TW201141500A - Use of coconut water extract or coconut shell extract for treating immunological diseases and/or disorders - Google Patents

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201141500 六、發明說明： [相關專利申請案之交互參照] 本申請案主張2009年11月25曰所申请之美國第 61/264,254號申請案之優先權，並以參照方式將該申請案 之全部内容併入本文中° 【發明所屬之技術領域】 本發明一般係關於椰子水或椰殼萃取物，且更具體而 言，係用於治療免疫疾病及/或異常。 【先前技術】 椰子在熱帶國家係作為熱帶水果及飲料。已有報導來 自椰子之果殼纖維的抗微生物及抗病毒活性主要是由於高 含量的盼化合物（Esquenazi D. et al. 2002)。 椰子的生物活性亦包含：對於抗無環鳥苷第一型單純 疮療病毒（acyclovir-resistant herpes simplex virus type 1)的 抑制活性、抗利什曼蟲作用（leishmanicidal effects) (Mendonpa-Filho RR. et al. 2004)、保護血紅素（hemoglobin) 避免因亞硝酸鹽（nitrite)所引起的氧化反應而轉變成變性 血紅素（methemoglobin)、以及自由基清除活性（AlvianoDS. et al. 2004)。椰子水是椰果（coconut fruit)之溶液，且已報 導為普遍及天然含有較少副作用的提神飲料（refreshing drink)。椰子水由於存在有醣類（carb〇hydrates)、維生素、 電解質、鑛物質與蛋白質，因此經常作為營養配方飲料及 食物產品（Santoso U. et ai. 1996 及 Campbell-Falck D. et al. 2000)。除此之外’椰子水亦用於保存綿羊的卵泡及狗的精 3 111906 201141500 液、山羊卵巢初級卵泡的活體外培養(Figueire(i〇 J.R. 2000 及 Andrade ER. et al. 2002)、以及植物組織培養(Tiajnen，τ. 1993)。此外，已報導椰子水對於人類的細菌性病原具有抑 制活性(Mandal SM. et al. 2009)，並且具有抗潰瘍的效果 (Nneli RO.及 Woyike OA. 2008) 〇 在哺乳動物中，皮膚是外皮系統(Integumentary system) 的最大器官，且扮演外界病原入侵的防禦屏障。皮膚發炎 會演變成對傷害的保護反應，從而消除外來有機體 (organism)或物質，且發炎的解決機制保護我們對抗過度的 組織傷害。發炎的解決機制失敗會引起慢性發炎，並導致 許多皮膚疾病。在鼠科動物疾病模型中指出，TNF受體的 異質性用於自體免疫疾病抑制對抗發炎組織的傷害，此建 議選擇性的TNF受體抑制對於治療慢性發炎疾病的抗 TNF 治療是有利的（Apostolaki M，Armaka M，Victoratos P et al. 2010)。腫瘤壞死因子a(TNF-a)的量在牛皮癬患者 (psoriatic patient)的水泡流體吸著及企清呈相關增加，且與 疾病的嚴重度成正比(Ettehadi P. et al. 1994、Bonifati C. et al. 1994 及 Groves R. et al. 2004)。 發炎會變成對損害（insult)或是傷害的保護反應，發炎 的原始反應是消除或是中和外來有機體或物質，發炎的解 決機制包含内生性的抗發炎機制，其保護我們對抗過度的 組織傷害，並促使組織結構和功能的修復。事實上，我們 的健康（well being)及生存依靠發炎的效率以及仔細平衡的 控制。一般而言，先天性發炎反應（innate inflammatory 4 111906 201141500 response)在數分鐘之内即可引發，如果全部健全，在數小 時内解除反應。相反的，慢性發炎卻持續數周，甚至是數 個月或數年(Lawrence T” Gilroy D.W. 2007)。在急性發炎 的後期，會產生白細胞介素10及TGF-/3，以限制發炎並 ^ 促進解決機制。這兩個細胞介素（IL-10及TGF-yS)係與發 。 炎的解決機制有關（Lawrence T. and Gilroy D.W. 2007 及 Serhan C.N. et al. 2007) ° 由於肝臟的解剖位置連結腸胃道(gastrointestinal tract) 與全身性靜脈循環（systemic venous circulation)，因此肝臟 在免疫耐力（immunological tolerance)中扮演重要的角色。 因此’必須避免對抗來自消化道之食物或細菌抗原的免疫 反應。肝臟的功能是作為清除器官（clearance organ)，然 而’卻隱藏著將被降解及/或消除之物質導致組織損害的危 險。因此，有效的防禦機制是必要的。在非實質細胞庫佛 氏細胞(Kupffer cells)、竇狀内皮細胞（sinusoidal endothelial cells)、及自然殺手（NK)淋巴球中係對全身發揮細胞防禦功 能，而且是適合肝臟本身。再者，肝臟的每種細胞類型， 包含肝細胞，擁有其自己的防紫基器（defenSe apparatus) (Erhardt A. et al. 2010 及 Ramadori G. et. al. 2008)。 類風濕性關節炎的病理特徵是關節囊内的滑液發炎 增生形成關節翳（pannus)，而關節翳會漸漸侵犯軟骨甚至 是硬骨表面。罹患類風濕性關節炎的病患其免疫系統已失 去辨&忍自我與非自我的能力。免疫系统首先攻擊四肢等高 活動性關節令的滑液組織和結缔組織，接著破壞骨形成與 111906 5 201141500 再吸收之間的平衡機制，並活化破骨細胞，因而造成關節 軟骨及硬骨的破壞。 由於類風濕性關節炎的免疫機制涉及複雜的網絡連 接各種細胞及細胞激素，因此類風濕性關節炎的詳細病原 機制到目前仍然不明（Gary S. and Firestein，M. 2005)。 類風濕性關節炎或其他關節炎相關疾病，如骨關節炎 (osteoarthritis)、僵直性脊椎炎（ankylosing spondylitis)、及 急性痛風性關節炎（acute gouty arthritis)的藥物治療包含非 類固醇消炎藥物（non-steroidal anti-inflammatory drugs， NS AID)、皮質類固醇(corticosteroid)、疾病修飾抗風濕病 藥物（Disease Modifying Anti-Rheumatic Drugs，DMARD)、 以及生物製劑。