TW201125982A - Non-embryonic stem cells and uses thereof - Google Patents

Description

201125982 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係’非胚胎性來源之新雛細胞及其用途。 【先前技術】 全能性幹細胞，諸如胚胎性幹細胞(EScells)，可在活體中 分化成所有細胞系，而且，當被引進試管中時，可分化成 份細胞類型。ES、細胞衍生自早期哺乳動物胚胎。由於其之^ 能性’咸信其在治療退化性或遺傳疾病上具有大的潛力 過，在倫理及供給方面的考量阻礙人類烈細胞在研究及治療 上之使用。非胚胎來源之全能性或多能性幹細胞(例如來自成 年或年輕動物之組織)將可迴避此阻礙。雖然一些幹 ，等非胚胎來源得到’此等細胞中之—些具有有限的發育潛 能。又’在供給方面’此等細胞難以獲得且此等細胞之 限以致不符有意義的臨床或研究用途需要。再者，此等細胞之 -些在活财會發育成畸胎瘤，所叫適合活觀用。因此需 $安全、容碰似具有豐富麵之非胚胎性全 性幹細胞。 〜/此 【發明内容】 供月至少部伤係基於非可預期地發現從非胚胎來源製 ^幹，群為全能性或纽性，可以極高鮮得到，且在活 體中不會發育成畸胎瘤。 ㈣之—方面之舰為製衫紐或全能性幹細 2m 。该方法包括：取得複數個胚葉細胞-類似性幹細 也(BLSCs，blastomere-like stem cdls)，在含有維生素 a 酸⑽， 她=acid)或轉形生長因子 p(TGF^，transf〇rming ir^iaCt〇r beta)之培養基中培養BLSCs，以及鑑定及富 化經培養細胞中之多能性或全能性細胞。該等多能性或全能性 201125982 細胞表現GADPH或β-肌動蛋白之mRNA。換言之，gadph 或β-肌動蛋白之mRNA之量係以下節實施例所述之方忐茲士 RT-PCR測定法檢測。 3 該多能性或全能性幹細胞在尺寸上通常為1至15微米， 較佳在尺寸上為1至10微米’且更佳在尺寸上為1至5微米。 此等尺寸為在懸浮液中或附接之細胞之尺寸(亦即，懸浮的細 胞或附接的細胞）。 该術語「幹細胞」係指能分化成許多最終、經分化細胞類 型之細胞。幹細胞可為全能性或多能性。全能性幹細胞典型地 具有發育成任何細胞類型之能力。全能性幹細胞在來源^可為 胚胎性及非胚胎性二者。多能性細胞典型地為能分化成數種^ 同的最終分化細胞類型之細胞。單能幹細胞只能產生一種細胞 類型，但具有自我更新之性質而使其能與非幹細胞區分。此等 幹細胞源自各種組織或器官系統，其包括，但非限於，血液、 神經、肌肉、皮膚、腸道、骨路、腎臟、肝臟、胰臟、胸腺等。 根據本發明，幹細胞衍生自成人或新生兒組織或器官。 BLSC(將於下文中詳述)為在成年或年輕動物中之一群非胚胎 幹細胞。此等細胞為全能性且具有與胚胎性幹細胞相似之分化 能力。參見 W02007/100845。 將藉由在含RA之培養基中培養BLSCs所得到之細胞中 命名為SBR。在一具體實施例中，該培養基含有αι至2〇 μΜ RA且可培養該BLSCs共計2至8星期。在另一具體實施例中， 該培養基含有1至15 μΜ RA且培養該等BLSCs 2至8星期。 ，又一具體實施例中，該培養基含有5至12μΜ 且培養該 等BLSCs 3至4星期。如此製備之多能性或全能性舰細胞 在尺寸上為1至15微米(諸如1至1〇、1至5、2至5、戋3 至5微米)且在懸浮液中可形成片狀結構。 〆 將藉由在含有TGF-β之培養基中培養BLSCs所得到之細 胞命名為SBT。在一具體實施例中，該培養基含有丨至4〇 _ TGF-β且培養該等BLSCs2至8星期。在另__具體實， 201125982 。亥培養基含有2至20 nM TGF-β且培養該等BLSCs 2至8星 期。在又-具體實施例巾，該培養基含有5至12 TGF_p 且培養該等BLSCs 4至6星期。該等多能性或全能性SBT細 胞在尺寸上為1至15微米(諸如丄至1〇、1至5、2至5、或3 至5微米）、具有圓形形狀且可形成凝聚物。 ^發月之另方面之特徵為組合物，其含有複數個上文提 及之經，養細胞’其係(1)為多能性或全能性，(2)在尺寸上為1 至15,米，（3)且表現GADpH或β_肌動蛋白之。該細 胞可藉由上述方法製備。該組合物可進一步含有^或 TGF-β。在了具體實施例中，該等細胞為cd1〇+、cd9〇+、cd1〇5+ 及CXCR4+。在另一具體實施例中，該等細胞為台盼藍染色陰 亦即此等細胞展現台盼藍排除。在再一具體實施例中，該 等經培養之細胞含有為C〇66e+之第一群細胞以及為CD66e_之 第-群細胞。 5亥等細胞實質上為純。術語「實質上為純」，當用於描述 ，細胞或衍生自幹細胞之細胞(例如經分化之細胞)時，意指特 疋細胞構成製劑中之大部分細胞(亦即，超過2〇%、3〇%、4〇0/〇、 50%、60%、70%、80%、90%或 95%)。一般而言，經實質純 化之細胞群構成製劑中之至少約70°/〇之細胞，通常製劑中之約 8〇%之細胞，尤其是製劑中至少約90%之細胞(例如95%、 97%、99%或1〇〇%)。如此，本發明之方法提供下述優點：在 未被其他細胞類型污染下可得到實質純的特定類型細胞群(例 如SBR或SBT細胞）。 上述經培養細胞可用於表現外源性重組多肽。因此，此等 經培養之細胞在本發明之範圍内，其各包括重組核酸。該重組 核酸可編碼多肽且該細胞可含有編碼多肽之。 / 上述經培養之細胞可以遺傳方法處理以致其不會表現β2_ 微球蛋白基因或不會表現一種或以上由第〗類主要組織相容性 複合體(MHC ’ major histocompatibility complex)基因所編 碼之蛋白質，該蛋白質會激發T淋巴球所媒介之抗細胞反應。 201125982 細胞不會導致移郎之社獅，因此可作為全適型 方，括將有效量之上述組合物投與至需要該^ 有一種或以上之上述多能性或全能性細胞。二i 且者包括重組核酸。該重組核酸可 ===性疾病、關節炎及癌症。神經變性疾病 另-方面，本發明之特徵為治療患者 t該方法包括將有效量之上述組合物投與至 =之ίϊΓίΐΓ，於該失調之疾病狀態或傾向損傷/ 治癒、減輕、解除、治療，延遲其發生，預防 y。有效量」係指能在㈣療患者巾鼓醫療上期望結 斷技失調之標準診 =!:!，失==== 5組合物之量。絲龄法可單獨進行賴其他難或療ί 疾f中被下調之多肽之表現量之步驟。於存在 i曰，主/之核量若純未存在钱化合物下之表現 ί勺括糖 化ΐ物為治療該疾病之候選者。退化性疾病之例 ίί ίί^^Γ退化性疾病、關節炎、癌症或自體免疫性 疾病表現1可由mRNA量及蛋白質量之任—者測定。 ，-方®’本發明讀徵為在患者中引進異源性核酸之方 ' »/方法包括下述步驟：取得上述組合物或細胞，其中此 观之至少-她括異雜核酸；以及將該細胞投與至需要該 201125982 ==表核酸可編碼多肽。該細胞-旦被 料術為—相對用語，當其用於描述核酸之部分 2二個或以上亞序列，此等亞序列在天然中未 im十舉例言之，經由重組產生之核酸典型地 不相關基因之跡此等序列以合成方法 新功能的核酸’例如啟動子來自-來源以及編碼 ίί:ί一if。該二核酸因此在其背景上彼此為異源性。