TW201344191A - 腐食酪蟎過敏檢測套組及檢測方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種腐食酪蟎過敏檢測套組及其檢測方法，主要係利用至少一抗原進行免疫分析，該抗原係選自Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)、Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)、Tyr p 8(SEQ ID NO: 28)、Tyr p 10(SEQ ID NO: 32)以及Tyr p 20(SEQ ID NO: 43)等胺基酸序列所組成的群組。藉由一種過敏原或一種以上的過敏原群組作為抗原與病患檢體進行免疫分析，而可有效檢測出病患是否會對腐食酪蟎產生過敏反應，並協助臨床上對於過敏病患的治療與預防。

Description

腐食酪蟎過敏檢測套組及檢測方法

本發明係關於一種免疫分析套組與方法，特別是指一種針對腐食酪蟎過敏的檢測套組及檢測方法。

腐食酪蟎(Tyrophagus putrescentiae)為儲藏室蟎類，主要孳生於家中的儲藏室、廚房、農作物的倉庫或烘焙坊，主食為倉庫中小麥等農作物，常是農夫或是烘焙工作者職業過敏病之原因，喜好溫暖潮濕的溫度，成蟎體約為1.7mm，軀體、排泄物、蟲卵和死亡的蟲體均可造成過敏現象，導致過敏性氣喘或過敏性休克等症狀。腐食酪蟎可因患者吸入或接觸蟲體而造成過敏。部分的病人還是因為誤食受到腐食酪蟎污染的食物而引發過敏反應。臨床上腐食酪蟎雖不是造成過敏性疾病最主要之蟎種，不過近年來造成過敏氣喘案例也有增多的趨勢，在許多國家也漸漸成為受到重視。

世界各地的居家環境中，都可發現腐食酪蟎的蹤跡，重要性除了食物的汙染外，在醫學診斷上也是引起過敏免疫的重要致敏因子之一。利用交叉免疫電泳法測定韓國農民的血清，發現腐食酪蟎至少含有16種致敏原，目前研究證實腐食酪蟎第二群的過敏原(group 2 allergen of Dermatophagoides pteronyssiuns，以下簡稱Tyr p 2)，IgE有高度的結合力，為一種主要過敏原。第三群的過敏原(group 3 allergen of Dermatophagoides pteronyssiuns，以下簡稱Tyr p 3)，在體外實驗中顯示是一種類胰蛋白酶的絲氨酸蛋白質水解酵素(trypsin-like serine protease)，也具有高度的IgE結合能力。第七群的過敏原(group 7 allergen of Dermatophagoides pteronyssiuns，以下簡稱Try p 7)的研究則證實具有IgE結合能力，以ELISA免疫抑制試驗發現其在過敏反應中具有獨特的重要性。第八群的過敏原(group 8 allergen of Dermatophagoides pteronyssiuns，以下簡稱Try p 8)，近期實驗發現可能與其他物種的穀胱甘肽硫移轉酶有高度的相似度，且在病人血清篩選後證實具有IgE結合能力，並推測可能是一種共同過敏原。第十群的過敏原(group 10 allergen of Dermatophagoides pteronyssiuns，以下簡稱Tyr p 10)證實為原肌球蛋白(tropomyosin)，與其他無脊椎動物之原肌球蛋白已發表的胺基酸序列，有很高(64-94%)的相似性，約有12.5%的IgE結合力，以ELISA免疫抑制試驗證明不同蟎種間抑制的程度低，而推測此型過敏原對於交叉反應程度不高。群組二十的過敏原(group 20 allergen of Dermatophagoides pteronyssiuns，以下簡稱Tyr p 20)則是一種精胺酸激酶(arginine kinase)。

腐食酪蟎在臨床上重要性俱增，但卻被忽略其過致敏的能力，而先前研究指出，亞洲地區與歐洲地區其過敏性病患中腐食酪蟎患者的陽性盛行率約有22~43%，並且過去報告顯示腐食酪蟎過敏會導致許多臨床上的症狀，包含過敏性結膜炎及口週血管性水腫症狀。這些腐食酪蟎在臨床上的重要性，顯示腐食酪蟎過敏具有檢測和診斷的必要性。

有鑑於此，本發明之主要目的在於提供一種腐食酪蟎過敏檢測套組，其可有效檢測病患是否對於腐食酪蟎產生過敏反應。

為達成前述目的，本發明提供一種腐食酪蟎過敏檢測套組，包含有至少一抗原，該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)、Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)、Tyr p 8(SEQ ID NO: 28)、Tyr p 10(SEQ ID NO: 32)以及Tyr p 20(SEQ ID NO: 43)。

前述該抗原亦可選自由下列胺基酸序列所組成的群組:Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)、Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)以及Tyr p 8(SEQ ID NO: 28)。

前述該抗原亦可選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)以及Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)。

前述該抗原亦可選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)以及Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)。

前述該抗原亦可係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)以及Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)。

前述該抗原亦可選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)以及Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)。

於本發明另一較佳實施例所提供的腐食酪蟎過敏檢測套組中，更可包含有一抗體共軛物，該抗體共軛物包含有一二級抗體以及一標定物，該二級抗體可專一地辨識該檢體內與該抗原結合之抗體，該標定物與該二級抗體共價結合。其中該標定物可為酵素，並且該套組更可包含有一酵素基質。

為達成前述目的，本發明又提供一種腐食酪蟎過敏檢測方法，包含有下列步驟：(a)提供一檢體，該檢體內包含有至少一目標抗體；(b)提供至少一抗原與該檢體反應，使該目標抗體與該抗原結合，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)、Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)、Tyr p 8(SEQ ID NO: 28)、Tyr p 10(SEQ ID NO: 32)以及Tyr p 20(SEQ ID NO: 43)；(c)將該抗原與該目標抗體結合之複合物與一抗體共軛物反應，該抗體共軛物包含有一二級抗體以及一標定物，該二級抗體可專一地辨識該檢體內與該抗原結合之抗體，該標定物與該二級抗體共價結合；以及(d)測定該標定物之表現。

於本發明另一較佳實施例所提供的腐食酪蟎過敏檢測方法中，更包含有下列步驟：(e)將該抗原附著於一固定基質。其中該固定基質可為聚乙烯，並且該檢體可為血清。

該抗原亦可選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)以及Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)。

該抗原亦可選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)以及Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)。

該抗原亦可選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)以及Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)。

為達成前述目的，本發明另提供一種腐食酪蟎過敏檢測方法，包含有下列步驟：(a)提供一歐洲室塵蟎粗萃取物與一檢體進行吸附反應，其中該檢體內包含有至少一目標抗體；(b)提供至少一抗原與(a)步驟之產物反應，使該目標抗體與該抗原結合，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)、Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)、Tyr p 8(SEQ ID NO: 28)、Tyr p 10(SEQ ID NO: 32)以及Tyr p 20(SEQ ID NO: 43)；(c)將該抗原與該目標抗體結合之複合物與一抗體共軛物反應，該抗體共軛物包含有一二級抗體以及一標定物，該二級抗體可專一地辨識該檢體內與該抗原結合之抗體，該標定物與該二級抗體共價結合；以及(d)測定該標定物之表現。