因為關節炎是一種發炎的狀況，所以第一 線治療係針對抑制發炎並且舒解病徵，例如NSAIDs及皮 質類固醇，其係有效控制與關節炎有關的疼痛、腫脹和僵 硬。然而，這兩種治療皆有副作用，且對長期的結果有限 制的影響。生物製劑，例如恩博（Etanercept)、因福利美 (Infliximab)和阿達木單抗（Adalimumab)，常與甲胺蝶吟 (Methotrexate)合併使用，且對類風濕性關節炎的病患亦顯 示有效，但由於價格考量，所以可能被認為是第二選擇。 DMARDs，包含曱胺蝶吟、奎寧(hydroxychloroquine)、柳 氮續B比咬（sulfasalazine)、來氟米特（leflunomide)以及其他 抗風濕性藥物，例如金鹽（Gold salt)和環孢靈 (cyclosporine)，係慢性作用化合物（slow-acting compound)，且主要作用是抑制免疫細胞的增生以及減少 6 111906 201141500 發炎反應。雖然DMARDs普遍用於診斷類風濕性關節炎之 病例’但是已報導的副作用和毒性值得注意（Gaffo A. etal. 2006、Gary S. and Firestein，Μ· 2003 及 Gary S. and

Firestein，M. 2005)。 與魏察在疾病進程中的對象間的變化（interpatient variability)組合調控機制的複雜性及重複性，解釋一些病 患為什麼會對特定治療有反應而其他病患卻不會有反應， 特別是以免疫事件的下游調控為目標。目前涉及類風濕性 關節炎之免疫反應的藥物專一性標靶上游的細胞激素，包 含IL-1抑制劑（例如阿那白滯素（anakinra)及阿那白滯素 (kineret))、抗腫瘤壞死因子（anti-TNF- α )試劑（例如恩博 (etanercept)、因福利美（infliximab)及阿達莫單抗 (adalimumab))，T細胞活化之共刺激阻礙劑（例如阿巴西普 (abatacept))，以及選擇性 B 細胞消耗劑（depletion agent)， 例如抗CD20單株抗體（例如利妥昔單抗(rituximab)) (Gaffo A. et al. 2006、Gary S, and Firestein，Μ. 2003 及 Gary S. and nrestein，M. 2005)。這些試劑可以專一性抑制異常免疫反 應，因而抑制發炎，但是由於免疫抑制的副作用，使病患 亦處於感染的高風險。 因此，迄今為止，在所屬技術領域中，仍然存在著前 述的缺失與不便所未解決的需求，本發明特別是與椰子水 萃取物或椰殼萃取物有關。 【發明内容】 在一個態樣中，本發明係關於一種用於在需要的對象 111906 7 201141500 上治療與腫賴死因子α (ΤΝΡ·α)相關聯之免疫疾Ί 或異常之方法，包括投予治療有效量的挪子水卒取1者 殼萃取物’以誘導轉化生長因0 (TCFW· 10(IL-10)作為内生性免疫抑制因子。 椰子水萃取物威揶毅萃取物係藉由下述方法製備’ 〇 括： (a)將椰子水或梛殻水通過樹脂吸附型層析管枉，其 中，該椰殼水是將水加至椰殼而獲得； (b) 以水洗滌該管枉；以及 (c) 以能夠從該管柱中解吸附該椰子水萃取物或椰殼 萃取物之任何溶液或溶劑之組合來洗提該管柱。 椰子水萃取物或椰殼萃取物有效治療免疫疾病及/或 異常’該免疫疾病及/或異常係選自皮膚發炎、肝臟發炎及 類風濕性關節炎所組成之群組之至少一者。 上述以及本發明的其他態樣將可在結合以下較佳具 體實施例的說明結合圖式後而變得較為明確，雖然可對上 述實施例進行改變與修飾，但是仍不違背本發明新賴概念 的精神以及範圍。 附圖說明本發明的一個或是多個具體實施例，連同書 面說明，兩者用以解釋本發明的原理。只要可能的話，在 圖式中所用的㈣參考符號係代表相同或是類似的具體實 施例元件。 【實施方式】 本說明書中所使用的術語在本發明所屬技術領域 111906 8 201141500 中、本發明内容範圍内、以及在特定内容中所用的各個術 語，一般具有他們的通常意義。用以描述本發明的某些術 語將於後討論，或是在說明書中的其他地方討論，以供做 為從事者瞭解本發明說明的額外指導。為了方便起見，某 些術語可能會被強調，例如使用斜體字及/或引號來表現。 使用強調的方式表現並不影響術語的範圍與意義，在相同 背景下，不管術語是否有被強調，該術語的範圍與意義仍 是相同的。值得注意的是，同一件事可能會以超過一種方 式來說明。因此，在本文中會使用可替換性的語言以及同 義詞來表現任何一個或多個的術語，不論該術語是否有在 本文中進行精闢的闡述或是討論，使用可替換性的語言以 及同義詞都沒有特定的意義。本發明會提供某些術語的同 義詞。一個或多個常用的同義詞並不排除其他同義詞的使 用。本說明書中任何部分所提到的例子（包含所討論的任何 術語的例子）都是用來說明而已，並沒有限制本發明的範圍 及意義或是任何當作例子來說明的術語。同樣地，本發明 也不受限於本說明書所提供的各種具體實施例。 除非有特別地定義，否則在本文中所用的技術性或是 特定術語都有其對於在本發明所屬領域中具通常知識者一 般所瞭解的相同意義。至於意見分歧的部分，本申請文件 (包含定義的部分）將會進行控管。 本文所使用的『約』、『大約』或是『近似』一般是 指一個指定的數值或是範圍的20%以内，較佳地是指10% 以内，而更佳地是指5%以内。本文所提到的數值量只是 9 111906 201141500 接近值，意指如果沒有明確表示，則術語『約』、『大約』 或是『近似』可以經推想而知。 以下說明根據本發明之具體實施例所使用的示範性 裝置、設備、方法以及其相關的結果，非意欲限制本發明 的範圍。應注意的是，在實施例中所使用的標題與子標題 只是為了供讀者易於閱讀，而並不限制本發明的範圍。另 外，以下也會說明並揭露一些理論，然而，不論他們的對 錯，只要本發明可以在不需要根據特別理論方案而能實施 時，這些說明及揭露都不該限制本發明的範圍。 實施例 實施例1製備椰子水萃取物或椰殼萃取物 椰子（Cocos wwcz/era Linw.)水及椰⑽以片⑽ 殼係自水果販售商所購買的新鮮椰子（台灣屏東 縣），247.68公斤（用以取得椰子水），2.1公斤（用以取得椰 子殼）。椰子殼加水，然後以果汁機打碎後得到椰殼水。椰 子水(47.6公升）或椰殼水(2.7公升）以玻璃微纖維過濾器進 行過濾，濾液再於4°C下連續通過一個Diaion HP-20(日本 三菱化學有限公司（Mitsubishi Chemical Co.，Japan)(52 公 分x5公分）管柱進行層析。