TW201503889A - 齒孔酸或其衍生物用於預防或治療疼痛、發炎及肝損傷之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係提供一種齒孔酸或其衍生物用於製備預防或治療疼痛、發炎及肝損傷藥物之用途。本發明中,齒孔酸或其衍生物,例如去氫齒孔酸,可與一或多種藥學上可接受之載劑調製而得一預防或治療疼痛、發炎及肝損傷之藥物。
Description
本發明係關於齒孔酸或其衍生物之醫療用途。
樟芝(Antrodia camphorata)又名牛樟芝,屬於無褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、薄孔菌屬(Antrodia),為台灣特有種,主要寄生於台灣高海拔的樟樹(Cinnamomum kanehirai)上。在民俗醫學上,樟芝的子實體(fruiting body)被用於治療食品或藥物中毒、腹瀉、腹痛、高血壓、皮膚搔癢以及癌症(J Ethnopharmacol(2007)109,93-103)。此外,樟芝的子實體亦被證實具有免疫調節、抗氧化以及肝臟保護效用(Planta Med(2004)70,310-314;J Agricultural And Food Chemistry (2003)51,3302-3308)。
已有報導指出,樟芝的發酵培養液具有對抗數種腫瘤細胞株的細胞毒性(J Ethnopharmacol(2007)109,93-103);樟芝的發酵培養液的濾液具有對抗四氯化碳誘發之肝毒性的肝臟保護效用以及抗氧化性質(J Agricultural And Food Chemistry(2003)51,1571-1577);樟芝的菌絲體(mycelia)具有抗發炎與血管舒張的效用、對抗多種癌細胞株的細胞毒性以及抗B型肝炎病毒之活性(FEMS Microbiology Letter(2004)231,137-143;Life Science(2003)73,2769-2783;Cancer Letter(2009)285,73-79;FEMS Microbiology Letter(2002)209,63-67)。其主要活性成分為脂肪酸、多醣體、苯類、三萜類、固醇類等。
齒孔酸(Eburicoic acid)已知可由松生擬層孔菌(Fomes pinicola)、嗜熱褶孔菌(Lenzites thermophila)及牛樟芝中分離(Journal of Pharmaceutical Sciences(1967)56,1656-1658;Canadian Journal of Microbiology(1972)18,261-263;Journal of natural products(2006)69,
689-691)。去氫齒孔酸(Dehydroeburicoic acid)已知可由茯苓(Poria cocos)及牛樟芝中分離(European Journal of Pharmacology(2009)615,27-32;Electrophoresis(2009)30,1967-1975)。已有報導指出,去氫齒孔酸具有抑制人類5-羥基色胺酸3A(5-hydroxytryptamine 3A,5-HT(3A))受體通道活性之功能(European Journal of Pharmacology(2009)615,27-32),此外可誘發神經膠母細胞瘤細胞株U87MG之鈣依賴與胞膜窖蛋白1(calpain)依賴之壞死(Chemical Research in Toxicology(2009)22,1817-1826)。儘管針對牛樟芝中分離的齒孔酸及去氫齒孔酸已進行研究,但並未曾對其是否可預防及/或治療疼痛、發炎或肝損傷進行任何研究,迄今亦無任何報導。
本發明發現齒孔酸及其衍生物,例如去氫齒孔酸,具有非可預期的預防及治療疼痛、發炎、肝損傷等醫療用途。
在一方面,本發明提供齒孔酸或其衍生物用於製備預防或治療疼痛、發炎及肝損傷藥物之用途,其中齒孔酸或其衍生物為具有下列通式I之化合物:
其中R1為氫、乙醯基(Acetyl)、苯甲基(Benzyl)、甲基、乙基、丁基、己基、或;及R為乙基、丁基或己基;以及R2為氫或甲基,或其醫藥上可接受之鹽或生理上具相同功
能之衍生物。
在本發明之一具體實施例中,該通式I化合物為齒孔酸或其醫藥上可接受之鹽或生理上具相同功能之衍生物。
在本發明之另一具體實施例中,該通式I化合物為去氫齒孔酸或其醫藥上可接受之鹽或生理上具相同功能之衍生物。
在本發明之一具體實施例中,該齒孔酸或其衍生物係萃取自樟芝。
在本發明之一具體實施例中,該預防及/或治療疼痛、發炎及肝損傷藥物係由口服、腸外注射或輸液形式投予。
本發明內容將可由下文發明說明及較佳具體實例,結合下述圖式了解,但本發明涵蓋不偏離本說明書揭示發明概念之精神及範圍下之變化及修飾。
圖1(A)顯示齒孔酸及去氫齒孔酸對於乙酸所誘發之扭體反應,及圖1(B)顯示齒孔酸及去氫齒孔酸福馬林所誘發之早期疼痛反應與晚期疼痛反應之止痛效果。圖中符號表示相較於病理控制組,*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。
圖2(A)顯示於鹿角菜膠誘發小鼠腳掌水腫試驗中,齒孔酸可減少小鼠腳掌水腫體積,圖2(B)顯示去氫齒孔酸亦可減少小鼠腳掌水腫體積;圖2(C)顯示注射鹿角菜膠5小時後齒孔酸及去氫齒孔酸可抑制腳掌組織中MDA濃度,圖2(D)顯示血清中一氧化氮濃度,及圖2(E)顯示血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)濃度。圖中符號表示相較於正常控制組,###:p<0.01;相較於病理控制組(-),*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。(-)代表病理控制組。
圖3顯示於鹿角菜膠誘發小鼠腳掌水腫試驗中,齒孔酸或去氫齒孔酸於注射鹿角菜膠5小時後,抑制腳掌組織中iNOS及COX-2表現量,圖3(A)為西方墨點分析之照片;圖3(B)為以β-肌動蛋白為基準之影像定量結果。圖中符號表示相較於正常控制組,###:p<0.01;相較於病理控制組(-),*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。
圖4(A)為小鼠腳掌組織染色之結果,顯示以鹿角菜膠處
理之小鼠腳掌組織產生出血並於皮下間質組織有大量發炎性白血球(主要為嗜中性白血球)之浸潤,齒孔酸與去氫齒孔酸可抑制或延緩組織之變化;圖4(B)為嗜中性白血球計數之結果,顯示齒孔酸或去氫齒孔酸顯著抑制發炎性白血球之浸潤現象。圖中符號表示相較於正常控制組,###:p<0.01;相較於病理控制組(-),*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。
圖5(A)顯示齒孔酸或去氫齒孔酸可於CCl4誘發之小鼠肝損傷中劑量依賴抑制天冬胺酸轉胺酶(AST)之活性;以及圖5(B)顯示抑制丙胺酸轉胺酶(ALT)之活性。圖中符號表示相較於正常控制組,###:p<0.001;相較於病理控制組(-),*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。
