200815464 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種新抑癌素變種蛋白F78A及?781^,可增加 藥物釋放能力。 【先前技術】 新抑癌素(Neocarzinostatin)是近期發現的強力抗腫瘤抗生 B 素複合體。它包含一個具有攜帶作用的蛋白 (Aponeocarzinostatin ),及一個烯雙炔所組成的小分子生色團 (Chromophore),它對腫瘤細胞的強烈殺傷力,來自於與蛋白結 合的生色團。硫醇類能引發烯雙炔的環化作用,產生自由基,抓 取去氧核醣核酸(DNA)的氫,造成基因的破壞,因而殺死腫瘤 細胞,蛋白部份擔任的重要功能之一,是攜帶保護生色團,並通 過適當的調控機制,來操縱管制生色團的釋放。新抑癌素的蛋白 有113個胺基酸殘基,包含有兩個區域,具有全部摺版型的二級 • 結構。 根據本發明先前的硏究,已知新抑癌素蛋白的苯丙胺酸支鏈 Phe78可能爲生色團釋放的影響因素之一。如第1圖所示,新抑癌素 生色團蛋白的支鏈Phe78有如環1 ( LOOP 1,黃色)及環2 ( LOOP 2, 黃色)之間的橋樑,可管制生色團(紅色)的釋放。當支鏈Phe78 受到刺激而打開時,生色團便可輕易釋出。圖中主幹爲灰及藍色, 支鏈則爲深藍色。 因此,本發明藉由蛋白工程的方法,針對支鏈Phe78進行定點 200815464 變種,以適當的胺基酸置換Phe78,以獲得可增進生色團釋放速率 的變種蛋白,改良新抑癌素的藥效。 【發明内容】 本發明之目的在於提供一種變種新抑癌素,可提高生色團的 釋放速率,並進一步增加藥物釋放能力。 本發明之變種新抑癌素,包括一變種蛋白及一生色團,其中 _ 變種蛋白係以新抑癌素之蛋白爲基,將其中之苯丙胺酸支鏈 (Phe78)置換成丙胺酸(Ala,密碼爲GCG)或白胺酸(Leu,密 碼爲CUG),並分別命名爲F78A及F78L。 本發明亦包括一種用以處理人類或動物體內贅生細胞之醫藥 組合物,包含上述之變種新抑癌素及適當的醫藥可接受載體。 【實施方式】 φ 本發明較佳實施例之操作步騾如下所述: 1·萃取生色團 將NCS粉末(購自日本Kayaku Co·,Ltd·)溶於檸檬酸鈉(5 mM)中,形成濃度〇·5 mM、pH 4·0的溶液’再以甲醇重複萃取 出生色團;此萃取步驟爲習知技術。以HPLC分析生色團的完整 性,並於滴定過量新抑癌素蛋白後,以增加的Α34〇 (ε,10,800)分 析其濃度。 6 200815464 2. 重建生色團蛋白(holoneocarzinostatin) 將等莫耳萃取出的生色團添加到重組蛋白(溶於5 mM醋酸 氨,pH 4.0)的冰浴溶液中,以重建(reconstitution)新抑癌素的 生色團蛋白;並在〇°C下培養5〜10分鐘,以確保完全重建。接著’ 將反應溶液中的甲醇減低至5%以下,並小心不使易起變化的生色 團(diromophore)降解。最後,以HPLC確認重建後生色團的完 整性。 3. 建構PCAL-n-EK-新抑癌素蛋白基因
9 將DNA基因組模板由鏈黴菌(S. carzinostaticus,ATCC 15944)的植物培養基中分離。本實施例以的基因序列作爲 、引子(primer )的設計;根據 GenBank™( National Institutes of Health genetic sequence data base (gi_420324—)),ncd 的基因序列係以 氮末端的訊號胜肽(signal peptide)對147個胺基酸的新抑癌素蛋 白前驅物編碼。經由聚合晦鏈反應(polymerase chain reaction, PCR),以下列引子擴增113個胺基酸的新抑癌素蛋白的原生基因= 5,-GACGACGACAAGGCGGCGCCGACGGCTACGGT-3,(正向)、 ⑩及 5、GGAACAAGACCCGTCGGAGCGGATCCTCCGATCA-3’ (反 向)。 