表現系統轉型之雄性及雌性生物體之良種，使得雄性及雌性存活，得到雙性別生物控制劑； ii) 視情況在下一步驟之前施加或允許限制性條件，以造成一種性別之個體死亡且由此提供包含攜載條件性致死基因系統之另一性別個體的單性別生物控制劑； iii) 釋放雙性別或單性別生物控制劑至生物控制所在地之環境中；及 iv) 經由生物控制劑個體與野生族群之相反性別個體的異種交配造成在後代中表現之基因系統來達成生物控制。 較佳地，在生物體分佈之前存在藉由性別特異性致死基因系統之表現的性別分離。 較佳地，致死效應殺死所釋放之生物體與野生族群之間交配之大於90%的目標類別子代。 亦提供一種性別分離方法，其包含： i) 在容許或限制性條件下繁育經基因表現系統轉型之雄性及雌性生物體之良種，使得雄性及雌性存活；及 ii) 移除容許或限制性條件以藉由致死基因之性別特異性交替剪接誘導致死基因在一種性別而非另一種性別中之致死效應。 較佳地，致死效應殺死所釋放之生物體與野生族群之間交配之大於90%的目標類別子代。 亦提供一種自族群選擇性消除雌性之方法。亦設想針對雄性之等效物。 本發明現將藉由參考以下實例來描述，該等實例意欲說明本發明之實施例且不應理解為限制本發明。 實例實例 1 經基因工程改造之埃及伊蚊株系係藉由將重組DNA (rDNA)構築體(圖 1 ) (下文「DSX -tTAV-Red」)插入至埃及伊蚊基因組中來生成。此DNA由兩個基因卡匣包含在用於將其插入至昆蟲基因組中之粉紋夜蛾piggyBac 轉型系統之5'及3'片段之間構成。基因卡匣如下： 1.Hr5IE1 強化子及啟動子，其來源於苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)，驅使DsRed2蛋白表現。此蛋白為源自Clontech之紅色螢光蛋白的合成衍生物。 2. 來自黑腹果蠅熱休克蛋白70之最小啟動子(Dmhsp70 minipro)基因，其在四環素反應性操縱子(TetO x7)之下游，驅使合成性四環素抑制性轉錄活化蛋白(tTAV)之表現(Gossen及Bujard 1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(12):5547-5551；Gong等人, (2005)Nat. Biotech. 23:453-456)。tTAV蛋白之表現藉由包括部分埃及伊蚊雙性基因(Aeadsx )而呈現雌性特異性。由於Aeadsx 序列將使得額外胺基酸包括在tTAV蛋白之N端上，故泛素蛋白(Ubi)置於Aeadsx 與tTAV序列之間。泛素經由正常細胞過程裂解且由此移除源於Aeadsx 之胺基酸及Ubi胺基酸，留下tTAV (Bachmair等人, (1986)Science 234(4773):179-186；Varshavsky, A. (2005)Meth. Enzymol. 399:777-799)。 此等基因卡匣共同使得埃及伊蚊株系當在四環素存在下飼養時，通常在兩種性別中進行發育，但當在四環素不存在下飼養時，雌性無法存活至成蟲期且產生僅雄性群組。另外，各昆蟲用螢光DsRed2蛋白標記。A. 製備 Aea dsx 剪接控制模組 Aeadsx 剪接控制模組係經埃及伊蚊雙性基因之內源組件工程改造，該等組件通常引起基因之性別特異性交替剪接。此等組件為外顯子4、5a、5b及6；及內含子4、5及6。此等組件中之一些(內含子4、內含子6及外顯子5b)之序列在整合於性別特異性模組中之前經操縱。 內含子4及6太大而無法以全長包括在pDSX-TTAV-RED中，其本身分別為14.526 kb及10.393 kb。已保留各內含子之5'端及3'端，但移除中心內含子部分而不損失功能。Aeadsx 剪接控制模組中之最終尺寸如下：內含子4為1.750 kb而內含子6為1.446 kb。 在天然蛋白質中部分編碼之外顯子5b經修飾以允許開放閱讀框架跨越整個外顯子，以使其將與前導肽(例如泛素)編碼序列同框，該前導肽編碼序列同樣與所關注基因同框。此係藉由進行一個鹼基對取代、使1個鹼基對缺失及插入5個鹼基對來實現。此操縱使得F2轉錄本中之閱讀框架自經工程改造緊接在外顯子4上游之起始密碼子(ATG)經外顯子4、5b及6且進入前導肽/所關注基因進行蛋白質編碼。M (雄性)剪接形式包括外顯子6，其在剪接至外顯子4時導致讀框轉移，使得終止密碼子包括在所關注基因編碼序列之前。a. tTAV 之 Aea dsx 控制 為了生成DSX -tTAV-Red，上文所述之Aeadsx 剪接控制模組經工程改造以產生合成的可抑制轉錄活化蛋白tTAV。其經工程改造以便在四環素反應性複合啟動子的控制下，藉由將來自大腸桿菌之7個重複TetO操縱序列(TetO x7)與來自黑腹果蠅之熱休克蛋白70基因的最小啟動子(DmHsp70 minipro)接合而經工程改造(Gossen及Bujard, 1992；Gong等人, 2005)。tTAV隨後在正反饋迴路中起作用，因為tTAV與TetO之結合驅使相同蛋白質之進一步表現。在不希望受任何特定操作理論束縛之情況下，咸信高水平表現有害於細胞，其可能歸因於轉錄「壓製」(Gill及Ptashe, 1988)。此反饋迴路可藉由投與四環素而破壞，因為此分子與tTAV結合且由此使得不能結合操縱子TetO。 反饋迴路由於Aeadsx )剪接控制模組之添加而在雌性中特異性運行，其中在雄性及雌性中產生之mRNA由於性別特異性剪接而不同。此繼而意味著tTAV蛋白僅由雌性中產生之mRNA正確地編碼。僅F2剪接形式正確地編碼tTAV蛋白。 除Aeadsx 模組之外，自限性基因將黑腹果蠅泛素(Ubi)蛋白編碼為tTAV蛋白之N端融合物。在昆蟲中，Ubi經預測在蛋白質轉譯後精確加工以便移除由Aeadsx 剪接控制模組編碼之多肽的任何部分，在蛋白質之N端僅留下tTAV蛋白而無任何其他多肽序列(Bachmair等人, (1986)Science 234(4773):179-186；Varshavsky, A. (2005)Meth. Enzymol . 