於本發明另一較佳實施例所提供的腐食酪蟎過敏檢測方法中，更包含有下列步驟：(e)將該抗原附著於一固定基質。其中該固定基質可為聚乙烯，且該檢體可為血清。

該抗原亦可選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)、Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)以及Tyr p 8(SEQ ID NO: 28)。

該抗原亦可選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)以及Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)。

該抗原亦可選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)以及Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)。

藉由上述技術特徵，本發明利用一種過敏原或一種以上的過敏原群組作為抗原與病患檢體進行免疫分析，而可有效檢測出病患是否會對腐食酪蟎產生過敏反應，並協助臨床上對於過敏病患的治療與預防。

有關本發明之詳細特點，將於後續之詳細說明中予以描述。然而，在本發明領域中具有通常知識者應能瞭解，該等詳細說明以及實施本發明所列舉之特定實施例或實驗例，僅用於說明本發明，並非用以限制本發明之專利申請範圍。

以下將藉由所列舉之實驗例，配合隨附之圖式，詳細說明本發明之技術內容及特徵。

實驗一：腐食酪蟎第二群過敏原之選殖與純化

1.　腐食酪蟎第二群過敏原分子選殖

取約50 mg的新鮮腐食酪蟎蟲體，加入約1 ml的TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)萃取腐食酪蟎全RNA。取出5 μg的全RNA，加入寡核苷酸隨機引子oligo-(dT)18，反轉錄酶(M-MLV reverse transcriptase)製備腐食酪蟎的cDNA。根據美國國家生物技術資訊中心(National center for Biotechnology information，以下簡稱NCBI)基因資料庫所公佈的Tyr p 2序列(登錄號：AN-O02380)，設計專一性引子Tyr p 2-NF(SEQ ID NO: 1)與Tyr p 2-NR(SEQ ID NO: 2)，此引子含有酵素Bam HI切點以利後面選殖用途，進行聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction，以下簡稱PCR)，反應條件為：第一階段95℃/5分鐘，第二階段95℃/30秒、60℃/30秒、72℃/1分鐘共30個循環，第三階段72℃/10分鐘。經由DNA電泳確認其PCR產物片段大小，將其產物引流出來並接合到pTA載體(pUC119)，轉型至XL1-Blue勝任細胞中，經過藍白篩選取得正確的菌落，定序分析確定其核苷酸序列為SEQ ID NO: 3，推演出胺基酸序列SEQ ID NO: 4。

2.　腐食酪蟎第二群過敏原之表現及純化

抽取質體DNA之後以限制酵素Bam HI切下，接合到pQE-30載體上，將此載體轉型至M15勝任細胞中以pQE-30F(SEQ ID NO: 5)、pQE-30R(SEQ ID NO: 6)和Tyr p 2-NF(SEQ ID NO: 1)、Tyr p 2-NR(SEQ ID NO: 2)兩組引子挑選正確的菌落及確認基因方向。以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylthio-β-galactoside，以下簡稱IPTG)刺激Tyr p 2/pQE-30的M15細胞表現蛋白，並以蛋白質電泳和西方墨點法確定蛋白表現的最佳時間。之後以IPTG刺激帶有Tyr p 2的M15細胞大量的表現蛋白，以超音波打碎細菌，離心後蒐集上清液，將上清液與具有組胺酸標籤活性(His-tag affinity)之金屬親和性管柱(Ni-NTA)結合後放入管柱中，接著以不同濃度的咪唑(imidazole)清洗，最後用250 mM咪唑溶液引流出rTyr p 2。

3.　利用免疫吸附反應鑑定重組腐食酪蟎第二群過敏原之致敏力

免疫吸附分析主要包含有免疫轉漬吸附分析(Immunoblot inhibition assay)與酵素連結免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，以下簡稱ELISA)兩部分。免疫轉漬吸附分析主要是先以重組過敏原rTyr p 2將病患血清之IgE吸附後，再拿吸附後之血清與腐食酪蟎粗萃取物做免疫轉漬反應，比較吸附前後之IgE免疫轉漬結果。先將病患血清跟rTyr p 2(50 μg/ml)於4℃下作用隔夜，之後再進行免疫轉漬。而ELISA吸附分析也是先取病患血清跟重組過敏原rTyr p 2(50 μg/ml)於4℃下作用隔夜，之後再進行ELISA，比較吸附前後血清IgE反應。IgE抑制百分比公式為：(吸附前ELISA OD405nm減去吸附後ELISA OD405nm)/(吸附前ELISA OD405 nm)乘以100%。

預先以腐食酪蟎粗萃取物為抗原，以ELISA選取出22位對腐食酪蟎有很強IgE反應的病患血清，使用重組過敏原rTyr p 2吸附老年血清IgE的程度來評估其致敏力。22位血清樣本中，以rTyr p 2吸附後之結果如第一圖。其中有13位(A3、A4、A5、A7、A9、A10、A12、A13、A14、A16、A19、A21、A22)(59%；13/22)之血清中IgE可被rTyr p 2吸附，吸附率達50%。

為了證明重組過敏原rTyr p 2之IgE結合性與腐食酪蟎粗萃取物16 kDa位置相似，以免疫吸附西方轉漬法(Western blotting inhibition)進一步分析。選擇了6位同時具有此兩個分子量之IgE的病患血清(A4、A10、A12、A14、A16、A20)，以rTyr p 2吸附後，再與腐食酪蟎之粗萃取物反應。結果如第四圖所示，6個病患血清在16 kDa位置幾乎都被rTyr p 2所吸附。上述實驗均顯示腐食酪蟎重組過敏原rTyr p 2具有致敏能力，並且為腐食酪蟎致敏能力的成份之一。

實驗二：腐食酪蟎第三群過敏原之選殖與純化

1.　選殖腐食酪蟎第三群過敏原基因

根據NCBI公佈腐食酪蟎部分序列及其他塵蟎之第三群過敏原之序列，設計簡併性引子(Degenerate primer)，分別以引子對Tp-SP-F(SEQ ID NO: 7)、Tp-SP-R(SEQ ID NO: 8)以及引子對Tp-SP-2F(SEQ ID NO: 9)、Tp-SP-2R(SEQ ID NO: 10)，進行PCR增幅得到250個鹼基對及400個鹼基對大小的片段。進行5’RACE-PCR(Rapid amplification of cDNA ends，以下簡稱RACE)，增幅得到約400個鹼基對大小的片段，並用南方墨點法(Southern blot)確認。3’RACE-PCR增幅得到600個鹼基對大小的片段，並用南方墨點法確認。而Tyr p 3基因全長是用引子對Tp-SP-EF(SEQ ID NO: 11)、Tp-SP-ER(SEQ ID NO: 12)增幅得到900個鹼基對大小的片段，並用南方墨點法確認，將其產物引流出來並接合到pTA載體(pUC119)，轉型至XL1-Blue勝任細胞中，經過藍白篩選取得正確的菌落，定序分析確定其核苷酸序列為SEQ ID NO: 13，胺基酸序列為SEQ ID NO: 14。