藉由旁側的12-核苷酸上段及13-核苷酸下段,於具有T7/lac啓動 子(卩]:〇111(^1')的£^/^厂/(7/^<^"表達載體卩€八1^-11_£1^(81^{&§6116, La Jolla,CA )上,進行獨立接合繁殖(ligation-independeftt cloning,LIC) 〇 上述之載體(50 ng)先以五amll041消化及凝膠純化,再於 200815464 72°C下,以含dTTP (1 mM)及P/w DNA聚合晦之溶液(LIC套 組;Stratagene,La Jolla,.CA)培養 10 分鐘,以 LIC 方式製造 12-及13-核苷酸的單股垂體。在dATP( 1 mM)存在下,同樣 聚合晦處理經凝膠純化的PCR擴增子(175 ng)。載體及嵌入體 於室溫下退火培養1小時後,再轉植至及co/f DH5a。 接著,新抑癌素蛋白基因向下與以CBP標記的序列融合,CBP 爲攜鈣素結合胜肽(calmodulin binding peptide),該標記結合於 ΕΚ載體的切割點(cleavage site)。藉由該ΕΚ切割點,可將CBP 標記完全去除,並產生具有原生氮末端的新抑癌素蛋白(亦即新 > 抑癌素蛋白中的Ala1) 〇PCR擴增子及pCAL-η-ΕΚ-新抑癌素蛋白 的 DNA 定序係以 ABI prism sequencer model 310( Biosystems,CA) 自動執行,以驗證序列的正確性。 4. 新抑癌素蛋白的定點變種 以PCR及『快速轉變法』對重組的新抑癌素野生種蛋白作定 點變種。根據£·⑺//的編碼,以丙胺酸(Ala,密碼爲GCG)及 白胺酸(Leu,密碼爲CUG)取代苯丙胺酸(Phe78),得到新抑 φ 癌素的變種蛋白,分別命名爲F78A及F78L。在PCR操作之後, 以Dpnl完全消耗未變種的DNA。將變種構造轉植到凡co/i DH5oc,並定序細胞質體(序列需至少重現兩次以確認無誤)。 5. 重組新抑癌素蛋白的表達及純化 將表達於pCAL-n-EK載體上的新抑癌素野生種蛋白或變種蛋 白轉植到五· co/z· BL21 Codon Plus (Stratagene,La Jolla,CA)。於 30 。0的 isopropyl β-D-thiogalactopyranoside ( 0.2 mM)中放置 5 小時 後,可誘導CBP-新抑癌素蛋白融合蛋白的表達。接著,將π// 細胞以超音波處理,可在細胞萃取液中發現CBP-新抑癌素蛋白融 200815464 合蛋白;再利用攜鈣素親和樹脂純化CBP-新抑癌素蛋白融合蛋白 (Stratagene,La Jolla,CA)。接著,使用 Amicon 或 Centricon 纖 維素膜(MWCO: 3000) (Millipore,Bedford,MA)將蛋白除鹽及 濃縮。以UV光譜測定CBP-新抑癌素蛋白融合蛋白的回收量。融 合蛋白於278 nm,ε278 = 21,400 ΜΓ1的消光係數可由新抑癌素蛋白 在ε278 = 14,4 0 0 Μ·1的報告値,及CBP標記蛋白在ε278 = 7,000 IVT1 的計算値(ProtPamm)來估算。在每一毫克CBP·新抑癌素蛋白融 合蛋白中添加 1 單位的 EK ( Invitrogen,CA or GenScript, Piscataway,NJ),並將溶液置於室溫下培養7天。當CBP標記的 酵素切割完成超過90% (以SDS-PAGE檢測)時,將混合物以線 性梯度爲〇〜4〇〇mM NaCl的DEAE-Sepharose (快速流動)樹脂 (Amersham Biosciences AB,Uppsala,Sweden )分離。