TW201207113A

TW201207113A - Virally-inactivated growth factors-containing platelet lysate depleted of PDGF and VEGF and preparation method thereof

Info

Publication number: TW201207113A
Application number: TW100118073A
Authority: TW
Inventors: Thierry Burnouf; Cheng-Yao Su
Original assignee: Gworei Biomedical Technology Co Ltd
Priority date: 2010-05-25
Filing date: 2011-05-24
Publication date: 2012-02-16
Also published as: EP2389942B1; CN102985101B; ES2402144T3; WO2011148326A1; US20130143810A1; US9034646B2; CN102985101A; JP2013528173A; TWI432578B; EP2389942A1

Description

2〇l2〇7li3 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】自人明係關於血/板衍生物的範°壽，特別是關於得明介關或動物源血小板之生長因子濃厚液的範轉。本發 =於二製二類(含有生長因子之血小板裂解物細於m及八在5式&内⑺咖）、活體外（“⑽）之床。ΐ Γ田月f廣增及分化）的用途、美容或臨勺應用，如與骨移植體之組合應用。【先前技術】有重’人類血小板包含大量具矚目。、子’其中又以生長因子（GF)最受括三種ί因子堆積在灰小板的α_顆粒内，主要包及Βτη小板知生之生長因子的異構體（PDGF-AA、-AB )、血管内皮生長因子(Vegf)、轉形生長因二及TGF-P2 )、表皮生長因 :子^ ^ 人類血丨4已斗艮且康^些生長因子的治療標的，將複雜的八頭血小板生長因子混合 4口认土 ,., 物材以之血漿進行物材枓係藉由凝血酶對含血小板釋屮血广板活化通常會使包含在血小板内的生長因子白A二_L、此同時，凝血酶會使纖維蛋白原轉變成纖維蛋 ;成凝膠基質（gel matrix)，這類凝膠基質會將生子抓在裡面。這項生物材料—般會單獨施用或與移 =材料（graftmaterials)共同施用在組織上，故可將含，生長因子之血小板凝膠（plateletgds)用於再生醫學 (regenerative medicine)’以促進軟組織及硬組織的癒 201207113 合及再生。亦可將從血小板得出的生長因子濃厚液補充在試管内（/·« vzYro )或活體外（ex ν/νο )之細胞培養的生長培養基中。近來已證明，可能使用富含人類生長因子之血小板釋出物來取代胎牛血清（fetal bovine serum ’ FBS )，而使間質幹細胞（mesenchymal stem cells ) 或造血幹細胞（hematopoietic stem cells)在活體外（ex Wv<9)中擴增。目前將富含生長因子之血小板釋出物應用於幹細胞擴增一事倍受矚目，特別是在公認的新「廣效」細胞 (即間質幹細胞(mesenchymal stem cells，MCS)，或造血幹細胞(hematopoietic stem cells))擴增中用來作為胎牛血清（FBS)或胎犢血清（fetal calf serum，FCS)的替代品，這些血清普遍被視為普利子蛋白（prion )及病毒的可能傳染源，也被視為在病患身上造成免疫問題的原因，這是胎牛血清或胎犢血清中殘餘的牛蛋白和抗原所造成的。最近已發展出新的策略，包括在習知表現系統中生產重組血小板生長因子，如將某重組人類個體（Rh)生長因子用於治療用途。某些國家已核准將基因工程酵母菌所表現的Rh-PDGF-BB用於治療慢性神經病變型下肢糖尿病性潰癌（chronic neuropathic lower-extremity diabetic ulcers)，不過，要達到臨床成效需要施用高劑 . 量的這種單一生長因子數週之久。同樣地，TGF-β超級家族中的Rh-骨型態發生蛋白（Rh-bone morphogenetic proteins，BMP) BMP-2及BMP-7可從中國倉鼠卵巢細胞製得，並已核准用於治療某些骨折手術。然而，可用的重組生長因子數目仍然非常有限，部分是因為這些生長因子在分離、鑑定、選殖及表現方面的難度所致。進一步言之’血小板衍生之製備物的優點仍比使用單一重組因子要多’這是因為在某些應用中，生長因子的組合 5 201207113 可達到優勢協同作用（synergistic effect)。目前資料顯示生長因子PDGF及VEGF係直接與異常細胞增殖及/或分化有關（例如可參見Ferrara et d.， Nature Medicine，vol. 9，no. 6, 2003, pp. 669-676 ;以及 European Medical Agency 在 2010 年 2 月 18 日刊行的 EMA/92326/2010，和 FDA 於 2008 年 3 月 27 日的通訊 “an ongoing safety review of regranex (becaplermin)，，）° 由於在以PDGF及VEGF個別進行的治療中，發展中癌症的感受性（susceptibility)增加了，因此要避免將這兩種生長因子用於培養幹細胞或治療病患，特別是當該病患已有罹癌風險的時候。因此，目前確有發展處理人類血小板材料之方法的需要’這些方法是用以製備已定性且具病毒安全性的工業生長因子製備物，特別是其中PDGF及VEGF耗盡之製備物。專利申請案W02009/087560已揭露可使人類血小板濃厚液接受溶劑及清潔劑組合（S/D)的處理來達到雙重目的：（a)脂質套膜病毒的去活化，以及(b)從血小板 α-顆粒大篁釋出生長因子。之後可藉由結合s/d處理、油萃取及疏水性交互作用層析（HIC)步驟而得出一標準化複雜血小板生長因子混合物，其包含PDgf-AB、 -ΒΒ及-ΑΑ、TGF-β、EGF、VEGF、以及類胰島素生長因子-βΐ (IGF-βΙ)，其中油萃取及hic係用以移除s/D 試劑而不會顯著影響PGF及蛋白的含量。所得血小板生長因子製備物顯示可在試管内刺激多種細胞株，並促使由抽脂取得之脂肪組織當中的幹細胞擴增。此外’ W02009/087560亦揭露了以sp_sepharose陽離子交換管柱來取代HIC，以製備經純化之PDGF-VEGF流析物 (fraction)。在這項策略中，pDGF及VEGF確實可被吸附在管柱上’但TGF-β、EGF、IGF則與在病毒去活

S 6 201207113 化步驟中使用的S/D試劑一同在前緣部分 (breakthrough)出現。反言之，W02009/087560 揭露的是可藉由DEAE-sepharose陰離子交換取代HIC的方式將TGF-β及EGF純化到一定的程度。在 El-Ekiaby et al.所發表的文獻（El-Ekiaby et al;， “Solvent-detergent filtered (S/D-F) fresh frozen plasma and cryoprecipitate minipools prepared in a newly designed integral disposable processing bag system”, Transfusion medicine, 2010, 20, 48-61 )當中，作者揭露了一種方法’其可用於單一來源（singulet)或迷你集池 (mini-pools )之輸血用血漿及冷凍沈澱品的病毒去活化處理，包含下列主要步驟：以ΤηΒΡ及TritonX-45之混合物對新鮮冷凍血漿（FFP)、冷凍沈澱品貧乏之血漿 (Cryo-Poor Plasma，CPP)或冷凍沈澱品進行s/D處理；對經S/D處理之血漿材料進行油萃取；以及透過含有經活化之活性碳的S/D吸收過濾器來過濾經油萃取之血漿材料。如該文獻的討論所述’其所揭露之方法特別是能夠保存血聚蛋白（例如凝血因子）之功能活性，不會改變 VWF 多聚體組成物（VWF multimer composition)，且會將ΤηΒΡ及TritonX-45減少到可接受濃度以下，並可藉由重力使所得之經純化血漿進行無菌過據。然而這份文獻係針對血漿材料的純化，故未揭露或建議一種可用於從血小板濃厚液純化出生長因子的方法。在密集研究後，發明人驚奇地發現，本發明包含對血小板濃厚液進行S/D處理、再進行油萃取及活性碳萃取或單以活性碳萃取的方法能夠簡便、快速、有效地製備出一種含有病毒去活化之生長因子且PDGF及VEG^ 耗盡的血小板裂解物，其中溶劑及清潔劑之濃度係符合主管機關有關經S/D處理之非經口血液衍生治療產品的核可標準。 ”扣、 201207113 白蛋白及免疫球蛋變主要蛋白（如 V腳以外之生長因子的濃度，如= 及將脂^套^來^及=明之方法可溶解脂質膜’所以會 ,卫·了移除在起始血小板濃厚液中存在供一^广心、^脂質。是以，本發明之方法使之可能提化的血小板衍生之生長因子混合物，其 U有效地&準化而用於治療性處理、細胞療法或培養。 ▲表後fera床上在靜脈内使用血小板來矯治數量性或力月bf生血J板數篁低下症（thr〇mb〇Cyt〇penja)時，由於血小板的保存期限是5或7天（部分是因為細菌污染風，與f血功能活性喪失的問題），所以每年通常都會廢棄大里，存時間大於5或7天的血小板單位。本發明之 =f允許使用過期血小板儲存液來製備血小板衍生之 /辰厚液，揭不了一種極具有經濟目標的願景。【發明内容】本發明之一目的是一種製備含有病毒去活化之生 ^因=且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的方法， i包含下列f驟：使起始血小板濃厚液與溶劑及/或清潔觸；使前述起始血小板濃厚液與前述溶劑及/或清潔劑共同培養一段至少5分鐘至6小時的時間，其值 1維持在，約6.0至約9.0的範圍内，且其溫度係在從 2°C至j0〇C的範圍内’較佳為在從250C至40。(：的範圍内，藉由油萃取來移除前述溶劑及/或清潔劑，以得出、水〖生^白相；以及將前述水性蛋白相與活性碳共同培養、’或藉^由將經溶劑及/或清潔劑處理之血小板濃厚液單與活性碳共同培養來移除溶劑及/或清潔劑。