2.　表現及純化重組腐食酪蟎第三群過敏原

抽取質體DNA之後以限制酵素Bam HI切下，接合到pQE-30載體上，將此載體轉型至M15勝任細胞中。將含有rTyr p 3/pQE 30/M15之菌株，用IPTG於37℃進行小規模誘發，於不同時間點收菌液，用超音將菌液萃取，萃取液於十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel eletrophoresis，以下簡稱SDS-PAGE)分析，發現細菌萃取液的確隨著時間越多，接近26 kDa位置之蛋白質表現量越多，加入IPTG後6至8小時就可以達到表現的高峰。進行大量表現得到純化rTyr p 3如第二圖(A)的欄3。為了確定rTyr p 3之胺基酸序列，利用液相層析-電噴灑游離-四極柱-飛行時間式串聯質譜儀(以下簡稱ESI-Q-TOF LC/MS/MS)對rTyr p 3進行序列分析，結果共得到15個胺基酸序列，這15個胺基酸都有對應在cDNA推演出之胺基酸序列SEQ ID NO: 14。

3.　製備重組腐食酪蟎第三群過敏原多株抗體及純化原生型第三群過敏原

用純化之rTyr p 3，免疫八週以上的荷蘭公兔以產生抗Tyr p 3的多株抗體，經過3劑為期6個禮拜後，已可偵測到抗體如第二圖(B)的欄3，以此抗體與腐食酪蟎粗萃取物反應可辨識在26 kDa位置，於相近分子量亦可偵測到nTyr p 3，如第二圖(B)的欄2。再將抗rTyr p 3之抗體，鍵結在含有溴化氰(Cyanogen bromide，以下簡稱CNBr)活化的瓊脂糖凝膠4B之管柱上，將腐食酪蟎蟲體生長培養基磨碎後，用超音波萃取其可溶性蛋白質，將蛋白質溶液通過含有抗體之管柱並清洗沒有結合之蛋白質後，引流出約26 kDa之蛋白質如第三圖(A)，也可被抗rTyr p 3之抗體確認如第三圖(B)。

4.　鑑定重組腐食酪蟎第三群過敏原之致敏力

免疫吸附分析方法如實驗一所述，先將病患血清跟rTyr p 3(50 μg/ml)於4℃下作用隔夜，之後再進行免疫轉漬。而ELISA吸附分析也是先取病患血清跟重組過敏原rTyr p 3(50 μg/ml)於4℃下作用隔夜，之後再進行ELISA。

預先以腐食酪蟎粗萃取物為抗原，以ELISA選取出22位對腐食酪蟎有很強IgE反應的病患血清，使用重組過敏原rTyr p 3吸附病患血清IgE的程度來評估其致敏力。在22位病患血清中，用rTyr p 3吸附後之結果如第一圖所示，其中有11位(A1、A2、A4、A6、A8、A10、A12、A14、A16、A20、A21)(50%；11/22)可被rTyr p 3吸附達50%。

為了證明重組過敏原rTyr p 3之IgE結合性與腐食酪蟎粗萃取物26 kD位置相似，利用免疫吸附西方轉漬法分析。選擇6位具有此分子量之IgE的病患血清(A4、A10、A12、A14、A16、A20)，先用rTyr p 3吸附再與腐食酪蟎之粗萃取物反應。結果如第四圖所示，這6個病患血清在26 kDa位置幾乎都被rTyr p 3所吸附。上述實驗均顯示腐食酪蟎重組過敏原rTyr p 3具有致敏能力，並且為腐食酪蟎致敏能力的成份之一。

5.　利用嗜鹼性球組織胺誘發試驗鑑定重組腐食酪蟎第三群過敏原之過敏原特性

嗜鹼性球組織胺體外誘發試驗(Basophil histamine release assay)之實驗方法如下，用綠色頭含有肝素之採血管，由上臂靜脈抽取健康人之血液，以上下倒轉方式混合均勻，緩慢加入等體積Polymorphprep^TM溶液(Axis-Shield,Oslo,Norway)，取出多形核白血球(Polymorphonuclear cells)並用滅菌後之磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline，以下簡稱PBS)清洗細胞，重新懸浮細胞於含有10%胎牛血清之細胞培養基(RPMI-1640)。用錐藍(Trypan blue)染色方法確認細胞存活率都在95%以上，用細胞計數器載玻片(hemacytometer)將細胞稀釋濃度至2 x 106 cells/ml，再加入不同過敏病患之5倍稀釋血清，置於37℃含二氧化碳培養箱中培養4小時，使嗜鹼性球致敏，再加入不同過敏原如rTry p 3(10 μg/ml)，於37℃培養箱靜置30分鐘以誘使釋放組織胺，離心收集懸浮液，取80 μl懸浮液加入96孔ELISA分析盤中，再加入20 μl磷苯二甲醛(ortho-phthalaldehyde，以下簡稱OPA,5 mM,Sigma)，利用OPA能與組織胺反應形成螢光衍生物，衍生產物具強螢光。OPA螢光衍生化反應專一性高但易衰退，於室溫避光反應7分鐘，加入2%硫酸(H₂SO₄)終止反應，於冷光螢光分析儀(Mutilabel counter)中完成吸光值(激發波長為355 nm，發射波長為455 nm)測定。而組織胺誘發釋放公式如下：(刺激後釋放組織胺含量減去自然釋放組織胺含量)/(組織胺釋放總含量)乘以100%。

預先以腐食酪蟎粗萃取物為抗原，利用ELISA選取10位對腐食酪蟎過敏患者之血清(Pt1~Pt10)以及3位健康對象之血清(H1~H3)，以rTyr p 3進行嗜鹼性球組織胺體外誘發試驗。結果如第五圖所示，這10位患者血清經rTyr p 3誘發後，組織胺之釋放都明顯上升，且誘發之程度與加入rTyr p 3有劑量依存現象(Dose dependent effect)，3位健康對象則無，顯示rTyr p 3具有過敏原特性。

實驗三：腐食酪蟎第七群過敏原之選殖與純化

1.　腐食酪蟎第七群重組過敏原之選殖

選殖方法如實驗一所述，首先純化出腐食酪蟎的全RNA，加入寡核苷酸隨機引子Oligo-(dT)18與反轉錄酶(M-MLV reverse transcriptase)製備cDNA。根據NCBI基因資料庫所公佈的Tyr 7基因序列(登錄號：DQ-983314)設計引子對Tyr p7-MF(SEQ ID NO: 15)與Tyr p7-ER-2(SEQ ID NO: 16)進行PCR，反應條件為：第一階段95℃/5分鐘，第二階段95℃/30秒、55℃/30秒、72℃/1分鐘共30個循環，第三階段72℃/10分鐘。經由DNA電泳確認其PCR產物片段大小為585個鹼基對，將產物引流出來並接合到pTA載體(pUC 19)，轉型至XL1-Blue勝任細胞中，經過藍白篩選取得正確的菌落，定序分析確定其核苷酸序列為SEQ ID NO: 17與NCBI所提供之Tyr p 7基因完全吻合，推演出胺基酸序列為SEQ ID NO: 18。

2.　表現及純化腐食酪蟎第七群過敏原重組蛋白

從XL1-Blue勝任細胞抽取質體DNA後，以Bam HI限制酶進行酶切，將900個鹼基對的目標片段切下進行引流純化後，與pQE30載體結合，轉型至表現宿主大腸桿菌M15中表現重組蛋白質。將含有rTyr p 7/pQE30/M15之菌株，用不同濃度IPTG於37℃進行小規模誘發，於不同時間點收菌液，用超音波震盪將菌液萃取，以SDS-PAGE電泳分析發現細菌萃取液在0.1 mM的IPTG就有很明顯的表現蛋白量，此外隨著時間越多，其接近23 kDa位置之蛋白表現量越多，加入IPTG後3至5小時就可以達到表現高峰，進行大量表現得到純化的重組過敏原rTyr p 7如第六圖所示。