圖6為小鼠肝臟組織染色之結果,顯示齒孔酸與去氫齒孔酸可抑制或延緩肝臟組織病變之與退化,其中圖6(A)為正常控制組;圖6(B)為病理控制組;圖6(C)為正控制組;圖6(D)為齒孔酸處理組;以及圖6(E)為去氫齒孔酸處理組。
圖7為小鼠肝臟組織中抗氧化酵素活性之分析,顯示齒孔酸或去氫齒孔酸可於CCl4誘發之小鼠肝損傷中呈現劑量依賴恢復肝臟功能,其中圖7(A)顯示超氧化物岐化酶(SOD)之活性;圖7(B)顯示過氧化氫分解脢(catalase)之活性;以及圖7(C)顯示麩氨基硫過氧化酶(GPx)抗氧化酵素之活性。圖中符號表示相較於正常控制組,###:p<0.01;相較於病理控制組(-),*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。
圖8顯示齒孔酸或去氫齒孔酸可於CCl4誘發之小鼠肝損傷呈現劑量依賴恢復肝臟功能,其中圖8(A)呈現劑量依賴抑制肝臟中硫巴比妥酸反應物質(TBARS)之含量,即顯示其可抑制脂肪過氧化;以及圖8(B)呈現劑量依賴增加肝臟中麩氨基硫(GSH)之含量。圖中符號表示相較於正常控制組,###:p<0.01;相較於病理控制組(-),*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。
圖9(A)顯示齒孔酸或去氫齒孔酸可於CCl4誘發之小鼠肝損傷呈現劑量依賴抑制血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α);以及圖9(B)顯示一氧化氮之濃度(以亞硝酸濃度表示)。圖中符號表示相較於正常控制組,###:p<0.01;相較於病理控制組(-),*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。
圖10顯示齒孔酸或去氫齒孔酸可於CCl4誘發之小鼠肝損傷中抑制iNOS及COX-2表現量,圖10(A)為西方墨點分析之照片;以及圖10(B)為以β-肌動蛋白為基準之影像定量結果。圖中符號表示相較於正常控制組,###:p<0.01;相較於病理控制組(-),*:p<0.05,**:p<0.01,***:p<0.001。
除非另外定義,本文中所用之所有技術及科學辭彙具皆有熟習本文所屬技藝者所通常明瞭之相同意義。如有衝突,則以本文件,包括其定義為主。
本文所使用冠詞「一」或「該」意指該冠詞文法上之受詞為一或一以上(亦即至少為一)。舉例而言,「一元件」代表一元件或多於一元件。
本文所用之術語「大約」、「約」、或「近似」一般而言應意謂指定數值或範圍之20%以內,較佳者為10%以內,且更佳者為5%以內。本文所給予之數量皆為近似值,意謂術語「大約」、「約」、或「近似」如未明確陳述亦可推論。
本發明提供齒孔酸或其衍生物用於製備預防或治療疼痛、發炎及肝損傷藥物之用途,其中齒孔酸或其衍生物為具有下列通式I之化合物:
其中R1為氫、乙醯基(Acetyl)、苯甲基(Benzyl)、甲基、乙基、丁基、己基、或;及R為乙基、丁基或己基;以及R2為氫或甲基,或其醫藥上可接受之鹽或生理上具相同功能之衍生物。
根據本發明之具體實施例,該通式I化合物較佳為齒孔酸及去氫齒孔酸。
本文所用之術語「齒孔酸(Eburicoic acid)」,係指3β-羥基-24-並甲基-8-羊毛固烯-21-酸(3beta-Hydroxy-24-methylene-8-lanostene-21-oic acid),具下列式II之結構:
本文所用之術語「去氫齒孔酸(Dehydroeburicoic acid)」,係指24-並甲基-3-氧羊毛固-7,9(11)-二烯-21-酸(24-methylene-3-oxolanosta-7,9(11)-dien-21-oic acid),具下列式III之結構:
依本發明,齒孔酸及其衍生物可藉由天然來源獲得,或藉由化學合成製造。在一具體實施例中,具通式I之化合物,較佳為齒孔酸或去
氫齒孔酸,可由樟芝之甲醇萃取物經純化而得。
本文所使用之術語「其醫藥上可接受之鹽」係指保留本發明化合物所需生物活性且具有最低不期望毒性之鹽類。此等醫藥上可接受之鹽可在最後單離或純化化合物時製備,或另由呈其游離酸或游離鹼型之純化化合物再分別與合適鹼或酸反應。代表性鹽類包括醫藥上可接受之金屬鹽(如:鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋁與鋅)、醫藥上可接受之金屬陽離子(如:鈉、鉀、鋰、鈣、鎂、鋁與鋅)之碳酸鹽與碳酸氫鹽、醫藥上可接受之有機一級、二級與三級胺。亦可經合適酸處理形成醫藥上可接受之酸加成鹽。合適酸包括醫藥上可接受之無機酸與醫藥上可接受之有機酸。代表性醫藥上可接受之酸加成鹽包括鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硝酸鹽、甲基硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、胺磺酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽等。
本文所使用之術語「生理上具相同功能之衍生物」係指本發明化合物之任何醫藥上可接受之衍生物,且將該衍生物投予哺乳類時可(直接或間接)提供本發明化合物或其活性代謝物,而產生本發明相同功效者。該等衍生物包括但不限於其酯或醯胺,對熟習本技藝者而言無需過度實驗即清楚明白之衍生物。
本文所用之術語「個體」意指一包含人類之動物,較佳為一哺乳動物,更較佳為一人類,其依本發明進行治療、預防或試驗。
本文所用之術語「治療」意指減少、減輕、改善、緩解、或控制一疾病或障礙的一或多個臨床徵兆,以及降低、停止或逆轉一正在被治療中的病況或症狀之嚴重性的進展。
本文所用之術語「預防」意指對一個體預先處理而避免該個體罹患一疾病或症狀。
氧化性損傷係指由於活性氧族(ROS)(例如,過氧化物和過氧化氫),以及自由基(例如,羥基自由基和過氧化自由基),與生物體內的基團或物質反應,進而導致細胞或組織的氧化性損傷,例如DNA損傷、聚不飽和脂肪酸氧化(亦被稱為脂質過氧化)、以及胺基酸氧化。目前已知生物體內存在有由抗氧化酵素所構成的交互作用網路來保護細胞或組織免於氧化性損傷,最為熟知的抗氧化酵素包括:超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、麩氨基硫過氧化酶
(glutathione peroxidase,GPx)、以及麩氨基硫還原酶(glutathione reductase,GSH reductase)。然而,當活性氧族以及自由基的數量超過細胞或組織本身的抗氧化能力時,便會形成氧化性壓力(oxidative stress)。現今氧化性壓力已被發現在各種不同疾病的退化性或病理學過程扮演重要的角色,例如,老化、癌症、發炎、及肝損傷。本案發明即在於發現齒孔酸及其衍生物在於治療或預防氧化性損傷之用途。
