TW200803835A

TW200803835A - Therapeutic compositions and methods useful in modulating protein tyrosine phosphatases

Info

Publication number: TW200803835A
Application number: TW096101061A
Authority: TW
Inventors: Taolin Yi
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 2006-01-11
Filing date: 2007-01-11
Publication date: 2008-01-16
Also published as: US20070202079A1; WO2007082052A2; WO2007082052A3

Description

200803835 九、發明說明： t發明所屬之技術領域】本發明係申明補充美國專利暫時申請案號 60/757,860，於2006年1月1丨日提申，在此完整併入本案以 5 作為參考資料。發明領域本發明係相關於蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑，以及利用該蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑與T細胞活化劑之結合，以治療疾病。 10 【先前發明背景各種文獻或專利係於本份說明書中引用，以描述本發明領域之最新技術。這些文獻或專利之每一者皆在此併入本案以作為參考資料。 15 細胞内蛋白質酪胺酸磷酸化係由細胞外刺激調節，如細胞放素。此5周_可控制細胞生長、分化與功能活性。文獻上已有數百種蛋白質酪胺酸磷酸酶（"PTPase”），包括 SHP-1、PTP1B、MKP1、PRL-卜 PRL-2與PRL-3。調節細胞内蛋白質酪胺酸磷酸化之機制取決於蛋白質酪胺酸激酶 20 Γρτκ’’)(其可啟動訊息傳遞鏈，經由磷酸化蛋白質受質之酪胺酸殘基)與蛋白質酪胺酸磷酸酶（其經由將受質去磷酸化而終止訊息）之相互影響。可調節蛋白質絡胺酸激酶或填酸酶活性之化學化合物，可誘發細胞變化，影響細胞内蛋白質酪胺酸磷酸化之平衡，並重新引導訊息。此可由先前以 5 200803835 PTK抑制劑STI-571成功治療人類慢性骨髓性白血病與腸胃道間質瘤作為示範（Berman等人，Hum. Pathol· 32，578 (2001) ; Druker等人，Ν· Engl. J· Med. 344, 1031 (2001); Mauro等人，Curr. Opin· Oncol. 13，3 (2001))。STI_571 以 5 bcr/abl或c-kit為標的，其會不正常活化蛋白質激酶，為一種重要的疾病致病分子。急性骨髓性白血病（"AML”）特徵為骨髓母細胞之堆積，其會停止各種分化階段，無法進行最終分化。依據法美英分類法（French-American-British ; FAB)，AML可依型 10 態學、細胞組織學、免疫性標記物與細胞遺傳學區分為不同亞群。大多數AML亞群之治療都不令人滿意。治療通常包括以密集化療作為誘發治療，以誘發完整之血液學緩解作用（hematological remission)，以及鞏固強化治療，以消滅殘餘疾病。僅以化療或與自體幹細胞移植結合之鞏固強化 15 治療，係具有相對復發高風險，且長效無疾病存活率低於 50%。異體移植之鞏固強化治療具有較低之復發風險，但較高之治療相關死亡率（Lownberg等人，N. Eng. J. Med. 341， 1051 (1999)(，’Lowenberg，，)）。 AML治療中分化誘發療法之潛力在於，最近在治療前 20 骨髓性白血病（APL，M3亞群)之全反式維甲酸(ATRA)之成功（Kogan等人，〇nc〇gene 18, 5261 (1999)("Κο§&η")>ΑΤΙΙΑ 已知可誘發完全緩解與長期無APL存活率達到75% (Fenaux 等人，Blood 94, 1192 (1999))。此ATRA治療效果源自於其誘發APL細胞末期分化之活性，係結合於異常出現之維曱 200803835 / 5 v • 酸受體a (RARa)嵌合蛋白，造成嵌合蛋白分解並改變轉錄調控(Kogan)。由於RARa嵌合蛋白之產生受限於APL細胞， ATRA之分化誘發治療顯示對於其他AML亞型僅具備有限效果(Lowenberg)。使用ATRA之治療會出現嚴重全身性毒性(Tallman等人，Blood 95, 90 (1999))並誘發ATRA抗藥性 (Melnick等人，Blood 93, 3167 (1999))。儘管如此，ARTA 在APL亞型案例的顯著成就，提供了以AML治療之分化誘發成效之證據，並促使更致力於確認其他分化誘發性療法。近來已有數種藥物被提出，包括砷衍生物與組蛋白去 10 乙醯酶抑制劑(He等人，Oncogene 18, 5278 (1999))。許多證據顯示，AML細胞之分化受細胞内酪胺酸填酸化的影響，係經PTKs與PTPases之平衡所調控。HL-60前骨髓性白血病細胞之粒狀成熟作用顯示胞内蛋白酪胺酸磷酸化表現降低，且絡胺酸激酶與蛋白填酸路胺酸填酸酶活性， 15 ❿ 增加(Frank等人，Cancer Res· 48 (1988))。AML細胞與其他細胞株出現造血蛋白酪胺酸磷酸酶(HePTP)放大與過度表現情形，造成異常AML細胞生長與分化停止(zanke等人， Leukemia 8, 236 (1994))。HL-60細胞分化過程中亦發現造血細胞磷酸酶SHP-1表現量增加(Zhao等人，Proc. Nat. Acad. 20 Sci USA 91，5007 (1994))，及抑制J2E白血病細胞之Epo-誘發性分化作用，顯示其參與情形(Bittorf等人，Biol. Chem· 380，1201 (1999))。有趣的是，PTK抑制劑顯示可增進APL 細胞之ATRA-誘發性分化作用，然其單獨處理卻無分化誘發性(Berman等人，Rev· Infect Dis 10, 560 (1988)) 〇 7 200803835 PRL家族酪胺酸磷酸酶(例如，PRL-；l、PRL-2與PRL_3) 之過度表現對人類惡性腫瘤作用具備潛在病理角色。PRL-1 (肝再生填酸酶-1)最初於肝再生反應中發現(〇以111011(1等人，Mol· Cell· Biol· 14，3752 (1994)(“Diamond”)）。PRL-2 5 與PRL-3之發現係依據PRL-1之類似物(Montagna等人，111!111·