最終蛋白產 物可經由水透析收集,或以Amicon或Centricon纖維素膜(MWCO: 3000)過濾而得。 以SDS-PAGE及HPLC分析純化後的蛋白,其平均純度高於 95%。純化的變種蛋白F78L的產率可高達4 mg// LB培養基。 5. 15N標定蛋白質的表達及純化 於M9最小培養基中,以15NH4C1 (0·25 g/L)爲單一氮來源 (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.? MA),以維生素 B1 培養 凡co/ί BL21 Codon Plus,完成15N均勻標定。標定後新抑癌素蛋 白及變種蛋白的純化步驟與上述純化步驟相同。產率約爲未標定 蛋白的一半。· 200815464 分析及驗證 ι·儀器 質譜儀(MS) 質譜儀採用具有大氣壓力游離源的Finnigan LCQ mass spectrometry detector ( Thermo Electron,San Jose,CA),並使用電 噴灑游離(+)-電荷模式。分析用的蛋白質樣品先以乙腈(30%,含 0.1%三氟醋酸)稀釋。 核磁共振(NMR)質譜儀 於室溫下,以V^urian 600_MHz NMR spectrometer (Palo Alto, CA)進行未標定的野生種新抑癌素蛋白及變種蛋白的一維的4 NMR分析。二維15Ν」Η異核單量子相關(heteronuclear single quantum coherence,HSQC) NMR 則以 Bruker DMX 600-MHz spectrometer (Rheinstetten,Germany)於 25°C 下進行。將冷凍脫水 的蛋白質溶於磷酸鈉(20mM,pH7_0,包括10%D2O及90%H2O) 中,以作爲NMR分析之樣品。 圓二色光譜儀(CD) 使用配置有循環水浴(Neslab,model RTE-140,Portsmouth, NH)的JascoJ-715 spectropolarimeter (Tokyo, Japan)分析新抑癌 素蛋白、生色團蛋白及其變種蛋白。將蛋白溶液(200 μΐ)溶於磷 酸鈉(20 mM,pH 7.0 )配製成10〜15 μΜ及50 μΜ兩種濃度,並分 別用於遠UV CD及近UV CD。數據則以平均殘基橢圓率(mean residue ellipticity)表示0 200815464 營光光譜儀 生色團蛋白樣品的釋放動力(kinetic)係以SLM Aminco Bowman Series II luminescence spectrometer( SLM Aminco Bowman, Urbana,IL)於25°C下分析。在波長340 nm激發,並在波長440nm 每30秒收集一單點發光數據。在100分鐘的檢測程序中,新抑癌素 的曝光時間僅2.33分鐘。利用快速設定以測定快速釋放生色團的變 種蛋白F78L。 高效能液相層析儀(HPLC) • 藉由Waters Millennium HPLC分析,比較完整的與蛋白結合的 生色團的量及釋放的生色團的量(未與蛋白結合的生色團可被麩 胱甘肽(GSH)誘導環化)·。 2.分析項冃 熱致變件試驗 以CD光譜(波長224 nm,由25°C升溫至91°C,升溫間隔爲3 φ °C),對野生種新抑癌素蛋白及變種蛋白(50 μΜ,於10 mM磷酸 鈉緩衝液中,pH 7)進行熱致變性試驗;平衡時間爲15分鐘。 生色團的釋放動力璺 對於天然生色團蛋白、重建的野生種或變種生色團蛋白釋放 生色團的速率,係根據『Sudhahar,G. C. P·,Balamumgan,K. and Chin, D.