本文所用之術語「發炎反應」係指生物體對抗外部壓力刺激或病原體的保護反應。在發炎的初期,受損傷的細胞或組織會釋放出大量的趨化激素,使得免疫系統中的多核白血球(例如,嗜中性球及單核球)往受損傷處聚集(浸潤)。同時,巨噬細胞會被活化並促使細胞膜上的卵磷脂經由磷脂酶A2(phospholipase A2)水解成花生四烯酸(arachidonic acid,AA),花生四烯酸接著藉由環氧酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)而代謝成大量的前列腺素(prostaglandin,PG)、前列環素(prostacyclin)以及凝血脂素A2(thromboxane A2)來增強發炎反應。此外,活化的巨噬細胞也會藉由釋放腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)來促進其他巨噬細胞釋放出各種不同的前發炎性細胞激素(proinflammatory cytokine),包括介白素-1(interleukin-1,IL-1)、介白素-6(IL-6)及介白素-8(IL-8),並且透過誘導性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的作用來生成能夠舒張血管以及殺滅病原體的一氧化氮。此外,活性氧族以及自由基也被免疫系統用來殺滅病原體而成為發炎反應的重要成員。
本文所用之術語「肝損傷」係指任何由一或多個外在或內在的因素及其組合直接或間接地造成肝臟在結構上或功能上的損傷,該等因素包括,但不限於:暴露於肝毒性化合物或輻射、機械性損傷、遺傳得病傾向(genetic predisposition)、病毒感染以及自體免疫疾病。本文所稱之肝臟損傷包括病毒性、酒精性與化學性三大類造成。肝細胞損傷主要是肝實質細胞和星狀細胞增生與肝實質細胞的變性和壞死,以及肝間質的滲出和增生。當肝細胞壞死,而剩餘肝細胞再生的情況下,則發生纖維增生導致肝硬化。在肝硬化時使靜脈血流受阻,導致肝靜脈與門靜脈壓上升,促進肝內動靜脈吻合支的形成,致使肝細胞供血減少,進而發生變性或壞死、纖維增生,肝硬化更加嚴重,形成惡性循環。當肝嚴重損傷,且代償能力
顯著減弱時,則出現嚴重肝功能障礙稱肝功能不全,進一步發展則肝功能衰竭,引起中樞神經系統功能障礙,出現肝昏迷。因此肝損傷的治療及預防更相形重要。
於本發明中,使用的肝損傷老鼠動物模式是採與人體有一致之病理現象的化學性肝損傷。最常使用的是四氯化碳(CCl4)作為肝毒性物質誘發之肝損傷模式,為異生物質(xenobiotic)所誘發之肝毒性中最為透徹研究了解者,故常用以篩選具有保護肝臟功效之藥物成分(Food Chemistry(2011)132,709-716)。四氯化碳(CCl4)誘發之肝損傷模式,涉及兩個階段,初始階段為細胞色素P450將CCl4代謝為三氯甲基自由基(CCl3 +),其導致細胞膜之脂質過氧化並最終造成細胞壞死;第二階段則涉及肝臟巨噬細胞(Kupffer)之活化,並伴隨前發炎介導因子的產生與釋放,進而導致發炎反應。此外,CCl4誘發之肝毒性可刺激產生內生性活性氧化物(ROS)及活性氮化物(RNS),而相關研究已指出ROS與RNS在肝毒性的病理機轉中扮演重要角色。
再者,細胞內ROS的平衡係取決於細胞進行有氧新陳代謝產生ROS,以及抗氧化防禦系統移除ROS之間的平衡。細胞內重要的抗氧化防禦系統包含非酵素型抗氧化劑(例如,GSH),以及酵素型抗氧化劑,例如,超氧化物岐化酶、過氧化氫分解脢及麩氨基硫過氧化酶(Foodand ChemicalToxicology(2009)47,716-721)。已有報導指出,抗氧化劑清除ROS的能力與保護肝臟的效果高度相關(Biochemical Pharmacology(1998)56,773-779),因此在CCl4導致肝損傷時,抗氧化酵素之活性及抑制自由基之產生對於保護肝臟具有關鍵影響(Evidence-BasedComplementary and Alternative Medicine 2012,480714)。
此外,發炎反應亦為肝臟暴露於各種肝毒性物質後造成病變的重要過程。當肝臟受到損害後,肝臟巨噬細胞(kupffer)會受到細胞壞死或是CCl4誘發之急性肝損傷所活化,進而釋放前發炎介導因子,例如,腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。當肝臟受到傷害後,巨噬細胞會迅速產生TNF-α,且TNF-α表現量之上升與肝組織壞死及血清轉胺酶之表現量之增加呈現正相關(Annals of Hepatology(2011)10,207-215)。此外,TNF-α刺激巨噬細胞分泌細胞激素且誘導吞噬細胞氧化代謝及產生一氧化氮(World Journal of Gastroenterology(2005)11,5795-5800)。而一氧化氮(NO)為一種高度反應性的氧化物質,其係由誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)合成產生,並參與多種生理現象。在CCl4誘導急性肝損傷之大鼠肝臟中,可發現iNOS的大量表現,並被視為肝毒性致病機轉的中介物(Food and Chemical Toxicology(2011)50,861-866)。然而,iNOS通常僅於發炎反應後表現,因此被視為發炎反應時造成細胞受損之中介物,在此情形下,一氧化氮會於過氧化物反應並產生ROS,進而改變生物有機分子、造成細胞外基質(ECM)的退化、及白血球之浸潤(Toxicology(2010)272,1-10)。CCl4誘導肝毒性之發炎反應中亦可觀察到大量環氧酶(cyclo-oxygenase)之誘導表現,其中最主要參與發炎反應之環氧酶係為環氧酶-2(COX-2)(Journal of natural products(2011)74,1055-1060)。
在本發明之實施例中,係以乙酸誘發之扭體試驗以及福馬林誘發之舔吮試驗分析待測物之鎮痛效果。於福馬林注射後第0至5分鐘的期間為早期疼痛期間,而於第15至40分鐘的期間為晚期疼痛期間。目前已知作用於中樞神經系統之藥物,例如鴉片類藥物,可抑制早期疼痛反應與晚期疼痛反應兩者,若為作用於周邊神經系統之藥物,如阿司匹靈(Aspirin)、引朵美甲辛(Indomethacin)及甲基脫氫皮質固醇(dexamethasone)則僅抑制晚期疼痛反應。根據本發明,給予齒孔酸或其衍生物,例如去氫齒孔酸齒孔酸,可顯著降低小鼠之扭體反應次數,以及降低晚期疼痛期間小鼠用於舔吮注射福馬林部位的時間,顯示其具有預防或治療疼痛之功效。
本發明中針對抗發炎試驗,係以鹿角菜膠誘發之小鼠腳掌水腫反應,進而用於分析抗水腫功效用以評估抗發炎功效。鹿角菜膠已知不會造成個體全身性反應且不具抗原性,故可提供具有再現性之抗發炎藥物評估。於小鼠腳掌注射炎性物質而導致水腫的過程中咸信為兩階段機制,其中第1至2小時之第一階段係由於組織胺(histamine)或血清素(serotonin)之釋放,而第二階段之水腫形成係由於前列腺素(prostaglandins)/蛋白水解酶(protease)與溶酶體(lysosome)之釋放,並於第3小時達到高峰。在本發明之實施例中,係以齒孔酸或其衍生物,例如去氫齒孔酸,投予鹿角菜膠(carrageenan)誘發發炎反應導致腳掌水腫之小鼠動物模式,發現投予齒孔酸或去氫齒孔酸可顯著減少小鼠腳掌之體積,即具有減緩氧化性損傷及