Genet. 96，532 (1995) ; Zeng 等人，Biochem· Biophys. Res.Commun. 244, 421 (1998)(“Zeng-1998，，)）。PRLs與類似填酸酶具有胺基酸序列相似性至少75% (“Zeng-1998”）。在正常成人組織中，PRLs主要表現於骨骼肌，且少量表現於 10 大腦（PRL-1)、肝臟（PRL-2)與心臟（PRL-3)(Diamond ; Zeng-1998)。PRLs之生理功能目前尚未知，僅知PRL-1參與分化作用，其於肝再生作用時表現量增加(Diamond)。目前有一種假設探討其維持表皮組織分化之潛在角色，係依據其於腎臟與肺臟（PRL-l)(Kong等人’ Am. J· 15 Physiol· Gastrointest· Liver Physiol· 279, G613 (2001))以及小鼠腸内（PRL_3)(Zeng等人 ’ J· Biol· Chem· 275，21444 (2000))最終分化細胞内之選擇性表現。最近之研究顯示， PRL-3之過度表現，始於基因放大或其他缺失，已知與人類直腸癌之腫瘤轉移有關（Saha等人，Science 294，1343 20 (2001)(“Saha”)）。PRL-3之過度表達，是否參與其他人類腫瘤惡化反應，可由PRL-3基因於人類染色體8q位置判定，許多不同腫瘤類型於後期階段，常發現此區域有多個複製區 (Saha)。與癌症PRL過度表現之腫瘤角色相同，PRLPTPases 之異位表現已知可增進細胞生長，導致細胞轉形與/或促進 200803835 裸鼠腫瘤生長(Cates等人，Cancer Lett· 110，49 (1996); Diamond)。雖然 PRL PTPases 可受原飢酸鈉（sodium orthovanadate)抑制（Diamond ; Matter 等人，Bi〇chem

Biophys· Res.Commun. 283, 1061 (2001))，其能廣泛抑制所 5 有填酸酶(Burke等人，Biopolymers 47, 225 (1998))，但臨床上可用之PRLs抑制劑卻仍未被報導。磷酸酶之致腫瘤機制與訊息調節狀態/分子仍未釐清。癌症與其他疾病包括免疫缺失、B型肝炎與其他肝炎通常以細胞激素進行治療。腎細胞癌（RCC)，舉例而言，係一 10 惡性疾病且美國每年約有31，200個新案例與12,000個死亡數（Greenlee R· Τ·，Μ· B· Hill-Harmon，T· Murrary與 M.

Thum. 2001. Cancer statistics, 2001. Ca Cancer J Clin 51 : • 15)。有很高比例的RCC病患係原始，或局部處理腫瘤細胞後發展成後期病症，其無法以常見方式治療，包括化學療 15 法與放射線療法(Mulders，P·，R· Figlin，J. B. deKernion，R.

Wiltrout，M. Linehan，D. Parkinson，W· deWolf 與 Α·

Belldegrun. 1997. Renal cell carcinoma· recent progress and future directions. Cancer Res 57 ·· 5189)。這些病患具備中度存活率，僅8個月，且5-年存活率者低於10% (Motzer，R. J· 20 與卩.尺1188〇.2000.83^611^1：1^&卩}^〇1*1^11&1。€11〇江^11〇111&· J· Urol 163 : 408)。免疫療法，係利用細胞激素或免疫細胞進行抗腫瘤免疫力活化作用，已被研究用來作為治療後期 RCC之替代全身性療法(Rosenberg，S· A. 2001. Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature 9 200803835 411 : 380)。令人意外的是，介白素-2 (IL-2)可誘發後期RCC 病患10-20%反應率，並已被認可為RCC療法(bleumer，I.，E· Oosterwijk，P. De Mulder 與 Ρ· F. Mulder. 2003. Immunotherapy for renal cell carcinoma. Eur Urol 44 : 65) o 5 有許多可誘發j anu s家族激酶/信號轉導和轉錄激活因子(Jak/Stat)途徑的細胞激素（Stark等人，Harvey Lect. 93，1 (1997))，已被認可用於多種疾病之臨床治療(D. J· Vestal等人，Pharmacology of Interferons : Induced Protein Cell Activation and Antitumor Activity, In Cancer Chemotherapy 10 Biotherapy (3rd ed. 200l))(“Vestal”）。干擾素(IFNs)係細胞素之其中一例，可傳遞Jak/Stat途徑，並已被認可作為臨床之用（Vestal)。IFNa係細胞素之其中一例，可有效用於治療人類惡性腫瘤，包括黑色素瘤（Borden等人，Semin. Cancer Biol· 10，125 (2000))。然而，IFNa之臨床效用常受限於癌 15 細胞對細胞素的排斥。以IFNa之訊息傳導分子為標靶之藥物，可擴大IFNa之抗癌能力，並克服排斥現象，但目前並未有此類報導。並且，廣義來說，任何使癌細胞產生抗藥性之細胞激素，均可由以涉及抗藥性之訊息傳遞分子為標乾之藥物獲益。 20 IL-2係T淋巴球與許多其他免疫細胞之激活因子 (Rosenberg, S. A. 2000. Interleukin-2 and the development of immunotherapy for the treatment of patients with cancer. Cancer J Sci Am 2000 : S2)。可結合至細胞表面之受體，以啟動胞内訊息傳遞瀑布，並受多種機制向下調節，包括IL—2 10 200803835 訊息分子受蛋白質酪胺酸磷酸酶（PTPases)去磷酸化 (Rosenberg, S. A. 2000. Interleukin-2 and the development of immunotherapy for the treatment of patients with cancer. Cancer J Sci Am 2000 : S2 ; Ellery，J· M·，J· Kempshall與P. J· 5 Nicholls. 2000. Activation of the interleukin 2 receptor ： a possible role for tyrosine phosphatases. Cell Signal 12 ： 367)。IL-2媒介之生物效應包括T細胞、自然殺手細胞(NK) 與B細胞之增生與擴張(Abbas等人’ Cellular and Molecular