S 8 201207113 在較佳實施態樣中，在本發明之方法中所使用的溶劑係選自由具有不同烷基鏈之二-或三烷基磷酸酯類所組成之群組，較佳為三正丁基磷酸酯（ΤηΒΡ)。在較佳實施態樣中，在本發明之方法中所使用的清潔劑係選自由脂肪酸之聚氧乙烯衍生物、山梨糖醇酐之偏酯類（partial esters )、非離子性清潔劑、去氧膽酸鈉 '及確基甜菜驗類（sulfobetaines )所組成之群組，更佳為 - 選自由 Triton X-45、Triton X-100、Tween 80 及 Tween 20 所組成之群組。在較佳實施態樣中，前述溶劑及/或前述清潔劑在將前述血小板濃厚液與溶劑/清潔劑共同培養之步驟中的個別濃度範圍為從0.2至5體積％，較佳為從0.2至2 體積％，其係以前述起始血小板濃厚液之體積為基礎計算。在本發明之方法的較佳實施態樣中，前述起始血小板濃厚液係單與2% ΤηΒΡ接觸，或與1% ΤηΒΡ及1% Triton X-45接觸’其係以前述血小板濃厚液之體積為基礎計算。進一步言之，在本發明之較佳實施態樣中，油萃取係以醫藥等級油來進行，且前述油之用量為從2至20 重量％、或從5至15重量％、或從5至10重量％，其係以前述血小板濃厚液與前述溶劑及/或清潔劑之混合物的重量為基礎計算。 . 在較佳實施態樣中，當在與經活化之活性碳共同培養之前進行油萃取時，經活化之活性碳之用量係為在油萃取後回收之水性蛋白相的從50至250 g/Ι，較佳為從 55至200 g/卜或從60至150 g/卜或從65至100 g/1。在另一實施態樣中，當在與經活化之活性碳共同培養之前不進行油萃取時，經活化之活性碳之用量係為經溶劑及/或清潔劑處理一次之血小板濃厚液的從250至 1250 g/Ι，較佳為從275至1000 g/卜或從300至750 g/]、 201207113 或從 325 至 500 g/l。在較佳實施態樣中，本發明之方法在油萃取後、及 /或在與活性碳共同培養後包含另一離心步驟。本發明之方法可進一步包含另一選自由層析、奈米過渡（用以移除致病劑）及/或超遽所組成之群組之步驟來處理所得血小板裂解物。在較佳實施態樣中，本發明之方法包含一製備起始血小板濃厚液的初步步驟，前述起始血小板濃厚液係藉由血小板分離術（apheresis )或藉由血沉棕黃層（buffy _ coat)分離法而從全血加已製備，且係為新鮮、過期之儲存液體、或過期且冷珠的狀態。本發明之另一目的是一種含有病毒去活化之生長因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物，或是一種藉由本發明之方法得出的含有病毒去活化之生長因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物。在較佳實施態樣中，這種血小板裂解物包含生長因子TGF-β、IGF及EGF。在另一實施態樣中，這種血小板裂解物進一步包含bFGF。在較佳貫施態樣中，本發明之含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物包含： -PDGF-AB，其濃度為低於1〇 ng/ml之前述裂解物，更佳為低於5 ng/ml之前述裂解物，更佳為低於3 ng/pl之前述裂解物；及/或 -VEGF ’其濃度為低於〇.1 ng/ml之前述裂解物，更佳為低於〇·〇1 ng/ml之前述裂解物；及/或 -TGF-β ’其濃度為高於50 ng/ml之前述裂解物，更佳為高於100 ng/ml之前述裂解物更佳為高於150 ng/ml之前述裂解物，更佳為高於200 ng/ml之前述裂解物’更佳為高於250 ng/ml之前述裂解物；及/ 或