該 ί因i二1胞中時，該重組核酸相對於細胞之内源性 非此，f染⑽中，異源核酸引進被整合入染 體外椤萨* ΐ非天然產)核酸，或非原生性(非天然產)染色 ，外，。相對照地，在本專利申請案之内容中，毕色體之天 =置改料，當其包含原生的_性核 =::，為係屬異源。相似地，異源蛋白 列(例3如，「融發^此有相同關係的亞序 碼)。，質可藉由i組以序列由單-核酸序列編 或核吾iii(reTmbi職t)J當被提及時’如：於一細胞、 蛋自4、或賴’係聽細胞、核酸、蛋自質或載體 此，例如，h或K細胞係源自於一細胞經該等修飾者。因 巧t被發現的，或表現一第二套 常或異常之树、私量之树因，祕因可正 (lib:)本之範.内包括—細胞銀行(eel1 —或庫 猶個胚葉細 少-種預，對於各細胞群得到至 寺徵’乂及按…亥至〉、一種預定的特徵將該等細 201125982 胞群分類以製備之 特徵之例子包含— 病及]VtHC資訊）。 。於製備該庫時，可進一步擴增細胞群。該 患者之姓名、性別、身體狀況(包含遺傳= 包含或t人類之動物。非人類之動物的例子 別係指高等靈ί ，像是非人類之靈長類(特 或豬)、以及非哺乳類動物像 適編巾⑽蝴—試驗動: 發明:具體實施例之細節係闡述於後文中。本 以及優點可藉由說明書、圖式及申請 【實施方式】 腦中：=為:es細胞可驗再生各種不同之細胞類型(諸如 的或神經膠質細胞)並從而純各種不同的退化 口疾病或組織損傷。然而，在倫理及供給方面的考量已 S細胞之用途。而非胚胎性來源之幹細胞，諸如：分挽後 幹細胞(如骨難生之_幹細胞，mesenehymal 2 cells))，曰係為另一具前景之替代方案。雖然如此，由於供給方 =考量以及增生/分化能力之限制，該替代方法並不總▲ 接焚。 本發明係關於從非胚胎性來源中製備之幹細胞群、舰 細胞、或SBT細胞。就如同ES '細胞一般，該些細胞亦為全能 性或多能性。更重要者，該等細胞可以極高產率得到，且在活 ，中伽WW)不會發育成畸胎瘤。該等細胞因而可被用於再生 分化出具功能之細胞’以治療各種不㈣化性疾病或組織損 傷。如下節實關所示’ SBR及SBT細胞可於活體物V/M 被輕易的製造、維持及增殖，以及使用常規技術方法以誘導其 201125982 分化。此外，將該細胞移植入一動物患者(如：一老鼠)後，並 無有絲分裂活化之細胞、畸胎瘤、或惡性生長等現象。基於這 些優點，相對於其他幹細胞，該等細胞呈現另一可供選擇之方 案。 八、 於本發明之一較佳具體實施例，該些SBR及SBT細胞係 從胚葉細胞-類似性幹細胞群(BLSCs)中所製備者。Βτ ςΓς盔力 成年或年輕_巾之-群非胚雌幹細胞。此^峨1^= 且具有與胚胎性幹細胞相似之分化能力。參見 W0200_0845。BLSCs包含正常之整套染色體，且^SCs 為細胞谱系未定(lineage-uncommitted)，且可形成身體之所有 體(非生殖)細胞。該等細胞亦可形成生殖配子精子及/或卵子， 以及細胞，以及胚胎性組織以及胎盤之胎兒部分。該細胞易對 ，譜系誘導劑、增生劑及分化抑制劑產生反應。另一方面，該 等細胞對於發展劑(progression agents)較無反應。相似於外胚層 -類似性幹細胞(epiblast-like stem cells)，BLSCs於細胞培養至 長滿時並無接觸抑制作用，但當其於一合乎需要之營養供給 時，則會形成多層長滿之細胞層。BLSCs沒有表現代表前驅^ 为化細胞、胚層譜系幹細胞、或外胚層_類似性幹細胞之表型 表現標記。相反地’ BLSCs表現一般及特定的胚胎性譜李撢 記’例如：胚胎性幹細胞標記CD66e、HCEA、CEA，^及 CEA-CAM-1。BLSCs於成熟組織中常為靜態。然而，當上述 組織叉到傷害，BLSCs便會活化及分化以修復該受損之組織。 片一相較於其他幹細胞，BLSCs可從一分挽後之組織中取得相 當If ί率。例如，BLSCs可從血液中被取得，其產率超過2 χΙΟ /每毫升血液。另一方面，由於BLSCs為靜態且不會表現 基因，故該等細胞於研究及治療目的之用途亦受侷限。 出乎預期的，以某種化學物質培養BLSCs可產生全能性 或$能性幹細胞，其可表現内生性基因及異源性基因。該兩種 全能性或多能性幹細胞群為SBR細胞群及SBT細胞群。將 BLSCs分別培養於含RA及TGF-β之培養基，以取得SBR細 201125982 胞群及SBT細胞群。 BLSCs可藉由下節實施例所述之方法、或於 W02007/100845所述之方法以製備之。一般而言，該細胞可 自成年或年輕動物之多種組織中分離出，包含血液、骨髓及骨 骼肌。為了確認所分離之細胞確實為BLSCs，可供檢驗之一些 特徵，包含(1)於懸浮液中之細胞尺寸少於1微米；（2)細胞表 面標記’如CD66e+ ;以及⑶台盼藍染色呈陽性。細胞表面標 記之抗體’如CD66e可被使用之。其可以適用標記結合之， 如.螢光異硫氣3欠鹽(FITC，fluorescein isothiocyanate)、藻紅 蛋白(PE，+phyC〇erythrin)、或量子點(quantum d〇ts) 〇 BLSC，其 為CD66e，可進一步以流式細胞儀富化之(第一圖至第二圖）。 該富化後細胞群接著係以標準技術測試之。為了確認該等 細胞之分化潛力，該等細胞可藉由習知技藝方法被誘導以形 成，例如：神經元-神經膠質細胞、骨細胞、以及脂肪細胞。 例如：該等細胞可被繼代及培養至長滿(confluence)，移轉至一 骨生成培養基或一脂肪生成培養基，並培養一段適當時間 (如：三週）。骨生成分化能力可藉由鈣累積之礦化作用以評估 之，該礦化作用可藉由vonKossa祕法觀察之。藉由油紅〇 將細胞内油齡色，並於顯微鏡下觀察以檢測猶生成分化情 形。對於神經分化方面’該等細胞可於一神經生成培養基中培 養j當時間(如七天），接著將其以缺乏血清(semmdepleti〇n) 進行处理’並以β-疏基乙醇(p_mercapt〇ethan〇i)進行培養。經分 化細胞呈現具延伸的似健結構之折光細胞體形態 (reftactile cell body)以構成一網絡。以譜系特異 可進一步導引確認神經之分化情形^ ==产，特異性第三_敬管蛋响屮、神經 算4Γ 由、BLf不具接觸抑制作用之特點，以確認該 it 可將該分離細胞培養至長滿。於此 條件下，BLSCs可形成球形之細胞凝聚物、細胞均佈之多層結 、，亦狀、稱蛋白(neurofilament)、以及 GFAP。 201125982 構(mU+ltiPleconfluent 丨ayers)、或網孔(mesh net)結構。相反的， CD42細胞無法形成前述結構，如細胞凝聚物。 經該等確認後之BLscs可進一步於一非分化性之培養基 中以超過10、20、50、或100代以上之細胞倍增率㈣祕加 oublrng)培養增殖之，且其中無自發性分化、老化、形態變化、 生長速度增加、或改縣具能力分化為神經元之跡象。該等細 胞可於使用前以標準方法保存之。 為J製備SBR細胞，可將該BLSCs於含有〇1至2〇 _ 兄中培養2至8週。於-較佳具體實施例中，該BLSCs 於含有1至15_RA之環境中培養2至8週，或更佳 ί^之環境中培養3至4週。藉此製備^多 u寸為1至15微米，且可於懸浮液中 狀、、，。構。任何市售可得之適用於細胞培養之Μ皆可被