3.　利用免疫吸附反應鑑定腐食酪蟎第七群過敏原之致敏力

分析方法如實驗一所述，預先以腐食酪蟎粗萃取物為抗原，利用ELISA挑選106位對腐食酪蟎呈陽性反應之過敏病患血清，搭配20位非過敏體質的血清做為控制組，測量血清中與腐食酪蟎重組過敏原rTyr p 7具IgE的反應情形，結果顯示在106個腐食酪蟎陽性血清中有40位呈現陽性反應，陽性率為37.7%(40/106)。

為了證明重組過敏原rTyr p 7之IgE結合性與腐食酪蟎粗萃取物23 kDa的位置相似，以免疫吸附西方轉漬法進一步分析。選擇1位具有腐食酪蟎粗萃取物蛋白分子量23 kDa之IgE過敏病患的血清，以rTyr p 7吸附後再與腐食酪蟎粗萃取物反應。結果如第七圖所示，此過敏病患之血清在23 kDa幾乎都被以rTyr p 7所吸附。上述實驗均顯示腐食酪蟎重組過敏原rTyr p 7具有致敏能力，並且為腐食酪蟎致敏能力的成份之一。

4.　利用嗜鹼性球誘發組織胺釋放試驗鑑定重組腐食酪蟎第七群過敏原之致敏性

組織胺誘發試驗方法如實驗二所述，預先以腐食酪蟎粗萃取物為抗原，利用ELISA挑選10位過敏患者高IgE效價的血清來致敏化健康者的嗜鹼性細胞，以進行組織胺的釋放測定。結果如第八圖所示，可以發現這10位患者血清致敏之後，再經過rTyr p 7的誘發，組織胺的釋放都明顯上升，並且隨著rTyr p 7濃度的提高，所釋放的組織胺也隨之升高，發現嗜鹼性細胞在100 μg/ml濃度的rTyr p 7刺激下，所造成的組織胺釋放呈現濃度遞增的現象，相對於健康者組在不同濃度下，卻無組織胺釋放，確定rTyr p 7具有刺激已經由病人血液致敏化後的嗜鹼性細胞釋放組織胺的過敏原性質。

實驗四：腐食酪蟎第八群過敏原之選殖與純化

1.　選殖腐食酪蟎第八群過敏原基因

經由2維電泳針對過敏原nTyr p 8進行胜肽圖譜分析，再以蛋白質體學的Edman N端定序方法分析nTyr p 8，參考N端定序所用標準品之反應時間，判讀nTyr p 8的第一個到第四個胺基酸序列為SEQ ID NO: 19，第五個到第八個胺基酸序列為SEQ ID NO: 20，比對出nTyr p 8部分片段為SEQ ID NO: 21，推測此段胺基酸序列為Try p 8的部分序列，藉此部分序列設計一段簡併性引子進行簡併PCR(degenerate PCR)，由簡併性引子和接合引子，從cDNA增幅得到多個不同大小之片段，利用基因選殖並定序，其多個不同大小之片段，結果以Bio-edit軟體分析，發現八個胺基酸部分序列SEQ ID NO: 21的cDNA序列為SEQ ID NO: 22，再次將此序列設計為一段專一性引子Tyr p 8-SF(SEQ ID NO: 23)進行3’RACE-PCR，由Tyr p 8-SF(SEQ ID NO: 23)和接合引子增幅得到312個鹼基對大小之片段。利用上述片段的專一性引子Tyr p 8-SR(SEQ ID NO: 24)再進行5’RACE-PCR，由oligo-dT和上述Tyr p 8-SR(SEQ ID NO: 24)增幅得到366個鹼基對大小之片段。接著選殖到XL1-Blue大腸桿菌內進行定序，再將定序結果設計專一引子Tyr p 8-EF(SEQ ID NO: 25)和Tyr p 8-ER(SEQ ID NO: 26)進行全長開放讀碼區(Open reading frame，以下簡稱ORF)的PCR，選殖到XL1-Blue，定序後得到全長為657個鹼基對大小的cDNA序列SEQ ID NO: 27，推演出218個胺基酸SEQ ID NO: 28，理論分子量約為26 kDa。

2.　表現及純化重組腐食酪蟎第八群過敏原

把全長657個鹼基對的Tyr p 8 cDNA選殖到表現載體中，將含有重組過敏原rTyr p 8/pQE30/M15的菌株，用不同濃度IPTG於37℃進行小規模誘發，於不同時間點收菌液，再使用超音波震盪將菌液萃取，進行大量表現得到純化rTyr p 8如第九圖所示。

3.　鑑定腐食酪蟎第八群過敏原之致敏力

分析方法如實驗一所述，預先以腐食酪蟎粗萃取物為抗原，利用ELISA挑選106位對腐食酪蟎呈陽性反應之過敏病患血清，搭配20位非過敏體質的血清做為控制組，測量血清中與腐食酪蟎重組過敏原rTyr p 8具IgE的反應情形，結果顯示在106個腐食酪蟎陽性血清中有47位呈現陽性反應，陽性率為44.3%(47/106)。

為了證明重組過敏原rTyr p 8之IgE結合性與腐食酪蟎粗萃取物25 kDa的位置相似，以免疫吸附西方轉漬法進一步分析。選擇1位具有腐食酪蟎粗萃取物蛋白分子量25 kDa之IgE過敏病患的血清，以rTyr p 8吸附後再與腐食酪蟎粗萃取物反應。結果如第十圖所示，此過敏病患之血清在25 kDa幾乎都被以rTyr p 8所吸附。上述實驗均顯示腐食酪蟎重組過敏原rTyr p 8具有致敏能力，並且為腐食酪蟎致敏能力的成份之一。

4.　腐食酪蟎第八群過敏原重組蛋白之嗜鹼性細胞組織胺釋放測定

組織胺誘發試驗方法如實驗二所述，預先以腐食酪蟎粗萃取物為抗原，利用ELISA挑選10位具有高IgE效價血清的過敏患者，來致敏化健康者的嗜鹼性細胞，以進行組織胺之釋放測定。結果如第十一圖所示，可以發現這10位患者血清致敏之後，再經過rTyr p 8的誘發，組織胺的釋放都明顯上升，相對於健康者組，卻無此現象發生，並且組織胺誘發的程度與加入rTyr p 8呈現濃度遞增的現象，確定rTyr p 8具有刺激已經由病人血液致敏化後的嗜鹼性細胞釋放組織胺的過敏原性質。

實驗五：腐食酪蟎第十群過敏原之選殖與純化

1.　腐食酪蟎第十群過敏原之選殖

設計引子對Tyr p 10-EF(SEQ ID NO: 29)與Tyr p 10-ER(SEQ ID NO: 30)進行PCR，反應條件為:第一階段95℃/10分鐘，第二階段95℃/30秒、56℃/30秒、72℃/1分鐘共30個循環，第三階段72℃/10分鐘。經由DNA電泳確認其PCR產物片段大小為852個鹼基對，將產物引流出來並接合到pTA載體(pUC 19)，轉型至XL1-Blue勝任細胞中，經過藍白篩選取得正確的菌落，定序分析其核苷酸序列為SEQ ID NO: 31，推演出胺基酸序列為SEQ ID NO: 32。