抑制發炎反應的功效。此外,組織染色之結果亦證實預先投予齒孔酸或去氫齒孔酸可有效減少嗜中性白血球之浸潤及有效緩解因發炎造成之水腫反應。在另一實施例中,證實了齒孔酸與去氫齒孔酸可提升腳掌組織中抗氧化酵素活性、抑制組織中脂質過氧化之程度,顯示可藉由增加小鼠腳掌組織之抗氧化能力達到保護的功效。又一實施例中,證實了齒孔酸與去氫齒孔酸可抑制血清中TNF-α及NO表現量、及腳掌組織中iNOS及COX-2表現量,顯示齒孔酸與去氫齒孔酸可有效抑制發炎反應。
另一方面,在本發明之實施例中,以齒孔酸或其衍生物,例如去氫齒孔酸,投予化學性肝損傷之小鼠動物模式,發現具有減緩肝臟之氧化性損傷,以及抑制、延緩肝臟發炎反應之效果,因而可用於預防及/或治療肝損傷。其中之一實施例證實了在CCl4小鼠肝損傷模式中,齒孔酸或去氫齒孔酸可抑制血清中AST與ALT水平的提升,並可顯著減緩肝損傷之組織學變化,具有顯著保護肝臟之功效。在另一實施例中,證實了齒孔酸與去氫齒孔酸可提升肝臟中抗氧化酵素活性與GSH之含量、抑制肝臟細胞脂質過氧化之程度,顯示可藉由增加小鼠肝臟組織之抗氧化能力達到保護肝臟的功效。又在一實施例中,證實了齒孔酸與去氫齒孔酸可抑制血清中TNF-α及NO表現量、及肝臟中iNOS及COX-2表現量,顯示齒孔酸與去氫齒孔酸可藉由抑制、減緩小鼠肝臟組織之發炎反應達到保護肝臟的功效。
由上述可證實,齒孔酸或其衍生物具有預防及/或治療疼痛、發炎及肝損傷之醫療用途。
在預防及治療之應用上,本發明之齒孔酸或其衍生物可與藥學上可接受載劑調配成醫藥組合物而予以個體服用。此處所使用之「藥學上可接受」意指該載劑係與包含於該組合物中之活性成分相容,較佳能穩定該活性成分而不會對投予該醫藥組合物之對象產生傷害。該載劑可為該活性成分之稀釋劑、載體、賦形劑或介質。適合載劑之實例包含生理相容緩衝液,如漢克氏溶液、林格氏溶液、生理食鹽水緩衝液、乳糖、右旋葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、海藻膠、黃耆膠、明膠、矽酸鈣、微晶型纖維素、聚乙烯咯啶酮、纖維素、無菌水、糖漿及甲基纖維素。該醫藥組合物可額外包含潤滑劑,例如,滑石、硬脂酸鎂及礦物油;潤濕劑;乳化與懸浮劑;保存劑,例如,甲基-及丙基-羥基苯
甲酸鹽;甜味劑;以及調味劑。
在本文中,與藥劑使用相關之術語「有效量」或「有效劑量」係指相較於未接受此量之對應個體,藥物或藥劑之用量造成所欲之藥理上之結果,或疾病、異常或副作用之治療、治癒、預防、或改善,或減少疾病或異常之擴散速度。藥劑之有效量或有效劑量可根據所使用之特定有效成分、投藥模式、年齡、體型、以及所欲治療個體之條件而改變。藥劑之精確用量係依醫師之判斷進行投藥且依個體差異而異。
根據本發明之具體實例,該治療或預防疼痛或發炎之有效量,是以該個體之體重(kg)計為0.5mg/kg/天~20mg/kg/天,較佳為1mg/kg/天~15mg/kg/天,更佳為10mg/kg/天。
又,根據本發明之另一具體實例,該治療或預防肝損傷之有效量,是以該個體之體重(kg)計為1mg/kg/天~40mg/kg/天,較佳為5mg/kg/天~30mg/kg/天,更佳為20mg/kg/天。
根據本發明之醫藥組合物可為片狀、藥丸、粉末、錠劑、囊袋、藥包、藥酒、懸浮液、乳化液、溶液、糖漿、軟明膠膠囊與硬明膠膠囊、栓劑、無菌注射溶液及經包裝之粉末之形式。
本發明之醫藥組合物可經由任何生理可接受途徑傳送。此些途徑包含但不限於口服投藥、腸外注射、輸液投藥、系統性投藥、鼻腔投藥、直腸投藥、腹腔注射、血管注射、皮下注射、經皮投藥、吸入投藥及肌肉注射等。根據本發明,該藥物較佳以口服、腸外注射或輸液形式投予。
本發明係藉由下列實施例進一步說明,此僅提供而用於展現而非限制之目的。由於本發明之揭露,本領域具有通常知識者應可理解所揭露之特定具體實施例,並對該些具體實施例進行諸多修改而獲得相似或類似的結果而仍未脫離本發明之精神與範疇。
實施例
材料及方法
試劑:醋酸係購自默克(Merck,Darmstadt,Germany)。λ型鹿角菜膠及引朵美甲辛(indomethacin,Indo)係購自Sigma(St.Louis,MO,USA)。福馬林係購自Nihon Shiyaku Industries(Japan)。四氯化碳(CCl4)係購自默克Nihon Shiyaku Industries(Japan)。水飛薊素(silymarin)、丙二
醛(malondialdehyde)及其他化學品係購自Sigma Chemical Co.,Ltd.(Steinheim,Germany)。測量丙胺酸轉胺酶(ALT)與天冬胺酸轉胺酶(AST)的生化分析試劑組係購自Randox Laboratories(CrumLin,United Kingdom)。TNF-α係購自Biosource International Inc.(Camarillo,CA,USA)。抗-iNOS、抗-COX-2及抗-β-肌動蛋白之抗體係購自Santa Cruz(USA)。蛋白質分析套組係購自Bio-Rad Laboratories Ltd.(Watford,Herts,United Kingdom)。PVDF膜係購自Millipore Corp.(Bedford,MA,USA)。
真菌材料:樟芝沉浸物之凍乾粉末(freeze-dried powder)係由葡萄王企業股份有限公司的生物工程中心(Biotechnology Center of Grape King,Inc.)(中壢,台灣)所提供,生產批號為MZ-247。樟芝果實體之固態培養物係由利得生物科技股份有限公司(新北市,台灣)鑑定與提供。定名證據標本(voucher specimen)係寄存於偉翔生技開發股份有限公司(台北市,台灣)。
製備例1:齒孔酸及去氫齒孔酸之分離與純化
將3.0kg固態培養牛樟芝之凍乾粉末以12升甲醇於室溫萃取3次,每次萃取時間為4天。將甲醇萃取物於真空中蒸發以獲得褐色之沉澱物,並將之懸浮於1升之水中,繼之以1升之乙酸乙酯進行分配萃取(partition)3次。接著,使用正己烷與乙酸乙酯混合液作為沖提液,將乙酸乙酯層(200g)於矽膠管柱進行色層分析,並進一步以高效液相層析儀進行純化。齒孔酸及去氫齒孔酸係於乙酸乙酯含量為10%沖提獲得,並以乙醇再結晶。
亦可由下列方式分離與純化。牛樟芝沉浸物(1.6kg)之凍乾粉末以16升甲醇於室溫萃取3次,每次萃取時間為1天。將甲醇萃取物於真空中蒸發以獲得褐色之沉澱物,並將之懸浮於1升之水中,繼之以1升之乙酸乙酯進行分配萃取(partition)3次。接著,使用正己烷與乙酸乙酯混合液作為沖提液,將乙酸乙酯層(95g)於矽膠管柱進行色層分析,並進一步以高效液相層析儀進行純化。齒孔酸及去氫齒孔酸係於乙酸乙酯含量為10%沖提獲得,並以乙醇再結晶。
齒孔酸之核磁共振光譜如下所示:1H NMR(300MHz,pyridine-d5):δ 3.41(1H,br t,J=7.6Hz,H-3),1.00(3H,s,H-18),1.06(3H,s,H-19),2.63(1H,td,J=2.4,10.6