Tr^ 了 ^備飢細胞1 ⑽^於含有1至40 ηΜ BLS? ίΪίt培養2至8週。於一較佳具體實施例中，該 3 # 咖TGF-P之環境中培養2至8週，或 ΐ ί ί ί 有5至12 _ TGF_P之環境中培養4至6 2 此或王/b性細胞群之尺寸為1至15微米，具一圓形之

且可械凝聚物。雖錄何麵之曹_卩皆可使用， 南、。屯度之TGF-β仍為較佳者。TG ηΐτ： TGF-p) ^ tgf- iTtit 同^^性之TGF_P/天然產的TGF_p及基 盥*紗=被使用。藉由DNA重組技術所取得之TGF-P可能 ^? TGF-β *有相同之胺基酸序歹、或一與 I二2能夠者」係指—天然產之TGF_P的多ΐ ί 如-蛋白具有_或多個點突變、插人 iTri °rTGF^ 變‘ TGF β、㈣Λ。撒?學修飾後之TGF-P的例子包含結構改 欠之TGF-β、增加或删除其醣鏈、以及被—化合物，如聚^ 201125982 醇(polyethylene glycol)，所結合之 TGF-β。 △ \該8811細胞及SBT細胞可基於其尺寸、接觸抑制作用、 台盼藍純排斥(如：⑽藍純雜)以與BLSCs _及確認 之。BLSCs較SBR細胞及SBT細胞小(小於丨微米），且缺乏 接觸抑制作用、或為盼藍染色排斥。該SBR細胞及SBT細胞 亦可根據相關之細胞標記，如CD1〇+、CD9〇+、以及CXCR4+ 以流式細胞分析，或其他標準分析方法，如RT_pCR，以確認 之。 如此製備之SBR細胞及SBT細胞可進一步與前述測試 BLSCs之相同方式、或其他習知技藝之標準技術，以測試其全 能性及多能性。於適當之誘導條件下，該等細胞可於活體外分 化為，如：脂肪細胞、軟骨細胞、以及骨生成譜系之細胞群。 此外，於前述誘導條件下，該等細胞具有能力去分化為神經膠 質細胞。 全能性及多能性可於活體測試之。例如，當腦部缺血之大 鼠接受大腦内SBR細胞或SBT細胞之腦内移植後，相較於以 安慰劑(vehicle)處理之對照組大鼠，其神經功能明顯被改善。 此結果指出’於腦内投與之SBR細胞或SBT細胞可進入腦 部、存活、遷移、以及改善中風後之功能恢復率。事實上，該 些移植細胞於缺血性腦部中可分化為神經膠質細胞 (GFAP+)、神經元(Nestin+、MAP-2+、以及 Neu-N+)、以及血 管内皮細胞(vWF+) ’以增強神經可塑性(neur0piastic)之效用。 大腦皮質的神經元活性可藉由氫質子磁振頻譜^H-MRS， Proton MR spectroscopy)評估之，相較於對照組，於移植組之 大腦皮質的神經元活性亦較大幅地增加。此外，於移植組之缺 血性大腦半球中亦可發現神經滋養因子(neurotrophic factor)之 調控表現顯著性地增加。 經此確5忍後之SBR細胞及SBT細胞可進·—步於一非分化 性培養基中以10、20、50、或100代以上之細胞倍增率 (population doubling)培養繁殖之，且其中無自發性分化、老 12 201125982 化、形態變化、生長速度增加、或改變為具能力分化為神經元 之跡象。該等細胞可於使用前以標準方法保存之。 “術語「增生」及「擴增」於此可交替用於與細胞相關，係 指藉由分裂以使同種類之細胞數增加。術語「分化」係指於細 胞發月過程中為一特定功能轉變特化之，例如，細胞獲得一或 多個，初始細胞類型不同之形態特徵及/或功能。術語「分化」 包含譜系決定(lineage commitment)及終末分化過程(terminal differentiation processes)。分化是可被評估的，例如：藉由使用 免疫組織化學法或該領域技藝者所知之其他步驟，以監測譜系 才示圮之出現與否。自先驅細胞衍生之後代分化細胞可能，但非 必然，與5亥幹細胞來源組織為相同胚層或組織。例如，神經先 驅細胞及肌肉前驅細胞可分化為造血的細胞雄糸。 > 術語「譜系決定」及「特化」於此交替使曰用，係指一幹細 胞發展為一前驅細胞之過程，該前驅細胞決定 範圍之細胞分化類型。已定向之前驅細胞通常具有 細胞分裂之能力。 術語「終末分化」係指一細胞最終分化為一成熟、完全分 化之細胞。例如，神經前驅細胞及肌肉前驅細胞可分化為造血 J胞譜J ’其終末分化為—屬於特定細胞_之成熟血球 終末分化與中斷細胞週期及停止增生有_。術語「前驅 胞(pr^mtor cell)」於此提及，係指一細胞已決定成為定 ^胞^ ’且其藉由—連串細齡_發展成該譜系之細胞 群。-則驅細胞之例子可為一肌母細胞，其僅可分化 型之細胞，但其本身並不完全成熟或完全分化。 類 1. 一般之用途 、本發明之SBR細胞及SBT細胞可應用於許多層面 =治療退化性或遺傳性疾病且能免_作人類胚胎的道德考 土於此目的，可自病患(如缺乏組織或器官正常發育所需 13 201125982 重要之功能性基因)體内分離BLSCs。自BLSC中生產出SBR 細胞和SBT細胞之後，可將一能夠編碼一功能性基因的核酸 載體轉入細胞内。該載體可藉由許多方式轉入細胞内，包含構 酸鈣共沈澱法、DEAE葡聚醣媒介轉染法、脂小體轉染法、電 穿孔法、顯微注射法、或病毒媒介之技術。以不影響該細胞多 能性之方法為較佳。該等技術之詳述可見於美國專利號 7,422,736 及 5,591，625，及美國專利中請號 20020127715。於 將功能性基因遞送入細胞内後，繼之以習知技藝方法將該等細 胞移植至該病患體内。由於該細胞係生產自該病人，因此，此 治療方法並不會引起免疫排斥現象。