2.　表現及純化重組腐食酪蟎第十群過敏原

實驗方法如實驗一所述，將已插入Tyr p10 cDNA的質體DNA，轉型至宿主細胞M15中，確定選殖出正確的菌種後，以1mM IPTG在37℃誘發rTyr p10表現四小時，可以發現在約40 kDa有大量蛋白表現量，再將菌液離心後打碎細胞，利用Ni-NTA管柱利用競爭的原理萃取出rTyr p10蛋白質後以SDS-PAGE確認如第十二圖所示。

3.　製備重組腐食酪蟎第十群過敏原多株抗體

實驗方法如實驗二所述，以純化後的rTyr p10免疫兔子，產生多株抗體。第3次注射後10天大量抽血取血清，以硫酸銨進行初步純化後，利用免疫轉漬法分析其抗體專一性，結果如第十三圖所示，免疫後的兔子血清可辨識rTyr p 10，免疫前的兔子血清則不能辨識。而以rTyr p10多株抗體偵測腐食酪蟎粗萃取，發現在40 kDa有一條蛋白質帶被辨識，由此推論腐食酪蟎之nTyr p10位於40 kDa。

4.　鑑定腐食酪蟎第十群過敏原之致敏力

免疫吸附分析方法如實驗一所述，先以rTyr p10為抗原，利用ELISA篩選出108位對rTyr p10呈陽性反應的患者，將rTyr p10陽性患者血清分成四組，加入不同濃度之腐食酪蟎粗萃取液，分成原倍、十倍稀釋、一百倍稀釋以及以1% PBS脫脂奶作為控制組，在4℃下反應整晚之後再進行免疫轉漬。另外再利用免疫吸附西方轉漬法分析，以rTyr p10吸附rTyr p10陽性患者血清後再與腐食酪蟎之粗萃取物反應。實驗結果如第十四圖所示，rTyr p10之反應帶完全被吸附掉，而在腐食酪蟎粗萃取之40 kDa位置蛋白質帶也隨著吸附物濃度上升而逐漸消失的情形，顯示rTyr p10的確具有與nTyr p10相同之IgE特異性。

實驗六：腐食酪蟎第二十群過敏原之選殖與純化

1.　腐食酪蟎第二十群過敏原之選殖

以簡併引子AKF2-1(SEQ ID NO: 33)和專一性引子AKF1-R(SEQ ID NO: 34)進行PCR，得到約200bp的片段，定序分析後得到一214個鹼基對的cDNA序列，根據此序列(internal Ak-1)設計專一性引子，進行3’RACE PCR，由TpAK2-1-SF(SEQ ID NO: 35)和adaptor primer(AP)(SEQ ID NO: 36)，從cDNA夾出一個約為600個鹼基對之片段；另外一個專一性引子TpAK2-1-SR(SEQ ID NO: 37)則往5’端的方向與另一保留區所設計的簡併引子AK3-DF(SEQ ID NO: 38)夾得一段約300個鹼基對的片段；經過定序分析後可得到一307個鹼基對的片段，根據此序列(internal Ak-2)設計專一性引子TpAK3-SR(SEQ ID NO: 39)，和Oligo-dT做5’RACE PCR，得到一個約750個鹼基對大小的片段，接著選殖到XL1-Blue大腸桿菌內，進行定序，得一749個鹼基對的片段；最後設計專一性引子TpAK-EF(SEQ ID NO: 40)和TpAK-ER(SEQ ID NO: 41)進行全長ORF的PCR，選殖到XL1-Blue，定序後得到全長為1074個鹼基對的cDNA序列SEQ ID NO: 42，推演出357個胺基酸序列SEQ ID NO: 43，理論分子量約為39.9 kDa。

2.　腐食酪蟎第二十群過敏原蛋白質表現及純化

先抽取已在pUC119載體建構好的質體DNA，與限制酶(Bam HI)於37℃作用16~18小時，以1.5%洋菜膠檢查後，將位於1000與1264個鹼基對之間的DNA帶引流。再將此DNA與Bam HI酶切過的表現載體pQE30於22℃做連接，經過轉型作用後，定序確認。將已經建構好的表現載體pQE30和不含插入片段的表現載體分別轉型至表現宿主M15大腸桿菌中，做小量的蛋白質表現試驗。破菌後，以12% SDS-PAGE和經過西方墨點法後，以組胺酸單株抗體(購買自SIGMA)去檢測結果。在考馬斯藍染色後，還有利用組胺酸單株抗體偵測的西方墨點法，加入IPTG後的欄位於40 kDa的位置皆有一個隨時間增長而表現增加的融合蛋白質帶，第十五圖是大量表現並以Ni-NTA管柱純化後的rTyr p 20。

3.　鑑定重組腐食酪蟎第二十群過敏原之致敏力

利用實驗一所述之免疫吸附分析方法，先將病患血清跟rTyr p 20(50 μg/ml)於4℃下作用隔夜，之後再進行免疫轉漬。而ELISA吸附分析也是先取病患血清跟重組過敏原rTyr p 20(50 μg/ml)於4℃下作用隔夜，之後再進行ELISA。

預先以腐食酪蟎粗萃取物為抗原，以ELISA分析171位對腐食酪蟎粗萃取物呈陽性的患者血清，搭配24位非過敏體質的血清作為控制組，測量血清中與rTyr p 20具特異性IgE的反應情形。結果顯示在171位病人中，有65個呈現陽性，比例是39%(65/171)；以免疫轉漬法測試同樣的171位病人，發現有30人對rTyr p 20有反應，陽性率為17.5%(30/171)。

4.　腐食酪蟎第二十群過敏原免疫轉漬抑制試驗

如第十六圖所示，圖(A)先將rTyr p 20做免疫轉漬，再把已經和不同濃度之腐食酪蟎粗萃取物反應一晚的病人血清當作一級抗體，可以觀察到在40 kDa處的蛋白質帶，隨著腐食酪蟎粗萃取物的濃度越濃而消失(0,10-2,10-1,1)；圖(B)先將腐食酪蟎粗萃取物做免疫轉漬，再把已經和不同濃度之rTyr p 20反應一晚的病人血清當作一級抗體，可以觀察到一條隨著rTyr p 20濃度上升(0,10-2,10-1,1)而消失的蛋白帶，由此可以知rTyr p 20具有辨識血清中特異性IgE之能力。