Immunology，4.sup.th Ed” Saunders 2000, ρ·255)。IL-2可刺 10激週邊白血球IFNY之合成，並可誘發腫瘤自殺細胞激素如腫瘤壞死因子之釋放。雖然IL-2療法相較於傳統方式已顯示可有效對抗多種癌症，但臨床上卻受限於其劑量相關毒性。咼劑量的IL-2治療會併發血管裂縫、休克、肺水腫與全身性高血壓。故亟需降低IL-2毒性，以增加其療效。 15 【發明内容】發明概要本發明係有關於蛋白質酷胺酸麟酸酶(“pTpase”)抑制劑，及使用PTPase抑制劑結合τ_細胞活化劑以治療癌症。進行處理之個體包括，但不侷限於，動物，其包括哺乳類 20動物，另包括人類。有幾類化合物被認定為有效的PTPase 抑制劑包括，但不侷限於，下列所示：五價銻(pentavalent antimonial)化合物、味唑（imidaz〇le)化合物與聯脒 (diamidine)化合物。本發明之一實施例係提供一治療組成物以治療癌症， 11 200803835 包含有一 PTPase抑制劑與一 τ—細胞活化劑。pTpase抑制劑係選自於以下類型之化合物：五價銻化合物、咪唑化合物或聯脒化合物。PTPase抑制劑可為任何此類化合物已知存在者或未末會發現者之生物性專效物。治療組成物可包 5含這些化合物的混合物或組合物。T-細胞活化劑係任何有效導致，直接或間接，τ細胞執行其效應細胞功能，包括誘發腫瘤浸潤型巨噬細胞之試劑。T細胞活化劑與丁細胞效應細胞功能為熟習此技術領域者所知，並揭示於Abbas等人，