另外，可利用來自一健康個體所製備之SBR細胞和SBT 細胞製造通用捐贈者細胞。用以製備通用捐贈者細胞之方法係 為習知技藝，該等製備通用SBR細胞及SBT細胞之方法將於 下詳述之。 於適當之條件下，該等移植之SBR細胞及SBT細胞可發 育成一功能性組織或器官。為促進其發育，可投予該病患誘導 細胞發育之因子。鮮因子可為小分子化合物、胜肽、及核酸。 其例包含，但不限於’轉型生長因子P、骨形態發生蛋白及 經生長因子。 該等SBR細胞及SBT細胞對於譜系發育及分化之發育或 分化機制之研究亦具其助益。使用該等細胞為一模式系統以鑑 疋誘導全能性多能性幹細胞成為一特定組織或器官之條件。此 外，可使用習知之差異性dDNA基因篩檢方法以分離於發育過 程中有參與之基因。參閱，如：Shen M. et al.，Development 124:429-42, 1997。可利用該等細胞，其已被誘導發育為一特定 譜系，如前述之神經膠質細胞系，以製備一 (^£^八庫。此庫 用於分離及研究具差異性表現之基因。該等分離之基因可進一 步用於研究其於各自階段之角色。相關之技術皆為習知技藏。 參閱，如：美國專利號7,422,736及美國專利申 20060035373。该荨SBR細胞及SBT細胞亦可使用習知方去 14 201125982 用於發欲為一器官或複製動物。夂

Nature，380: 64-66 1996。因迚 如。卿以11 K.过 al” 業極且價值，+因此，5亥專細胞對於寵物及畜牧產 糸U禮，且可用於保存瀕臨絕種之動物。 2.師檢方法 旦邊胞可被應用㈣檢試财，可鑑定⑽定方法 型之藥物’亦即該藥物即可用於治療綠 因此本發明-方面係關於―鑑定—製劑之 細胞進行接觸，_出可改縣分化舰^胞 i 胞之魏的試劑。她於未存在朗試製劑時之功 =，f存在該測試試劑時，該等細胞之功 測試製劑係為可改變該等細胞之功能或基因 ㈣」係指被用於檢測其具有改變細胞功能或 土因表見此力之任何分子。雖然該方法係做為一篩檢方方法， -般被用以气—定出-先前未知但具有一職活性的分子，然 而’本發明之騎方法亦可用於確認某已知擁有特定活性 劑0 該功能可為基因之表現，其一般係指於細胞中表現(或不 表現）’以及該製劑可藉由增加或減少一表現基因（如：降低 CD66e之，現量)之表現量、或藉由開啟一未表現基因(如：誘 導特定譜系之抗原的表現)於細胞中之表現，以改變該功能。 於一具體貫施例中，此能影響細胞功能之製劑係為一能誘 導細胞分化且產生出已分化細胞之製劑。此等已分化之細胞可 為多能性人類幹細胞(如：造血幹細胞）、或可為最終分化的細 胞(如··肌肉細胞、神經細胞、血球細胞、結締組織、或上皮 細胞）。此方法就其本身而言，可用於鑑定一製劑，其可誘導 分化SBR細胞及SBT細胞成為最終分化之細胞，如：胰島卢 細胞、肝細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞或任何其他細胞類型。 該此法所鑑定之製劑或化合物可被用於治療退化性疾病、癌症 15 201125982 或是免疫疾病。 定。藉由表現量或是蛋白質表現量來決 測曰之爾a表現量的方法係為習知技藝。為量 探測^里定匕與否，皆可藉由，如：雜交試驗(使用可 的麵或繼探針），以及量化或半量 或丰的狀基因引子對)量測之。另外，量化 浮液，可試驗可用於組織切片、或未溶解之細胞懸 探可探測之(如：榮光或酵素)標定DNA或顺八 Ξϋ 定量方法包含該舰保護試驗_)方法， 術。 序列分析方法(SAGE)，以及以陣列為基礎之技 分使本t自餘現制綠料胃知«。其中部 早株抗體或多株抗體），其可特異性地結合至 皆或結合其之第二抗體 存者另外’5亥抗體可以與生物素結合。其 量列^ 標定之印白素(一胜狀係結合於生物素)以 用於；配組合(包含「多層夾心結構」試驗)可 用於曰強忒方法之靈敏度。一些蛋白質量 ?Γ:墨點法)可被應用於體液或細胞溶解物、‘他(如··免 法或螢光流式細胞儀)可應用於組織切ί di 二細巧洋=方，。適當的標定包括放射性 過氣化‘之、氣或32鱗)、酵素(如：驗性鱗酸酶、辣根 榮光/酶)、=冷光劑(如： "一、、目，丨疋里免疫沈澱分析、或補體結合試驗。 -胜肽以是任何類型之分子’例如，—聚核普酸、

Dernoidd、一 I U肽、擬肽可為乙烯化之擬肽(vinyl〇g〇us 、一小3L有齡子或其她物，且可藉各種方式以改 16 201125982 變SBR細胞及SBT細胞之功能。例如，該測試製劑可藉由在 細，外結合至一表現於細胞表面之受器，藉此改變一功能，該 功能係由一通常結合並作用於該受器之配體所媒介。另外，該 測試製劑可被動地或由主動運輸機制以穿過細胞膜，並作用於 細胞内而改變一功能。 胜狀測試製劑可為任何胺基酸或胺基酸類似物之聚合 物，且其可為三至四個殘基，至幾百或幾千個殘基之不同變 化。胜狀測試製劑可藉由化學合成、或使用蛋白質純化、續以 蛋白水解作用之方法製備，若有需求，可進一步利用層析法或 電冰法進步純化，或可藉由編碼多核普酸以表現。一胜狀測 試製劑可為一已知胜肽，如：一天然產之胜肽，但亦可與該天 然產之f列不同，例如：包含一個或多個胺基酸類似物。 ^ 一多核苷酸製劑可為二個或多個去氧核醣核酸或核醣核 酸之序列，其藉由一磷酸雙酯鍵以互相連結。可為抓八或 DNA，其可，一基因或其蛋白，一 cDNA、一 RNAi試劑、一 合成之多去氧核醣核酸序列、或其相似物，及其亦可為單股或 雙股’亦可為一 DNA/RNA雜合體。可為一自細胞中分離之天 然產之核酸分子，柯為—合成分子，其係勤如化學合成法 或酵J法(如聚合酶鍵鎖反應(PCR，polymerase —η)) 以製，。於乡種具體實施例+，本發明之錄#酸可包含核誓 或核普酸類似物’或—料酸雙g旨鍵之骨架鍵結。此等核賊 ，似，係為f知技藝且市售可得，而包含此顧魏類似物之 夕核苦酉夂亦同(Lin et al.，Nucl. Acids Res. 22:5220-5234，1994; Jellinek et al., Biochemistry 34:11363-11372, 1995; Pagratis et al.,

Nature Biotechn〇U5:68-73, 1997)。 一多核苷酸測試製劑可與SBR細胞及SBT細胞接觸、或 藉由文中所述之方法或習知技藝，將之轉入SBR細胞及SBT 、’’田月l 瓜而&，而非必然，該多核苷酸被轉入細胞内時，其 可直上接影響其功能，或影響其轉錄或轉譯、或兩者之功能。例 如’《亥多核皆酸可編码一胜肽測試製劑，其可於細胞内表現， 17 201125982 並影響該細胞之功能。一多核苷酸劑亦可為，或編碼出，一反 股分子、一核醣酵素、或一三股合成試劑，其可被設計來標靶 一或多個特定目標核酸分子。 欲篩選之候選製劑或化合物(如：蛋白、胜肽、擬胜肽、 擬肽、抗體、小分子、或其他藥物)可藉由本技術已知之組合 庫法中之多種途徑之任一種得到。此等庫包含：胜肽庫、擬月I 庫(具有胜肽功能，但具有可抵抗酵素降解之新穎、非胜肽骨 架之分子之庫）；空間可尋址平行固相或溶液相庫(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries);藉由 解旋法或親和性層析法篩選獲得之合成分子庫；以及該一 珠粒單一化合物」分子庫。參閱，如：Zuckermann & 1994, J. Med. Chem. 37:2678-2685;及 Lam，1997, Anticancer Drug