於4°C在凝膠(gel)上所吸附的殘 留物以去離子水(4公升，流速·· 20 ml/min)第一次洗提， 然後使用100%甲醇(ACS等級；台灣景明化工有限公司 (Echo Chemical Co Ltd·，Taiwan))(約 6.5 公升，流速：8.3 ml/min)洗提’直到各個洗提液的UV2〇〇-4()()nm的吸收訊號偵 10 111906 201141500 測不到為止。收集並冷凍乾燥各個去離子水洗提液，以獲 * 得水洗提產物，其主要為醣類，秤重為2438.9公克（取自 • 椰子水萃取物）或13〇公克（取自椰殼萃取物）。收集各個 100。/。甲醇洗提液，以真空蒸發濃縮，並且冷凍乾燥，以獲 . 得甲醇洗提產物，此在本說明書中名為椰子水萃取物或揶 , 殼萃取物。 藉由薄層層析（TCL)進行層析，用以特徵化存在於去 離子水及甲醇洗提液中的醋類含量。TLC層析圖譜係在石夕 膠TLC片（德國默克公司（Merck，Germany))上移動，使用 1-丁醇：乙酸：水[3.2:4:0.6 (v/v)]作為洗提液，以及聚醯 胺TLC片（德國Macherey-Nagel)，使用乙酸乙酯：吡啶： 水[6:3:2 (v/v)]作為洗提液。將去離子水與乙醇洗提 液的滯留因子（retention factor，Rf)值與醣類標準品（D(+) 半乳糖、D(+)葡萄糖、D(+)甘露糖、£)(+)阿拉伯糖、d(+) 核糖、D(+)木糖及麥芽糖；美國sigma公司）作比較，同時 所有醣類係藉由基笨甲醚鄰苯二甲酸(anisidine phthalate) 試劑呈色。

Rf值及呈色顯示出去離子水洗提液與葡萄糖及甘露醣 標準品相近，其可能示意葡萄糖及甘露醣在椰子水或椰殼 中為主要的單醣。100%曱醇洗提液的結果顯示幾乎不含醣 類。 實施例2椰子水萃取物或椰殼萃取物對於脂多醣誘導 RAW 264.7細胞發炎的效果 11 111906 201141500 RAW 264.7細胞是鼠類巨嗤細胞的細胞株，且經常被 用在發炎反應的研究。在96孔盤(Falcon)中將RAW 264.7 細胞(4 X l〇4cells/well)置於含有1〇 %(v/v)胎牛血清(FBS， Gibco)之DMEM高葡萄糖(Gibco)中過夜，然後在沒有椰子 水萃取物或椰殼萃取物中（控制組）或存在0.1、1及10 y g/ml椰子水萃取物或存在1、10及100 // g/ml椰殼水萃取 物中以 1 # g/ml 脂多膽（lip〇p〇lysaccharide) (LPS ; Sigma， USA)處理。正常組係不以LPS處理亦不以椰子水萃取物或 椰殼萃取物處理。經過24小時的培養週期後，利用DAN 分析測量懸浮物的一氧化氮(NO)產量，並且使用雷沙紫分 析（resazurin assay)測量細胞的存活率。 一氧化氮（NO)參與發炎反應，因而可被當作指 標’以評估發炎反應的效果β 2,3-二胺基萘 (2,3-Diaminonaphthalene，DAN，Sigma，USA)與亞硝酸鹽在 酸性條件下可還原生成1_(H)_萘并三唑，此產物為一螢光 產物。將100 y 1的樣本先加入盤内。將5〇以丨新鮮配製 的DAN (0.01 mg/m卜在〇 62 M HC1中）加入並且立即混 合。在37 C下培養1〇分鐘後，加入25〆丨2 8 N的Na〇H 中止反應。使用螢光分析儀（QuoreseeMpiatereader)以355 nm的激發光激發並且讀取46〇 nm的發射光以測量螢光強 度(Misko TP. et al. 1993)。結果表示為平均值±s D (標準差） ㈣）。，控制組相比***表示p<〇顧。如第i圖所示， 挪子水萃取物和椰殼萃取物具有相似的生物活性，其顯著 地抑制以脂多醣(LPS)誘導RAW 264.7細胞之發炎的一氧 12 111906 201141500 化氮(NO)產生。 細胞分化的能力可以雷沙紫分析來測量（Nociari mm. et al. 1998) ’其中雷沙紫染料(resazurin dye)用為氧化還原 反應的指示劑，可以用來偵測細胞生長，但無法用來測量 細胞死亡。配製5 mM雷沙紫鈉（Resazurin sodium) (Sigma, USA)儲存溶液於磷酸鹽緩衝生理食鹽水(ph〇sphate buffer saline) (PBS)，且工作溶液（5〇 gM)從該儲存液使用不含 FBS的DMEM高葡萄糖（Gibco)所稀釋。進行雷沙紫分 析，將培養液移除，接著將新鮮稀釋的雷沙紫工作溶液加 入各個孔中。接著，細胞在附有水盤的培養箱（5〇/〇 C〇2_95%空氣）在37°C的條件下培養2小時，雷沙紫染料 會被活細胞還原成還原態，雷沙紫的還原態經由Victor 2 1420 Multilable Counter (Wallac，PerkinElmer)在螢光激發 波長530 nm及發射波長590 nm下偵測。椰子水萃取物或 椰殼萃取物對於LPS誘導的發炎反應的抑制作用（第1圖） 不是因為細胞數目的減少，並且椰子水萃取物或椰殼萃取 物並不具細胞毒性。 實施例3椰子水萃取物在TPA刺激的HaCaT細胞中對於 TNF-α基因表現的效果

HaCaT細胞株為人類角質細胞細胞株。將HaCaT細胞 (2.5 X 105 cells/well ;於 6 孔盤中）培養在含有 10 % (v/v) 胎牛血清(FBS; Gibco)的DMEM高葡萄糖(Gibco)之96 孔盤24小時。然後在96孔盤將培養液換成含有2%(v/v)胎 13 111906 201141500 牛血清(FBS; Gibco)的DMEM高葡萄糖，並培養24小時。 然後以2 ng/ml 12-0-十四烷醯巴豆醇-13-乙酸酯 (12-O-tetradecanoyl-phorbol-l3-acetate) (TPA，Sigma)，在 沒有椰子水萃取物（控制組）或0.1、1及10 β g/ml椰子水 萃取物存在下處理。正常組係以PBS處理。 6小時培養週期後，利用RareRNA試劑(Bio-East，台灣) 根據操作指南的使用方法從HaCaT細胞分離全部核糠核 酸(ribonucleic acid，RNA)，並且利用莫洛尼氏鼠類白血腫 瘤病毒反轉錄酶（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase)(Promega)將RNA轉為互補去氧核糖核酸 (complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)。接著進行 定量反轉錄聚合酶鏈反應（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)，其反應 混合物總體為20 #卜包含lxSYBR GREEN PCR master mix，混有0.5 的正向和反向引子，以及3 ygcDNA。 欲偵測引子對(primers):腫瘤壞死因子a (TNF- α )(序列 編號1及2)及GAPDH (序列邊號3及4)係顯示於表1。