Cellular and Molecular Immunology，（sup.th Ed· 2000與 10 Janeway等人，Immunology，5.sup.th Ed. 2001。T細胞活化劑可為蛋白、胜肽與有機或無機分子。舉例而言，雙膦酸鹽類與膦酸抗原為熟習此技術領域者所知之有效T細胞活化劑。若T細胞活化劑為蛋白或胜肽，則本發明包含其功能變形物。如本文所指，胜肽τ細胞活化劑之，，功能變形物，， 15 或”變形物”，係指一胜肽，其於τ細胞活化劑胜肽之一級胺基酸序列上含有一或更多之修飾，而保有原始蛋白或胜肽之T細胞活化劑免疫激活功效。若τ細胞活化劑胜肽之功能變形物具備胺基酸取代，則保留性胺基酸取代反應為較佳，亦即取代反應仍維持原始胺基酸特性，如帶電性、疏 20 水性、構形等。胺基酸保留取代之範例包括下列各類胺基酸之取代：（1) M，I，L，V; (2) F，Y，w; (3) K，R，Η; (4) A，G ; (5)S，T ; (6)Q，N ; (7)E，D。以變形物胜肽Τ細胞活化劑激活T細胞，顯示此變形物胜肽為功能性變形物。在一實施例中，T細胞活化劑為IL-2及其功能性變形物。 12 200803835 本發明之另一實施例係提供一治療組成物以治療癌症’包含有葡萄糖酸銻鈉(sodium stibogluconate)或其生物性專效物’及一T細胞活化劑。葡萄糖酸銻鈉可進一步分離為不同分子量之分離物(fracti〇n)，並排除其中某些分離物。 5 本發明之另一實施例係提供一治療組成物以治療癌症’包含有PTPase抑制劑與il-2，或其功能性變形物。使用PTPase抑制劑結合IL_2，可增加IL_2的效用並明顯降低其毒性。PTPase抑制劑係選自於以下類型之化合物：五價銻化合物、咪唾化合物或聯脒化合物。pTpase抑制劑可為任 10何此類化合物已知存在者，或未來會發現者之生物性等效物。治療組成物可包含這些化合物的混合物或組合物。本發明之另一實施例係提供一治療組成物以治療癌症’包含有葡萄糖酸銻鈉或其生物性等效物，及IL_2。本务明之另一實施例係提供一治療組成物，並於前述 15實施例之條件下以治療癌症，包含有經分離之化合物。當化a物作為治療組成物，並包含有不同化合物之混合物打此此合物可經分離，且一或更多分離物可被排除。一或更多分離物可隨即用於製備一治療組成物。本务明之另一實施例係提供一組成物，以降低IL-2毒 20性，包含有PTPase抑制劑與IL-2。PTPase抑制劑係選自於以下類型之化合物：五價銻化合物、咪唾化合物或聯肺化合物。PTPase抑制劑可為任何此類化合物已知存在者，或未來會發現者之生物性等效物。在-實施例中，PTPase抑制劑係葡萄糖酸銻鈉及其生物性等效物。在另一實施例 13 200803835 中’ PTPase抑制劑係一或更多種葡萄糖酸銻鈉分離物 (fraction) 〇本發明之另一實施例係提供一套組，包含有〜人 δ PTPase抑制劑之容器，及前述癌症治療用之PTPase抑制, 5 與丁細胞活化劑之使用說明。在一實施例中，PTPaSe抑制劑係葡萄糖酸銻鈉，且T細胞活化劑係IL-2。本發明之另一實施例係提供一治療癌症之方法，包含投予個體一有效量之PTPase抑制劑與T細胞活化劑。pTPase 抑制劑係選自於以下類型之化合物：五價銻化合物、味唾 10化合物或聯脒化合物。PTPase抑制劑可為任何此類化合物已知存在者，或未來會發現者之生物性等效物。治療組成物可包含這些化合物的混合物或組合物。在一實施例中， PTPase抑制劑係葡萄糖酸銻鈉。τ細胞活化劑係任何有效導致直接或間接，Τ細胞執行其效應細胞功能，包括誘發腫 15瘤次潤型巨噬細胞之試劑。在一實施例中，Τ細胞活化劑係 IL-2及其功能變形物。本發明之另一實施例係提供一降低IL_2毒性之方法，包含有投予個體一有效量之PTPase抑制劑與IL_2。PTPase 抑=劑係選自於以下類型之化合物：五價錄化合物'味嗤 2〇化合物或聯肺化合物。PTPase抑制劑可為任何此類化合物已=存在者’或未來會發現者之生物料效物。治療組成物可包含這些化合物的混合物或組合物。在一實施例中， PTPa=抑制劑係葡萄糖酸銻鈉。在—實施财，本方法包含有前後順序投予pTPase抑制劑與il_2。在另一實施例 14 200803835 中’ PTPase抑制劑與IL_2係同時投藥。勺人it明之另—實施例係提供—強化1L·2療效之方法， •又予個體-有效量之PTpase抑制劑與 IL-2 〇 PTPase 抑制劑係選自於以下類型之化合物：五價錄化合物、哺嗤已矣存在者’絲來會發現者之生物性等效物”台療組成物可包含這些化合物的混合物或組合物。在—實施例中， PTPase抑制劑係葡萄糖酸職。在—實施例中，本方法包

10 含有丽後順序投予PTPase抑制劑與以。在$ 一實施例中’ PTPase抑制劑與^係同時投藥。本發明之另一實施例係提供一強化IL_2療效之方法成，包含於處理IL-2時，投予個體一有效量之pTPase抑制劑。本發明之另一實施例係提供一種治療疾病之方法，於 15前述方法實施例之條件下，包含分離欲投藥之化合物。當使用於該方法之化合物包含不同化合物之混合物時，此混合物可經分離，且一或更多分離物可被排除。圖式簡單說明第1圖係葡萄糖酸銻鈉（sodium stibogluconate)(A)與|弟 20 酸甲葡胺(meglumine antimonate)(B)之假設結構。第2圖係_康ϋ坐（ketoconazole)(A)、左美素 (levamisole)(B)與噴他肺(pentamidine)(C)之假設結構。第3圖係A· SHP-1、SHP-2與PTP1B之GST融合蛋白於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)存在下之相對PTPase活性。B. 15 200803835 GST/SHP-1融合蛋白於不同量之葡萄糖酸銻鈉或蘇拉明 (suramine)存在下之相對PTPase活性。C. PTP1B與MKP1之 GST融合蛋白於不同量之葡萄糖酸銻鈉存在下之相對 PTPase活性。

