TW200950795A - A chinese herb extract for treating dementia and preparation method thereof - Google Patents

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200950795 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於-種中藥萃取物及其製備方法。本發明亦 關於萃取物及活性部分用於治療或預防諸如阿兹海默氏症 ' (Alzheimer’s —ease)之癡呆症的用途。 ·： 【先前技術】 療呆症為由超出正f老化所預期之腦損^疾病所引起 的為知功能之進行性下降。最熟知類型之癡呆症為阿茲海 默氏症。 阿茲海默氏症（AD)為曰益普遍之神經退化形式’在65歲 以上之人中其佔癡呆症之總病例的約50%-60%。由於人口 中老齡人之相對增加，估計全世界約有24億人受其影 響。在接下來之20至30年内其盛行率可能會增加。人口為 種進行性病症，其在臨床症狀發作與死亡之間約有8.5 年之平均持續時間。在與較高智力功能有關之腦部中角錐 〇 形神經元之死亡及神經元突觸之缺失導致典型症狀，其特 : 徵為認知功能之總體及進行性障礙（參見Francis，P, 丁等 : 人，J' Neuro1. Neurosurg. Psychiatry (1999) 66: 137- )打絲海默氏症臨床徵死的特徵為進行性認知能力退 化以及每日生活之活動性下降及神經精神症狀或行為變 化。 在神經病理學上，AD之主要標誌為存在兩種特徵病 變·類澱粉老年斑及神經原纖維纏結（NFT)。斑塊係於神 經凡外沈積，而纏結係在死後之腦中神經元内觀察到。類 115989.doc 200950795 殺粉斑塊核心之一種主要組份為病理沈積之小類澱粉_P_肽 (Αβ) ’其係藉由分泌酵素自類澱粉前驅蛋白（App)裂解（參 見 Selkoe，D.J.，抑州0/· i?ev. (2001) 81: 741-766 ; Hardy, J.及 Selkoe，D.J.，Sc/ewce (2002) 297: 353-356)。Αβ，一種 39-43殘基（MW約4 kDa)之自凝集肽，係合成為

較大APP

❹ (110-12〇 kDa)之部分。APP為第I型整合膜醣蛋白，其具有 大的N-末端細胞外域、單跨膜區及短的細胞質尾區。Αβ區 位於ΑΡΡ之細胞外及跨膜區部分。Αρρ參與AD中之神經元 細胞死亡之最常見假說為類澱粉蛋白假說。此假說假定斑 塊類澱粉沈積或部分凝集之可溶性Ap引起一連串的神經毒 性，藉此導致與AD病理相似之神經退化（參見Selk〇e，D, J·, Physiol. Rev. (2001) 81： 741-766 ； Hardy, J.^Selkoe, D. J” iWwce (2002) 297: 353-356)。 目前可獲得之藥物可有助於減輕阿茲海默氏症之症狀， 但其不可改變其根本的病理過程。阿兹海默氏症通常無法 治癒。目前仍需要提供治療及/或預防年齡相關之癡呆 症、尤其阿茲海默氏症的方法。 何首烏（户0〇^仰_通常亦稱為首烏⑽⑽ wu、he sh〇u wu、f0_ti、f〇_ti_teng、CMnese 、 climbing knotweed、fl〇wery kn〇tweed、❿似行〇赠)及其 類似名稱。據稱，一位名為何首烏之中國男子為此草藥： 記㈣第-個食用纟，其活至132歲。何首烏塊根傳統上 在中樂中用作滋補及抗老化藥物，尤其用於脫髮及頭髮早 白。何首烏味苦、甘且诞，且當攝取時具有輕微溫熱效 H5989.doc 200950795 應。其可用作主藥或滋補藥物之主 要組份。何首烏之主要

