TW201206462A

TW201206462A - Methods and compositions for intrathecal delivery of β -Galactocerebrosidase

Info

Publication number: TW201206462A
Application number: TW100122530A
Authority: TW
Inventors: Nazila Salamat-Miller; Katherine Taylor; Ken Manning; Gaozhong Zhu; Paul Campolieto; Zahra Shahrokh; Pericles Calias; Thomas Mccauley
Original assignee: Shire Human Genetic Therapies
Priority date: 2010-06-25
Filing date: 2011-06-27
Publication date: 2012-02-16
Also published as: US20130295071A1; US20110318324A1; EP2588132A4; EP2588132A2; WO2011163651A2; WO2011163651A3

Description

201206462 六、發明說明：本申請案主張美國臨時專利申請案第61/358,857號（2010 年6月25曰申請）、第61/360,786號（2010年7月1曰申請）、第 61/387,862號（2010年 9 月 29 曰申請）、第 61/435,710號（2011 年1月24曰申請）、第61/442,11 5號（2011年2月11曰申請）、第61/476,210號（2011年4月15日申請）及第61/495,268號 (2011年6月9曰申請）之優先權’每一案件之全文以引用方式併入本文中》【.先前技術】酵素替代療法（ERT)涉及向個體全身投與天然或以重組方式得到之蛋白質及/或酵素。經批准療法通常經靜脈内投與個體’且通常可有效治療由酵素缺陷引起之軀體症狀。由於經靜脈内投與之蛋白質及/或酵素不能充分地跨過血腦障壁（BBB) ’故經靜脈内投與之蛋白質及/或酵素至中樞神經系統（CNS)細胞及組織中之分佈很有限，因而治療具有CNS病因之疾病一直尤其具有挑戰性。血腦障壁（BBB)係由内皮細胞構成之結構系統，其藉由限制血流中之有害物質（例如細菌、大分子（例如，蛋白質）及其他親水性分子）擴散跨過BBB及擴散至下面的腦脊髓液（CSF)及中樞神經系統（CNS)中而起保護cnS遠離該等物質之功能。全身物質（不管該物質為内源的抑或外源投與的）穿透 BBB之能力取決於數個因素。該等因素包括（例如）該物質在BBB兩側之濃度、該物質之尺寸、該物質之親脂性以及 157227.doc 201206462 該物質對特定活性載體結構之親和力。已經提出以有效遞送治療劑跨過ΒΒΒ之策略包括受體介導之轉運，由此通過固有主動轉運系統使大分子主動轉運跨過ΒΒΒ *亦已將 ΒΒΒ之高滲性開放視為能夠控制ΒΒΒ以促進治療劑之遞送的技術。亦已將更多侵襲性技術（例如對流增強之治療劑遞送）視為藉由將該等治療劑直接輸注至CNS中而繞開ΒΒΒ 之方式。儘管認為具有侵襲性，但將治療劑投與脊髓周圍之腦脊髓膜内間隙中仍然為將治療劑直接投與跨過ΒΒΒ並投與下面的 CSF 中之最常見方式。（Kroin JS，Clin Phannacokinet (1992) 22(5):3 19_326.)相對於可全身投與個體之組合物醴積，適於腦脊髓膜内投與之組合物體積通常係治療具有 CNS病因之某些疾病之重大障礙。通常，對於可投與個體之治療劑總劑量的該等限制會抑制在擬定作用位點達到治療劑之最佳治療濃度的能力，因此，該等限制可使腦脊髓膜内遞送途徑對於懷疑具有（：>^病因之許多疾病而言不可行，尤其對於在受侵襲組織（例如，腦）中達到有效治療濃度需要較大劑量治療劑之疾病。製備濃縮組合物不足以抵消與腦脊髓膜内投與治療劑及在受侵襲組織中達到有效治療濃度有關之限制。製備濃縮組合物通常可造成治療劑之聚集及/或沉澱。可利用之適於CNS投與之醫藥組合物有限進一步使該限制複雜化。因此，業内仍然需要能夠使治療劑增溶且適於將該等治療劑 CNS奴與有需要之個體的穩定組合#。亦仍然需要能夠在 157227.doc 201206462 CNS細胞及組織内達到治療濃度之醫藥組合物（例如，經腦脊髓膜内投與之醫藥組合物）。【發明内容】本發明提供尤其適於將治療有效量之治療劑遞送至個體 CNS中之醫藥組合物以及與使用該等醫藥組合物有關之治療方法》由於可投與中柩神經系統（CNS)中之治療劑的注射體積有限以及該房室中獨特的流體動力學、組成及代謝’預期僅特定組合物適於直接CNS投與以避免不良事件°本發明提供適於任何治療劑之CNS遞送的調配物設計空間（formulation design space)。另外，.該調配物設計空間適於蛋白質治療劑之穩定性。在一個態樣中’本發明提供用於腦脊趙膜内投與之穩定調配物’其包含半乳糖腦苷酶（GalC)蛋白質、鹽、緩衝劑、穩定劑及聚山梨醇酯表面活性劑。在一些實施例中， GalC蛋白質係以高達約75 mg/mi之濃度存在。在一些實施 J中GalC蛋白質係以選自3 mg/mi、30 mg/ml或50 mg/ml 之農度存在。在一些實施例中，GalC蛋白質之調配物包含胺基酸序列 SEQ ID ΝΟ:1 〇在—些實施例中’該鹽係NaCl。在一些實施例中，NaCl 係以介於約75 mM至200 mM範圍内之濃度存在。在一些實施例中’ NaCl係以約15〇 mM之濃度存在。在一些實施例中，聚山梨醇酯表面活性劑選自由以下組成之群：聚山梨醇酯2〇、聚山梨醇酯4〇、聚山梨醇酯6〇、 157227.doc 201206462 聚梨醇8曰80及其組合。在一些實施例中，聚山梨醇酯表面'舌〖生劑係聚山梨醇酯20。在一些實施例中，聚山梨醇酯 2〇係以介於約0%至〇〇2%範圍内之濃度存在。在一些實施例中’聚山梨醇酯20係以約0.005%之濃度存在。在些實施例中，緩衝劑係填酸鹽。在一些實施例中，磷酸鹽係以不大於2〇 mM之濃度存在。在一些實施例中，磷酸鹽以約5 mM之濃度存在。在一些實施例中，穩定劑選自蔗糖、葡萄糖及/或PeG。在一些實施例中’穩定劑係蔗糖。在一些實施例中，蔗糖係以約1 %至3%之濃度存在。在一些實施例中，該調配物具有約5.5至7.〇之pH。在一些實施例中’該調配物具有約6.0至6.5之pH。在一些實施例中，該調配物具有約6.3之pH。在一些實施例中’本文所述穩定調配物係液體調配物。在一些實施例中’將該調配物調配成凍乾之乾燥粉末。在另一態樣中’本發明提供用於腦脊髓膜内投與之穩定調配物，其包括半乳糖腦苷酶（GalC)蛋白質、麟酸鹽（濃度為約5 mM)、NaCl(濃度為約150 mM)、蔗糖（濃度為約 1%)、聚山梨醇酯2〇(濃度為約0.005%)，且其pH為約6.3。在一些實施例中’ GalC蛋白質之濃度為約3 mg/ml。在一些實施例中’ GalC蛋白質之濃度為約30 mg/ml。在再一態樣中’本發明提供含有單一劑型之本文所述穩定調配物之容器。在一些實施例中，該容器選自安瓿或預填充注射器。在一些實施例中’該容器係預填充注射器。 157227.doc • 6 - 201206462

在一些實施例中，該容器係貯器。在一些實施例中，預填充注射器選自有烤聚矽氧塗層之硼矽酸鹽玻璃注射器、有喷塗聚矽氧之硼矽酸鹽玻璃注射器，或無聚矽氧之塑膠樹脂注射器。在一些實施例中，穩定調配物係以小於約5 〇 mL ‘ 之體積存在。在一些實施例中，穩定調配物係以小於約 - 3.0 mL之體積存在。在另一態樣中，本發明提供治療球樣細胞性腦白質營養不良（GLD)病之方法，其包括向需要治療之個體經腦脊髓膜内投與本文所述調配物之步驟。在一些實施例中，經腦脊髓膜内投與調配物不會在個體中引起實質不良效應。在一些實施例中，調配物之腦脊髓膜内投與不會在個體中引起實質適應性Τ細胞介導之免疫反應。在一些實施例中，調配物之腦脊髓膜内投與使得GalC蛋白質遞送至深層白質之少突膠質細胞中。在一些實施例中，調配物之腦脊髓膜内投與使得GLD病之至少一種症狀或特徵之強度、嚴重程度或頻率降低，或使其發作延遲》在一些實施例中，GLD病之至少一種症狀或特徵係易怒、抽搐、精神衰退、耳聾、失明、肌陣攣發作、肌肉張力過大、發育遲緩、發育技能減退、過敏、震顫、共濟失調、痙攣狀態、發作性劇吐、腦白質營養不良、大腦萎縮、產生球樣細胞及/或脫髓鞘。在再一態樣中，本發明提供用於腦脊髓膜内投與之系統’其包括輸液裝置；空心體，其具有與該流體進入裝置流體連通之第一流量孔及構造用以插入脊髓中之第二流量 157227.doc 201206462 孔，·及用於該空心體緊固插入脊髓中之緊固機構。在一些實施例中，該緊固機構包含一或多個安裝於空心體表面上之球形頭及於該一或多個球形頭上可調整之縫合環。在一些貫施例中’輸液裝置係可注射座（injectable port)。在·一些實施例中’可注射座係可植入的。在一些實施例中，輸液裝置係幫浦。【實施方式】圖式僅用於說明性目的而非限制性目的。定義下文將首先定義某些術語以便更容易地理解本發明。以下術語及其他術語之其他定義陳述於說明書通篇中。遗# :本文所用之術語「改善」意指狀況之預防、減弱或緩解、或個體狀況之改良。改善包括（但不要求）病況（例如，球樣細胞性腦白質營養不良）之完全恢復或完全預防。在一些實施例中，改善包括增加相關疾病組織中缺陷之相關蛋白質（例如，β_半乳糖腦苷酶）之含量或提高其活性程度。、/ ：本文所用之片語「生物活性」係指在生物系統中且尤其在生物體中具有活性之任一藥劑之特徵。例二與生物體時對該生物體具有生物效果之藥劑視為性。在特定實施例中’倘若蛋白質或多肽具有 -種該蛋白f或多狀中共有蛋白f或多狀之至少活性的部分通常稱作「生物活性」部八。廣/垄本文所田〜^ 「刀文所用之術語「劑型」及「單仅劑型」係指用 157227.doc 201206462 於擬治療患者之治療性蛋白f (例如，p半乳糖腦苷酶）之物理離散單位。每-單位含有經計算以產生期望治療效果之預定量之活性材料。然而，應理解，組合物之總劑量應由主治醫師在合理的醫學判斷範圍内確定。改庭f加或厣愈：本文所用之術語「改良」、「增加」或降低」或'法等效詞表示相對於基線量測（例如相同個體在開始本文所述治療前之量測、或對照個體（或多個對…、個體）在不存在本文所述治療時之量測）之值。「對照個體」係患有與所治療個體相同之溶酶體貯積症形式(例如，球樣細胞性腦白質營養不良）之個體，其與所治療個體之年齡大致相同（以確保所治療個體與對照個體之疾病階段相當）。窗邀細W⑽、居舍：本文所用之術語「個體⑽⑽，individual)」或「患者」係指人類或非人類哺 ^動物個體。所治療個體（individual)(亦稱作「患者」或個體（subject)」）係患有疾病（例如球樣細胞性腦白質營養不良）之個體（胎兒、幼兒、兒童、少年或成人）。邊赛潑：本文所用之術語「連接體」係指融合蛋白中不在天然蛋白質中特定位置出現且通常經設計以具有撓性或將結構（例如α-螺旋）插入兩個蛋白質部分之間的胺基酸序 7。例如，在一些實施例中，靶向序列（例如，IGF_n部分）可經由連接體與β_半乳糖腦苷酶蛋白質結合。稱作間隔體。多凝：一般而言，本文所用之「多肽」係至少兩個藉由 157227.doc 201206462 肽鍵彼此附接之胺基酸串。在一些實施例中，多肽可包括少3至5個胺基酸，每一胺基酸藉助至少—個狀鍵附接至其^ 胺基酸。彼等熟習此項技術者應瞭解，多肽有時視情況包括「非天然」胺基酸或仍然能整合至多肽鏈令之其他實體。力料：本文所用之術語「可溶的」係指治療劑能夠形成均質溶液。在-些實施例中，治療劑於溶液中之溶解性足以容許將治療有效量之治療劑遞送至目標作用位點’其中將治療劑投與該溶液中並藉由該溶液轉運至目標作用位點（例如’腦細胞及組…數㈣素可料治㈣之溶解性》例如，可影響蛋白質溶解性之有關因素包括離子強度、胺基㈣列及存在其他辅助溶㈣（c^S〇lubilizing a—或鹽（例如弼鹽）。在—些實施例中，該等醫藥組人物經調配而使該等組合物不包含㈣。在-些實施例中：本發明治療劑可溶於其對應醫藥組合物中。應瞭解，儘管通常對於非經腸投與藥物而言等渗溶液係較佳的，但使用等渗溶液可能限制-些治療劑且尤其一些蛋白質及/或酵素之充刀各解。已證實輕微高滲溶液⑽如高達Μ福氯化納存於5蝴碟酸納中，PH 7.0)及含糖溶液（例如，高達2%庶糖存於5福鱗酸納中，PH 7.0)在猴子中具有良好 m n 之經批准cns團注調配組合物係鹽水（150 mM Naa水溶液）。如“ “缺：文所用之術語「穩定的J係指治療劑(例其苟/Μ 夠在較長時間内保持H療功效（例如’ ' 活跬及’或生理化學完整性(phy— 157227.doc 201206462 integrity)之全部或大部分）。可在較長時間内（例如，持續至少1個月、3個月、6個月、12個月、18個月、24個月、 3〇個月、36則或更長_)料料狀敎性及醫藥組合物保持該治療劑之穩定性的能力…般而言，本文所述醫藥組合物經調配以能夠穩定與其_起調配之—或多種治療劑(例如重組蛋白質）’或者減緩或阻止其降解。在調配物之情形下’穩定調配物係其巾之治療齡儲存後及在處理（例如冷康/解;東、機械混合及;東乾）期間基本上保持其物理及/或化學完整性及生物活性者。對於蛋白質穩定性而言，其可藉由高分子量（HMW)聚集體之形成、酵素活性之損失、肽片段之產生及電荷曲線之移位來量測。沏邀：本文所用之術語「個體」意指任何哺乳動物，包括人類。在本發明之某些實施例中，個體係成年、少年或幼兒。本發明亦涵蓋在子宮内投與該等醫藥組合物及/或實施該等治療方法。實穿苟渌尨：片語「實質同源性」在本文中用於指胺基酸或核酸序列之間之比較》如彼等熟習此項技術者所瞭解’兩個序列若在對應位置中含有同源殘基，則通常將其視為「實質上同源」。同源殘基可為相同殘基。或者，同源殘基可為具有合適的類似結構及/或功能特徵之不同殘基。例如，如彼等熟習此項技術者所熟知，通常將某些胺基酸歸類為「疏水性」或「親水性」胺基酸及/或具有「極性」或「非極性」侧鍵。一種胺基酸取代為相同類型之另一種胺基酸通常可視為「同源」取代》 157227.doc 201206462

如業内所熟知，胺基酸或核酸序列可使用多種算法中之任一者來比較，包括彼等可在商用電腦程式（例如用於核苷酸序列之BLASTN及用於胺基酸序列之BLASTP、空位 BLAST及PSI-BLAST)中獲得者。該等實例性程式闡述於以下文獻中：Altschul等人，Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990 ； Altschul# A > Methods 少；Altschul 等人，「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs」，Wwc/ezc Λα. 25:3389-3402, 1997 .，Baxevanis等人，Bioinformatics: A Practical Guide ίο 〇/ ⑽d Proie/w·?，Wiley, 1998 ;及

Misener 等人（編輯），Mei/zoc/s Pro/oco(Methods in Molecular Biology，第 132 卷）， Humana Press，1999。除鑑別同源序列外，上述程式通常亦指示同源性程度。在一些實施例中，若兩個序列在相關殘基延伸部分上有至少50%、55%、60%、65%、70%、 75% ' 80% ' 85% ' 90% ' 91% ' 92% ' 93% ' 94% > 95% ' 96%、97%、98%、99%或更多的對應殘基同源，則將其視為實質上同源。在一些實施例中，相關延伸部分係完整序列。在一些實施例中，相關延伸部分係至少10、15、20、 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、 275 、 300 、 325 、 350 、 375 、 400 、 425 、 450 、 475 、 500或更多個殘基。 157227.doc -12- 201206462 實#一衮從：片語「實質一致性」在本文中用於指胺基酸或核酸序列之間之比較"如彼等熟習此項技術者所瞭解，兩個序列若在對應位置中含有相同殘基，則通常將其視為「實質上一致如業内所熟知，胺基酸或核酸序列可使用多種算法中之任一者來比較，包括彼等可在商用電腦程式（例如用於核苷酸序列之BLASTN及用於胺基酸序列之BLASTP、空位BLAST及PSI-BLAST)中獲得者》該等實例性程式闡述於以下文獻中：Altschul等人，Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990 ; Altschul等人，; Altschul 等 A · Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997 ; Baxevanis等人，Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes Wiley, 1998 ;及 Misener 等人（編輯），

Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第 132卷），Humana Press, 1999。除鑑別一致序列外、，上述程式通常亦提供一致性程度之指示。在一些實施例中，若兩個序列在相關殘基延伸部分上有至少50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、910/〇、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的對應殘基一致，則將其視為實質上一致。在一些實施例中，相關延伸部分係完整序列。在一些實施例中，相關延伸部分係至少 10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95 ' 100 ' 125、 150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、 157227.doc -13- 201206462 400、425、450、475、500或更多個殘基。適於遠送至C见S尹：當關於本發明醫藥組合物時，本文所用之片語「適於遞送至中樞神經系統中」或「適於遞送至CNS中」通常係指該等組合物之穩定性、耐受性及溶解性特性以及該等組合物將其中含有之有效量之治療劑遞送至目標遞送位點（例如’ CSF或腦）的能力。在一些實施例中’若本發明醫藥組合物展示穩定性及耐受性，則該等組合物適於遞送至個體之中樞神經系統中。在一些實施例中，右本發明醫藥組合物展示穩定性及耐受性且能夠溶解其中含有之治療劑，則該等組合物適於遞送至個體之中框神經系統中。治#沒妒分：本文所用之術語「治療性部分」係指分子中賦予分子之治療效果之部分。在一些實施例中，治療性邛刀係具有治療活性之多肽。例如，本發明治療性部分可為可取代天然GalC蛋白質之多肽。在一些實施例中，本發明治療性部分可為可挽救—或多種與卜半乳糖騎酶缺陷有關之表型的多肽。在一些實施例中，本發明治療性部分可治療球樣細胞性腦白質營養不良患者之—或多種症狀。治财放f本文所用之術語「治療有效量」係指治療 &蛋白質（例如’ β_半乳糖腦普酶）以適用於任—醫學治療之。理益處/風險比賦予對所治療個體之治療效果之量。治療效果可具有客觀性（即，可藉由某制試或標記量測） ί主觀性(即，個體給出對效果之指示或感覺)。具體而 …療有效量」係指治療性蛋白質或組合物藉由(例如) 157227.doc 201206462 改善與疾病有關症狀、預防或延遲疾病發作、及/或亦降低疾病症狀之嚴重程度或頻率來有效治療、改善或預防期望疾病或病狀、或呈現治療或預防可檢測效果之量。治療有效量通常以可包含多個單位劑量之給藥方案投與。對於 2一特定治療性蛋白質而言’治療有效量（及/或在有效給藥方案内之合適單位劑量）可端視（例如）投與途徑、與其他醫藥劑之組合而變化。此外，任—特^患者之具體=療有效量(及/或單位劑量)可端視多種因素而定，包括所治療病症及該病症之嚴重程度；所用具體醫藥劑之活性；所用具體組合物；患者之年齡、體重、總體健康狀況、性別及飲食；所用具體融合蛋白之投與時間、投與途徑及/或排泄或代謝速率；治療持續時間；及醫學技術内熟知之類似因 w切：本文所狀術語「可耐受的」及「耐受性」係指本發明醫藥組合物不在投與該組合物之個體中引發不良反應或另-選擇為不在投與該組合物之個體中引發嚴重不良反應之能力。在一些實施例中，本發明醫藥組合物在投與該等組合物之個體中具有良好耐受性。治蘑而:本文所用之術語「治療办咖叫」 (亦稱為「治療（_或treating)」）係指任何投與治療性蛋白質（例如’溶酶體酵素）以部分或完全地緩和、改善、減或例如’球樣細胞性腦低良)之一或多種症狀或特徵，延遲其發作，降其威重㈣及/或降低其發生率1治療可針對不呈現 157227.doc •15· 201206462 相關疾病、病症及/或病狀之體徵之個體及/或針對僅呈現該疾病、病症及/或病狀之早期體徵之個體。或者或另外’該治療可針對呈現相關疾病、病症及/或病狀之一或多個確立體徵之個體。本發明尤其係關於經腦脊髓膜内投與溶酶體酵素來有效治療溶酶體貯積症。在一些實施例中，本發明提供用於IT 遞送β-半乳糖腦苷酶之穩定調配物。本文所述某些實施例至少部分地基於以下發現：緩衝濃度及用於調配供CNS投與之治療劑之醫藥組合物及溶液之 pH之微小變化對投與溶液及其中所含治療劑之对受性及活體内女全性具有顯著影響。此外’某些實施例至少部分基於以下發現：本文所揭示醫藥組合物促進一或多種治療劑 (例如’以重組方式製備之酵素）有效遞送及分佈至CNS之特定（例如，目標）組織、細胞及/或細胞器中。某些實施例之醫藥組合物及調配物能夠溶解高濃度之治療劑（例如，蛋白質或酵素）’且適於將該等治療劑遞送至個體之CNS中以治療具有CNS成份（comp0nent)及/或病因之疾病。本文所述組合物之特徵進一步在於投與需要其之個體之CNS(例如’經腦脊趙膜内）後具有改良之穩定性及改良之耐受性。如上文所討論，BBB係限制物質擴散跨過BBB及擴散至下面的CNS中之結構系統。在全身遞送大的大分子（例如外源治療性蛋白質及酵素）後，大多未成功地在CNS之細胞及組織内達到治療劑之治療濃度。例如，嘗試僅全身投與酵 157227.doc -16· 201206462 素來治療泰-薩克斯病（Tay Sachs disease)具有有限之治療價值，此乃因該等酵素至CNS之細胞及組織中之分佈較差以及該等酵素以全身方式清除及降解。（v〇n Specht 81^等人Neurology (1979) 29:848-854.)因此，將大分子治，劑遞送跨過BBB並隨後在CSF&CNS組織（例如，腦）中達到及/ 或保持該等治療劑之有效治療濃度係治療具有特定CNS成份及/或病因之疾病的特定挑戰。具體而言，除非酵素可被有效地遞送至需要的作用位點（例如，腦組織，例如大腦皮質、小腦及/或大腦），否則酵素替代療法（ERT)對於治療與CNS組織中一或多種酵素病理性缺陷有關之疾病（例如，溶酶體貯積症）的功用及功效仍然有限。由於BBB之障壁特性及與全身投與治療性蛋白質及/或酵素有關之限制，較佳將本文所述醫藥組合物直接投與個體之CNS中《本發明醫藥組合物之較佳投與途徑包括（例如）腦脊髓膜内、腦室内、大腦室内及腦池内遞送。儘管對於溶酶體貯積症之軀體症狀的治療已經取得了一些進展，但對於伴隨該等疾病之通常具有破壞性的神經後遺症尚未取得類似的療法發展。例如，嚴重的亨特氏症候群（Hunter syndrome)在受侵襲患者之腦中呈現組織學變化，此可包括萎縮、皮質神經元腫脹、大腦白質減少、血官周間隙擴大及普爾欽細胞（purkinje cell)樹突腫脹。磁共振成像/光譜研究已顯示，與不患有認知損害者相比，在患有認知損害之患者中涉及白質之嚴重彌漫性損傷、腦萎縮及腦積水較常見。（Ved〇lin，L等人，ajnr Am j 157227.doc -17- 201206462

Neuroradiol (2007) 28，1029-1033)。甚至不患有諸如智力遲鈍或發育遲緩等極度神經後遺症的患者也顯示具有腦異常，包括萎縮、腦室擴大及血管周間隙擴大。（Matheus， MG等人，Neuroradiology (2004) 46，666-672.) 因此，某些實施例係關於將一或多種治療劑遞送至CNS 細胞之一或多種細胞器（例如，溶酶體）中以治療該等溶酶體貯積症且尤其治療該等溶酶體貯積症之神經後遺症的方法。例如，某些實施例係關於向受亨特氏症候群侵襲之個體之中樞神經系統中投與（例如，經腦脊髓膜内）包含治療有效量之艾杜糖酸酸鹽（iduronate)-2-硫酸醋酶之醫藥組合物，其中該醫藥組合物使得艾杜糖醛酸鹽-2-硫酸酯酶分佈及/或積聚至一或多種受侵襲細胞器（例如溶酶體或粒線體）中。某些實施例係關於治療一或多種溶酶體貯積症（例如亨特氏症候群或B型聖菲利波症候群（Sanfilippo syndrome))之方法，其藉由減少或消除個體溶酶體内未消化大分子之積聚或另一選擇為減小該等溶酶體之尺寸及數量由此減少或改善細胞功能障礙及其他有關臨床異常來實施。因此，本發明之方法及醫藥組合物可減弱、治癒或改善溶酶體貯積症（例如亨特氏症候群）之CNS表現。可藉由該等方法及組合物治療之其他溶酶體貯積症種類可為熟習此項技術者例行獲知且例行獲得。（例如，參見Kolodny等人，「Storage Diseases of the Reticuloendothelial System」， Nathan and Oski's Hematology of Infancy and Childhood, (1998)第 5版，第 2卷，David G. Nathan及 Stuart H· Orkin編 157227.doc • 18 - 201206462 輯’ W. B. Saunders公司，第1461-1507頁，其内容以引用方式併入本文中可使用本發明方法及組合物治療之較佳溶酶體貯積症包括具有CNS病因或成份之疾病。具有CNS病因或成份之溶酶體貯積症包括（例如且不限於）Α型聖菲利波症候群、Β型聖菲利波症候群、亨特氏症候群、異染性腦白質營養不良及球樣細胞性腦白質營養不良。經批准療法之侷限性在於其經靜脈内投與個體且通常僅可有效治療由酵素缺陷引起之軀體症狀。本發明組合物及方法可有利地直接投與患有具有該CNS病因之疾病之個體的CNS中（例如，經腦脊趙膜内、經腦室内或經腦池内）’由此在CNS之受侵襲細胞及組織（例如，腦）内達到治療濃度，從而克服與傳統的全身投與該等治療劑有關之限制。某些實施例之醫藥組合物亦可被描述成能夠有效地分佈至CNS細胞及組織中，由此將一或多種治療劑（例如，以重組方式製備之用於治療溶酶體貯積症的酵素）遞送至目標細胞及組織中（或使該一或多種治療劑與目標細胞及組織接觸）。在一些實施例中，該等醫藥組合物能夠促進一或多種治療劑分佈至CNS細胞及組織（例如，神經元）中，由此治療具有CNS表現之疾病（例如，亨特氏症候群）^在某些實施例中，目標組織可包括CSF及/或腦（例如，白質、灰質、大腦皮質、小腦、大腦、穹窿及/或胼胝體在某些實施例中，該等醫藥組合物（例如，經腦脊趙膜内投與之I2S)可促進治療劑於一或多種目標細胞（例如，神經元、 157227.doc •19· 201206462 外顯子、軸突、少突膠質細胞及/或普爾欽細胞）中之細胞疋位。在某些實施例中’該等醫藥組合物(例如，經腦脊髓膜内投與之溶酶體酵素)可促進治療劑於目標組織或目標細胞之一或多種細胞器(例如，溶酶體、粒線體或空泡) 中之定位。在些實施例中’本發明組合物及方法可經腦脊髓膜内投與，且展示在腦之深層細胞、組織及細胞器中達到缺陷蛋白質或酵素之治療濃度的能力。例如，在一些實施例中’經腦脊髓膜内投與之酵素展示易位動力學由此酵素在血管周間隙内移動（例如，藉由脈動輔助之對流機制）。另外’與所投與蛋白質或酵素與神經絲之結合有關之主動軸突轉運機制亦可有助力或促進經腦脊髓膜内投與之蛋白質或酵素分佈至中樞神經系統之深層組織中。本文所述醫藥組合物可有利地促進一或多種治療劑遞送至目標細胞器中。例如，由於溶酶體貯積症（例如亨特氏症候群）之特徵在於受侵襲細胞之溶酶體中積聚糖胺聚多糖（GAG) ’故對於治療溶酶體貯積症而言溶酶體係有吸引力的目標細胞器。因此’在某些實施例中，該等醫藥組合物使得或促進其中含有之治療劑分佈至目標細胞且尤其該等目標細胞内之細胞器（例如溶酶體）中。在某些實施例中，本發明醫藥組合物引起或展示一或多種與溶酶體貯積症有關之病理或生物標記之存在或另一選擇為積聚的減少（例如，約5%、1〇%、15%、20%、25。/〇、 30〇/〇、40〇/〇、50%、55〇/〇、60%、650/〇、70%、75%、80%、 157227.doc •20· 201206462 90/。、95%、97.5%、99%或更多減少）或完全消除。該減少或消除在CNS細胞及組織（例如，神經元及少突膠質細胞）中尤其明顯。例如，在一些實施例中，在投與個體後，本發明醫藥組合物展示或達成個體之CNS細胞及組織中（例如，大腦皮質、小腦、尾狀核及豆狀核殼、白質及/或丘腦中）生物標記溶酶體相關膜蛋白i (LAMp丨）積聚之減少。 LAMP 1係高度表現於溶酶體膜中之糖蛋白，且在許多患有溶酶體貯積症之患者中其存在提高。（Meikle等人CHn

Chem. (1997)43:1325-1335.)因此，在患有溶酶體貯積症之患者中存在或不存在LAMP1(例如，如藉由LAMP染色所測疋）可提供溶酶體活性之有用指示及用於診斷及監測溶酶體貯積症之標記。因此，本發明之一些實施例係關於減少或消除一或多種與疾病（例如，溶酶體貯積症）有關之病理或生物標記之存在或積聚的方法。類似地，本發明之一些實施例係關於增加或多種與溶酶體貯積症有關之病理或生物標記（例如，LAMP1)之降解（或降解速率）的方法。