實驗七：腐食酪蟎陽性盛行率之群組建立

1.過敏患者血清IgE抗體對腐食酪蟎的陽性盛行率

以ELISA篩檢來自298位過敏病患之血清樣本，以腐食酪蟎粗萃取液作為抗原，測定血清中IgE抗體對於此抗原之效價。

ELISA篩檢方法如下，以附著緩衝溶液將腐食酪蟎抗原以每孔5 μg之濃度附著在96孔酵素免疫分析盤中，以八爪微量吸管，在每個孔槽加入100 μl含腐食酪蟎萃取液之附著緩衝溶液，加上蓋子放入4℃冰箱，放置一夜穩定抗原，使抗原附著於孔槽表面。第二天，利用八爪微量吸管加入200 μl的PBST(Tween 20與1倍PBS之體積比為1比2000)，清洗5次把多餘的抗原洗掉。每個孔槽加入200 μl、1%的脫脂奶溶液進行遮蓋，加蓋後擺在37℃培養箱中反應1小時，1小時後利用PBST清洗4次後拍乾，在孔槽中加入100 μl病人血清(血清與1倍PBS的體積比為1比4)，每個檢體做三個重複，加蓋後放入4℃冰箱，放置隔夜進行一抗反應。隔夜後取出分析盤，利用PBST清洗5次準備進行二抗反應，以PBS稀釋二抗(HRP-conjugated Goat anti-Human IgG)1000倍，加入100 μl二抗溶液在孔槽中，加蓋後在37℃下反應2小時，反應結束後利用PBST清洗6次，加入100 μl的2,2'-聯氮雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)，以下簡稱ABTS)受質溶液，避光反應15分鐘後，利用ELISA讀值儀判讀在波長為450nm下檢測吸光值。於此條件下，每0.10為一價，零價(吸光值小於0.10)、一價(吸光值介於0.10至0.19)、二價(吸光值介於0.20至0.29)、三價(吸光值介於0.30至0.39)、四價(吸光值0.40介於0.49)、五價(吸光值介於0.50至0.59)、六價以上(吸光值大於0.6)，以波長450nm下的吸光值0.25為截取值，作為判定是否為陽性的標準(以十位健康人之血清之平均值加上兩倍標準差)，以吸光值0.101為截取值(以二十位健康血清吸光平均值加兩倍標準差)作為判定是否為陽性標準。結果顯示298位過敏病患的血清樣本內有106位具有對抗腐食酪蟎過敏原的IgE抗體，陽性率為35.6%(106/298)。

2.　過敏患者血清IgE對腐食酪蟎主要過敏原陽性率之比較

從腐食酪蟎中選殖六種主要重組過敏原作為抗原，包含rTyr p 2、rTyr p 3、rTyr p 7、rTyr p 8、rTyr p 10、rTyr p 20，選殖方法如先前實驗一至六所述，以ELISA檢測經過腐食酪蟎過敏原篩選得出106位含有IgE抗體的血清樣本。結果如第十七圖所示，過敏病患IgE陽性率最高為rTyr p 2(79.2%)，其次為rTyr p 3(49.1%)，再其次為rTyr p 20(48.1%)，而rTyr p 7(37.7%)跟rTyr p 10(18.9%)的IgE陽性率甚低。

3.　腐食酪蟎過敏原陽性盛行率之群組建立

依上述結果，不同過敏原檢測群組的建立結果如表一，設定三組群組分別為：群組一(Tyr p 2+Tyr p 3)、群組二(Tyr p 3+Tyr p 7)、群組三(Tyr p 2+Tyr p 3+Tyr p 7)，結果顯示經設定群組後腐食酪蟎陽性盛行率提升為群組一的84.0%、群組二的86.0%、群組三的100%，群組設定後腐食酪蟎陽性盛行率均明顯提升，尤其是群組三達到100%的腐食酪蟎陽性盛行率。

表一、腐食酪蟎陽性盛行率之群組建立

實驗八：腐食酪蟎專一性IgE陽性盛行率之群組建立

1.　以免疫吸附抑制效應分析鑑定過敏患者血清對腐食酪蟎主要過敏原之特異性IgE陽性盛行率

先取病患血清分別跟濃度50 μg/ml的rTyr p 2、rTyr p 3、rTyr p 7、rTyr p 8、rTyr p 10、或rTyr p 20於4℃下反應隔夜，之後再進行ELISA分析。使用歐洲室塵蟎粗萃取液，以ELISA方法吸附106位過敏病患的血清，來評估腐食酪蟎主要重組過敏原的重要性。結果如第十八圖所示，腐食酪蟎的個別重組過敏原之特異性IgE陽性率結果依序如下，rTyr p 2為39.6%(42/106)、rTyr p 3為41.5%(44/106)、rTyr p 7為32.1%(34/106)、rTyr p 8為17.9%(19/106)、rTyr p 10為5.7%(6/106)、rTyr p 20為17.9%(19/106)，可發現106位過敏病患之特異性IgE的陽性率最高為rTyr p 3(41.5%)，其次為rTyr p 2(39.6%)，再其次為rTyr p 7(32.1%)，而rTyr p 10(5.7%)特異性IgE陽性率甚低。

2.　腐食酪蟎專一性IgE陽性盛行率之群組建立

以相同的群組建立方法，分析歐洲室塵蟎粗萃取液吸附後腐食酪蟎特異性IgE陽性盛行率。結果如表二所示，設定四組群組分別為：群組一(Tyr p 2+Tyr p 3)、群組二(Tyr p 2+Tyr p 3+Tyr p 7)、群組三(Tyr p 2+Tyr p 3+Tyr p 7+Tyr p 8)、群組四(Tyr p 2+Tyr p 3+Tyr p 7+Tyr p 8+Tyr p 10+Tyr p 20)，結果顯示經設定過敏原陽性篩檢群組後腐食酪蟎特異性IgE陽性盛行率提升為群組一的67.9%、群組二的79.2%、群組三的87.0%、群組四的88.0%，發現經群組設定後腐食酪蟎特異性IgE陽性盛行率均明顯提升，尤其是群組四提升至88.0%。

表二、經免疫吸附抑制效應，腐食酪蟎特異性IgE陽性盛行率之群組建立

在此必須說明者為，以上配合圖式所為之詳細描述，僅係為了說明本發明之技術內容及特徵而提供之一實施方式，凡在本發明領域中具有一般通常知識之人，在瞭解本發明之技術內容及特徵之後，於不違背本發明之精神下，所為之種種簡單之修飾、替換或構件之減省，皆應屬於以下所揭示之申請專利範圍之內。

第一圖為使用ELISA檢測過敏原rTyr p 2以及rTyr p 3吸附病患血清中，腐食酪蟎之IgE。其中A1~A22為過敏病患；□係以PBS吸附；係以rTyr p 2(50 μg/ml)吸附；■係以rTyr p 3(50 μg/ml)吸附。

第二圖為腐食酪蟎蟲體和第三群過敏原之蛋白質圖譜及西方墨點轉漬法。其中(A)為膠體電泳圖(SDS-PAGE)並用考馬斯藍染色；M為分子量標準溶液；欄1、2為腐食酪蟎蟲體50 μg；欄3為重組第三型過敏原(rTyr p 3)10 μg。(B)為西方墨點轉漬法；欄1為一級抗體：免疫前兔子血清IgG，以及二級抗體：老鼠抗兔子IgG；欄2為一級抗體：免疫後抗rTyr p 3兔子血清IgG，以及二級抗體：老鼠抗兔子IgG；欄3為一級抗體：免疫後抗rTyr p 3兔子血清IgG，以及二級抗體：老鼠抗兔子IgG。