反 應係以 ABI PRISM 7500 序列债測系統（Sequence Detector System) (Applied Biosystems)在 96 孔微滴盤（microtiter plate)進行。反應混合物先在50°C培養2分鐘並在95°C培 養10分鐘，接著進行40個循環的放大反應。此放大反應 的步驟為在95 °C變性15秒，接著在55 °C引子黏接 (annealing)40 秒以及在 72〇C 延展（expression)40 秒。以小鼠 GAPDH的表現量作為内部參考。相對基因表現量是以2- 14 111906 201141500 △△CT方法計算。結果表示為平均值±S.D.(n=2)。與以PBS . 處理相比較，##p< 0.01。與沒有TPA相比較，*P < 0.05， **P < 0.01。如第2圖顯示’ 0.1、1、10 /zg/ml椰子水萃 取物顯著地抑制在TPA刺激的HaCaT細胞中對於TPA誘 導的TNF- α基因表現。 表一 引子名稱 序 列 序列 編號 TNF-a 前置引子 5，-CGG TGC CTA TGT CTC AGC CTC T-3， 1 TNF-a 反置引子 5，-CAC TCC AGC TGC TCC TCC ACT T-3， 2 GAPDH 前置引子 5，-GCA AAT TCC ATG GCA CCG T -3’ 3 GAPDH 反置引子 5，-TCG CCC CAC TGA TTT TGG-3， 4 實施例4椰子水萃取物在HaCaT細胞中對於IL-10及 TGF-万基因表現的效果 將HaCaT細胞(2.5 X 105 cells/well ;於6孔盤中）置於 含有10%(ν/ν)胎牛血清(FBS ; Gibco)的DMEM高葡萄糖 (Gibco)之96孔盤(Falcon)24小時。然後在96孔盤(Falcon) 將培養液換成含有2%(v/v)胎牛血清（FBS ; Gibco)的 DMEM高葡萄糖(Gibco)，並培養24小時。然後以0· 1、1 15 111906 201141500 及10 yg/ml椰子水萃取物處理，正常組係以pBS處理。 6小時培養週期後，利用RareRNA試劑（Bi〇_East，台灣) 根據操作指南的使用方法從HaCaT細胞分離全部核糖核 酸(RNA)，並且利用莫洛尼氏鼠類白血腫瘤病毒反轉錄酶 (Promega)將RNA轉為互補去氧核糖核酸(cDNA)。接著進 行定量反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR)，其反應混合物總體 積為 20 "卜包含 lxSYBR GREEN PCR master mix，混有 0.5 的正向和反向引子，以及3 egCDNA。欲偵測引 子對：白細胞介素10 (IL-10)(序列編號5及6)、轉化生長 因子冷（TGF-点）（序列編號7及8)及GAPDH (序列編號9 及10)係顯示於表2。反應係以ABI PMSM 7500序列偵測 系統(Applied Biosystems)在96孔微滴盤中進行。反應混合 物先在50°C培養2分鐘及在95°C培養1〇分鐘，接著進行 40個循環的放大反應。此放大反應的步驟為在95°C變性 15秒、接著在55°C引子黏接40秒、以及在72°C延展40 秒。以小鼠GAPDH的表現量作為内部參考。相對基因表 現量是以2· △△ CT方法計算，結果表示為平均值士 S.D.(n=2)。與僅以PBS相比較，< 〇.〇卜如第3圖顯 示，椰子水萃取物在HaCaT細胞中具有誘導IL-10 (第3A 圖）以及TGF-召（第3B圖）基因表現的趨勢。 16 111906 201141500 表二 引子名稱 序 列 序列 編號 IL-10 前置引子 5，-GCC TAA CAT GCT TCG AGA TC-3， 5 IL-10 反置引子 5’-TGATGT CTG GGT CTT GGT TC-3， 6 TGF-/3 前置引子 5，-AAA TGG ATA CAC GAA CCC AA-3， 7 ΎβΈ-β 反置引子 5’-GCT GCA TTT GCA AGA CTT TAC-3， 8 GAPDH 前置引子 5，-GCA AAT TCC ATG GCA CCG T -3， 9 GAPDH 反置引子 5’-TCG CCC CAC TGATTT TGG-3， 10 實施例5椰子水萃取物對於TPA誘導耳朵皮膚發炎模型 的效果 8週齡之雌性BALB/c小氣係購買於國家實驗研究院 :驗動物中心(NLAC，台灣)。為了在小鼠耳朵誘導 γ小鼠係_下财式驗化：在沒有椰子料取 ^組)或兩天口服。.2小5_的挪子水 (二 :，於小鼠耳朵之上皮膚塗抹8〇_ 12_〇_十四：里 醇-13-乙酸醋（TPA，Sigma)。正常組係以pBs處理。丑 111906 17 201141500 在6小時及36 λΜ夺TPA處理後，記錄小鼠耳朵皮膚 厚度（第4圖）。結果表示為平均值±S D (n=2至6)。與正常 組相比’ #!> < 0.05，_P < 〇 〇〇卜與僅以τρΑ處理相比， < 0.05, **P < 〇.〇1，< 〇 〇〇卜如第 4 圖顯示，在 6 小時TPA處理後’ 5 mg/kg的挪子水萃取物對於了伙 誘導的小鼠耳朵皮膚發炎反應有顯著的抑制作用，以及在 36小時TPA處理後，藉由〇 2、】、5 的挪子水萃取 物對於TPA誘導的小鼠耳朵皮膚的發炎反應也有顯著的 抑制作用。 在36小時TPA處理後，將小鼠耳朵皮膚的生物切片 藉由蘇木紫及伊紅染色法(Hemat〇xylin and E〇sin) (h&e)

染色分析（第5A至5J圖）。第5a至5e圖的放大倍率為200 倍，第5F至5J圖的放大倍率為4〇〇倍。如第5B及5G圖 所示，相較於正常組（第5A至5F圖），80 y Μ TPA處理 顯著地誘導小鼠耳朵之皮膚水腫。另外，〇2mg/kg(第5C 及 5H 圖）、1 mg/kg (第 5D 及 51 圖）、5 mg/kg (第 5E 及 5J 圖）椰子水萃取物處理顯著地抑制τρΑ誘導的皮膚水腫並 且降低發炎細胞浸潤。 實施例6椰子水萃取物對於脂多醣誘導的肝細胞發炎的 效果 8至10週齡之C57BL/6J Narl小鼠係購買於國家實驗 研究院實驗動物中心（NLAC,台灣）。由先前文獻所描述的 方法加以修飾以分離肝細胞（Kreanier BL. et al. 1986、 18 111906 201141500