399:777-799)。泛素在包括昆蟲之真核生物中以多肽形式編碼，且依賴於在泛素76聚體序列之C端殘基的精確蛋白質裂解以生成游離泛素。藉由將替代性序列融合於泛素之C端，有可能利用此裂解活性使所關注之蛋白質自N端標籤裂解。B. 製備 DsRed2 卡匣 DSX-TTAV-RED含有Hr5IE1 強化子及驅使DsRed2蛋白表現之啟動子。螢光表型在所有幼蟲、蛹及成蟲生活期清楚可見。此利用Actin5C啟動子增強自限性株系OX513A之表型，以在幼蟲期及蛹期中產生DsRed2標記。 基於SV40 NLS序列，如圖 2 中所示，將核定位信號肽編碼序列(nls1及nls2)工程改造於DsRed2之N端及C端編碼部分上(Kalderon等人 (1984)Cell 39(3):499-509)。在此實例中，nls序列顯示於SEQ ID NO:20 (nls1)及SEQ ID NO:21 (nls2)中。C. 製備載體質體 圖 2 中所示之載體質體係基於選殖載體pKC26-FB2 (Genbank #HQ998855)。質體主鏈含有用於分子選殖程序之pUC複製起點及β-內醯胺酶安比西林(ampicillin)抗性基因。此質體部分不包括於rDNA中或併入至昆蟲基因組中。載體質體亦含有併入至昆蟲中之完整rDNA且包括：來源於粉紋夜蛾之3'及5'piggyBac 元件端、含有來自網鳚屬(Dictyosoma )之DsRed2紅色螢光標記蛋白基因的DsRed2卡匣、基於Gossan及Bujard (1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(12):5547-5551序列融合之四環素可抑制轉錄活化因子tTAV之合成DNA序列、及來源於埃及伊蚊之經修飾之Aeadsx 剪接控制模組(大體如上文及本說明書通篇所述)。圖2中所示之組件的表格展示於表1中，其中亦描述各組件之性質。使用常規DNA選殖程序製備質體。表 1. D. 株系生成 為將卡匣插入至埃及伊蚊中，在標準養蟲室條件([26℃ ± 2℃]、70% [±10%]相對濕度及12h:12h亮/暗循環)下飼養拉丁野生型株系之埃及伊蚊(源自墨西哥)。蚊子胚係藉由標準微注射方法(Jasinskiene等人, (1998)Proc. Natl. ACad. Sci. USA95:7520-7525；Morris, A.C. (1997) 「Microinjection of mosquito embryos」, Crampton, J.M., Beard, C.B., Louis, C. (編), Molecular Biology of Insect Disease Vectors: A Methods Manual. Chapman & Hall, 2-6 Boundary Row, London SE1 8HN, UK, 第423-429頁)，注射質體DNA (300 ng/µl濃度之DSX -tTAV-Red，圖 2 中所描繪之質體)及piggyBac mRNA (在500 ng/µl濃度下)之組合作為轉座酶之來源來轉型。在使用標準實驗室級試劑製備之注射緩衝液(5 mM KCl、0.1 mM NaH2 PO4 ，pH 6.8)中復原質體DNA及轉座酶mRNA (Handler及James, 1998)。E. 株系 選擇 藉由使DSX-tTAV-Red成蟲注射存活者(第0代或G0 )與拉丁WT回交來進行轉殖基因DSX-TTAV-RED株系之選擇。兩個G0 雄性與10個拉丁WT雌性雜交且6個G0 雌性與6個拉丁WT雄性雜交。使用裝備有偵測濾光器之Leica M80顯微鏡針對DsRed2螢光篩選G1 蛹：最大激發563 nm，發射582 nm。獲得十個G1 轉殖基因家族(8個來自雄性G0 雜交，2個來自雌性G0 雜交)，使來自其之3個單獨G2 雄性與WT雌性雜交，得到產生有活力蟲卵之20個轉殖基因株系。藉由使G3 雄性與拉丁WT雌性雜交維持株系。評定來自所有株系之G4 半合子子代在解毒劑(鹽酸多西環素(doxycycline hyclate))存在及不存在下飼養時的存活率。十五個株系呈現所需表型；在多西環素存在下無偏性別比率及在多西環素不存在下之全部雌性外顯率(亦即無雌性存活)。棄去未顯示此表型之株系。攜載DSX-tTAV-Red轉殖基因之個體的成蟲羽化及存活率的評定表明來自此15個株系之蛹可成功羽化成成蟲。兩個相關株系(O及S)之結果呈現在圖 5 中。 根據孟德爾遺傳學(Mendelian genetics)藉由篩選來自G5 半合子雜交之蛹(3:1比率螢光：非螢光)進行株系之可能接合子型式的評定，其中預期純合子具有更亮的螢光表型。選擇九個呈現可能的純合子存活率超過10%之株系用於羽化評定。兩個株系(DSX-tTAV-Red-O及DSX-tTAV-Red-S)之結果顯示在圖 6 中。發現九個株系具有預期孟德爾遺傳比率且藉由使雄性與表現明亮表型之雌性雜交(1個雄性與2個雌性之家族)及PCR分析(基因分型)進一步評估此等株系。經2代(圖 4 中所示之代表性螢光幼蟲期/蛹期)針對螢光篩選雜交子代，得到來自16個親本(7個雄性及9個雌性)之純合子DSX -tTAV-Red-O亞株系及來自70個親本(29個雄性及41個雌性)之DSX -tTAV-Red-S株系。儘管各轉殖基因事件之整合發生在蚊子染色體內之相同位置的事實，但僅亞株系O及S顯示所需表型。蚊子並不近親交配，因此接近整合位點之染色體中存在小變異，其可影響所插入之遺傳物質是否起作用。因此，吾等評定載體之精確整合點且設計分析以偵測蚊子中之分異度且估計埃及伊蚊族群中所存在之變異。 為確保DSX-tTAV-Red純合子成功羽化成有活力的成蟲，評定存活。