A.D.) 〇

治療癡呆症之草本組合物，其包含何首烏及其他草藥。 CN 1 5 82975揭示一種用於治療腦血管疾病及老年癡呆症之 中藥，其係由包括何首烏、荷葉、地龍等五種中藥材經由 煎煮及在醇中萃取並乾燥製得。CN 1621〇78係關於一種中 〇 藥組合物，其係由紅參（red sage)、凍乾新鮮鹿茸 - (ginsenoside)、人參皂苦（fieece fi〇wer root)、何首烏、黃 : 精（sealwort)、山楂（haw)及大黃（rhubarb)製備以治療智力 哀退及癡呆症。CN 174296 8係關於一種治療友管性癡呆症 之藥物’其係由中藥材何首烏、黃笑（astragalus root)、丹 參（salvia root)、當歸（iigUstiCUm root)、石菖蒲（acorus root)、益智仁（alphinia fruit)、銀杏葉總黃酮（ginkgo leaf total flavone)、地龍（earthworm)、水虫至（leech)及天麻 (gastrodia root)製備。 115989.doc 200950795 何首烏之一種主要組份為如圖1A所示之2,3,5,4'-四羥基 一苯乙稀-2-〇-P-D-糖普（TSG)。TSG可使用微波萃取方法 (參見 Wang, J.等人，（2003) Z/zo/igcaoyao 34 (4): 314- 3 1 7)、逆流技術（參見 Zhang，T.等人，《/owma/ Chromatography & Related Technologies (2003) 26(9 & l〇)： 1565_1577)、及使用液相萃取及層析之方法（參見Yan，x,， Shanghai Diyi Yixueyuan Xuebao (1981) 8(2): 123-6及 CN ❹ 1215728)萃取及分離^ CN 1159015C揭示利用逆相層析法 以氣仿後再以乙醇分離自何首烏中萃取之二苯乙烯糖苦化 合物。經在動物實驗證明，二苯乙烯糖苷化合物能夠預防 由β-類澱粉蛋白及過氧化氫所引起之腦細胞損傷且增強患 有莨菪鹼致癡呆症及Αβ癡呆症之小鼠的記憶能力。Zhang， L.等人（Clin. Pharm. J_，2005, 40 (10): 749-752)發現何首烏 中之2,3,5,4 -四經基一苯乙烯- 2-0-p_D-糖芽（TSG)具有治療 大鼠膽驗素性知傷之作用且在劑量低至3〇 mg/kg時，TSG ❹ 可增強膽驗乙醯基轉移酶（ChAT)活性及改良M-膽驗素受體 ' 結合能力。CN 1 159015C亦教示3,4'，5_三羥基·2·二苯乙稀 : 基-β-D-糖苷可用作治療阿茲海默氏症、血管性癡呆症及 認知功能障礙之藥劑。 文獻中亦指出綠茶能夠預防中風發生（參見Kakucja，τ.， Foods & Food Ingredients Journal of Japan (2001) 191： 51. 55)。綠茶中之兒茶素被發現具有清除自由基作用，而可 間接預防癡呆症。JP 2005-082495揭示綠茶中所含有之兒 茶素及丁胺酸（GAB A)具有改善記憶及治療癡呆症及精神 115989.doc 200950795 病症之功效。 通常，草藥之複雜性不僅存在於成份差異上，亦存在於 草藥之間可能的相互作用上。因此，傳統草藥之作用完全 不同於具有單一目標及單一藥物關係之新型西藥的作用。 r #於難以鑑別單味中藥中之所有組份，故難以藉由科學^ - &確定能否藉由其中所含有之活性成份達到協同幻或補 充效應。為研究中藥之功效且由中藥製備治療齊），必須研 0 發一種有效方法以分離、鑑別及純化草藥中之活性成份。 傳統上，何首烏原料在使用之前必須加工以便自材料中 移除會導致腹蕩副作用之組份大黃素及大黃素甲轉。在傳 ，、先加：L·方法中，將乾燥何首烏丨Μ⑽麵魏出浸 泡於黑大且汁中，並以蒸汽加熱，隨後乾燥以獲得稱為 "制首烏（Radix P〇lygoni Muhifl〇ri)"之產物。然而，在加 工期間，治療性活性成份會降解。因此，仍需要研發有效 方法以加工何首烏。此外，為改良何首烏萃取物之功效， G 必須研發經濟且有效之方法以獲得包含最大量之TSG及兒 : 茶素及最低量之大黃素的產物。 : 【發明内容】 本發明之一個目的為提供一種製備何首烏萃取物之方 法。 本發明之另一目的為提供一種何首烏萃取物。 本發明之另一目的為提供一種組合物，其包含本發明之 何首烏萃取物。 本發明之又一目的為提供一種預防或治療個體之癡呆症 115989.doc • 10- 200950795 (諸如老化相關之癡呆症、阿茲海默氏症、血管性癡呆症 或輕型精神及智力病症）的方法，其包含向需要該治療之 個體投與本發明之組合物。 本發明之另—目的為提供—種本發明之何首烏萃取物的 用途，其係用於製備用以預防或治療痕呆症（諸如老化相 '目之癡呆症m默氏症、灰管性癡呆症或輕型精神及 智力病症）之藥物。 〇 在以下部分中詳細描述本發明。本發明之其他特徵、目 的及優勢可易於見於本發明之實施方式及中請專利範圍 中。 【實施方式】 除非本文另外界疋，否則本發明所用之科學及技術術語 應具有一般熟習此項技術者通常所理解之含義。該等術語 之含義及㈣應為清晰的；然而，在任何潛在歧義之情況 下，本文所提供之定義優於任何辭典或外在定義。 ❹ 除非另外指出’否則如本揭示内容所用之以下術語應理 • 解為具有以下含義。 >本文所用之術語"癡呆症”表示由超出自然老化所預期 之腦損傷或疾病所引起之認知功能的進行性下降，諸如老 化相關之療呆症、阿兹海默氏症、血管性癡呆症、輕型精 神及智力病症及其類似病症。 如本文所用之術語”預防”係指遲延羅患疾病個體之症狀 發作或減少疾病出現。 如本文所用之術語”治療”表示緩解或改善感病個體之症 115989.doc 200950795 狀。 如本文所用之術語"個體”矣_ 丨士 不動物、尤其哺乳動物。在 一杈佳實施例中，術語，，個體"表示"人類"。 /口本文所用之術語”治療有效量，，係、指單獨或與其他治療/ 藥物組合使用以治療癡呆仏 ’、 量。 顯不/0療功效之活性成份的 術語"載劑••或"醫藥學卜 樂学上可接受之載劑"係指-般孰習此 ❹ ❹ 項技術者所熟知之用以製備 又…^此 劑、接受劑或類似物。独合物之稀釋劑、賦形 術°。何百烏草藥”係指植物何首烏之乾燥根、f、莖及/ 或整體、較佳係指植物的根。 、術語，，醇溶液”係指無水醇或藉由使醇與水混合製備之溶 =°根據本發明，醇具有含⑴個碳原子，較佳含…個 =原子且更佳含13個碳原子之直鏈或支鏈烧基。舉例而 口’醇為曱醇，乙醇、異丙醇或其混合物。醇較佳為曱醇 或乙醇。 否則單數術語應包括複數且複數術 除非本文另外需要， δ吾應包括單數。 製備方法 本發明之用於製備何首烏萃取物之方法包含以下步驟： a) 以醇溶液萃取何首烏草藥以獲得粗萃取物； b) 以水稀釋步驟a)所獲得之粗萃取⑯以獲得經稀釋粗萃 取物； c) 將步驟b)之經稀釋粗萃取物裝入樹脂管柱中； 115989.doc 200950795 d) 自管柱中沖提何首烏萃取物，·及 e) 收集沖提份以獲得提純之何首烏萃取物。 根據本發明之方法，步驟a)中所用之醇 :1GG V/t 在—較佳實施例中，醇溶液為約腿 :V V。之甲醇錢、較佳約2〇至95 v/v%之 '最佳約20至50 ¥〜%之，醇溶液。在另一較佳眘广” 醇溶液為㈣至95 v/v%之乙_、較佳約 〇 之乙醇溶液、最佳約20v/v%之乙醇溶液。 萃：=!明：方法，步驟a)之粗萃取物可藉由任何習知 授動戈其二 由煎煮、浸潰、超音波處理、攪拌、 24= Γ。卒取時間為約1至約24小時、較佳約12至 24小時、最佳約17小時以上。萃取溫度為約 佳約10至30°c、最佳在室、*^下贫& 較 卒取PH值為約2.5至9.卜 較佳約2.5至5·3、最佳約5·3。在—較佳實施例中，何首烏 草樂係藉由冷萃取法（在室溫下 …、 ❹小時）來萃取。 曰波處理1小時並授拌16 : 根據本發明之方法，在步_中，以水稀釋粗萃取物以 : 錢經稀釋萃取物中醇之濃度為約β10 v/v%、較佳約2 在一較佳實施例中，經稀釋粗萃取物之醇濃度 為約2 v / V %。在另一較佳音始点丨rb _ 濃度為約5WI 實㈣中，經稀釋粗萃取物之醇 根據本發明之方法，步驟e)中所用之樹脂係選自（但不限 於）大孔㈣旨及㈣樹脂。大孔㈣較佳係選自職⑽系 列、Amberme列及D〇Wex吸附劑，更佳趣簡系列。、 115989.doc 200950795 凝藤樹腊較佳係選自Sephadex系列、T〇y〇pead及