Kojima T. et al. 2001 及 Liu S. et al. 2002)。利用阿佛丁 (入乂6出11)(2%(评/¥)2,2,2-三溴乙醇，4.30〇1118/1^體重）麻 醉小鼠，隨後以含有0.5 mM乙二醇-雙（2-胺基乙基 醚)-N，N，N ，N -四乙酸(EGTA; Sigma-Aldrich)之不含約 離子的 Hank 平衡鹽溶液（Hank's balanced salt solution; HBSS)在下腔靜脈進行肝臟灌流技術。灌流液經由切斷的 肝門靜脈流出’且其流速為1 ml/min。經過10分鐘的灌流 後，將含有 0.05% (w/v)的膠原酶(collagenase) (Type II; Worthington Biochemical Corporation)以及 1 mM 的氯化辦 (Sigma-Aldrich)的HBSS溶液加入灌流裝置，持續以相同 的流速灌流十分鐘。移除部分經水解(digest)的肝臟，然後 放至裝有HBSS的60 mm培養盤（BD Falcon)，並輕微地 剪碎，以使肝竇的肝細胞可以釋放出來。將剪碎的肝臟懸 浮液以尼龍膜（300 孔徑）過濾，之後以50xg離心3 分鐘，以獲得細胞沉澱物。將細胞沉澱物懸浮於DMEM培 養液（Gibco/Invitrogen)，且在 35% (v/v) percoll (GE Healthcare)培養液中以50xg離心5分鐘。細胞沉澱物進 一步以DMEM培養液清洗兩次或三次，再以50xg離心3 分鐘，以獲得肝細胞。 將分離的肝細胞以近乎lxlO4 cells/well置於含有 10%FBS(Gibco)之 DMEM 培養液的 96 孔盤（Costar)，然後 在附有水盤的培養箱（5% C02-95%空氣）中以37°C培養。 肝細胞然後以1或10 //g/ml脂多醣(LPS ; Sigma，USA) 在沒有椰子水萃取物(控制組）或存在0.1及1 y g/ml椰子 19 111906 201141500 水萃取物下，以含有2〇/0 (v/v) FBS(Gibc〇)的DMEM中培養 至隔曰。正常組係不以LPS亦不以椰子水萃取物處理。經 過24小時培養週期後，以DAN分析測量懸浮物的一氧化 氮(NO)產量’以及使用雷沙紫分析測量細胞存活率。 NO參與肝臟的發炎反應，因而可被當作指標，以評 估發炎反應的效果。2,3-二胺基萘(DAN，Sigma，USA)與亞 硝酸鹽在酸性的條件下可還原生成^旧卜萘并三唑，此產 物為一螢光產物。將1〇〇从丨樣本先加入盤中。將5〇 新 鮮配製的DAN (〇.〇5 mg/mi於〇 62 μ HC1中）加入並立即 混合。在37 C下培養1〇分鐘後，以25 “12 8Ν的Na〇H 中止反應。使用螢光分析儀以355 ηιη的激發光激發並且 讀取460 nm的發射光以測量螢光強度(Misk〇 τρ. et al. 1993)。結果表示為平均值±s D (n=6卜與控制組相比，*** 表示p < 0.001。如第6圖所示，在〇1和1 # g/mi的椰 子水萃取物皆可顯著地抑制以L p s誘導肝細胞之發炎的一 氧化氮產生。 細胞分化的能力可以雷沙紫分析來測量（N〇dari MM et al· 1998) ’其中雷沙紫染料為氧化還原反應的指示劑， 可以用來偵測細胞生長，但無法用來測量細胞死亡。配製 5 mM雷沙i#3(Sigma，USA)儲存溶液於填酸鹽緩衝生理 食鹽水(P B S )，且工作溶液(5 〇 # M)係從該儲存液使用不含 FBS的DMEM所稀釋。進行雷沙紫分析，將培養液移除， 接著將新鮮稀釋的雷沙紫工作溶液加入各個孔中。接著在 附有水盤的培養箱（5% C〇2_95%空氣)在37»c的條件下培 111906 20 201141500 養2小時，雷沙紫染料係藉由活細胞的活性而還原，且雷 沙紫的還原態係經由 Victor 2 1420 Multilable Counter (Wallac，PerkinElmer)在螢光激發波長530 nm及發射波長 590 nm下偵測。經投予椰子水萃取物的肝細胞係沒有細胞 毒性。因此，椰子水萃取物在處理發炎反應為有效的。 實施例7椰子水萃取物在D-GalN/LPS誘導的肝發炎對於 肝損傷的效果 8週齡之雄性C57BL/6J Narl小鼠係購買於國家實驗 研究院實驗動物中心（NLAC，台灣）。預備LPS/D-GalN誘 導急性肝發炎（Yamada I. et al. 2008)，小鼠於腹腔注射（i.p.) 含有 D 胺基半乳糖(D-GalN ; Sigma，USA) (600 mg/kg 體 重）及脂多醣(LPS ; Sigma, USA) (8 pg/kg體重）之磷酸鹽 緩衝生理食鹽水。於合併注射LPS/D-GalN前24小時及30 分鐘’口服投予溶於開水中的椰子水萃取物（0.2及1 mg/kg 體重），控制組則給於等量的開水。正常組另於腹腔注射與 D-GalN及LPS注射液等量之PBS。於合併注射LPS/D-GalN 3小時後，收集血清樣本及肝臟組織，以分別分析血清轉 胺酶活性及mRNA量。 經由測量丙胺酸轉胺酶（Alanine Aminotransferase， ALT)(又稱穀胺酸丙嗣酸轉胺酶（Glutamic pyruvic transaminase，GPT))及天門冬胺酸轉胺酶（Aspartate aminotransferase，AST)(又稱榖胺酸草醋酸轉胺酶 (Glutamic oxaloacetic transaminase，GOT))的金清酵素活 21 111906 201141500 性’分別使用 GPT (ALAT) IFCC mod.及 GOT (ASAT) IFCC mod· (HUMAN GmbH，Germany)套組根據操作指南的使用 方法以評估肝損傷。結果表示為平均值至6)。 與控制組相比，**表示p < 〇.〇1及***表示p < 〇 〇(Π。如 第7Α及7Β圖所示，於D-GalN/LPS誘導肝發炎後，〇.2 mg/kg椰子水萃取物顯著地抑制GPT量，同時1 mg/kg椰 子水萃取物亦顯著地抑制GOT及GPT量。 利用RareRNA試劑(Bio-East，台灣）根據操作指南的使 用方法從肝組織分離全部核糖核酸(RNA)，並且利用莫洛 尼氏鼠類白血腫瘤病毒反轉錄酶(Promega)將RNA轉為互 補去氧核糖核酸(cDNA)。接著進行定量反轉錄聚合酶鏈反 應(RT-PCR)，其反應混合物總體積為20以1，包含lxSYBR GREEN PCR master mix，混有0.5 /z Μ的正向和反向引 子，以及3 /z g cDNA。欲偵測引子對：腫瘤壞死因子α (TNF-α)(序列編號11及12)和/3肌動蛋白（序列編號π 及14)，係顯示於表3。此反應在96孔微滴盤以ABI PRISM 7500 Sequence Detector System (Applied Biosystems)進 行。反應混合物先在50 °C培養2分鐘及在95°C培養l〇 分鐘，接著進行40個循環的放大反應。此放大反應的步驟 為在95°C變性15秒、接著在55Ϊ黏接40秒及在72t延 展30秒。以小鼠冷肌動蛋白的表現量作為内部參考。