在螢光蛹中，根據孟德爾遺傳學，半合子與純合子之預期比率將為2:1。將兩個株系O及S鑑別為適合之候選物，其中可能的純合子之比例分別為15.6%及34.4% (圖 6 )。隨後發現株系S4a含有兩次插入之DSX-TTAV-RED轉殖基因。其在株系之同型接合之前分離。 並非所有測試株系均符合所有準則。雖然不希望受任何特定因素束縛，但埃及伊蚊染色體之轉殖基因事件及在特定區域中之插入影響基因表現及觀察到的表型。株系選擇之彙總展示在圖 7 中。實例 4 ： 用於偵測 DSX-tTAV-Red 轉殖基因之方案 此分析用於偵測多種DSX-tTAV-Red昆蟲樣品(野外、大規模飼養及實驗室)中是否存在DSX-tTAV-Red轉殖基因。相同方案亦可用於提供DSX-tTAV-Red轉殖基因隨時間推移之穩定性的證據。DSX-tTAV-Red轉殖基因隨時間推移之成功擴增提供其穩定性之證據，由於一個引子黏接於轉殖基因，另一個黏接於側接基因組序列，因此轉殖基因移動產生陰性PCR。a. 提取基因組 DNA 使用Invitrogen PurelinkTM 基因組提取套組使用以下方案自個別昆蟲分離基因組DNA。 根據關於各標記(Invitrogen)之說明書，將96-100%乙醇溶液添加至PureLink™基因組洗滌緩衝液及PureLink™基因組洗滌緩衝液2中且充分混合。 將180 μL PureLink™基因組消化緩衝液及20 μL蛋白酶K添加至各池之腹部。用無菌研杵使昆蟲樣品破碎，確保組織完全浸沒在緩衝液混合物中。溶液在55℃下在偶爾渦旋下培育，直至溶解完全(1-4小時)。或者，樣品可置放隔夜以消化。 使樣品在室溫下以最大速度離心3分鐘以移除任何顆粒材料，且將清液層轉移至新的微量離心管。將20 μL RNA酶A添加至溶解物中，且藉由簡單渦旋充分混合，隨後在室溫下培育2分鐘。 添加200 μL PureLink™基因組溶解/結合緩衝液且藉由渦旋充分混合，產生均勻溶液。隨後添加200 μL 96-100%乙醇至溶解物中。溶解物藉由渦旋充分混合，產生均勻溶液。或者，可在添加之前混合溶解/結合緩衝液及100%乙醇。 將用PureLink™基因組溶解/結合緩衝液及乙醇製備之溶解物(-640 μL)添加至來自套組之收集管中的PureLink™旋轉管柱中。 管柱隨後在室溫下以10,000 × g離心1分鐘。棄去收集管且將旋轉管柱置放於由套組供應之乾淨的PureLink™收集管中。 將500 μL用乙醇製備之洗滌緩衝液1添加至管柱中且使管柱在室溫下以10,000 × g離心1分鐘。棄去收集管且將旋轉管柱置放於由套組供應之乾淨的PureLink™收集管中。 將500 μL用乙醇製備之洗滌緩衝液2添加至管柱中且使管柱在室溫下以最大速度離心3分鐘。棄去流通物且再使管柱以10,000 × g再旋轉一分鐘。 將旋轉管柱置於無菌1.5-ml微量離心管中且向管柱中添加100 μL PureLink™基因組溶離緩衝液。管柱在室溫下培育1分鐘，隨後在室溫下以最大速度離心1分鐘。接著移出管柱且棄去，使用所收集的經純化之DNA或將經純化之DNA儲存在4℃ (短期)或-20℃ (長期)下。 已發現對於DSX-TTAV-RED-O株系，DSX-TTAV-RED rDNA插入在基因AAEL009696與基因AAEL009706中之外顯子之間的超重疊群(supercont)1.420位置324552，而對於DSX-TTAV-RED-S株系，DSX-TTAV-RED rDNA插入在超重疊群1.19位置2799615，亦稱為重疊群AAGE02001348.1位置88740。 對於DSX-TTAV-RED-O株系，亦即DSX-TTAV-RED rDNA在埃及伊蚊基因組中之插入，rDNA插入於與SEQ ID NO: 46之序列對應的在核苷酸1845與1850之間的區域中。rDNA嵌段藉由與SEQ ID NO: 46 (SEQ ID NO: 73)之核苷酸1443至1845對應的埃及伊蚊基因組序列側接在5'端且藉由與SEQ ID NO: 46 (SEQ ID NO: 74)之核苷酸1859至2222對應的埃及伊蚊基因組序列側接在3'端。 對於DSX-TTAV-RED-S株系，亦即DSX-TTAV-RED rDNA在埃及伊蚊基因組中之插入，rDNA藉由與SEQ ID NO: 75對應之埃及伊蚊基因組序列側接在5'端且藉由與SEQ ID NO: 76對應之埃及伊蚊基因組序列側接在3'端。用於 DSX-tTAV-Red-O 及 DSX-tTAV-Red-S 基因分型之 PCR A) DSX-tTAV-Red-O 藉由Taqman即時PCR進行DSX-tTAV-Red-O株系之基因分型。DSX-tTAV-Red轉殖基因藉由使qPCR Ct值相對於內部參考基因IAP歸一化來定量。藉由將(已知異合子)校準樣品中DSX-tTAV-Red之歸一化Ct值與各未知樣品相比較來計算DSX-tTAV-Red轉殖基因之相對複本數。預期未知樣品中DSX-tTAV-Red rDNA之相對複本數為半合子約1且純合子約2，但在此等條件下擴增之低效率使得相對DSX-tTAV-Red複本數＞1.2之個體被視為純合子。 在以下條件下使用TaqMan® Gene Expression Master Mix (ThermoFisher Scientific)進行PCR：在95℃下初始變性及酶活化10 min，43個循環之在94℃下變性11 s，在60℃下探針黏接15 s，在54℃下引子黏接30 s及在60℃下延伸30 s。 B. DSX-tTAV-Red-S 使用下文所示之寡核苷酸及以下PCR條件藉由端點PCR進行DSX -tTAV-Red-S之基因分型：94℃，2 min；3-5個循環之94℃ 15 s、60℃ 30 s -0.5℃/循環、72℃ 15 s；23個循環之94℃ 15 s、55℃ 30 s、72℃ 15 s；72℃ 7 min；保持4℃。