本發明組合物及方法亦可用於治療溶酶體貯積症之神經及躺體後遺症。例如’本發明之__些實施例係關於將一或多種治療劑遞送至個體之CNS中（例如，經腦脊髓膜内、經腦至内或經腦池内）以治療溶酶體貯積症之CNS或神經後遺症及表現，同時亦治療該溶酶體貯積症之全身或軀體表現的組合物及方法。例如，可將一些本發明組合物經腦脊趙膜内投與個體，由此將一或多種治療劑遞送至個體之CNS 157227.doc 201206462 中並治療神經後遺症，外加靜脈内投與一或多種治療劑以將該等治療劑遞送至全身循環之細胞及組織（例如，心臟、肺、肝'腎或淋巴結之細胞及組織）中，由此治療軀體後遺症°例如，可向患有溶酶體貯積症（例如，亨特氏症候群）或受該疾病侵襲之個體至少每週一次、每兩週一次、每月一次、每兩個月一次或更經常地經腦脊髓膜内投與包含一或多種治療劑（例如，艾杜糖醛酸鹽_2_硫酸酯酶）之醫藥組合物以治療神經後遺症，同時更頻繁地（例如，每天一次、每隔一天一次、每週三次或每週一次）經靜脈内向該個體投與不同治療劑以治療該疾病之全身或軀體表現。當關於本發明醫藥組合物時，本文所用之片語「適於遞送至中柩神經系統中」通常係指該等組合物之穩定性、耐受性及溶解性特性以及該等組合物將其中含有之有效量之治療劑遞送至目標遞送位點（例如，CSF或腦）的能力。在坠實施例中，若本發明醫藥組合物展示穩定性及耐受性，則該等組合物適於遞送至個體之中樞神經系統中。在些實施例中，若本發明醫藥組合物展示穩定性及耐受性且能夠☆解其中含有之治療劑，則該等組合物適於遞送至個體之中樞神經系統中。本發明組合物及方法通常適用於許多治療劑。在一些實施例中’本發明醫藥組合物及方法包含蛋白質及/或酵素作為/α療劑。在本發明—些實施例中，治療劑可為天然或以重組方式得到之蛋白質及/或酵素。在-些實施例中，療劑係可用於治療疾病(例如，溶酶體貯積症)之天然或 157227.doc •22- 201206462 重組酵素。例如，在某些實施例中’本發明醫藥組合物包含重組酵素乙酿肝素N_硫酸s旨酶、艾杜糖酸鹽_2_硫酸酯酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、芳基硫酸酯酶Α、乙醯基葡萄糖胺酶或半乳糖腦苷酶中之一或多者。本發明#法涵蓋單次以及多次投與有效量之本文所述醫藥組合物。該等醫藥組合物可每隔—定時間投與，此端視個體病狀，溶酶體貯積症）之性質、嚴重程度 (severity)及範圍（extent)而定。在—些實施例中，可每隔 -定時間週期性地投與有效量之本發明醫藥組合物(例如，一年一次、一年四次、兩個月_次、—月一次、兩週一次、一週一次、一週兩次、一週三次、每天一次、一天兩次、一天三次或四次或更頻繁）。在某些實施财’本發明醫藥組合物係無菌的且利用適當無菌技術投與個體。本文所用之術語「個體」意指任何哺乳動物，包括人類。在本發明之某些實施例中，個體係成年、少年或幼兒。本發明亦涵蓋在子宮内投與該等醫藥組合物及/或實施該等治療方法。本文所用之術語「有效量」主要係基於本發明醫藥組合中所3有冶療劑之總量來確定^通常，有效量足以對個體達成有意義的益處（例如，治療、調節、治癒、預防及/ 或改善潛在疾病或病狀)。例如’本發明醫藥組合物之有效里可為足以達成期望治療及/或預防效果的量，例如足、1 /谷酶體酵素受體或其活性由此治療該溶酶體貯積症 157227.doc •23· 201206462 或其症狀（例如，在將本發明組合物投與個體後減少或消除「斑馬體」或細胞空泡形成的存在或發生）的量。通常，投與有需要之個體的治療劑（例如，重組溶酶體酵素）的量應端視個體特徵而定。該等特徵包括個體之病狀、疾病嚴重程度、總體健康狀況、年齡、性別及體重。熟習此項技術者可容易地能夠端視該等及其他相關因素來確定合適劑量。另外，可視情況利用客觀及主觀分析來確定最佳劑量範圍。確疋治療個體所需要之治療劑的有效量在研發本發明醫藥組合物時係尤其重要的考慮因素。可經腦脊髓膜内投與個體之有限體積可影響醫藥組合物中治療劑之濃度。在某些實施例中，醫藥組合物中治療劑之濃度足以在受侵襲之 CNS細胞及組織（例如，腦）中達到該治療劑之治療濃度。例如’在投與某些實施例之醫藥組合物後，可在目標細胞及組織（例如，腦組織或CSF)中達到或檢測到其中含有之治療劑的治療濃度。在某些實施例中，在投與後（例如，在將醫藥組合物經腦脊髓膜内投與個體後1週' 3天、 48小時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、ό小時、4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘或更短時間）’醫藥組合物在個體之CNS組織及細胞中達到至少30 Mg/ml之濃度。在某些實施例中，在投與個體後（例如，在將醫藥組合物經腦脊髓膜内投與個體後1週、3天、48小時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、 4小時、3小時、2小時、1小時、30分鐘或更短時間），該 157227.doc -24- 201206462 '、、· α物在該個體之目標組織或細胞（例如，腦組織或神經疋)中達到至少2”g/ml、至少15 pg/m卜至少10 —卜至少、至少5_ml、至少25μ§/ιη1、至少1.0 pg/ml或至少〇 5 pg/ml之濃度。在某—實施例中’醫藥組合物中治療劑之濃度係至少、至少45吨就、至少40 mg/mL、至少35 一^、至少 3〇 mg/mL、至少 25 mg/mL、至少 2〇 mg/mL、至少15 mg/mL、至少1〇㈣社、至少5叫就、至少2.5 mg/mL、至少丄㈣社或小於】叫/紅。較佳地， $治療劑可溶於本發明醫藥組合物t。較佳地，本發明醫藥組合物在長時間内保持穩定（例如，在室溫下或另一選擇為在36-46T之冷;東條件下穩定至少12個月）。治療性蛋白質適於本發明之治療性部分可為可取代天然存在之半乳糖腦苦酶（GalC)蛋白質活性或挽救一或多種與Gaic_缺陷有關之表型或症狀的任一分子或分子之一部分。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分係具有與成熟人類GalC蛋白質實質上類似或相同之N_末端及c_末端及胺基酸序列之多肽。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分係具有與成熟小鼠GalC蛋白質實質上類似或相同之N_末端及匕末端及胺基酸序列之多肽。通常’ GalC係以處理為成熟形式之前體分子產生。此處理通常藉由去除42個胺基酸信號肽來進行。通常，前體形式亦稱作全長前體或全長Galc蛋白質，對於人類蛋白質而 157227.doc -25· 201206462 言其含有685個胺基酸且對於小鼠蛋白質而言含有684個胺基酸。將N-末端42個胺基酸解離，從而產生長度為643個胺基酸之人類蛋白質之成熟形式及長度為642個胺基酸之小鼠蛋白質之成熟形式。因此，預計對於GalC蛋白質活性而言，通常無需N-末端42個胺基酸。典型野生型或天然存在之人類GalC蛋白質之成熟形式（SEQ ID ΝΟ:1)及全長前體（SEQ ID NO:2)的胺基酸序列展示於表1中"典型野生型或天然存在之小鼠GalC蛋白質之成熟形式（SEQ ID NO:3) 及全長前體（SEQ ID NO:4)的胺基酸序列亦展示於表1中。表1.人類及小鼠半乳糖腦苷酶人類成熟形式 YVLDDSDGLGREFDGIGAVSGGGATSRLLVNYPEP YRSQILDYLFKPNFGASLHILKVEIGGDGQTTDGTE PSHMHYALDENWRGYEWWLMKEAKJKJRNPMTLI GLPWSFPGWLGKGFDWPYVNLQLTAYYWTWIVG AKRYHDLDIDYIGIWNERSYNANYIKILRKMLNYQ GLQRVKIIASDNLWESISASMLLDAELFKWDVIGA HYPGTHSAKDAKLTGKKLWSSEDFSTLNSDMGAG CWGRILNQNYINGYMTSTIAWNLVASYYEQLPYGR CGLMTAQEPWSGHYWESPVWSAHTTQFTQPGW YYLKTVGHLEKGGSYVALTDGLGNLTIIIETMSHKH SKCIRPFLPYFNVSQQFATFVLKGSFSEIPELQVWYT KLGKTSERFLFKQLDSLWLLDSDGSFTLSLHEDELF TLTTLTTGRKGSYPLPPKSQPFPSTYKDDFNVDYPFF SEAPNFADQTGVFEYPTNIEDPGEHHFTLRQVLNQR PITWAADASNTISIIGDYNWTNLTIKCDVYIETPDTG GVFIAGRVNKGGILIRSARGIFFWIFANGSYRVTGDL AGWIIYALGRVEVTAKKWYTLTLTIKGHFASGMLN DKSLWTDIPVNFPKNGWAAIGTHSFEFAQFDNFLVE ATR(SEQIDNO:l) 157227.doc •26- 201206462

人類全長前體 MAEWLLSASWQRRAKAMTAAAGSAGRAAVPLLL CALLAPGGAYYLDDSDGLGREFDGIGAVSGGGATS RLLVNYPEPYRSQILDYLFKPNFGASLHILKVEIGGD GQTTDGTEPSHMHYALDENYFRGYEWWLMKEAK KRNPNITLIGLPWSFPGWLGKGFDWPYVNLQLTAY YWTWIVGAKRYHDLDIDYIGIWNERSYNANYIKIL RKMLNYQGLQRVKIIASDNLWESISASMLLDAELF KWDVIGAHYPGTHSAKDAKLTGKKLWSSEDFSTL NSDMGAGCWGRILNQNYINGYMTSTIAWNLVASY YEQLPYGRCGLMTAQEPWSGHYWESPVWVSAHT TQFTQPGWYYLKTVGHLEKGGSYVALTDGLGNLTI IIETMSHKHSKCIRPFLPYFNVSQQFATFVLKGSFSEI PELQVWYTKLGKTSERFLFKQLDSLWLLDSDGSFT LSLHEDELFTLTTLTTGRKGSYPLPPKSQPFPSTYKD DFNVDYPFFSEAPNFADQTGVFEYFTNIEDPGEHHF TLRQVLNQRPITWAADASNTISIIGDYNWTNLTIKC DVYIETPDTGGVFIAGRVNKGGILIRSARGIFFWIFA NGSYRVTGDLAGWIIYALGRVEVTAKKWYTLTLTIK GHFASGMLNDKSLWTDIPVNFPKNGWAAIGTHSFE FAQFDNFLVEATR (SEQIDNO:2) 小鼠成熟形式 YVLDDSDGLGREFDGIGAVSGGGATSRLLVNYPEP YRSEILDYLFKPNFGASLHILKVEIGGDGQTTDGTE PSHMHYELDENWRGYEWWLMKEAKKRNPDIILM GLPWSFPGWLGKGFSWPYVNLQLTAYYWRWILG AKHYHDLDIDYIGIW^RPFDANYIKELRKMLDYQ GLQRVRIIASDNLWEPISSSLLLDQELWKWDVIGA HYPGTYTVWNAKMSGKKLWSSEDFSTINSNVGAG CWSRILNQNYINGNMTSTIAWNLVASYYEELPYGR SGLMTAQEPWSGHYWASPIWVSAHTTQFTQPGW YYLKTVGHLEKGGSYVALTDGLGNLTIIIETMSHQH SMCIRPYLPYYNVSHQLATFTLKGSLREIQELQVWY TKLGTPQQRLHFKQLDTLWLLDGSGSFTLELEEDEI FTLTTLTTGRKGSYPPPPSSKPFPTNYKDDFNVEYPL FSEAPNFADQTGVFEYYMNNEDREHRFTLRQVLNQ 157227.doc ·27· 201206462 RPITWAADASSTISVIGDHHWTNMTVQCDVYIETPR SGGVFIAGRVNKGGILIRSATGVFFWIFANGSYRVTA DLGGWITYASGHADVTAKRWYTLTLGIKGYFAFG MLNGTILWKNVRVKYPGHGWAAIGTHTFEFAQFD NFRVEAAR (SEQ ID NO:3) 小鼠全長前體 MANSQPKASQQRQAKVMTAAAGSASRVAVPLLLC ALLVPGGAYVLDDSDGLGREFDGIGAVSGGGATSR LLVNYPEPYRSEILDYLFKPNPGASLHILKVEIGGDG QTTDGTEPSHMHYELDENYFRGYEWWLMKEAKK RNPDIILMGLPWSFPGWLGKGFSWPYVNLQLTAYY WRWILGAKHYHDLDIDYIGIWNERPFDANYIKEL RKMLDYQGLQRVRIIASDNLWEPISSSLLLDQELWK VVDVIGAHYPGTYTVWNAKMSGKKLWSSEDFSTI NSNVGAGCWSRILNQNYINGNMTSTIAWNLVASYY EELPYGRSGLMTAQEPWSGHYVVASPIWVSAHTTQ FTQPGWYYLKTVGHLEKGGSYVALTDGLGNLTIIIE TMSHQHSMCIRPYLPYYNVSHQLATFTLKGSLREIQ ELQVWYTKLGTPQQRLHFKQLDTLWLLDGSGSFTL ELEEDEIFTLTTLTTGRKGSYPPPPSSKPFPTNYKDD FNVEYPLFSEAPNFADQTGVFEYYMNNEDREHRFT LRQVLNQRPITWAADASSTISVIGDHHWTNMTVQC DVYIETPRSGGVFIAGRVNKGGILIRSATGVFFWIFA NGSYRVTADLGGWITYASGHADVTAKRWYTLTLGI KGYFAFGMLNGTILWKNVRVKYPGHGWAAIGTHT FEFAQFDNFRVEAAR (SEQ ID NO:4) 因此，在一些實施例中，適於本發明之治療性部分係成熟人類GalC蛋白質（SEQ ID ΝΟ:1)。在一些實施例中，適宜治療性部分可為成熟人類GalC蛋白質之同源物或類似物。例如，成熟人類GalC蛋白質之同源物或類似物可為與野生型或天然存在之GalC蛋白質（例如，SEQ ID ΝΟ:1)相比含有一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入，同時保持 157227.doc •28- 201206462 實質GalC蛋白質活性之經修飾成熟人類GalC蛋白質。因此，在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與成熟人類GalC蛋白質（SEQ ID ΝΟ:1)實質上同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之胺基酸序列與SEQ ID ΝΟ:1 至少 50%、55% ' 60% ' 65% ' 70% ' 75% ' 80% ' 85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99。/〇或更多同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與成熟人類GalC蛋白質（SEQ ID N0:1)實質上一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之胺基酸序列與 SEQ ID ΝΟ:1 至少 50°/。、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、〇、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或更多一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分含有成熟人類GalC蛋白質之片段或部分。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分係成熟小鼠 GalC蛋白質（SEQ ID NO:3)。在〆些實施例中’適宜治療性部分可為成熟小鼠GalC蛋白質之同源物或類似物。例如，成熟小鼠GalC蛋白質之同源物或類似物可為與野生型或天然存在之GalC蛋白質（例如，sEQ ID NO··3)相比含有一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入’同時保持實質 GalC蛋白質活性之經修飾成熟小鼠0310蛋白質。因此’在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與成熟小鼠GalC 蛋白質（SEQ ID NO:3)實質上同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之胺基酸序列與SEQ ID N〇:3至少 157227.doc ·29· 201206462 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 91%、92%、93%、94%、950/〇、96%、97%、98〇/〇、99%或更多同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與成熟小鼠GalC蛋白質（SEQ ID NO:3)實質上一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之胺基酸序列與SEQ ID NO:3 至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85% > 90% ' 91% ' 92% ' 93% > 94% ' 95% ' 96% ' 97% ' 98%、99%或更多一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分含有成熟小鼠GalC蛋白質之片段或部分。或者，適於本發明之治療性部分係全長人類GalC蛋白質。在一些實施例中，適宜治療性部分可為全長人類GalC 蛋白質之同源物或類似物。例如，全長人類GalC蛋白質之同源物或類似物可為與野生型或天然存在之全長GalC蛋白質（例如，SEQ ID NO:2)相比含有一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入，同時保持實質GalC蛋白質活性之經修飾全長人類GalC蛋白質。因此，在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與全長人類GalC蛋白質（SEQ ID NO:2)實質上同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之胺基酸序列與 SEQ ID NO:2至少 50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或更多同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與SEQ ID NO:2實質上一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之胺基酸序列與 SEQ ID NO:2至少 50%、55%、60%、65%、70%、 157227.doc •30· 201206462 75%、80〇/〇、85% ' 90%、91%、92%、93%、94%、95% ' 96%、97〇/〇、98%、99%或更多一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分含有全長人類GalC蛋白質之片段或部分。本文所用之全長GalC蛋白質通常含有信號肽序列。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分係全長小鼠 GalC蛋白質。在一些實施例中，適宜治療性部分可為全長小鼠GalC蛋白質之同源物或類似物。例如，全長小鼠GalC 蛋白質之同源物或類似物可為與野生型或天然存在之全長 GalC蛋白質（例如，SEQ ID NO:4)相比含有一或多個胺基酸取代、缺失及/或插入，同時保持實質GalC蛋白質活性之經修飾全長小鼠GalC蛋白質。因此’在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與全長小鼠GalC蛋白質（SEQ ID NO:4)實質上同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之胺基酸序列與SEQ ID NO:4至少50%、55%、 60% > 65% ' 70% > 75% ' 80% ' 85% ' 90% ' 91% ' 92% ' 93%、94〇/〇、95%、96%、97%、98% ' 99%或更多同源。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分與SEQ ID NO:4實質上一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分之胺基酸序列與SEQ ID NO:4至少50%、55%、60%、 65% ' 70% ' 75% ' 80% ' 85% ' 90% ' 91% ' 92% ' 93% ' 94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多一致。在一些實施例中，適於本發明之治療性部分含有全長小鼠GalC蛋白質之片段或部分。本文所用之全長GalC蛋白質通常含有信號肽序列。 157227.doc •31· 201206462 在-些實施例中，治療性蛋白質包括靶向部分(例如，溶酶體靶向序列)及/或膜穿透肽。在—些實施例中，靶向序列及/或膜穿透肽係治療性部分之固有部分（例如，經由化學連接、經由融合蛋白）。在一些實施例中乾向序列含有甘露糖-6-磷酸鹽.部分。在一些實施例中，靶向序列含有IGF-I部分。在一些實施例中，#向序列含有ι(}ρ_π部分。調配物傳統用於將治療劑遞送至個體之CNS中之水性醫藥溶液及組合物包括不含緩衝劑之等滲鹽水及Em〇tt，s B溶液（其為人造CSF) 描述CSF相對於Elliott，s B溶液之組成之比較包括於下表2中。如表2中所示，Eniot，s ；8溶液之濃度接近等同於CSF之濃度。然而，Elliott's B溶液含有非常低之緩衝劑濃度’且因此可能不能提供穩定治療劑（例如，蛋白質）所需要之足夠緩衝能力，尤其在較長時間内（例如，在儲存條件期間）。此外’ Elliott's B溶液含有某些可能與意欲遞送一些治療劑且尤其蛋白質或酵素之調配物不相容的鹽。例如，存在於Elliott's B溶液中之鈣鹽能夠介導蛋白質沉澱且由此降低調配物之穩定性。表2 溶液 Na+ mEq/L K+ mEq/L Ca^ mEq/L Mg” mEq/L HC03* mEq/L cr mEq/L pH 磷 mg/L 葡萄糖 mg/L CSF 117-137 2.3 2.2 2.2 22.9 113-127 7.31 1.2-2.1 45-80 Elliott's B 溶液 149 2.6 2.7 2.4 22.6 132 6.0-7.5 2.3 80 本文所述醫藥組合物經調配以能夠穩定與其一起調配之 157227.doc •32- 201206462 -或#種治療劑（例如重組蛋白質），或者減緩或阻止其降解。本文所用之術語「穩定的」係指治療劑⑼如重㈣幻能夠在較長時間内保持其治療功效（例如，其預期生物活性及/或生理化學完整性（physiochemicai integ邮之全部或大部分）。可在較長時間内（例如，較佳持續至少_ 月、3個月、6個月、12個月、18個月、24個月' %個月、 36個月或更長時昨κ㈣狀敎性及醫藥組合物保持該治療劑之穩定性的能力。纟調配物之情形了，穩定調配物係其巾之治療劑在儲存後及在處理（例如冷;東/解;東，機械混合及凍乾）期間基本上保持其物理及/或化學完整性及生物活性者。對於蛋白質穩定性而言，其可藉由高分子量（HMW)聚集體之形成、酵素活性之損失、肽片段之產生及電荷曲線之移位來量測。 /〇療劑之穩定性對於保持使該治療劑起到其預期治療功能重要之特定治療劑濃度範圍特別重要。可在較長時間内相對於治療劑之生物活性或生理化學完整性進一步評定治療劑之穩定性。例如，可對照早期時間點（例如，調配時第〇天）之穩定性或對照未經調配治療劑比較給定時間點之穩疋丨生’且該比較之結果以百分比表示。較佳地，本發明醫藥組合物在較長時間内保持治療劑生物活性或生理化學 70整性之至少100%、至少99〇/〇、至少、至少97%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少 70%、至少65%、至少60%、至少55%或至少50%(例如，如在至少約6至12個月内於室溫下或在加速儲存條件下所量 157227.doc •33· 201206462 測）。該等治療劑較佳可溶於本發明醫藥組合物中。當關於本發明治療劑時，術語「可溶的」係指該等治療劑能夠形成均質/谷液。較佳地，治療劑於溶液中之溶解性足以容許將治療有效量之治療劑遞送至目標作用位點，其中將治療劑才又與該洛液中並藉由該溶液轉運至目標作用位點（例如，腦細胞及組織）。數個因素可影響治療劑之溶解性。例如，可影響蛋白質溶解性之有關因素包括離子強度、胺基酸序列及存在其他辅助溶解劑或鹽（例如鈣鹽）^在一些實施例中，該等醫藥組合物經調配而使該等組合物不包含鈣〇適於凍乾之調配物可含有不同濃度之所關注治療劑。在一些實施例中，調配物可含有濃度在約工mg/ml至100 mg/ml(例如，約 1 mg/mi 至 5〇 mg/mi、！ mg/ml 至 6〇 mg/ml、1 mg/ml 至 70 mg/ml、1 mg/mi 至 8〇 mg/mi、！ mg/ml至 90 mg/ml、1 mg/ml至 100 mg/mi、25 mg/ml至 100 mg/ml、50 mg/ml至100 nig/mi)之範圍内之所關注蛋白質或治療劑。在一些實施例中，適於凍乾之調配物可含有濃度為約 25 mg/ml、50 mg/ml、75 mg/ml及 100 mg/ml之所關注蛋白質。儘管通常對於非經腸投與藥物而言等渗溶液係較佳的，但使用等滲溶液可能限制一些治療劑且尤其一些蛋白質及/ 或酵素之充分溶解。已證實輕微高滲溶液（例如，高達175 mM氯化鈉存於5 mM磷酸鈉中，pH 7〇)及含糖溶液（例 157227.doc •34· 201206462 如，高達2%蔗糖存於5 mM磷酸鈉中，pH 7.0)在猴子中具有良好耐受性。最常見之經批准CNS團注調配組合物係鹽水（15 0 mM NaC 1水溶液）。先前已測試數種組合物且展示較差之安全性特徵（safety profile)。（von Specht BU等人，Neurology (1979) 29:848-854 ; Grondin R等人，Brain (2002) 125:2191-2201 ; Gill SS等人，Nature Medicine (2003) 9(5):589-95 ; Hood DD等人，Anesthesiology (1995) 82(2): 331-43 ; Sakura SM 等人，Anesthesiology (1997) 87(4):771-8 ; Eisenach JC 等人，Pain (2002) 99:599-604 ; King H等人，Can J Anaesth (1993) 40(5):431-4 ; Rane K等人，Anesthesiology (1998) 89(5):1108-15 ; Steven RA 等人，Anesthesiology (1993) 78(3):492-7 ; Dominiquez AR 等人，Clin Transl Oncol (2005) 7(6): 232-8 ; Kim S等人，J. Clin· Oncology (1993) 11(11):2186-2193 ; Shulman M等人，Reg Anesth (1990) 15(3):142-6 ; Shulman M 等人，Reg Anesth Pain Med (1998) 23(4):395-401) 〇本發明醫藥組合物之特徵在於其耐受性。本文所用之術語「可耐受的」及「耐受性」係指本發明醫藥組合物不在投與該組合物之個體中引發不良反應或另一選擇為不在投與該組合物之個體中引發嚴重不良反應之能力。在一些實施例中，本發明醫藥組合物在投與該等組合物之個體中具有良好耐受性。許多治療劑且尤其本發明之蛋白質及酵素需要受控pH及 157227.doc -35- 201206462 特定賦形劑以在本發明醫藥組合物中保持其溶解性及穩定性。下表3給出認為可保持本發明蛋白質治療劑之溶解性及穩定性之蛋白質調配物的典型態樣。表3 參數典型範圍/類型原理 pH 5 至 7.5 用於穩定性有時亦用於溶解性緩衝劑類型乙酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、組胺酸、磷酸鹽或Tris 保持最佳pH 亦可影響穩定性緩衝劑濃度 5-50 mM 保持pH 亦可穩定或增加離子強度滲透壓調節劑 NaQ、糖、甘露醇使其為等滲透壓或等滲溶液表面活性劑聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80 針對介面及剪切保持穩定其他數十至數百mM之胺基酸 (例如精胺酸）增強溶解性或穩定性醫藥組合物之pH係能夠改變治療劑（例如，酵素或蛋白質）於水性醫藥組合物中之溶解性的另一因素，且因此本發明醫藥組合物較佳包含一或多種緩衝劑。在一些實施例中，水性醫藥組合物包含足以使該組合物之最佳pH保持介於約4.0-8.0之間、介於約5.0-7.5之間、介於約5.5-7.0之間、介於約6.0-7.0之間及介於約6.0-7.5之間的量之緩衝劑。在其他實施例中，緩衝劑包含約5 - 5 0 mM之填酸納且足以使該水性醫藥組合物之最佳pH保持在約7.0。適宜緩衝劑包括（例如）乙酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽、其他有機酸及叁（羥曱基）胺基甲烷（「Tris」）。本發明醫藥組合物之緩衝劑濃度及pH範圍在使於成年及幼年猴子中給藥時調配物耐受性最大化中係重要因素。緩衝劑濃度可為約1 mM至約30 mM或約3 mM至約20 mM，此端視（例如）緩 157227.doc -36- 201206462 衝劑及調配物之期望等滲性而定。在一些實施例中，適宜緩衝劑係以約 1 mM、5 mM、1〇 mM、15 mM、2〇 mM、25 mM ' 30 mM或50 mM之濃度存在。在一些實施例中，調配物含有等滲劑以使調配物保持等滲。通常，所謂「等滲」意指所關注調配物具有與人類血液基本上相同之滲透壓。等滲調配物通常會具有約 mOsm/kg至約350 mOsm/kg之滲透壓。等滲性可使用（例如）蒸私壓或冰點型滲透壓計來量測。實例性等滲劑包括（但不限於）甘胺酸、山梨醇、甘露醇、氣化鈉及精胺酸。在一些實施例中’適宜等滲劑可以按重量計約〇〇15%(例如，0.05%、〇.1%、〇.15%、〇 2%、〇 3%、〇 4%、〇 5%、 0.75% ' 1.〇〇/〇 > 1.25% ^ 1.5% ^ 2.0% ' 2.5% ' 3.0% χ 4.0% 或5.0%)之濃度存在於預凍乾調配物中。在一些實施例中，用於凍乾之調配物含有等滲劑以使預凍乾調配物或復原調配物保持等滲。在一些實施例中，調配物可含有穩定劑以保護蛋白質。通中’適且穩又劑係非還原性糖，例如薦糖、棉子糖、海藻糖或胺基酸（例如甘胺酸、精胺酸及曱硫胺酸）。凍乾調配物中穩定劑之量通常應使調配物等滲。然而，高滲復原調配物亦可適宜。另外，穩定劑之量不應過低而使治療劑發生不可接受之程度之降解/聚集。調配物中之實例性穩定劑濃度可介於約i mM至約400 mM(例如，約3〇 mM至約 300 mM及約50 mM至約100 mM)、或另一選擇為以重量計 0·1%至 15%(例如，1°/。至 10%、5%至 15°/。、5。/。至 1〇%)之範 157227.doc •37· 201206462 圍内在些實施例中’穩定劑與治療劑之體積量之比率係，.勺1 · 1 »在其他實施例中，穩定劑與治療劑之比率可為約on、Λ 之 υ·2.1 、 0.25:1 、 0.4··1 、0.5:1 、 1:1 、 2,1、2.6:1、3:1、4:1、5:1、1〇:1 或 2〇:1。在一些實施例中，適於康乾之穩定劑亦為來乾保護劑。儘管本發明醫藥組合物在投與個體時通常呈水性形式， 4在些實施例中本發明醫藥組合物係凍乾的。該等組合物在投與個體之前必須藉由向其中添加一或多種稀釋劑二以復原。適宜稀釋劑包括（但不限於）滅菌水、注射用抑菌水及滅菌鹽水溶液。較佳地，在復原醫藥組合物時，其中所含之治療劑穩定，易溶解，且在投與個體時展示耐受性。在一些實施例中，適於凍乾之調配物可進一步包括一或多種增積劑°「增積劑」係增加凍乾混合物體積並有助於康乾餅之物理結構的化合物。例如，增積劑可改良;東乾餅之外觀（例如基本上均勻之凍乾餅）。適宜增積劑包括（但不限於）氣化鈉、乳糖、甘露醇、甘胺酸、蔗糖、海藻糠、經乙基澱粉。增積劑之實例性濃度係約至約10%(例如 1.0% > 1.5% ' 2.0% ^ 2.5% ' 3.0% ' 3.5% ' 4.0% ' 4.5% ' 5.0% ' 5.5% ' 6.0% ' 6.5% ' 7.0% ' 7.5% ' 8.0% ' 8.5% ' 9.0%、9.5%及 10.0%)。本發明之醫藥組合物、調配物及相關方法可用於將多種治療劑遞送至個體之CNS中（例如經腦脊髓膜内、經腦室内或經腦池内）及用於治療有關疾病。本發明醫藥組合物尤 157227.doc -38- 201206462 其可用於將蛋白質及酵素（例如酵素替代療法）遞送至患有溶酶體貯積症之個體中。溶酶體貯積症係由溶酶體功能缺陷所引起之一類相當罕見之遺傳性代謝病症。溶酶體疾病之特徵在於溶酶體内積聚未消化之大分子，此導致該等溶酶體之尺寸及數量增加且最终導致細胞功能障礙及臨床異常。在一些實施例中，期望將表面活性劑添加至調配物中。實例性表面活性劑包括非離子型表面活性劑，例如聚山梨醇醋（例如，聚山梨醇酯20或80);泊洛沙姆（p〇l〇xamer)(例如’泊洛沙姆188) ; Triton ;十二烷基硫酸鈉（SDS);月桂基硫酸納；辛基糖苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基_、亞油基_或硬脂基磺基-甜菜鹼；月桂基_、肉豆蔻基_、亞油基_或硬脂基-肌胺酸；亞油基-、肉豆蔻基-或鯨蠟基_甜菜鹼；月桂醯胺丙基-、椰油醯胺丙基_、亞油醯胺丙基_、肉豆蔻醯胺丙基-、棕櫚油醯胺丙基-或異硬脂醯胺丙基_甜菜鹼（例如’月桂醯胺丙基甜菜鹼）；肉豆蔻醯胺丙基_、棕櫚油醯胺丙基-或異硬脂酿胺丙基_二曱胺；甲基椰油醯基牛續酸納或曱基油醯基牛磺酸鈉；及M〇NAQUATtm系列（Mona Industries公司，paterson，NJ)、聚乙二醇、聚丙二醇及乙二醇與丙二醇之共聚物（例如，Plur〇nics、PF68等）。通常’所添加表面活性劑之量應可減少蛋白質之聚集並使微粒或起泡之形成最小化。例如，表面活性劑可以約〇〇〇i_ 0.5%(例如’約0.005-0.〇5%或0.005-0.01%)之濃度存在於調配物中。具體而言，表面活性劑可以約〇〇〇5%、 157227.doc 39· 201206462 0.01%、0.02%、0.1%、0 2。/。、0.3%、0.4% 或 0.5。/。等之濃度存在於調配物中。或者或另外，可將表面.活性劑添加至陳乾調配物、預凍乾調配物及/或復原調配物中。其他醫藥上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑（例如彼等闞述於Remington's Pharmaceutical Sciences第 16版，Osol， A.編輯（1980)中者）可包括於調配物（及/或;東乾調配物及/或復原調配物）中’前提為其不會不良地影響調配物之期望特徵。可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒且包括（但不限於）額外緩衝劑；防腐劑；共溶劑；抗氧化劑’包括抗壞血酸及曱硫胺酸；螯合劑，例如EDTA，金屬錯合物（例如，Zn-蛋白質錯合物）；生物可降解聚合物，例如聚酯；及/或鹽形成抗衡離子，例如納。本發明調配物可基於以下來評定：產品品質分析、復原時間（若來乾）、復原品質（若束乾）、高分子量、水分及玻璃轉變溫度。通常，蛋白質品質及產品分析包括產品降解速率分析’其係使用包括（但不限於）以下之方法來達成：尺寸排除HPLC (SE-HPLC)、陽離子交換_ΗΡΙχ (CEX_ hplc)、X-射線繞射（XRD)、調幅式差示掃描量熱法 (mDSC)、反相 HPLC (RP-HPLC)、多角度光散射（MALS)、螢光、紫外線吸收、濁度測定法、毛細管電泳（CE)、sds_ PAGE及其組合。在一些實施例中，對本發明產品之評價可包括評價外觀（液體或餅外觀）之步驟。通常’調配物（凍乾或水溶液）可在室溫下儲存較長時 157227.doc • 40· 201206462 間。儲存溫度通常可介於〇°C至45〇C (例如，fc、2〇〇c、 25 C、45 C等）之範圍内。調配物可儲存數月時間至數年時間。儲存時間通常可為24個月、12個月、6個月、4.5個月、3個月、2個月或丨個月。調配物可直接儲存於用於投與之容器中，以省去轉移步驟。調配物可直接儲存於亦可用作復原器皿之凍乾容器（若 /東乾）中，以省去轉移步驟。或者，柬乾產品調配物可量測為較小子樣（increment)以供儲存。儲存通常應避免導致蛋白質降解之環境’包括（但不限於）暴露於陽光、uv輻射' 其他形式之電磁輻射、過熱或過冷、快速熱衝擊及機械衝擊^ 球樣細胞性腦白質營養不良（GLD>疾病之治療溶酶體貯積症係由溶酶體功能障礙引起之一類相對罕見之遺傳性代謝病症。溶酶體疾病之特徵在於溶酶體内積聚未消化之大分子（包括彼等酵素受質），此導致該等溶酶體之尺寸及數量增加且最終導致細胞功能障礙及臨床異常。球樣細胞性腦白質營養不良（GLD)係一種由半乳糖腦苷酶（GALC)功能缺陷引起的罕見的體染色體隱性溶酶體貯積症。GALC係可溶性溶酶體酸水解酶酵素，其將半乳糖苷基神經醯胺（一種正常的髓磷脂成份）降解為半乳糖及神經醯胺並將鞘胺醇半乳糖苷（半乳糖苷基鞘胺醇）（一種半乳糖苷基神經醢胺合成之有毒副產物）降解為半乳糖及勒胺酵。GALC缺陷在兩種相關但獨立之途徑中導致中柩及周圍神經系統（分別為CNS及PNS)之神經損傷。第一途徑導 157227.doc • 41· 201206462 致勒胺醇半乳糖苷積聚過多，並致使趙鞘生成細胞之細胞洞亡。在第二途徑t ’半乳糖苷基神經酿胺積聚並被吞噬於激活之小神經膠質細胞中，從而產生命名疾病之特徵性球樣細胞。與積聚未降解受質之其他溶酶體貯積症不同，神經組織中之總半乳糖苷基神經醯胺通常不會增加。此病症之定義性臨床特徵係中柩神經系統（CNS)變性，其導致損失或不能達成主要的發育里程碑。進行性認知衰退在癡呆及早死中達到極點。該疾病可在幼兒（早髮型 GLD)或任一年齡之個體（遲髮型GLD)中自身表現。受早髮型GLD侵襲之個體之壽命通常不會超過兩歲❶遲髮型GLd 可出現於任一年齡之個體中且可極大地改變疾病進展。本發明組合物及方法可用於有效治療患有或易患GLd之個體。本文所用之術語「治療（trea1^ treatment)」係指改善一或多種與疾病有關之症狀、預防或延遲疾病之一或多種症狀之發作及/或降低疾病之一或多種症狀之嚴重程度或頻率。GLD之症狀包括（但不限於）易怒、抽搐、精神衰退、耳聾、失明、肌陣攣發作、肌肉張力過大、發育遲緩、發育技能減退、過敏、震顫、共濟失調、痙攣狀態、發作性劇吐、腦白質營養不良、大腦萎縮、產生球樣細胞及/或脫髓勒。一般而§，在受GLd侵襲個體中經由mri觀察到之臨床異常與腦白質營養不良一致。大腦萎縮可在疾病晚期中觀察到。在一些實施例中，治療係指在GLD患者中部分或完全地緩和、改善、減緩、抑制神經損害，延遲其發作，降低其 157227.doc -42- 201206462 嚴重程度及/或發生率。本文所用之術語「神經損害」包括與中樞神經系統（例如，腦及脊髓）之損害有關之各種症狀。在一些實施例中，治療係指各種組織中之溶酶體貯積減少。在一些實施例中，治療係指腦目標組織、脊趙神經元及/或周圍目標組織中溶酶體貯積之減少。在某些實施例中，溶酶體貯積與對照相比減少約5%、10%、15%、 20% ' 25% ' 30% ' 35% ' 40% ' 45% ' 50% ' 55% ' 60% > 65% ' 70%、75% ' 80% > 85%、90%、95%、100% 或更多。在一些實施例中，溶酶體貯積與對照相比減少到至多 1/1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9 或 1/10 » 在一些實施例中，治療係指神經元（例如，含有普爾欽細胞之神經元）中之空泡形成減少。在某些實施例中，神經元中之空泡形成與對照相比減少約5%、10%、15°/〇、 20% ' 25% ' 30% ' 35% ' 40% ' 45% ' 50% > 55% ' 60% > 65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100% 或更多。在一些實施例中，空泡形成與對照相比減少到至多 1/1、1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9 或 1/10。在一些實施例中，治療係指各種組織中之GALC酵素活性提高。在一些實施例中，治療係指腦目標組織、脊髓神經元及/或周圍目標組織中之GALC酵素活性提高。在一些實施例中，GALC酵素活性與對照相比提高約5%、10%、 15% ' 20% ' 25% > 30% ' 35% ' 40% ' 45% ' 50% > 55% ' 60% ' 65% ' 70% ' 75% ' 80% ' 85% ' 90% ' 95% > 157227.doc -43- 201206462 100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、 800%、900%、1000%或更多。在一些實施例中，GALC酵素活性與對照相比提高至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6 倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些實施例中，提高的 GALC酵素活性為至少約 10 nmol/hr/mg、20 nmol/hr/mg、 40 nmol/hr/mg、50 nmol/hr/mg、60 nmol/hr/mg、70 nmol/hr/mg 、 80 nmol/hr/mg 、 90 nmol/hr/mg 、 100 nmol/hr/mg、 150 nmol/hr/mg、200 nmol/hr/mg、250 nmol/hr/mg 、300 nmol/hr/mg、350 nmol/hr/mg、400 nmol/hr/mg、450 nmol/hr/mg、500 nmol/hr/mg、550 nmol/hr/mg、600 nmol/hr/mg或更多。在一些實施例中，腰區中之GALC酵素活性提高。在一些實施例中，腰區中提高的GALC酵素活性為至少約2000 nmol/hr/mg、3000 nmol/hr/mg、4000 nmol/hr/mg、5000 nmol/hr/mg、6000 nmol/hr/mg、7000 nmol/hr/mg、8000 nmol/hr/mg、9000 nmol/hr/mg、10,000 nmol/hr/mg或更多。在一些實施例中，治療係指認知能力損失之進展減慢。在某些實施例中，認知能力損失之進展與對照相比減慢約 5% ' 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 95%、100%或更多。在一些實施例中，治療係指發育遲緩減輕。在某些實施例中，發育遲緩與對照相比減輕約 5% ' 10% > 15% > 20% ' 25% ' 30% ' 35% ' 40% ' 45% ' 50% ' 55% ' 60% ' 65% ' 70% ' 75% ' 80% ' 85% ' 90% ' 157227.doc -44- 201206462 95%、100%或更多β 在一些實施例中，治療係指存活（例如存活時間）延長。例如，治療可延長患者之預期壽命。在一些實施例中，本發明之治療可使患者之預期壽命與未經治療之患有類似疾病的一或多個對照個體之平均預期壽命相比延長超過約 5/〇、約 10%、約 15%、約 2〇%、約 25%、約、約乃％、約 40/〇、約 45%、約 5〇%、約 55%、約 6〇%、約 65〇/〇、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 9〇%、約 95%、約 100%、約 105%、約 110%、約 115%、約 12〇%、約、約 130%、約 _、約 140%、約 145%、約 15〇%、約 155%、約 16〇%、約165%、約 170%、約 175%、約 180%、約185%、約190%、約195%、約2〇〇%或更多。在_些實施例中，本發明之治療使患者之預期壽命與未經治療之類似疾病的-或多個對照個體之平均預期壽命相比延切過約6個月、约7相日 ,,7 月、約8個月、約9個月、約1〇個月、 11個月'㈣個月、約2年、約3年、約4年、約5年、：6 ^約7年、約8年、約9年、約1〇年或更長時間。在一此語「長期存、舌二：存活。本文所用之術年、50年、^ 間或預期壽命長於約4〇年、45 年55年、60年或更長時間。本文所用之術語「改良」、「於對照之值。在一此啻^“ A ㈣」表不相對如相同個體在門二宜對照係基線量測，例 (或多個對照個體 >在、篁測、或對照個體個體）在不存在本文所述治療時之「對照 157227.doc •45· 201206462 個體」係與所治療個體之年齡大致相同及/或性別相同（以確保所治療個體與對照個體之疾病階段相當）之患有gld 之個體》所治療個體（individual^亦稱作「患者」或「個體 (subject)」）係患有GLD或具有罹患GLD之可能的個體（胎兒、幼兒、兒童、少年或成人）》個體可具有殘餘内源 GALC表現及/或活性’或無可量測之活性。例如，患有 GLD之個體之GALC表現程度可為正常GALC表現程度的約 30-50。/。以下、約 25-30%以下、約 20-25%以下、約 15_20% 以下、約10-1 5%以下、約5-1〇。/。以下、約〇.1巧°/。以下。在一些實施例中，該個體係最近診斷患有該疾病之個體。通常，早期治療（診斷後盡可能快地開始治療）對於使疾病之影響最小化及使治療之益處最大化而言係至關重要的0 授舆治療劑之腦脊髓膜内投與通常藉由腰椎穿刺術（即，緩慢團注）或經由座-導管（p0rt_catheter)遞送系統（即，輸注或團注）來實施。使植入的導管連接至貯器（用於團注遞送）或輸注幫浦（植入或在外部）。導管最通常插入於腰椎板之間’且尖端向上穿過腦脊髓膜間隙至期望節段（通常為L3-L4)。儘管認為具有侵襲性，但將治療劑投與脊髓周圍之腦脊髓膜内間隙中仍然為將治療劑直接且有效地遞送跨過 BBB並遞送至下面的CSF中之最常見方式。（參見Kroin JS， Clin Pharmacokinet (1992) 22(5):319-326 ’ 其全部内容以 157227.doc •46· 201206462 引用方式併入本文中。）相對於可經靜脈内投與個體之體積，適於腦脊髓膜内投與之體積通常係治療具有CNS病因之某些疾病之特有障礙。治療劑之腦脊髓膜内遞送進一步受保持CSF組成之微妙平衡以及保持個體顱内壓所限制。例如，在人類中，治療劑之腦脊髓膜内團注遞送體積通常限於0.5-1 mL » (例如，參見Grouls RJE等人，General considerations in the formulation of drugs for spinal delivery. Spinal Drug Delivery, 第 15章。Elsevier Science(Yaksh，TL編輯）1999，其全部内容以引用方式併入本文中。）此外，沒有自個體對應移除 CSF，在人類中總腦脊髓膜内劑量體積限於小於3 mL。本發明醫藥組合物亦可用於將治療劑經腦室内遞送至個體之CNS中（即，直接投與腦室中）。腦室内遞送可經由 Ommaya氏貯器或其他類似輸液座（access p〇rt)加以促進，該貯器或其他類似輸液座可植入於位於個體頭頂部在頭皮與骨膜之間之袋狀物中，其中導引導管直接放置於腦室中。（Nutts JG等人，Neurology (2003) 60:69-73.)本發明亦涵蓋將治療劑投與小腦延趙池（cerebellomedullary cistern 或cisterna magna)之CSF中，此方式可在（例如）動物物種中使用係由於與腦脊趙膜内或腦室内投與相比在小型齧齒類動物中使用此方式後勤方便。本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）可藉由任一適當途徑投與。在一些實施例中，經靜脈内投與本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。在一些實施 157227.doc -47· 201206462 例中’經腦脊髓膜内投與本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。熟習此項技術者應瞭解，腦脊髓膜内藥物遞送可由用於腦脊髓膜内遞送之許多機構組成。在一些實施例中’腦脊髓膜内藥物遞送可由腰椎注射組成。在一些實施例中’經由腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)經腦脊髓膜内投與本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑在一些實施例中，腦脊髓膜内藥物遞送可由與大腦室内（1C V)導管流體連通之微幫浦組成。在其他實施例中，腦脊髓膜内藥物遞送可由與導管流體連通之皮下輸液座組成。在此實施例中，經由具有大腦室内（ICV)導管之腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)經腦脊髓膜内投與本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。在此實施例中，輸液座與大腦室内（ICV)導管流體連通。在一些實施例中，經由腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)經腦脊髓膜内投與本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。若需要’可同時使用一種以上途徑。本發明之水性醫藥組合物較佳以通常小於4 0 、小於 3.0 mL、小於2·5 mL、小於2 〇社、小於i 5 mL、小於ι 〇 mL j於0.5 mL或小於〇·25 mL劑量之體積投與個體。本發明之向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）係以治療有效量（即’在每隔一定時間投與時，藉由（例如）改善與疾病有關之症狀、預防該疾病或延遲其發作、及，或亦降低疾病之症狀之嚴重程度或頻率足以治療該疾病之劑量量，如上文所述）投與。本文所用之治療有效量亦稱作治 157227.doc -48· 201206462 療有效劑量或治療有效劑量量。對於疾病治療而言在治療上有效地之劑量將取決於疾病影響之性質及程度，且可藉由標準臨床技術確定。另外，可視情況採用活體外或活體内分析以有助於鑑別最佳劑量範圍。擬採用之準確劑量亦將取決於投與途徑及疾病之嚴重性，且應根據執業醫師之判斷及各患者之情況來決定。有效劑量可自得自活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推（例如，如由美國衛生及人類服務部（U.S. Department of Health and Human Services)食品與藥品管理局（Food and Drug Administration) 及藥品評價與研究中心（Center for Drug Evaluation and Research)於「Guidance for Industry: Estimating Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」,Pharmacology and Toxicology, 2005年7月中所述，其全部内容以引用方式併入本文中）。在一些實施例中，治療有效量可為（例如）約0.01-25 mg/kg、約 1-20 mg/kg、約 4-20 mg/kg、約 5-15 mg/kg、約 5-10 mg/kg體重。特定個體之有效劑量可端視個體需要隨時間而變化（例如，增加或降低）。例如，在身體性疾病或應力情況下，或若疾病症狀惡化，則可增加劑量量。端視疾病影響之性質及程度，每隔一定時間持續投與治療有效量之本發明之粗向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）。本文所用以一「間隔」投與指示週期性投與治療有效量（與一次性劑量相區分）。該間隔可藉由標準臨床技術 157227.doc • 49· 201206462 來確定。在一些實施例中，本發明之靶向治療劑（或含有其之組合物或藥劑）係兩個月一次、每月一次每月兩次、每二週一次、每兩週一次、每週一次、每週兩次、每週二次或每日一次投與。單一個體之投與間隔不一定係固定間隔，且可隨時間而變化，此端視該個體之需要而定。例如，在身體性疾病或應力情況下，或若疾病症狀惡化時’則劑量之間之間隔可縮短。在投與某些實施例之醫藥組合物後，可在目標細胞及組織（例如腦組織或CSF)中達到或檢測到其中所含之治療劑的治療濃度。在某些實施例中’在投與後（例如在醫藥組合物經腦脊趙膜内投與個體後1週、3天、48小時、36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3 小時、2小時、1小時、3〇分鐘或更短時間），醫藥組合物在個體之CNS組織及細胞中達到至少3〇 pg/mi之濃度β 視疾病影響之性質及程度，以規則間隔持續投與治療有效量之半乳糖腦皆酶（GalC) °本文所用以一「間隔」投與指示週期性投與治療有效量（與一次劑量區分）^該間隔可藉由標準臨床技術確定。在一些實施例中，治療劑係兩個月认、每月一次、每月兩次、每三週一次、每兩週一次、每週一次、每週兩次、每週三次或每曰一次投與。單一個體之投與間隔不需為固定間隔’可隨時間變化，視該個體之需要而定。例如，在身體疾病或壓力情況下，若抗-半乳糖腦苷酶（GalC)抗體存在或增加，或若疾病症狀惡化，則劑量間之間隔可縮短。 157227.doc •50· 201206462 本文所用之術語「兩個月一次」意指每兩個月投與一次 (即每兩個月一次）；術語「每月一次」意指每月投與一次，術「母二週一次」意指每三週投與一次.(即每三週一次）；術語「每兩週一次」意指每兩週投與一次（即每兩週一次）；術語「每週一次」意指每週投與一次；及術語「每日一次」意指每天投與一次。在某些實施例中’在投與個體後（例如在醫藥組合物經腦脊髓膜内投與個體後1週、3天、料小時' 36小時、24小時、18小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2 小時、1小時、30分鐘或更短時間）’該等醫藥組合物在該個體之目標組織或細胞（例如腦組織或神經元）中達到至少 50 pg/m卜至少 45 pg/ml、至少 40 pg/m卜至少 35 μβ/ιη1 至少 30 pg/m卜 25 pg/nd、20 pg/m卜至少 15 pg/ml、至少 10 pg/m卜至少7.5 pg/m卜至少5 Mg/m卜至少2 5 、至少1_0 Mg/ml或至少0.5 pg/ml之濃度。在某些實施例令，醫藥組合物中之治療劑之濃度為至少100 mg/mL、至少％ mg/mL ' 至少 i() mg/mL、至少 5 mg/mL、至少 2 5 叫/虹、至少1 mg/mL或小於1 mg/mL ^較佳地，該治療劑可溶於本發明醫藥組合物中。較佳地’本發明醫藥組合物在長時