相 對基因的表現量是以2-ΔΔσΓ方法計算。結果表示為平均值 土S.D.(n=4至6)。與控制組相比’ ***表示p < 0.001。如第 7C圖所示，0.2和1 mg/kg的椰子水萃取物皆顯著抑制 22 111906 201141500 D-GalN/LPS誘導的肝發炎之TNF-α表現。根據第7A至 7 C圖的結果所示，投予椰子水萃取物對於肝臟發炎（受損） 具有治療的功效。此外，椰子水萃取物之TNF-α抑制效果 可用於處理與TNF-α相關的免疫疾病及/或異常。 表三 引子名稱 序 列 序列 編號 TNF- a 前置引子 5，-CCA GGC AGT CAG ATC ATC TTC TC-3， 11 TNF-a 反置引子 5 ’-AGC TGG TTA TCT CTC AGC TCC AC -3 ’ 12 方肌動蛋白 前置引子 5，-GTG GGC CGC CCT AGG CAC CA-3’ 13 召肌動蛋白 反置引子 5’-TGG CCT TAG GGT TCA GGG GG-3， 14 實施例8椰子水萃取物對於D_GalN/Lps誘導肝發炎後之 小鼠的存活率的效果 9週齡之雄性C57BL/6J Narl小鼠係購買於國家實驗 研究院實驗動物中心(NLAC，台灣）。預備LPS/D-GalN誘 導急性肝發炎(Yamadal. etal. 2008)，小鼠於腹腔注射（i.p.) 含有 D 胺基半乳糖(D-GalN; Sigma，USA) (600 mg/kg 體重) 及月曰多酿(LPS ; Sigma，USA) (8 pg/kg體重）之填酸鹽緩衝 23 111906 201141500 生理食鹽水。於合併注射LPS/D-GalN前24小時及30分 鐘，口服投予溶於開水中的椰子水萃取物（〇.2、1及5 mg/kg體量）兩次，控制組則給於等量的開水。正常組另於 腹腔注射與D-GalN及LPS注射液等量之PBS。如第8圖 顯示，0.2、1及5 mg/kg椰子水萃取物顯著降低D-GalN/LPS 誘導的肝發炎之小鼠的死亡率。 實施例9製備蛋白多醋（proteoglycan) 豬關節軟骨組織的蛋白多醣之製備方法為參照先前 文獻條件敘述進行修飾（Finnegan A. et al. 1999及Giant TT. and Mikecz K. 2004.)。簡而言之，軟骨切片後冷凍於_70 °C ’使用粉碎機（pulverizer)研磨，然後以4 Μ鹽酸胍 (guanidium hydrochloride » Sigma, USA)、10 mM EDTA (Sigma，USA)、2 mM 苯曱基績醯 I (phenylmethylsulfonyl fluoride ; PMSF ; Sigma，USA)、2 mM 碘代乙醯胺 0〇廿〇3〇6{311^廿6;81层11^，1；8入)及5((^/1111胃蛋白酶抑制劑 八化叩313以11八；8丨8〇1&，1；8八)在4。〇下萃取。24小時後，以 2000xg離心40分鐘，收集萃取液，以獲得懸浮液。懸浮 液進一步於氯化鉋（1.5 g/ml; Sigma，USA)梯度在4 °C下 75000xg離心48小時’以收集具有密度大於1.56 g/ml之 分餾物。於4 °C進行透析，以0.1 Μ醋酸鈉（Sigma，USA) 在pH 7.4進行透析（使用透析膜(snake skin pleated)透析管 3500 MW，Pierce)及去離子水透析四次後，冷凍乾燥分餾 物，以獲得蛋白多醣粗萃物，產率為0.51%。 24 111906 201141500 將蛋白多醣粗萃物在pH 8.0溶解於含有50 mM Tris . (UBS，USA)和60 mM醋酸鈉（Sigma，USA)的緩衝液，然後 以軟骨素分解酶（chodroitinaseABC; luint; Sigma,USA) 在37°C水解24小時。水解後，將缓衝液調整至pH 5.8， 進一步再加入角蛋白酶（keratinase; 5.6 uints; Sigma， USA)，37°C下水解24小時，最後將蛋白多醣粗萃物，以 去離子Ηβ透析及冷凍乾燥，以獲得去醣化之蛋白多醣（耗 盡醣胺多醣側鏈的蛋白多醣），在本說明書中以此命名為蛋 白多醣（proteoglycan)。蛋白多醣係以12〇/〇變性十二烷基 硫酸納聚丙稀酿胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE ， 數據未顯 示）分析及確定。蛋白多醣的產率約為19.13〇/0。 實施例10椰子水萃取物對於蛋白多醣誘導之關節炎模型 的效果 蛋白多聽誘導的關節炎模型（類風溼性關節炎模型）係 參照先别文獻條件敘述進行修飾（Finnegan a. et al. 1999 及 Giant TT. and Mikecz Κ· 2004)。8 至 10 週齡之雌性 BALB/c小鼠係購買於國家實驗研究院實驗動物中心 (NLAC，Taiwan)。對於蛋白多醣誘導的關節.炎組，小鼠係 透過下列方法免疫化：在〇、14、28、42及63天，經由腹 腔注射蛋白多醣乳劑（含有1〇〇或5〇 蛋白多醣之磷酸 鹽緩衝生理食鹽水，及1 mg二曱基二（十八烷基）溴化錄 (dimethyldioctadecylammonium bromide» DDA； Sigma, USA) 25 111906 201141500 佐劑）。在第14天到實驗結束間，投予於飼料中添加0.2、 1及5 mg/kg/day之椰子水萃取物（分別為0.2、1及5 mg/kg/day組）。正常組則於腹腔注射PBS及投予小鼠標準 飼料(LabDiet®)。於第77天犧牲小鼠。 於實驗末期將5 mg/kg/day組的發生率及腳掌厚度迅 速增強作為控制組，且最終發生率約85% (第9A及9B 圖）。1 mg/kg/day組的最終發生率約40% (第9A及9B圖）。 1 mg/kg/day組的腳掌厚度只有輕微腫脹，且在注射最後一 次蛋白多醣後，於第73天發現其腳掌腫脹情形減緩（第9A 圖）。1 mg/kg/day組的腳掌腫脹情形及臨床上類風濕性關 節炎，係較三組椰子水萃取物處理之組減緩（第9A及9B 圖）。在實驗末期最後一次注射蛋白多醣後，0.2 mg/kg/day 組的發生率提高至約50%。在最後一次注射蛋白多醣後， 〇·2 mg/kg/day組的腳掌腫脹情形雖提高，但於73天開始 減緩’且與1 mg/kg/day組相似（第9A圖）。除此之外，實 驗期間’腳掌厚度及類風濕性關節炎的臨床徵狀係顯著低 於控制組（第0A及9B圖）。 椰子水被使用於營養配方飲料及食物產品，在民間用 藥上常用於減緩發燒，且可醫治腸胃炎、膀胱結石及冠狀 動脈心臟病（Mandal SM. et al. 2009)。此外，椰子水被報 導有抑制人類細菌性病原體活性及抗潰瘍的功效（Mandal SM. et al. 2009 及 Nneli RO. and Woyike OA. 2008)。