野生型PCR產物(240 bp)為用引子SS2326)5034S5R1及SS2336)5034S3F2擴增之結果。DSX-tTAV-Red PCR產物(221 bp)為用引子SS2326)5034S5R3及TD225)Mod-666-sal擴增之結果。 轉殖基因特異性基因序列係如下藉由使用PCR BIO聚合酶之PCR擴增： 為擴增DSX -tTAV-RED-O亞株系中之嵌段，設計兩個特異性寡核苷酸引子：TD4037 (5'-CTGTTGCTGCGCACGAAACAC-3'；SEQ ID NO: 38)，其黏接於埃及伊蚊基因組DNA；及TD2127 (5'- GTGCCAAAGTTGTTTCTGACTGAC-3'；SEQ ID NO: 39)，其黏接於SEQ ID NO: 36中所示區域中之插入構築體。此引子集僅擴增含有DSX -tTAV-RED-O轉殖基因之樣品(資料未示出)。 為擴增DSX -tTAV-RED-S亞株系中之嵌段，設計兩個特異性寡核苷酸引子：TD4037 (5'-tgacaagcacgcctcacgggag-3'；SEQ ID NO:41)，其黏接於埃及伊蚊基因組DNA；及TD225 (5'-GCTTCATTAAGCAGAAACACTGA-3'；SEQ ID NO: 40)，其黏接於SEQ ID NO: 37中所示區域中之插入構築體，且產生221 bp之產物。此引子集僅擴增含有DSX -tTAV-RED-S轉殖基因之樣品。 其他用於擴增及檢測轉殖基因之方法如下：1. 端點 PCR 偵測方法 1.1 偵測 DSX-tTAV-Red rDNA 在第一方法中，PCR引子可經設計以使得一個引子黏接在DSX-tTAV-Red rDNA內且另一個引子在側接OX5034 rDNA之插入位點的區域中黏接於埃及伊蚊DNA。此類引子可視需要閉合在一起或彼此遠離(就bp而言)。為方便起見，吾等一般設計200-500 bp擴增子用於瓊脂糖凝膠分析、200 bp用於使用SybrGreen之qPCR及100 bp用於Taqman qPCR。 此等引子可用於擴增適合之PCR擴增子，其可藉由使用諸如溴化乙錠之嵌入染料的瓊脂糖凝膠DNA電泳偵測。 舉例而言，可使用以下引子偵測DSX-tTAV-Red-O rDNA： 舉例而言，可使用以下引子偵測DSX-tTAV-Red-S rDNA： 展示使用引子SS2326)5034S5R3及TD225)Mod-666-sal擴增DSX-tTAV-Red-S中之整個基因組DNA轉殖基因rDNA邊界(預期擴增子尺寸為221 bp)之PCR產物擴增的代表性凝膠展示於圖 8 中。1.2 偵測野生型對偶基因 此分析方法亦可藉由設計使用黏接DSX-tTAV-Red rDNA之插入位點之任一側之引子(亦即引子1及引子3，圖 9 )的PCR反應用於偵測DSX-tTAV-Red rDNA的不存在(例如在DSX-tTAV-Red半合子個體中或在野生/野生型蚊子中)。然而，埃及伊蚊基因組中天然變異之存在意味著可能需要多個引子集擴增族群內存在的各種野生型對偶基因(例如已在實驗室族群中發現3種野生型對偶基因)，且其他野生型對偶基因之發現將需要沿著此處概述之線設計其他引子集。 DSX-tTAV-Red-O野生型對偶基因： DSX-tTAV-S野生型對偶基因： 用於端點PCR偵測方法之PCR反應混合物如下： 12.8 µL MilliQ水 4 µL Biotaq緩衝液 0.5 µL 10×BSA 0.25 µL引子1 (10 µM) 0.25 µL引子2/引子3 (10 µM) 0.2 µL PCRBIO Taq聚合酶(PCR Biosystems) 2 µl濃度為大致10 ng/uL之模板gDNA PCR循環： 步驟1) 94℃ 2 min 步驟2) 94℃ 15s 步驟3) 60℃ 30s -0.5℃/循環 步驟4) 72℃ 15s 步驟5) 再重複步驟2至4九次 步驟6) 94℃ 15s 步驟7) 55℃ 30s 步驟8) 72℃ 15s 步驟9) 再重複步驟6至8十八次 步驟10) 72℃ 7 min 步驟11) 保持4℃ 在含有溴化乙錠或類似DNA嵌入染料(諸如SYBR-safe)之適當瓊脂糖凝膠上分析PCR反應混合物。2. SYBR-Green qPCR 偵測方法 在關於端點PCR方法之變化形式中，可藉由使用諸如SYBR-Green之嵌入染料的定量即時PCR (qPCR)偵測擴增。 對於qPCR擴增/偵測，使用以下標準參數設計引子以擴增大約200 bp之產物： 長度18-40 bp 預測Tm 約55℃， GC含量在30-70%之間 無顯著二級結構：二聚體/髮夾dG ＜3。 DSX-tTAV-Red-O rDNA之引子： DSX-tTAV-Red-S rDNA之引子： DSX-tTAV-Red-O野生型對偶基因之引子： DSX-tTAV-Red-S野生型對偶基因之引子： 埃及伊蚊內源對照引子及探針(IAP1)： 每孔之反應混合物(使用qPCR套組，來自Thermofisher之SuperMix-UDG Platinum SYBR Green目錄號10633863)： 4.1µl MilliQ水 0.4 µL引子1 (10 µM) 0.4 µL引子2 (10 µM) 0.1 µl ROX 10 µl SYBR Mastermix 5 µl模板gDNA，約1 ng/uL PCR循環： 步驟1) 50℃ 2 min 步驟2) 95℃ 2 min 步驟3) 95℃ 15s 步驟4) 60℃ 30s 步驟5) 再重複步驟3至4三十九次 使用標準校準曲線將循環臨限(Ct)值轉化成濃度，相對於內源對照PCR(例如埃及伊蚊IAP1基因，表9))歸一化且針對預定偵測極限及定量極限進行評定以判定OX5034 rDNA或野生型對偶基因是否存在於昆蟲樣品中。