S 10 201207113 -EGF，其濃度為高於0.5 ng/ml之前述裂解物，更佳為高於1 ng/ml之前述裂解物，更佳為高於1.5 ng/ml 之前述裂解物，更佳為高於2 ng/ml之前述裂解物，更佳為高於2.5 ng/ml之前述裂解物；及/或 -IGF，其濃度高於20 ng/ml之前述裂解物，更佳為高於50 ng/ml之前述裂解物，更佳為高於100 ng/ml 之前述裂解物。本發明之又一目的是藉由本發明之方法得出之含有病毒去活化之生長因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，或是本發明之含有病毒去活化且 PDGF及VEGF耗盡之生長因子的血小板裂解物之用途，；其係用於促進骨骼再生或重建，或用於治療骨折骨。本發明之再一目的是藉由本發明之方法得出之含有病毒去活化之生長因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的用途，或是本發明之含有病毒去活化之生長因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物之用途；其係用於試管内（M v/iro )或活體外（ex Wvo )之細胞培養；較佳為用於促進幹細胞增殖及/或分化。在較佳實施態樣中，本發明之含有生長因子之血小板裂解物係用於促進幹細胞分化為成骨細胞系及/或軟骨細胞。【實施方式】本發明之一目的是一種製備含有病毒去活化之生長因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物的方法，其包含下列步驟：使起始血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑接觸；使前述起始血小板濃厚液與前述溶劑及/或清潔劑共同培養一段至少5分鐘至6小時的時間，其pH值係維持在從約6.0至約9.0的範圍内，且其溫度係在從 2°C至50°C的範圍内；藉由油萃取來移除前述溶劑及/ 201207113 或清潔劑，以得出一水性蛋白相；以及將前述水性蛋白相與活性碳共同培養，或藉由將經溶劑及/或清潔劑處理之血小板濃厚液單與活性碳共同培養來移除溶劑及/或清潔劑。本發明使用了「病毒去活化之」的用語，其係指實質上不帶有感染性病毒的含有生長因子之血小板裂解物，特別是脂質套膜病毒，例如人類免疫不全病毒 (HIV)、B型肝炎病毒（HBV)、C型肝炎病毒（HCV)、西尼羅病毒（WNV )、TT病毒、登革熱病毒、巨細胞病毒（CMV )、Epstein Barr病毒（EBV )、人類疮療病毒-8 (HHV-8)、猿猴泡沫病毒、嚴重急性呼吸道症候群病毒 (SARS冠狀病毒）、H1NI及其他流感病毒；以及其他脂質套膜病毒，例如反轉錄病毒、肝炎病毒、巨細胞病毒、乳酸脫氫酶病毒、疱疹群病毒（Herpes group virus )、棒狀病毒（rhabdovirus)、白血病病毒（leukovirus)、黏液病毒、α病毒、蟲媒病毒（arbovirus )、副黏液病毒、沙狀病毒（arenavirus )及冠狀病毒。「實質上不帶有」係指血小板生長因子製備物之病毒去活化程度至少大於4 log!〇，這是強力病毒減毒步驟所定出的標準（由歐洲醫藥產物評量機構（European Agency for the Evaluation of Medicinal Products，EMEA)的專利醫藥產物委員會 (Committee for proprietary medicinal products，CPMP)在病毒批核研究基準（Note for guidance on virus validation studies)定出，參考文獻 CPMP/BWP/268/95)，且更佳為大於5 logi〇或更進一步大於6 log1() ’因此，它不大可能會在輸血給患者時造成脂質套膜病毒的血源性感染本發明使用了「PDGF及VEGF耗盡」一詞，其係指該含有生長因子之血小板裂解物實質上不含PDGF (platelet derived growth factor)及 VEGF ( vascular s 12 201207113 endothelial growth factor)。在一特別實施態樣中，本發明之含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物中的PDGF-AB濃度係低於1〇 ng/ml裂解物’較佳為低於5 ng/ml裂解物，更佳為低於 3 ng/ml裂解物。在一特別實施態樣中，本發明之含有病毒去活化之 ' 生長因子的血小板裂解物中的VEGF濃度係低於0.1 ng/ml裂解物’較佳為低於〇.〇1 ng/ml裂解物。本發明亦使用了「經活化之活性碳」、「經活化之碳」或「活性碳」一詞’其係指一經處理而非常多孔之形式的碳。因此，經活化之活性碳具有非常大的表面積，能提供非常重要的吸收能力。經活化之活性碳一般係製自碳源材料’如堅果殼、泥炭（peat )、木頭、椰棕（coir )、褐煤（lignite )、煤（coal)及石油遞青（petr〇ieum phch)。其可用多種方法得出，包含物理性再活化（使用氣體來使前趨物轉變為經活化之活性碳）及化學性活化（在碳化作用前將特定化學物質注入原始材料，例如酸、強鹼或鹽）。經活化之活性碳可以整塊使用，或包在市售濾筒中使用。在較佳實施態樣中，在本發明中使用的經活化之活性碳係由蒸氣及/或化學處理得出的經活化之活性碳粉末。活性碳之孔隙度可為微孔（孔徑範圍<l〇nm)、中孔 (孔徑範圍l〇-25nm)或大孔（孔徑範圍>25nm)、或其組合。來源與處理方式的不同可能會影響最後所得的孔隙度。在較佳實施態樣中’經活化之活性碳的等級及/或孔隙度要能夠留置溶劑、清潔劑、PDGF及VEGF。適用於本發明之方法的經活化之活性碳可能來自多個供應商，如已預先包裝的活性碳濾筒、3M/CUN0 (CUN0的 201207113 /舌=之活性碳）及pall (經活化之活性碳Ακ$ )。當使用3M/CUNO的經活化之活性碳時，較佳為使用，(孔隙度）等級5的經活化之活性碳。進一步言之， ^隙度為5的3M/CUNO等級5經活化之活性碳^移除 =劑、清潔劑、PDGF及VEGF的效果方面要比孔隙度 ‘、、2、3及4的來得好。同樣地’當使用Pall的經活化性碳時，AKS等級6會比AKS 7和4來得好，因為匕提供了較好的溶劑、.清潔劑、pDGF及VEGF移除效果。在較佳實施態樣中’在本發明之方法中使用的經活化之活性碳可吸收在從100 g/m2至550 g/m2範圍内的曱基藍’在—實施態樣中，可吸收在300 g/m2至500 g/m2，或巧另—實施態樣中，可吸收100 g/m2至300 g/m2 (曱基k近來係用作測量經活化之活性碳的吸收能力的標 ^物質）。亦可依照待處理之流體的黏度來選擇活性碳；較佳為針對低黏度流體（如黏度低於20 cp)設計的活性碳。一種可使用的特殊活性碳為CUNO R55，其中第一個5是指過遽精度（fiitrati〇n rating，與黏度有關），第一個5則是指碳的等級。「清除溶劑及/或清潔劑」的說法係指含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物中的溶劑及/或清潔劑量極低，且較佳為無法偵測。確實，所屬領域具有通常知識者已知溶劑及/或清潔劑濃度升高與長期毒性是有直接連結的，且特別是與神經性病症的發生有直接連結 (如揭示於：J.P.R. Pelletier，S. Transue，E丄· Snyder. Pathogen inactivation techniques. Best Practice & Research Clinical Haematology Vol. 19, No. 1, pp. 205-242,2006)。因此，溶劑量「極低」的說法係指在本發明中的溶 201207113 劑量小於：Γ二較)圭為小於5 0 PPm，更佳為小於20 ppm，又更佳為小於10 PPm、小於5 ppm，且再更佳為小於 1 pPm 〇 ’’’ 進一步來說，清潔劑量「極低」的說明中的清潔劑量小於500 ppm，較佳為小於= 曰在= 更佳為小於刚PPm，又更佳為小於5〇ppm，且=倍為小於10 PPm。本發明或藉由本赉明之方法所得的令古主化之生長因子的血小板裂解物至少包含下列二=性生長因子：轉形生長因子（TGF-β)超級家族，含TGF-βΙ及/或TGF-P2，胰島素樣生長因子Gp ). 表皮生長因子（EGF)。在較佳實施態樣中，本發人有生長因裂解物進一步包含鹼性“母二胞生長因子（bFGF)。在/特別實施態樣中，本發明之含有病毒去活化生長因子的血小板裂解物中的TGF-(M濃度係至少盥始血小板濃厚液中者類似，較佳為高於50 ng/ml穸角Λ 物，較佳為高於l〇〇ng/ml裂解物，較佳為高於15〇η^/^ 裂解物，較佳為高於200 ng/ml裂解物，較佳為高於25〇 ng/ml裂解物。。在/特別實施態樣中，本發明之含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物中的IGF濃度係至少與起始血小板濃厚液中者類似，且較佳為局於20 ng/ml裂解物，較佳為高於50 ng/ml裂解物’較佳為高於1〇〇 ^g/ml裂解物。在一特別貫施態樣中，本發明之含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物中的EGF濃度係高於〇5 ng/ml裂解物’較佳為高於1 ng/ml裂解物，較佳為高於 1.5 ng/ml裂解物，較佳為高於2 ng/ml裂解物，且較佳為高於2.5 ng/ml裂解物。 15 201207113 π在一特別實施態樣中，本發明或藉由本發明之方法所得的含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物不會引起血液細胞相關之輸血反應。「血液細胞相關之輸血反應」係指這種含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物不π有完整的活細胞（例如紅血球、血小板及白血农）故了避免在患者身上引起一定範圍之已知輸血反應0括免疫（如異體免疫(Alloimmunization))及溶血丨生併啦症（如參見 Stroncek et Rebulla, “Platelet tranSfuS1〇ns，The Lancet，August 4, 2007; v〇l. 370 : ^確貫，免疫能力正常的受贈者通常會對捐贈屑#選自·特異抗原的床結果。最普遍的相關抗 ί =種類:⑴第-型HLA ’係血小板及白血球 -'ΗΡΛ)；生長二传=之含有病毒去活化之從而=是避免受血者可能會=血血反凝/的抗體’ 之生’本發明之含有:毒去活化厚液製得===之i小板濃胞方法中，活的减細溶胞，從而減少（且更佳m會i容劑-清潔劍摧毀/ 及完整血液細胞的風險。故本露於外來抗原到的血小板(用來治療患者本身)、：== 201207113 小板來製備含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物。在另一實施態樣中，藉由本發明之方法所得的含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物進一步包含免疫球蛋白，如IgG、IgM及/或IgA。在一特別實施態樣中，本發明之含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物中免疫球蛋白IgG的濃度較佳為高於5 g/L裂解物，且更佳為約8 g/L裂解物。在另一實施態樣中，藉由本發明之方法得出之含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物可進一步額外進行純化步驟，例如離子交換層析，以移除免疫球蛋白，例如IgG、IgM及/或IgA。在另一實施態樣中，本發明或藉由本發明之方法得出之含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物係包含白蛋白、纖維蛋白原及凝血酶原當中至少一種。在一特別實施態樣中，本發明之含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物中的白蛋白濃度較佳為高於 3 0 g/L裂解物。在另一實施態樣中，本發明或藉由本發明之方法所得的含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物進一步包含αΐ-抗胰蛋白酶（al-antitrypsin )、α2-抗胞漿素 (a2-antiplasmin )、α2-巨球蛋白（a2-macroglobulin )、轉鐵蛋白（transferrin)、纖維黏連蛋白（fibronectin)及 C1-INH。在一較佳實施態樣中，血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑於本發明之方法進行培養的時間範圍為從2至4小時，其係於生理pH值下進行，如在從pH 7.0至pH 7.5 範圍内之pH值（當起始血小板為新鮮的血小板時）、或在從pH 6.8至8.2範圍内之pH值（當起始血小板為過期及/或冷凍血小板時）進行。有利的是，培養溫度為約 17 201207113 310C。在本發明之方法中所使用的合適溶劑為二-或三烷基磷酸酯類，如三-(η-丁基)磷酸酯、三-(t-丁基)磷酸酯、三-(η-己基)磷酸酯、三-(2_乙基己基)磷酸酯、三-(η-癸基) 磷酸酯、二-(η-丁基)磷酸酯、二-(t-丁基)磷酸酯、二-(η-己基)磷酸酯、二-(2-乙基己基)磷酸酯、二-(η-癸基)磷酸酯及具有不同烷基鏈之二烷基磷酸酯類。可使用具有不同烷基鏈之二或三烷基磷酸酯類，例如二-(η-丁基)磷酸乙酯。特佳的三烷基磷酸酯為三-(η- 丁基）磷酸酯 (ΤηΒΡ)。在本發明之方法中所使用的合適清潔劑包括脂肪酸之聚氧乙烯衍生物、山梨糖醇酐之偏酯類（partial esters )(例如品名為「Tween 80」（也稱為「聚山梨醇酉旨80 (polysorbate 80)」）、「Tween 20」之市售產品）及非離子性清潔劑（如以下列品名販售的氧乙基化之烷基 g分：「Triton X-100」或「Triton X-45」）。進一步考慮的清潔劑是去氧膽酸鈉及磺基甜菜鹼類，如N-十二基 -N，N-二曱基-2-銨-1-乙烷磺酸鹽（]^-(1〇(16〇乂1-：^，：^-dimethyl-2-ammonio-l-ethane sulphonate )。特佳清潔劑為「Triton X-45」、「Triton X-100」、「Tween 80」及「Tween 20 j ° 在本發明之特別實施態樣中，起始血小板濃厚液係與溶劑及清潔劑共同培養，較佳為與ΤηΒΡ及Triton X-45共同培養。有利的是，前述溶劑或前述清潔劑之最終濃度、或前述溶劑及前述清潔劑的個別最終濃度係包含於從0.2 至5體積％之範圍内，較佳為包含於從0.2至2體積％之範圍内，其係以前述企小板濃厚液之體積為基礎計算。在一較佳實施態樣中，前述起始血小板濃厚液係與 2% ΤηΒΡ共同培養。在另一較佳實施態樣中，前述起始