5 第4圖係A. SHP-1 與SHP-1 催化區塊(SHP-lcata)之GST 融合蛋白之蛋白區塊結構。B. SHP-1與SHP-1 cata融合蛋白於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)存在下之相對PTPase活性。第5圖係SHP-1之GST融合蛋白與葡萄糖酸銻鈉（SS)或蘇拉明預靜置，隨後清洗(+)或不清洗之相對PTPase活性。 10 第6圖係Baf3細胞除去IL-3達16小時後，培養於葡萄糖酸銻鈉（SS)(A)或過釩酸鈉(pervanadate)(B)之不同時間下，總細胞裂解物之SDS-PAGE凝膠圖。第7圖係Baf3細胞之總細胞裂解物之SDS-PAGE凝膠圖，顯示葡萄糖酸銻鈉（SS)增加Baf3細胞中IL-3誘發之 15 Jak2/Stat5酪胺酸填酸化作用。第8圖係A.葡萄糖酸銻鈉（SS)可增加培養於IL-3之Baf3 細胞增生作用。Β·以不同量之IL-3，以及葡萄糖酸銻鈉存在或不存在下，培養Baf3細胞三天後之細胞數。第9圖係A· TF-1細胞培養於不同量之GM-CSF及有或 20 無葡萄糖酸銻鈉（SS)三天後之增生作用。B· TF-1細胞培養於GM-CSF與不同量之IFNoi及有或無葡萄糖酸銻鈉（SS)三天後之增生作用。C·以細胞生長抑制百分比表示B之結果。 D· TF-1細胞培養於GM-CSF與不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS) 六天後之增生作用。E· TF-1細胞培養於GM-CSF/IFNa與不 16 200803835 同量之葡萄糖酸銻鈉（ss)六天後之增生作用。第10圖係A· SHP-l、PTP1B與MKP1之GST融合蛋白於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)，或酒石酸銻鉀（酒石酸錄鉀)(PSbT)存在下之相對PTPase活性。B. Baf3細胞於葡萄糖 5 酸銻鈉或酒石酸銻鉀存在或不存在下，以IL-3激活不同時間之總細胞裂解物SDS-PAGE凝膠圖。C. Baf3細胞於IL-3 (10單位/ min)存在下，培養於不同量之葡萄糖酸銻鈉或酒石酸銻鉀三天後之增生作用。第11圖係A. NB4細胞暴露於葡萄糖酸銻鈉（SS)三天與 10 六天後之NBT-陽性細胞百分比。B. NB4細胞暴露於全反式維甲酸(ATRA)或葡萄糖酸銻鈉六天後之NBT-陽性細胞百分比。C· NB4細胞培養於全反式維甲酸或葡萄糖酸銻鈉三天後之CD 11b-陽性細胞百分比。第12圖係Α· NB4、HL-60與U937細胞培養於不同量之 15葡萄糖酸銻鈉（SS)六天後之生長抑制百分比。β· NB4細胞培養於不添加或葡萄糖酸銻鈉或全反式維甲酸(ATRA)存在下之G0/G卜S或G2/M期百分比。C· NB4細胞培養於不添加或葡萄糖酸銻鈉或全反式維曱酸存在下三天後之流式細胞儀分析圖（X軸顯示以膜聯蛋白V (Annexin V) FITC染色，γ 20 軸顯示以峨化丙。定染色）。第13圖係Α· NB4細胞於存在或不存在葡萄糖酸銻鈉 (SS)或全反式維甲酸(ATRA)下培養六天後洗滌，並繼續培養六天之NBT-陽性細胞百分比。B.NB4細胞於存在或不存在葡萄糖酸銻鈉或全反式維甲酸下培養〇·5至24小時後洗 17 200803835 滌，並繼續培養六天之NBT-陽性細胞百分比。第14圖係A· HL-60細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS) 存在或不存在下，培養3或6天之ΝΒΤ-陽性細胞百分比。Β. U937細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)存在或不存在下， 5 培養3或6天之ΝΒΤ-陽性細胞百分比。C. HL-60細胞於全反式維甲酸(ATRA)或葡萄糖酸銻鈉存在或不存在下，培養〇或6天之ΝΒΤ-陽性細胞百分比。D· U937細胞於全反式維甲酸或葡萄糖酸銻鈉存在或不存在下，培養〇或6天之ΝΒΤ-陽性細胞百分比。 10 第丨5圖係HL-60 (Α)與U937 (Β)細胞於粒細胞/巨嗟細胞集落刺激因子(GM-CSF)、葡萄糖酸銻鈉(SS)或兩者存在或不存在下，培養不同時間後之ΝΒΤ-陽性細胞百分比。第16圖係A· DR細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)與/ 或IFNa存在或不存在下，培養3天之細胞生長情形。β·由 15圖A數據計算之DR細胞生長抑制百分比。c. DS細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉與/或IFNcx存在或不存在下，培養3天之細胞生長情形。D· DR細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)與 /或IFNa存在或不存在下，培養六天之細胞生長抑制百分比。E· U266細胞以IFNa與不同量之葡萄糖酸銻鈉培養六天 20之生長抑制百分比。第 17 圖係 WM9 (A)、DU145 (B)、MDA231 (C)與