3. Taqman qPCR 偵測方法 PCR引子可經設計以使得一個引子黏接在DSX-tTAV-Red rDNA內且另一個引子在側接DSX-tTAV-Red rDNA之插入位點的區域中黏接於埃及伊蚊DNA。此等引子可用於擴增PCR擴增子，其可藉由使用設計成黏接於PCR擴增子之Taqman探針的定量即時PCR (qPCR)偵測。使用此方法可偵測轉殖基因之存在及複本數，以使得有可能區分DSX-tTAV-Red rDNA純合子蚊子與DSX-tTAV-Red rDNA半合子蚊子以及野生型/野生蚊子。 根據以下法則設計引子及探針： 探針：無G作為5'核苷酸 C多於G Tm 68-70℃ 使用以下法則設計引子以擴增約100 bp (小於150 bp)之產物： 長度18-40 bp Tm 58-60℃(或低於探針之Tm 5-10℃) 最後5個核苷酸中A/T多於G/C (無GC夾) GC在30-70%之間 無顯著二級結構：二聚體/髮夾dG ＜3。 舉例而言，可使用以下引子及Taqman探針偵測DSX-tTAV-Red-O rDNA： 舉例而言，可使用以下引子及Taqman探針偵測DSX-tTAV-Red-S rDNA： 因此，此反應可作為多重Taqman qPCR反應來進行。 DSX-tTAV-Red rDNA可藉由使用FAM標記之rDNA探針偵測，而HEX標記之內源對照探針可用於偵測內源性埃及伊蚊單複本基因PCR擴增子，例如IAP1 (細胞凋亡基因1之抑制劑)。相對複本數可藉由首先將DSX-tTAV-Red rDNA Ct (循環臨限)值歸一化為內源對照Ct值，且隨後歸一化為已知OX5034 rDNA純合子個體所獲得之DSX-tTAV-Red rDNA Ct值來計算。 埃及伊蚊內源對照引子及探針(IAP1)之引子： 每孔之反應混合物(使用來自Thermofisher之Applied Biosystems Taqman基因表現主混合物，目錄號4369016)： 1.4 µl MilliQ H2 O 0.6 µl OX5034 rDNA引子(10 µM) 0.6 µl OX5034 rDNA引子2 (10 µM) 0.6 µl內源對照引子1 (10 µM) 0.6 µl內源對照引子2 (10 µM) 10 µl基因表現主混合物 0.6 µl OX5034 rDNA探針(10 µM) 0.6 µl內源對照探針(10 µM) 5 µl模板gDNA (約1 ng/uL) PCR循環： 步驟1) 95℃ 10min 步驟2 )94℃ 15s 步驟3) 60℃ 1 min (在此步驟結束時讀取螢光) 步驟4) 再重複步驟2及3三十九次。
圖 1 展示DSX -tTAV-Red之rDNA中存在兩個基因卡匣。一個表現螢光標記DsRed2且另一個表現雌性特異性tTAV蛋白。外顯子表示為E4、E5a、E5b及E6。Hr5/IE1為來自桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)之啟動子/強化子，DmHSP70為來自黑腹果蠅之HSP70基因。圖 2 展示DSX -tTAV-Red之質體圖譜。rDNA係由沿著質體示意圖內部運行的細黑線展示。未指定為rDNA之組件未併入至昆蟲基因組中。rDNA組件之清單及描述提供於表1中。圖 3 展示DSX -tTAV-Red株系中Aeadsx 剪接控制模組之剪接行為。Aeadsx 剪接模組由Aeadsx 外顯子4、5a、5b及6以及Aeadsx 內含子4及5之片段組成。F1轉錄本含有接合至Aeadsx 外顯子5a之Aeadsx 外顯子4及Aeadsx 內含子5之一部分(充當具有內部終止及聚腺苷酸化(聚A)信號之3'UTR)。此轉錄本具有在Aeadsx 外顯子4上游立刻開始且在Aeadsx 外顯子5a之終止密碼子結束的短開放閱讀框架(ORF)。F2轉錄本含有Aeadsx 外顯子4、Aeadsx 經修飾之外顯子5b、截短的Aeadsx 外顯子6、泛素及SV40 3'UTR。此轉錄本具有在Aeadsx 外顯子4上游開始且在tTAV編碼序列之3'端後立刻結束的長ORF。轉錄本M含有Aeadsx 外顯子4、Aeadsx 外顯子6、泛素、tTAV及SV40 3'UTR。此轉錄本中之ORF如另兩個轉錄本中一般，在Aeadsx 外顯子4上游開始且在泛素序列(在與編碼泛素蛋白之ORF不同的框架中)結束。箭頭指示起始密碼子之位置且紅色停止標誌指示終止密碼子之位置。圖 4 展示表現DsRed2標記之DSX -tTAV-Red-O、OX513A及WT生活期在白光及螢光下之影像。畫面A：在白光下之野生型(wt)蛹及幼蟲、DSX -tTAV-Red-O蛹及幼蟲；畫面B：在螢光下之A中所示相同的蛹及幼蟲；畫面C：在白光下之OX513A幼蟲；畫面D：在螢光光下之C中所示相同的幼蟲。圖 5 展示自DSX -tTAV-Red-O及DSX -tTAV-Red-S之開-關多西環素飼養存活的功能性DSX -tTAV-Red成蟲的比例。百分比為以每一株系所採集之螢光蛹的數目計，變成功能性成蟲之個體的平均值。對於雌性樣品，在圓括號中顯示95%信賴區間。彙集雄性樣品(參見方法部分)。圖 6 展示功能性DSX -tTAV-Red雌性成蟲羽化。百分比為羽化成功能性成蟲之螢光雌性蛹的平均值。顯示95%信賴區間。在自半合子雜交個體採集之螢光蛹中，半合子與純合子之比率預期為2:1 (基於孟德爾遺傳學)。任何成蟲羽化超過50%指示純合子在容許條件下之存活率。圖 7 展示產生DSX-tTAV-Red-O及DSX-tTAV-Red-S之株系選擇準則之彙總。圖 8 為展示使用引子SS2326及TD225)Mod-666-sal在DSX -tTAV-Red-S之基因組DNA-轉殖基因rDNA邊界中擴增之PCR產物的代表性凝膠。預期擴增子大小：221 bp。樣品13、15、37及B6代表針對DSX -tTAV-Red-S轉殖基因插入之存在篩選的個別蚊子。樣品『+ve』為已知DSX -tTAV-Red-S個體且『H2 O』為無DNA陰性對照樣品。