18 201207113 血小板濃厚液係與1% ΤηΒΡ及1% Triton X-45共同培養。 σ —前述溶劑及/或清潔劑可藉由以醫藥等級油進行油萃取及活性碳萃取、或僅藉由活性碳萃取而從生物性济體中萃出，如此則留存之裂解物中的溶劑及/或清潔劑= 被耗盡。 ^前述醫藥等級油可以是天然油（例如從植物或動物萃取出來的油）或結構類似的合成化合物。合適的天然油包括蓖麻油（castor 〇U，或稱ricinus 、大豆油'、、'、葵花油、棉籽油。較佳之合成化合物為合成性三酸甘油醋。合適的合成性三酸甘油酯範例包括三油精 (triolein )、三硬脂精（tristearin )、三棕櫚 k (tripalmitin )、三肉苴惹精（trimyristin )、及其組合。醫藥等級油的量為可萃取至少80%脂溶性製程化學物質（process chemical)的量，所用油量為從2至2〇重量％，其係以血小板濃厚液的重量為基礎計算；較佳為從5至15重量％，且更佳為從5至10重量％。活性破萃取可用前文所述的經活化之活性碳來進行，前述活性碳可吸收並留置溶劑及/或清潔劑粒子。活性碳萃取可分批進行（即將活性碳與油萃取後回收之水性蛋白相混合）或在管柱中進行（使水性蛋白相通過前置沉搬活性破(Preably sedimented charcoal)) ’或者透過預先填充的市售筒匣來進行。在較佳實施態樣中，活性碳萃取係分批進行。在較佳實施態樣中’當在與經活化之活性碳共同培養之前進行油萃取時，用以進行活性碳萃取的經活化之活性碳用量為從50至250 g/Ι水性蛋白相’較佳為從55 至2〇〇 g/Ι水性蛋白相，或從60至150 g/Ι水性蛋白柄，或從65至1〇0 g/丨水性蛋白相。在一更佳實施態樣中，用以進行活性碳萃取的經活化之活性碳用量為75 g/i水 19 201207113 性蛋白相，其中水性蛋白相係在油萃取後回收得出。 _在另一較佳實施態樣中，當在與經活化之活性碳共同培養之前不進行油萃取時，用以進行活性碳萃取的經 f化之活性碳用量為從250至1250 g/l經溶劑及/或清潔，處理之血小板濃厚液’較佳為從275至1000 g/i經溶或清潔劑處理之血小板濃厚液，或從300至750 g/1 、··二’谷劑及/或清潔劑處理之血小板濃厚液，或從至 50〇 g/i經溶劑及/或清潔劑處理之血小板濃厚液。在—較佳實施態樣+，在油萃取及活性碳萃取後、 =僅進行活性碳萃取後的溶劑量為小於100 ppm，較佳為小於50 ppm ’更佳為小於2〇 ppm，又更佳為小於1〇 PPm小於5 ppm ’且再更佳為小於1 ppm。在—較佳實施態樣中，在油萃取及活性碳萃取後、 ^ .堇進行活性ί反萃取後的清潔劑量為小於5〇〇卯爪，較為小於250 ppm ’更佳為小於1〇〇 ppm，更佳為小於 Uppm ’且再更佳為小於lOppm。在一較佳實施態樣中，本發明之方法可在油萃取 ^:$在與活性碳共同培養後進一步包含至少一離心步行。，佳者’該離心步驟係在油萃取及活性碳萃取後進或在單獨施行活性碳萃取後進行，以移除細胞碎 1Q。有利的是’前述離心步驟係於800至20000xg進行至3〇分鐘’且較佳為於1〇〇〇〇xg進行15分鐘。在，佳實施態樣中’本發明之方法亦可進一步包含太Ϊ 一額外步驟’其係選自層析純化及/或超濾、及/或不米過濾、及/或無菌過濾。在油及活性碳萃取、或活性碳萃取後接著可以進行曰析純化。較佳者，係將活性碳與在油萃取後回收之水性蛋白相j混合物、或活性碳與經溶劑及/或清潔劑處理之血]板/辰厚液的混合物於培養後進行離心，收集上清液並將之加入層析支持物，以流析出混合物的成分，或

S 20 201207113 移除某些成分。其曾可ΐΐί適層析管柱包含反相（疏水性交互反庫）基質、或蛋白吸附基質如離子二尺寸排除（s—i 巧定化肝素）基質、或血小板裂解物中所包含的i i因在子二 ί析二物層 1;條步自Γ適“提緩衝液洗提出