mg/mL、至少 90 mg/mL mg/mL、至少 70 mg/mL mg/mL、至少 55 mg/mL mg/mL、至少 40 mg/mL mg/mL、至少 25 mg/mL 至少80 mg/mL、至少75 至少65 mg/mL、至少6〇至少50 mg/mL、至少45 至少35 mg/mL、至少3〇至少20 mg/mL、至少I〗 157227.doc -51· 201206462 間内保持穩定（例如，在室溫下或另一選擇為在4_8〇c之冷束條件下穩定至少12個月）》儘管已根據某些實施例詳細闡述了本文所述之某些化合物、組合物及方法，但以下實例僅用於闡釋本發明化合物且不意欲對其進行限制。醫藥組合物係以治療有效量（即，在每隔一定時間投與時，藉由（例如）改善與疾病有關之症狀、預防該疾病或延遲其發作、及/或亦降低疾病之症狀之嚴重程度或頻率足以治療該疾病之劑量量，如上文所述）投與。本文所用之治療有效量亦稱作治療有效劑量或治療有效劑量量。對於疾病治療而言在治療上有效地之劑量將取決於疾病影響之性質及程度，且可藉由標準臨床技術確定。另外，可視情況採用活體外或活體内分析以有助於鑑別最佳劑量範圍，例如彼等在下文中例示者。擬採用之準確劑量亦將取決於投與途徑及疾病之嚴重性，且應根據執業醫師之判斷及各患者之情況來決定。例如，在一些實施例中，半乳糖腦苷酶（GalC)之靜脈内投與治療有效量為半乳糖腦苷酶（Gaic) 之腦脊髓膜内投與治療有效量的約15倍、約2倍約2 5 倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約以倍、約5 倍、約5.5倍、約6倍、約6.5倍、約7倍、約7 5倍、約8 倍、約8.5倍、約9倍、約9·5倍、約1〇倍或更多倍。有效劑量可自得自活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推（例如，如由美國衛生及人類服務部（us以叫恤如〇f Health and Human Services)食品與藥品管理局（F〇〇d and 157227.doc •52· 201206462

Drug Administration)及藥品評價與研究中心（Center for Drug Evaluation and Research)於「Guidance for Industry:

Estimating Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers」， Pharmacology and Toxicology, 2005 年 7 月中戶斤述，其全内容以引用方式併入本文中）。在一些實施例中，治療有效量可為（例如）大於約0_01 mg/kg體重、大於約0.05 mg/kg體重、大於約0.1 mg/kg體重、大於約0.5 mg/kg體重、大於約1.0 mg/kg體重、大於約1.5 mg/kg體重、大於約2.0 mg/kg體重、大於約2.5 mg/kg體重、大於約5.0 mg/kg體重、大於約7.5 mg/kg體重、大於約10 mg/kg體重、大於約12.5 mg/kg體重、大於約15 mg/kg體重、大於約17.5 mg/kg體重、大於約20 mg/kg體重、大於約22.5 mg/kg體重或大於約25 mg/kg體重。在一些實施例中，治療有效量可為約0.01-25 mg/kg體重、約 0.01-20 mg/kg體重、約 0.01-15 mg/kg體重、約 0.Ol-iO mg/kg體重、約 0.01-7.5 mg/kg體重、約0.01-5 mg/kg體重、約0.01-4 mg/kg體重、約0.01-3 mg/kg體重、約0.01-2 mg/kg體重、約 0.01-1.5 mg/kg體重、約 0.01-1.0 mg/kg體重、約0.01-0.5 mg/kg體重、約0.01-0.1 mg/kg體重、約 1-20 mg/kg體重、約4-20 mg/kg體重、約5-15 mg/kg體重、約5-10 mg/kg體重。在一些實施例中，治療有效量係約 0.01 mg/kg體重、約0.05 mg/kg體重、約0.1 mg/kg體重、約0.2 mg/kg體重、約0.3 mg/kg體重、約0.4 mg/kg體重、 157227.doc -53- 201206462 約0.5 mg/kg體重、約0.6 mg/kg體重、約0.7 mg/kg體重、約0.8 mg/kg體重、約0.9 mg/kg體重、約1.0 mg/kg體重、約 1.1 mg/kg體重、約 1.2 mg/kg體重、約 1·3 mg/kg、約 1.4 mg/kg體重、約1.5 mg/kg體重、約1.6 mg/kg體重、約1.7 mg/kg體重、約1.8 mg/kg體重、約1.9 mg/kg體重、約2.0 mg/kg體重、約2.5 mg/kg體重、約3.0 mg/kg體重、約4.0 mg/kg體重、約5.0 mg/kg體重、約6.0 mg/kg體重、約7.0 mg/kg體重、約8.0 mg/kg體重、約9.0 mg/kg體重、約 10.0 mg/kg體重、約11.0 mg/kg體重、約12.0 mg/kg體重、約 13.0 mg/kg體重、約 14.0 mg/kg體重、約 15.0 mg/kg體重、約 16.0 mg/kg體重、約 17·0 mg/kg體重、約 18.0 mg/kg體重、約19.0 mg/kg體重、約20.0 mg/kg體重或更高。在一些實施例中，治療有效量不大於約30 mg/kg、不大於約20 mg/kg、不大於約15 mg/kg、不大於約1 〇 mg/kg、不大於約 7.5 mg/kg、不大於約5 mg/kg、不大於約4 mg/kg、不大於約3 mg/kg、不大於約2 mg/kg或不大於約1 mg/kg體重或更 /Jn 〇特定個體之有效劑量可端視個體需要隨時間而變化（如’增加或降低）。例如，在身體性疾病或應力情況下或若抗-半乳糖腦㈣（Galc)抗體存在或增加，或若疾心狀惡化，則可增加劑量量。初ΐ二：Γ中’可在療程開始時給予負荷劑量(例如 (例如，後續姑“I 物隨後投與降低之維持劑i 後續較低㈣）之治療组合物。不㈣受限於㈣ 157227.doc •54· 201206462 理論，預計負荷劑量會消除脂肪物質在組織中（例如，在肝中）之初始及（通常）大量積聚，且維持劑量可防止初始消除後脂肪物質之累積。應瞭解，治療之負荷劑量及維持劑量量、間隔及持續時間可藉由任一可用方法來確定，例如彼等在本文中例示者及彼等在業内已知者。在一些實施例中，負荷劑量量為約 0.01至1 mg/kg體重、約0_01至5 mg/kg體重、約〇〇1至1〇 mg/kg體重、約（^至^ mg/kg體重、約〇1至2〇體重、約0.1至25 mg/kg體重、約〇.1至30 mg/kg體重、約〇1 至5 mg/kg體重、約〇.1至2 mg/kg體重、約〇.1至1 mg/kg體重或約0.1至0_5 mg/kg體重。在一些實施例中，維持劑量量為約0至10 mg/kg體重、約〇至5 mg/kg體重、約〇至2 mg/kg體重、約〇至1 mg/kg體重、約〇至〇 5 mg/kg體重約〇至 0.4 mg/kg體重、約〇至〇.3 mg/kg體重、約〇至〇2 mg/kg 體重、約0至0.1 mg/kg體重《在一些實施例中，每隔一定時間向個體投與負荷劑量，在給定時間（例如，1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月）内及/或以給定給藥次數（例如，給藥1、2、3、4、5、ό、7、8、 9、10、15、2〇、25'3〇或更多次）每隔一定時間向個體投與負荷劑量’隨後投與維持劑量。在一些實施例中，維持劑量之範圍為0至2 mg/kg體重、約。至^ mg/kg體重、約〇至 1·〇 mg/kg體重、約〇至〇_75 mg/kg體重、約〇至〇 5 mg/kg 體重、約0至0.4 mg/kg體重、約〇至〇·3 mg/kg體重、約〇至 0.2 mg/kg體重或約〇至(M mg/kg體重。在一些實施例中， 157227.doc •55- 201206462 維持劑量為約 o.oi、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5 ' 0.6、0.7、0.8 ' 0.9、1.0、1.2、1.4、 1.6、1.8或2.0 mg/kg體重。在一些實施例中，經1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12個月或更多個月投與維持劑量。在一些實施例中，經1、2、3、4、5、6、7、8、 9、1 0年或更多年投與維持劑量。在一些實施例中，無限期（例如，終生）投與維持劑量。本文所用之術語「組合療法」係指在重疊方案中投與兩種或更多種不同醫藥劑從而使個體同時暴露於兩種藥劑之情形。可單獨或結合其他藥劑投與半乳糖腦苷酶（GalC)(或含有半乳糖腦苷酶（GalC)之組合物或藥劑），該等藥劑係例如抗阻胺藥（例如，苯海拉明（diphenhydramine))或免疫抑制劑（例如，考布他汀（combretastatin) A-4、黴紛酸、喷司他丁（pentostatin)、奈拉濱（nelarabine)或米托蒽醒 (mitoxantrone))或抵抗抗半乳糖腦苷酶（GalC)抗體之其他免疫治療劑。熟習此項技術者已知之任一免疫抑制劑可與本發明之組合療法一起使用。該等免疫抑制劑包括（但不限於）環孢菌素（cyclosporine)、FK506、雷帕黴素（rapamycin)、CTLA4-Ig、及諸如依那西普（etanercept)等抗TNF劑（例如，參見 Moder, 2000, Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 280-284 ； Nevins，2000，Curr_ Opin· Pediatr. 12，146-150 ; Kurlberg等人，2000, Scand. J. Immunol. 51，224-230 ; Ideguchi 等人，2000，Neuroscience 95，217-226 ; Potter等人，1999, 157227.doc -56- 201206462

Ann. N.Y. Acad. Sci. 875，159-174 ; Slavik等人，1999, Immunol. Res. 19，1-24 ; Gaziev等人，1999, Bone Marro^ Transplant. 25，689-696 ; Henry，1999，Clin. Transplant. 13, 209-220 ; Gummert等人，1999，J. Am. Soc. Nephrol. l〇, 1366-1380 ; Qi 等人，2000，Transplantation 69，1275-1283)。抗IL2受體（a亞單位）抗體達珠單抗（daclizumab)(例如赛尼派TM. (Zenapax.TM.))已證實可有效用於移植患者中，其亦可用作免疫抑制劑（例如，參見Wiseman等人， 1999，Drugs 58, 1029-1042 ; Beniaminovitz等人，2000，Ν· Engl J. Med. 342, 613-619 ; Ponticelli等人，1999，Drugs R. D. 1，55-60 ; Berard等人，1999, Pharmacotherapy 19, 1127-1137 ; Eckhoff等人，2000，Transplantation 69，1867-1872 ; Ekberg等人，2000，Transpl. Int. 13, 151-159)。額外免疫抑制劑包括（但不限於）抗CD2(Branco等人，1999, Transplantation 68, 1588-1596 ; Przepiorka 等人，1998,

Blood 92, 4066-4071)、抗 CD4(Marinova-Mutafchieva 等人，2000, Arthritis Rheum. 43，638-644 ; Fishwild等人， 1999，Clin. Immunol. 92，138-152)、及抗 CD40 配體（Hong 等人，2000，Semin. Nephrol. 20，108-125 ; Chirmule 等人，2000，J. Virol. 74，3345-3352 ; Ito 等人，2000，】· Immunol. 164，1230-1235)。術語「與...結合」表示藥劑在半乳糖腦苷酶（GalC)(或含有半乳糖腦苷酶（GalC)之組合物）之前、大致同時或之後投與。例如，可將藥劑混合至含有半乳糖腦苷酶（GalC)之組 157227.doc -57- 201206462 合物中，且由此與半乳糖腦苷酶（GalC)同時投與；另一選擇為，可在並不混合之情形下同時投與藥劑（例如，藉由在投與半乳糖腦苷酶（GalC)之靜脈管線上亦「附帶」遞送藥劑’或反之亦然）。在另一實例中，可單獨（例如，不混合）但在投與半乳糖腦苷酶（GalC)後短時間範圍内（例如，在24小時内）投與藥劑。在一些實施例中，結合經設計以減小抗半乳糖腦苷酶（GalC)抗體之量或預防其產生之免疫抑制或免疫治療方案來投與半乳糖腦苷酶（Galc)(或含有半乳糖腦苷酶（GalC)之組合物）。例如，可使用與彼等用於血友病患者中之方案（Nilsson等人（1988) N. Engl. J. Med” 3 18:947-50)類似之方案來減少抗半乳糖腦苷酶（Galc)抗體。此一方案可用於具有抗半乳糖腦苷酶（Galc)抗體或處於具有抗半乳糖腦苷酶（GalC)抗體之風險中的個體中。在一些實施例中，免疫抑制或免疫治療方案開始於首次投與半乳糖腦苷酶（GalC)之前以將抗半乳糖腦苷酶（Galc)抗體之可能性降至最低。熟習此項技術者已知之免疫抑制劑的任一組合皆可與本發明組合療法一起使用。套組本發明提供套組或其他製品，其含有本發明調配物並提供調配物復原（若凍乾）及/或使用之說明。套組或其他製品可包括容器。適宜容器包括（例如）瓶子、小瓶及注射器。容器可自諸如玻璃或塑膠等各種材料形成。容器可容納調配物，且位於容器上或與其連接之標籤可指示復原及/或使用之說明。例如，標籤可指示將調配物復原至上述蛋白 157227.doc •58· 201206462 質濃度。標籤可進一步指示調配物可用於或意欲用於（例如）it投與。容納調配物之容器可為多用途小瓶，該多用途小瓶容許重複投與（例如，投與2_6次）調配物。套組或其他製品可進一步包括含有適宜稀釋劑（例如，Bwfi)之第二容器。將稀釋劑及調配物混合後，復原調配物中之最終蛋白質濃度通常為至少25 mg/ml(例如，至少25 mg/ml、至少 50 mg/ml 至 J 75 mg/ml、至少 1〇〇 mg/mi)。套組或其他製品可進-步包括自商業及使用者角度考慮合宜之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器、及具有使用說明之包裝插頁。藉由參照下列實例來更全面地理解本發明。然而，該等實例不應解釋為限制本發明範圍。所有文獻引文皆以引用方式併入本文中。應瞭解，在本文說明書及申請專利範圍中使用之冠詞「一（a及an)」除非明確指示相反情形，否則包括複數個指示物。除非上下文中指示相反情形或另有說明，否則若一個、一個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關，則可認為在群組的-或夕個成員間包括「或^的技術方案或說明係適合表述該情形的。本發明包括其中恰好只有—個群組成員存在於、用於給定產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。本發明亦包括其中"'個以上或所有的群組成員皆存在於、用於給疋產物或過程或與給定產物或過程相關的實施例。此外’應瞭解’除非另有說明或除非對熟習此項技術者而言 157227.doc •59- 201206462 矛盾或不一致係顯而易見的，否則本發明涵蓋其中將一或多項所列技術方案之一或多種限制、要素、條款、說明：術語等引入附屬於相同基礎技術方案(或任一其他相關技術方案）之另一技術方案中的所有變化、組合及置換。倘若以列表形式（例如’以馬庫西群組（Markush抑叫）或類似格式）給出要素，則應瞭解，本發明亦揭示每個要素亞組並且可自該群組中移除任何要素。應瞭解，通常，倘若稱本發明或本發明之態樣包含特定要素、特徵等，則本發明之某些實施例或本發明之態樣由該等要素、特徵等組成或主要由其組成。為簡潔起見，在本文中未以過多語言具體陳述該等實施例之每一情形。亦應瞭解，可自申請專利範圍中明確排除本發明之任一實施例或態樣，不管在說明書中是否敍述該特定排除。在本文中提及以闡述本發明之彦景及it供關於本發明實施之額外細節的出版物、網站及其他參考材料以引用方式併入本文中。實例實例1 :用於腦脊髄膜内及大滕室内導管遞送之GaiC調配物本實例闡述用以評定經由具有大腦室内（ICV)導管之腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)引入之Gale在食蟹猴種群中之相容性及恢復的研究。