M指示分子量標記。圖 9 呈現展示埃及伊蚊基因組DNA中DSX-tTAV-Red rDNA之偵測方法的示意圖。引子1在側接DSX-tTAV-Red rDNA之插入位點的區域黏接至DNA。引子2黏接至DSX-tTAV-Red rDNA內之DNA。亦描繪黏接至擴增子之Taqman探針，其中Taqman探針中之『*』代表通用螢光團且『Q』代表通用淬滅劑。引子3在側接插入位點之另一端的區域黏接至DNA。圖 10 展示在DSX-tTAV-Red-O純合子個體蚊子(hom，呈紅色)、DSX-tTAV-Red-O半合子個體(het，呈藍色)及野生型個體(WT)中偵測到之DSX-tTAV-Red rDNA的相對複本數。亦進行無DNA對照反應(NTC)。此等數據係使用表10中概述之引子及探針生成。相對複本數係藉由首先將Ct (循環臨限)值歸一化為內源埃及伊蚊基因(IAP1)獲得之Ct值，且隨後將Ct值歸一化為DSX-tTAV-Red rDNA純合子個體獲得之DSX-tTAV-Red rDNA Ct值而計算所得。

Claims (70)

  1. 一種雙性(dsx )剪接控制模組聚核苷酸，其自5'至3'包含： i.dsx 之外顯子4； ii.dsx 之截短內含子4，其包含該dsx 內含子4之5'端片段及該dsx 內含子4之3'片段； iii.dsx 之外顯子5a； iv.dsx 之內含子5； v.dsx 之經修飾之外顯子5b； vi.dsx 之截短內含子6，其包含該dsx 內含子6之5'端片段及該dsx 內含子6之3'片段；及 vii. 外顯子6之5'片段。
  2. 如請求項1之dsx 剪接控制模組，其中該dsx 來源於埃及伊蚊(Aedes aegypti) (Aeadsx )。
  3. 如請求項1或2之dsx 剪接控制模組，其中該經修飾之外顯子5b經修飾以創建用於整個外顯子之開放閱讀框架。
  4. 如請求項3之dsx 剪接控制模組，其中該經修飾之外顯子5b包含至少一個取代、插入及/或缺失以形成用於整個外顯子之開放閱讀框架。
  5. 如請求項1至4中任一項之dsx 剪接控制模組，其中該剪接控制模組在引入至昆蟲中時，剪接在性別特異性基礎上。
  6. 如請求項5之dsx 剪接控制模組，該昆蟲屬於選自由以下組成之群之目：雙翅目(Diptera)、毛虱目(Phthiraptera)、半翅目(Hemiptera)、膜翅目(Hymenoptera)、撚翅目(Strepsiptera)、鱗翅目(Lepidoptera)及鞘翅目(Coleoptera)。
  7. 如請求項6之dsx 剪接控制模組，其中該昆蟲為選自由以下組成之群之物種的雙翅目昆蟲：地中海實蠅(Ceratitis capitata )、墨西哥實蠅(Anastrepha ludens )、東方實蠅(Bactrocera dorsalis )、橄欖實蠅(Bactrocera oleae)、瓜實蠅(Bactrocera cucurbitae )、納塔爾實蠅(Ceratitis rosa )、櫻桃實蠅(Rhagoletis cerasi )、昆士蘭實蠅(Bactrocera tyroni)、桃實蠅(Bactrocera zonata )、加勒比實蠅(Anastrepha suspensa )或西印度實蠅(Anastrepha obliqua )。
  8. 如請求項6之dsx 剪接控制模組，其中該雙翅目為選自由以下組成之群之屬的蚊子：覆蚊亞屬(Stegomyia )、伊蚊屬(Aedes )、按蚊屬(Anopheles )及庫蚊屬(Culex )。
  9. 如請求項8之dsx 剪接控制模組，其中該蚊子為選自由以下組成之群之物種：埃及伊蚊(Aedes aegypti )、白紋伊蚊(Aedes albopictus )、斯氏按蚊(Anopheles stephensi )、淡色按蚊(Anopheles albimanus )及岡比亞按蚊(Anopheles gambiae )。
  10. 如請求項6之dsx 剪接控制模組，其中該昆蟲為選自由以下組成之群之麗蠅科(Calliphoridae)物種：嗜人錐蠅(Cochliomyia hominivorax )、蛆症金蠅(Chrysomya bezziana )及銅綠蠅(Lucilia cuprina )。
  11. 如請求項6之dsx 剪接控制模組，其中該鱗翅目昆蟲為選自由以下組成之群之物種：蘋果蠹蛾(Cydia pomonella )、蠶(Bombyx mori )、棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella )、小菜蛾(Plutella xylostella )、舞毒蛾(Lymantria dispar )、臍橙螟(Amyelois transitella )、桃條麥蛾(Anarsia lineatella )、水稻三化螟(Tryporyza incertulas )及實夜蛾屬(Heliothinae spp . )。
  12. 如請求項6之dsx 剪接控制模組，其中該鞘翅目昆蟲為選自由以下組成之群之物種：日本麗金龜(Popilla japonica )、白緣象甲屬(Graphognatus spp . )、棉鈴象甲(Anthonomous grandis )、根螢葉甲屬(Diabrotica spp .)及科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata )。
  13. 一種基因表現系統，其包含可操作地連接於編碼異源蛋白質之聚核苷酸的包含如請求項1至5中任一項之雙性(dsx )剪接控制模組的聚核苷酸。
  14. 如請求項13之基因表現系統，其中該dsx 剪接控制模組來源於埃及伊蚊(Aeadsx )。
  15. 如請求項13或14之基因表現系統，其中該異源蛋白質為對昆蟲具有致死、有害或不育效應之蛋白質。