WlT49_Nl (D)細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)與/或IFNa 存在或不存在下，培養六天之細胞生長抑制百分比。弟18A，B圖係WM9細胞於不同量之ss、IFNa與IFNP存 18 200803835 5 在或不存在下培養六天之細胞生長抑制百分比。第19圖係顯示WM9細胞之葡萄糖酸銻鈉（SS)與 IFNg(A)或IFNP(B)之間協同作用之細胞控制百分比。第20圖係顯示U266細胞於不存在(A)或存在IFNa(B)、葡萄糖酸銻鈉（SS)(C)或兩者(D)下培養三天之流式細胞儀 V 分析圖（X軸顯示以膜聯蛋白V FITC染色，Y轴顯示以碘化丙咬染色)。第21圖係A· DR細胞於葡萄糖酸銻鈉（SS)不存在或存 • 10 在下，進行不同時間點之IFNa刺激反應後，總細胞裂解物之SDS-PAGE凝膠圖。B.癌症人類細胞株WM9、WM35、 WiT49-Nl與DU145於葡萄糖酸銻鈉不存在或存在下，以 IFNa刺激五小時之總細胞裂解物之SDS-PAGE凝膠圖。第22A，B圖係葡萄糖酸銻鈉、IFNa或兩者對於裸鼠 WM9與DU145腫瘤體積隨時間之影響。 - 15 • 第23圖係WM9異種皮移植裸鼠與控制組體重之比較。第24圖係體外腎瘤細胞(Renca)與WM9細胞對SSG之不同生長反應。腎瘤細胞(A)與WM9 (B)細胞於不同量之SSG 不存在或存在下培養6天。存活細胞隨即以MTT分析進行定量。數據表示三重複樣本之平均值± s.d.。 20 第25圖顯示SSG與SSG/IL-2結合治療可抑制Balb/c小鼠腎瘤細胞(Renca)生長。將腎瘤細胞植入Balb/c小鼠（106 細胞/處，s.c·)。小氛4天後出現腎腫瘤，隨後進行未處理(控制組）或處理IL-2 (105 IU/天，i.p·)、SSG (12 mg/天，i.m·) 或結合以上二試劑。紀錄這些小鼠的腎腫瘤體積（平均值土 19 200803835 s.d·，n=8)並如所示。試劑處理時間如箭頭所指。第26圖顯示SSG與SSG/IL_2結合治療可增加Baib/c小鼠腎腫瘤浸潤巨噬細胞。A.Balb/c小鼠進行不同處理後（第2 圖）腎腫瘤T淋巴細胞與巨嗟細胞之相對數目如免疫組織化 5學所疋里。冶療結束後由小鼠所採集之腫瘤經組織切片，並以抗-CD4、抗_CD8或抗_F4/8〇 mAb染色。比較控制組小鼠腫瘤之基線值，進行處理組小鼠腫瘤〇1)4+、(：1)8+與174/8〇+ 細胞之評分（增加倍數）。Β·不同處理組小鼠腎腫瘤切片之 F4/80+細胞之代表圖（4〇倍）。 10 第27圖顯示SSG與SSG/IL-2結合治療可增加Balb/c小既脾臟巨嗟細胞。A. Balb/c小鼠進行不同處理後（第2圖）脾臟T淋巴細胞與巨噬細胞之相對數目，如免疫組織化學所定量。治療結束後由小鼠所採集之脾臟經組織切片，並以抗 CD4、抗-CD8或抗_F4/80 mAb染色。比較控制組小鼠脾臟 15之基線值’進行處理組小鼠脾臟CD4+、CD8+與F4/80+細胞之評分(倍數）。B·不同處理組小鼠脾臟之574/8〇+細胞代表圖 (20倍）。第28圖顯示SSG可增加體外Jurkat細胞iFNy之釋放。 Jurkat細胞於不同置之ssg不存在或存在下培養16 hrs。經 20 培養Jurkat T細胞上清液之IFNY量以ELISA進行定量。數據表示三重複樣本之平均值± s.d.。第29圖顯示IL-2/SSG結合治療對於無胸腺Balb/c小鼠腎腫瘤生長之影響。將腎瘤細胞植入（1〇6細胞/處，s.c.)無胸腺Balb/c小鼠(nu/nu)。小鼠4天後出現腎腫瘤，隨後進行 20 200803835 未處理(控制組）或結合處理IL-2 (105 IU/天，i.p.)與SSG (12 mg/天，i.m·)或結合以上二試劑。紀錄這些小鼠的腎腫瘤體寻貝（平均值土 s.d.’n=8)並如所示。試劑處理時間如箭頭所指。第30圖顯示Α·重組prl磷酸酶於葡萄糖酸銻鈉存在或 5不存在下，進行一合成酪胺酸磷酸化胜肽之去磷酸化反應之相對活性。B.不同葡萄糖酸銻鈉之預靜置時間，對於重組PRL-3之受質胜肽去磷酸化活性之影響。c.重組pRL_3於不存在或存在不同量之SSG、原釩酸鈉(v〇)或蘇拉明下，進行DiFMUP受質去填酸化反應之相對活性。d.重組SHp」 10與PRL-3於不存在或存在SS下，進行DiFMUP去磷酸化反應之相對活性。E.將PRL-3結合至麵胱甘肽（glutathione)微珠、預靜置於SSG 10分鐘後進行不清洗(清洗〇或清洗(清洗 +)動作以比較相對磷酸酶活性。第31圖係Α· NIH3T3細胞以含控制組載體（v)，或 15 Flag-pRL-l表達構築體轉染後進行未處理(〇)，或葡萄糖酸銻鈉（SSG)處理(5 min)’利用體外PTPase分析法檢測抗-Flag 免疫錯合物，以決定PTPase活性。Β·利用SDS-PAGE/西方墨染彳貞測免疫錯合物’以決定Flag-PRL-Ι之相對量。C. NIH3T3細胞以Flag-PRL-2轉染後，進行未處理或葡萄糖酸 20 銻鈉處理之PTPase活性。D·利用SDS-PAGE/西方墨染彳貞測免疫錯合物，以決定Flag-PRL-2之相對量。E NIH3T3細胞以Flag-PRL-3轉染後，進行未處理或葡萄糖酸銻鈉處理之 PTPase活性。F·利用SDS-PAGE/西方墨染偵測免疫錯合物，以決定Flag-PRL-3之相對量。 21 200803835 第32圖係Α· NIH3T3細胞以Flag-PRL-2轉染後，進行未處理或葡萄糖酸銻納（SSG)處理5 min、清洗移除多餘藥物，及不同時間培養後檢測抗-Flag免疫錯合物，以決定相對PTPase活性。B.利用SDS-PAGE/西方墨染偵測免疫錯合 5 物，以決定Flag_PRL-2之相對量。