-H· (2000) J· Biol. Chem· 275, 39900-39906』所述之方法測定。將重建 後的新抑癌素生色團蛋白(10 μΜ)溶於Tris-HCl ( 100 mM,pH 7·〇),並以異丙醇(80%)測定完全釋放生色團的量。使用螢光 11 200815464 光譜儀(25°C,添加5 mM GSH)測定生色團的釋放速率;反相HPLC 則用來分析其釋放的量。完整的生色團及GSH所誘導的物質分別 代表蛋白結合及蛋白釋放的生色團的量,其量則根據『Chin,D.-H., Tseng, M.-C.5 Chuang, T.-C.5 and Hong, M.-C. (1997) Biochim. Biophys· Acta 1336, 43-50』所述方法估算。 釋放動力學數據處理 生色團的釋放速率可表示如下: d[holoNCS]/dt = - k〇bs [holoNCSP = - ki [holoNCS] 式 • ⑴ 其中,1^1^及11分別爲新抑癌素生色團蛋白(holoNCS)消失的觀 察速率常數及反應級數,h爲近似一級速率常數。當完整生色團漸 減,使新抑癌素蛋白/生色團的比値增加時,釋放速率亦漸減。速 率常數係由釋放至1〇°/〇的數據計算,其趨勢符合一級線性關係;根 據Kaleidagraph program (Synergy Software,Reading,PA)的運算 結果,其平均r = 0.97。 新抑癌素生色團蛋白對DNA的破壞 每一個生色團蛋白複合物切割DNA的能力係以型I DNA(超螺 旋型)轉換至型Π (鬆驰型;由單股斷點引起)及型ΠΙ (線性;由 雙股斷點引起)的比例來評估。使用Mini_PreP Plasmid isolation kit (Qiagenlnc·),由凡co/ί分離出超螺旋型pBR322DNA。將剛重建的 生色團蛋白(最後濃度爲5μΜ)、GSH(5mM)、TriS-HCl(100 mM,ρΗ7·0)及pBR322 DNA (4Ong/0)混合,以製備藥物反應 混合液(16·μ1)。此藥物混合液在16°C下培養15分鐘後’立刻移 到瓊脂電泳膠(agarose gel,l%w/v)上觀察DNA的切割情形。 12 200815464 檢測結果 雙硫分析 根據質譜儀分析結果,新抑癌素的野生種及變種蛋白都具有2 個雙硫基,與天然的相同〜 a 新抑癌素蛋白的CD分析 第2圖的CD光譜顯示新抑癌素的重組野生種及變種蛋白的結 構特徵’其中第2A圖中的重組野生種蛋白光譜,與文獻報告中原 生新抑癌素蛋白的特徵相符;變種蛋白的遠UV CD光譜與野生種 蛋白亦極接近。整體而言,變種蛋白仍保留了野生種蛋白的遠UV CD光譜所有特徵,顯示類似野生種的次級結構仍存在於變種蛋白 中。 此外,由第2Α圖右上方爲野生種蛋白的近UV CD光譜,可看 出在波長271 nm附近具有相同寬廣的負訊號,此與原生蛋白相 同。變種蛋白的平均殘基橢圓率具有相似強度,顯示芳香族支鏈 Tyr32、TrP39及Trp83處於穩定而緊密的三級環境中,與原生蛋白 相同。 野牛種及變種新抑癌素牛色團蛋白的CD光譜 如第2B圖所示,重組野生種新抑癌素生色團蛋白在波長255 nm附近出現較寬的負訊號,與天然的相符。此訊號強度深受生色 團及新抑癌素蛋白結合的莫耳比影響;已知天然生色團蛋白的結 合比爲1 ·· 1。圖中,野生種及變種生色團蛋白在2% nm ([θ]255 ) 的平均殘基橢圓率非常相近,顯示其與生色團可以1 : 1的比例結 合。由相似的CD曲線可知,生色團的結合並未因變種蛋白而產生 13 200815464 明顯變化。 熱致變件試驗 本試驗係用以比較天然新抑癌素蛋白、重組野生種蛋白及變 種蛋白的結構穩定性,結果如第2C圖的CD變化曲線圖所示。