Hz,H-20),2.27(1H,m,H-25),1.01(6H,d,J=7.6Hz,H-26 and H-27),4.87(1H,br s,H-28a),4.91(1H,br s,H-28b),1.05(3H,s,H-29),1.22(3H,s,H-30),1.00(3H,s,H-31)
去氫齒孔酸之核磁共振光譜如下所示:1H NMR(300MHz,pyridine-d5):δ 1.90(2H,m,H-2),3.43(1H,t,J=7.5Hz,H-3),1.26(1H,H-5),2.16(2H,H-6),5.61(1H,br s,H-7),5.36(1H,d,J=5.1Hz,H-11),2.50(1H,H-12α),2.33(1H,H-12β),0.99(3H,s,H-18),1.19(3H,s,H-19),2.64(1H,td,J=11.0,3.0Hz,H-20),2.29(1H,H-25),1.02(3H,d,J=3.0Hz,H-26 or H-27),1.00(6H,d,J=7.5Hz,H-27 and H-26),4.88(1H,br s,H-28α),4.92(1H,br s,H-28β),1.11(3H,s,H-29),1.05(6H,s,H-30,31)
製備例2:實驗動物之準備
6-8週之雄性ICR小鼠係購自樂斯科生物科技股份有限公司。於進行實驗前,將小鼠至少飼養2週待其生理狀況穩定,飼養條件為室內溫度22±1℃、相對溼度55±5%、光週期12小時,食物及水自由採食。有關實驗動物的一切實驗程序是依據國家衛生研究院(National Institutes of Health,NIH)的實驗動物飼養管理及使用規範(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals),並遵從國際疼痛研究協會(International Association for the Study of Pain)的指導原則來進行。
2.1 乙酸誘發扭體試驗
為了測試齒孔酸與去氫齒孔酸對於止痛的效果,將ICR小鼠飼養2週後,將小鼠隨機分為5組,每組6隻,以腹腔注射乙酸(1%,0.1mL/10g)方式誘發小鼠疼痛之扭體反應。正控制組係於注射乙酸25分鐘前以腹腔注射引朵美甲辛(10mg/kg)。3組實驗組中,於注射乙酸25分鐘前小鼠分別以不同劑量之齒孔酸及去氫齒孔酸處理(1、5、10mg/kg)。以腹腔注射乙酸5分鐘之後,紀錄小鼠扭體的次數。
2.2 福馬林誘發舔吮試驗
將ICR小鼠飼養2週後,將小鼠隨機分為5組,每組6隻,在以腹腔注射齒孔酸或去氫齒孔酸(1、5、10mg/kg)或引朵美甲辛(10mg/kg)30分鐘之後,於小鼠後腳掌之背面注入20μL 5%之福馬林。於注射福馬林
後的第0至5分鐘的期間(又稱為早期疼痛期間),以及第15至40分鐘的期間(又稱為晚期疼痛期間)紀錄小鼠舔吮右後腳掌所花費的時間。
2.3 鹿角菜膠誘發腳掌水腫試驗
以鹿角菜膠誘發後腳掌水腫以測定待測樣品對抗發炎反應之活性。將小鼠隨機分為6組,每組6隻。於注射鹿角菜膠前,分別以腹腔注射齒孔酸或去氫齒孔酸(1、5、10mg/kg)或引朵美甲辛(Indo)(10mg/kg),病理控制組則注射生理食鹽水,30分鐘後,將鹿角菜膠(1%,50μL)注入小鼠右後腳掌之足底。於注射鹿角菜膠後1、2、3、4及5小時以體積測定儀(plethysmometer)(Cat.No.7159,Ugo Basile,Varese,Italy)來測量小鼠腳掌的體積。小鼠腳掌腫脹的程度以比值a/b表示,其中a為以鹿角菜膠注射後的右後腳掌體積,b為以鹿角菜膠注射前右後腳掌的體積。引朵美甲辛(Indo)為正控制組。於5小時後,犧牲小鼠以取得鹿角菜膠誘發水腫之右後腳掌組織,切片並儲存於-80℃。此外亦抽取小鼠之血液並保存於-80℃。
將右後腳掌組織以冰冷之生理食鹽水清洗後,立即置於其4倍體積之冰冷生理食鹽水中,並於4℃下均質化。將組織均質物於12,000 xg離心5分鐘。取得上清液,以Bradford試劑(Bio-Rad,Hercules,CA)測定蛋白質含量,並儲存於-20℃以供丙二醛(malondialdehyde,MDA)分析。另一方面,將右後腳掌組織以冰冷之生理食鹽水清洗後,立即置於等體積之冰冷生理食鹽水中,於4℃下均質化後將組織均質物於12,000 xg離心5分鐘。取得上清液,並儲存於-20℃以供抗氧化酵素活性分析。
2.4 四氯化碳誘導小鼠肝損傷
將小鼠隨機分為6組,每組6隻。所有動物依實驗組別以腹腔注射不同成分,每日1次連續7天。其中,正常控制組與病理控制組注射蒸餾水;正控制組注射水飛薊素(silymarin,200mg/kg,溶於約10mL之1%羧甲基纖維素中);3組實驗組中,小鼠分別以不同劑量之齒孔酸及去氫齒孔酸處理(5、10、20mg/kg,溶於1%羧甲基纖維素中)。於最後一次腹腔注射後1小時,除了正常控制組外,所有小鼠以腹腔注射四氯化碳(CCl4)(溶於橄欖油中,濃度20%,1.5mL/kg)。於CCl4處理24小時後,以乙醚麻醉小鼠並透過頸動脈採血。
製備例3:肝功能之分析
將收集到的血液於4℃於1700 xg離心30分鐘以分離血清並分析ALT與AST。取自小鼠的肝組織部分以10%福馬林固定以進行組織病理學分析;此外,其餘之肝組織以-80℃保存用於後續之酵素水平分析。所有的生化因子係使用臨床檢測試劑組(Roche Cobas Mira plus,Germany)分析。
製備例3:組織病理評估
3.1 腳掌組織之組織病理評估
於注射鹿角菜膠5小時後犧牲小鼠取得腳掌組織。將腳掌組織浸於1.85%甲醛與1%乙酸於室溫一週以固定組織,以酒精脫水並以石蠟包埋。將5μm的組織切片以二甲苯脫蠟並以蘇木紫(hematoxylin)與伊紅(eosin)染色,於顯微鏡下觀察並拍攝組織影像(BH2,Olympus)。於各組隨機挑選3至5個組織切片,於顯微鏡下觀察由於發炎反應造成之中性白血球浸潤情形,並於400倍放大倍數下觀察5個視野以計算中性白血球之數目。
3.2 肝組織之組織病理評估
將肝組織以10%福馬林固定後以石蠟包埋,將4-5μm的組織切片以蘇木紫(hematoxylin)與伊紅(eosin)染色,於顯微鏡(ECLIPSE TS100,Nikon,Japan)下觀察組織病理學變化,並於200倍放大倍數拍攝組織染色影像(NIS-Elements D 2.30,SP4,Build 387)。
製備例4:抗氧化酵素活性分析。
4.1 超氧化物岐化酶(superoxide dismutase,SOD)
超氧化物岐化酶(SOD)活性藉由測量抑制細胞色素c(cytochrome c)之還原加以測定。cytochrome c之還原係藉由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統(xanthine/xanthine oxidase system)所產生的超氧化物陰離子(superoxide anion)所介導,並於吸光值550nm偵測。一單位之SOD係定義為可抑制cytochrome c之50%還原速率所需的酵素含量。
4.2 過氧化氫分解脢(catalase)