本實例尤其闡述用於在食蟹猴中成功CSF遞送GalC之 GalC調配物。在一些實施例中，該調配物包括5 mM磷酸鈉（pH 6.3)與150 mM氣化鈉、1%蔗糖及0.005%聚山梨醇酯 20。在一些實施例中，該調配物包括5 mM磷酸鈉+150 mM 157227.doc •60· 201206462

NaCl (pH 6.0)。材料及方法研究設計對於此研究而言，使用無菌塑膠可棄式注射器將藥品注射至IDDD中。在研究開始前用磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)沖洗座及導管。將0.6 mL 3 mg/mL或30 mg/mL經過濾藥品注射至座及ICV導管中。在注射藥物後用〇·5 mL PBS沖洗。再用4份1.0 mL PBS等分試樣沖洗座與導管二者。在每次注射/沖洗後自導管採集試樣並使用A28Q及比活性加以分析。結果展示於表4中。表4自具有ICV導管之IDDD之GalC恢復表4a.非臨床研究設計-單次沖洗試樣濃度(mg/mL) 恢復(以總質量(mg)計）恢復(以總活性(U)計） 30 87 土 7% 99±14% 3 86±1% 96±3% 表4b.利用額外沖洗之恢復試樣濃度(mg/mL) 恢復(以總質量(mg)計）恢復(以總活性(U)計） 30 89±7% 102±12% 3 89 土 1% 98±2% 對於IDDD(座及ICV導管）而言，存在約0.7 mL滯留體積。 157227.doc -61 · 201206462 實例2:用於腦脊髄膜内遞送之GalC調配物的生理化學表徵本實例闡述GalC之生理化學表徵，其經實施以瞭解其在蛋白質之腦脊髓膜内（IT)遞送期間在不同溶液條件下之狀況及穩定性。本實例尤其闡述用於成功IT遞送GalC之GalC調配物β在一些實施例中，該調配物包括5 mM磷酸鈉+150 mM NaC卜pH 6.0 + 0.005%聚山梨醇酯20。在一些實施例中，該調配物包括<5 mM、<10 mM、<15 mM及<20 mM填酸鈉。在一些實施例中，該調配物包括150 mM NaCl，pH 2 5.5且pH $ 7.0。在成年食蟹猴中測試具有不同磷酸鹽體積莫耳濃度及pH 之PBS遞送媒劑（圖1)。在猴子中，5 mM磷酸鹽pH介於5.5-7·〇範圍内未顯示不良效應，而20 mM磷酸鹽pH介於7.0-7.5之間及1〇_20 mM磷酸鹽pH介於7.5-8.0之間顯示不良效應（圖 1)。研究 hGalC (lmg/ml)在含有 50 mM NaCl之 3 mM 檸檬酸鹽、磷酸鹽及硼酸鹽緩衝劑中之熱穩定性隨pH(在卩^15.0-8.0範圍内）之變化（圖2)。在基線（2〇-25。(：）及在40它下2週時量測1!(3&1(：比活性，其中在pH 6〇65下保持最高比活性（圖2A)。另外，在5°C下3個月時量測hGalC比活性’其中在pH 6.0-6.5下保持最高比活性（圖2B)。量測 hGalc之溶化溫度隨pH之變化（表5)，並且在不同調配物中獨立地進行量測（表6)。 157227.doc •62· 201206462

表5 hGalC (lmg/mL)之熔化溫度隨pH之變化通用緩衝劑之pH Tm (°〇 4.5* 61.6 5.0* 63.0 6.0 60.8 6.5 58.9 7.0 57.3 7.5 56.5 由於沉澱，[GalC]小於1 mg/mL 表6 hGalC (1 mg/mL)在不同調配物中之熔化溫度調配物(pH 6.0) Tm (°〇 5 mM磷酸鹽，50 mMNaCl 61.6 5mM 磷酸鹽，150mMNaCl 60.2 5mM麟酸鹽，500mMNaCl 59.5 5 mM鱗酸鹽，5%右旋糖 63.8 5mM磷酸鹽，150mMNaCl，l%NaTC 56.8 亦評價hGalC之熱穩定性隨鹽濃度之變化（圖3)，如藉由在5°C下約3週時及在40°C下2週時hGalC比活性之保留所測定。結果顯示，在pH 6.5下在介於5 mM磷酸鹽+50 mM NaCl(本文中縮寫為5 + 50)至50 mM磷酸鹽+150 mM NaCl(本文中縮寫為50+150)範圍内之多種鹽濃度下，在 5°C下3週後hGalC保留較高比活性（圖3)。 hGalC之沉降分析沉降速度係量測分子響應離心機中所產生之離心力移動之速率的分析型超速離心（AUC)方法，且為用於測定溶液 157227.doc -63- 201206462 中蛋白質締合狀態之有用技術。第一沉降速度實驗係人類 GalC在含有150 mM NaCl之5 mM磷酸鈉（pH 6.0)中之稀釋系列（圖4B)，以針對自締合及/或非理想狀態對試樣進行評定。以每一濃度下之正規化g(s*)曲線（g(s*)對s*)對稀釋系列作圖。稀釋後曲線通常移位至較低s值表明發生解離，且此為快速可逆之自締合系統。比較不同離子強度（圖 4A、B及C)，很明顯’提高離子強度後各組曲線移位至較低s值，此表明在締合過程中亦涉及離子相互作用且在較高鹽濃度下自締合減少。亦同時在150 mM NaCl下測試小鼠GalC以與hGalC進行比較。比較對應離子強度（150 mM NaCl)，很明顯， mGalC之自締合自由能小於hGalC。將圖4中之曲線截止在約20S以更清楚地顯示解離；然而，當使用寬分佈分析 (WDA)來分析該等實驗且以對數尺度對結果作圖時，可清楚地看到較高聚集體（s*>20S)。在pH 6_0下，聚集成較高低聚體（圖5)在50 mM NaCl下尤其明顯，在1〇 mM NaC1下稍微減少且在500 mM NaCl下顯著減少（但仍存在）。每一離子強度下最高濃度之WDA曲線繪製於圖5中。 pH 6.0下通用緩衝劑中之自締合

如在圖6中所見，在該等條件下於通用緩衝劑中，自締合似乎與在磷酸鹽緩衝劑（pH 6.0)中處於大致相同的數量級°亦研究pH對通用緩衝劑中hGalC自締合之能量學的影響。在pH 4.5、5.0、0.0、6.5、7.0及7.5下實施稀釋系列實驗。試樣在pH 4.5及5.0下不溶解’基本上1〇〇%的hGalC 157227.doc -64- 201206462 沉殿出來使得上清液中未留下可量測之試樣β pH之影響清楚地顯示於圖7中，其中在ρΗ 7.5下觀察到最少量之自締合且在pH 6.0下觀察到相當多之自締合。此趨勢與較高pH下離子強度變化時所見之趨勢類似。在最高濃度（全部約1.0 mg/mL)下，提高離子強度及pH使平衡偏移得有利於較小低聚體。藉由1/3系列稀釋來降低濃度（參見圖4)使得平衡偏移朝向最小物質，其似乎具有約5 28之沉降係數。在約1〇·13S處出現之峰可能為5S物質之四聚體。將該等數據擬合至自締合模型之努力迄今未獲得成功’且此可能係因為由糖基化程度可變而造成之固有的微觀不均' 性。 pH 6t〇下通用缓衝劑中之自締合在稀釋系列實驗中比較存於5 mM麟酸鈉（pH 6.0)以及 150 mM NaCl中之應力（stressed)及基線GalC試樣（紅色+藍色+綠色+黑色）（圖8)。最低濃度（黑色）約〇.03 mg/mL之結果已經平滑，因此該曲線看起來具有較少雜訊。在應力試樣中’在ln(s*)=3.0(約20S)附近存在聚集體，相比於基線試樣其在較高濃度下存在。其佔試樣之份額近乎恆定，如藉由稀釋後正規化圖示中其持久性所證實（圖9)。因此，其為不可逆之聚集體，且莫耳質量為至少5〇〇 kg/m〇i。 hGalC與牛磺膽酸鈉溶液在牛磺膽酸鈉（NaTC) (1%)中，自締合顯著減少。主邊界（main boundary)移位至較低s值且較高之低聚反應得以抑制（圖10)。 157227.doc -65 - 201206462 hGalC與5%右旋糖向存於5 mM磷酸鈉（pH 6.0)中之GalC中添加5%右旋糖導致形成大的聚集體（圖11)。18S處的峰對應於約440 kDa之最小莫耳質量且56S處的峰對應於2.4 MDa之最小莫耳質量，而延伸超過150S之尾部則對應於大於10.0 MDa之莫耳質量。自1 _0 mg/mL稀釋至0.3 mg/mL後該圖案之變化非常小，此表明該等低聚體在沉降實驗之時標上（為期5至6小時）大部分不可逆。 hGalC固有螢光實施hGalC之固有螢光研究（使用23 Trp)以評價pH及鹽濃度對分子相互作用之作用（圖12)。在500 mM NaCl或1% NaTC下分子相互作用最小（最高相對螢光出現於330 nm-3 50 nm)(圖12A)。觀察到隨pH變化二級結構有較小變化。在pH 4.5及5.0下觀察到沉澱（圖12B)。概述利用聚乙二醇（PEG)誘導之固相途徑（Middaugh等人，J. Biol. Chem. 1979, 254, 367-370)來評價 hGalC 及 mGalC 之相對溶解度。該途徑容許以可計量方式來量測蛋白質之相對溶解度。藉由將各GalC之緩衝溶液（5 mM磷酸鈉與150 mM NaC卜pH 6.0)引入不同濃度之PEG (10kDa)中來實施溶解度量測。以log蛋白質溶解度對PEG濃度作圖產生線性趨勢。將表觀溶解度外推至零PEG濃度以獲得各蛋白質之相對溶解度。mGalC對hGalC之相對溶解度未顯示任何差異。在hGalC之溶解度實驗中，在2-8°C下3週後未觀察到 157227.doc -66- 201206462 沉澱或活性損失（在5 mM磷酸鈉與不同鹽濃度下，pH 6.〇_ 6.5)。使用調配物5 mM填酸納+150 mM NaCl (pH 6.0)達到約30 mg/mL之溶解度，且在2-8°C下50天後未觀察到沉澱。 AUC數據表明，GalC之「天然」狀態以濃度依賴方式可逆締合成較高級低聚體（higher order oligomer)。生物物理數據表明，較高級低聚體可能具有功能及結構重要性。如藉由AUC所測定，在較高pH值下，保留較少活性，具有較低Tm值且系統更均質。在5 mM磷酸鈉與150 mM NaCl (pH 6.0)下，可能在單體、四聚體與其他較高級物質間達成平衡。此外，在6.5-7.5之pH範圍内pH並未顯著影響AUC曲線。總之，該GalC系統在所測試緩衝劑中係快速可逆之高度自締合系統。實例3:在單次腦脊趙膜内給予或單次靜脈内團注^夏一 hGALC後Sprague-Dawley大鼠中放射性之藥物代謝動力學及組織分佈本實例繪示實例性結果，其展示單次腦脊髓膜内給藥或單次靜脈内團注後雄性Sprague-Dawley大鼠中125I-hGALC 之藥物代謝動力學及組織分佈。量測全血、血清、紅血球、腦脊髓液（CSF)及組織中放射性之濃度及含量，並對所得數據實施非房室藥物代謝動力學分析。選擇腦脊髓膜内及靜脈内途徑，此乃因其為人類之擬定投與途徑。基於潛在之人類暴露、現有毒性及藥物代謝動力學數據及測試物質所施加之任何限制來選擇劑量量。選擇大鼠來實施研 157227.doc •67· 201206462 究’此乃因大鼠係公認的用於藥物代謝動力學及組織分佈研究之物種。材料及方法測試系統自 Charles River Canada公司（St. Constant，Quebec, Canada) 收到82隻雄性Sprague-Dawley大鼠（褐家鼠（Rattus norvegicus))。治療開始時，動物為約i〇_n週齡。自 Charles River Canada收到另外9隻雄性大鼠；該等動物在到達時約9週齡且需要該等動物來確保足量插管動物可以利用以完成給藥研究。治療開始時雄性大鼠之體重介於342 g至453 g範圍内。除一隻雄性大鼠外，實施給藥時所有其他雄性大鼠之體重均高於方案中所規定之範圍（250_350 g)，然而並不認為此微小偏離會影響研究或所獲得之數據，因為該等動物健康且使用實際體重來實施劑量投與。動物管控到達PCS-MTL後，由有資格的獸醫人員成員對所有動物進行全面的體格檢查。在收到的動物中未檢測到顯著異常。將動物單獨圈養在具有金屬絲網底板及自動注水閥之不銹鋼籠子中。按照合適的S0P來實施環境豐富化程序。每只籠子使用指明研究、群組、動物編號及性別之色彩代碼籠卡清楚地加以標注。研究進行期間之環境條件控制在目標溫度及相對濕度，分別為19〇c至25它及3〇%至7〇%。除因預定活動而中斷外，光週期為12小時光及12小時暗。 157227.doc • 68 - 201206462 飼料除指定程序期間以外，所有動物自由獲取標準經鑒定的丸狀市售實驗室飼料（經PMI鑒定之齧齒類動物飼料（PMI Certified Rodent Diet) 5002: PMI Nutrition International公司）。控制飼料中污染物（例如，重金屬、黃曲毒素 (aflatoxin)、有機鱗酸鹽、氣化烴、PCB)之最大允許濃度，並由製造商定期進行分析。除指定程序期間以外，動物隨意獲取適於人類消耗之市政自來水（通過0.5 μιη抑菌性聚碳酸酯過濾器加以過濾）。吾人認為在飼料材料中不存在可能干擾研究目的之習知污染物。適應環境及隨機化在動物的接收與實施手術以放置腦脊髓膜内插管之間間隔至少6天或3天以容許動物適應身體及環境條件。在適應環境期間，給所有動物稱重並使用基於電腦之隨機化程序實施隨機化。隨機化係在使用體重作為參數分層之後實施。體重為體重範圍端點之動物不分配至群組中。如下將動物分配至研究群組中：群組編號投與途徑及劑量計劃的劑量體積動物編號靜脈内靜脈内靜脈内 (mL/kg) 腦脊髓膜内 (mL) 雄性 1 - 60 pg - 0.02 1001-1024 2 1 mg/kg - 3.33 - 2001-2024 3a 1 mg/kg 60 pg 333 0.02 3001-3024 a: IV劑量係在腦脊髓膜内劑量後5分鐘内投與。 157227.doc •69- 201206462 群組1及2令之每隻大鼠接受約3 μ(：ί/動物之標稱放射化學劑量。群組3中之每隻大鼠接受約6 pCi/動物之標稱放射化學劑量。腦脊髓膜内劑量調配物腦脊趙膜内劑量調配物係在第一次投與腦脊魏膜内劑量當天製備。量出足量125I-hGALC溶液，並添加至量出的足量未經標記hGALC溶液中。添加量出的一定體積的媒劑並整體輕輕混合。製備目標放射性含量為約15〇 pCi/mL之3 mg/mL濃度之/容液。將所得調配物通過低蛋白質結合過滤器（0.22 μιη GV PVDF過濾器單元）過濾至無菌容器中，並在用於給藥之前冷凍（2_8。〇避光保存。靜脈内劑量調配物靜脈内劑量調配物係在第一次投與靜脈内劑量當天製備。量出足量125I-hGALC溶液，並添加至量出的足量未經標記hGALC溶液中。添加量出的—定體積的媒劑並整體輕輕混合。製備目標放射性含量為約3 pCi/mLi 〇 3 mg/mL /農度之/合液。將所得調配物通過低蛋白質結合過濾器（〇 22 μπι GV PVDF過滤器單元）過瀘至無菌容器中，並在用於給藥之前冷凍（2-8。〇避光保存。劑量調配物之分析在PCS-MTL在每一給藥之日藉由液體閃燦光譜來分析每 ’玉放射‘记的劑量調配物以測定治療之前及之後的放射性濃度藉由在媒劑令製備劑量調配物之合適稀釋物來測定放射11;農度’並對每—稀釋之兩份相同等分試樣進行分 157227.doc 201206462 析。完成分析（包括重複分析）後’棄除剩餘的劑量調配物0 計算測試物質之比活性劑量調配物中測試物質之比活性係自量測之平均放射性含量（在給藥之前及之後）及劑量調配物中測試物質之總質量（基於提供之濃度）來計算。臨床觀察在整個適應環境及研究階段，除到達及研究結束之日外 (在到達及研究結束之日僅檢查動物一次），每天針對死亡率及不健康體徵以及治療反應檢查所有動物兩次。每週實施一次詳細檢查。體重在適應環境期間、手術之前及劑量投與前一天量測一次個體體重。僅報告劑量投與前一天記錄之體重。手術在動物的接收與實施手術之間間隔最少6天（或對於另外 9隻動物為3天）以容許動物適應實驗室環境條件。在手術當天及再次在手術後兩天’所有動物（包括備用動物）接受單二人肌内注射节星青徽素G (Benzathine Penicillin G)加上普魯卡因青黴素G (Procaine Penicillin G)抗生素。通常，在手術之前及第一次投與後約8小時以及此後認為需要時經皮下投與 0.05 mg/kg丁丙諾,（BUprenorphine)。對於一些動物’丁丙諾啡係在第一次投與後約6小時而非8_12小時投與。藉由自顱骨至頸之胸背區給動物剃毛為手術作準 157227.doc -71· 201206462 備。在手術之前將動物用異氟醚/氧氣麻醉，且在整個手術程序期間保持在異氟醚氣體麻醉下。在手術之前及在手術程序結束時，同時在麻醉下，向每一隻眼投與溫和的潤滑性眼用藥劑（ophthalmic agent)。在手術之前及在第一次投與後間隔約24小時之另外兩個時間，每隻動物經皮下注射接受消炎藥（5 mg/kg卡洛芬（Carprofen))。將動物放置於立體定位桌（stere〇taxic table)内。自顧骨之後部邊緣至頸產生約2 cm之皮膚切口。將背部頸肌分開以暴露環枕膜。使用牽開器以有助於接近該膜。切開環枕膜’並緩慢地朝向尾部插入腦脊髓膜内導管，直至導管位於腰區中。像用棉頭拭子移除過量的流體，並乾燥環枕膜。隨後立即使用黏合劑將導管球囊（catheter bulb)銷定在膜上。在膠乾燥且導管穩固地錨定後，移除牵開器。用導管在顱骨上作一小迴路’並使用由不能吸收材料製成之縫線附接上球囊。在穩固導管後，使其通過背部胸區，背部胸區中有切口以放置輸液座。使用不能吸收的材料原位縫合。在縫合頸肌之前，用2 mL溫鹽水（即約37.5。〇沖洗傷口。使用可吸收材料利用單純間斷縫合來縫合肌肉。用2 mL溫鹽水沖洗輸液座位點，並使用可吸收縫合材料利用連續皮内縫合來縫合皮膚。在手術後向手術位點投與局部抗生素軟膏，且此後每天投與一次直至認為不需要》在手術時測定導管及輸液座之死體積。在治療前階段期間在手術之日與治療之日之間實施一次開放性檢查 157227.doc •72· 201206462 (patency check) ° 洛# 導管/輸液座植入手術與開始治療之間間隔至少7天以容許充分恢復。在腦脊髓膜内給藥之前，將輸液座部位剃毛 (右需要）。使用葡萄糖酸氣己定（chi〇rhexidine gluconate) 及水清洗穿刺位點，並使用無菌水浸泡紗布擦拭位點，隨後使10%聚維酮蛾（povidone iodine)通過3次。用連接至給藥注射器之針穿刺輸液座’並緩慢投與測試物質。給藥後，用碘擦拭該位點以限制污染。在研究第1天，向群組1動物投與調配之i25〗_hGALC，其藉由經腦脊趙膜内緩慢團注至皮下腰部輸液座，隨後用 0.04 mL鹽水沖洗來遞送60 pg/動物之目標劑量量及約 3 μ(：ί/動物之放射性劑量。在研究第2天’向群組3動物投與調配之I25i_hGALC，其藉由經腦脊髓膜内緩慢團注至皮下腰部輸液座，隨後用 0.04 mL鹽水沖洗來遞送60 pg/動物之目標劑量量及約3 μ〇ί/動物之放射性劑量。在經腦脊髓膜内緩慢團注後5分鐘内，群組3動物亦接受靜脈内注射，其經由靜脈内導管注射至尾部靜脈中（3.33 mL/kg)，隨後用0.6 mL鹽水沖洗以遞送1 mg/kg之目標劑量量與3 μ(：ΐ/動物之合適放射性含量。在研究第3天，向群組2動物投與調配之125i_hGALC，其藉由經由靜脈内導管靜脈内注射至尾部靜脈中（3.33 mL/kg) ’隨後用0.6 mL鹽水沖洗以遞送1 mg/kg動物之目 157227.doc -73- 201206462 標劑量量及約3 μ〇Μ/動物之放射性劑量。投與翘積係基於每隻動物最近之實際體重《記錄裝滿調配之125I-hGALC及遞送至動物後騰空之注射器的重量。基於自注射器排出之劑量調配物之淨重量及量測之調配劑量中的放射性濃度來計算遞送至每隻動物之劑量。給藥期間，使用紗布來吸收任何少量劑量調配物回流，並按照項目特定程序藉由液體閃燦計數來計算測試物質損失。保留用於投與調配之測試物質的注射器及靜脈内導管。按照項目特定程序針對放射性含量來分析靜脈内導管及選擇之腦脊髓膜内輸液座/導管。試樣採集金液/叙清及組織

對於群組1至3，在給藥後10分鐘、3〇分鐘及i、3、6、 24、48及96 h每個時間點自3隻動物採集終末血液試樣（最大可能體積）。在群組3中，腦脊髓膜内投與在靜脈内投與之則，且終末血液試樣之時間安排係基於靜脈内投與之時間。自在異氟醚麻醉下無痛致死之大鼠（群組丨、2及3，及 3隻備用動物）的腹主動脈採集終末血液試樣，此藉由給腹主動脈放血來實施。將約3 mL血液（群組〗、2及3)轉移至含有Ks-EDTA之適宜管中以提供全血試樣，並在處理之前保持於濕冰上。對於群組2及3以及備用動物，將額外 mL血液轉移至含有檸檬酸鈉之管中以分析凝血酶原時間 (ρττ)、激活部分促凝血酶原激酶時間（Αρττ)及纖維蛋白原將血液試樣儲存於濕冰上，隨後在2700 RPM下於4°C 157227.doc -74- 201206462 下離心15分鐘。將血漿試樣在約_8〇<t下冷凍儲存隨後運輸及在申請人指定之實驗室進行分析。備用動物之血漿用作PTT、APTT及纖維蛋白原分析之空白試樣。當獲得之血液體積不足以實施所有分析（群組丨、2及3)時，則血液優先用於放射性分析。將剩餘血液（群組丨、2及3以及3隻備用動物）轉移至含有凝血激活劑之管中以產生血清，並容許在室溫下經約％分鐘凝血，隨後離心'。使用自備用動物採集之試樣來評定未治療動物之血液試樣之凝血。放血後，^ ^ 所不’母個時間點自群組1至3之3隻動物採集以下組織： 1 ·脂肪組織（腎脂） 2. 腎上腺 3. 骨（股骨） 4. 腦 5. 眼睛 6. 心臟 7·腎 8.大腸 9·大腸内容物 1〇·肝 11.肺 12·肌肉（骨骼肌） u.坐骨神經 157227.doc •75- 201206462 14. 小腸 15. 小腸内容物 16. 脊髓（腰部、胸部、頸部） 17_脾 18. 胃 19. 胃内容物 20. 甲狀腺/副曱狀腺 21. 膀胱内容物採集後，給組織稱重，

存（-10°c至-20°c)在指定冷凍器中以 •量。將剩餘屠體冷凍保以容許在作為生物廢物丟棄之前放射性衰變。自冷凍器取回群組〗及3之每一時間點第一隻動物之屠體，解凍並取出輸液座及導管，用水沖洗並驗證殘留放射性。腦脊髓液在無痛致死之前即刻屍體剖檢時自所有動物採集腦脊髓液（CSF)試樣。對於群組丨至3，在給藥後1〇分鐘、3〇分鐘及1、3、6、24、48及90 h，每一時間點將三隻動物無痛致死。經由小腦延髓池取出CSF試樣（最大可能體積），需要使用立體定值桌來使頭部成一直線。將CSF轉移至光管 (plain tube)中，並放置於濕冰上。對一部分（約2〇進行處理並分析總放射性含量。亦自備用動物採集CSF，且用以測定背景放射性含量。 157227.doc •76· 201206462 背景放射性含量之測定使用自備用動物採集之企液、血清及組織來測定群組 1、2及3中之動物血液、血清及組織之背景放射性含量。使用自備用動物採集之CSF來測定CSF之背景放射性含量。處理試樣以量測放射性採集後給所有試樣稱重，血液、血漿、血清及csf除外。對於所有群組，取兩份相同的在^〇丁八上採集之 100 μι稱重全血等分試樣以分析放射性。如下使用三氣乙酸（TCA)實施全血之蛋白質沉澱：將等體積之i5% tca水溶液添加至兩份相同的100 稱重全血等分試樣中。藉由渦流來混合試樣（1〇〇 pL全血+ 1〇〇 TCA)，且隨後在4。〇下於10000 rpm下離心約15分鐘，並將上清液輕輕倒至單獨管中。分析上清液及糰粒之放射性含量。將用於血清採集之血液在室溫下保持約3〇分鐘以容許凝血，隨後在4°C下於2700 rpm (1250 ref)下離心約10分鐘以分離出血清。然後將血清試樣保存於濕冰上，直到將其分成專伤用於放射性分析為止（2 X 1 〇〇 μΕ，經稱重等分試樣）。將濃縮紅血球（packed red blood cell)(在血清分離後獲得）保存於濕冰上，直到進行處理以用於放射性分析為止。其餘血清冷凍儲存（_1(rc至_2〇它）^將全血及紅血球之兩份相同的100 pL稱重等分試樣（在血清分離後獲得，與等體積之去離子水（w/v)混合並用p〇iytron乳化器均質化）溶解於Soluene-350中，用過氧化氫（3〇% w/v)脫色，並與 157227.doc •77- 201206462 液體閃爍液混合以分析放射性。將TCA血液沉澱糰粒溶解於35%氫氧化四乙銨（TEAH) 中，用過氧化氫（30% w/v)脫色，並與液體閃爍液混合以量測放射性。將膀胱内容物、TCA血液上清液、劑量調配物之兩份相同的稱重等分試樣（稀釋）及血清直接與液體閃爍液混合以量測放射性。將兩份相同的CSF稱重等分試樣 (約10 pL/等分試樣）溶解於35% TEAH中，隨後與液體閃爍液混合以量測放射性。將組織試樣完全溶解於35% TEAH中。隨後使兩份相同的等分試樣與液體閃爍液混合，之後量測放射性。在已知體積的水中使大腸内容物均質化。將大腸内容物（LINC)勻漿、胃内容物（STC)及小腸内容物（SINC)之兩份相同的稱重等分試樣溶解於35% TEAH中，並與液體閃爍液混合以量測放射性。放射性量測藉由液體閃爍光譜按照標準操作程序（SOP)來實施放射性量測。每份試樣計數5分鐘或計數至0.1%之2σ誤差（two-sigma error) ，哪一個均可先發生。藉由自動淬滅校正基於光譜向外標之移位將所有計數轉化成絕對放射性（DPM)。自所有試樣DPM值減去合適的背景DPM值。背景減除後，對於所有隨後操作，呈現小於或等於背景值之放射性的試樣均視為零。數據分析放射性濃度 157227.doc • 78 · 201206462 將所有放射性量測值輸入標準電腦數據庫程序（〇吡^第 5.2版）中以計算試樣中之放射性濃度（dpm/g及質量eq/g)及技與放射性百分比。血液、血清、組織及csf之放射性濃 (p g及質量eq/g)係基於量測之劑量溶液中經放射標記之測δ式物質的比活性（dpm/mg或合適的質量單位）來計算。基於大鼠血液之密度將血液試樣中之放射性濃度轉化成質量eq/mL。針對總器官重量來計算總組織含量。藥物代謝動力學血液、血清、CSF及組織中總放射性之藥物代謝動力學 (pk)曲線係藉由使用有效的電腦軟體（WinN〇niin，第3 2 版 ’ Pharsight公司 ’ Mountain View，California，USA)對濃度與時間數據進行非房室分析來表徵，基於靜脈内及血管外投與途徑來選擇模型。報告為不可檢測或計量之濃度值未進行估計；將其以不存在試樣處理。在每一時間點自不同動物獲得濃度數據，且使用平均值來產生複合的藥物代謝動力學曲線◊群組1(動物編號1001、1〇〇2、1〇〇3)及群組2(動物編號2001、2002、2003)之1〇分鐘取樣以及群組 1(動物編號1019、1020)之48小時取樣偏離標稱時間點大於 10%或6分鐘。此與方案之偏離並不影響研究之有效性或獲得之數據’此乃因在藥物代謝動力學分析中計算及使用平均時間。使用線性梯形方法（線性内插法）來計算放射性濃度與時間曲線（AUC)下之面積。實際上，基於最佳擬合線（R2)使用至少最後三個觀測濃度值來確定PK曲線之終末排出相。 157227.doc -79· 201206462 使用對數線性回歸使用未加權之濃度數據來計算終末排出相之斜率《若測定係數（R2)小於0.8，或若將AUC外推至無限佔總面積之大於20%，則依賴於測定kel之參數不予報告。結果給藥調配物之分析在每一給藥之日，在向所有群組投與劑量之前及之後藉由液體閃爍光譜對每一調配物之等分試樣進行分析，並根據該等分析來計算測試物質之比活性。用於腦脊髓膜内投與之調配物中之總平均放射性濃度（±S D )係 345.4xl06±4.92xl06 dpm/g (155.60 pCi/g)(群組 1)及 334_4χ10 ±5·87><106 dpm/g (150.62 pCi/g)(群組 3)。用於靜脈内投與之調配物中之總平均放射性濃度係 4.4xl06±4.22xl05 dpm/g (1·97 pCi/g)(群組 2)及 4.7χ106±2·31χ105 dpm/g (2.11 pCi/g)(群組 3)。腦脊髓膜内調配物中測试物質之比活性計算為51.16 pCi/mg(群組1劑量）及49.53 pCi/mg(群組3劑量）。靜脈内調配物中測試物質之比活性計算為6.53 pCi/mg(群組2劑量）及6.99 pCi/mg(群組3劑量）。 157227.doc •80- 201206462 表/藉由液體閃爍光譜測定之給藥調配物中放射性濃度之結果概述群組編號投與途徑時間平均放射性濃度 (dpm/g) (μ〇ί/δ) 平均值± SD CV 平均值給藥前 348445137±3391878 0.97% 156.96 1 腦脊髓膜内給藥後 342426851±4484476 1.31% 154.25 總 345435994±4924300 1.43% 155.60 給藥前 4691887±61669 1.51% 1.84 2 靜脈内團注給藥後 4672629±430335 9.21% 2.10 總 4382258±421765 9.62% 1.97 給藥前 332418463±3013337 0.91% 149.74 3 腦脊髓膜内給藥後 336332353±7582128 2.25% 151.50 總 334375408±5868250 1.75% 150.62 給藥前 4827255±92785 1.92% 2.17 3 靜脈内團注給藥後 4545578±247903 5.45% 2,05 總 4686417±231271 4.93% 2.11