圖 中,重組野生種蛋白的熔點爲64.0°C,與大部,分文獻所記載的天然 蛋白的熔點(63.5°C )相符。至於變種蛋白,其曲線左右兩側(25〜52 及73〜91°C )及中間的快速展開區段(52〜73°C )幾乎重疊。變種 蛋白F78A及F78L的實測熔點分別爲65.5°C及65.7°C。 釋放動力學 GSH可快速誘導自由生色團失去活性,並產生比生色團高60 倍的螢光,藉此螢光變化便可檢測出生色團釋放反應動力。第3A 圖顯示變種生色團蛋白釋放生色團的速率皆高於野生種。尤其是 變種蛋白F78L,在相同條件下,15分鐘內便可釋放9〇°/。的生色團, 其釋放速率明顯提高。 表1爲天然、重組野生種及變種生色團蛋白釋放生色團的一級 • 速率常數(kd。野生種生色團蛋白的一級速率常數爲〇·19 h·1, 變種生色團蛋白F78A及F78L的釋放速率則分別高出7倍及9〇倍。 14 200815464 表1 生色團蛋白來源 生色團釋放速率常數(h_「) 鏈黴菌之天然生色團蛋白 0.20 ± 0.01 由重組的野生種蛋白重建 0.19 ± 〇.〇1 由變種蛋白F78A重建 1.32 ± 0.18 由變種蛋白F78L重建 16.5 ± 2.9 與蛋白結合的殘留生色圑的時間進程分_析_ 藉由反向HPLC分析,可比較與蛋白結合的完整生色團與釋放 的生色團(已被GSH誘導環化)。因此,以HPLC來分離及定量殘留 的完整生色團,可直接偵測到生色團的釋放情況。第3B圖顯示與 變種蛋白F7SA及F7SL結合的完整生色團迅速減少,而重組野生種 生色團蛋白的時間進程分析結果與天然生色團蛋白大致相符。 DNA切害1[ 在新抑癌素對DNA的切割反應中,釋放生色團爲新抑癌素作 用的第一步。因此,當蛋白釋放生色團的速率成爲DNA切割反應 的速率決定步驟時,新抑癌素對DNA的切割程度將受生色團的釋 放速率影響。第3C圖爲新抑癌素生色團蛋白切割pBR322DNA細胞 質體的瓊脂電泳膠分布圖,圖中變種蛋白F78A及F78L明顯促進切 割作用。變種蛋白F78A可使DNA長度明顯減少;而箭頭所指的變 種蛋白F78L甚至使DNA的全長降至500 bp以下。此結果與螢光或 HPLC對生色團釋放速率的分析一致。 15 200815464 二維HSOC NMR檢涮 第4圖顯示以二維HSQC NMR分析野生種及變種蛋白 的結果。對照於野生種蛋白,顯示變種蛋白個別胺基酸殘基幾無 化學遷移位置的變化。亦即新抑癌素蛋白的主幹結構並未因變種 而改變,亦非增進生色團釋放速率的因素。 * · 綜上所述,本發明藉由分析驗證,顯示新抑癌素蛋白的支鏈 Phe78爲控制生色團的釋放速率的重要因子。因此,針對支鏈Phe78 作定點變種,便可有效增加生色團的釋放速率。第5圖顯示與第1 φ 圖相似的變種新抑癌素模型,其中支鏈Phe78 (變種爲F78)恰好於 把關位置。當左方的支鏈F78受到刺激而打開時,生色團便可輕易 釋出;藉此將可進一步提高新抑癌素的藥效。
16 200815464 【圖式簡早說明】 第1圖顯示新抑癌素生色團蛋白的模型,其中: 碳末端、氮末端、生色團一紅色,主幹一灰及監,環1及2— 黃,支鏈一深藍。 第2A圖:顯示新抑癌素的野生種蛋白及變種蛋白的0]0光譜。0 第2B圖:顯示新抑癌素的野生種蛋白及變種蛋白的CD光譜。 第2C圖:顯示新抑癌素的野生種蛋白及變種蛋白的CD光譜。 ® 第3人及3B圖爲釋放生色團的時間進程分析,其中: 第3A圖:野生種圖線爲(_),F78A圖線爲(_),F78L圖線爲(▲) 第3B圖:野生種圖線爲(*),F78A圖線爲(B),F78L圖線爲(▲) 第3C圖爲新抑癌素生色團蛋白切割PBR322DNA細胞質體的瓊脂 電泳膠分布圖。’ 第4圖顯示以二維NMR分析野生種及變種蛋白的結果。 φ 第5圖顯示變種新抑癌素的模型。 【主要元件符號說明】 17