Des. 12:145。分子庫之合成方法範例可見於，例如：Dewitte/ al., 1993, PNAS USA 90:6909; Erb et al., 1994, PNAS USA 91:11422; Zuckennann et al, 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho etal., 1993, Science 261:1303; Carrell etaL, 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al.^ 1994, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 ;以及 Gallop ei β/·，1994 J. Med. Chem. 37:1233。分子庫之化合物可呈現於液體中(如：H〇ughten，1992,

Biotechniques 13:412-421) ’ 或珠粒上（Lam，1991，Nature 354:82-84)、晶片(Fodor，1993, Nature 364:555-556)、細菌(美國 專利號5,223,409)、孢子(美國專利號5,223,409)、質體(〇111心/.， 1992, PNAS USA 89:1865-1869)、或噬菌體(Scott 及 Smith 1990,

Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla et al, 1990, PNAS USA 87:6378-6382; Felici 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310 ;以及美國專利號 5,223,409)。 3.退化性疾病之治療 於本發明範疇内，係為一治療退化性疾病、舒缓該疾病症 狀、或延緩該疾病於一患者中發作的方法。可藉由標準技術診 201125982 斷患者情況或疾病以鑑定出料療者。該治療方法需投與一亟 需其治療之患者一有效量之前述SBR細胞或SBT細胞。 一退化性疾病係指一疾病，其中感染組織或器官之功能 結構隨著時間逐漸惡化，無論係歸因於遺傳缺陷、受傷、缺乏 適當細胞分化(如於細胞增生之赫）、雜上正常磨損、或生 活方式的選擇。退化性疾病之例子包含神經性退化疾如： 阿滋海默症、帕金森氏病、Ττ_蹈症、多發性硬化症、以 » amyotrophic lateral sclerosis)) ^ if疾病(包含橫性脊髓炎、腦部或脊髓神經創傷 ίίf f 鞘、急性腦部受損、頭部創傷、脊髓受損、周 ίί ί ^腦部受損、中極神經系、统之遺傳性_脂 失调、癲癇、周產期窒息、窒息、缺氧症、癲癇 、 瘅自症及/風）、癌症或相關癌症療法^生 ώ / (、予療法），代谢疾病(如糖尿病、尼曼匹启症）； 1免疫或發炎相關疾病(如：紅斑、發炎性腸道疾病卿， in、a:i^tdise=、制腺炎、骨卿炎、骨質疏鬆 L ϊί f炎' 狼瘡' 糖尿病、及氣喘）、眼疾(如：青 網膜炎、諾里氏症、及黃斑部病變);心臟或 萎縮Γ ί田广it : WiscottAIdrich氏症候群；肌肉 病(如愛迪肝臟疾^肺臟疾病、腎臟疾 ⑴i知哉(如·肌肉損傷、老化受損細胞及老化受損组 、:L如 ' 巧相關之情況(如：落髮、雄性充及圓形旬、病毒情 im型f炎病毒感染、及後天性免疫缺乏症‘ if 與該疾病相關之症狀。本發明之方症狀及/或 及整形外科、或女性之乳顧人方法了被㈣轉勃起障礙、 疾病 4.治療帕金森氏症和其他神經退化性》 J9 201125982 受損^減’係為—治療腦部或中枢神經系統組織 展=内疾病症狀之方法。此方法包括鑑定出遭 人類、或X人胞夕匈:二，織文損之潛在風險的患者。此患者可為 受損之例早勺入類動物，如：描、狗、或馬。腦部組織 性#^ 腦局部缺血(如：慢性中風）、或神經退化 病ίίίϋ腾。可藉由鮮麟频患者情況或疾 一右二，，者。該治療方法須投與—亟需其治療之患者 有效里之别述之SBR細胞或SBT細胞、或一活性成分/化合 此細胞之療效可藉由標準方法以測之。例如，欲確認豆促 進月^血管新生之功用，可分別於治療前後藉由標準腦部影像技 術診察一患者，例如：電腦斷層掃描（cr，c〇mputed tomography)、都卜勒超音波影像技術(Dm，D〇ppler ultrasound imaging)、磁振造影(MRI，magnetic res〇nance imaging)、以及氫質子磁振頻譜(4祖8)。例如，氫質子磁振 頻譜(b-MRS)代表一非侵入性方法，其可獲取和腦部代謝活 動相關之生化負 §fl(Lu et al·，1997，Magn. Reson. Med. 37, 18-23)。此技術可用於評估幹細胞移植前後和大腦局部缺血有 關之代謝變化。例如，可用於研究腦内N-乙醯天門東胺酸 (NAA ’ N-acetylasparate)之濃度’其為腦部神經元完整性之 指標。雖然神經元碎片中之NAA重新分布和截留係限制了其 可作為一定量用神經標記之用途，然而，大腦局部缺血時之腦 部NAA濃度下降仍可被作為神經元喪失或功能異常之指標 (Demougeot et al” 2004, J. Neurochem. 90, 776-83)。因此，藉由 風質子磁振頻谱（H-MRS)測得之NAA濃度可作為·-有效指標 以追蹤大腦局部缺血後經幹細胞移植後之效用。 5.癌症 前述之SBR細胞或SBT細胞亦可被用於治療癌症及其他 20 201125982 、自 疾病，其特徵在於無法控‘細胞=t和ί時」 以:多V癌細胞具自生長之能力，例如:-不正常之快 化丄县、H ί之狀態或狀況。該術語意欲包含所有類型之癌 人二為何組織病理類型、或侵入階段。癌症之範例^ 二-不限於’癌及肉瘤，如：白血病、肉瘤、骨肉瘤、 :盘黑色素瘤、神經膠質瘤、嗜鉻性細胞瘤、肝癌、印巢^、 ϊί癌二睪丸癌、胃癌、胰臟癌、腎癌、乳癌、前列腺癌、大 ^、頭部或頸部癌、腦癌、食道癌、膀胱癌、腎臟皮質癌、 其他原明til膜癌、鼻咽癌、子宮頸癌或肝癌、及 6.基因療法 前述細胞及方法可被用於各種不同之習知基因治療方法 ^。基因療法包含活體外(exv/w)及活體内(加Ww)技術。尤其 是’前述幹細胞可於活體外以一寡核苷酸調節子或一核酸分子 編碼該調節子進行基因工程改造，將該等工程改造後細胞提供 給一被治療之病患。細胞培養物可被調配以投與一病患，例 如，藉由分離該細胞(如：藉由機械式分離），並將該細胞與一 醫藥上可接受載劑(如：磷酸鹽緩衝液)混合均勻。或者，細胞 可被培養於一適用之生物相容性載體(support)，並將之植入一 病患。該等經工程改造之細胞一般係為自體衍生的，以便於避 免同種異體或異種異體排斥。該等活體外〇x Wvo)方法皆為習 知技藝。 該等細胞可藉由習知技術投與寡核苷酸或核酸分子以進 行工程改造。例如，寡核苷酸及其他核酸分子可藉由直接注射 一「裸露(naked)」核酸分子來投與(Feigner及Rhodes，（1991) Nature 349:351-352; U.S. Pat. No. 5,679,647)，或一核酸分子可 21 201125982 被配製於-含有-❹财促賴酸奸被細胞魏之成分 的組合物_，該成分可為皂芽(sap〇nins)(例如請參閱美國專利 號5,739，118)，或陽離子聚胺（例如請參閱美國專利 5,837,533)，或藉由微粒子轟炸(例如；透過使用一「基因搶 杜邦(Dupont)製藥之基因搶(Bidistic》；或藉由將該核酸分子以 脂質、細胞表面受體、或轉染劑塗覆之；或將該核酸分子 於-微脂體、微粒、或微膠囊中；或藉由投與一與胜肽鏈結之 核酸分子’紐肽已知可進人細胞核；或藉由投與—與配體鍵 結之Ϊ酸分子’該配體易被受體媒介之胞飲作用所影響，其可 用以標定出可專一性表現該類受體之細胞類型。 、 一核酸-配體複合物可被形成，其中該配體包含一融合病 毒胜肽以瓦解内體，可使得該核酸免於被溶酶體降解；或該核 酸分子可作為細胞專-性吸收之目標，以及藉由—特定受體^ 目標以於活體内(in vivo)表現。此外，一引入、表現及累積反 股寡核苷酸之有效率的方法已於美國專利號6,265,167中被描 述，其可使得該反股寡核苷酸與一正股於細胞核中^ 合，亦可避免反股寡核苷酸被加工處理或運輸至細胞質。本發 明亦考量於細胞内狀誠酸分子，以及隨之藉由習知同源^ 重組技術於宿主細胞DNA進行嵌合以表現之。 、 該多核苷酸亦可被嵌入於一適用表現載體。一些眾所皆知 之適用於基因療法應用之載體(參閱，例如：Viral Vect〇rs: Basje