因此， 挪子水在免疫反應方面仍有許多未知的影響。 本發明已證明椰子水萃取物可抑制TNF-α及NO產 26 111906 201141500 生，其係與發炎或自體免疫疾病有關’且可誘導IL-10及 . TGF- /5的產生，其係與減緩發炎反應有關（Lawrence T. and Gilroy D.W.2007 及 Serhan C.N. et al. 2007)。此外’椰 a 子水萃取物對於皮膚發炎、肝臟發炎及類風濕性關節炎， 特別是低劑量（例如低於2 mg/kg/day)具有治療效果，因此 其在免疫疾病及/或異常上具有免疫抑制之功效，例如，發 炎以及自體免疫疾病。本發明證實椰子水或是椰殼萃取物 可被用於治療免疫疾病及/或異常，並可抑制其發炎之臨床 症狀。 對於關節炎小鼠，2 mg/kg/day的治療劑量等同於60 kg 體重的人類為 0.162 mg/kg/day (Reagan-Shaw S. et al. 2008)。一顆揶子水果（含有約500 ml椰子水），可得到20 mg 的椰子水萃取物’對於人類而言，2 mg/kg/day椰子萃取物 的治療劑量約等同於每天飲用243 ml的椰子水，約半棵椰 子水果’其係近似於民間用藥使用量。因此，在普通的免 疫抑制處理中，即使投予高劑量（例如50 mg/kg/day的椰子 水萃取物）亦不會造成副作用，例如抑制免疫細胞增生及造 血功能。 現今仍有許多免疫疾病及/或異常需要經由抗發炎或 是免疫抑制處理來治療，例如皮膚發炎、肝臟發炎、關節 炎(例如類風濕性關節炎、骨關節炎、多發性結節性動脈炎 及急性痛風性關節炎）、過敏(例如氣喘、濕疹（異位性皮膚 炎）、過敏性鼻炎及眼睛過敏）、冷凝球蛋白血症、免疫性 血小板缺乏紫斑症、系統性血管炎、自體免疫性溶血性貧 27 111906 201141500 血、雷諾氏徵候群、系統性紅斑性狼瘡、硬皮症（系統性硬 化症）、非胰島素依賴性糠尿病（IDDM)、發炎性腸道疾病（例 如克隆氏症）（Koo AP. 2000、Davidson A. and Diamond B. 2001 及 Kim ΕΥ. and Moudgil KD. 2008)、敗血·症與敗血性 休克(Annane D. et al. 2009)、乾癬(Menter A. et al. 2009)及 貝賽特氏症（Sakane T. et al. 1999)。因此，投予椰子水萃取 物或椰殼萃取物有益於上述免疫疾病及/或異常，而無抗發 炎或是免疫抑制治療的缺點。 除此之外，本發明證明椰子水萃取物或椰殼萃取物能 抑制TNF- α。TNF- α為能產生各種細胞变態的細胞激 素’包含單核細胞及巨噬細胞，起初被認為能引起某些小 鼠腫瘤壞死。一連串對於TNF-α之效果的分析證明，TNF 在前發炎性細胞激素的網絡中扮演重要的角色。許多慢性 發炎的特徵像是白血球聚集、活化與增生，以及產生發炎 的媒介機制，皆與 TNF 有關（Tracey D.etal. 2008)。TNF-α涉及許多發炎疾病與異常的病原機制，同時係使用抗 TNF-α治療，像是風濕性關節炎、乾癬及乾癬性關節炎、 幼年型慢性關節炎、僵直性脊椎炎、發炎性腸道疾病（包含 克隆氏症）、潰瘍性大腸炎、貝赛特氏症、幼年特發性關節 炎、葡萄膜炎(Valesini G. et al. 2007、Wong M. et al. 2008 及Lin J· et al. 2008)、成人型史笛兒氏症、韋格納肉芽腫、 硬皮症、修格連氏症候群、類肉瘤、壞疽性膿皮症及多發 性肌炎與皮肌炎（Tutuncu Z. et al· 2002)。因此，椰子水萃 取物或揶殼萃取物可被用來治療這些與TNF- α相關的疾 28 111906 201141500 病及/或異常。 一田上述描述可知一…及描 明實&例’但可在不偏離本發明之精 略^ 種修飾。因此，除了附隨之申請專 …進订各 不欲用以限制本發明。—卜’前述範例係 以上具體實施例及實施例所描述之 釋本發明之原理以及實際應I從而使本發日/本身 明經過改變後能夠被應用在其他技術的特定用途。在不偏 離本發明之精神與範4下，經過改變實施的方式是可預見 而 的:因此’本發明所定義的範嘴為以下申請專利範圍 不是上述描述以及範例體現之内容。 本發明所引用及討論的參考資料包含專利、專利申請 以及已出版的文獻資料。本發明所引用及/或討論的參考資 料，其目的只為說明本發明内容，並非屬於本發明之先前 技術的範疇。本說明書中所有引用及討論的參考資料其全 部内谷係併入本文中，且對相同程度來說，各個參考資料 係以參照方式獨立併入。 參考文獻列舉如下：

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Wong M. et al. 2008. Clin Immunol. 126:121-136. Yamada I. et al. 2008. Cytokine. 41:293-301. 【圖式簡單說明】 第1圖的圖示顯示椰子水萃取物或椰殼萃取物對於 LPS誘導RAW 264.7細胞發炎之效果。控制組係投予脂多 醣(LPS)以誘導發炎的RAW 264.7細胞。處理組係投予存 在0.1、1及10〆g/ml椰子水萃取物或1、10及100 /z g/ml 椰殼萃取物的LPS。正常組係不以LPS處理亦不以椰子水 萃取物或椰殼萃取物處理。藉由DAN分析測量一氧化氮 (NO)的產生，即發炎指標。結果以平均值±8.0.表示（n=6)。 *表示 p < 0.05。 第2圖的圖示顯示椰子水萃取物在TPA刺激的HaCaT 細胞對於TNF-α基因表現之效果。角質細胞細胞株HaCaT 細胞(2.5xl05細胞/孔；在6孔盤中）在含有具有不同椰子 水萃取物（0、0.1、1及10 V g/ml)濃度之TPA (2 ng/ml)的 培養液中培養。在以TPA及椰子水萃取物之6小時培養週 期後，藉由即時PCR分析TNF-α的mRNA濃度。結果以 平均值±S.D.表示（n=2)。與PBS處理組相比##p<001。與 不含 TPA 組相比*P<0.05，**P<0.01。 第3圖的圖示顯示在HaCaT細胞以椰子水萃取物誘導 111906 32 201141500 IL-10 (第3A圖）與TGF-点（第3B圖）之mRNA表現。角 質細胞細胞株HaCaT細胞（2.5χ105細胞/孔；在6孔盤中） 在含有揶子水萃取物（〇、〇· 1、1及1 〇 β g/m〇的培養液中 培養。在以椰子水萃取物之6小時培養週期後，藉由即時 PCR分析IL-10與TGF-/?的mRNA量。結果以平均值±S.D· 表示（n=2)。僅與PBS組相比**ρ<〇.〇1。 第4圖的圖示顯示椰子水萃取物對於TPA誘導的小鼠 耳朵厚度之效果。