SePhaCryI，更佳Sephadex系列。在一較佳實施例中，樹脂 為DIAION HP-20。在另-較佳實施例十，樹脂為㈣㈣以 LH-20。 根據本發明之方法，在將經稀釋粗萃取物加至步驟c)之 管柱前，將樹脂以具有與步驟b)所獲得之經稀釋粗萃取物 相同之醇濃度的沖洗液沖洗。

❹ 根據本發明之方法，在沖提步驟d)之前，將管柱以具有 與步驟b)所獲得之經稀釋粗萃取物相同之醇濃度的沖洗液 沖洗。 根據本發明之方法，在步驟句中，為獲得何首烏萃取 物’將官柱以約10至1〇〇 v/v%、較佳約3〇至鳩且更佳約 35至50%之醇溶液沖提，並隨後以約7〇至1〇〇 之丙酮 溶液沖提。醇溶液可為具有遞增醇濃度之—系列醇溶液。 在-較佳實施例中’將管柱用5〇 v/v%之曱醇溶液，隨後 1 〇 〇 %之甲醇及最終Π) 0 %之丙酮沖提。在另—較佳實施例 中，將管柱以50 v/v%之乙醇溶液，隨後95 v/v%之乙醇溶 液及最終1〇〇%丙酮沖提。在又一較佳實施例中，將管2 用35 v/v%之乙醇溶液，隨後5〇 v/v%之乙醇溶液，隨二乃 v/v%之乙醇溶液，隨後95 v/v%之乙醇溶液及最終^ v/v% 之丙酮沖提。 ° 本發明提供一種製備何首 q 《 ,’’ν τ π切〜负用万法。藉由本 發明之方法獲得之何首烏萃取物與傳統加工之何首良萃取 物相比含有較多的2,3,5,4，.四經基二苯乙烯_2_〇仰、_糖苦 H5989.doc •14- 200950795 (TSG)及兒茶素，及較少的大黃素（emd)及大黃素_8〇+ D-糖皆（EMDG)。藉由本發明之方法製備的何首烏萃取物 較佳者主要含有則及兒茶素。藉由本發明之方法製備的 何首烏萃取物更佳者含有大於約65 w/«tsg、大於約5 w/w/0之兒茶素，小於約〇 5 之應d及小於約〇 2 W/W。/。之EMDGe藉由本發明之方法製備的何首烏萃取物最

❹ 佳者含有約65至85 w/w%tTSG及約5至1〇 w/w%之兒茶 素。 根據本發明之方法，何首烏萃取物中四羥基二苯乙烯之 回收率與何首烏粗萃取物中相比大於約8〇%、較佳大於約 9〇\更佳大於約95%且最佳大於約97%。何首烏萃取物 中兒茶素之回收率與何首烏粗萃取物中相比大於約观， 較佳大於約75%且更佳大於約8〇0/〇。 根據本發明之方法，步驟e)中所獲得之經沖提萃取物可 藉由任何習知溶液濃縮法濃縮，諸如使用減壓旋轉式汽化 器來濃縮。 組合物 本發明提供-種組合物，其包含治療有效劑量之本發明 之何首烏萃取物。 二發明之組合物可藉由任何合適投藥途徑(諸如經口投 :、）投與個體。合適的調配物包括（但不限於）錠劑、口含 ，八硬膠囊或軟勝囊、水性懸浮液或油性懸浮液、乳液、 σ刀散性放劑或顆粒、糖漿或酏劑。必、^ ^ 哎盥唑l f J將其滅囟 一 /、渚如穩疋劑、濕潤劑及其類似物之醫藥學上可接受之 1Ϊ 5989.doc 15 200950795 載劑混合。 本發明之組合物可藉由習知程序使用此項技術中熟知之 省知醫藥賦开> 劑來製得。因此’欲經口使用之組合物可含 有例如一或多種著色劑、甜味劑、調味劑及/或防腐劑。