Science and Gene Therapy，Eaton Publishing Co. (2000))。 、該表現載體可為一質體載體。生成及純化質體DNA之 法快速且簡易。此外，當發生消除分立實體之基因毒性事件 (discrete entity eliminating genotoxicity issues)而可能引起染 體整合時，質體DNA—般不會整合入宿主細胞之基因組了而 係維持於游離基因位置(epiS0mal locati〇n)。現今已有各種不 市售可得之載體’以及包含該等源自大腸桿菌及枯草桿菌的g 體，其中多被特別設計為可用於哺乳動物系統中。於本發明中 可能被使用之質體之例子包含，但不限於，真核表現戴體 22 201125982 pRc/CMV (Invitrogen)、pCR2] (In 2P^GFPq « - al. Pc^I；〇g^y ΐϋ i㈣體實關中，該㈣係為PRe/CMV、 pRc/CMV2 (Invitrogen) > pAdCMVS (IRB-NRC) ^ pcDNAB (Invitrogen) > pAdMLPS (IRB-NRC) >PVAX (Invitrogen) 〇 5亥表現載體可為一病毒載體。病毒載體之例子包含，但不 限源自無法自我複製之反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒 j及腺病病毒之病毒韻。反轉錄病毒紐，以及腺病 毒相關病毒載體係為目前重組基因遞送系統中之首選，其可供 活體内(in vivo)傳遞外源性寡核苷酸、或基因，特別是可傳乂 人體。該等麵使得細可有效_進人細胞，以及使該傳遞 後之核酸可穩定的與宿主之染色體DNA整合。一取決使用反 轉，病毒之主要先決條件為該等病毒使用時之安全性，尤其需 注意野生型病毒於細胞群中蔓延的可能性。反轉錄病毒載體可 源自^反轉錄病毒，包含’但不限於，莫洛尼鼠類白血病病毒、 胰臟壞死病毒、反轉錄病毒(像是勞斯肉瘤病毒、哈維氏鼠類 肉瘤病毒、禽白血病病毒、長臂猿白血病病毒、人類免疫缺乏 病毒、腺病毒、骨髓增生肉瘤病毒、以及乳腺腫瘤病毒。特定 的反轉錄病毒包含pLJ、pZIP、pWE以及pEM，該等對於習 知技藝係屬眾所皆知者。 7.細胞庫 本發明之一特徵在於一幹細胞銀行或庫，其可便利的及有 系統的存取不同幹細胞系。該銀行或庫中之幹細胞，係源自前 述BLSC、SBR細胞、或SBT細胞，其可來自於健康之個體、 或具有已知疾病狀態之患者或該症狀對於使用者(如：研究人 員）來說係屬重要珍貴者。具有從前述幹細胞分化之細胞之細 胞銀行或庫亦在本發明之範疇中。該等自幹細胞所分化之細胞 例子包含腦細胞、神經元細胞、星狀膠質細胞、神經膠質細胞、 T細胞、B細胞、軟骨細胞、骨細胞、胰島細胞、脂肪細胞、 23 20Π25982 胞、肝細胞、腎細胞、肺細胞、肌肉細胞、以及眼細胞。 於銀行鱗内之細胞係根據縱概时類之，該特徵包 1Ϊ型形態特徵：分化縣、血型、主要組織相容性複 口 、知贈者之疾病狀態 '或基因型資訊(如：單一核苷酸多 ^NP ’ single — pGlymGrphisms)之—特定核酸序列 ί二ί因、基因體或粒線體DNA _)。該等細胞係於-適當 =中(、-般·由精)娜存，韓触幹細胞存活並仍具 二° 可i括建立各細胞群特徵之集中紀錄，例如，但不 =電庫(dat一。本f上’此具體實施)例=亡= f 雜細祕行可㈣細者從料樣本中筛選 使用者需要之特定幹細胞樣本。此外，於本發明之另 涉及銀行，其包含來自於各別來源之許 八類上ί本’且4雜本絲於至少—預定舰以特徵化及 許ΐ來；一建？細胞銀行之方法，包 者下触令後，可11由聰式補組使產生 器上·覽。於一特定的具體實施例中，本 化ϋίί患者的幹細胞。該疾病狀況可包含前述之退 ΐ細ΐίί雜人於—㈣庫中。❹卜，亦或是，該 "係基於—特絲現型但並非'城與-疾病狀況有關來 24 201125982 特徵化。例如，肝細胞可基於其可代謝某類化合物來特徵化， ，：咖1因、酒精、藥物製劑等化合物，以研究此等不同代謝 能力之遺傳本質，或與其侧之基礎生理機能。其他細胞類型 係可依據其功能性及/或形態表現型來特徵化。 於一些具體實施例中，自SBR細胞或SBT細胞分化的细 胞，可藉由引入一工程改造之載體、或其他遺傳物質，而使1 可能易受影響分化或排斥分化之狀況所影響。排斥分化包含^桑 控一細胞使其具有一較不會分化細胞之特性。 本發明之幹細胞庫可藉由前述方式以篩選出可用以治療 ，化性疾病、癌症或免疫疾病之製劑或化合物。該庫可適^於 高速篩選系統，及可幫助鑑定出對於一特定患者特別有效之製 劑。對於一尚速篩選系統，該等幹細胞可被導入於一多孔盤之 孔中或於一載玻片或微晶片，並與測試製劑接觸。一般而言， 該等細胞於一陣列中係為有組織化的，尤其係指一可尋址^陣 列，這樣即可便於以機器人操作該等細胞及溶液，及監測該等 細胞，該等操作特別與被檢測之功能有關。使用一高產率^式 之優點在於可同時進行檢驗許多測試試劑，以及，視需要，對 照組之反應可與測試條件完全相同之條件下進行反應。因此， 本^明之賴方法提供具從-個、—些或大量的測試製劑 中篩選以鑑定出一可改變幹細胞功能之製劑，例如，該製劑包 含：可使該細胞分化為一所欲之細胞類型、或可避免自^ 化者，例如：可維持高量表現之調控分子。 刀 8.通用捐贈者細胞 刖述之幹細胞可藉基因工程方法改造以產生組織抗原相 容之捐贈者細胞或組織以作為移植之用。移植及細胞治療之目 標係以具功能性之捐贈者組織或器官將衰竭之組織或器官成 功地取代。然而，為求成功移植，需克服兩道屏障：適合之捐 贈者組織或器官之取得，以及免疫排斥現象。取代衰竭^組織 或器官以及免疫排斥之治療，係受限於可接受的捐贈者之數量 25 201125982 i 定而言，本文所述之幹細胞可·基心程摔作改 ，，使其不於細胞表面表現第二類主要組織相容性複 J其:表現大體上所有細胞表面上之第一類及第二 織相谷性複合體分子。如本文，術語「不表、於 ，表面上不足量之表現，故無法引起反應，或是，所 蛋白質有所缺陷而無法引起一反應。 該主要組織相容性複合體分子係指HLA分 J，A、B及C，以及第二·请仰及之七 類。此術財解釋為專指人類主要組_容性複合體， 於本文可触包含來自其他捐贈者物種之粒主要组 =複合體基因，例如：若該細胞來源為豬，則術語扯八係 才曰豬之主要組織相容性複合體分子，無論係指第一類或第二類 主要組織相谷性複合體。當第二類主要組織相容性複合體分子 移除時’ CD4+ Τ細胞即無法辨認被基因工程改造之内皮細 胞，^第一類及第二類主要組織相容性複合體分子皆被移除， 則無論cm+A CD8+細胞冑無法觸經料之細胞。 .較佳之幹細胞基歸飾包含υ破_生性錢異胜肽鏈 (mvanant chain)基因，其作用於第二類Mpjc分子之組裝和運 送士細胞表面，以及抗原性胜肽之裝載；以及2)破壞内生性 β2_试球蛋白基因(βΜ gene)，其編碼所有第一類mhC分子表 現於細胞表面時所需之蛋白f。另夕卜，僅錢異胜肽鏈 [invariant chain)基因被破壞。非變異胜肽鏈(invariant比刪被 認為，抗原性胜肽片段嵌入第二類mhc分子時所需。總結 ’杬原性胜肽和主要組織相容性複合體為τ細胞所辨識。於 抗原胜肽不存在時’ Τ細胞辨識即無法正常達成，第二類mjjc 26 201125982 分子亦無法正確折疊。因此，在缺乏非變異胜肽鏈(invariant chain)之細胞中，胜肽之呈現將受阻礙，縱使另存在極少量之 細胞表面MHC，其仍缺少胜肽因而無法引起免疫反應。 卜該等基因之破壞可藉由同源重組基因標靶技術以達成。該 等技術係為習知技藝。參閱美國專利號6916654及6986887,