TPA 80# Μ對小鼠耳朵的上皮膚外觀導 致皮膚水腔的誘導’且在兩天以挪子水萃取物（〇·2、1及5 mg/kg/day)預處理’以劑量依賴的方式抑制皮膚水腫的誘 導。結果以平均值±8.0.表示。與正常組相比#p < 0.05，# "Ρ<0·001。僅與以TPA處理組相比*P<0.〇5，**P< 0.01，***P<0.001° 第5圖的圖示顯示椰子水萃取物對於TPA誘導的耳朵 水腫及細胞浸潤的效果。第5A至圖的放大倍數為200 倍，第5F至5J圖為400倍。耳朵皮膚活組織切片係在局 部TPA (80/zM)處理36小時後所收集。以不同劑量之椰子 水萃取物（G.2、1及5mg/kg/day)經口服地預處理兩天，可 以抑制皮膚水腫的誘導，且在TPA處理後降低發炎細胞的 發炎作用。 第6圖的圖示顯示椰子水萃取物對於脂多醋誘導肝細 胞發炎的效果。控制組係好脂多叫摩誘導發炎的肝 細胞。處理組係在〇 1及] / *及1 Μ/ΙΏ1椰子水萃取物的存在下 才又予LPS。正常組係不以lps處理 处理亦不以椰子水萃取物處 111906 33 201141500 理。藉由DAN分析測量一氧化氮(NO)的產生，發炎指標。 結果以平均值土S.D.表示（n=6)。***表示p<〇 〇〇1 0 第7A圖的圖示顯示椰子水萃取物在D-GalN/LPS誘 導肝發炎小鼠模型對於肝損傷的效果。控制組係投予D胺 基半乳糖(D-GalN)及脂多醣(LPS)以誘導肝發炎。正常組係 給予磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)代替D-GalN及LPS，並 餵食0.2及1 mg/kg/day劑量的椰子水萃取物。決定榖胺酸 草醋酸轉胺酶（GOT)的活性。結果以平均值±S D表示（n=4 至 6)。***表示 ρ<〇.〇〇ι 〇 第7B圖的圖示顯示椰子水萃取物在D_GalN/LPS誘 導肝發炎小鼠模型對於肝損傷的效果。決定榖胺酸丙酮酸 轉胺酶(GPT)的活性。結果以平均值±S D表示（n=4至6)。 **表示 p<0.01。 第7C圖的圖示顯示椰子水萃取物在D_GalN/Lps誘導

肝發炎小鼠模型對於TNF_a表現的效果。ΤΝρ·α的mRNA 量係藉由即時PCR決定。結果以平均值削表示㈣至 6)。***表示 p<〇 〇〇1。 第8圖的圖不顯示相P子水萃取物對於小鼠共注射 LPS/D-GalN後的存活曲線之效果。每一組由6至8隻小鼠 組成小鼠係&腹腔注射D_Ga叫刪mg/kg體重）及Lps (Wg/kg體重）。在D-GalN及奶注射之前，口服投予椰 子水萃取物(OU'Smg/kg體重)。 #第9A圖的圖不顯示椰子水萃取物在蛋白多醣誘導的 關郎炎小鼠模型中鮮於後肢厚度的效果。控制組係投予蛋 34 111906 201141500 白多醣以誘導關節炎。正常組係給予磷酸鹽緩衝生理食鹽 水(PBS)代替蛋白多醣。處理組係投予蛋白多醣，並餵食 0.2、1及5 mg/kg/day劑量的椰子水萃取物。 第9B圖的圖示顯示椰子水萃取物在蛋白多醣誘導的 關節炎小鼠模型中對於類風濕性關節炎指數的效果。椰子 水萃取物係在0.2、1及5 mg/kg/day劑量下投予。 【主要元件符號說明】 無。 35 111906

Claims (1)

1. 201141500 七、申請專利範圍： 1. 一種用於在需要的對象上治療與腫瘤壞死因子α (TNF-α)相關聯之免疫疾病及/或異常之方法，包括對 該需要的對象投予治療有效量的椰子水萃取物或椰殼 萃取物，以誘導轉化生長因子/9 (TGF-β)或白細胞介 素10 (IL-10)作為内生性免疫抑制因子。 2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該椰子水萃 取物或椰殼萃取物係藉由下述方法製備，包括： (a) 將椰子水或椰殼水通過樹脂吸附型層析管柱，其 中，該椰殼水係將水加至椰殼而獲得； (b) 以水洗滌該管柱；以及 (c) 以能夠從該管柱解吸附該椰子水萃取物或該椰 殼萃取物之任何溶液或溶劑之組合洗提該管柱。 3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中，該解吸附溶 液或溶劑係有機溶劑、水或其任何組合。 4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中，該有機溶劑 係至少一種選自由甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、異丙醇及 其任何組合所組成之群組者。 5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中，該有機溶劑 係至少一種選自由甲醇、乙醇及其任何組合所組成之群 組者。 6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該免疫疾病 及/或異常係至少一種選自由下列所組成之群組者：皮 膚發炎、肝臟發炎、類風濕性關節炎、骨性關節炎、結 1 111906 201141500 節性多動脈炎、急性痛風性關節炎、哮喘、濕修（異位 . 性皮膚炎）、過敏性鼻炎、眼睛過敏、冷球蛋白血症、 • 原發性血小板減少性紫癜、系統性血管炎、自體免疫性 溶血性貧血、雷諾氏現象、系統性紅斑狼瘡、硬皮病（系 - 統性硬化症）、胰島素依賴型糖尿病、炎性腸道疾病、 , 敗血症、感染性休克、牛皮癖和白塞氏病。 7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該免疫疾病 及/或異常係至少一種選自由下列所組成之群組者：皮 膚發炎、肝臟發炎及類風濕性關節炎。 8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，該對象患有 皮膚發炎。 ~ 9. 如申請專利範圍第丨項所述之方法，其中，該對象患有 肝臟發炎。 〜 10. 如申請專利範圍第丨項所述之方法，其中，該對象患有 類風濕性關節炎。 ^ 如申，專利範圍帛i項所述之方法，其巾，該投予治療 有效量的椰子水萃取物或椰殼萃取物具有轉化生長因 子yS (TGF-泠）或白細胞介素10(11^1〇)之誘導效果，以 作為用於治療免疫疾病及/或異常之内生性免疫抑制因 子。 12. 如申請專利範圍第丨項所述之方法，其中，該椰子水萃 取物或該椰殼萃取物包括至少—種物、雙酶、寡 多醣。 13. 如申請專利範項所叙枝，其巾，該單聽係 111906 2 201141500 至少一種葡萄糖及甘露糖。 14. 一種用於治療與腫瘤壞死因子a (TNF-o:)相關聯之免 疫疾病及/或異常之醫藥組成物，包括治療有效量的椰 子水萃取物或椰殼萃取物。 15. 如申請專利範圍第14項所述之醫藥組成物，係呈錠劑 或膠囊之型式。 3 111906