在AD治療中，本發明之組合物可與其他現有抗癡呆症 藥劑，諸如膽鹼酯酶抑制劑（例如利憶靈（Reminyl)、憶思 能（Exelon)、愛憶欣（Aricept)及康格憶（c〇gnex)及美金剛胺 (memantine))組合使用。 本發明之組合物可用於預防或治療癡呆症，諸如老化相 關之癡呆症阿茲海默氏症、血管性癡呆症、輕型精神及 智力病症及其類似病症。 熟習此項技術者應不難選擇治療之合適途徑及劑量。根 據本發明，較佳途徑為經口投與。劑量將視病症之性質及 病狀、患者之年齡及健康狀況、㈣途徑及任何先前治療 而定。熟習此項技術者應已知劑量可視個體年齡、大小、 健康狀況及其他相關因素而變化。 在-較佳實施例中’本發明之何首烏萃取物之最佳劑量 為每公斤體重約1至約25毫克。 提供以下實例以輔助熟習此項技術者實踐本發明，" 應將該等實例理解為過度限制本發明，因為在 明之發現的精神或範疇之情況下，_ 血丄 飯熟習此項技術者可 對本文所述實施例進行修改及變化。 實例 115989.doc -16- 200950795 何首烏萃取物之製備 ，燥何首烏植物磨碎後，與高極性溶劑(例如水、甲 醇、乙醇、異丙醇或其混合物）混合並浸泡24小時。用筛 網或慮紙_混合物以移除植物組織殘餘物，以獲得澄清 黃棕色溶液（何首烏粗萃取物）。 Ο Ο 將大孔樹脂或凝膠樹月旨填入分離管柱中。管柱可由玻 璃、不鏽鋼或高分子聚合物(如ρρ)製成。若使用大孔樹 月:’則藉由乾式填充法將樹脂填入管柱中。若使用凝膠樹 :曰，則將樹脂浸泡於水中，再將膨脹之樹脂填入管柱中。 樹脂之重量為原始乾燥植物重量之1〇倍以上。將填充後之 管柱以麵之甲醇或95 ν/ν%之乙醇溶液沖洗以移除雜 質，再以2至5 ν/ν%之醇水溶液平衡。 將適量之何首烏粗萃取物以水稀釋至溶劑之濃度為約2 至5 V/V%。將經稀釋之溶液注人分離管柱中。在將所有經 稀釋之溶液裝人管柱中《，將管柱以5倍管柱體積之⑴ WV%之醇溶液沖洗，並隨後以不同比率之溶劑水混合物依 次沖提管柱。將沖提份分別以減壓旋轉式汽化器濃縮並來 乾以獲得萃取物粉末。 何首烏萃取物之複合分析法 儀器及設備：HPLC系統（Shimadzu HPLC系統，包括 8(：1^1〇八丫15系統控制器、1^(：：_1〇八1^1)泵、1?(：¥_1〇八1^1)四通 閥、SIL-l〇ADvP自動取樣器、SPD_Ml〇Avp二極體陣列偵 測器、AUtech 2000 ELSD Evaporetive光散射偵測器及 ERC-3415a 脫氣器） 115989.doc 17 200950795 分析管枝：CosmosilC18-5MS(4,6x250mm) 條件： 流動迷率：1 .〇 ml/min 分析時間：60 min 樣品量：10 μΐ PDA條件：取樣週期：〇 64 sec ;波長範圍：190-370 nm ;通道：254 nm ELSD條件：溫度1〇〇。〇；氮氣流動速率：3.0 ml/min 對照樣品：TSG、兒茶素、EMDG及大黃素

G 測試何首烏萃取物活性之方法 移動相：B = 100% 乙腈；C=甲醇；D=l〇 mM NH4OAc， pH 3.05 時間(min) B(CAN) C(MeOH) D( 10 mM NH4O Ac, pH 3.05) 0 1 0 10 90 5 0 10 90 35 100 0 〇 50 100 0 〇 53 0 10 90 60 η 1 Λ 利用 Nabeshima，Τ·及 Nitta, ，A.之動物模型（Tohoku J. Exp·