目標生長因子之穩定性及生=化二;J =中性的ρΗ值，如此則=免=;2 It充真，月洗及洗提的條件係由發明所屬碩的且右常知識者依其-般常識來決定。料㈣屬賴具有通 Μ ί A 2 ΐ! Ϊ性碳萃取或單由活性碳萃取來移除 iHf 或者也可能是八型肝炎病毒(_)) 二活化丄將之移除，例如奈米過濾，且更特別是使用進行奈米猶。 ·MU).·隸之濾膜來在—特別實施態樣巾，在本㈣之方法巾用作起始材料^血小板濃厚液係單—或混合（_ed)之標準血小板=厚液，例如製備作輸血用途的血小板濃厚液。血板濃厚液亦可得自全血之血沉棕黃層分離法。一單位得自血，儿^頁層之血小板濃厚液—般係3〇至5〇爪卜得自血沉棕黃層之血小板可用作起始材料，其係單一單位或多個單一單位之混合，如在形成一治療性單位時，其係4至6個單一单位的混合（如c〇uncii 0f Europe所編輯之 Guide to the preparation，use and quality assurance of blood components - 13th edition (2007)中的揭示）。金小板濃厚液可藉由血_液分離術、細胞分離術 (cytapheresis)或血小板分離術（plateletpheresis)標準 21 201207113 程序（如參見Council of Europe所編輯之Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components，13th edition (2007)，）得出，且可藉由使用 MCS+ (Haemonetics)、Trima Accell 或 COBE Spectra (Gambro)或Amicus (Baxter)而得出。與透過血沉棕育層分離法程序所得者相較之下，血小板分離術一般會從每個捐贈者身上得到較大的體積（相當於3〇〇 mi血小板濃厚液）。在一較佳實施態樣中，本發明之方法包含一製備起始血小板濃厚液之初步步驟。有利的是，製備起始血小板濃厚液之方法包括但不限於：標準血庫程序（如血小板分離術或透過全血捐輸的血小板製備法）及重點照護程序（如那些使用血球保存劑/分離器或桌上裝置者）。在本發明之方法中，用作起始材料之血小板濃厚液可以是新鮮（即收集後少於5或7天）、過期（即收集後多於5或7天）、或過期且冷凍於_2〇。(^或以下數週的時間。社一符别貫施態樣中，在本發明之方法中用作起始材料之血小板濃厚液可進一步包含白血球及/或紅血球。故該起始血小板濃厚液可能包含數種已分化且未活化之白血球，如淋巴細胞、嗜中性之顆粒性白血球及單特定言之，嗜中性球及單核球富含内有骨髓過 (myd〇Per〇XidaSe)之顆粒，這種酶會催化氯化 Ϊ的氧化作用，而生成次氣酸（hypochlorons acid)及二，J應性氧衍生物’其中前述反應性氧衍生物係作為术又囷氧化劑，對微生物及黴菌具有毒性。 f此’、虽起始血小板濃厚液包含數種已分化且未活球時，藉由本發明之方法所得的含有病毒去活 = 子的血小板裂解物進一步包含抗微生物成刀及夕種源自白血球的生長因子。

S 22 201207113 在一較佳實施態樣中，用液中的白a球會被消滅n才枓之血小板濃厚 (leukorediiction)來谁广马措由白血球去除作用酸水解酶發生促發炎反二球中之蛋白酶及利子蛋白㈤⑽）污染的風險/去除作用也可降低普含15〇J〇至〜。。::^:::卜::系每咖3血液:包血小板/L。這個「正常血 P 150至400xl〇9個上是如此，而剩下的人身板計士（非常低或非常高）3有料上不正常的血小當中==以在-袋尸ml 板，其血小板計數相當於每袋（二f1，109個血t 個血小板。衣（早位）有多於約3x10丨丨數目係= = 數Ϊ = 义夜中血小板的化之去，，白、幾丁聚醣(chit〇san)、陶兗所製(:土以： =血膠或纖維蛋白密封劑; i 理，用於;===預= 藥、復、修“= 化之Hi fr之方法所得的含有病毒去活 Ιίΐΐ 小板裂解物特別適用於處理人類及/ 病症、及/或用於與其身體之體表部分接觸、，這 =因為它的溶劑及清潔劑都已被清除，且具有病毒安全可f含有病毒去活化之生長时的血小板裂解中加入頜外的化合物，其包含但不限於：化療劑、抗 23 201207113 生素及/或激素。本务明之另一目的是一種本二生長因子逆。告内或活體外之細胞培養的用之=二子的金小板裂解物存在於培養基中 2 積的從1 〇/〇至m〇/ rm ±J. ^ 里1恭在心養基體叉爭社b 0圍内，較佳為從2%至20%範圍内，又更佳為攸3°/。至10%範圍内。 0 明之另一目的係一種醫藥產品及/或美容產二f包含本發明或料本發明之料得出的含有病ί 去活生長因子的血小板裂解物。，毋「醫藥產物」係指血小板凝膠（plateletgei)、& , 及/或铨封劑（sealant)、人工鷹架。「美容產品」係指數種施用於人體的製劑當 :種’其係用於美化、保存或改變外表、或壬调理或保護皮膚、輕、指f H、眼睛或牙齒。本發明之另一目的是一種本發明或藉由本發明之方法得出的含有病毒去活化之生長因子的血小板裂，於細胞培養之用途，其係適用於在試管内或活體外培養纖維母細胞、軟骨細胞、成骨細胞、角質細月^ (keratinocytes )、幹細胞及 / 或移植細胞（transplants cells)。本發明之另一目的是適用於在試管内或活體外培養纖維母細胞、軟骨細胞、成骨細胞、角質細胞、幹、^ 胞及/或移植細胞的培養基，且包含本發明或藉由本發明之方法得出的含有病毒去活化之生長因子的血小^裂解物。在較佳實施態樣中，本發明含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物之用途係用於促進幹細胞之繁殖

S 24 201207113 及/或分化，特別是間質幹細胞。在較佳實施態樣中，本發明含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物之用途係用於促進幹細胞分化為成骨細胞系及/或軟骨細胞系。本發明之另一目的係為一種本發明含有病毒去活化之生長因子且PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物之用途’其係用於其係用於促進骨骼重建、骨骼再生或傷口療癒’以及美容用途。本發明之上述及其他目的、特徵及優點將因以下敘述、參考文獻及後附圖式而變得更加顯明。實施例 I-材料與方法 1-分離術血小板（apheresis platelet)的收集起始血小板濃厚液（PC)係徵得志願捐贈者同意後使用MCS+多成分系統（Haemonetics， Braintree, USA)收集而來。全血係透過使用間歇性流動（intermittent flow)之靜脈導管取得，並立即以1/9的比例用檸檬酸右旋葡萄糖溶液配方a (citrate dextrose solution Formula A)進行抗凝血

處理。藉由連續離心，使血小板與紅血球及其他血液成分分離，並懸浮於血漿中，再收集到無菌容器内。進行數個分離循環’直到所收集之PC的總體積達到在225及315 mL之間的體積範圍為止，預定的血小板產量目標係等於或大於3 〇χ1〇"。PC 係於室溫緩慢混合儲存，並在收集的24至72小時内進行處理。 2-細胞計數 25 201207113 紅血球、血小板及白血球在起始pc中的含量係使用細胞計數器（ABC Vet Automatic Blood Counter，ABX Diagnostics, France )來測定。 3-起始血小板濃厚液的處理 a-研究設計：起始血小板濃厚液係根據第一圖之研究設計來處理。簡言之，將PC ( 300 mL )移入塑膠袋，並如EP 1，685,852所述進行處理。將血漿濃厚液 (plasma concentrates)與 1% (v/v)(終濃度）三正丁基填酸醋（TnBP)( Merck KGaA, Darmstadt, Germany)及 1% (v/v)(終濃度）Triton X-45 (Sigma，Missouri，USA)之組合於室溫（RT) 恆定溫和攪拌（70 rpm ) ( FINEPCR, Seoul, Korea)的條件下共同培養1小時。之後加入10% (v/v)(終濃度）大豆油（Sigma， Missouri，USA)，先劇烈混合30秒，之後與經 S/D 處理之 PC ( S/D-PC )於室溫（RT )在 70rpm 混合15分鐘。之後將該油/S/D-PC混合物倒出45分鐘，以分離出清澈的油相（頂部）、濁相（turbid phase ) (中間）及一清澈的水性蛋白相（底部）。藉由重力從袋子底部回收水性蛋白相（約 270 mL)回收，並於 20-25oC 在 6000xg 離心 10 分鐘使之澄清，並使細胞碎片或不溶材料沉澱成團塊狀。在離心後，回收上清液（S/D-PC-0，約265 mL)並於RT在70 rpm與回收19.9 g經活化之活性碳（3M，St. Paul，MN, USA)混合 30 分鐘，