動物體重及投與劑量{表A 在給藥前一天群組1、2及3中大鼠之平均體重分別為405 g (在373 g至452 g範圍内）、410 g(在367 g至453 g範圍内）及 395 g(在342 g至444 g範圍内）。經腦脊髓膜内投與群組1動物之125I-hGALC的計算平均劑量係4U0.014 pg/動物，此等效於2.12±0.72 μίΜ/動物之放射化學劑量。藉由靜脈内途徑投與群組2動物之125I-hGALC的平均劑量為1.00±0.02 mg/kg(2_69±0.14 μ(Μ/動物）。對於群組3，經腦脊髓膜内及 157227.doc -81 - 201206462 靜脈内投與之125I-hGALC的計算平均劑量為1.08±0·04 mg/kg(5.72±0_31 pCi/動物）。表8群组平均體重及投與雄性Sprague-Dawley大鼠之12SI-hGALC劑量的詳細說明群组 tt重 (kg) 投與途徑放射性a DPM/動物 μσϋ 動物 MCi/kg mg/ 動物 mg/kg Mg/ 動物 1 0.405± 0.022 IT 4,715,057 ±1,600,366 2.12±0.72 5.26±1.86 0.041±0.014 0.102 ±0.037 41 2 0.410 ±0.021 IV 5,961，365士306,654 2.69土0.14 6.55土 0.15 0.411 ±0.022 1.00土 0.023 - b 3 0.395±0.027 IT 及 IV 12,698,351±686s160 5.72 ±0.31 14 5± 0.62 0.425±0.034 1.08±0,042 投與群組1中大鼠之平均化學劑量及放射化學劑量較目標劑量量為低（分別為約32%及29%)，且此為與該方案之偏離。然而，由於在整個計算過程中使用投與動物之實際劑量，故認為該等較低值不影響研究之有效性或獲得之數據。臨床觀察在經腦脊髓膜内以60 pg/動物及/或經靜脈内以1 mg/kg 投與125I-hGALC後，在任一大鼠中均未觀察到治療相關臨床體徵。凝血評定在早期時間點（給藥後10分鐘至6小時），注意到，自治療動物採集之血液在留出之30分鐘内未完全凝結。然而，自3隻未治療備用大鼠採集之血液容易地凝結，此表明測試物質對凝血過程有些干擾。凝血時間短於或長於30分鐘係與該方案之偏離。然而，據研究主任之意見，一些試樣需要較長之凝血時間以提供一些分析用血清。察看獲得之 157227.doc • 82 - 201206462 結果顯不，在血清中獲得之濃度值與血液凝結所花費之時間長度間沒有聯繫。因此，據研究主任之意見，此延長或縮短之凝血時間並不影響研究之有效性或獲得之數據。血液、血清、紅血球' CSF及組織中總放射性之藥物代謝動力學血液、血清及紅血球中之總放射性濃度{表9、表w、表 11 、圖 13) 表9中給出腦脊髓膜内及/或靜脈内給予uq—hGALc後雄性大鼠之血清中經放射標記之物質的平均濃度。表1〇中給出全血及紅血球中經放射標記之物質的平均濃度。圖13中以圖示形式給出平均值數據。表u中給Atca沉殿後在血液上清液及糰粒中回收之放射性的平均百分比。群組1(腦脊髓膜内平均劑量為41 動物）在腦脊髓膜内給藥後，在給藥後3小時觀測到血清及血液中經放射標記之物質的最高平均濃度（Cmax)(分別為 0.108±0.026 ng eq/g 及 0.093±〇.〇23 肫 eq/g)。在給藥後到、時與6小時之間，血液中之放射性含量保持相對恆定而血清中之放射性含量略微下降。此後，血清及血液中之放射性濃度下降，且到給藥後48小時低於定量極限（L〇Q)。對於紅血球，在給藥後6小時觀測到^“且為〇〇89±〇〇24 Mg eq/g。此後，紅血球之放射性濃度下降且到給藥後牦小時低於LOQ。在整個研究階段中，腦脊髓膜内給藥後平均血液與血清比小於1(介於〇.7至〇9範圍内），此表明經放射標記之物質未很大程度地與血球結合。紅血球與血清之比 157227.doc 〇, 201206462 值（介於0.8至0.9範圍内）亦證實放射性物質未與血球實質結合。使用標準血液體積/體重（即64·〇 mL/kg)來估計血液中發現之劑量百分比e tmax(出現最高放射性漢度之時間）時，約6%之投與劑量與血液結合。群組2(靜脈内平均劑量為1.00 mg/kg) 靜脈内投與後，在給藥後10分鐘（即分析之第一時間點）觀測到血清（14.864±0·853 pg eq/g)及血液（10 228±〇 447 μβ eq/g)中經放射標記之物質的最高平均濃度（Cm^)。此後，血清及血液中之放射性濃度緩慢下降，但在給藥後96小時仍可檢測到（血清：0.088±0.006叫eq/g，佔之 0.59% ;血液：〇.〇51±〇.〇〇2 pg eq/g，佔（：_之〇 5〇%)，且估計之血液中劑量百分比自68.4%降低至〇 3%。對於紅血球’在給藥後10分鐘觀測到Cmax，為5 136±1 529 pg eq/g。此後，紅血球之放射性濃度下降，且到給藥後96小時低於LOQ。在整個研究階段中，靜脈内給藥後平均血液與血清比小於1(介於〇.6至〇·8範圍内），此表明經放射標記之物質未很大程度地與血球結合。紅血球與血清之比值（介於0.4至0_6範圍内）亦證實放射性物質未與血球實質結合。群組3(腦脊髓膜内給藥後接著靜脈内給藥：1〇8 mg/kg(組合劑量））在腦脊髓膜内給藥（目標為6〇 μβ/動物）及靜脈内給藥（1 mg/kg)後，在給藥後丨〇分鐘（即分析之第一時間點）觀測到血清（14.675±0.810 pg eq/g)及血液（9 974±〇 558 叫 eq/g)中經放射標記之物質的最高平均濃度（Cmax)。此後，血清及 157227.doc -84- 201206462 血液中之放射性濃度緩慢下降，但在給藥後96小時仍可檢測到（血清：0.077±0·010 pg eq/g，佔 Cmax 之 0.52% ;血液：0·037±0.033 pg eq/g，佔 Cmax 之 0.37%)，且外推之血液中劑量百分比自32.6%降低至0.1%。對於紅血球，在給藥後10分鐘觀測到Cmax，為6.113±1.748 Mg eq/g。此後，紅血球之放射性濃度下降，且到給藥後96小時低於定量極限。如平均血液與血清比及紅金球與血清比小於1 (分別介於0·7至0.8及0.4至0.7範圍内）所示，經放射標記之物質未很大程度地與血球結合。表9a在單次腦脊髓膜内給予125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血清中放射性濃度的群組平均值群組1 :以41 pg/動物之平均劑量放射性濃度3 時間點 - _DPM/g_\ig eq/g 10 min 504±462 0.004士 0.004 30 min 4125±2327 0.036±0.020 1 h 5705±1535 0.050±0.014 3h 12311±2960 0.108±0.026 6h 11473±2596 0.101±0.023 24 h 884±122 0.008±0.001 48 h 0±0 0.000±0.000 96 h 0±0 0.000±0.000 157227.doc • 85 - 201206462 表9b在單次靜脈内團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血清中放射性濃度的群組平均值群組2 :以1.00 mg/kg之平均劑量時間點放射性濃度a DPM/g Hg eq/g 10 min 215632±12377 14.864±0.853 30 min 157239±14339 10.840±0.988 lh 106804±6790 7.362±0·468 3h 47009±3754 3·240±0·259 6h 31898士2417 2.199±0.167 24 h 6584±194 0.454±0.013 48 h 3523±503 0.243±0.035 96 h 1278±86 0.088±0.006 表9c在單次腦脊髓膜内及靜脈内團注n5I-hGALC後雄性 Sprague-Dawley大鼠之血清中放射性漠度的群組平均值群組3 :以1.08 mg/kg之平均劑量放射性濃度a 時間點 DPM/g__eq/g 10 min 227675±12574 14.675±0.810 30 min 171721±10165 11.069±0.655 lh 127621±7785 8.226±0.502 3h 66561±1164 4.290±0.075 6h 54374 ±4044 3.505±0.261 24 h 8894±686 0.573± 0.044 48 h 3622±458 0.233±0.030 96 h 1199±157 0.077±0.010 157227.doc • 86 · 201206462 表10a -在單次腦脊髓膜内‘予125I-hGALC後雄性 Sprague-Dawley大鼠之血液中之放射性濃度及含量以及血液與血清比的群組平均值群組1 ··以41扑惡/動物之平均劑量

放射性濃度* 時間點 DPM/g μδ eq/g \ig eq/mL 血液與血清比劑量百分比 10 min 210±364 0.002±0.003 0.002±0.003 0.696b 0.074±0.128 30 min 3579±1918 0.032±0.017 0.033士 0.018 0.878±0.029 1.822±0.351 lh 4933±1446 0.043±0.013 0.046±0.013 0.860±0.027 3.890±0.253 3h 10617士2586 0.093±0.023 0.098±0.024 0.862±0.006 5.582±0.554 6h 10530±2507 0.093士 0.022 0.097±0.023 0.917±0.035 4,664±0.576 24 h 677土118 0.006±0.001 0.006±0.001 0.764±0.032 0.600±0.114 48 h 0土 0 0.000±0.000 O.OOOiO.OOO n/a O.OOOiO.OOO 96 h 0±0 0.000±0.000 0.000 ±0.000 n/a O.OOOiO.OOO 表1 Ob在單次靜脈内團注 ϊ-hGALC後雄性sprague-Dawley 大鼠之血液中之放射性濃度及含量以及血液與血清比的群組平均值群組2 :以 1.00 mg/kg之平均劑量時間點放射性濃度1 DPM/a με eq/g μβ eq/mL 血液與血清比劑量百分比 10 min 148373±5480 10_228±0·447 10.739±0.469 0.688±0.012 68·393±3_453 30 min 107195±5739 7.389±0.396 7·759±0.415 〇.683±0.036 49.317±1.788 lh 77163±694 5.319±0.048 5.585±0.051 0.724±0.040 36.460±0.174 3h 35469±3124 2.445士 0.215 2.567±0.226 〇.754±0.007 16.355±1.166 6h 24364±1639 1.679±0.113 1.763 ±0.119 0.764±〇.〇〇7 11_184±0.612 24 h 4794±160 0.330±0.011 0.347±0.011 0.729±0.030 2.218±0.076 48 h 2259±233 0.156±0.016 0.163±0.017 0.644±0.028 1.042±0.141 96 h 738±29 0.051 土 0.002 0.053±0.003 〇.579±0.052 0.341±0.011 -87- 157227.doc 201206462 表10c在單次腦脊髓膜内給予及靜脈内團注i^phGALC 後雄性Sprague-Dawley大鼠之血液中之放射性濃度及含量以及血液與血清比的群組平均值群組3 :以1.08 mg/kg之平均劑量時間點放射性濃度a DPM/g US eq/e gg eq/mL 血液與血清比劑量百分比 10 min 154742±8651 9.974±0.558 10.473±0.586 0.680±〇.〇〇9 32.599±1.331 30 min 117563 ±4922 7.578±0.317 7.957±0 .333 0.685±0.018 24.596±1.523 1 h 92086±2812 5.936±0.181 6.233士 0.191 0.723±0.022 19.132±1.432 3h 52419±244 3.379 ±0.016 3.548=0.016 0.7SS±0.017 11.283 ±0.344 6h 43097±4071 2.778±0.262 2.917±0.276 0.792±0.0019 9.263士 0.836 24 h 6561±78 0.423±0.005 0.444±0.006 0.740±0.054 1.345 ±0.080 48 h 2362±398 0.152±0.026 0.160± 0.027 0.650±0.029 0.465士 0.083 96 h 581±513 0_037±0.033 0.039±0.035 0.684土c 0.124±0·109 表10d -在單次腦脊髓膜内給予125I-hGALC後雄性 Sprague-Dawley大鼠之紅血球中之放射性濃度及含量以及紅血球與血清比的群組平均值群組1 :以41 pg/動物之平均劑量

時間點放射性濃度a DPM/g μβ eq/g 紅血球與血清比劑量百分比 10 min 0±0 0.000±0.000 n/a O.OOOiO.OOO 30 min 3044±1261 0.027±0.011 0.793±0.148 0.213±0.067 1 h 4454±1396 0.039±0.012 0.773±0.059 0.357±0.336 3h 9768±2664 0.086±0.023 0.789±0.031 0.734±0.300 6h 10086±2682 0.089 ±0.024 〇.876±0.083 0.616±0.200 24 h 287±497 0.003±0.004 0.841b 0.044±0.075 48 h 0±0 0·000±0·000 n/a 0.000±0.000 96 h 0±0 0.000±0.000 n/a O.OOOiO.OOO • 88 - 157227.doc 201206462 表10e -在單次靜脈内團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之紅血球中之放射性濃度及含量以及紅血球與血清比的群組平均值群組2 : 以 1.00 m g/kg之平均劑量放射性濃度a 時間點 DPM/g eq/g 红jk球與血清比劑量百分比 10 min 74506±22185 5.136±1.529 0.350±0.119 4.110±2.794 30 min 59201±14694 4_081±1.013 0.377±0.086 2.600±1.087 1 h 52799±23155 3.639±1.596 0.487±0.196 3.229±2.403 3h 28039±3432 1.933 ±0.237 0.599±0.083 1.709±0.734 6h 19662±2540 1.355±0.175 0.616±0.057 1.143±0.315 24 h 3714±292 0.256±0.020 0.564±0.040 0.164±0.111 48 h 1619±482 0.112±0.033 0.453±0.082 0.076±0.064 96 h 0±0 0.000±0.000 n/a 0.000±0.000 表10f在單次腦脊髓膜内給予及靜脈内團注125I-hGALC 後雄性Sprague-Dawley大鼠之紅血球中之放射性濃度及含量以及紅血球與血清比的群組平均值群組3 :以1.08 mg/kg之平均劑量放射性濃度a 時間點 DPM/g UR eq/g 紅jk球與血清比劑量百分比 10 min 94843±27122 6.113±1.748 0.414士0.104 3.640±1.162 30 min 65477±25687 4.230±1.527 0.371±0.117 2.266±1.583 lh 61906±14623 3 ,990± 0.943 0.489±0.130 2.253±1300 3h 38985±8524 2.513 ±0.549 0386±0.128 0.992±0.458 6h 37327±4497 2.406±0.290 0.685±0.038 1.479±0‘417 24 h 5250±334 0.338±0.022 0.591±0.032 0.139±0.070 48 h 2109±319 0.136±0.921 0.581±0.022 0.060±0.017 96 h 0±0 0.000±0.000 n/a 0.000±0.000 • 89· 157227.doc 201206462 表lla在單次腦脊髓膜内給予125I-hGALC後在雄性 Sprague-Dawley大鼠之血液上清液及糰粒中回收之放射性的平均百分比群組1 :以0.10 mg/kg之平均劑量 ^ _ 放射性濃度a 吁间點糰粒上清液 10 min 100±0 0±0 30 min 75.1±10.7 24.9±10.7 1 h 71.8±11.7 28.2±11.7 3h 81.2±2.38 18_8±2.38 6h 67.3±13.5 32.7±13.5 24 h 100±0 0±0 48 h 100±0 0±0 96 h 100±0 0±0 表lib -在單次靜脈内團注125I-hGALC後在雄性Sprague-Dawley 大鼠之企液上清液及糰粒中回收之放射性的平均百分比群組2 :以1.00 mg/kg之平均劑量 „ 放射性濃度a 时间點棚粒上清液 10 min 99.2±0.03 0.85 士 0.03 30 min 97.5±0.32 2.48±0·32 1 h 95.8±0.56 4.23±0.56 3h 92.5±0.17 7.49±0.17 6h 90.7±0.45 9.26±0.45 24 h 100±0 0±0 48 h 100士0 0±0 96 h 100±0 0±0 157227.doc -90- 201206462 /表lie -在單次腦脊髓膜内給予及靜脈内團注i^LhGALC 後在雄性Sprague-Dawley大鼠之血液上清液及糰粒中回故之放射性的平均百分比群組3:以1.08mg/kg冬平均劑量放射性濃度8 糰粒上清液 10 min 99.0±0.11 1.02±0.11 30 min 95.9±0.49 4.07±0.49 lh 94.5±0.56 5.55±0.56 3h 88.1±5.34 11.9±5.34 6 h 88.9±1.03 11.1±1.03 24 h 90.7±3.48 9.33±3.48 48 h 100±0 0±0 96 h 100±0 0±0 η5ι-可沉澱於全血中 (表 11) 對於群組1、2及3，在藉由三氣乙酸（TCA)於全血中沉澱後糰粒及上清液中回收之放射性的平均值概述於表“中。當使用15% TCA水溶液使全血中之蛋白質沉澱時，主要在血液糰粒中回收到放射性（在群組1中介於100%至67〇/〇範圍内；在群組2中介於1〇〇%至91%範圍内；在群組3中介於 100°/。至88°/。範圍内），此表明大部分循環放射性與蛋白質結合且因此不反映游離125碘。組織及腦脊髓液(CSF)中之放射性濃度 (表 12、表 13、表 14、圖 14、圖 15、圖 16、圖 17) 表12中給出在單次腦脊髓膜内及/或靜脈内給予 hGALC後大鼠組織及CSF中放射性之平均濃度。圖14、圖 157227.doc -91· 201206462 15、圖16、圖17中以圖示形式給出平均值數據。表13中給出平均組織與血清比，且表14中給出組織、CSF及胃腸道以及膀胱内容物中投與劑量之回收。表12a-在單次腦脊髓膜内給予12SI-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髄液中放射性濃度之群組平均值群組1 :以41 pg eq/ga之平均劑量試樣始射性濃度.wc«^se lOaom 30obd in 脂肪组織（腎脂）腎上腺股骨梅雎脊髄液(CSF) HR B# 0.000 ±0.000 αοοο^σοοα Οί005^0.0Μ 0.000« OjOOO OjOUdOJMK aoruQjm OXm&<LQ09 0.000 A 0.000 αοιι & 0.005 aou^aa» 0.040^ 0.0U αοοο^ο,οοο OlOOD、 a〇Q3A〇J〇03 Qj000k (UXM 士 0.004 〇J〇DDv o.mAo.m oloooao.000 心被 aoo〇AQ.D〇〇〇L〇t»* 0.004 aou tb 0.003 0.«7.± ej0Q5 〇j〇n 去 0006 o.on 士 aotu 0i»4 ± &00$ OuStt 士 0J006 大胁 OOOIAOLOM 认042 由〇J〇2) a<XS2(fe〇M4 CUM 金 amt 肝 0.000 ±cu〇oo OJOQ9 士 a〇04 〇J〇UA<MX〇 QjQ2(迕⑽0 肺 αοοοΑΟ^οοο 似12*0撕〇L〇t5^〇IKtf 〇J〇2»&〇.〇〇> 肌肉（骨骼肌） 0.002 ▲ 0003 0400 A OJDIO 0ίβΠ4〇ίΜ <MB8A<L<U4 坐骨神經〇〇〇〇£&〇〇〇 olw 迕 aoos (MOD 土众002 0.01« ^0.00) 小賸 aw〇A 〇.〇〇〇 a〇08 ▲0.00! 0l«2a〇jM1 0·00 虫 Ol017 脊髓（腰部、胸 M00 土 OlOOO 0.011 dt OjOOS QiH6 λ aw 01046*0013 部 '頭部） aooo^oino 0ϋ04 * 0.001 〇jQ〇0A〇j〇ai OL009AQUQ01 脾 Α000 Α 0,000 OM4AOMS 〇jH9dt〇J〇06 (UMOilOLOlO 胃 ao〇3i>a〇Q2 a〇22^〇j〇to 0.037410017 0209*0.101 甲狀A/副甲狀腺 0.too ^m9 OJ4I±〇jDB) 〇J7S^〇lI47 _：kU28 Λ · ______放_性濃度!«_·____ 试樣_ 6t 24h _ _ Mb 賭肪组織（腎脂）腎上腺股骨猫睡脊髄液(CSF) 眼睛心臟腎大勝肝牌肌肉（骨骼肌）坐脊神經小播脊髓（腰部、胸部、頦部）脾胃甲狀腺/副甲狀腺 o.m*〇tt)〇 a〇2〇±ao〇2 0.M1 * OflCT α〇Μ±αοοι am. 0<Q“M〇} ao^&ao〇4 ao>2 ± aou 0024 a. 0.001aaso ^ oooe Q.0S7 i 0.012aoiz ^ ao〇2 O.D9DAOJOI» awi ♦ aoi5 o.oos*ao〇) 0.036^0107 0.163 A 0.M0 0.000*0.000 IMXXU 0.000 fiLOOOAOJOOO ΟΟΟΟΑΦ.ΟΟΟ CLOOOAOjOOO oootdfc<um 0.001 ±<una 0 Q12 & <UKH 。如± 0、败 OOQOlOjX» 0.004 士 ¢.000 «uno念o撕 a«oo a «.οι» 0.004 a am cloooaqlooo aooo^ojooo 0.<nt«€u001 4126« 1.073 issiiiiiii!

OjDQO^OiOOO ουοω^οΜο OiXUAOLOOO (MWO^aMO <um>*aoooaooo 士 o.ooo oiioo^am (MMtf a o.m 〇.〇〇〇 a aooo aooo tfc 〇,〇〇〇 OLOOOAO.OOO cuooodbaooo 〇：〇〇〇* aooo ftooo^aooo UmAQjOOQ <ukb 土 am 0002^0.001 1:927 金 15V 92- 157227.doc 201206462 表12b-在單次靜脈内團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley 大鼠之組織、腦脊髓液中放射性濃度之群組平均值群組2:以1.00mg/kg之平均劑量放射性浪度、 lOiran SOmo. lb Ih. 脂肪组織（腎脂）腎上腺股骨路雎脊髄液(CSF) 眼睛心臟腎大腸肝肺肌肉（骨骼肌）坐骨神經小_ 脊髓（腰部、胸部、頭部）牌胃甲狀昧/副甲狀腺 C.136 士 ΟϋΟΜ &827H41S 156B*〇j〇U ojsi* a〇ii 0.137^0^38 o.n〇A aoio 1213^0.122 5827*03» 〇52S^〇J〇73 1U3S* 1·43ύ 11^84 4(1906 0.12S 念（K0U 0.173 Λ cm om ± ooM 6J93±Oj〇2S 6光在0_«U 0.433 Λ 0088 4A^S±U94 ilis *****4**4****44*4*§lsiiflL}07t.l(sslilii O.U$«a〇97 4,M 士 0LS7泰 1.2StfA.〇J«6 〇.!»$ 士 ojrns 0Mb o.m±oxai OJ9»±0.^ Ζ2«ί*α449 A492 n： 0JQ3 1904 念 0J67 11436 士 3撕 0^73 dt QJ725 ftS84 ± 0.(^9 5.7ββ ± 0 .125 〇277*α〇(β 4.187^ 0311 1430^0.07« 37^0^11.900 0.092 ±0.01» 1^73^0.070 0^87 A 0.090 0.083^0.002 0210*0·3«3 0J44*〇.M9ojssa ^ osm 1.6S7±0190 0J97 土 atm 3J90 ± o.m 丨 <526 *0.815 (LlS9±Oi»7 Q.鄉由0必6 0^33 Λ 〇jee 0.142 dt 0.010 Σ010 d> OJ23 Z40«A0.m 147,641 ±5i：m 試樣 €h 24h 放射性濃度_ρ; 48 ig_· Eh 96h 脂肪組織（腎脂）腎上腺股骨腦腦脊髄液(CSF) 眼睛心臟腎 λ勝肝肺肌肉（骨骼肌）坐骨神經小略脊髓（腰部、胸部、頸部）脾胃甲狀腺/副甲狀腺

0.077*0.007 1^13 £ 0.031 0.736* 0033 006»^ 0.00» oaa3ft〇j2i 〇336A〇m 0.440* 〇j〇n 1.4U& (LKtt 0.376^0077 li?9± CL1«8 1U7&QJ079 ai53^0.0U OJOfi aen 0.1»« a〇17 L6S7 士 0.田1 HOSiO t由WM XMi 267.423 d ΟΜήΟΜ aua 土 0J0S3 似》4由0田0〇.〇〇〇 ^ 〇j〇oa GL<»0 土 ΟϋΟΟ Qy〇OQ&0.e〇0 αο<ο ± 0.002 αι»^αο〇ρ ααζβ法〇抛 0323 a 0 .114 ¢.000^0000 ΦϋΚΙ〇ώ〇ϋ〇〇 0.0« ώ 0013 «ΜΟάΟ^ΟΘ 0030 ^0iB8 294521 ± 51953 aooa* 0.000 0.010 aooo^aooo 〇L〇0〇A〇.〇〇〇〇.〇〇〇*〇〇{)〇 0.000 irOJOOO 〇.〇〇〇 i osm 0.099^0X110 OjOOO 去 Oi»0 0.126± 0.Q14 osos^oim am 去。‘〇〇〇 OAOO^OiOOO WX»db〇.〇〇a OjOOO^OOOO am a 〇.〇(^ 仰15 士⑽3 211^17^45,093 93- 157227.doc 201206462 表12c-在單次腦脊髓膜内給予及靜脈内團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液中放射性濃度之群組平均值群組3 :以1.08 mg/kg之平均劑量放射性澧廑试樣 10 mitt ίΟηέα Ih 3h 脂肪组織（腎脂） 0.140*0029 αιτβ « 0L0S1 0.1S« « {LQ20 0.161 * c.ooe 腎上腺 1478 M«7 由 U29 4SG8 金 0ifi30 ^010 A 0J3! 股骨 1^27*0137 L707*CL160 J^7J * 0.C71 1^61 «0.00 腦· OJ83 金 0·062 〇276 缶 aoio 0230 a 0008 QLl^&a〇23 猫脊*1液(CSF) 2QS7« 1.913 O3«Mt037l 059«金 UBS Q.1QS«0i82 眼睛心贜腎大腈肝 aitOAO^U 05?2^D.(M2 0339 金 0u0!9 0.β11 £ 0.079 I.CS4«aiM9 2J64A0JSS 〇.»t * OQ26 UI5^r〇.U6 1^4 虫 0<2S$ 0597 士 a〇3l U8e^0.0QS 3J90 由 0JB3 Ο,ΊΡί* α〇6>8 QM * 〇j〇39 2.S22 * 0.020 0.681 ή 0102 10.IS1 A 〇M BL475 dt 0204 &237 0341 3.74DA0.0S3 肌肉（骨骼肌） 3.1334 03» 5.1«2 ^0.564 SM ^ 0-194 2.727^0.1» 坐骨神經 auff^aat» 0J97 A 0j0U a4tl ^ 〇J〇Q9 C〇9« 么 9.013 小腸 0M*<US7 QJ04AWm 0.538 ^ 0.029 0.994 Λ 〇Jm r〇43<t〇.QS7 脊髄（腰部、胸 0.77S A 0.037 U49db〇J10 1^01^0.153 部、頸部） 0527 ± 0.0d2 0.319 ±O.OEZ5 <L285 xt 0.044 (L227 ^ 0.019 脾 34M2*0JQ2 Ck.4$3±0.0«9 4.721 A 0J02 1740^0.40« 2.IM s 0.2U 胃 IJOi ±- 0.S7S 24S0 dL〇.SdS» 4.454 A； 1.455 甲狀路/副甲狀腺 3.边1 念 1J42 2L727 ± »473 ΚΛΪΙ A IS.7^6 Ι3λ771 * 37J»9 _放射性濃度，明球8* .owl p.ooo.ooo.otiMi^yJSr« ODOOOOOOOOOO&^oon^^ ill細试律_ _ph _ 24k 4Sh 脂肪组織（腎脂） 0L131 ± α〇05 aooo 士 αοσο oxjqoa c.m 腎上腺股骨雎腦脊败液(CSF) 眼睛心赋腎 1.412 A 〇.U7 0301 A 0.014 0.U8 Λ 0.015 t.m ± α〇6$ 0.148 士（X012 a〇29 ^ 〇.〇» 〇J〇9Sit〇i»2 αοοο» O574^a〇v αα»Α 〇.〇〇〇 OjOOO' Ο.ύΟΟ λ 0.00D 〇〇〇〇« 0O64dr〇006 0.010 A OjOCS CTO * 0.W7 ¢ .101 去 0.0» 0315^ 0.019 ⑽S 土 0.007 λ» 2JtMA〇J39 0249^0.029 肝 0.726 * 0.173 3.136^0.143 〇j〇74 ± 0.014 aaz7A〇.o〇4 肺 0货6 由 0.033 a4IB* 0.036 肌肉（骨骼肌） 1.630^ 0.t33 0.223^ 0.007 a〇76A〇.«0 坐骨神經 ^0.029 0.032 A OM aooo^t 〇.〇〇〇小胁 l .拼 Λ 0133 o.os5« om 0,000 去 0000 脊髄（腰部、胸 1.102 & αιοι 0J36& 0.0Π Qy〇33 0.00S 部、頸部）〇3m*.〇j〇n aoz5 a 0.009 0.000*0000 脾 0JP5 ± a〇i7 au2 tfe 〇·〇» 胃 4.242 ύ t.m Q.4i3A〇S57 296JS7i 57.791 OMi A O.OT4 甲狀滕/副甲狀腺 nz<m ± άλώ 199J16A 26085 ·94· 157227.doc 201206462 表13a -在單次腦脊髓膜内給予125I-hGALC後雄性 Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液與血清放射性比的群組平均值群組1 :以41 pg/動物之平均劑量组織、CSF與血清比* 30 ΒΑ

Jk 脂肪組織（腎脂) 腎上腺股骨蹈腦脊髄液(CSF) 眼睛心喊腎大腸肝肌肉（骨骼肌）坐骨神經小族脊髓（腰部、胸部、頸部）脾 η 甲狀線/副甲狀腺 α!»ί ϋa3nT-sTII/tsoliio^l β/崖 0Jp7lb Ol423 金 0.H6 0324 由 OjO» 0Λ96Λ 0.012 OJOSt^QjDIO 0·319 金。JD38 0J«*O.02S 0.0«* <Lm*om 0:045^0.006 Bik sfiv Kfm 0.177* α田2 0^6^0400 0253^0.007 oau a tijm 032» 盎 ¢.008 0265 士 a〇Q 1.157 ±〇.ΟΛ 1，田6 念 Φ·«β 0JK9S 士〇j〇58 0^4» A 0.027 O220^«Xt23 0220^0048 0351 ± 0.028 <im lb 0.036 026^ ^〇Λ\5 OSSi^^OSO OS33 由 a〇}4 0i»^〇jD03 0.197 * a〇32 am * 〇i»n 0134^0.(01 0»、 03t7fc 0J82£DJT74 MUiiO.0^ osn* ms CAHit 〇,〇l« (U44、 O.U?^0J>17 0.082 0.010 039S± 0.036 0383^0013 O36Sii6.0ff7 0.βΖ7^α(Π2 0.723 i 0252 U01 ^0.619 4JQ33 ± 0.750 5j6a〇±l£\2 17边士 «215 _组織、CSF與血清比8_ 試樣 6h ST5 48k 55Γ 脂肪组織（腎脂) 腎上腺股骨腦腦脊髄液(CSF) 眼睛心臟腎大腸肝肺肌肉（骨骼肌）坐脊神經小族脊髄（腰部、胸部、頸部）脾胃甲狀腺/剔甲狀腺 i iii ****^*******11*··***i lls§ nri 由故 0J84b 〇L343k A 0.13« 03M、 ef· oAi ar» o.5$o 表 <um n^i of* 1j0S5^0.I» S27.0Q2 d； m.\96 157227.doc 95- 201206462 表13b -在單次靜脈内團注125I-hGALC後雄性Sprague-