物中之純化物質的生物活性。 實例1萃取溫度及溶劑之影宰 115989.doc •18· 200950795 將5 g何首烏（PM)粉末添加至約50 ml水中且在100°C水浴 中萃取1小時。將混合物在室溫下以8,000 rpm之速度離心 1 5分鐘，隨後以1號濾紙抽氣過濾。收集到34 ml濾液 (PMWH)。 將2.5 g何首烏劑粉末分別以4種不同溶劑，亦即二次蒸 ' 餾水、20 v/v%之乙醇溶液、50 v/v%之乙醇溶液及95 v/v% 之乙醇溶液冷萃取（在室溫下超音波處理1小時再以45 rpm 之速度旋轉震盪1 6小時）。隨後，將混合物在室溫下以 3，000 rpm之速度離心1 5分鐘，再以1號濾紙抽氣過濾以收 集第一次萃取物（PMWL-1、PM20EL-1、PM50EL-1 及 PM95EL-1)。將剩餘藥渣藉由上所述之冷萃取步驟再萃取 並收集第二次萃取物（PMWL-2、PM20EL-2、PM50EL-2及 PM95EL-2) 〇分析每一萃取物之萃取產率並以HPLC分析萃 取物中之大黃素（EMD)、大黃素-8-0-P-D-糖苷（EMDG)及 2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-糖苷（TSG)之量。各萃取 φ 方法及批次之萃取產率概述於表1中。 : 表1利用不同萃取法及多次萃取之萃取率 樣品 第一次萃取物 第二次萃取物 萃取方法 萃取物之量 (mg/ml) 萃取率 (%) 萃取物之量 (mg/ml) 萃取率 (%) PMWH(熱水萃取） 34 23.1 - - PMWL(室溫水萃取） 24.9 19.1 3.7 3.4 PM2〇EL(室溫2〇%之乙醇萃取） 30.3 23.1 5.5 5.1 PM5〇EL(室溫5〇°/〇之乙醇萃取） 33.4 26.2 5.1 4.5 PMEL(室溫95%之乙醇萃取） 20.7 19.7 2.5 2.8 如表1所示，熱水萃取之萃取率與室溫水萃取之萃取率 相比高約20%。若以乙醇溶液作為萃取溶劑，則利用50% 115989.doc -19· 200950795 之乙醇溶液的方法具有最高之萃取率。總之，第一次萃取 之萃取率為約19至26%，而第二次萃取之萃取率僅為3至 5%。EMD、EMDG及TSG之量的分析結果概述於表2中。 表2不同萃取物中EMD、EMDG及TSG之量 成份之量(mg) PMWH PMWL PM20EL PM50EL PM95EL EMD 0.00 0.13 0.00 1.88 3.88 EMDG 1.34 0.00 0.00 0.00 8.72 TSG 20.40 28.78 32.61 56.28 40.08 以室温水萃取之萃取物中TSG之量與以熱水萃取之萃取 〇 物中TSG之量相比高約40%。以室溫水萃取之萃取物含有 EMD，而以熱水萃取之萃取物含有EMDG。當以乙醇溶液 萃取時，以50%之乙醇溶液萃取之萃取物含有最大量之 TSG。然而，EMD及EMDG之量隨乙醇濃度增加而增加。 雖然以20%之乙醇溶液萃取之萃取物中TSG之含量不是最 高，但其不含有EMD或EMDG。因此，以TSG萃取率及萃 取物之品質來評估，在室溫下利用20%之乙醇溶液的萃取 法具有最大效益。 ® 實例2萃取溶劑比率及pH值的影響 製備三種不同溶劑（10 v/v0/。、20 Wv%及30 v/v%之乙醇 溶液）。將2 g何首烏粉末添加至20 ml之各溶劑中，且每一 溶劑各製備三管混合物。將各溶劑之三管混和物各以 NaOH及HCl調整pH值至分別為2.5、5.3及9.1。隨後，將各 管超音波處理1小時且以45 rpm之速度旋轉混和16小時。 將每一樣品以3,000 rpm之速度離心15分鐘並收集上清液。 上清液之成份分析概述於表3中。 115989.doc -20- 200950795 表3利用不同溶劑及pH值萃取之何首烏（PM)萃取物中 EMD、EMDG 及 TSG 之量 pH值 2.5 5.3 9.1 溶劑（乙醇 濃度） 10% 20% 30% 10% 20% 30% 10% 20% 30% 成份之量< :mg/gPM 粉末） EMD 0.14 0.18 0.36 0.19 0.26 0.38 1.22 1.61 2.03 EMDG 0.98 1.05 1.20 0.00 0.00 0.00 0.60 1.04 1.60 TSG 22.12 22.01 25.20 25.75 25.35 27.24 0.00 0.00 2.43 如表3所示，在三種pH值下EMD之量隨乙醇濃度之升高 而增加（10%<20%<30%)。以30%之乙醇溶液萃取之EMD的 量約為以20%之乙醇溶液萃取之EMD的量之兩倍。在pH值 9.1的條件下，以三種溶劑萃取何首烏幾乎不會萃取出 TSG。在pH值為5.3及2.5下，當乙醇濃度升高時所萃取之 丁80的量類似且略有增加（10%$20%<3 0%)。在!^值5.3的 條件下，三種溶劑皆不能萃取出EMDG ;然而在PH值2.5及 9.1的條件下’可萃取出一些EMDG，且其量隨乙醇濃度之 升高而增加（10%<20%<3 0%)。 ❹ 實例2之結果顯示萃取何首烏之最佳條件為在PH值5.3下 : 利用10至20°/。之乙醇溶液萃取。在此條件下，可有效萃取 : TSG，且萃取出最少量之EMD及EMDG。當萃取PH值降低 至2·5時，TSG之量減少約10%，EMD之量減少約30%，而 EMDG之量增加。 實例3利用大孔樹脂萃取何首烏之活性成份 將100 g何首烏粉末以1公升曱醇冷萃取（在室溫下超音波 處理1小時再攪拌16小時）。將所萃取之溶液以1號濾紙抽 氣過濾並收集900 ml濾液（PM901)。 115989.doc •21 - 200950795 將 100 g DIAION HP-20樹脂（Mitsubishi Chemicals)填入 層析管柱（ID=40 mm ; L=200 mm)中，並將管柱以1公升曱 醇再循環1小時。隨後將管柱以2公升5 v/v°/〇之甲醇溶液沖 洗。將400 ml PM901以純水稀釋至最終體積為8公升，使 甲醇之最終濃度為5%。將經稀釋溶液以15 ml/min之流動 速率加入DIAION管柱中並收集未吸附液。將管柱以1公升 5 v/v°/〇之曱醇溶液沖洗並使沖洗液與未吸附液合併，隨後 以減壓旋轉式汽化器將合併之液體濃縮至50 ml (PM902)。 隨後將管柱以1 ·5公升50 v/v%之曱醇溶液沖提。收集經 沖提液體並將其以減壓旋轉式汽化器濃縮至200 ml(PM903)。將管柱以1.5公升100%之甲醇進一步沖提。收 集經沖提液體並將其以減壓旋轉式汽化器濃縮至200 ml(PM904)。最終，將管柱以1公升100%之丙酮沖提。收 集經沖提液體並將其以減壓旋轉式汽化器濃縮至50 ml(PM905)。樣品（管柱分離前或管柱分離後所收集者）中 TSG及兒茶素之量及回收率顯示於表4中。 表4 PM901裘PM905中TSG及兒茶素之量及回收率 樣品 兒茶素之 總量(mg) 兒茶素£ 回收率(％) 樣品中兒茶 素之百分比 (%) TSG之 總量(g) TSG之回 收率(％) 樣品中TSG 之百分比 (%) ΡΜ901 10.8 100 0.13 1.7 100 21.2 ΡΜ902 1.6 14.8 0 0 0 0 ΡΜ903 8.6 79.6 0.31 1.5 88.2 54.3 ΡΜ904 0 0 0 0.1 5.8 14.6 ΡΜ905 0 0 0 0 0 0 如表4所示，曱醇萃取之樣品（PM901)中TSG及兒茶素之 百分比分別為21·2°/。及0.13%。可將所萃取之樣品PM901藉 115989.doc -22- 200950795 由管柱分離以50。/。之甲醇溶液進一步提純以得到28 g PM903。PM903中TSG之百分比為54·3%，其為最初百分比 之2.6倍且ΡΜ903中兒茶素之百分比為〇·3 1%，其為最初百 为比之3倍。TSG及兒茶素之回收率分別為88 2%及 r 79.6%。 ' 實例4利用大孔樹脂萃取何首烏活性成份 將180.10 g何首烏粉末以1.8公升2〇 ν/ν%之乙醇溶液冷 φ 萃取（在室溫下超音波處理1小時再攪拌丨6小時）。將萃取之 溶液在25°c下以8,000 rpm之速度離心15分鐘，並隨後以1 號濾紙抽氣過濾。