S 26 201207113 其對應比例為1.5g/20mL之S/D-PC-O。之後將混合物離心（ 6000xg，10分鐘，RT)而使活性碳沉澱成團塊狀，並回收澄清的上清液 (S/D-PC-0C )。使樣本經此方法處理並於_8〇〇c 冷康’直到要進行分析為止。所呈現的數據係為四次或五次重複的平均圖形。 4- 活性碳比例的影響進行小規模預先實驗，決定要用來移除ΤηΒΡ 及Triton Χ-45之活性碳的最適量，並評估它對gf 及蛋白含量的影響。使用旋轉混合器將用量遞增的

活性碳（1.5 至 4 g)與 S/D-PC-0 (20 mL)於 RT 在70 rpm混合30分鐘。之後將混合物離心 (6000χ《，10分鐘，RT)，使活性碳沉殿成團塊狀並回收澄清的上清液，再將之於-30°C冷;東，直到進行評估為止。 5- 生長因子測定在程序的各個步驟中取出1-rnl樣本。將之於 lOOOOxg 離心 15 分鐘（Microfuge® 22R，Beckman

Coulter，Fullerton, CA) ’使血小板及/或細胞碎片沉澱成團塊狀，並得出無細胞之上清液來進行血小板源生長因子之測量。之後上清液立即於_8〇°C冷康。樣本於37°C解;東’並在1小時内以敏感且具專一性的市售免疫測定法進行分析。標準品及樣本係進行二重複測定，並計算平均值。結果乘以樣本所用的稀釋係數。 PDGF-AB、TGF-βΙ、EGF、VEGF 及 IGF-1 係特別使用 Quantikine 套組（R&D Systems; Minneapolis, MN )來進行ELISA測定而進行量測。 27 201207113

a-PDGF-AB 使用 Quantikine ELISA kit ( #.DHD00B, R&D SYSTEMs，Minneapolis，MN )來測定 PDGF-AB。樣本以 Calibrator 稀釋劑（RD6-11) 稀釋100倍。將孔盤培養2小時、清洗、並和與酶共輛結合之PDGF-AB抗體於室溫再共同培養 3小時。使用清洗緩衝液（Wash Buffer )來清洗盤孑L，之後於室溫加入受質溶液（Substrate Solution) 20-30分鐘。盤孔係避光保護。在各盤孔中加入停止溶液（Stop Solution )，並使用微滴定盤讀取儀來測定450 nm之吸光值。最小可债測的劑量為1.7 pg/ml。 b--TGF-βΙ 使用 Quantikine ELISA kit (DB100B，R&D SYSTEMS)來測定 TGF-βΙ。樣本以 Calibrator 稀釋劑（RD5-26)稀釋100倍。在塗覆有TGF-β-受器II之96孔微滴定盤中製備體積為1〇〇-μ1的 TGF-βΙ標準品（890207)稀釋序列。在TGF-βΙ 分析之前，進行酸活化及中和反應，以將潛性 TGF-βΙ活化到免疫活性形成狀態。為達此目的，將0.5 ml樣本與0.1 ml之in HC1混合，於室溫培養10分鐘，加入0.1 ml之1.2N NaOH/ 0.5M HEPES (N-[2-羥基乙基]哌畊-ΝΟ-[2·乙烷石黃酸])(Sigma ’ Η-7523 )加以中和，再行離心。之後測定上清液部分之總TGF-βΙ含量。將各等分（50 μΐ)以二重複的方式加到微滴定盤中，之後蓋上蓋子，於室溫培養2小時。之後清洗盤孔，加入與酶共軛結合之TGF-βΙ多株抗體，並 28 201207113 於室溫持續培養1.5小時。如前述完成測量。 TGF-βΙ之偵測限值為4.61 pg/ml。

c-EGF 使用 Quantikine ELISA kit ( #.DEG00，R&D SYSTEMs，Minneapolis，MN)來測定 EGF。樣本以Calibrator稀釋劑（RD6N)稀釋20倍。將200 μΐ之標準品、對照品或樣本加入盤孔中。將孔盤於室溫培養2小時。各盤孔經過抽吸，並填入清洗緩衝液來加以清洗。在各盤孔中加入EGF共輛結合物，並於室溫培養2小時。使用清洗緩衝液清洗盤孔，並在各盤孔中加入受質溶液（200 μΐ)。混合物於室溫避光培養20分鐘。在各盤孔中加入停止溶液（50 μΐ)。各盤孔之光學密度係使用微孔盤讀取儀（VersaMax ™ microplate reader, Molecular Devices, USA)在 30 分鐘内於 450 nm進行測定。最小可偵測的劑量為0.7 pg/ml °

d- VEGF 使用 Quantikine ELISA kit (# DVE00，R&D Systems，Minneapolis，MN)來定量 VEGF。樣本以Calibrator稀釋劑（RD6U)稀釋2倍。如製造商所說，其最小可偵測的劑量範圍為小於9.0 pg/m卜且平均MDD為50ng/m卜在各盤孔中加入10〇μ1之測定稀釋劑（RD1W)，接著是100μ1 之標準品（VEGF標準品）。以黏膠條覆蓋孔盤，並於室溫培養2小時。將盤孔清洗3次，之後和與酶共軛結合之VEGF於室溫共同培養2小時。 e-IGF-1 29 使用 Quantikine ELISA kit (DG100，得自 R&D SYSTEMS)來定量 IGF_1。樣本以 Calibrator 稀釋劑（RD5-22)稀釋100倍。如製造商所說，其最小可偵測的劑量範圍為從0.007至0.056 ng/m卜且平均MDD為0.026 ng/ml。在各盤孔中加入150 μΐ之測定稀釋劑（RD1-53)，接著是 50 μΐ之標準品（ 890775)。以黏膠條覆蓋孔盤，並於2-8°C培養2小時。將盤孔清洗3次，之後和與酶共輛結合之IGF-1於2-8。〇：共同培養1小時。如前述完成測量。 6- P-選擇素測定使用 Quantikine kits ( R&D Systems )而以 ELISA測定法來測量P-選擇素。 7- 蛋白及脂質測定在油萃取後及在活性碳吸收後，用RocheP800 分析儀來測定總蛋白、白蛋白、總膽固醇及三酸甘油酯（triglycerides ’ TG)在起始 PC 中的量。IgG、 IgM 及 IgA 係在 Cobas Integra 800 ( Roche COB AS INTEGRA 800，RocheDiagnostics, Mannheim, Germany )使用全自動乳膠增強免疫比濁測定法 (fully automatic latex-enhanced immunoturbidimetric assay )來測量。 . 8- 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醢胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE ) 808-?八0£係使用4-12%梯度凝膠、反應試劑及 Invitrogen 電泳系統（Invitrogen Corporation,

Carlsbad, California, USA)在未還原與還原的條件下進行。使用 Novex® Sharp Pre-Stained Protein Molecular Weight Standard (Invitrogen)來估算分子量。 9- TnBP 及 TritonX-45 測定如先前所述進行樣本的萃取，以測定殘餘的 TnBP 及 Triton X-45 (19)。以氣相層析（GC-17A， SHIMADZU, Tokyo, Japan )及火談离隹子化偵測 (flame ionization detection)來進行 TnBP 定量，另使用 LiChrospher 100 RP-18 管柱（ID : 4mm，長度：250mm，P/N ·· 724964，Merck KGaA，