Dawley大鼠之組織、腦脊髓液與血清放射性比的群組平均值群組2 :以1.00 mg/kg之平均劑量组蛾* CSF與血清比11 試樣 10BSB 30niA lh 3b 脂肪组織（腎脂） 0.009 *0.0» 0.DU « 0003 0.017 ό αοοι 0.02« «01003 腎上腺 03»&0.13) 0.654 λ αοιο O^MdiOiOfiP 0L$»金⑽9 股骨 am 金 <L14« ^0.019 o.ru±aon 〇2m：aoos 庙 0.017 &ao〇2 〇J〇22dra〇Qi 0.QZ7* 0003 0.026 由 0.002 雎脊*1液(CSF) σι»· 眼蠄 αο〇7±〇0» aott^aota a〇S5±IUK3S aloe ± am 心賊腎大腾肝 O.OS2 金 OlOOi (UQ3 OJQU O.Q23A〇L〇〇i 0.1(0 A o.ooe 026Φ A 0.019 a〇43 & 0.009 o.m^aoar 0311 由 0.0U 0067 士 aoi2 am a oom CL512 念 0.M$ 0.123 ^ 00t9 肺 α?66« 0.119 QL^Qdi 0.026 0.«» ώ 0.097 Lm念〇.松肌肉（骨骼肌） 0.7S1 * 〇 070 l^O^OJOO 2 说士 (U52 2.m^ow 坐骨#經 o.ra先。⑽ α〇24ώ 0^)04 0.037 «b 0.002 0.0SP 4 0.004 小® « 022 * 0.002 O 0.012 0080^ A009 0213 0.007 脊髄（媵部、胸 ολ39λ>ομ am 念 0.007 αιοτ ± όχι» 0·255 金 0.032 部、頦部） Q.0I9± 0.002 〇J〇25^a<XQ (LOSS O OOt a〇44 由 0.007 脾 0.443 A a〇15 0.009 & 0.004 034? «0.090 0371 Ob 007， dj6\z ± 0.063 01743 ± 0 038 胃〇J〇S5^〇j〇13 OJM 虫 0.012 甲狀路/剔甲狀腺 0J03A<M»2 Z074±0.J1» 5.106 ± 1J55 4tf.7f>7 £ 21^39

試樣組織、 CSF與血清比* 6h 24h 4fth 96& 脂肪组織（腎脂） €l〇9S A 0.003 n£a 0½ 腎上腺 Q.74?>faftM as» 迕&i〇4 0J43&QlI2(» 股骨 CJ30A 〇.〇M 0^34ii〇jQ30 0225b ΛίΛ 腦 OSmA OJOOZ ate mA sA 腦脊髓液(CSF) 0232、 tim 〇r· 眼睛 OJS2 ^ 0.024 QLtn3 * Ojnj afm sb 心喊腎大脒肝肺肌肉（骨骼肌） o^oo±aoio 0.16S ± ftdM am* om «ώ 0649 念 0.0S6 0.741 It QJBS5 Ct8334iD.Ifi9 1.U8 & Ql〇G6 0Λ71 Λ 0^5 金 OOW (UI9 * Oik2D 0.109AOJ008 at· 2J4S±^i42 2.1094 0392 1.449 士 0229 L453 ± OJ97I &jQSAZli〇 1345^0.431 0l7S0 士 6lQ33 坐骨#經〇J〇09«&D« O052b nf· afk 小砝 0J92 A 0.011 〇Lt0^ ίΛ ste 脊髓（腰部、胸 0JM 圭 ao«5 0207 “.OS? an5 ± oino sA 部、《部） Δ.0» & 0.008 0M7* L24?i：flLl34 αλ I2«3 ΑΟΌΰ» 脾 0l752 a QJ084 L⑽在IUBS 0.774 A «7» 0197 士 at» O.X9710XM7 a26” 7mj660 A 471J07 甲狀脉/剔甲狀腺 K24in6^S&»7 6(5.413 dt 169^27 323L«S4A2S3J»S 96- 157227.doc 201206462 表13c-在單次腦脊髓膜内給予及靜脈内團注125I-hGALC 後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液與血清放射性比的群組平均值群組3 :以1.08 mg/kg之平均劑量試樣組織、 CSF與血清比8 ΐΟνΪΑ Ih 36 脂肪組織（腎脂） 0010*01002 0.016 osm « 023 ± 0.00> 0.03? ii 0.002 腎上腺 0柳▲0俯 0.挪全a〇72 0JS9 i 0.077 0.4<S^ 〇j〇» 股骨〇L〇eS * 0.006 aiss ώ a〇J2 o.i»i ± σ.013 0.03S ± 0.00) (U94由⑽5 腦 αοι»^ο.ο〇3 0.02S *：0.00! ⑽$主αα» 腦脊髓液(CSF) 02Mb 00» b Λ22Ρ 0.072 ν 眼_ 0.007 L· 0.001 。识4 0.09S 0.006 ± Q.0G7 ο.ιβ a aan 心磁腎大腸肝 0.071 ^ OjOOI 0O93i： 0J»3 GOU^OJDQZ QJ19^a〇15 QJQ2虫咖 aosi ^ 〇l«& 0.145^ 〇.«Ι 0.<U 讼 0·022 <u»7 金 aou 0.197*^012 a战金⑽6 <U59±〇.〇B 0272^0024 肺 OfiMii〇.OQF7 0.768 ±aon 0.739 * 肌肉（骨骼肌） 02U«b〇jff30 a«5 A. QjQ2S « 0.045 。如 0.SS6 坐骨神經 0t.003 ^ 0.00! 0·位7 古 0 002 。⑽±0.财 0970^0003 小族〇j〇t7±〇M dLQSO 金 0.004 0.122^0.0» 0243 0i02 脊髓（联部、胸 a〇Ql it 0.007 o.«f7i±o.«r7 0.140^ 0.915 032$£QLQ29 部、頭部） 0.022^00» 〇〇〇$ & 0.001 «•田S ± 0.<»? 0.05)^0.004 脾 0l342 由 a〇44 &4Z7 ^ ΟΜύ Α4» 4 0.044 OJ10&a〇49 胃 0.<β2 ±： OjOOS 01094 士 act» &300 土 01979 ⑽ *0341 甲狀腺/副甲狀腺 i^69 «bans 3L181 ^ X52L 3XS61±X7I7 試樣组織、 CSF與血清比a 6h 24k 4Sb 脂肪组織（腎脂）〇.〇» ^ 9sm «% 物 ate 腎上腺 <140$ 士 (Μ伤 0527 ±0029 <L5i4 ^ aioe 091S&(tSl? 股骨猫腦脊髄液(CSF) 眼睛嫌 0烈士 (I畑 0483 fc ate a€Q8 ^ 0.001 ιΑ 0.163 A QlOU 必 mf* &Ι13*<10Χ» 你〇j〇68 知 ate nfa site 賢一大腸 0^6^0.001 &t77 金 0JE胡 0LM4AQXKS 0^15^ 0^83^00» 〇JQD« 0J397 L〇n ± 0.104 t«23 * 0.17D 肝〇j〇7^〇j〇44 am ± CMi ans & αοκ 成肺 0撕 4 0UQ2S 1744 士 ¢431 U770 士 0023 0.4Ά±ύΜ 肌肉（骨骼肌） 0332 A 0.0» &391 A 0.040 ojzi^aou 坐骨神經 <MT73 士⑽1 9.0» a% 的小族 &296 ^ &〇tfi 02½¾ 油脊髄（腰部、胸 0J14AO006 0JZ»£〇0G o.i4d^ a〇i9 sA 部、頸部）脾胃甲狀腺/副甲狀腺 0挪态QJ907 0.046 ^ 0JX9 a% αΛι 0.471 ± 〇Lf»S CL曲2 虫 <Utf7 Cj66\±0M Ld87*〇L230 ⑽士 037} 0 J07 士 0274^0.432 α4〇$ db βαη S2.475 * U JS2 52SJ35 A l^J&U ¢54.144^^1674 S7L341 * I01H7 -97- 157227.doc 201206462 表14a -在單次腦脊髓膜内給予125I-hGALC後雄性 Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液、胃腸道及膀胱内容物中放射性含量的群組平均值群組1 :以41 pg/動物之平均劑量 b IM 剞酱苜分th1 试樣 Watm JOttm m 腎上腺 αβοο^αοοο aooz± 〇.〇〇〇 OjOMa 〇.〇〇» OJG27 ή Q.024 腦 OiSOAQjOOD 0.010 A 0.009 腦脊髓液(CSF) oow* aooo· 0.00Qb 眼睛〇j〇oo^o.oocr 0XKk3db(U»l ⑽ 1 * 0.002 心臟 0.002 * ΌΧΚβ 〇uQ37^am «.D66AO.OQ9 腎 ox27* a«rt 0252 ^ o.as$ 0353 ± 0.057 肝 OjOOOA O.QOO a417 * a〇37 0i?4Sd> aios 0.121^0021 肺 0.0031 A Ό.σ» 00》，金 ft〇〇9 0.00] A 0.001 坐骨神烴 ojooo^aooo 〇j〇03 ★ 0.002 脊髄（》部、胸部、頦部） am ti aooo 0.004^1 0.004 0.024*0.009 OjOU ^ 0.001 0.0M 4： 0.Q1D 脾〇〇〇〇«〇〇〇〇甲狀脉/副甲狀腺 0.001 ^ 0.001 0.007 λ o.g〇2 ύ.024 a 0.0U Η骑埠小腾 σο〇0Α 〇·〇〇〇 0Λ93 A 0.054 〇3«4 i： 0.W 小賸内容物 aooo 410.000 0399*0.00 0J7t±Q.m 大縢内容物 0.000 Jfc O.QOO 0.090^0.018 0.\«5 ± a〇37 0000^0.000 0009 ± MOD aooo ±o.qoo 。從 A 0-007 0.066^0.009 胃内容物 O.OODaOOOO 0.48»ώα〇52 1.77* ± 0526 膀胱内容物〇J〇09* 0.001 0.110 4 〇.»0 QLue^oxm

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Dawley大鼠之組織、腦脊趙液、胃腸道及膀耽内容物中放射性含量的群組平均值群組2:以1.00mg/kg之平均劑量試樣 10mm 30 flat 割暑百分

Sh 腎上腺滕腦脊髓液(CSF) 眼睛心臟腎肝肺坐骨神經脊髄（腰部、胸部脾甲狀腺/副甲狀腺胃膀道小腸小無内容物大腸大脉内容物 I 胃内容物膀胱内容物頸部） 0J13 « α〇Β 0Λ2»Α 0.023 〇.〇») a 〇ύω 0jQ07* 0.001 0iS2^Q.0SS litis 0.172 4t7II Λ 3.901 4.024 A 0303 O.DQS ± αοοι 0.D45 ^0.005 IJHAtkM m4^o.oot 07^^0.121 O^O^OjOX ?*o,on \±(u〇〇a Q.t76 ^ 0.033 0343^0.127 ΟϋΟΘΟ^ 0J17 a.922 am^aou aooo^aooo 0.021 ^ aooi (U19 由 aots t966±a〇>l 3t.ltft*im 7M7± 0512 »0.003 r a〇〇8 t〇]4db(U93 0ΛΧΑΟ.Ο09 0.003 0.042 A < U77A023? 1.921 A 034$ 0Λ78& 0.076 034$ ±0.029 0437^0.050 1J37±0l2S7 〇4〇9* am |娜»*|=1§__|| I=i l:li ?i

ii 444***1·4****iii!i I 1J35 A 5.446^2102 0AU*^m 0.7Ώ 由 ftJQU 0992太0辦 103&A xsn 0^4S±(LS71 «.!00 ±0.041 試樣苕合the 24b 49¾ 96% 腎上腺猫腦脊髄液(CSF) 眼睛心臟腎肝肺坐骨神經脊髓（腰部、胸部、頸部) 脾甲狀腺/副甲狀腺胃腸道小勝小腸内容物大腸大腸内容物胃胃内容物膀胱内容物 ii i? 由去壬*4*^*士&&********Eisi ii 由**********4 ii§ 0J73 ^ 0.(0} OJQ〇dL〇.lS4 0.054^( 0^6±( 0.078^0023 XA$S^CX07 b 0.007 ,¾ ⑽i=_l i_li 士去由土由士厶**4**士ώΛ***4ii il !iig 由**土4**411*** 0.009 ^OjOOO 0.000 AiLOOO 0.000 db 0.000 OlOOd^OJQS OOOO^OJXO 〇L〇07±a〇6l 99- 157227.doc 201206462 表14c -在單次腦脊髓膜内給予及靜脈内團注125I-hGALC 後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織、腦脊髓液、胃腸道及膀胱内容物中放射性含量的群組平均值群組3:以1.08mg/kg之平均劑量试樣WJM 蹈脊髄液(CSF) 眼睛心臟腎肝肺蚤骨神經脊髓（腰部、胸部牌甲狀腺/副甲狀腺 g膳道小胁小膳内容物大腈大腈内容物霣内容物膀胱内容物頸部）

Minna O.OM&OQ13 0M6±MH OMS±(Lmo.u? ή o.oos 1.005 *〇.IC7 um ± Q.7B 0206« 0.033 Q.001 * 0.000 O.DQS 士 0.007 0.461^0.077 0.008 ^ 0.004 0286^0046 ⑽ 7 o.ui * tLm iutx»±a.fxo 0,100 士 0017 〇J«l A 0L029 αβ» * 0.021 gsy i= ,,βΛ*4*4Λ士*±*念*********i?1.157li_ it 氤 3h 0.033^ αοο» 0XR5±QJm «<038^0.002 0脚惫CJX8 0.01? 0.062 ibO.OOS 0.018 dr&ODI 0.021*0.003 0.165 ± am 0.1鉍去0识4 l.!79A〇j〇6! 0915« 0.00β 10.0» ^ m? ¢.754^0^13 0J7I &⑽7 〇4S7i〇.〇3J 0.0(6^0001 aooa ύ 0.002 0 .0B * 0.005 aois * a〇M 03» ft 0X02 0 2l?«0i»7 o.m ± 〇.〇« <09210071 ΙΛίΖώ (I26i U?6>fc 0.044 uu±〇Jm 4J14 企 U59 C3$0^QX8i oisi ± am α.«β ± o.isi 04彩士（U24 O^t ± Q393 ism* ism <*> IM3 <1834A αβο turn ai 0.007 剖普·§·分比a 試樣 24 b 49 b 腎上腺 OJOtOdt ϋΜΆ 0.402 ± 0.900 O.A0I 土 0 000 腦 &.024金。⑽ am^acoo 0.000^0000 腦脊髄液(CSF) 0.000» ft000· aotn^ 眼睛 σ⑽士 0.062^ Cum aoii^duooi am^ojoo 心联 β·ΐοβ 金 am (M〇5*a〇〇I 腎〇猫土〇掷 om^^m aosi 土 ao〇7 肝 1083 A 02C IdSAQjOV? D.737A d.043 肺 0^97 A aou oo»«om 〇J〇12^0.0D3 坐骨神經 0.004^0.001 0j0Q0aO.O0Q OlOOO^QjOOO 0.000^ OjOOO 脊髓（腰部、胸部、頭部） 0.016 ώ 0.003 am 去〇·〇〇〇脾 βΛ4β^α〇20 &0U由咖甲狀旅/剔甲狀腺 049β 忐(UMi 0^73 ^ 0J«Z 〇J67ih〇i(ttS 胃歸道小腾 0l9M^ 0153 0.125^Q.0«6 0.032 圭。加7 小膀内容物 20S4& 0.707 6^9S ώ 0.019 0.115^0.039 大腠 0SS9± (LQ97 0.03β± 0.009 0.013 « 0.002 大賸内容物 0^71 A 0.09S 0^90^0.115 0.041 ^ 0.071 胃 0^3 ± 0.3D 0.102 ^ 0.0M 0.014 * am 胃内容物 5^01 4 Χ6Λ 0410^03« 0.173 * 0.033 膀胱内容物 0.114^0.034 0.199^0.266 o.oai ^ ao〇2 ggggggg®0000008*mMgg020008 56***4*****41*4***41*** =1 ii 群組1(腦脊髄膜内平均劑量為41 pg/動物）在腦脊髓膜内給藥後，1251標記之物質普遍分佈至所檢 CSF中之放射性含量低於LOQ。曱狀腺（4.127±1.635 pg eq/g) (0.203 士 0.101 pg eq/g) 查之所有組織中，在給藥後48小時在然而曱狀腺/副時在胃中及在給藥後3 〔0.096±0.014 pg eq/g)及肺（0.058±0.014 pg eq/g)中觀測到小腎 157227.doc •100· 201206462 雄性大鼠^織中⑵！標記之物質的最高平均濃度。其他組織中之3量較低’且通常在給藥後3小時與6小時之間觀測到w值。在腦（0.005±0 001叫eq/g)及腎脂（〇〇〇6±〇刪 Mg eq/g)中觀測到最低Cmax值。到給藥後48小時及％小時大部分組織中之放射性含量低於檢測極限，甲狀腺/ 副曱狀腺、腎及胃除外。在給藥後96小時，在曱狀腺/副甲狀腺中觀測到最高平均濃度（1.927±1.585 eq/g，cmax 為 46.7/。），腎（〇.〇〇5±〇〇〇1 eq/g，c_ 為 5篇）及胃 (0.002土0.001 Mg eq/g，Cmax為 ”/〇)次之。一直到腦脊髓膜内給藥後24小時，對於該等組織，組織與血清比通常小於1。甲狀腺/副甲狀腺、腎及胃除外。到目前為止，在甲狀腺/副甲狀腺中觀測到最高比。到給藥後48小時及96小時，由於血清濃度低於L〇Q而無法計算組織與血清比。在給藥後3小時，所有組織中回收之放射性含量皆小於投與劑量之1¾，且在肝（0.91%)中觀測到最高比例。在給樂後1小時’僅發現胃内容物（1.8%)中比例大於投與劑量之1 °/。。到給藥後3小時’在小腸内容物（2.6°/。）、胃内容物 (5.0%)及膀耽内容物（1.2%)中檢測到比例大於投與劑量之 1%。在給藥後6小時，在小腸内容物（1.7%)及胃内容物 (4.0%)中發現比例大於投與劑量之ι%。到給藥後96小時，在腎、甲狀腺/副甲狀腺、胃及膀胱内容物中仍然回收到少量125I-hGALC衍生放射性（小於0.1%)，且在甲狀腺/副曱狀腺（0.09%)中觀測到最高回收率。 157227.doc -101- 201206462 群組2(靜脈内平均劑量為1.00 mg/kg)

在靜脈内投與後’在甲狀腺/副曱狀腺（294.521 士52.953 pg eq/g ;在給藥後48小時）、次之肺（20.629±2.125 pg eq/g ;在給藥後30分鐘）、肝（11.335±1.436 eq/g ;在給藥後1〇分鐘）、腎上腺（8.827士2.435 4苞6(}/经；在給藥後1〇分鐘）、脾（6.595士0.625 μgeq/g;在給藥後lo分鐘）及腎 (3·027±0·330 pg eq/g; 10分鐘）中觀測到群組2大鼠之組織中經放射標記之物質的最高平均濃度（Cmax)。除曱狀腺/副甲狀腺（在給藥後48小時）外，組織之tmax值均出現在給藥後 10分鐘與3小時之間。在腎脂（0.l58±0.019μgeq/g)、CSF (0.210±0.363 pg eq/g)、腦（0.252±0.041 pg eq/g)、骨骼肌 (0.275±0.025 pg eq/g)及脊髓（〇.293±0·028 pg eq/g)中觀測到最低平均放射性Cmax值。到給藥後96小時，在所分析18 種組織中之7種組織中仍然檢測到放射性，其中在甲狀腺/ 副曱狀腺（218.917±45_098 4呂69/莒，（：咖3£為74.3〇/〇)中檢測到最尚平均濃度，肝（〇.126±0.014 pg eq/g，Cmax為 1.1%)、脾 (0.111±〇.〇〇9 eq/g ’ Cmax為 1 7〇/〇)及腎（〇〇99土〇〇1〇叫 eq/g ’ Cmax為 3.3%)次之。在給藥後10分鐘’對於分析之所有組織，平均組織與血清比均小於1。到給藥後30分鐘及1小時，對於肺及甲狀腺/ 副甲狀腺’平均組織與血清比大於1。在給藥後3小時及6 小時’對於肝、肺及甲狀腺/副曱狀腺，平均組織與血清比大於1。在給藥後24小時及48小時，肝、肺、脾及甲狀腺彳甲狀腺之平均組織與血清比大於1。在給藥後96小 157227.doc •102· 201206462 時’對於腎、肝、脾及曱狀腺/副曱狀腺，平均組織與血清比大於1 »在甲狀腺/副甲狀腺（2485，在96小時）、肺 (6.5 ’在24小時）及肝（2.2 ’在24小時）中觀測到最高組織與血清比。 · 就佔所投與放射性之比例而言，在肝（41.7%，在給藥後 10分鐘）、肺（7.0% ’在30分鐘）、腎（2.2%，在10分鐘）、小腸（1.5%，在1小時）及甲狀腺/副甲狀腺（1.4%，在48小時）中觀測到組織中之最高平均值。在胃腸道内容物中，最高平均值係胃内容物（在給藥後3小時）中劑量之10.3%、小腸内容物（在給藥後3小時）中5.4%及大腸内容物（6小時）中 1.1 °/〇。到給藥後96小時，在曱狀腺/副曱狀腺（1 .〇〇/0)、肝 (0.5%)及腎（0.1%)中檢測到投與劑量之最高比例。在給藥後之此時間點，投與劑量之小於0.01 %仍然留在胃及膀胱内容物中。群組3(腦脊髓膜内給藥後接著靜脈内給藥：1.08 mg/kg(組合劑量））在腦脊髓膜内及靜脈内給藥後，在曱狀腺/副曱狀腺 (296.957±57.793 Mg eq/g ;在給藥後24小時）、次之肝 (10.181±0.600 pg eq/g ;在給藥後10分鐘）、腎上腺 (9.567±1.678pg eq/g;在給藥後 10分鐘）、肺（5.305±0.194 0§^/§;在給藥後1小時）、脾（5.〇42士〇.9〇24§64/居；在給藥後10分鐘）、胃（4·454±1.45 5 pg eq/g ;在給藥後3小時）、腎（3.390±0.183 pg eq/g;卜J、時）及 CSF(2.087±2.912pg eq/g ; 10分鐘）中觀測到群組3大鼠之組織中經放射標記之 157227.doc •103- 201206462 物質的最高平均濃度（cmax)。除大腸（在給藥後6小時）及甲狀腺/副曱狀腺（在給藥後24小時）外，組織之tmax值均出現在給藥後10分鐘與3小時之間。在腎脂（〇 188土〇〇2〇 Μ eq/g)、腦（0·283±0.062 pg eq/g)、脊髓⑺ 327±〇〇62 eq/g)及骨骼肌（〇·411±〇.〇〇9 eq/g)中觀測到最低平均放射陡匸„^值。到給藥後96小時，在所分析1 $種組織中之8 種組織中仍然檢測到放射性，其中在甲狀腺/副甲狀腺 (3.962±23.164 pg eq/g ’ Cmax為 14.8%)中檢測到最高平均濃度’肝（0.137±0.018 ng eq/g ’ Cmax為 1.3%)、腎（0·124±〇〇〇5 M eq/g ’ Cmax為 3.7%)、脾（0.083±0.009 叩叫仏，Cmax為 1.6%)及腎上腺（0 069±0 〇16 eq/g，為〇次之。在給藥後10分鐘，對於分析之所有組織，平均組織與血清比均小於1 ^到給藥後30分鐘及1小時，對於甲狀腺/副曱狀腺，平均組織與血清比大於丨。在給藥後3小時及石小時，對於胃及曱狀腺/副甲狀腺，平均組織與血清比大於 1。在給藥後24小時，肝及甲狀腺/副甲狀腺之平均組織與血清比大於1。在給藥後48小時及96小時，對於腎、肝及甲狀腺/副曱狀腺且對於脾（96小時）’平均組織與血清比大於1。在甲狀腺/副甲狀腺（854，在48小時）、肝（1.8，在48 小時）及腎（1_6，在96小時）中觀測到最高組織與血清比。就佔所投與放射性之比例而言，在肝（19 〇%，在給藥後 10分鐘）、腎（1.2%，在1小時）及小腸（1.2，在3小時）中觀測到組織中之最高平均值。在胃腸道内容物中，最高平均值係胃内容物（在給藥後3小時）中劑量之8.8。/。、小腸内容物 157227.doc -104· 201206462 (在給藥後3小時）中4.3%及大腸内容物（6小時）中1.0%。到給藥後96小時，在肝（0.3%)、甲狀腺/副甲狀腺（0.1%)及腎 (0.05%)中檢測到投與劑量之最高比例。在給藥後之此時間點，投與劑量之小於0.01%仍然留在腎上腺、心臟、肺、脾、胃及膀胱内容物中。 . 血液、血清、紅血球、CSF及組織中放射性之藥物代謝動力學 (表15及表16) 表15及表16中給出單次腦脊髓膜内及/或靜脈内給予125I-hGALC後大鼠血液、血清、紅血球、CSF及組織中放射性之平均藥物代謝動力學參數。表15a -在單次腦脊髓膜内給予125I-hGALC後雄性Sprague-Daw丨ey大鼠之血清、jk液及紅血球中總放射性之處置動力學 (Disposition Kinetics) 血清群組1 :以41 pg/動物之平均劑量 00 AlKW. (ligeq蝴 1: <V*) R1 00 AUC^ 〇igeq-t^g) %外推 AUC« 3 0.108 24 1.48 0.130 osns 534 1.54 4.00 血液 tnn (MSe^g) 00 AUQ^ 〇*geq切） k Ct'1) R: (h> AWW (μχ«ϊ·^> %外推 AUC^ 3 0·0930 24 U3 o.m 0.983 3诳 137 3.16 紅血球 AUC^te Λ R: tft <W AUCW 〇igcq^l〇 i外推 AUQ^, « 24 1.24 0.170 0.P80 4.0S 1*25 1.41 157227.doc -105- 201206462 表15b -在單次靜脈内團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、血液及紅血球中總放射性之處置動力學血清群组2 :以1.00mg/kg之平均劑量

tmm <t) C^. 00 AUC^o (uxecrh/ft> k O»·1) R* tH (h> AtXW 0«eq*h/R) %外推 V. fadJkd CL 0 20.1 96 7U 0.0226 0S97 307 75.0 5.21 »1 13J 血液 tmm (h) (PKc^id bo. 0>) AUQm. k 0»'1) 圮 (h> AWW (Mftcq-Ms) %外推 AUC^r v. (mUk8) a (ihL/hfte) 0 U.0 96 5U 0.0236 OW4 27.1 53-2 3.75 735 !&8 紅血球 00 CU 〇igeq-h(K> k 0^) h R* 00 AIXW (MReq-lUfe) %外推 AUC« V. (mlAg) Cl (niL/h^g) 0 <.40 48 319 0.0635 0·941 1(L9 35.7 4.94 441 28.0 表15c -在單次腦脊趙膜内給予及靜脈内團注125I-hGALC後雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、血液及紅血球中總放射性之處置動力學 i清群组3 :以1.08mg/kg之平均劑量

Ch) C^. (ρβ«Ψίΰ AUCm, k (h·1) R4 (b) AUCW (MK«<rh^) %外推 AUC^f V· (mlAe) CL (aOJh/kgi 0 16.9 96 89.8 0.0271 92.6 3.06 4» Π.7 血液

W CU. W k H AUCW %外推 V. a (h) 00 (flgttrb/td 00 R? (Id (Mcortk^O AUCwrf (inDke) (nd^IcK) 0 11.4 96 66S 0.0332 0.990 20J 68.0 1.64 478 Ι5·9 红血球 cw. ΛΧΧ^ k k* U AUCW %外推 v. a C(lA«4/fd (pseWid (k1) ㈤ Outarh^e) AO^fc* (nO/kg) (rnUhW 0 7.36 48 49.2 0.0721 0JM7 9.61 51.0 3.69 293 21J 106· 157227.doc 201206462 表16a -在單次腦脊髓膜内給予125I-hGALC後雄性Sprague_ Dawley大鼠之組織及猫脊趙液中總放射性之處置動力學群组1 :以41 μδ/動物之平均劑量試振 ίο» 如 6«喊⑽ AUCW, (M〇r»g)