收集1,840 ml濾液（PM20EL)並量測固體 物質之量。 將300.08 g DIAION HP-20樹脂填入層析管柱（ID=8〇 mm，L=295 mm)中，並以2.0公升95 Wv0/〇之乙醇溶液將管 柱再循環1，5小時。隨後將管柱用4.3 8公升2 v/v%之乙醇溶 液沖洗。將1,533 ml PM20EL以純水稀釋至i5,330 m卜使 〇 乙醇之最終濃度為2%。將經稀釋溶液以15 之流動 ' 速率加入DIAI〇N管柱中並收集未吸附液。將管柱以3 84公 : 升2 v/v%之甲醇溶液沖洗且使沖洗液與未吸附液合併，合 併之液體總體積為16,840 ml(PM801)。 隨後將管柱以6.5公升50 v/v%之乙醇溶液沖提。收集最 初200 ml黃橙色之沖提液體並將所收集之液體與剩餘萃取 液體合併為PM802。樣品（管柱分離前或管柱分離後所收集 者）中TSG及兒茶素之里及回收_率顯示於表5中。 表S PM20EL、PM801及PM802中TSG及兒茶素之量及回 115989.doc •23- 200950795 收率 樣品 兒茶素t 總量(mg) 兒茶素之回 收率(％) 樣品中兒茶素 之百分比(％) TSG之總 量(g) TSG之回收 率(％) 樣品中TSG 之百分比(％) PM20EL 41.4 100.0 0.11 5.2 100.0 14.3 PM801 0.6 1.5 0.02 0.0 0.0 〇.〇 PM802 28.9 69.9 0.32 4.8 91.2 52.3 如表5所示，50%乙醇溶液萃取樣品（PM20EL)中TSG及 ' 兒茶素之百分比分別為14.3。/。及0.11%。將所萃取之樣品 PM20EL以50%之曱醇沖提溶液使用管柱分離進一步提純 ❹ 以得到9.1 g PM802。PM802中TSG之百分比為52.3%，其 為最初百分比之3.6倍，且PM802中兒茶素之百分比為 0.3 2%，其為最初百分比之3倍。TSG及兒茶素之回收率分 別為9 1.2°/。及69.9%。根據實例4之結果，本發明之製備方 法可有效分離TSG及兒茶素，並控制損失率低至 8,8%(TSG)及30.1%(兒茶素）。 實例5利用凝膠樹脂萃取何首烏活性成份 將30 g Sephadex LH-20樹脂（Pharmacia)填入層析管柱 ❹ 中，並以500 ml 95 v/v%之乙醇溶液以20 ml/min之流動速 ： 率再循環2小時。隨後將管柱以500 ml 2 v/v%之乙醇溶液 : 沖洗。將由實例4獲得之132 ml PM20EL-1以M.Q.水稀釋至 最終體積為1000 ml。將經稀釋溶液裝入LH-20管柱中，並 收集未吸附淺棕色混濁液體。隨後將管柱用500 ml 2 v/v〇/。 之乙醇溶液再沖洗。使最初15 0 ml沖洗液與未吸附液合 併，並以減壓旋轉式汽化器將合併之液體濃縮至25 ml(PM211)。收集剩餘345 ml淺黃色澄清沖洗液，並以減 壓旋轉式汽化器將其濃縮至10 ml(PM212)。將PM211及 115989.doc 24- 200950795 PM212合併為 PMLH201。 先將管柱以25〇 ml 35 v/v%之乙醇溶液沖提，收集244 ml沖提液體（最初80 ml為淺黃色，而剩餘164 ml為淺黃標 色），並以減壓旋轉式汽化器將其濃縮至25 ml ^ (PMLH202C)。 _ 隨後將管柱以250 ml 50 v/v%之乙醇溶液沖提，收集244 ml沖提液體（最初60 ml為淺黃棕色，而剩餘184 ml為黃棕 @ 色），並以減壓旋轉式汽化器將其濃縮至25 ml (PMLH203C)。 再將管柱以250 ml 75 v/v%之乙醇溶液沖提，收集242 ml沖提液體（最初70 ml為淺黃棕色，其次56 ml為黃棕色， 而剩餘116 ml為淺橘黃色）’並以減壓旋轉式汽化器將其濃 縮至 25 ml(PMLH204c)。 接著將管柱以250 ml 95 v/v%之乙醇溶液沖提，收集246 ml沖提液體（最初70 ml為淺橘黃色，而剩餘176 ml為無 〇 色）’並以減壓旋轉式汽化器將其濃縮至25 ml : (PMLH205C)。 ' 最後將管柱以250 ml 70 v/v°/〇之丙酮溶液沖提，收集246 ml沖提液體，並以減壓旋轉式汽化器將其濃縮至25 ml(PMLH206c)。分析每一濃縮樣品（沖提份）中固體物質之 量及活性成份之比率，結果顯示於表6中。 表6每一沖提份中TSG、EMD、EMD(J及兒茶素之量及回 收率 115989.doc 25· 200950795 沖提份 溶劑 固體物TSG之TSG TSG EMD EMD與 質之量 量 之回與固之量固體物 (mg/ml)(mg/ml)收率體物(Mg/ml)質之比 (%)質之 率(％) 比率 (%) EMDG 之量 (μ_) EMDG 與固體 物質之 比率(％) 兒茶素兒茶素 之量與固體 (mg/ml)物質之 比率(％) PM20EL-I 20% EtOH 26.4 2.8 100 10.6 8.0 0.03 0 0.00 0 0.00 PMLH201 20% a〇H(未 結合） 84.0 0.6 4.7 0.7 <3.5 <0.004 <5 <0.01 0.7 0,83 PMLH202C 35% EtOH 8,5 6.9 53.6 81.2 <3.5 <0.041 7 0.08 0.7 8.24 PMLH203C 50% EtOH 7.1 5.6 43.5 78.9 21,9 0.31 <5 <0.07 <0.5 <7.04 PMLH204C 75% EtOH 3.2 0 0 0 4.0 0.13 0 0.00 0 0.00 PMLH205C 95% EtOH 1.2 0 0 0 0 0.00 0 0.00 0 0.00 PMLH206C 70%丙酮 10.8 0 0 0 0 0.00 0 0.00 0 0.00 ❹ 如表6所示，多數TSG可藉由35至50%之乙醇溶液沖提， 且總回收率為97%以上。兒茶素及EMDG可於同一沖提份 中沖提，但大多數EMD係藉由50%之乙醇溶液沖提。實例 5之結果表示當以LH-樹脂作為分離材料時，最佳沖提溶液 為35至40 v/v%之乙醇溶液。 實例6 藉由使用Αβ注射劑誘發之阿茲海默氏大鼠模型 PM903的認知行為評估 在大鼠中誘發神經退化 © Αβ 1-40注入大鼠模型為一種快速篩檢用於治療阿茲海 默氏症藥物的動物模型。藉由將Αβ 1-40緩慢注入大鼠之 第三側腦室中而誘發大鼠模型之神經退化，以藉由腦脊髓 液（CSF)系統損傷海馬區而造成認知行為障礙。 為製備阿茲海默氏症大鼠，將Αβ 1-40溶液注入Alzet滲 透泵（Alzet 1002 ; DURECT Co.，USA)中且將腦灌注套組 之PE管與泵連接。將大鼠以戊巴比妥納（sodium pentobarbital)(45 mg/kg)麻醉，並置放於立體定位儀 -26- 115989.doc 200950795 (8丁〇丑1^川〇，1；8八；1^(^1 51650)上以定位側腦室。將腦 灌注套組插入大鼠之第三側腦室中，並將Alzet滲透泵植入 大鼠頸後之皮下區域。將手術區域縫合且將大鼠置放於籠 中。在對照組（Sham)中，將Alzet滲透泵中之Αβ 1—40溶液 以35%乙腈/0.1%二氟乙酸替代。植入之後8至9天’對大鼠 ' 進行被動迴避測試。植入之後1〇至15天，使用Morris水迷 宮（water maze)評估大鼠之認知行為。自植入之日起實 〇 驗組大鼠分別投予安慰劑、不同劑量之ΡΜ9〇3(ι至25 mg/kg)及 100 mg/kg之 PMWH。 被動迴避測試之構造 被動迴避測試係根據避暗實驗法（step_thr〇ugh meth〇d) 進行（參見 Jarvik Μ. Ε·及 Kopp R.尸矸c/m/ (1967) 8 月；21(1):221-224)。將由明箱組成之裝置藉由含有閘門 之分隔牆與暗箱連接。在訓練期中，以下列方法進行獲得 試驗（acquisition trial):使大鼠在明箱中適應2 min，隨後 ❹ 打開閘門。3秒之後，當大鼠穿過至暗箱中時，傳輸不可 ' 避免之電擊（0·8 mA，3秒）。重複此試驗直至確定獲得。當 — 大鼠最終留在明箱中3〇〇秒以上以避免進入暗箱時可認定 為確定獲得。將大鼠移走並放回至籠中。藉由an〇va* 析資料。