Zijlstra et al.，1989, Nature 342:435438;以及 Koller et al.，1990 Science 248:1227-1230。 9.組合物 本發j月提供一醫藥組合物，包含前述細胞或活性成分/化 s物。醫藥組合物可藉由混合—治療纽量之該等細胞或活性 ，浏/化合物，及視需要包含其他活性物質，及一醫藥可接受 ^載劑以製備。該細可為不同形式，視投與之路徑決定之。 性物質之例子包含已知之活性化合物或藉由前述篩選 万法所鑑定者。 做則藥組合物可藉由常規的f藥_劑及製備方法來 3進形^可與贿劑、溶劑、粒化劑、保濕劑及黏 ϊΐί:二本文所述之術語「有效量」或「治療有效量」 之^一 ϋ :疾病之至少—症狀或參數得以顯著地改善 一^之m之治療有效量可由習知方法決定。職治療 方由該領域具有通常技藝者以軸 疾病之情況及g度確切數量將依照該 於该病患之報告來決定。將被明瞭由^師對 何臨床上或崎上顯著減弱或者ίίϊίί 27 201125982 生不欲之反應。較佳地，術語「醫藥可接受的」意 二列於美國藥典、或於其他:終認 ，戶^ Α如了用於#礼動物，特別係指人類。醫藥可接受趟 類、醋類、醯胺’以及前驅藥，係指該些鹽如二 胺基酸添加鹽）、_、_，以及前驅藥，於醫g 反麟；μ考倾制叙合判τ益=險 -可應驗前述醫藥組合物之載舰指—稀釋劑、賦形 劑、或-載體，其可被投與-化合物。該等醫藥載劑可為=菌 ，液體’例如水及油。健麵财或水麵、魏、及液態 葡1糖及甘油溶液作為-載劑’特別可作為注射溶液。適用^ 醫藥載齊Η系已於由E. w. Martin所撰之"Remingt〇n，s

Pharmaceutical Sciences”第 18 版中描述。 該等前述細胞可透過注入或注射(例如：靜脈注射、鞘内 /主射、肌肉主射、腔内、氣管内、腹腔或皮下）、口服、皮膚 穿透、或其他習知方法，以投與一個體。投與可能每兩週一次、 一週一次、或更頻繁，但當該疾病或失調於一穩定階段時，豆 投與頻率則可能會減少。 〜 異源的及自體的細胞皆可被使用。於前者情況，jjLA之 吻合將可避免或降低宿主之反應。於後者情況，自體的細胞係 從一患者中被富化及純化後，進行保存以備用。該細胞可活體 外培養於一含有宿主、或移植T細胞之環境中，並重新被送回 該宿主。此舉可使該等細胞於該宿主内被視為自體的細胞，並 較可降低T細胞活性。 劑量和投與頻率將取決於臨床症狀，其經確認緩解階段之 維持，或於急性期之至少一個或多個，較佳為多於一個之該領 域熟諳技藝人士所知之臨床症狀被減少或消失。更普遍者，劑 量和投與頻率部分將取決於一疾病狀況或失調之病理症狀及 臨床和亞臨床症狀經前述組合物治療後的削弱情形。於病患或 28 201125982 被治療之哺乳患者、及醫師之診斷，其劑量和投與 性別、身體狀況的管理，以及共軛利益和副作用 >來調聲， 忒等技藝皆為熟諳技藝者所知悉者。於所有前述方法° 細胞以每次lxio4至lxio1。之量投予一患者。 5乂 以下特定之實施例僅供示例說明，非用以限制未 揭示者。無需進—步詳細闡述，咸信該領域熟諳 本文之說明，將本發明發揮至淋漓盡致。 土、 SBR及SBT細胞之製備 將BLSCs活化、純化及擴增之方法，係已於 WO/2007/100845中被描述。於此實施例中，BLSCs係從人類 患者之血液中以兩種方法純化。該等分離細胞係以流式細胞儀 分析。結果顯示於圖1A至1C及圖2A至2C。結果發現，該 兩種方法分別可獲得200xl06及230xl〇6BLSC/毫升血液。以 該純化後之BLSCs可於StemBios-001中進行培養。為了 產生SBR及SBT細胞，BLSCs可於StemBios-002培養基^培 養兩週。接著，該等BLSCs遂於一含有〇.1至20 μΜΚΑ、或 1至40 ηΜ TGF-β之StemBios-003培養基中培養超過二至六 週。可觀察到該等培養細胞其形態及尺寸逐漸地變化(圖6至 12圖）。該等細胞分別命名為SBR及SBT細胞。 該SBR及SBT細胞係以標準方法測試其發育及分化能 力。可發現該等細胞可分化為源自三種胚層之細胞，例如：外 胚層、中胚層，及内胚層。亦可觀察到該等所有或大部分細胞 皆為 CD10+、CD90+、CD105+、及 CXCR4+。 SBR、SBT 及 BLSCs 的 RT-PCR 結果 SBR細胞、SBT細胞及BLSCs之基因表現係可被檢測的。 係以一 Qiagen RNA 萃取套組（Qiagen，CA)、Paris kit (Ambion)、或 RNAzol kit (InvitroGen)，從 SBR 培養細胞或 SBT 培養細胞(每一種皆超過六百萬個)分離出總RNA。依操作手冊 29 201125982 (Qiagen)可使用 0.25 ng 寡-(dT)12-18 及反轉錄酶(Qiagen)將 2.0 pg RNA製備為cDNA。然而，從超過1億個BLSCs中係 無法取得可偵測之RNA。 RT-PCR 係以 940C (15 秒）、55°C (15 秒）、72〇C (20 秒)之 條件進行30個循環。β-肌動蛋白之引子對為：正向 5，-ACAAAACCTAACTTGCGCAG-3， ; 反向 5’-TCCTGTAACAACGCATCTCA-3’。GADPH 之引子對為： 正向 5，-AGCCACATCGCTCAGACACC-3，;反向 5’-GTACTCAGCGGCCAGCATCG-3’。該等結果顯示於圖 13。 可發現β-肌動蛋白及GADPH可表現於SBR細胞及SBT細 胞，而於BLSCs則無表現。 其他具體實施例 所有於本說明書所揭露之特徵係可以任何組合方式組 合。於本說明書中所揭露之每一特徵可藉由另一相同、等效、 或相似目的之可替換特徵來置換。因此，除非明確聲明，否則 每一揭露之特徵僅為各種等效或相似特徵的一般系列之示例'。 於前述說明中，該領域熟諳技藝者可輕易確認本發明之必 要技術特徵，在無脫離其精神及範圍下，可對本發明進行各種 不同改變及修改以使其適用於各種不同之用途及情況。因此， 其他之具體實施例亦在以下申請專利範圍之範略内。 【圖式簡單說明】 圖1A至1C顯示經溶血(hemolysis)以取得胚葉細胞_類似 性幹細胞群(BLSCs)之流式細胞分析直方圖(fl〇w cyt〇metry histograms)之結果。 ^圖2A至圖2C顯示自血漿區段(plasma fractions)中取得胚 葉細胞-類似性幹細胞群(BLSCs)流式細胞分析直方圖之結果。 第二A圖至第三C圖係為一照片，其顯示培養之胚葉細 胞-類似性幹細胞群(BLSCs)形成多層、網孔狀(meshnet)結構、’。 201125982 圖4係一照片，其顯 (BLSCs)形成凝聚物。 示培養之胚葉細胞-類似性幹細跑群 圖5係一照片，其顯示培養之胚葉細胞_類似性幹細 (BLSCs)形成球狀細胞凝聚物。 # 圖6至8為顯示從含有維生素a酸(retin〇ic acid)之胚葉細 胞-類似性幹細胞群(BLSCs)培養中製備出SBR細胞之照片。 圖9至12為顯示從含有轉形生長因子p(TGF-p)之胚葉細 胞··類似性幹細胞群(BLSCs)培養中製備出SBT細胞之照片。 圖13為RT-PCR結果之照片，係顯示GADPH或β-肌動 蛋白於SBR及SBT細胞之表現情形，以及不表現於BLSC中。 31