  16. 如請求項15之基因表現系統，其中對昆蟲致死或有害的該蛋白質為選自由以下組成之群的蛋白質：合成性四環素抑制性轉錄活化蛋白(tTAV)、細胞凋亡誘導因子、Hid、Reaper (Rpr)及Nipp1Dm。
  17. 如請求項16之基因表現系統，其中該tTAV選自由以下組成之群：tTAV、tTAV2或tTAV3。
  18. 如請求項13之基因表現系統，其中編碼該異源蛋白質之該聚核苷酸另外包含與編碼該tTAV之該聚核苷酸的5'端同框融合的編碼融合前導多肽之聚核苷酸序列。
  19. 如請求項18之基因表現系統，其中該融合前導多肽為泛素。
  20. 如請求項13至19中任一項之基因表現系統，其另外包含可操作地連接該剪接控制模組之5'的5'非轉譯區(5'UTR)。
  21. 如請求項20之基因表現系統，其中該5'UTR包含在昆蟲中可操作之啟動子。
  22. 如請求項21之基因表現系統，其中該啟動子為黑腹果蠅(Drosophila melanogaster )最小HSP70啟動子(DmHsp70)。
  23. 如請求項21或22之基因表現系統，其中該5'UTR另外包含四環素反應性操縱子。
  24. 如請求項13至23中任一項之基因表現系統，其另外包含可操作地連接該tTAV之3'的3'非轉譯區(3'UTR)。
  25. 如請求項24之基因表現系統，其中該3'UTR為SV40 3'UTR。
  26. 一種表現載體質體，其包含如請求項13至25中任一項之基因表現系統。
  27. 如請求項26之表現載體質體，其另外包含編碼螢光標記蛋白之聚核苷酸。
  28. 如請求項27之表現載體質體，其中該螢光標記蛋白為DsRed2。
  29. 如請求項27之表現載體質體，其中編碼該螢光標記蛋白之該聚核苷酸可操作地連接於啟動子。
  30. 如請求項29之表現載體質體，其中該啟動子為IE1啟動子。
  31. 如請求項26至30中任一項之表現載體質體，其另外包含piggyBac轉位元件端，以引導該表現載體質體併入至昆蟲之染色體中。
  32. 一種經基因工程改造之昆蟲，其包含併入至該昆蟲之染色體中的基因表現系統，該基因表現系統包含具有以下之聚核苷酸構築體： i. 雙性(dsx )剪接控制模組，其中該剪接控制模組自5'至3'包含以下組件： i. 外顯子4； ii.dsx 之截短內含子4，其包含該dsx 內含子4之5'端片段及該dsx 內含子4之3'片段； iii. 外顯子5a； iv.dsx 之內含子5； v. 該dsx 之經修飾之外顯子5b； vi.dsx 之截短內含子6，其包含該dsx 內含子6之5'端片段及該dsx 內含子6之3'片段；及 vii. 外顯子6之5'片段； ii. 與位於該剪接控制模組之3'的編碼tTAV之聚核苷酸的5'端同框融合的編碼泛素之聚核苷酸；及 iii. tetO元件；及 iv. 位於該剪接控制模組之5'的5'UTR，其中該5'UTR包含啟動子。
  33. 如請求項32之經基因工程改造之昆蟲，其中該昆蟲為蚊子。
  34. 如請求項33之經基因工程改造之昆蟲，其中該蚊子為伊蚊屬、按蚊屬或庫蚊屬之蚊子。
  35. 如請求項34之經基因工程改造之昆蟲，其中該蚊子為埃及伊蚊。
  36. 如請求項32之經基因工程改造之昆蟲，其中該基因表現系統另外包含編碼螢光蛋白之聚核苷酸。
  37. 如請求項36之經基因工程改造之昆蟲，其中該螢光蛋白為DsRed2。
  38. 如請求項36之經基因工程改造之昆蟲，其中該螢光蛋白可操作地連接於啟動子。
  39. 如請求項38之經基因工程改造之昆蟲，其中該螢光蛋白為DsRed2且編碼該螢光蛋白之該聚核苷酸可操作地連接於IE1啟動子。
  40. 一種產生經基因工程改造之昆蟲的方法，其包括藉由插入基因表現系統來修飾昆蟲之染色體，其中該基因表現系統包含： i. 雙性(dsx )剪接控制模組，其中該剪接控制模組自5'至3'包含以下組件： i. 外顯子4； ii.dsx 之截短內含子4，其包含該dsx 內含子4之5'端片段及該dsx 內含子4之3'片段； iii. 外顯子5a； iv.dsx 之內含子5； v. 該dsx 之經修飾之外顯子5b； vi.dsx 之截短內含子6，其包含該dsx 內含子6之5'端片段及該dsx 內含子6之3'片段；及 vii. 外顯子6之5'片段； ii. 與位於該剪接控制模組之3'的編碼tTAV之聚核苷酸的5'端同框融合的編碼泛素之聚核苷酸；及 iii. tetO元件；及 iv. 位於該剪接控制模組之5'的5'UTR，其中該5'UTR包含啟動子。
  41. 如請求項40之方法，其中該昆蟲為蚊子。
  42. 如請求項41之方法，其中該蚊子為伊蚊屬、按蚊屬或庫蚊屬之蚊子。
  43. 如請求項42之方法，其中該蚊子為埃及伊蚊。
  44. 如請求項40之方法，其中該基因表現系統另外包含編碼螢光蛋白之聚核苷酸。
  45. 如請求項44之方法，其中該螢光蛋白為DsRed2。
  46. 如請求項44之方法，其中該螢光蛋白可操作地連接於啟動子。
  47. 如請求項46之方法，其中該螢光蛋白為DsRed2且編碼該螢光蛋白之該聚核苷酸可操作地連接於IE1啟動子。
  48. 一種選擇性飼養經基因工程改造之雄性昆蟲的方法，其包括飼養如請求項32至39中任一項之經基因工程改造之昆蟲，其中在沒有四環素下進行該飼養。
  49. 一種經基因工程改造之雄性昆蟲，其係藉由如請求項48之方法產生。
  50. 一種減少野生昆蟲族群之方法，其包括使該野生昆蟲族群與複數個如請求項49之經基因工程改造之雄性昆蟲接觸，其中該經基因工程改造之雄性昆蟲與相同物種之雌性昆蟲交配。
  51. 如請求項50之方法，其中該昆蟲為蚊子。
  52. 如請求項51之方法，其中該蚊子為伊蚊屬、按蚊屬或庫蚊屬之蚊子。
  53. 如請求項52之方法，其中該蚊子為埃及伊蚊。