過氧化氫分解脢活性之偵測係參照Aebi方法(1984)分析,簡要地說,將待測樣品與含有10mM H2O2之20mM磷酸緩衝液(pH 7)混和,並於240nm測量吸光值。使用莫耳吸收係數(molar absorption coefficient)計算酵素活性,酵素活性系定義為每分鐘每毫克蛋白質可分解過氧化氫的奈米莫耳數。
4.3 麩氨基硫過氧化酶(Glutathione peroxidase)
麩氨基硫過氧化酶之活性偵測係將待測樣品與含有過氧化氫及麩氨基硫之三羥甲基氨基甲烷緩衝液(0.1mM Tris buffer,pH 7.2)混和,並於340nm測量吸光值。由校正曲線分析酵素之活性,且酵素活性係定義為每分鐘每毫克蛋白質可氧化NAPDH的奈米莫耳數。
4.4 肝臟中麩氨基硫(glutathoine,GSH)
肝臟中麩氨基硫(GSH)含量之測定係參照Ellman所述之方法加以些微調整。簡要地說,將肝臟之均質物溶於200mM Tris-HCl緩衝液中(pH 7.2),取720μL肝臟均質物並以等體積之緩衝液稀釋,加入160μL之TCA並均勻混和,於4℃以10,000 xg離心5分鐘。抽取330μL上清液並與660μL Ellman試劑(DTNB)混和,於405nm測量吸光值。各個樣品之蛋白質含量係以BCA蛋白質分析試劑組(Pierce)測定。
4.5 脂質過氧化中間物(lipid peroxidation intermediates)
硫巴比妥酸反應物質(thiobarbituric acid reacting substances,TBARS),特別是丙二醛(malondialdehyde,MDA),係為聚不飽和脂肪酸氧化降解之產物。脂質過氧化之測量係參照前述方法,將MDA與硫巴比妥酸反應後,於535nm測量吸光值。將0.4mL經處理之細胞或肝臟萃取物與0.4mL之硫巴比妥酸試劑(包含0.4%之硫巴比妥酸與0.2%之丁化羥基甲苯)混和。將混和物置於90℃水浴45分鐘,待冷卻後加入等體積之正丁醇,離心後取上清液並於535nm測量吸光值。以1,1,3,3-四乙氧基丙烷(1,1,3,3-tetraethoxypropane,TEP)建立標準曲線。
製備例5:血清中TNF-α含量之偵測
血清中TNF-α之含量係使用市售酵素免疫連結分析(ELISA)試劑組(Biosource International Inc.,Camarillo,CA),根據說明書之建議加以偵測,TNF-α之濃度係以pg/mL表示並由標準曲線推算而得。
製備例6:血清中一氧化氮(Nitric Oxide)/亞硝酸(Nitrite)含量之偵測
血清中一氧化氮之含量係參照Griess反應以成色法測量血清中亞硝酸含量而間接測得。將血清樣品以蒸餾水稀釋4倍並添加5%體積之硫化鋅(最終濃度15g/L)以去除蛋白質。於室溫以10,000 xg離心5分鐘後,
抽取100μL之上清液至微量偵測盤,接著添加100μL之Griess試劑(於2.5%之多磷酸中含有1%苯磺酸及0.1%之N-1-萘二胺二鹽酸)。於室溫成色10分鐘後,於540nm偵測吸光值,並以亞硝酸鈉建立標準曲線。
製備例7:西方墨點分析。
7.1 鹿角菜膠誘發腳掌發炎反應之分析
分離小鼠腳掌之軟組織並以含有10mM CHAPS、1mM苯甲基磺氟(PMSF)、5μg/mL aprotinin、1μM胃酶抑素(pepstatin)及10μM亮抑酶肽(leupeptin)之溶液均質化。以12,000 xg離心20分鐘以取得上清液。將30μg的蛋白質藉由10% SDS-PAGE分離並轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。將PVDF膜浸泡於含有5%脫脂奶粉的TBST緩衝液中(20mM Tris、500mM氯化鈉及0.1% Tween 20,pH 7.5)於室溫下反應2小時。接著,以小鼠抗-iNOS(誘導型一氧化氮合成酶)或抗-COX-2(還氧酶-2)之單株抗體與PVDF膜於室溫反應2小時後,以鏈接辣根過氧化氫酶(HRP)之二級抗體結合,並以增強型化學冷光(ECL)系統(Amersham International plc.,Buckinghamshire,UK)偵測免疫反應性蛋白質。
7.2四氯化碳誘發肝損傷之分析
以溶胞緩衝液(0.6% NP-40,150mM氯化鈉,10mM HEPES(pH 7.9),1mM EDTA,0.5mM PMSF)於4℃將肝臟均質化。將50μg的蛋白質藉由10% SDS-PAGE分離並轉移至硝化纖維素膜。將山羊抗兔子之抗-iNOS(誘導型一氧化氮合成酶)、抗-COX-2(還氧酶-2)及抗-β-肌動蛋白之初級抗體稀釋1000倍並與硝化纖維素膜於4℃隔夜反應。將膜片清洗3次後以增強型化學冷光(ECL)系統(Amersham International plc.,Buckinghamshire,UK)偵測免疫反應性蛋白質。使用柯達分子影像軟體(Version 4.0.5,Eastman Kodak Company,Rochester,NY)偵測西方墨點分析之結果。
8. 統計分析
所有數值係以平均數±SE呈現。數據分析包含單因子變異數分析(ANOVA)及後來的Scheffé測試。統計顯著性係以*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001表示。
功效實施例
實施例1:抑制小鼠之發炎性疼痛試驗
1.1 齒孔酸及去氫齒孔酸降低乙酸所誘發之小鼠扭體反應
為了測定齒孔酸及去氫齒孔酸是否能緩解小鼠之疼痛,以腹腔注射乙酸之方式誘發疼痛所造成的扭體反應,並計數反應次數以分析疼痛緩解程度。小鼠扭體反應計數結果如圖1(A)所示,可發現相較於病理對照組,隨著齒孔酸或去氫齒孔酸劑量之增加可顯著降低小鼠之扭體次數,顯示齒孔酸或去氫齒孔酸可以劑量依賴之方式達到周邊止痛的效用。
1.2 齒孔酸及去氫齒孔酸降低福馬林所誘發腳掌舔允時間
於腹腔注射齒孔酸或去氫齒孔酸(1、5、10mg/kg)或引朵美甲辛(10mg/kg)30分鐘之後,於小鼠後腳掌之背面注入20μL 5%之福馬林,於注射福馬林後的第0至5分鐘的期間(又稱為早期疼痛期間),以及第15至40分鐘的期間(又稱為晚期疼痛期間)紀錄小鼠舔吮右後腳掌所花費的時間,其統計結果如圖1(B)所示。由結果可見,與病理對照組相較,在福馬林注射後的第0至5分鐘的期間(早期),各組的舔吮時間並沒有顯著差異,但是在福馬林注射後的第15至40分鐘的期間(晚期),隨著齒孔酸及去氫齒孔酸劑量之增加顯著降低舔吮時間,顯示齒孔酸或去氫齒孔酸可以劑量依賴之方式達到抑制發炎性疼痛的效果。
實施例2:抑制鹿角菜膠造成之發炎反應與氧化性損傷試驗
2.1 齒孔酸及去氫齒孔酸減低鹿角菜膠所造成之腳掌水腫
鹿角菜膠造成發炎反應所誘發之水腫反應模式已廣泛應用於抗發炎藥物藥效評估與篩選,在此我們亦使用此動物模式以評估待測樣品之抗發炎效果。將小鼠隨機分為6組,每組6隻。於注射鹿角菜膠前,分別以腹腔注射齒孔酸或去氫齒孔酸(1、5、10mg/kg)或引朵美甲辛(Indo)(10mg/kg),病理控制組則注射生理食鹽水,30分鐘後,將鹿角菜膠(1%,50μL)注入小鼠右後腳掌之足底。於注射鹿角菜膠後1、2、3、4及5小時以體積測定儀(plethysmometer)來測量小鼠腳掌的體積,其結果如圖2(A)及2(B)所示。與病理對照組(鹿角菜膠)相較,腹腔注射10mg/kg之齒孔酸或去氫齒孔酸時,可於鹿角菜膠處理後第4與5小時顯著抑制誘發之腳掌水腫反應(p<0.01或p<0.001),且相較於病理對照組,腳掌體積分別下降了38.78%與45.21%。