V R* %外推脂肪组織（腎脂）腎上腺股骨 IS 腦脊髄液(CSF) 睢睛心β 腎大腸肝肺肌肉（骨骼肌）坐骨#經小縢脊髓（塍部、胸部脾 I 甲狀腺/副甲狀腺頸部)

iiipEJPJH 00215 * 4 ¢.1矽 z 4 尊 ά 0ΛΜ7 0.000 0345 αία U 0379 αιβτ 96 184 〇ϋΐι$ 24 0l3<7 ΟίΙ25 6 6.141 霜 24 MOI 0JDSK3 am 6 OJOi t 24 0.606 Φ.Ι21 6 0·〇436 > 6 am « 96 1Λ 0.0177 9ύ HI c irT-°f.li a由於不能嫌定终末相而無可報告之結果* b由於試樣小於LLOQ而未估計PK參數* c由於AUCo^外推超過20%或R2小於〇·8而未報告數值· 表16b·在單次靜脈内團注125l-hGALC後雄性SPrague-Dawley大鼠之組織及腦脊髓液中總放射性之處置動力學群组2:以l.00"^71"8之平均削量 ~^ ~% 外X~

a由於AUCow外推超過20%或R2小於0.8而未報告數值· b由於不能確定终末相而無可報告之結果* __m ____神細，Μ.jrm-

λΛΛ*Ϊ » fittW 脂肪组織（腎脂）腎上睞股骨腦雎脊髓液(CSF) 睢睛心臟腎大腸肝肺肌肉（骨骼肌）坐骨神經小腸脊败（胜部、胸部、頭部）牌霣甲狀腺y副甲狀腺 107- 157227.doc 201206462 表16c-在單次腦脊髓膜内給予及靜脈内團注125I-hGALC 後雄性Sprague-Dawley大鼠之組織及腦脊髓液中總放射性之處置動力學群组3 :以1.08 mg/kg之平均劑量試樣 U AUC^ fc t, 0¾¾¾¾) (¾ tewrh/a gt1) _g〇 AIKW %外推膀肪组織（腎脂） I 0J明腎上腺 0 XX6 股骨 χ.η m 0 tLW 腦脊败液(CSF) 0 眼睛 ⑽1 心臟 1J3 腎 I 大播 6 0.» 肝 ”3 1 $31 肌肉（骨骼肌） OMi 坐骨神經 $ \M 小脒 J.40 脊髓（胜部、胸部、頸部） 0 oast 脾 0 胃 4.43 甲狀滕/副甲狀腺 24 »7 0l0354 αοββ» 0.0947 α咖 0.0190 0076« α〇2β» a〇2S2 0210 0147 ^MSX 0.103 ΟΛ34Π dASSf o,om ^3ss^1ftlss^sss§2 •l7f7.nl7.7s§2J.TseJl5S.Msl12.42s.4 a由於AUGwnf外推超過20%或R2小於0.8而未報告數值。 sk液、血清及紅血球在腦脊髓膜内給藥（群組1 : 41 pg/動物）後，對於血清、全血及紅血球，自時間零至最後可量測時間點放射性濃度與時間曲線下之平均計算面積（AUC〇_tlast)分別為1.48 pg eq.h/g、1.33 pg eq.h/g及 1.24 pg eq.h/g。報告的 jk清、全血及紅血球中放射性之表觀終末t1/2值分別為5.34、5.02及 4.08小時。血清、全血及紅血球中之排出速率常數k經計算分別為0.130 h·1、0.138 h·1及0.170 h·1。血清、全血及紅血球中之AUC〇.inf經計算分別為1.54 pg eq.h/g、1.37 pg eq.h/g及1.25 pg eq.h/g。放射性自血清、全血及紅血球之排出相非常明確，如計算AUC〇.inW必需之外推百分比值非常低（分別為4.0%、3.2%及1.4%)所證實。在靜脈内給藥（群組2 : 1.00 mg/kg)後，對於血清、全血 157227.doc -108· 201206462 及紅血球，平均AUC〇_tlast值分別為71.1 pg eq.h/g、5 1.2 pg eq.h/g及33.9 pg eq，h/g，且表觀終末t1/2值分別為30.7、 2 7.1及10 · 9小時。血清、全jk及紅jk球中之k值經計算分別為 0.0226 h'1 ' 0.0256 h-1 及 0.0635 h·1 ° 放射性自血清、全血及紅血球之排出相非常明確，且血清、全血及紅血球中之 AUC〇_inf經計算分別為 75.0 pg eq.h/g(外推5.21%)、53_2 4吕69.11/经（外推3.75%)及35.7洋§69.11/§(外推4.94%)。全企 (735 mL/kg)中之表觀分佈體積（Vz)最大，血清（591 mL/kg) 及紅血球（441 mL/kg)次之。測試物質之清除率估計為13.3 mL/h/kg(自血清）及1 8.8 mL/h/kg(對於全血）。在給群組3動物腦脊髓膜内給藥及靜脈内給藥（組合劑量為1.08 mg/kg)後，對於血清、全血及紅血球，平均AUC〇_ tiast值分別為 89.8 pg eq.h/g、66.9 洋吕 eq.h/g 及 49.2 pg eq.h/g。報告的血清、全金及紅血球中放射性之表觀終末 t1/2 值分別為 25.5、20_9 及 9.61 小時，且 k為 0.0272 h·1、 0.03 32 h·1及0.0721 h·1。再次，對於所有三種基質，排出相非常明確，且血清、全血及紅血球中之AUC〇_inf經計算分別為 92.6 pg eq.h/g、68.0 pg eq.h/g 及 51.0 pg eq.h/g(外推 3.06%、1_64% 及 3.69%)。全血（478 mL/kg)中之 Vz 較大，血清（429 mL/kg)及紅血球（293 mL/kg)次之。清除率值為 15.9 mL/h/kg(對於全血）及11.7 mL/h/kg(對於血清）。組織在腦脊髓膜内給予125I-hGALC(群組1 : 41 μβ/動物）後，在曱狀腺/副甲狀腺（313 pg eq*h/g)中觀測到大鼠組織中之 157227.doc •109· 201206462 最高八11(：0.1丨如值，胃（2.60 pg eq.h/g)及腎（1.84 eq.h/g) 次之。對於數種組織，不能估計1^或衍生自k之任何參數 (即tW2及AUC〇_inf) ’此乃因將AUC外推至無限之百分比大於20°/。或者缺少終末相之數據。對於可估計k之組織（眼睛、心臟、腎、大腸、肺、小腸及胃），k介於〇.01 h·!至 0.17 h範圍内’且t1/2通常介於4 h至6 h範圍内，腎（586 h)及胃（39.1 h)除外。在靜脈内給藥（群組2 : 1.00 mg/kg)後，在曱狀腺/副甲狀腺（24989 pg eq.h/g)中觀測到最高 AUC〇.tlasj，肺（165 eq.h/g)、肝（1〇〇 pg eq.h/g)、脾（56.1 pg eq.h/g)、腎上腺 (43.1卜§69.]1/呂）及腎（4〇.7 08 69.11/§)次之》在腎脂（〇617 pg eq.h/g)及腦（0.735 pg eq.h/g)中觀測到最低AUC〇.tlast 值。對於排出相不甚明確之組織（甲狀腺/副甲狀腺及CSF) 或外推至AUC〇.inf大於20%之組織（腎脂及腦），不報告衍生自k之參數。僅肝及肺之AUCG-inf值大於金清之AUCG-inf值 (75 μβ eq.h/g)。據報告’肺具有最高 AUC〇.inj(167 pg eq.h/g ;外推 0.832%) ’ 次之為肝（105 eq.h/g ;外推 4.15%)、脾（61·2 pg eq.h/g ;外推 8.33%)、腎上腺（46.8 pg 69，11/§;外推7.89%)及腎（46.7 4§69.11/8;外推12.7°/〇)。經計算’脊髓（2.51 pg eq.h/g;外推4.87°/〇)具有最低 AUC〇-inf報告值，肌肉（2_69 pg eq.h/g;外推1.93%)及眼睛 (5.64卜呂69.11/§;外推5.19%)次之。組織中之最長可計算 t1/;z係41.6小時（腎），次之為34.6小時（腎上腺）及31.8小時 (脾）。報告之最短11 u係4 · 18小時（坐骨神經）。 157227.doc -110- 201206462 對於群組3 ’在腦脊髓膜内及靜脈内給藥（組合劑量為 1.08 mg/kg)後，在甲狀腺/副甲狀腺（16776叩eq.h/g)中觀測到最咼 AUC〇.tUst 值’肝（96.5 pg eq»h/g)、胃（72.1 pg eq.h/g)、腎（57.9 pg eq.h/g)、脾（46.9 pg eq.h/g)、肺（44·1

Mg eq.h/g)及腎上腺（43·9 eq.h/g)次之。在腎脂（〇 954叫 eq.h/g)及腦（1.03 pg eq.h/g)中觀測到最低 AUC〇.tlasHl_。對於外推至AUC〇-inf大於20°/。之組織（腎脂及腦）或R2小於〇 8 (CSF) 之組織，不報告衍生自k之參數。僅甲狀腺/副甲狀腺及肝之 AUC〇-inf值大於血清之 AUC〇-inf值（92.6 pg eq.h/g)。據報告，甲狀腺/副曱狀腺具有最高AUC〇.inf值（1839〇吨 eq.h/g ;外推 8.78%)，次之為肝（102 eq.h/g ;外推 5.0%)、胃（72.6 eq.h/g ;外推 0.766%)、腎（64.4 pg eq.h/g ;外推 10.1。/。）、脾（49·3 eq.h/g ;外推4 85%)、腎上腺（45.8μgeq·h/g;外推4.25¼)及肺（45·4μgeq·h/g;外推2.88°/。）。經計算，脊髓（3.77 0层69.11/§;外推6.55°/。）具有最低八1_1(1；〇_丨1^報告值，肌肉（4.66卩§69*11/§;外推6.25%) 次之。組織中之最長可計算…2係36.4小時（腎），次之為 27.5小時（肺）、25_7小時（肝）及25.4小時（甲狀腺/副甲狀腺）。報告之最短11Q係4.71小時（坐骨神經）。討論在腦脊髓膜内投與後，在給藥後3小時觀測到血清及全血中放射性之最咼平均濃度，此表明劑量相關物質相對快速地分佈至全身循環中。在靜脈内投與後，在量測之第一時間點觀測到血清及全血中放射性之最高平均濃度。血清 157227.doc -111· 201206462 中之濃度始終高於全血中之濃度，如血液與血清比小於i 所反映。此表明，劑量相關物質在給藥後之任一時間均未很大程度地與任一群組之血球結合。在血液蛋白質之沉澱後，主要在糰粒中回收到放射性，此表明大部分循環放射性與蛋白質結合，表明觀測到之放射性分佈在很大程度上不反映游離125埃之佈置。當比較群組2(靜脈内劑量為loo mg/kg)與群組3(腦脊髓膜内與靜脈内組合劑量為mg/kg)時，群組3血清及全血中之濃度似乎通常與群組2類似。兩個群組之兩種基質中放射性之下降亦非常類似，如藉由血液與血清比所評疋。比較群組2與群組3血清及血液之AUC()tiast&AUC。^，表明群組3動物於劑量相關物質中之暴露略微較高。在群組1中，CSF中之放射性含量非常低，此發現似乎與將測試物質直接投與腦脊髓膜内間隙中不符合，儘管在腦中觀測到非常低含量。然而，在給藥後不久在全身循環及全身組織中觀測到放射性，此表明劑量相關物質在投與後相當快速地自腦脊髓膜内間隙分佈出去。胃及腸内容物中之較尚含量表明’劑量相關物質經由翼便排泄，但在該研九中未在排泄物中實施直接量測。另外膀胱内容物中之回含量亦表明經由尿排泄。除甲狀腺/副曱狀腺中之高含量（認為其反映碘標記之損失及該標記在該組織中之持久14而非測試物質本身之分佈/持久性）以外亦在肝、肺、腎上腺、脾及腎中觀測到高放射性含量；該等組織可能與測試物質之代謝及/或排泄有關。 157227.doc •112- 201206462 在群組⑴中到給藥後之第一時間點放射性普遍且廣泛分佈。最高濃度通常涉及肝、肺、腎、脾、腎上腺，且尤其甲狀腺/副甲狀腺。因此，放射性在所有三個群組之組織中之分佈模式非常類似。再次，在所有動物之甲狀腺/ _甲狀腺中觀測到高放射性含量，尤其考慮到隨著給藥後 . <時間延長濃度顯著增加，此很可能表示碘標記之損失及該標記在該組織中之持久性而非測試物質本身之分伟/持久性。與群組1相比，在給藥後之早期時間點，該等群組中之CSF含量較高，此表明經放射標記之物質能夠跨越血腦障壁。與群組2相比再次在給藥後之早期時間點在群組3 之該基質中觀測到略微較高之含量，此表明該漢度係由自靜脈内劑量分佈出來之測試物質相關物質及直接注射至腦脊髓膜内間隙中之物質而引起。因此，觀測到群組i低於 LOQ值可為非常小試樣體積中之濃度非常低而低於該分析方法之可定量極限的結果。、到給藥後96小時，所有群組之大多數組織中之組織與血清比通常小於1 ’此表明劑量相關物質分佈至組織中而且與血清相比通常更容易自組織中清除。對於所有群組，大多數組織於劑量相關物質中之暴露（如藉由AUC〇 tiast所評定）小於血清。結論在向雄性大鼠投與單次腦脊髓膜内劑量（標稱為60 pg/動物）及/或靜脈内團注uq—hGALc劑量（標稱濃度為1 mg/kg)後，測定血液、血清、紅血球、CSF及組織 157227.doc -113· 201206462 中之放射性濃度。在腦脊髓膜内投與後在給藥後3小時或在靜脈内給藥後在給藥後之第一時間點（10分鐘），在血清及全血中觀測到最高放射性濃度，此表明相對快速地分佈至全身循環中。血清中之濃度高於血液中之濃度，此表明測試物質相關物質未很大程度地與血球結合。到給藥後之早期時間點放射性普遍且廣泛地分佈至組織中，且通常，所有三個群組之組織分佈模式類似。對於所有群組，大多數組織於劑量相關物質中之暴露（如藉由AUC〇-tlast所評定）小於血清。認為所有三個群組之甲狀腺/副甲狀腺中之高濃度表示碘標記之損失而非劑量相關物質在該組織中之分佈及持久性。到靜脈内給藥後96小時，仍然在數個所檢查組織中檢測到放射性。實例4 :調配物對mGalC與hGalC之締合及比活性之影響本實例闡述mGalC與hGalC之締合比較及比活性比較的一個實施例。本實例尤其闡述對於保持mGalC與hGalC之咼比活性至關重要之調配物β在一些實施例中，該調配物包括 5 mM磷酸鈉+150 mM NaCl (pH 6.0)。沉降速度係量測分子響應離心機中所產生之離心力移動之速率的分析型超速離心（AUC)方法，且為用於測定溶液中蛋白質締合狀態之有用技術。藉由AUC比較hGalC與 mGalc(l mg/mL，5 mM磷酸鈉-150 mM NaCl，pH 6.0)之締合狀態產生mGalC峰之較小譜尾，此表明低於hGalC之重量分子量物質（圖18)。天然凝膠數據表明存在hGalC低聚 157227.doc • 114· 201206462 體（圖19)。螢光及CD光譜分析表明在hGalC與mGalC之間在三級及/或二級結構上可存在微小差異（圖20)。實施差示掃描量熱法（DSC)以表徵1 mg/mL hGalC (Tm=60.3°C)及 mGalC (Tm=60.5°C)在 5 mM鱗酸納+150 mM NaCl (pH 6.0) 中之Tm(圖21)。另外，亦計算mGalC與hGalC之比活性，其中mGalC顯示高活性（圖22)。實例5: mGalC與hGalC之夭然SEC曲線本實例展示比較天然SEC曲線之對mGalC與hGalC之聚集研究的一個實施例。在一些實施例中，使用由R4批mGalC R4(原始）組成之調配物，其以3.56 mg/ml存於10 mM NaPi， 137mMNaCl，pH6_5，lmMMgCl2，5%甘油中。在一些實施例中，將該調配物以1.1 mg/ml透析至5 mM NaPi, 150 mM NaCl，pH 6.0中。在一些實施例中，使用以30 mg/mL 存於 5 mM NaPi，150 mM NaCl，pH 6 中之hGalC(圖 23)。實例6 :對hGalC之濁度分析本實例展示對hGalC之濁度分析之一個實施例。使用螢光分光計來檢測光散射強度。該方法依照公開程序使用 350 nm及5 10 nm波長。為量測光散射強度，以90度角量測螢光，其中將激發及發射設定為相同波長。在一些實施例中，在SoftMax M5及1 mm路徑長度光析槽中實施實驗。在此實施例中，BSA、缓衝劑及H2O之光散射強度（1 mm路徑）低於2,500 RFU。在一些實施例中，在Varian Carry Eclips及10 mm路徑長度光析槽中實施實驗。在此實施例中，BSA、缓衝劑及H20之光散射強度（10 mm路徑）低於50 157227.doc •115- 201206462 RFU。在一些實施例中，使用AMCO標準物在510 nm下之光散射強度來計算hGalC濁度單位（圖24A-D)。在一些實施例中，利用多項式曲線擬合。在一些實施例中，自對應標準曲線外推hGalC NTU以產生圖24E。實例7: ICV及ICV/IP rmGALC注射之臨床前研究及顫搐型小鼠（Twiteher Mice)之存活期延長本實例展示臨床前研究之一個實施例，其闡釋每週IP注射一次rmGALC之顏搐型小鼠的存活期延長。在本實施例中，在坐骨神經中觀測到髓鞘生成之改良以及鞘胺醇半乳糖苷含量降低及大肌肉運動功能（即，步態）改良。在一些實施例中，經單次IC V或IC V/IP rmGALC注射治療之顫搐型小鼠呈現存活期延長及腦鞘胺醇半乳糖苷含量之高達 63%降低。在單次ICV投與rmGALC後重要端點（即，存活期、腦鞘胺醇半乳糖苷含量）之陽性結果以及在增加全身投與（ICV/IP)後該等端點之極小程度改良表明，僅CNS方案係使用ERT治療GLD之可行臨床選擇方案。引言球樣細胞性腦白質營養不良（GLD)係一種體染色體隱性遺傳溶酶體貯積症，其發病率為約1:1〇〇,〇〇〇名新生兒（在斯堪的納維亞國家（Scandinavian countries)為 1.9:100,000 名新生兒）。GLD係一種進行性周圍（PNS)及中樞（CNS)神經系統病症，其係導致降解受質脂質[即，半乳糖苷基神經醯胺降解成半乳糖及神經醯胺；半乳糖苷基鞘胺醇（鞘胺醇半乳糖苷）降解成半乳糖及鞘胺醇]之半乳糖腦苷酶 157227.doc -116- 201206462 (GALC)酵素活性缺陷之基因突變的結果《該病症之特徵在於完全損失少突膠質細胞及髓磷脂以及存在充斥著半乳糖苷基神經醯胺之巨噬細胞（「球樣」細胞）。該疾病之臨床特徵以兩種形式存在：幼兒型及遲髮型。幼兒型GLD(亦稱為克拉伯病）在90%的診斷為GALC缺陷之所有患者中發生，且通常在出生後3-6個月内觀察到症狀，有在早至2-3週齡表現症狀之報導（Wenger，D.A.等人，2001 ， Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease) ， The Metabolic and

Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver,

Beaudet，A· L·，Sly，W.S.及Valle，D編輯，2001，McGraw-Hill.，第3669-3687頁；以引用方式併入本文中）。該疾病之遲髮型變體在臨床上通常到10週歲呈現，然而，已報導在40週歲時診斷患有該疾病之患者（Wenger，D.A.等人， 2001 ， Galactosylcer amide Lipidosis: Globoid Cell

Leukodystrophy (Krabbe Disease) » The Metabolic and

Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver,

Beaudet，A. L.，Sly, W.S·及Valle，D編輯，2001，McGraw-Hill. ，第 3669-3687頁；以引用方式併入本文中）。遲髮型患者經數年時間功能逐漸衰退。全身性酵素替代療法（ERT)已經為患有溶酶體儲存症 (LSD)(例如戈謝病（Gaucher disease)、法布裏病（Fabry disease)及亨特氏症候群）之患者提供益處（Wenger，D.A.等人，2001， Galactosylcer amide Lipidosis: Globoid Cell 157227.doc -117- 201206462

Leukodystrophy (Krabbe Disease) ， The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, Beaudet，A. L.，Sly，W.S.及Valle, D編輯，2001，McGraw-Hill. ，第 3669-3687 頁；Neufeld， E.F., 2004, Enzyme

Replacement therapy. Lysosomal disorders of the Brain， F.M.a.W. Platt, S.V.編輯，2004: Oxford University Press. 327-338 I Desnick, R.J., 2004. J. Inherit. Metab. Dis., 27(3):第385-410 ;所有該等文獻均以引用方式併入本文中）。ERT用於GLD未曾嚴格推行，或許因為該疾病侵襲 PNS及CNS〇當前用於GLD患者之治療包括造血細胞移植 (HCT)，然而，該程序由於具有顯著不良事件（即，30%的治療相關死亡率、終生免疫抑制療法）及僅在症狀發生前患者中具有功效而具有其侷限性。顫搐型小鼠係用於研究GLD之最常見的實驗動物模型，且係該疾病實驗工作之主體（Wenger，D.A.，2000，Mo/. Med. Γοί/α;;，6(11):第449-451頁；以引用方式併入本文中），但存在其他天然存在之表徵程度有所差異的GLD動物模型。自發突變存在於西高地白梗（West Highland White Terrier)/飢恩梗（Cairn Terrier)中（Kobayashi T.等人，1980, Brak Λα.，2〇2:479-83 ;以引用方式併入本文中）、無角多赛特綿羊（Dorset Sheep)(Pritchard D.等人，1980，Vet. Pfli/zo/.，17:399-405)、家貓（Johnson K.，1970, X 4m. Fei. MeA Jssoc·，157:2057-64 ;以引用方式併入本文中）及非人類靈長類動物恒河獼猴（Baskin G.等人，1998，Jniw. 157227.doc •118· 201206462

Sci.，48:476-82 ;以引 f 以引用方式併入本文中）。最初之神經同

*胞可長期恢復。然而，此技術不能歸納 I 療法（Baskin G.等人，1998，dwiw.

Sci·，48:476-82 ；以引用方式併入本文中）^在受侵襲小鼠中，HCT顯不受侵襲動物之壽命及體重增加顯著改良，然而’觀察到功效變化不定，其中記載之生存能力介於44天至大於100天之間（在接受髓鞘減少調節之小鼠中）(Lin，D 等人 2〇〇7，A/o/. 77zer.，15(1):第 44-52 頁；Hoogerbrugge, P.M.等人 ’ 1998，乂 C/i«. /_".，81(6):第 1790-4頁；兩篇文獻均以引用方式併入本文中）。該等研究中未治療小鼠之典型壽命為約40天。在該等及其他研究中，相比於未治療對照，治療小鼠中之髓鞠再生速率及現有腦病變均未得到改良（Yeager A等人，1984，Scz.ewce，225:1052-4 ; Toyoshima，Ε·等人， 1986, 乂 &Λ，74(2-3)，第 307-18頁；兩篇文獻均以引用方式併入本文中）。使用L-環絲胺酸（單獨或與HCT組合）靶向鞘胺醇合成實施受質抑制可延長顫搐型小鼠之壽命（LeVine S.等人，2000，乂心义，60:231-6 ;

Biswas S·等人，2003, Ze".，p347:33-6 ;兩篇文獻均以引用方式併入本文中）。L-環絲胺酸與適於治療焦慮症之其對映異構體D-環絲胺酸不同，其毒性太大以致於 157227.doc -119- 201206462 不能用於人類。基因療法實驗（單一療法或與HCT組合）已顯示在轉染細胞中產生酵素及延長顫搐型小鼠壽命之能力 (Lin，D·等人，2007, Mo/· 77zer·，15(1):第 44-52 頁；以引用方式併入本文中）。當用於症狀發生前動物時，受質減少、HCT及基因療法皆提供最顯著功效，而在具有症狀之動物中其對疾病無影響或影響有限。因此，ERT可在GLD 之治療中提供可行的選擇方案，尤其在給予症狀發生前患者時。結果當與媒劑治療動物相比較時，使用衍生自HEK 293之鼠類GALC (rmGALC; 5 mg/kg)(以多次腹膜内（IP)注射形式周圍給予）實施全身投與之酵素替代療法可延長顫搐型小鼠之壽命及減少鞘胺醇半乳糖苷積聚達15%(表17、圖 25)。表17-IP投與rmGALC可延長顫搐型小鼠之存活期劑量群組存活期(天） Mann-Whitney 分析 (與媒劑相比）平均值範圍 Min Max 未治療 42.6 39 45 0.49 媒劑 43.2 37 48 n/a 1 mg/kg 43.0 40 46 0.61 5mg/kg 48.9 46 54 0.0003 10 mg/kg 49.2 47 54 0.0003 與未治療或媒劑治療動物相比，經IP投與rmGALC治療之小鼠在步態測試中表現較好，且坐骨神經組織病理學得 157227.doc •120· 201206462 以改良。周圍（IP)投與之rmGALC藉由尚未已知之機制最低程度地遞送至腦中，導致腦鞘胺醇半乳糖苷略微減少。然而，腦組織病理學似乎無任何變化。因此，在經每週一次重複全身投與（IP) rmGALC (5 mg/kg)治療之顫搐型小鼠中觀察到之結果係存活益處、腦鞘胺醇半乳糖苷含量略微降低及大肌肉運動功能改良。

在顫搐型小鼠中單次ICV及ICV/IP組合投與rmGALC 結果顯示，高劑量ICV/IP治療群組平均存活50天（120 pg/5 mpk)，而媒劑治療動物僅存活36天（圖26)。僅用ICV rmGALC治療之小鼠顯示劑量反應性平均存活時間，為42 天（40 pg)及 48 天（120 pg)。單次 ICV 注射 120 pg rmGALC 可降低腦鞘胺醇半乳糖苷含量（63%)，而單次ICV注射40 pg rmGALC使鞘胺醇半乳糖苷減少39%(圖27)。儘管ICV/IP投與和單獨ICV相比在鞘胺醇半乳糖苷減少方面未提供任何額外益處，但使用組合方案時觀測到鞘胺醇半乳糖苷含量降低48%，顯著低於使用每週一次單獨IP治療時所觀測到的（15%)。另外，使用ICV以40 pg含量實施治療時觀察到距離注射位點較遠之位點處腦組織學之改良（圖28)。該等結果證實在直接ICV注射後rmGALC於腦中之活性及生物分佈。然而，僅經ICV rmGALC治療之小鼠不能顯示坐骨神經纖維形態或髓鞘生成之恢復，且大肌肉運動功能（例如，步態分析）僅略微改良。在單次ICV投與rmGALC後重要端點（即，存活期、腦鞘胺醇半乳糖苷含量）之顯著改良表明在全身循環中缺乏足夠酵素濃度。 157227.doc -121 - 201206462 臨床給藥參數：顫搐型小鼠中之鞘胺醇半乳糖苷再積聚速率在顫搐型小鼠模型中實施以下研究以確定合適的臨床劑量範圍： -在出生後第19天（PND19)單次ICV注射後顫搐型小鼠中之腦鞘胺醇半乳糖苷再積聚速率。 -在顫搐型小鼠中使用腹膜内（IP) +大腦室内（ICV)組合 rmGALC注射實施劑量發現研究為評定中樞神經系統中之鞘胺醇半乳糖苷再積聚速率，在PND19使用單次ICV注射12 pg或40 pg rmGALC來治療顫搐型小鼠。在注射後24 hr (PND20)且隨後每三天屠宰小鼠群組（n=3) 〇取出腦組織並實施鞘胺醇半乳糖苷分析、組織病理學及酵素活性分析。監測動物亞群之存活情況 (n=8)’並在PND40分析運動功能（步態分析）。經由質譜（LCMS有限公司，North Carolina)分析單次iCV 注射後腦勻漿中之鞘胺醇半乳糖苷含量，且表明在投與 rmGALC後24 hr内鞘胺醇半乳糖苷快速減少（圖29)。鞘胺醇半乳糖苷之減少趨勢在酵素投與後保持24天。另外，與媒劑治療動物相比，鞘胺醇半乳糖苷濃度之降低在該時間段内呈現劑量依賴性：媒劑治療（平均·· 45 ng/mi鞘胺醇半乳糖苷）對！2 μ rmGALC(平均：2 5 mg/ml鞘胺醇半乳糖苷）對40 Mg/ml rmGALC(平均：丨6 ng/mi鞘胺醇半乳糖苷）。令人感興趣的是，研究結束時（在治療後2832天）在兩個劑量群組t觀測到之勒胺醇半乳糖苦含量增加表明若 157227.doc •122· 201206462 每月投與一次ERT可能不成功。可能需要更頻繁之給藥時間表。由於每一取樣時間點時動物之數量較少，故結果之變化很明顯。然而，基於該等結果，顯而易見，鞘胺醇半乳糖苷再積聚約以4週（28天）時間表發生。當分析存活時間時，結果顯示12 pg/mL及40 pg/mL 1*111〇八1^€：治療群組具有48天（12 4层/1111^)及50.5天（4〇4层/1111〇之中值存活期，而媒劑治療動物存活40天（圖30)。出人意料地，相比於媒劑治療動物存活40天，經40 pg人類GALC (rhGALC)治療之小鼠顯示僅存活42天之存活益處。 rhGALC之該較低功效的原因尚不瞭解，但將在隨後部分中進行討論。然而，自該研究之結果可以明顯地看出，即使較低劑量之rmGALC仍然在顫搐型小鼠模型中有效而顯示存活益處。臨床給藥參數··顫搐型小鼠中之rmGALC及rhGALC劑量範圍研究先前結果顯示，使用ICV/IP rmGALC(120 pg及5 mpk)治療之顫搐型小鼠比媒劑治療動物多存活14天。然而，僅使用直接CNS注射治療之顫搐型小鼠顯示劑量反應性改良，平均存活期為12天（120 pg ICV)及6天（40 pg ICV)。鼠類腦中之120 pg劑量在患者中轉變成300 mg/kg腦之劑量；因此，研究較低劑量之rmGALC的功效非常重要。另外’在顫搐型小鼠中檢測先前一批rhGALC之功效。從PND 1 〇開始每週一次IP注射（5 mg/kg) rmGALC加上在PND19單次 ICV注射 12 pg(30 mg/kg腦重量）或26 pg(60 mg/kg腦重量） 157227.doc -123· 201206462 之rmGALC或rhGALC來治療小鼠群組。在PND39時，屠宰小鼠亞群（n=3/群組）以收穫組織（腦、坐骨神經、肝、血清）。對腦組織實施鞘胺醇半乳糖苷分析、組織病理學及酵素活性定量。監測其餘存活動物（n=8)之存活情況及步態分析。討論該劑量發現研究之結果顯示rmGALC投與之存活益處具有輕微的劑量依賴性趨勢（圖31)。12 pg/5 mpk及26 pg/5 mpk組合劑量之rmGALC分別使顫搐型小鼠之平均壽命延長至44_5天及45.5天，相比之下，媒劑治療動物之壽命為 40.5天。不幸的是，12 pg/5 mpk(38天）及26 pg/5 mpk(39.5 天）劑量之rhGALC無存活益處。26 pg/5. mpk rhGALC劑量使受侵襲顫搐型小鼠之壽命延長1.5天，然而任何劑量之 rhGALC均未達到媒劑治療動物之存活天數（圖31) »如先前在使用rmGALC全身治療（IP)之動物中所觀察到的，對於接受組合ICV/IP投與rmGALC之所有動物，觀察到步態分析之改良，然而使用單次ICV注射治療之動物顯示較少運動功能益處（圖32)。如對於壽命益處所觀察到的，在使用 rhGALC治療之動物中未觀察到步態分析之益處。因此，該等當前結果表明，即使使用較低劑量之rmGALC，亦存在存活及運動功能之益處，由此增加了 ERT用於治療GLD 之機會。然而，顯而易見，鞘胺醇半乳糖苷再積聚約以4 週（28天）時間表發生。 rhGALC :在顫搐型小鼠模型中無存活益處 157227.doc -124· 201206462 考慮到先前利用rmGALC顯示之結果，未預期到在給予較低劑量之rhGALC (12 pg，26 pg)後未觀察到存活益處或利用40 pg rhGALC時觀察到降低之存活益處。已確定無此功效之若干原因且其正處於研究之中。首先，用於顫搐型小鼠研究中之rhGALC批次（批次73)尚處於研發過程早期且僅第二批次欲藉由PD於内部產生。因此，該批次rhGALC 達成之最大濃度係8.74 mg/mL，從而限制可檢測之劑量。其次，批次73之比活性為rmGALC活體外活性的約33%(表 18)。表 18-rmGALC及 rhGALC活性

令人鼓舞地，最近rhGALC批次（批次94)之活性顯示為 rmGALC之161°/。且為批料73活性的3倍。第三，不管注射途徑如何，在顫搐型小鼠中利用rmGALC及rhGALC進行治療皆可產生抗該等蛋白質之血清抗體。預期rmGALC及 rhGALC具有抗原性，因為顫搐型小鼠係裸模型（null model)[即’其呈交叉反應免疫物質（CRIM)-陰性]。總之， 157227.doc •125· 201206462 rhGALC治療小鼠（ICV/ΙΡ方案）中之最大血清抗體效價顯著高於使用相對照ICV/IP rmGALC方案治療之小鼠（圖33)。儘管經直接CNS注射治療之小鼠中亦存在抗體（僅可獲取 rmGALC數據），但最大效價為接受ICV/IP治療之動物的幾分之一。該等抗體之來源（即，CNS對周圍）尚不清楚。儘管未對該等血清試樣實施進一步表徵，但可能已產生中和抗體。已開始在GALC缺陷犬中進行第一研究並試圖表徵 rhGALC之抗原性。在該研究中，每週一次IV投與2 mg/kg 人類GALC及/或IT投與2.25 mg(30 mg/kg腦重量）人類 GALC或單獨媒劑來治療受侵襲動物（出生後6週）。在8週時且在剩餘研究時間内每月一次投與額外治療（直至出生後約16週）。取出CSF，隨後無痛致死，並分析抗體形成及鞘胺醇半乳糖苷含量（圖34)。在MPSIIIA之牧羊犬（Huntaway dog)模型中使用重組人類肝素N-硫酸酯酶之先前研究顯示對外源酵素之顯著抗體反應，使得需要在該研究中使動物免疫耐受。檢測天然及 rhGALC治療犬之CSF的初步結果顯示，與未治療對照相比鞘胺醇半乳糖苷含量明顯降低（圖34)。實例8:經IT注射之Ga丨C在小鼠中之腦及肝組織學/標記本實例闡述在小鼠中經IT注射之hGalC及mGalC以及 GalC抗體在各個組織中之對應檢測及定位的一個實施例。實驗設計 157227.doc -126- 201206462 實驗設計：