Morris水迷宮之建構 在神經科學中，Morris水迷宮之設計為測試空間記憶之 行為程序.其係由神經科學家Richard G M〇rrissi984研 發（參見 Morris R. J Neurosci Methods (1984) 11 (i)· 47 I15989.doc -27- 200950795 60)，現今通常用於探測海馬區在形成該空間記憶方面之 作用。 將圓筒狀水槽(直徑為160 cm，深為6〇加水至％⑽ 深，並使水溫維持在23±lte將水池分為四個象限（西 北、西南、東北及東南）。將圓形不錄鋼救生平台固定於" 西南"象限中並隱藏於水面以下！⑽。將視覺線索（例如彩 色形狀）置放於動物視線中的水槽周圍。將與個人電腦連 ❹ Ο 接之CCD相機置放於水池上方以操取並記錄所受試大鼠進 行軌跡之影像。 動物行為之測試 母一組中使用4至5隻大鼠。將大鼠訓練3天，每天}個訓 練週期，每個時期4個循環。在各循環中給予每一大鼠in 秒以發現”西南"象限中之救生平台。若大鼠不能發現救生 平台’則將大鼠引導至平台。在下-循環前讓大氣休息15 秒。藉由電腦追縱系統記錄包括游泳路徑及到達平台所用 時間(潛伏時間)之整個測試過程。第4天，將救生平台移 走，並計算大鼠在1.5分鐘内到達"西南,,象限及到達其他象 限所用時間。以最初四次行為測試所獲得之潛伏時間及游 泳距離的資料來表示大鼠之學習及記憶能力。藉由 ANOVA分析f料。第4天之行為測試表示大鼠之參考空間 記憶。 被動迴避測試之結果顯示於圖2中。學習及記憶能力之 結果顯示於圖3中’而水迷宮測試之參考記憶結果顯示於 圖4中。由圖2至4可見，對照組（Sham)中之大鼠未顯示認 I15989.doc •28· 200950795 知行為障礙，然而用安慰劑（圖中所示之Αβ 1 _4〇組）處理之 Αβ 1 -40誘發癡呆症大鼠則顯現嚴重認知行為障礙。結果 發現ΡΜ903(每公斤體重1、5及25毫克）可有效改善Αβ 1-40 誘發癡呆症大鼠之被動迴避及空間記憶。ΡΜ903之有效劑 ‘ 量為每公斤體重1至25毫克。與陽性對照物（圖中所示之 • PMWH&)相比，ΡΜ903之有效劑量需要量減少20倍以上。 【圖式簡單說明】 0 囷1顯示（A) : 2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯-2-〇-p-D-糖苷 (TSG) ; :兒茶素；（c):大黃素（EMD);及⑺）：大黃 素-8-〇-^D_糖苷（EMDG)之化學結構。 囷2顯示被動迴避測試之結果。 圓3顯示水迷宮測試之空間操縱能力的結果。 囷4顯示水迷宮測試之工作記憶的結果。 〇 115989.doc -29-