第三圖為使用親和層析法之CNBr活化的瓊脂糖凝膠管柱純化腐蝕酪蟎原生型第三群過敏原，純化過程後各管呈現於膠體電泳圖SDS-PAGE並用卡馬斯藍染色如圖(A)以及西方墨點轉漬法如圖(B)。其中一級抗體為抗rTyr p 3之多株抗體兔子血清IgG，二級抗體為老鼠抗兔子IgGM為分子量標準溶液，SGM為腐食酪蟎生長後培養基，FT為蟲體生長後培養基，FT為蟲體生長後培養基過完管柱之流出液，W1為緩衝液(0.1M Borate/0.5M NaCl/0.05% Tween 20)清洗第一次流出液，W2為緩衝液(0.1M Borate/0.5M NaCl/0.05% Tween 20)清洗第二次流出液，E1為引流液(0.1M glycine/0.15M NaCl)沖出第一次引流液，E2為引流液(0.1M glycine/0.15M NaCl)沖出第二次引流液。

第四圖為使用西方免疫轉漬法確認腐食酪蟎之過敏成分並使用重組過敏原rTyr p 2或rTyr p 3進行免疫吸附反應。M為蛋白質分子量標準，Tp crude為腐食酪蟎之萃取物。欄1為rTyr p 2，欄2為rTyr p 3，26 kDa←係蛋白質分子量為26 kDa，16 kDa←係蛋白質分子量為16 kDa。A4、A10、A12、A14、A16、A21為具有抗腐食酪蟎過敏原分子量位於16 kDa與26 kDa IgE抗體之過敏病患。係以rTyr p 2(50 μg/ml)吸附；■係以rTyr p 3(50 μg/ml)吸附。

第五圖為嗜鹼性球組織胺體外誘發試驗。rTyr p 3使用的濃度為0.01~100 μg/ml，Pt1~Pt10為對腐食酪蟎過敏的病患用實線表示，H1~H3為健康對象用虛線表示。

第六圖為腐食酪蟎重組第七群過敏原大量表現後，以鎳離子螯合層析法純化後，利用12% SDS-PAGE蛋白質電泳與卡馬斯藍染色確認結果。其中M為蛋白質分子量標準，L為未與膠體結合的細菌萃取液之上清液，W50為以50 mM咪唑清洗緩衝液清洗的流出液，W60為以60 mM咪唑清洗緩衝液清洗的流出液，E1~14為以250 mM咪唑沖提緩衝液蛋白洗出液順序。

第七圖為使用西方免疫轉漬法確認腐食酪蟎之過敏成分並用重組第七群過敏原進行免疫吸附反應。M為蛋白質分子量標準，Tp為腐食酪蟎之粗萃取物。欄1為未經吸附病患之血清，欄2為事先以重組第七群過敏原吸附病患之血清，欄3為事先以小牛血清蛋白(Bovin serum albumin)吸附病患之血清當作吸附陰性對照。

第八圖為嗜鹼性球組織胺體外誘發試驗。rTyr p 7使用的濃度為0~100 μg/ml，P1~P10為對腐食酪蟎過敏的病患，N1~N4為健康對象。

第九圖為腐食酪蟎第八群過敏原大量表現後，以鎳離子螯合層析法純化後，利用12% SDS-PAGE蛋白質電泳以及卡馬斯藍染色確定結果。其中M為蛋白質分子量標準，L為未與膠體結合的細菌萃取液，S為未與膠體結合的細菌萃取液之上清液，R為與膠體結合的細菌萃取液之上清液，W10為以10 mM咪唑清洗緩衝液清洗的流出液，W50為以50 mM咪唑清洗緩衝液清洗的流出液，E1~4為以250 mM咪唑沖提緩衝液蛋白洗出液順序。

第十圖為使用西方免疫轉漬法確認腐食酪蟎之過敏成份並用重組第八群過敏原進行免疫吸附反應。其中M為蛋白質分子量標準，欄1為腐食酪蟎之粗萃取物，欄2~3為腐食酪蟎之重組過敏原rTyr p 7、8、20，未經吸附病患之血清為欄1~2，事先以重組過敏原吸附病患之血清為欄3。

第十一圖為嗜鹼性球組織胺體外誘發試驗。rTyr p 8使用的濃度為0~100 μg/ml，P1~P10為對腐食酪蟎過敏的病患，N1~N4為健康對象。

第十二圖為腐食酪蟎第十群過敏原大量表現後，以鎳離子螯合層析法純化後，利用12% SDS-PAGE蛋白質電泳以及卡馬斯藍染色確定結果。其中M為蛋白質分子量標準，F為未與膠體結合的細菌萃取液，W為以10 mM咪唑清洗緩衝液清洗的流出液，E1~5為以250 mM咪唑沖提緩衝液蛋白洗出液順序。

第十三圖為免疫轉漬法分析rTyr p 10抗體專一性結果左邊區域為SDS-PAGE分析，Tp為腐食酪蟎粗萃取，p10為rTyr p10；右邊區域為免疫轉漬實驗結果，分成第1組：未免疫之兔子血清、第2組：免疫之兔子血清結果。由圖中可見未免疫之兔子血清不能辨識rTyr p10，也對腐食酪蟎之粗萃取無反應。免疫後兔子血清可辨識rTyr p 10，而且在腐食酪蟎粗萃取中，發現在40 kDa有一條蛋白質帶被辨識，由此推論腐食酪蟎之天然原肌球蛋白位於40 kDa。

第十四圖腐食酪蟎粗萃取與rTyr p10之免疫轉漬吸附實驗，(A)圖為以rTyr p10吸附腐食酪蟎粗萃取，(B)圖為以腐食酪蟎粗萃取吸附rTyr p10的結果。兩組皆以同樣之rTyr p10陽性血清做為樣本，欄1、2、3代表不同吸附物倍率，分別為原倍、10倍稀釋、100倍稀釋，N為以1% PBST-脫脂奶作為控制組。圖中可見rTyr p10在濃度上升後逐漸被吸附掉，而在腐食酪蟎粗萃取之40 kDa位置蛋白質帶也隨著吸附物濃度上升而逐漸消失。顯示rTyr p10具有與腐食酪蟎萃取液中天然原肌球蛋白具有相似之IgE特異性。

第十五圖為腐食酪蟎第二十群過敏原大量表現後，以鎳離子螯合層析法純化後，利用12% SDS-PAGE蛋白質電泳以及卡馬斯藍染色確定結果。其中M為蛋白質分子量標準，欄1為與膠體結合3-4小時的細菌萃取液，欄2為未與膠體結合的細菌萃取液，欄3為以30 mM咪唑清洗緩衝液清洗的流出液，欄4為以1 ml 250 mM咪唑沖提緩衝液蛋白洗出液順序洗出液第一管，欄5為洗出液第二管，欄6為洗出液第三管，欄7為洗出液第四管，欄8為洗出液第五管。

第十六圖為腐食酪蟎第二十群過敏原免疫轉漬抑制試驗。圖(A)先將rTyr p 20做免疫轉漬，再把已經和不同濃度之抑制物(腐食酪蟎粗萃取物)反應一晚的病人血清當作一級抗體，可以觀察到在40 kDa處的蛋白質帶，隨著抑制物的濃度越濃而消失(0,10^-2,10^-1,1)；圖(B)先將腐食酪蟎粗萃取物做免疫轉漬，再把已經和不同濃度之抑制物(rTyr p 20)反應一晚的病人血清當作一級抗體，可以觀察到一條隨著抑制物濃度上升(0,10^-2,10^-1,1)而消失的蛋白帶，推測此蛋白帶所在位置為nTyr p 20所在位置。由(A)(B)可以推測，rTyr p 20與nTyr p 20均具有辨識血清中特異性IgE之功能。