第33圖顯示以RT-PCR決定一組人類癌症細胞株 (A549、HEY、LoVo、SK-N-SH與DU145)，及健康自願者 PBMC之PRLs轉錄子表達情形。第34圖顯示人類癌細胞株A549 (A)、HEY (B)、LoVo 10 (c)、SK-N-SH (D)、U251 (E)與DU145 (F)於SSG不存在或存在下，培養6天之生長情形。第35圖係A·小鼠植入DU145細胞2天後不處理(控制組) 或處理葡萄糖酸録鈉（SSG)之腫瘤體積。B.控制組小鼠於25 天後DU145細胞植入部位之組織學研究。c.經SSG處理小鼠 15 於25天後DU145細胞植入部位之組織學研究(DU145腫瘤如箭頭所指）。第36圖係A· DU145與DU145R細胞於葡萄糖酸銻鈉 (SSG)不存在或存在下，培養6天之生長情形。B DU145或 DU145R細胞之PRL_i cDNAs序列（密碼子86附近）。c· 20 PRL-1 蛋白之S86與R86位置。D· PRL_1、PRL-1R86 (R86) 之GST融合蛋白與GST蛋白（控制組）於體外PTPase分析中’對於一合成酪胺酸磷酸化胜肽受質之去磷酸化反應活性。Ε·以體外PTPase分析決定重組prl-1與PRL-1R86 (R86) 磷酸酶，於葡萄糖酸銻鈉不存在或存在下之相對pTPas6i 22 200803835 性〇第37圖係A· WM9細胞以含控制組載體（V)或 Flag-PRL-1或Flag-PRL-1R8 6表達構築體轉染後進行未處理或葡萄糖酸銻鈉（SSG)處理，並利用SDS-PAGE/西方墨染债 5 測抗-Flag免疫錯合物。B·以體外PTPase分析偵測抗-Flag免疫錯合物，以決定相對PTPase活性（以未處理之Flag_PRL-l 轉染細胞組之免疫錯合物PTPase活性當作100%值）。c. WM9轉染細胞於不存在葡萄糖酸銻鈉下培養6天之生長情形。D. WM9轉染細胞於葡萄糖酸銻鈉存在下培養6天之相 10 對生長抑制情形。第38圖顯示體外銻酸甲葡胺存在下之相對SHP-1與 PRL-3 PTPase活性。第39圖係A.分離葡萄糖酸銻鈉之HPLC層析圖，顯示各分液與其中Sb含量。B·重組SHP-1於每一葡萄糖酸銻鈉分液 15 存在下之相對PTPase活性。第40圖顯示MKP (A)、PTP1B (B)與GSTm8 (C)於左美素(levamisole)、S同康唑(ketoconazole)與喷他脒（pentamidine) 存在下，及以葡萄糖酸録鈉（SS)為原型劑(model agent)之相對PTPase活性。 2〇第 41 圖顯示 SHP-1 (A)、PTP1B (B)與 MKP1 (C)於 _ 康唾(ketoconazole)與喷他脒(pentamidine)存在下，及以葡萄糖酸銻鈉（SS)為原型劑之相對PTPase活性。第42圖係A. PRL-1、PRL_2與PRL-3於不同量之噴他勝 (pentamidine)存在下之相對PTPase活性。B. PRL-1、prl-2 23 200803835 與PRL-3於不同量之酮康嗤（ketoconazole)存在下之相對 PTPase活性。C· SHP-1於喷他脒與酮康唑存在下之相對 PTPase活性。第43圖顯示WM9細胞於噴他脒(A)或酮康唑(B)之單一 5 劑量或結合IFNot存在下培養6天之生長抑制百分比。【實施方式3 較佳實施例之詳細說明本文中，下列縮寫具備以下意義：本文中” AML"意指急性骨髓性白血病； 1〇本文中’’ATRA”意指全反式維甲酸；本文中’’GM-CSF”意指粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子；本文中” IFNa”意指干擾素a ; 本文中"IFNP”意指干擾素β ; 15 本文中’’ΙΡΝβ”意指干擾素γ; 本文中"IL-2”意指介白素_2 ; 本文中"IL-3”意指介白素-3 ; 本文中’’Jak2”意指janus家族激酶2 ; 本文中"M0f’意指巨噬細胞； 20 本文中"NBT”意指氣化硝基四氮唑藍；本文中"PTPase"意指蛋白質酪胺酸磷酸酶；本文中"PTK”意指蛋白質酪胺酸激酶；本文中"RCC"意指腎細胞癌；本文中"SH2"意指Src-同源2區塊； 24 200803835 本文中nSHP-r意指Src_同源蛋白質酪胺酸磷酸酶；本文中"Statl"意指信號轉導和轉錄激活因子1 ; 本文中”Stat5n意指信號轉導和轉錄激活因子5 ; 本文中SS思指匍萄糖酸録納；以及 5 本文中τ細胞活化劑”意指一物質、分子或組成物可有效引發本文所揭示之T細胞效應細胞功能，包括活化腫瘤浸潤巨噬細胞。本文係揭示用於抑制PTPase活性之組成物與方法。本發明人罵#地發現用於治療利什曼病（leishmaniasis)之藥 10物’係有效的蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑，可用於治療蛋白質酪胺酸磷酸酶異常活化有關之疾病，或其他有關蛋白質酪胺酸磷酸酶活性之疾病如癌症。受治療對象可包括，但不侷限於，動物，包括人類。本文中利什曼病藥劑一詞可與”治療利什曼病之有效化合物，，互用。治療利什曼病之 15有效藥物類型包括，但不侷限於，五價銻化合物(pentavalent antimonial)、味唾(imidaz〇le)化合物與聯肺⑼㈣沾㈣化合物。此外，並非利什曼病藥劑之五價銻化合物、咪唑化合物與聯脒化合物，亦可用於抑制PTPase活性。一治療利什曼病有效藥劑之回顧文獻可發現於Steck，Prog. Drug. Res. 2〇 18, 289 (1974)。利什曼病藥劑或治療利什曼病之有效化合物一詞，可包括目前於臨床上與/或實驗上用於治療利什曼病之藥物或化合物，並為熟習此技術領域者所知。用於治療利什曼病之有效藥物之某些特殊範例包括，但不偈紐下歹】化合物·女樂普諾錠（allopurinol)(例如，Giax〇 25 200803835