2.2 齒孔酸及去氫齒孔酸降低腳掌組織中丙二醛(MDA)之水平
丙二醛(malondialdehyde,MDA),係為聚不飽和脂肪酸氧化降解之產物,其可與硫巴比妥酸(thiobarbituric acid)反應以測定聚不飽和脂肪酸氧化(亦被稱為脂質過氧化)。如圖2(C)所示,在鹿角菜膠誘發小鼠腳掌發炎反應中,可觀察到相對於正常控制組,注射鹿角菜膠5小時後,小鼠腳掌組織中的MDA水平大幅增加(p<0.001)。然而若以齒孔酸或去氫齒孔酸預先處理,則可顯著降低組織中MDA含量,在投予10mg/kg齒孔酸及去氫齒孔酸之組別中,抑制幅度分別達48.18%及56.93%,顯示齒孔酸及去氫齒孔酸可以劑量依賴之方式抑制脂質過氧化。
2.3 齒孔酸及去氫齒孔酸抑制小鼠血清中TNF-α及一氧化氮(NO)表現量
為測定齒孔酸或去氫齒孔酸是否具有抑制鹿角菜膠所誘發發炎反應之功效,此處選用並偵測血清中TNF-α及NO之表現量。將不同組別之小鼠以鹿角菜膠處理5小時後,以乙醚麻醉小鼠並透過頸動脈採血並收集血清。小鼠血清中TNF-α之含量係以ELISA試劑組偵測,NO之含量係參照Griess反應以成色法測量血清中亞硝酸含量而間接測得。
圖2(D)表示以鹿角菜膠注射小鼠腳掌5小時後各組別血清中之一氧化氮(NO)表現量,相較於正常控制組,病理對照組之血清NO表現量顯著增加(p<0.001),而以齒孔酸或去氫齒孔酸處理之組別則可顯著降低NO表現量,其中當投予劑量達10mg/kg時,相較於病理控制組,齒孔酸及去氫齒孔酸可分別降低血清中NO表現量達53.64%及62.76%。此外,各組小鼠血清中TNF-α之含量亦呈現相同趨勢,投予齒孔酸或去氫齒孔酸可顯著降低血清中TNF-α之含量(p<0.01或p<0.001),在投予10mg/kg齒孔酸及去氫齒孔酸之組別中,降低幅度分別達35.18%及45.02%,如圖2(E)所示,顯示齒孔酸及去氫齒孔酸可以劑量依賴之方式抑制發炎反應。
2.4 齒孔酸及去氫齒孔酸抑制小鼠腳掌組織中iNOS及COX-2表現量
在鹿角菜膠誘發小鼠發炎反應之腳掌水腫模式中,為了探討齒孔酸或去氫齒孔酸抑制小鼠血清中NO表現量是否緣於iNOS與COX-2蛋
白質含量的下降,以西方墨點法偵測小鼠腳掌組織中iNOS與COX-2之蛋白質含量,將各個組別組織的細胞溶裂物以10% SDS-PAGE分離,以抗-iNOS、抗-COX-2及抗-β-肌動蛋白之單株抗體偵測蛋白質表現,並以影像軟體進行定量。圖3(A)顯示以西方墨點偵測齒孔酸或去氫齒孔酸存在下iNOS及COX-2之表現量。圖3(B)顯示使用分子影像軟體計算之相對表現量。結果顯示,以鹿角菜膠誘發水腫5小時後,相較於病理控制組,投予10mg/kg齒孔酸時可抑制小鼠腳掌組織中iNOS與COX-2之表現量分別達62.6%及61.2%,而投予10mg/kg之去氫齒孔酸則可抑制小鼠腳掌組織中iNOS與COX-2之表現量分別達69.8%及73.4%,效果皆優於投予引朵美甲辛(Indo)之正控制組。
由上述血清中TNF-α及NO表現量、及腳掌組織中iNOS及COX-2表現量的分析,顯示齒孔酸與去氫齒孔酸可抑制、減緩鹿角菜膠誘發之發炎反應。
2.5 齒孔酸及去氫齒孔酸恢復小鼠腳掌組織中抗氧化酵素之活性
於小鼠腳掌注射鹿角菜膠5小時後,分析各個組別中抗氧化酵素包含超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫分解脢(catalase)及麩氨基硫過氧化酶(GPx)之活性,其結果如表1所示。
相較於正常控制組,注射鹿角菜膠之組別(病理控制組)其組織中超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫分解脢(catalase)及麩氨基硫過氧化酶(GPx)之活性分別下降48.72%、43.95%及35.21%。而當以10mg/kg之齒孔酸及去氫齒孔酸投予小鼠時,相較於病理控制組,可分別增加腳掌組織中過氧化氫分解脢(catalase)之活性達151.62%及160.73%,分別增加超氧化物岐化酶(SOD)之活性達153.85%及161.27%,且分別增加麩氨基硫過氧化酶(GPx)之活性達138.34%及143.56%。相較於病理控制組,正控制組(引朵美甲辛)則可增加過氧化氫分解脢(catalase)之活性174.23%,增加超氧化物岐化酶(SOD)之活性163.58%,增加麩氨基硫過氧化酶(GPx)之活性145.92%,顯示齒孔酸或去氫齒孔酸之保護效果可能為提升抗氧化酵素之活性所致。
由上述小鼠腳掌組織中抗氧化酵素活性及脂質過氧化之程度(MDA表現量),可知齒孔酸與去氫齒孔酸藉由增加組織之抗氧化能力達到保護功效。
2.6 齒孔酸及去氫齒孔酸減低鹿角菜膠誘發發炎反應之組織學變化
為觀察鹿角菜膠誘發發炎反應之腳掌組織變化,以蘇木紫(hematoxylin)與伊紅(eosin)染色評估各組別之組織病理變化。如圖4(A)
所示,相較於正常控制組,單獨以鹿角菜膠處理之病理控制組其結締組織呈現顯著的細胞浸潤現象,細胞浸潤累積於膠原蛋白纖維之間以及細胞之間的空間。相較於此,投予10mg/kg之齒孔酸或去氫齒孔酸的小鼠腳掌組織中發炎反應顯著降低,其中發炎反應細胞數量下降且侷限於血管周圍區域,細胞之間的空間並未呈現任何細胞浸潤,膠原蛋白纖維較為規則且細胞間隙較低。圖4(B)則為各組別中嗜中性白血球計數結果,顯示相較於正常控制組,鹿角菜膠誘發之發炎反應造成組織中嗜中性白血球大量浸潤(p<0.001),而投予引朵美甲辛(正控制組)、齒孔酸及去氫齒孔酸(10mg/kg)則可顯著降低白血球之浸潤數量(p<0.01或p<0.001)。
實施例3:CCl4造成之小鼠肝損傷試驗
3.1 齒孔酸及去氫齒孔酸抑制CCl4肝損傷小鼠血清中AST與ALT的上升
為了測定齒孔酸及去氫齒孔酸是否具有保護肝臟之功效,茲選用CCl4建立小鼠之肝損傷模式並進行各項分析。於腹腔注射CCl4前一週,每日於小鼠之腹腔注射不同劑量之齒孔酸或去氫齒孔酸(5、10、20mg/kg),正控制組注射水飛薊素(200mg/kg),正常控制組與病理控制組則注射蒸餾水。於最後一次腹腔注射後1小時,除了正常控制組外,所有小鼠以腹腔注射CCl4,並於CCl4處理24小時後進行分析。
目前已知有數種肝臟酵素可作為早期急性肝損傷之生化指標,此處選用測量血清中AST與ALT之含量以評估CCl4對於小鼠造成肝組織損傷的程度。如圖5所示,相較於正常控制組,腹腔注射CCl4之小鼠(-)血清中AST與ALT水平顯著提升(p<0.001),顯示大量之酵素進入血液循環系統,代表肝臟大量之中葉壞死、氣球樣變性(balloning degeneration)及細胞浸潤。相較於此,預先投予齒孔酸或去氫齒孔酸的小鼠,可觀察到抑制血清中AST與ALT水平的提升,且隨著劑量的增加抑制的效果更加顯著,顯示齒孔酸及去氫齒孔酸可減緩CCl4造成之肝損傷而抑制酵素自細胞膜滲出進入血液循環系統。