第十七圖為使用ELISA篩檢106位過敏病患，對腐食酪蟎粗萃取液篩選含有IgE抗體之血清，其個別重組過敏原之IgE陽性率結果。以腐食酪蟎個別重組過敏原作為抗原濃度為5 μg/well，血清稀釋倍率為5倍，吸光值為OD450nm，於此條件下，以吸光值0.101為截取值(以二十位健康血清吸光平均值加兩倍標準差)作為判定是否為陽性標準。

第十八圖為使用ELISA篩檢106位過敏病患經歐洲室塵蟎粗萃取物吸附後，對腐食酪蟎個別重組過敏原含有特異性IgE抗體之血清，其陽性盛行率結果。

<110>　行政院國軍退除役官兵輔導委員會臺中榮民總醫院

<120>　腐食酪蟎過敏檢測套組及檢測方法

<160>　43

<170>　PatentIn version 3.5

<210>　1

<211>　27

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

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<223>　primer

<400>　1

<210>　2

<211>　27

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　2

<210>　3

<211>　383

<212>　DNA

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　3

<210>　4

<211>　126

<212>　PRT

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　4

<210>　5

<211>　22

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

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<400>　5

<210>　6

<211>　22

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

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<223>　primer

<400>　6

<210>　7

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<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

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<223>　primer

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<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

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<400>　12

<210>　13

<211>　858

<212>　DNA

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　13

<210>　14

<211>　285

<212>　PRT

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　14

<210>　15

<211>　21

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　15

<210>　16

<211>　30

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　16

<210>　17

<211>　585

<212>　DNA

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　17

<210>　18

<211>　194

<212>　PRT

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　18

<210>　19

<211>　4

<212>　PRT

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　19

<210>　20

<211>　4

<212>　PRT

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　20

<210>　21

<211>　8

<212>　PRT

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　21

<210>　22

<211>　24

<212>　DNA

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　22

<210>　23

<211>　24

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　23

<210>　24

<211>　24

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　24

<210>　25

<211>　21

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　25

<210>　26

<211>　20

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　Primer

<400>　26

<210>　27

<211>　657

<212>　DNA

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　27

<210>　28

<211>　218

<212>　PRT

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　28

<210>　29

<211>　30

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　29

<210>　30

<211>　30

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　30

<210>　31

<211>　855

<212>　DNA

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　31

<210>　32

<211>　284

<212>　PRT

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　32

<210>　33

<211>　35

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　33

<210>　34

<211>　32

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　34

<210>　35

<211>　25

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　35

<210>　36

<211>　21

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　36

<210>　37

<211>　25

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　37

<210>　38

<211>　29

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　38

<210>　39

<211>　27

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　39

<210>　40

<211>　27

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　40

<210>　41

<211>　27

<212>　DNA

<213>　Artificial Sequence

<220>

<223>　primer

<400>　41

<210>　42

<211>　1074

<212>　DNA

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　42

<210>　43

<211>　357

<212>　PRT

<213>　Tyrophagus putrescentiae

<400>　43

Claims (23)

1. 一種腐食酪蟎過敏檢測套組，包含有：至少一抗原，該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)、Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)、Tyr p 8(SEQ ID NO: 28)、Tyr p 10(SEQ ID NO: 32)以及Tyr p 20(SEQ ID NO: 43)。
2. 如申請專利範圍第1項所述之腐食酪蟎過敏檢測套組，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)、Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)以及Tyr p 8(SEQ ID NO: 28)。
3. 如申請專利範圍第1項所述之腐食酪蟎過敏檢測套組，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)以及Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)。
4. 如申請專利範圍第1項所述之腐食酪蟎過敏檢測套組，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)以及Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)。
5. 如申請專利範圍第1項所述之腐食酪蟎過敏檢測套組，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)以及Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)。
6. 如申請專利範圍第1項所述之腐食酪蟎過敏檢測套組，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)以及Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)。
7. 如申請專利範圍第1項所述之腐食酪蟎過敏檢測套組，更包含有一抗體共軛物，該抗體共軛物包含有一二級抗體以及一標定物，該二級抗體可專一地辨識該檢體內與該抗原結合之抗體，該標定物與該二級抗體共價結合。
8. 如申請專利範圍第7項所述之腐食酪蟎過敏檢測套組，其中該標定物為酵素。
9. 如申請專利範圍第8項所述之腐食酪蟎過敏檢測套組，更包含有一酵素基質。
10. 一種腐食酪蟎過敏檢測方法，包含有下列步驟：(a)提供一檢體，該檢體內包含有至少一目標抗體；(b)提供至少一抗原與該檢體反應，使該目標抗體與該抗原結合，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)、Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)、Tyr p 8(SEQ ID NO: 28)、Tyr p 10(SEQ ID NO: 32)以及Tyr p 20(SEQ ID NO: 43)；(c)將該抗原與該目標抗體結合之複合物與一抗體共軛物反應，該抗體共軛物包含有一二級抗體以及一標定物，該二級抗體可專一地辨識該檢體內與該抗原結合之抗體，該標定物與該二級抗體共價結合；以及(d)測定該標定物之表現。
11. 如申請專利範圍第10項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，更包含有下列步驟：(e)將該抗原附著於一固定基質。
12. 如申請專利範圍第11項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，其中該固定基質為聚乙烯。
13. 如申請專利範圍第10項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，其中該檢體為血清。
14. 如申請專利範圍第10項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)以及Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)。
15. 如申請專利範圍第10項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)以及Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)。
16. 如申請專利範圍第10項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)以及Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)。
17. 一種腐食酪蟎過敏檢測方法，包含有下列步驟：(a)提供一歐洲室塵蟎粗萃取物與一檢體進行吸附反應，其中該檢體內包含有至少一目標抗體；(b)提供至少一抗原與(a)步驟之產物反應，使該目標抗體與該抗原結合，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)、Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)、Tyr p 8(SEQ ID NO: 28)、Tyr p 10(SEQ ID NO: 32)以及Tyr p 20(SEQ ID NO: 43)；(c)將該抗原與該目標抗體結合之複合物與一抗體共軛物反應，該抗體共軛物包含有一二級抗體以及一標定物，該二級抗體可專一地辨識該檢體內與該抗原結合之抗體，該標定物與該二級抗體共價結合；以及(d)測定該標定物之表現。
18. 如申請專利範圍第17項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，更包含有下列步驟：(e)將該抗原附著於一固定基質。
19. 如申請專利範圍第18項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，其中該固定基質為聚乙烯。
20. 如申請專利範圍第17項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，其中該檢體為血清。
21. 如申請專利範圍第17項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組:Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)、Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)以及Tyr p 8(SEQ ID NO: 28)。
22. 如申請專利範圍第17項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)、Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)以及Tyr p 7(SEQ ID NO: 18)。
23. 如申請專利範圍第17項所述之腐食酪蟎過敏檢測方法，其中該抗原係選自由下列胺基酸序列所組成的群組：Tyr p 2(SEQ ID NO: 4)以及Tyr p 3(SEQ ID NO: 14)。