Darmstadt, Germany ) 以高效液相層析 (SHIMADZU)來進行 TritonX-45 定量。 10- 細胞培養 S/D-PC-OC在試管内刺激細胞生長及取代FBS 的能力係使用下列細胞株來進行評估：（a)人類成骨細胞MG63 ( ATCC CRL 1427，購自台灣新竹生物資源保存及研究中心，BCRC ) 及 (b)StatensSeruminstitute 兔角膜上皮細胞（rabbit corneal epithelial cells，SIRC) ( ATCC CCL-60，購自BCRC)。這些細胞株係維持在37°C且含有5% C02的控制環境中。它們係以每孔2xl03個細胞的密度在平底 96 孔盤（Greiner bio-one, Tokyo, Japan ) 中使用最低必需培養基（minimum Essential medium，MEM) (Gibco, Invitrogen)進行培養，前述培養基含有2.2g之NaHC03、O.lmM非必須胺基酸、ImM 丙嗣酸鈉（sodium pyruvate )、2mM 之L-麩酿胺酸（L-glutamine)、100 U/mL青黴素及 201207113 100 pg/mL 鏈黴素，且添加了 1〇〇/0 (v/v) FBS( Gibco, Invitrogen)。在實驗中，一開始係使細胞貼附18 小時’之後在測試不同的GF添加物之前，於無血清培養基中使細胞處於饑餓狀態6小時。用無血清培養基清洗兩次後，將細胞在添加了不同濃度（1 至10%)之S/D-PC-OC的培養基（分別對應於 TGF-β終濃度在0.31及3.1 ng/ml之間的範圍）培養高達5天的時間。每輪實驗都以不添加任何蛋白 /GF添加物或添加了 i〇%FBS之細胞培養物來作為對照組。 11- MTS測試在培養五天時，使用MTS四唑鏽[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-(3-羧基曱氧基苯基）-2-(4-磺苯基）-2H-四0坐鏽，[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium )之内鹽（inner ) ( Promega Corporation,

Madison，Wisconsin, USA )依照製造商的指示來測定目視在增生的細胞。這項測定使用了 MTS溶液及電子耗合试劑PMS (吩0秦硫酸曱醋（phenazine methosulfate) )。MTS 會被細胞生物還原 (bioreduced )為不溶於組織培養基的產物曱月皆 (formazan )。具代謝活性之細胞當中的去氫酶會將MTS轉換為曱腊。從96孔測定盤測量曱服於 490nm的吸光值，其與培養物中存活細胞的數目有直接的比例關係。製備後，將溶液保持在_2〇°C的避光保護管中。將MTS及PMS偵測試劑以20 : 1 (MTS: PMS )比例混合後，立刻以1: 5( MTS+PMS/ 培養基）的比例加入細胞培養物中。 12- 統計分析

S 32 201207113 數據係以平均值±標準差（SD)來表示。並以雙尾配對學生檢定（two- tailed paired Student test) 來進行統計上的比較。p值小於0.05係用來估算平均測試參數之明顯差異（the significance of the differences)。當p值<〇·〇5時，則認為有明顯差異。 II-結果 1- 細胞計數起始PC平均含有1216±188.6x106個血小板/ml (範圍：896-1388xl〇6個/ml)。白jk球及紅血球之平均計數分別為0.32±0.10 (範圍：0.20-0.4) xlO6 個/ml 及 0·04±0.01 (範圍·· 0.02-0.06) xlO9個/m卜之後進行S/D處理的所有流析物中都偵測不到血球細胞。 2- 活性碳之最適比例測定預先實驗顯示活性碳處理在所測試之各個比例都會移除S/D試劑，但也會大幅降低PDGF-AB 及VEGF的含量。因此進行下列測試：將用量漸增的活性碳（1.5、3、3.5 或 4 g)與 20 mL 之 S/D-PC-0 混合。在所有進行評估的比例中，殘餘的ΤηΒΡ均 <2 ppm，而殘餘的TritonX-45則分別為9、3、2 及1.5 ppm。第二圖顯示S/D-PC-0流析物之活性碳處理對於 PDGF-AB、TGF-βΙ、EGF、VEGF 及 IGF-1含量的典型影響。TGF-β卜EGF及IGF-1之 '濃度保持基本不變，而在所有進行評估的比例中， PDGF-AB及VEGF含量都大幅降低。每20 mL之 S/D-PC-0對1.5 g之活性碳的比例可讓ΤηΒΡ及 TritonX-45的量降低至少於1〇 ppm，故在後續實驗中使用該比例。 33 201207113 3 -多種流析物之組成使用19.9g之活性碳對265 mL之P/D-PC-0萃取物（對應選擇率為1.5g/20mL)進行活性碳處理，其對GF、p-選擇素、蛋白、膽固醇及TG含量的影響係如表1所示（4次實驗的平均值）。在油萃取及活性碳吸收後，TGF-βΙ ' IGF及EGF濃度保持基本恆定（分別為約368、55及2.4ng/mL)。在S/D-PC-OC中的GF平均整體回收量相對於在 S/D-PC-0中所偵測到的含量分別為：TGF-βΙ為 81.5%，EGF 為 94%，而 IGF 為 83.8%。相對而言， PDGF及VEGF的平均濃度在活性碳處理當中顯著降低（ρ<〇.〇1)(分別為約 2_31 ng/mL 及 <0.009 ng/mL )，確認了在小規模實驗中的觀察。p-選擇素含量不會受活性碳處理的影響太多，只有輕微的降低。白蛋白、IgG、IgA、IgM的平均濃度保持基本不變，但可觀察到纖維蛋白原含量有顯著的小幅降低（p<0.05)。膽固醇及TG平均含量保持穩定。 ΤηΒΡ平均量會從約738 ppm降至8.7 ppm，而 TritonX-45 貝1J 會從 2628 ppm 降至 8.8 ppm (ρ<0·001 )。

34 201207113 表1。經S/D處理之血小板濃厚液在油萃取後的組成物 (S/D-PC-0)及其在活性碳處理後的組成物（S/D-PC-OC) (N=4) 參數 S/D-PC-0 S/D-PC-OC 生長因子，ng/mL PDGF-AB 59.9±2.9 2.3±0.52** TGF-β 1 452.0±17.69 368.4+24.6 EGF 2.56±0.1 2·41±0.1 IGF 64.5+1.1 54.7±4.1 VEGF 0.21±0.03 < 0.009 P-選擇素 273.9+5.0 262.5±4.3* 蛋白，mg/Ml 總蛋白 60.3+0.5 60.010.08 白蛋白 38.7±0.38 40.0±0.08 IgG 8.2±0·4 8·5±0.04 IgM 0.79±0.05 0.87±0.02 IgA 1.49±0.11 1.67+0.1 纖維蛋白原 4.5±0.3 2·65±0.7 脂質成分，mg/mL 膽固醇 15.0±2.0 15.75+2.6 TG 20.7±3.5 20·7±3.3 S/D試劑，卯m ΤηΒΡ 738.3±226.4 8.7+3.5*** Triton Χ-45 2628+75 8.8±1.3*** *p<0.05 ； **p<0.01 ； ***p< 0.001 35 201207113