Claims (1)

1. 201125982 七、申請專利範圍： L 一種製造多能性或全能性細胞群體之方法，其包含： 取知'複數個胚葉細胞-類似性幹細胞(Blscs)， f含有維生素A酸(RA)或轉形生長因 養基中培養BLSCs，以及 ；培 ，定及富化經培養細胞巾之多紐或全能性細胞； 蛋白i 多能性或全能性細胞表現GADPH或卜肌動 ft專她圍第1項之方法’其中該等多能性或全能性 、，，田胞在尺寸上為1至15微米。 專利範圍第1項之方法，其中該培養基含有αι至 2〇 μΜ RA且培養該等BLSCs 2至8星期。 =專利範圍第3項之方法，其巾該培養基含有 且培養該等BLSCs2至8星期。 申 =專利蛇圍第4項之方法’其中該培養基含有5至12 μΜ RA且培養該等B£SCs 3至4星期。 5項之方法’其中該等多能性或全能性 如申咬直為至15微米且在懸浮液中形成片狀構造。 之方法，其中該培養基含有1至40 nM TGF-β且培養該等BLSCs 2至8星期。 第7項之方法，其中該培養基含有2錢 權TGF-β且培養該等BLSCs 2至8星期。 9’ tlfm圍，方法，其中該培養基含有5至 GF+且培養垓等BLSCs 4至6星期。 10·專利範圍第9項之方法，其中該等多能性或全能性 :肊尺寸上為1至15微米、具有81形形狀且形成凝聚 其包含複數個經培養之細胞，該等經培養之 且(Hi it或全能性，（2)在尺寸上為1至15微米， 且⑶表現GADPH或β-肌動蛋白之mRNA。 2. 3. 4. 5. 7. 8. 201125982 12·=申請專利範圍第u項之組合物，其中該組合物進一步包 含維生素A酸(ra)或轉形生長因子p(TGF-p)。 13.=申請專利範圍第Π項之組合物，其中該*細胞之第—群 馬 CD66e+。 1屯=申請專利範圍帛n項之組合物’其中該等細胞包括 核酸。 、 15’ 利範圍$14項之組合物，其中該重組核酸編碼多 肤且s亥專細胞含有編碼多肽之mRNA。 16·Ϊίί專利範圍第11項之組合物，其中該等細胞藉由如申 5月專利乾圍第1項之方法製備。 17· 範圍第16項之組合物，其中該等細胞之第二群 項辦物，射亀胞不會表現 19. 範圍第U項之組合物，其中該等細胞不會表現 編石1類主要組織相容性複合體(MHC)基因所 蛋白質，該蛋白質會激發T淋巴球所媒介之抗= 2〇' 21· 項之組合物，其中該等細胞為台料 A 之方法’該方法包含將有效量之 2項之方法’其中在該組合= 24· 25.如申請專利範圍第24項之方法， 病、神經退化性疾病、關節炎或癌症、^退化疾病為橋尿 201125982 範圍第25項之方法，其中該神經退化性疾病為 27· 患者自體免疫性疾病之方法，該方法包含將有效 J，如申請專利範圍第Η項之組合物投與』^ 28·:種鑑定用於治療退化性疾病之候選藥之方法，該方法包 以及使受試化合物與如申請專利範圍第11項之組合物接觸 測定在退化性疾病中被下調之多肽之表現量， 受物^之表現量若高於不存在該 候^ 表現量’則表示該化合物為治療該疾病之 29. ==== 28項之方法，其中該退化性疾病為糖尿 3〇·二病、關節炎、癌症或自體免疫性疾病。 種在心者中引進異源性核酸之方法，其包含. 取得如申請專利範圍帛η項之組合物，其中該組 中之細胞包括異源性核酸，以及 、' 將該細胞投與至需要該異源性核酸之患者。 31. ^申請專利範圍第3〇項之方法，其中該異^生核酸編碼多 辽專利範圍第31項之方法，其中該細胞在該患者 現遠多肽。 幻.一種細胞銀行，其包含複數種如申請專利範圍第u項之组 合物。 、、 34.如申請專利範_ 33項之細胞銀行，其中該等細胞為 細胞。 、 35·—種製造如申請專利範圍第33項之細胞銀行之方法，其包 含： . 〆、 從複數個患者收獲細胞以分別得到複數個胚葉細胞- 201125982 類似性幹細胞群； 鑑定該等細胞群，對於各細胞群得到至少一種預定的 特徵；以及 按照該至少一種預定的特徵將該等細胞群之各個分 類。 36.如申請專利範圍第35項之方法，其中該方法進一步包含擴 增細胞群。 4