群組 N 治療劑量(pg) 注射體途徑積⑽）頻率屠宰 A 6 媒劑對照 0 10 μΐ IT 每週一次注射，連續三週在最後一次注射後24 hr B 6 hGalC (研究） 100 C 6 hGalC (PD) D 6 mGalC 組織採集及組織學染色僅分別來自群組B及C之三隻動物可用於組織學分析。將腦及肝試樣固定於1 0%中性緩衝福馬林（formalin)中以便隨後實施石蠟包埋。製備5 μιη石蠟切片用於I2S之免疫組織化學（IHC)以檢測注射之蛋白質。使用三種抗-GalC抗體來實施GalCA之IHC染色。 1. 小鼠單株抗體（由Dr. Eckman實驗室產生） 2. 兔多株抗體（由群組B產生） 3. 兔多株抗體（由群組C產生）使用高靈敏度的ABC+酪胺醯胺（Tyramide)螢光擴增方法來標記目標蛋白質。染色結果將GalC陽性細胞顯示為綠色，細胞核顯示為DAPI藍色對比染色，且背景區域顯示為黑色。結果群組B多株抗體與小鼠腦中之内源蛋白質具有強烈交叉反應。即使在媒劑對照腦中，所有CNS細胞皆強烈陽性染色。在該強烈背景下不能識別出注射之蛋白質（圖35)。群 157227.doc -127- 201206462 組c多株抗體與小鼠腦中之内源蛋白質具有較弱交叉反應’但媒劑對照腦中之CNS細胞仍然呈陽性。在該背景上不能檢測到注射之蛋白質（圖36)。小鼠單株抗體具有可接受之特異性’在媒劑對照腦中具有遠遠較低之信號（數據未顯示）。IT注射後，所有蛋白質均在腦表面上之腦脊髓膜中檢測到。群組B及群組C之hGalC均在位於腦脊髓膜下方之區域中之CNS細胞（神經元及神經膠質細胞）中檢測到’其中群組B治療動物之hGalC信號相對較強。未在 mGalC治療腦中檢測到陽性神經元及神經膠質細胞（圖 37)。在小腦中，hGalC在腦脊髓膜中及在顆粒區表面上產生染色，而媒劑未如此（圖38)。小鼠單株抗體在小鼠腦中有效’但在肝中顯示與竇狀隙細胞之強烈交叉反應性，因而不能用於評定肝中經IT注射之蛋白質之細胞吸收（圖 39)。群組C多株抗體在肝組織中顯示特異性，而在媒劑對照腦中信號遠遠較低。治療後，在肝中之寶狀隙細胞及肝細胞中均可檢測到所有經IT注射之蛋白質，而群組B治療動物具有較少hGalC陽性細胞且hGalC信號較弱（圖40)。儘管在任一治療群組中均未發現較高GalC活性，但在腦脊髓膜中及在周圍區域中之CNS細胞中發現陽性染色，表明 IHC在檢測注射之蛋白質（已在細胞層面上被吸收）方面靈敏（圖41A)。在肝中，mGalC顯示較高活性，然而，經由群組C Ab之IHC在mGalC與hGalC之間檢測到非常小差異（圖 41B)。使用群組B Ab時hGalC之可檢測活性較低與觀測到之IHC含量較低一致。 157227.doc •128· 201206462 概述 IT注射後，經由IHC可在大腦之腦膜中檢測到所有注射之蛋白質。在CNS細胞（神經元及神經膠質細胞）中檢測到群組B及群組C之注射hGalC的細胞吸收，而群組b治療腦中之hGalC信號相對較強。未在mGalC治療腦中檢測到陽性神經元及神經膠質細胞。在小腦中，除腦脊趙膜中有陽性信號以外，亦在顆粒區表面上之細胞層中發現群組B及群組C之注射hGalC。在所有治療群組之肝中，在竇狀隙細胞及肝細胞中檢測到注射之蛋白質’此表明腦脊髓膜内 I2S最終吸收至循環系統中。群組c^mGalc及hGalc與群組B之hGalC具有近似強烈的染色信號。實例9:經IT注射之Ga丨C在犬中之滕組織學/標記本實例闡述在犬中經IT注射之Gale以及Gale抗體在腦中之對應檢測及疋位的一個貫施例。在該實施例中，在腦脊髓膜及腦脊髓膜下方之表面皮質區域中檢測到經it注射之蛋白質。在腦室周圍區域中發現經ICV注射之蛋白質（圖 42A)。IT注射後，GalC IHC顯示在皮質中有擴散的細胞外染色圖案’而神經元呈現陰性信號（以圓圈圈出）（圖42B)。在ICV注射之腦室周圍區域及IT注射之皮質中觀察到呈陽性Iba染色之激活的小神經膠質細胞有限的減少（圖43)。在媒劑群組中’使用LFB/PAS在皮質中未發現形態變化（球樣細胞）’且各群組間未觀察到差異。ICV治療後在腦室周圍區域之4個有限區域中經iba染色標記之球樣細胞（箭號）減少（圖44)。 157227.doc -129- 201206462 【圖式簡單說明】圖1繪示實例性結果，其概述在成年猴子中測試之媒劑。圖2繪示實例性結果，其展示hGalC之穩定性及比活性。圖2A繪示實例性結果，其展示hGalC隨pH而變之熱篩選。圖2B繪示實例性結果，其展示hGalC隨pH而變之比活性。圖3繪示實例性結果，其展示hGalC隨鹽濃度而變之熱篩選。圖4繪示實例性結果，其展示GalC之沉降速度實驗，該實驗比較在5 mM磷酸鈉（pH 6.0)緩衝劑中之不同離子強度。圖4A繪示使用50 mM NaCl及hGalC之實例性結果。圖 4B繪示實例性結果，其展示150 mM NaCl及hGalC。圖4C 繪示實例性結果，其展示500 mM NaCl及hGalC。圖4D繪示實例性結果，其展示150 mM NaCl及小鼠GalC。圖5繪示實例性結果，其展示GalC隨鹽濃度而變之AUC 曲線（1 mg/mL GalC，5 mM填酸鈉，pH 6.0)(Y軸=s*g(s*) ; X 軸=s*) 0 圖6繪示實例性結果，其展示hGalC在通用緩衝劑（pH 6.0)中之稀釋系列（Y軸=<g(s*)/C〇>(l/斯韋德貝裏（svedberg)); X軸=s*(斯韋德貝裏））。圖7繪示實例性結果，其展示GalC隨pH而變之AUC曲線 (1 mg/mL，3 mM檸檬酸鹽、磷酸鹽及硼酸鹽緩衝劑，含有 50 mM NaCl)。圖8繪示實例性結果，其展示在最高濃度下之WDA分 157227.doc -130- 201206462 析，該分析比較在pH 6.0(5 mM磷酸鈉及150 mM NaCl)下之基線及應力試樣。圖8 A繪示實例性結果，其展示基本讀數。圖8B繪示實例性結果，其展示應力讀數。圖9以圖示方式比較並重疊基線及應力GalC試樣。圖10繪示實例性結果，其展示hGalC在1% NaTC存在下之稀釋系列。圖11繪示實例性結果，其展示hGalC在1% NaTC存在下之稀釋系列（1 .〇 mg/mL及 0.3 mg/mL)。圖12A繪示實例性結果，其展示hGalC (1 mg/mL)在不同緩衝劑及pH中之固有螢光。圖12B繪示實例性結果，其展示hGalC隨pH而變之圓二色性。圖13繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜内給予 125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、血液及紅血球中放射性之群組平均濃度。圖14A繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜内給予 125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、血液及紅血球中放射性之群組平均濃度。圖14B繪示實例性結果，其展示在單次靜脈内團注125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、血液及紅血球中放射性之群組平均濃度。圖14C繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜内給予及靜脈内團注125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、血液及紅血球中放射性之群組平均濃度。圖15 A繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜内給予 125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清及組織中放 157227.doc -131 - 201206462 射性之平均濃度。圖15B繪示實例性結果，其展示在單次靜脈内團注125I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清及組織中放射性之平均濃度。圖15C繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜内給予及靜脈内團注125I_hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清及組織中放射性之平均濃度。圖16A螬·示貫例性結果，其展示在單次腦脊髓膜内給 125 I-hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、腦脊髓液及組織中放射性之平均濃度。圖16B繪示實例性結果，其展示在單次靜脈内團注lA-hGWC後，雄性Sprague Dawie'y 大鼠之血清、腦脊髓液及組織中放射性之平均濃度。圖 16C繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜内給予及靜脈内團注125I_hGalC後，雄性Sprague-Dawley大鼠之血清、腦脊髓液及組織中放射性之平均濃度。圖17A繪示實例性結果，其展示在單次腦脊髓膜内給 12 5 ^ I-hGalC後，雄性Sprague-Daw丨ey大鼠之血清及組織中放射性之平均濃度。圖17B繪示實例性靜脈内團注〜後，雄性一Dawl;== 及組織十放射性之平均濃度。圖17C繪示實例性結果其展示在單次腦脊髓膜内給予及靜脈内團注後，' 雄性Sprague-Dawley大鼠之血清及組織中放射性之平均濃度。 ’ 圖18A繪示實例性結果，其展示藉由鞭比較⑽批與 mGalC之締合狀態（1 mg/mL，5 mM鱗酸納+i5〇 157227.doc •132- 201206462

NaCM，pH 6.0)。圖19繪示實例性結果，其展示GalC在天然凝膠中之締合狀態。圖20繪示實例性結果’其展示mGalC對hGalC之螢光及 CD光譜（1 mg/mL，5 mM磷酸鈉+150 mM NaCl，pH 6.0)。圖21繪示實例性結果’其展示hGalC及mGalC之差示掃描量熱法（1 mg/mL，5 mM填酸納 +150 mM NaCl ’ pH 6.0)。圖22繪示實例性結果，其展示mGalC (1 mg/mL)與hGalC (1 mg/mL)在5 mM磷酸鈉+150 mM NaCl (pH 6.0)中之比活性。圖23繪示實例性結果，其展示mGalC與hGalC之天然SEC 曲線之比較。圖24A繪示實例性結果，其展示hGalC之光散射強度 (Soft Max Instrumental mm路徑）。圖24B繪示實例性結果，其展示AMC0濁度標準物之光散射強度（Soft Max Instrumental mm路徑）。圖24C繪示實例性結果，其展.示 hGalC之光散射強度（Varian Carry Eclips)(l 0 mm路徑）。圖 24D繪示實例性結果，其展示AMC0濁度標準物之光散射強度（Varian Carry Eclips)(10 mm路徑）。圖24E繪示實例性結果，其展示使用AMC0標準物計算之濁度單位。圖25繪示實例性結果，其展示IP投與rmGalC可降低顫搐型小鼠中腦之鞘胺醇半乳糖苷含量。數據代表每個治療群組中n=4隻小鼠之平均值土 SEM。 157227.doc -133- 201206462 圖26繪示實例性結果，其展示僅使用ICV及使用ICV/IP 之rmGalC療法時延長之存活期。圖27繪示實例性結果，其展示在顫搐型小鼠中，在ICV 及ICV/IP注射rmGalC後，腦勒胺醇半乳糖苷顯著減少。圖28繪示實例性結果，其展示在經40 pg rmGalC治療之顫搐型小鼠中觀察到組織學標記有所改良。使用神經膠質纖維酸性蛋白（GFAP)作為星形細胞標記。使用Iba 1作為小神經膠質細胞/巨噬細胞標記。使用溶酶體相關膜蛋白-1 (LAMP-1)作為溶酶體標記。圖29繪示實例性結果，其展示在單次ICV注射rmGalC或媒劑後，鞘胺醇半乳糖苷再積聚。圖30繪示實例性結果，其展示在PND19/20時經單次ICV 注射rmGalC治療之顫搐型小鼠之存活百分比。數據代表每個群組n=8。圖31繪示實例性結果，其展示經ICV/IP rmGalC及 rhGalC治療之小鼠之存活百分比。圖32繪示實例性結果，其展示對經單次ICV注射rmGalC 及rhGalC治療之小鼠之步態分析。圖33繪示實例性結果，其展示在顫搐型小鼠中對rmGalC 或rhGalC之抗原反應。圖34繪示實例性結果，其展示幼稚（naive) GLD犬及經 rhGalC治療之GLD犬之CSF中鞘胺醇半乳糖苷之含量。圖35繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在大腦中使用群組B多株抗體之IHC染色。 157227.doc -134- 201206462 圖36繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在大腦中使用群組C多株抗體之IHC染色。圖37繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在大腦中使用小鼠單株抗體之IHC染色。圖38繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在大腦中使用小鼠單株抗體之IHC染色。圖39繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在肝中使用小鼠單株抗體之IHC染色。圖40繪示實例性結果，其展示IT注射GalC在肝中使用群組C多株抗體之IHC染色。圖41A繪示實例性結果，其展示腦中之平均GalC活性。圖41B繪示實例性結果，其展示肝中之平均GalC活性。圖42A繪示實例性結果，其以10X展示腦中之GalC免疫染色。圖42B繪示實例性結果，其以40X展示腦中之GalC 免疫染色。圖43繪示實例性結果，其以40X展示對激活小神經膠質細胞之Iba染色。圖44繪示實例性結果，其以10X展示腦中之LFB/PAS染色。圖45展示具有緊固機構之腦脊髓膜内藥物遞送裝置 (IDDD)之實例性簡圖。圖46A繪示患者體内可放置IDDD之實例性位置；圖46B 繪示腦脊髓膜内藥物遞送裝置（IDDD)之各個組件；且圖 46C繪示患者體内用於IT-腰椎注射之實例性插入位置。 157227.doc -135- 201206462 序列表 <110>美商舒爾人類基因療法公司 <120>於腦脊髓膜内遞送β·半乳糖腦苷酶之方法及組合物 <130> 2006685-0050 <140> 100122530 <141> 2011-06-27 <150> US 61/358,857 <151> 2010-06-25 <150> US 61/360,786 <151> 2010-07-01 <150> US 61/387,862 <151> 2010-09-29 <150> US 61/435,710 <151> 2011-01-24 <150> US 61/442,115 <151> 2011-02-11 <150> US 61/476,210 <151> 2011-04-15 <150> US 61/495,268 <151> 2011-06-09 <160> 4 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 648 <212> PRT <213>智人 <400> 1

Tyr Val Leu Asp Asp Ser Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly lie 15 10 15

Gly Ala Val Ser Gly Gly Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr 20 25 30

Pro Glu Pro Tyr Arg Ser Gin lie Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn 35 40 45

Phe Gly Ala Ser Leu His lie Leu Lys Val Glu lie Gly Gly Asp Gly 50 55 60

Gin Thr Thr Asp Gly Thr Glu Pro Ser His Met His Tyr Ala Leu Asp 65 70 75 80

Glu Asn Tyr Phe Arg Gly Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys 85 90 95

Lys Arg Asn Pro Asn lie Thr Leu lie Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro 100 105 110

Gly Trp Leu Gly Lys Gly Phe Asp Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gin Leu 115 120 125 157227.doc 201206462

Thr Ala Tyr Tyr Val Val Thr Trp lie Val Gly Ala Lys Arg Tyr His 130 135 140

Asp Leu Asp lie Asp Tyr lie Gly lie Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn 145 150 155 160

Ala Asn Tyr lie Lys lie Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gin Gly Leu 165 170 175

Gin Arg Val Lys lie lie Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Ser lie Ser 180 185 190

Ala Ser Met Leu Leu Asp Ala Glu Leu Phe Lys Val Val Asp Val lie 195 200 205

Gly Ala His Tyr Pro Gly Thr His Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Thr 210 215 220

Gly Lys Lys Leu Trp Ser Ser Glu Asp Phe Ser Thr Leu Asn Ser Asp 225 230 235 240

Met Gly Ala Gly Cys Trp Gly Arg lie Leu Asn Gin Asn Tyr lie Asn 245 250 255

Gly Tyr Met Thr Ser Thr lie Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr 260 265 270

Glu Gin Leu Pro Tyr Gly Arg Cys Gly Leu Met Thr Ala Gin Glu Pro 275 280 285

Trp Ser Gly His Tyr Val Val Glu Ser Pro Val Trp Val Ser Ala His 290 295 300

Thr Thr Gin Phe Thr Gin Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly 305 310 315 320

His Leu Glu Lys Gly Gly Ser Tyr Val Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly 325 330 335

Asn Leu Thr lie lie lie Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys 340 345 350 lie Arg Pro Phe Leu Pro Tyr Phe Asn Val Ser Gin Gin Phe Ala Thr 355 360 365

Phe Val Leu Lys Gly Ser Phe Ser Glu lie Pro Glu Leu Gin Val Trp 370 375 380

Tyr Thr Lys Leu Gly Lys Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gin Leu 385 · 390 395 400

Asp Ser Leu Trp Leu Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu 405 410 415

His Glu Asp Glu Leu Phe Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys 420 425 430 •2· 157227.doc 201206462

Gly Ser Tyr Pro Leu Pro Pro Lys Ser Gin Pro Phe Pro Ser Thr Tyr 435 440 445

Lys Asp Asp Phe Asn Val Asp Tyr Pro Phe Phe Ser Glu Ala Pro Asn 450 455 460

Phe Ala Asp Gin Thr Gly Val Phe Glu Tyr Phe Thr Asn lie Glu Asp 465 470 475 480

Pro Gly Glu His His Phe Thr Leu Arg Gin Val Leu Asn Gin Arg Pro 485 490 495 lie Thr Trp Ala Ala Asp Ala Ser Asn Thr lie Ser lie lie Gly Asp 500 505 510

Tyr Asn Trp Thr Asn Leu Thr lie Lys Cys Asp Val Tyr lie Glu TTir 515 520 525

Pro Asp Thr Gly Gly Val Phe He Ala Gly Arg Val Asn Lys Gly Gly 530 535 540 lie Leu lie Arg Ser Ala Arg Gly lie Phe Phe Trp lie Phe Ala Asn 545 550 555 560

Gly Ser Tyr Arg Val Thr Gly Asp Leu Ala Gly Trp lie lie Tyr Ala 565 570 575

Leu Gly Arg Val Glu Val Thr Ala Lys Lys Trp Tyr Thr Leu Thr Leu 580 585 590

Thr lie Lys Gly His Phe Ala Ser Gly Met Leu Asn Asp Lys Ser Leu 595 600 605

Trp Thr Asp lie Pro Val Asn Phe Pro Lys Asn Gly Trp Ala Ala lie 610 615 620

Gly Thr His Ser Phe Glu Phe Ala Gin Phe Asp Asn Phe Leu Val Glu 625 630 635 640

Ala Thr Arg Ser Glu Gin lie Asp 645 <210〉 2 <211> 685 <212> PRT <213>智人 <400> 2

Met Ala Glu Trp Leu Leu Ser Ala Ser Trp Gin Arg Arg Ala Lys Ala 15 10 15

Met Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ala Ala Val Pro Leu Leu 20 25 30

Leu Cys Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly Ala Tyr Val Leu Asp Asp Ser 35 40 45

Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly lie Gly Ala Val Ser Gly Gly 157227.doc 201206462 50 55 60

Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr Pro Glu Pro Tyr Arg Ser 65 70 75 80

Gin lie Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn Phe Gly Ala Ser Leu His 85 90 95 lie Leu Lys Val Glu lie Gly Gly Asp Gly Gin Thr Thr Asp Gly Thr 100 105 110

Glu Pro Ser His Met His Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Arg Gly 115 120 125

Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys Lys Arg Asn Pro Asn lie 130 135 140

Thr Leu lie Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro Gly Trp Leu Gly Lys Gly 145 150 155 160

Phe Asp Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gin Leu Thr Ala Tyr Tyr Val Val 165 170 175

Thr Trp lie Val Gly Ala Lys Arg Tyr His Asp Leu Asp lie Asp Tyr 180 185 190 lie Gly lie Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Tyr lie Lys lie 195 200 205

Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gin Gly Leu Gin Arg Val Lys lie lie 210 215 220

Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Ser lie Ser Ala Ser Met Leu Leu Asp 225 230 235 240

Ala Glu Leu Phe Lys Val Val Asp Val lie Gly Ala His Tyr Pro Gly 245 250 255

Thr His Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Thr Gly Lys Lys Leu Trp Ser 260 265 270

Ser Glu Asp Phe Ser Thr Leu Asn Ser Asp Met Gly Ala Gly Cys Trp 275 280 285

Gly Arg lie Leu Asn Gin Asn Tyr He Asn Gly Tyr Met Thr Ser Thr 290 295 300 lie Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr Glu Gin Leu Pro Tyr Gly 305 310 315 320

Arg Cys Gly Leu Met Thr Ala Gin Glu Pro Trp Ser Gly His Tyr Val 325 330 335

ValGlu Ser Pro Val Trp Val Ser Ala His Thr Thr Gin Phe Thr Gin 340 345 350

Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly His Leu Glu Lys Gly Gly -4- 157227.doc 201206462 355 360 365

Ser Tyr Val Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly Asn Leu Thr lie lie lie 370 375 380

Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys lie Arg Pro Phe Leu Pro 385 390 395 400

Tyr Phe Asn Val Ser Gin Gin Phe Ala Thr Phc Val Leu Lys Gly Ser 405 410 415

Phe Ser Glu lie Pro Glu Leu Gin Val Trp Tyr Thr Lys Leu Gly Lys 420 425 430

Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gin Leu Asp Ser Leu Trp Leu Leu 435 440 445

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Leu Phe 450 455 460

Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys Gly Ser Tyr Pro Leu Pro 465 470 475 480

Pro Lys Ser Gin Pro Phe Pro Ser Thr Tyr Lys Asp Asp Phe Asn Val 485 490 495

Asp Tyr Pro Phe Phe Ser Glu Ala Pro Asn Phe Ala Asp Gin Thr Gly 500 505 510

Val Phe Glu Tyr Phe Thr Asn lie Glu Asp Pro Gly Glu His His Phe 515 520 525

Thr Leu Arg Gin Val Leu Asn Gin Arg Pro lie Thr Trp Ala Ala Asp 530 535 540

Ala Ser Asn Thr lie Ser He He Gly Asp Tyr Asn Trp Thr Asn Leu 545 550 555 560

Thr lie Lys Cys Asp Val Tyr He Glu Thr Pro Asp Thr Gly Gly Val 565 570 575

Phe lie Ala Gly Arg Val Asn Lys Gly Gly lie Leu lie Arg Ser Ala 580 585 590

Arg Gly lie Phe Phe Trp lie Phe Ala Asn Gly Ser Tyr Arg Val Thr 595 600 605

Gly Asp Leu Ala Gly Trp lie lie Tyr Ala Leu Gly Arg Val Glu Val 610 615 620

Thr Ala Lys Lys Trp Tyr Thr Leu Thr Leu Thr lie Lys Gly His Phe 625 630 635 640

Ala Ser Gly Met Leu Asn Asp Lys Ser Leu Trp Thr Asp lie Pro Val 645 650 655

Asn Phe Pro Lys Asn Gly Trp Ala Ala lie Gly Thr His Ser Phe Glu 157227.doc 201206462 66. G1 va uo e8 L6 c ph n As p s c ph n5 1 7 G6 la c ph 85 Γ 8 A6 Γ Th ^ > > > &123 <21<21<21<21 0> o 4 鼠 42RTS 36P 家 3

Tyr Val Leu Asp Asp Ser Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly lie 1 5 10 15

Gly Ala Val Ser Gly Gly Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr 20 25 30

Pro Glu Pro Tyr Arg Ser Glu lie Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn 35 40 45

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Glu Asn Tyr Phe Arg Gly Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys 85 90 95

Lys Arg Asn Pro Asp lie lie Leu Met Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro 100 105 110

Gly Trp Leu Gly Lys Gly Phe Ser Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gin Leu 115 120 125

Thr Ala Tyr Tyr Val Val Arg Trp lie Leu Gly Ala Lys His Tyr His 130 135 140

Asp Leu Asp lie Asp Tyr lie Gly lie Trp Asn Glu Arg Pro Phe Asp 145 150 155 160

Ala Asn Tyr lie Lys Glu Leu Arg Lys Met Leu Asp Tyr Gin Gly Leu 165 170 175

Gin Arg Val Arg lie lie Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Pro lie Ser 180 185 190

Ser Ser Leu Leu Leu Asp Gin Glu Leu Trp Lys Val Val Asp Val lie 195 200 205

Gly Ala His Tyr Pro Gly Thr Tyr Thr Val Trp Asn Ala Lys Met Ser 210 215 220

Giy Lys Lys Leu Trp Ser Ser Glu Asp Phe Ser Thr lie Asn Ser Asn 225 230 235 240

Val Gly Ala Gly Cys Trp Ser Arg lie Leu Asn Gin Asn Tyr lie Asn 245 250 255 157227.doc 201206462

Gly Asn Met Thr Ser Thr lie Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr 260 265 270

Glu Glu Leu Pro Tyr Gly Arg Scr Gly Leu Met Thr Ala Gin Glu Pro 275 280 285

Trp Ser Gly His Tyr Val Val Ala Ser Pro He Trp Val Ser Ala His 290 295 300

Thr Tlir Gin Phe Thr Gin Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly 305 310 315 320

His Leu Glu Lys Gly Gly Ser Tyr Val Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly 325 330 335

Asn Leu Thr lie lie lie Glu Thr Met Ser His Gin His Ser Met Cys 340 345 350 lie Arg Pro Tyr Leu Pro Tyr Tyr Asn Val Ser His Gin Leu Ala Thr 355 360 365

Phe Thr Leu Lys Gly Ser Leu Arg Glu lie Gin Glu Leu Gin Val Trp 370 375 380

Tyr Thr Lys Leu Gly Thr Pro Gin Gin Arg Leu His Phe Lys Gin Leu 385 390 395 400

Asp Thr Leu Trp Leu Leu Asp Gly Ser Gly Ser Phe Thr Leu Glu Leu 405 410 415

Glu Glu Asp Glu lie Phe Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys 420 425 430

Gly Ser Tyr Pro Pro Pro Pro Scr Ser Lys Pro Phe Pro Thr Asn Tyr 435 440 445

Lys Asp Asp Phe Asn Val Glu Tyr Pro Leu Phe Scr Glu Ala Pro Asn 450 455 460

Phe Ala Asp Gin Thr Gly Val Phe Glu Tyr Tyr Met Asn Asn Glu Asp 465 470 475 480

Arg Glu His Arg Phe Thr Leu Arg Gin Val Leu Asn Gin Arg Pro lie 485 490 495

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Arg Ser Gly Gly Val Phe lie Ala Gly Arg Val Asn Lys Gly Gly lie 530 535 540

Leu lie Arg Ser Ala Thr Gly Val Phe Phe Trp lie Phe Ala Asn Gly 545 550 555 560 157227.doc 201206462

Ser Tyr Arg Val Thr Ala Asp Leu Gly Gly Trp lie Thr Tyr Ala Ser 565 570 575

Gly His Ala Asp Val Thr Ala Lys Arg Trp Tyr Thr Leu Thr Leu Gly 580 585 590 lie Lys Gly Tyr Phe Ala Phe Gly Met Leu Asn Gly Thr lie Leu Trp 595 600 605

Lys Asn Val Arg Val Lys Tyr Pro Gly His Gly Trp Ala Ala lie Gly 610 615 620

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Ala Arg <210> 4 <211> 684 <212> PRT <213>家鼷鼠 <400> 4

Met Ala Asn Ser Gin Pro Lys Ala Ser Gin Gin Arg Gin Ala Lys Val 15 10 15

Met Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Ser Arg Val Ala Val Pro Leu Leu 20 25 30

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Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys Gly Ser Tyr Pro Pro Pro 465 470 475 480 157227.doc 201206462

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Gly Val Phe Phe Trp lie Phe Ala Asn Gly Ser 595 600

Tyr Arg Val Thr Ala 605

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His Thr Phe Glu Phe 670

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Arg 157227.doc 10·

Claims

201206462 七 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 、申請專利範圍：一種用於腦脊髓膜内投與之穩定調配物，其包含半乳糖腦苷酶（Gale)蛋白質、鹽、緩衝劑、穩定劑及聚山梨醇 Θ旨表面活性劑。如請求項1之穩定調配物，其中該GalC蛋白質係以多達約75 mg/ml之濃度存在。如請求項1或2之穩定調配物，其中該GalC蛋白質係以選自 3 mg/ml、30 mg/ml或 50 mg/ml之濃度存在。如前述請求項中任一項之穩定調配物，其中該Galc蛋白質包含胺基酸序列SEq ID N〇:i。如前述請求項中任一項之穩定調配物，其中該鹽係 NaCl。如請求項5之穩定調配物，其中該^^化丨係以介於約75 至200 mM範圍内之濃度存在。如請求項6之穩定調配物，其中該NaCi係以約15〇 mM之濃度存在。如前述請求項中任-項之敎調配物，其中該聚山梨醇醋表面活性劑選自由以下組成之群：聚山梨醇醋2〇、聚山梨醇S旨40、聚山梨醇醋6〇、聚山梨醇醋⑽及其組合。如請求項8之穩定調配物，其中該聚山梨醇醋表面活性劑係聚山梨醇酯20。如請求項9之穩定調配物，其中兮头〒該聚山梨醇酯20係以介於約0°/。至0.02%範圍内之濃度存在。如請求項10之穩定調配物，其中哕 Τ β聚山梨醇酯2〇係以約 157227.doc 201206462 〇·005%之濃度存在。 12. 如前述請求項中任一項之穩定調配物，其中該緩衝劑係磷酸鹽。 13. 如請求項12之穩定調配物’其中該磷酸鹽係以不大於2〇 mM之濃度存在。 14. 如請求項U之穩定調配物，其中該磷酸鹽係以約5 mM之濃度存在。 1 5 _如則述清求項中任一項之穩定調配物’其中該穩定劑選自廉糖、葡萄糖及/或PEG。 16_如請求項15之穩定調配物，其中該穩定劑係蔗糖。 17. 如請求項16之穩定調配物，其中該蔗糖係以約至3% 之濃度存在。 18. 如前述請求項中任一項之穩定調配物’其中該調配物具有約5.5至7.〇之pH。 19. 如請求項18之穩定調配物，其中該調配物具有約6〇至 6 · 5 之 p 〇 20. 如請求項19之穩定調配物，其中該調配物具有約6 3之 pH。 21·如前述請求項中任一項之穩定調配物’其中該調配物係液體調配物。 22.如請求項2〇中任一項之穩定調配物，其中該調配物調配成凍乾之乾燥粉末。 23_ —種用於腦脊髓膜内投與之穩定調配物，其包含半乳糖腦芽酶（GalC)蛋白質、濃度約5 mM之磷酸鹽、濃度約 157227.doc 201206462 150 mM之NaC卜濃度約1%之蔗糖、濃度約0.005%之聚山梨醇酯20，且其pH為約6.3。 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 32. 33. 如請求項23之穩定調配物’其中該GalC蛋白質之濃度係約 3 mg/ml 〇如請求項23之穩定調配物，其中該GalC蛋白質之濃度係約 30 mg/ml。一種容器，其包含如請求項1至23中任一項之穩定調配物之單一劑型。如請求項26之容器，其中該容器選自安瓿或預填充注射器。如請求項27之容器，其中該容器係預填充注射器。如請求項27之容器，其中該容器係貯器。如請求項28之容器，其中該預填充注射器選自有烤聚矽氧塗層之硼矽酸鹽玻璃注射器、有喷塗聚矽氧之硼矽酸鹽玻璃注射器’或無聚矽氧之塑膠樹脂注射器。如請求項26至30中任一項之容器，其中該穩定調配物係以小於約5.0 mL之體積存在。如請求項31之容器，其中該穩定調配物係以小於約3〇 mL之體積存在。一種治療球樣細胞性腦白質營養不良（GLD)病之方法，其包含以下步驟：向需要治療之個體經腦脊髓膜内投與如請求項i至25 中任一項之調配物。如請求項32之方法，其中該調配物經腦脊髓膜内投與不 157227.doc 201206462 會在該個體中引起實質不良效應。 34. 如請求項32之方法，其中該調配物經腦脊髓膜内投與不會在該個體中引起實質適應性T細胞介導之免疫反應。 35. 如請求項32至34中任一項之方法，其中該調配物經腦脊髓膜内投與使得該GalC蛋白質遞送至深層白質之少突勝質細胞中。 36. 如請求項32至35中任一項之方法，其中該調配物經腦脊趙膜内投與使得該GLD病之至少一種症狀或特徵之強度、嚴重程度或頻率降低，或發作延遲。 37. 如請求項36之方法’其中該GLD病之至少一種症狀或特徵係易怒、抽搐、精神衰退、耳聾、失明、肌陣擎發作、肌肉張力過大、發育遲緩、發育技能減退、過敏、震顫、共濟失調、痙攣狀態、發作性劇吐、腦白質營養不良、大腦萎縮、產生球樣細胞及/或脫髓鞘。 3 8. —種用於腦脊髓膜内投與之系統，其包含輸液裝置；空心體，其具有與該輸液裝置流體連通之第一流量孔及構造用以插入脊髓中之第二流量孔；及用於該空心體緊固插入該脊髓中之緊固機構。 39. 如請求項38之系統，其中該緊固機構包含一或多個安裝於該空心體表面上之球形頭（nobs)及於該一或多個球形頭上可調整之縫合環。 40. 如請求項38或39之系統，其中該輸液裝置係可注射座 (injectable port)。 157227.doc 201206462 41. 如請求項40之系統，其中該可注射座係可植入的。 42. 如請求項38至41中任一項之系統，其中該輸液裝置係幫浦。 157227.doc