4- SDS-PAGE 在未還原（第三圖A)及還原（第三圖B)條件下進行的SDS-PAGE分析中，起始PC (1)、 S/D-PC-0 (2)及S/D-PC-OC (3)之蛋白濃度圖形 (profile )並未顯示出可偵測的變化，其係以對應於未還原之纖維蛋白原（a)、未還原之IgG(b)及白蛋白（c)之分子量的主要蛋白條帶（band)來加以證明。 5- 細胞培養 MTS測試結果（N=3)係如第四圖A (MG63)及第四圖B ( SIRC)所示。兩個細胞株在添加了 10% (v/v) FBS的培養基中進行培養時，細胞生長率較高（a)，但在未添加FBS之對照組中則顯著降低 (p<0.05) (b)。而當這兩個細胞株所用的培養基添加了 1至10%的S/D-PC-OC，細胞生長率也顯著高於（p<0.05)對照組。在有1% S/D-PC-0C存在的情況下，MG63細胞的MTS值少於在有10%FBS 存在的情況下所得之值，但其濃度介於3及10%之間的情況下所得之值則是相似的。SIRC細胞在有 1% S/D-PC-0C及10%FBS存在的情況下所得之生長率並無顯著不同，但當S/D-PC-0C用量從3%漸增至10%，其值顯著較高（p<〇.〇5)。當這兩個細胞株生長在有10% FBS或MO% S/D-PC-0C存在的情況下，其細胞形態都是正常的。【圖式簡單說明】第一圖：富含TGF-βΙ且PDGF-AB及VEGF耗盡之生長因子混合物的製備方法。第二圖：S/D-PC-0 ⑻及每 20 mL 之 S/D-PC-0 (即在油萃取後回收的水性蛋白相）以1.5 g (b)、3 g (c)、

S 36 201207113

5 g (d)及4 g (e)經活化之活性碳處理後的pDGF_AB (A) 、VEGF (B)、EGF (c)、IGF_! (D)及 TGF p i (e)含量。第二圖：在未還原（A)及還原（B)條件下對血小板流所進行的SDS-PAGE分析，包括起始PC(第“亍）、 "二溶劑-清潔劑處理及一次油萃取後（S/D-PC-0 ;第2 • 行）、經活性碳吸收後（S/D-PC-OC ;第3行）。Novex ' 鮮明預染蛋白標記（Μ)。a :纖維蛋白原；b : IgG ; c : 白蛋白；d :纖維蛋白原次單元；e : igG重鏈；f : lgG 輕鍵。

第四圖；在添加10% (v/v) FBS (a)與未添加FBS (b)、以及添加了 1% (c)、3% (d)、5% (e)及 10% (f)之 S/D-PC-OC的MEM培養基中培養之MG63 (A)及SIRC (B) 細胞株的MTS細胞增殖數據。培養5天後測定細胞存活率。【主要元件符號說明】益 37

Claims

201207113 七、申請專利範圍： 1· 一種含有病毒去活化之生長因子且PDGf及VEgf耗盡的血小板裂解物。 2. 如申請專利範圍第1項所述之含有病毒去活化之生長因子的血·小板裂解物’其包含生長因子TGF-β、IGF 及 EGF。 3. 如申請專利範圍第1或2項所述之含有病毒去活化之生長因子的血小板裂解物，其中： -PDGF-AB在前述裂解物中之濃度為低於1〇 ng/m卜更佳為低於5 ng/m卜更佳為低於3 ng/ml ; 及/或 -VEGF在削述裂解物中之濃度為低於ο] ng/ml，更佳為低於0·01 ng/ml ;及/或 -TGF-β在前述裂解物中之濃度為高於5〇ng/m卜更佳為高於100 ng/rrd ’更佳為高於15〇 ng/m卜更佳為高於200 ng/m卜更佳為高於250 ng/ml ;及/或 'EGF在前述裂解物中之濃度為高於0.5 ng/ml，更佳為高於1 ng/m卜更佳為高於丨5 ng/m卜更佳為高於2ng/m卜更佳為高於2 5 ng/mi ;及/或 _ IGF在前述裂解物中之濃度為高於2〇ng/m卜更佳為高於50 ng/m卜更佳為高於100 ng/mh 4. 一種製備含有病毒去活化之生長因子且pdgf及 VEGF耗盡的血小板裂解物的方法，其包含下列步驟： a) 使起始血小板濃厚液與溶劑及/或清潔劑接觸； b) 使前述起始血小板濃厚液與前述溶劑及/或清潔劑共同培養 -一段至少5分鐘至6小時的時間， -其pH值係維持在從約6.〇至約9.〇的範圍内，且 _其溫度係在從2。(：至50。(：的範圍内； S 38 201207113 c) =萃取來選擇性移除前述溶劑及/或清潔劑，乂件出一水性蛋白相；以及 d) 將步驟b)的經溶劑及/或清潔劑處理之血 5々液主或步驟c)的水性蛋白相與活性碳共同培養。子 •專利範圍第4項所述之方法，其巾前述溶劑係 '自由一-或三-烷基磷酸酯類、具有不同烷基鏈之二旨類所組成之群組，較佳為三 6. 口巧範圍第4至5項中任-項所述之方法，1 半：嫌系選自由脂肪酸之聚氧乙烯衍生物、山 =^酐之偏_ ( partial esters )、非離子性清群i 基甜菜驗類（π1—)所“之 7. 如 Φ 枝車0 45、Triton x_100 或Tween 80。 :專利辄圍第4至6項中任—項所述之方法，並圍ί〇b^51广』:前，潔劑的個別濃度範之體積為基礎計ΐ 係别述起始血小板濃厚液 8. 圍第1至7項中任-項所述之方法，其化之病毒去活化之生長因子血小板裂解物第1至3項中任-項所述= 之ft去活化之生長因子血小板裂解物。範圍第4至8項中任一項所述之方法，其 2至油來進行’前述油之用量為從 0/甘/重里/〇、或從5至15重量％或從5至1〇重量二板濃厚液與前述溶劑及/或清潔劑之5物的重買為基礎計算。申請專利範圍第4至9項中任一項所述之方法，其 ~ 3彳:步驟。)之油萃取時，亦對步驟e)之水性蛋白相進行活性碳萃取，其中活性碳之量為前述水 39 201207113 性蛋白相的從50至25〇 g/1 ^ g/卜或從60至150的、較佳為從55至200 k -當不進行油萃取時，則對tt65至i〇0g/1;以及潔劑處理之A小板濃厚液^_ 之經溶劑及/或清活性碳之量為前述水性炭萃取’f中 g"’較佳為從275至1〇〇〇 )從25〇至125〇或從 325 至 500 g/卜 g/1、或從 300 至 750 g/l、 11·如申請專利範圍第4至10 中經活化之活性賴糾之所狀方法，其的從100至550 g/m2範圍内，車^ ^為m之活性奴或從⑽至·咖;=。車乂佳為從至500咖2 12. 如申請專利範圍第4 項中任豆油：取之後、及/或在步驟…與活刚^ 養之後進一步包含至少一離心步驟。 13. 如申請專利範圍第4至12項中任一項所述之方法，其進一步包含步驟（e):層析純化及/或超濾 (ultrafiltration)及/或奈米過濾（nan〇mtrati〇n)。 14. 如申請專利範圍第4至13項中任一項所述之方法，其在步驟a)之前進一步包含一製備起始血小板濃厚液之初步步驟’較佳係藉由血小板分離術（apheresjs )或血沉棕黃層（buffy-coat)分離法而從全血加以製備。 15.如申請專利範圍第4至14項中任一項所述之方法，其中步驟a)之起始血小板濃厚液係從混合血小板濃厚液 (pool platelet concentrates)得出。 16_ —種藉由如申請專利範圍第4至15項中任一項所述之方法得出的含有病毒去活化之生長因子且PDGF及 VEGF耗盡的血小板裂解物、或如申請專利範圍第1 至3項中任一項所述之含有病毒去活化之生長因子且 PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物之用途，其係用於美容、促進骨骼再生或重建、或治療骨折。 201207113 17. —種藉由如申請專利範圍第4至15項中任一項所述之方法得出的含有病毒去活化之生長因子且PDGF及 VEGF耗盡的血小板裂解物、或如申請專利範圍第1 至3項中任一項所述之含有病毒去活化之生長因子且 PDGF及VEGF耗盡的血小板裂解物之用途，其係用於試管内（z>2 vzYro )或活體外（ex Wvo )之細胞培養， • 較佳為用於促進幹細胞分化為成骨細胞系（osteoblast - lineage)及/或軟骨細胞。 41