3.2 齒孔酸及去氫齒孔酸減緩CCl4肝損傷小鼠肝臟之組織學變化
以蘇木紫與伊紅染色觀察各個組別之組織病理變化。目前已
知CCl4誘發的急性肝損傷可造成肝臟多種組織學變化,包括肝細胞退化、中葉壞死、肝炎、門脈三體炎(portal triaditis)及肝臟巨噬細胞(Kupffer)大量增生。如圖6所示,相較於正常控制組,腹腔注射CCl4之小鼠於肝臟中葉區產生氣球樣變性、肝細胞壞死、並具有大量細胞浸潤。但若預先投予齒孔酸及去氫齒孔酸,則可顯著緩和肝臟的組織學變化,尤其在高劑量(20mg/kg)時其效果與水飛薊素相似,此結果與血清中肝臟酵素水平的測量結果一致,顯示齒孔酸及去氫齒孔酸可顯著減緩CCl4誘發肝損傷之組織學變化,具有顯著保護肝臟之功效。
實施例4:小鼠肝臟中抗氧化功能試驗
為探討齒孔酸及去氫齒孔酸保護肝臟免於CCl4誘發肝損傷之機制,進行細胞抗氧化相關功能之分析。目前已知CCl4誘發之肝毒性係由於肝臟之細胞色素P450將CCl4代謝為三氯甲基自由基(CCl3.),自由基之連鎖反應導致細胞膜之脂質過氧化並最終造成細胞壞死。此外,CCl4亦可刺激內生性活性氧化物(ROS)及活性氮化物(RNS)之產生,故偵測細胞之抗氧化系統以了解齒孔酸及去氫齒孔酸扮演之角色。
4.1 齒孔酸及去氫齒孔酸恢復CCl4肝損傷小鼠肝臟中抗氧化酵素之活性
細胞中重要的抗氧化酵素包含超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化氫分解脢(catalase)及麩氨基硫過氧化酶(GPx)。為偵測上述酵素之活性,取得小鼠肝臟之均質物並依前述方法進行分析。小鼠肝臟中抗氧化酵素之活性係如圖7所示。相較於正常控制組,以CCl4處理之小鼠其抗氧化酵素之活性均顯著降低,然預先投予齒孔酸或去氫齒孔酸之組別,可恢復肝臟中抗氧化酵素之活性,且隨著投予劑量之增加效果更為顯著(p<0.001)。
4.2 齒孔酸及去氫齒孔酸抑制CCl4肝損傷小鼠肝臟組織之脂質過氧化
硫巴比妥酸反應物質(TBARS)係為聚不飽和脂肪酸氧化降解之產物。為分析肝臟組織中脂質過氧化的程度,將小鼠肝臟萃取物混和硫巴比妥酸試劑以測定肝臟中硫巴比妥酸反應物質(TBARS)之水平。如圖8(A)所示,經CCl4處理之小鼠肝臟中TBARS之水平顯著提升,顯示
因CCl4肝臟組織產生脂質之過氧化,相較於此,齒孔酸或去氫齒孔酸可抑制TBARS之水平,且隨著劑量之增加效果更為顯著(p<0.001),表示其可抑制脂質過氧化,達到保護肝臟細胞之功效。
4.3 齒孔酸及去氫齒孔酸增加CCl4肝損傷小鼠肝臟中麩氨基硫(GSH)之含量
GSH係為細胞與組織對抗自由基的第一道防線,因此對於組織或細胞承受氧化壓力的能力有關鍵影響,已有報導指出GSH對於CCl4造成的毒性代謝產物具有關鍵的解毒能力,一旦細胞中GSH之儲量被耗竭殆盡則會觀察到肝臟壞死的產生。
為分析齒孔酸與去氫齒孔酸對於肝臟中GSH含量的影響,以Ellman方法測定小鼠肝臟中GSH含量之變化,其結果如圖8(B)所示。相較於正常控制組小鼠,以CCl4處理之小鼠其肝臟中GSH含量顯著降低,顯示自由基之產生而大量消耗細胞之GSH,然而當預先投予齒孔酸或去氫齒孔酸時,可增加肝臟中GSH之含量,且隨著劑量之增加效果更為顯著(p<0.001)。
由上述肝臟中抗氧化酵素活性、脂質過氧化之程度、以及GSH含量的分析,可知齒孔酸與去氫齒孔酸藉由增加小鼠肝臟組織之抗氧化能力達到保護肝臟的功效。
實施例5:CCl4造成之發炎反應試驗
CCl4誘發之急性肝損傷中,第二階段為發炎反應之產生,導因於肝臟巨噬細胞之活化並釋放前發炎前導因子。接著偵測發炎相關因子以分析齒孔酸及去氫齒孔酸所扮演之角色。
5.1 齒孔酸及去氫齒孔酸抑制CCl4肝損傷小鼠血清中TNF-α及一氧化氮(NO)表現量
當肝臟受到損害後,受到細胞壞死或是CCl4誘發之急性肝損傷所活化,肝臟巨噬細胞(kupffer)會釋放前發炎介導因子,引發發炎反應。為測定齒孔酸或去氫齒孔酸是否具有抑制發炎反應之功效,此處選用並偵測血清中TNF-α及NO之表現量。
將不同組別之小鼠以CCl4處理24小時後,以乙醚麻醉小鼠並透過頸動脈採血並收集血清。小鼠血清中TNF-α之含量係以ELISA試劑組偵
測,NO之含量係參照Griess反應以成色法測量血清中亞硝酸含而間接測得。
如圖9所示,CCl4誘發急性肝損傷之小鼠呈現發炎反應,其血清中TNF-α及NO表現量均顯著增加,相較於此,預先投予齒孔酸或去氫齒孔酸可抑制血清中TNF-α及NO表現量,且隨著劑量之增加抑制效果更為顯著(p<0.001)。
5.2 齒孔酸及去氫齒孔酸抑制CCl4肝損傷小鼠肝臟中iNOS及COX-2表現量
CCl4誘導急性肝損傷之肝臟中,可能會觀察到iNOS與COX-2的大量表現,因此本試驗偵測齒孔酸及去氫齒孔酸對於iNOS與COX-2表現量之影響。將各個組別小鼠肝臟組織的細胞溶裂物以10%SDS-PAGE分離,以山羊抗兔子之抗-iNOS、抗-COX-2及抗-β-肌動蛋白之抗體偵測蛋白質表現,並以影像軟體進行定量。圖10(A)顯示以西方墨點偵測齒孔酸或去氫齒孔酸存在下iNOS及COX-2之表現量。圖10(B)顯示使用分子影像軟體計算之相對表現量。
如圖10所示,CCl4誘導iNOS與COX-2的大量表現,而當以20mg/kg劑量之齒孔酸或去氫齒孔酸預先投予時,可顯著抑制iNOS及COX-2之表現量。
由上述血清中TNF-α及NO表現量、及肝臟中iNOS及COX-2表現量的分析,顯示齒孔酸與去氫齒孔酸藉由抑制、減緩小鼠肝臟組織之發炎反應達到保護肝臟的功效。
總之,本發明證實了萃取自樟芝的齒孔酸及去氫齒孔酸可保護肝臟免於CCl4誘發之氧化壓力與組織傷害,因此齒孔酸及去氫齒孔酸可用於預防及治療肝臟損傷,尤其是化學性之肝損傷。
咸信本發明所屬技藝中具一般知識者基於本文之敘述,無須進一步之例示即可將本發明應用至其最廣泛之範圍。因此,應了解此處所提供之敘述及申請專利範圍係供例示目的而非以任何方式限制本發明之範疇。
Claims (9)
- 一種齒孔酸或其衍生物用於製備預防或治療疼痛、發炎及肝損傷藥物之用途,其中齒孔酸或其衍生物為具有下列通式I之化合物:
- 如請求項1之用途,其中該具有下列通式I之化合物為齒孔酸(Eburicoic acid)或其醫藥上可接受之鹽或生理上具相同功能之衍生物。
- 如請求項1之用途,其中該具有下列通式I之化合物為去氫齒孔酸(Dehydroburicoic acid)或其醫藥上可接受之鹽或生理上具相同功能之衍生物。
- 如請求項1至3項之任一項之用途,其中該齒孔酸或其衍生物係萃取自樟芝。
- 如請求項1之用途,其中該藥物係由口服、腸外注射性或輸液性形式投予。
- 如請求項1之用途,其用於製備預防或治療疼痛藥物之用途。
- 如請求項1之用途,其用於製備預防或治療發炎藥物之用途。
- 如請求項1之用途,其用於製備預防或治療肝損傷藥物之用途。
- 如請求項8之用途,其中該肝損傷為化學性肝損傷。
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