  54. 一種埃及伊蚊染色體靶位點，其位於基因AAEL009696與基因AAEL009706中之外顯子之間的埃及伊蚊超重疊群1.420位置324552上，其中該靶位點包含異源核酸。
  55. 如請求項54之埃及伊蚊染色體靶位點，其中該靶位點位於SEQ ID NO: 46之核苷酸1845與1850之間。
  56. 如請求項54之埃及伊蚊染色體靶位點，其中該靶位點藉由SEQ ID NO: 46之核苷酸1443至1845側接5'且藉由SEQ ID NO: 46之核苷酸1859至2222側接3'。
  57. 一種製造轉殖基因埃及伊蚊蚊子之方法，其包括在基因AAEL009696與基因AAEL009706中之外顯子之間的埃及伊蚊超重疊群(supercont)1.420位置324552上的位置處插入異源核酸。
  58. 如請求項57之方法，其中該異源核酸插入在埃及伊蚊上之SEQ ID NO: 46之核苷酸1845與1850之間或在SEQ ID NO: 73與SEQ ID NO: 74之間。
  59. 如請求項57之方法，其中該插入之異源核酸藉由SEQ ID NO: 46之核苷酸1443至1845側接5'且藉由SEQ ID NO: 46之核苷酸1859至2222側接3'。
  60. 一種埃及伊蚊染色體靶位點，其位於埃及伊蚊超重疊群1.19位置2799615上。
  61. 如請求項60之埃及伊蚊染色體靶位點，其中該標靶位點藉由SEQ ID NO: 75之核苷酸側接5'且藉由SEQ ID NO: 76之核苷酸側接3'。
  62. 一種製造轉殖基因埃及伊蚊蚊子之方法，其包括在埃及伊蚊超重疊群1.19位置2799615上之位置處插入異源核酸。
  63. 如請求項62之方法，其中該異源核酸插入在包含SEQ ID NO: 75之核苷酸與包含SEQ ID NO: 76之核苷酸之間的埃及伊蚊gDNA上。
  64. 如請求項62之方法，其中該插入之異源核酸藉由SEQ ID NO:75之核苷酸側接5'且藉由SEQ ID NO:76之核苷酸側接3'。
  65. 一種經基因工程改造之埃及伊蚊蚊子，其包含插入在基因AAEL009696與基因AAEL009706中之外顯子之間的伊蚊超重疊群1.420位置324552上之位置處的異源核酸，其中該異源核酸包含具有剪接控制模組之基因表現系統，該剪接控制模組可操作地連接於編碼融合前導多肽之聚核苷酸，該融合前導多肽係與編碼有待差異表現之所關注基因之聚核苷酸的5'同框融合，且其中編碼該融合前導多肽之該聚核苷酸位於該剪接控制模組之3'；tetO元件，及位於該剪接控制模組之5'的5'UTR，其中該5'UTR包含啟動子。
  66. 一種經基因工程改造之埃及伊蚊蚊子，其包含插入在埃及伊蚊超重疊群1.19位置2799615上之位置處的異源核酸，其中該異源核酸包含具有剪接控制模組之基因表現系統，該剪接控制模組可操作地連接於編碼融合前導多肽之聚核苷酸，該融合前導多肽與編碼有待差異表現之所關注基因之聚核苷酸的5'同框融合，且其中編碼該融合前導多肽之該聚核苷酸位於該剪接控制模組之3'；tetO元件；及位於該剪接控制模組之5'的5'UTR，其中該5'UTR包含啟動子。
  67. 如請求項65或66之經基因工程改造之埃及伊蚊蚊子，其中該剪接控制模組來源於選自由tra 、dsx 及肌動蛋白 - 4 組成之群之基因。
  68. 一種偵測DNA樣品中選自由SEQ ID NO: 36及SEQ ID NO: 37組成之群之DNA分子之存在的方法，該方法包括： (a)自昆蟲提取DNA樣品； (b)使該DNA樣品與在DSX-tTAV-Red插入位點之上游或下游3 kb插入位點內鑑別為可充當引子的DNA分子接觸，其中該DNA分子為在嚴格雜交條件下與選自由鄰接DSX-tTAV-Red嵌段之序列組成之群之DNA分子雜交，且在該等嚴格雜交條件下不會與不含鑑別為鄰接DSX-tTAV-Red插入位點之序列之DNA分子的DNA樣品雜交的DNA序列； (c)使用第二引子，其為在包含SEQ ID NO:36之序列的rDNA或包含SEQ ID NO: 37之序列的rDNA內鑑別為可充當引子的DNA分子，其中該DNA分子為在嚴格雜交條件下與選自由該包含SEQ ID NO:36之序列的rDNA或該包含SEQ ID NO: 37之序列嵌段的rDNA組成之群之DNA分子雜交，且在該等嚴格雜交條件下不會與不含該包含SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37之序列之DNA分子的DNA樣品雜交的DNA序列； i. 其中能夠充當引子之DNA序列的雜交允許特異性擴增來自DSX-tTAV-Red株系之DNA，因此透過DNA擴增方法及偵測該擴增之DNA，該產物得以對DSX-tTAV-Red-O或DSX-tTAV-Red-S株系具有特異性， ii. 或其中對株系DSX-tTAV-Red-O及DSX-tTAV-Red-S具有特異性之DNA探針可允許在無進一步DNA擴增之情況下，經由雜交來特異性偵測DSX-tTAV-Red-O及DSX-tTAV-Red-S株系； (d)使該樣品及探針經過嚴格雜交條件；及透過使用兩種引子之DNA擴增或透過依賴特異性針對DSX-tTAV-Red-S及DSX-tTAV-Red-O之序列之雜交的其他技術，來偵測該探針與該DNA之雜交。
  69. 一種DNA分子，其包含本說明書中所提供之任一引子。
  70. 一種DNA偵測套組，其包含：至少一種具有與SEQ ID NO: 36或SEQ ID NO: 37同源或互補之足夠長度之連續核苷酸的DNA分子，其功能為作為特異性針對DSX-tTAV-Red-O及DSX-tTAV-Red-S及其子代之DNA引子或探針。
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