Claims (1)

1. 200950795 十、申請專利範圍： 卿萃取物之方 l 一種製備何首烏（Po/ygo⑽m 法’其包含以下步驟： a) 以約10至1〇〇 v/v%之醇溶液萃取何首 何首烏粗萃取物； 烏草藥以獲得 W稀釋㈣_得之粗萃取物以獲得具有約⑷ v/v%之最終醇濃度的經稀釋粗萃取物；

   c) 將該步驟b)之經稀釋粗萃取物裝入樹脂管柱中； d) 以約W至1〇〇 v/v。/。之醇溶液自該管柱沖提何首烏萃 取物，並隨後以約70至1〇〇 v/v%之丙酮溶液來沖提 何首烏萃取物；及 e) 收集該經沖提之沖提份以獲得提純之何首烏萃取 物。 用求項1之方法，其中該何首烏草藥為乾燥或經加工 之何首烏草藥。 如π求項1之方法，其中該醇溶液為乙醇、曱醇或異丙 醇溶液。 4.如吻求項1之方法，其中該樹脂為大孔樹脂或凝膠樹 脂0 5·如研求項4之方法’其中該大孔樹脂為diai〇n ΗΡ-20樹 脂。 6·如清求項4之方法，其中該凝膠樹脂為Sephadex LH_20樹 脂° 7.如清求項1之方法，其中該步驟a)之萃取係在室溫下進 115989.doc 200950795 行。 8.如Μ求項8之方法，其中該步驟 值下進行。 a)之萃取係在 約5.3之pH 9·如請求項1之方法 V/V%之乙醇溶液。 10.如請求項1之方法 v/v%之甲醇溶液。 其中該步驟a)之醇 J 畔，合液為約10至30 其中該步驟a)之醢、、六、产从 X醇/合液為約2〇至95

   11 ·如請求項1之方法 v/v%之濃度。 其中該步驟d)之醇溶液具有 約30至70 12·如=求項i之方法，其中該步驟d)之醇溶液具有約w v/v%之濃度。 13_如明求項!之方法，其中該步驟幻之醇溶液為5〇 να%之 甲醇溶液。 14. 如請求項丨之方法，其中該步驟d)之醇溶液為約μ 之乙醇溶液。 15. 如請求項1之方法，其中該步驟d)之醇溶液為約50 v/v% 之乙醇溶液。 16·如請求項！之方法，其中該步驟e)中所獲得之何首烏萃取 物包含約65至85 w/w%之2,3,5,4，-四羥基二笨乙烯_2_〇_(3_ D-糖苷（TSG)及約5至10 w/w%之兒茶素。 1 7. —種藉由如請求項1之方法製備之何首烏萃取物。 18. 如請求項17之何首烏萃取物，其包含約65至85 w/w%之 TSG及約5至10 w/w%之兒茶素。 19. 如請求項17之何首烏萃取物，其包含小於約0.5你~%之 115989.doc 200950795 大黃素及小於約0.2 w/w%之大黃素-8-〇_p_D_糖芽 20· —種組合物，其包含治療有效劑量之如請 $ 1 7之何f 烏萃取物及視情況醫藥學上可接受之載劑、 形劑。 m稀釋劑或賦 21.如請求項20之組合物，其另外包含一或多種其他抗癡呆 症藥劑^ ^ ❹ 22. —種如請求項20之組合物之用途，其係用於製備用以預 防或治療癡呆症之醫藥品。 23·如請求項22之用途，其中該癡呆症係選自由老化相關之 癡呆症、阿茲海默氏症（Alzheimer,s disease)、血管性癡 呆症及輕型精神及智力病症組成之群。 24.如請求項22之用途，其中該醫藥品係用於投予每公斤體 重約1至25毫克之何首烏萃取物。

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