Wellcome/Glaxo Smith Kline之萊諾利（Zyloric.RTM·)、Saval 之塔洛(TaloLRTM·)、萊諾普（Zyloprim.RTM·))、巴龍黴素 (aminosidine)(例如，卡普歐黴素(Gabbriomycin.RTM·))、兩性黴素/兩性黴素B (amphotericine/amphotericine B)(例如， 5 方基龍(Fungizone.RTM·)、安比松(Ambisome.RTM.)、安普辛（Amphocin.RTM.)、安弗西（Amphocil.RTM·)、安貝利 (Abelect.RTM·))、干擾素（例如，安替敏 (Actimmune.RTM·))、伊曲康唑（ilraconazole)、酮康唑 (ketoconazole)(例如，尼羅拉（NizoraLRTM·))、左美素 10 (levamisole)(例如，雅各米（Ergamisol.RTM.))、銻酸曱葡胺 (meglumine antimonate)或銻酸葡胺(glucatime)(例如，古卡美（Glucatime.RTM·)、古卡亭（Glucatim.RTM.))、滅特復星 (miltefosine)(烷基磷酸脂）、巴龍黴素(paroni〇mycin)、安美西亭（aminosidine)(例如，胡馬亭(Humatin.RTM·))、戊烷脒 15 (pentamidine isothionate或isthionate pentamidine)(例如，尼布班（NebuPent.RTM·)、潘卡那（Pentacarinat.RTM.)、潘塔 (Pentam.RTM·))、喷他脒（pentamidine)(例如，Rhone_Poulene， May & Baker 之羅米錠（Lomidine.RTM·))、西他馬啥 (sitamaquine)/WR6026 (8-胺基喹啉）與葡萄糖酸銻鈉 20 (sodium stibogluconate)(例如，Glaxo Wellcome之潘士丹 (Pentostam.RTM·))。上述之任何化合物若有所忽略，不可被視為排除於利什曼病藥劑一詞範疇之外。利什曼病藥劑一詞亦包括尚未被發現之有效治療利什曼病之藥物與化合物，其於未來可能被發現有效。 26 200803835 本文所描述之組成物與方法意指包括藥物、藥物種類及其生物性等效物，其於未來可能被發現有助於治療利什曼病者。此外，本文所描述之組成物與方法意指包括藥物、藥物種類及其生物性等效物，其於未來可能被衍生或發展 5成有助於治療利什曼病之藥物。治療利什曼病之有效藥物已被發現可引發細胞變化，如影響細胞内蛋白質酪胺酸磷酸酶之恆定並重新導引訊息傳遞。雖然可斷言治療利什曼病之藥物為有效的PTPase抑制劑，但本發明並不侷限在這瞻些有效治療利什曼病之藥物，而是涵蓋其他種類化合物(例 10如，五價銻化合物、咪唑化合物與聯咪化合物）。五價銻化合物包括，但不侷限於，化合物如銻酸甲葡胺(銻酸葡胺）、銻聚葡萄糖苷、銻甘露聚醣、乙基有機銻 (ethyl stibanme)、脲基有機銻(urea stibanine)與葡萄糖酸銻納。五價銻化合物已知為有效的PTPas_制齊卜五價錄化 I5合物含有Sb(V)。舉例而言，葡萄糖酸銻鈉係处⑺與葡萄糖酸之錯合物，且銻酸甲葡胺係訃(¥)與11•甲基葡胺之錯 • 合物。葡萄糖酸銻鈉與銻酸甲葡胺的結構並未完全確認，口為這二、、且成物$以《合物形式存在。葡萄糖酸錄鈉與錄酸甲葡胺之假設結構分別如第认與第m圖所示。葡萄糖酸 2〇 _驗利什曼病之治療已有數十年…種原蟲類寄生蟲侵入巨仙胞所造成的疾病。雖然其藥理學機制尚不清楚，但研究顯示其藥物治療效用可能藉由細胞内標的物：其可殺死蚋細胞内的利什曼蟲，但不影響自由存在於立腸内的原蟲(鞭毛體），其可於體外培養基畴活。㈣糖酸錄 27 200803835 鈉（sodium stibogluconate)亦可稱為葡萄糖酸銻鈉（s〇dium antimony gluconate)、銻酸鹽（Stibanate)、戴巴涅（Dibanatc)、斯銻黑克（Stihek)、索士單（Solustibostam)、索士拉美 (Solynsurmin)與潘士丹(Pentostam.RTM·)。葡萄糖酸銻鈉之 5 合成方法為熟習此技術領域者所知。咪唑化合物與聯脒化合物亦被發現為有效之pTpase抑制劑。較特別的是，咪唑化合物與聯脒化合物左美素 (kvamisole)、酮康唑與喷他脒（pentamidine)被證實為有效之PTPase抑制劑，但此類型中之其他化合物亦可使用。左 10美素、酮康唑與喷他脒係已知構造之有機化合物，過去都用於治療利什曼病。左美素、酮康唾與喷他脎之結構分別如第2A、第2B與第2C圖所示。本發明之一實施例係提供一治療組成物以治療癌症，包含抗癌試劑。抗癌試劑係一試劑可有效治療癌症。抗癌 15試劑可選自於下列各類化合物：五價銻化合物、嗦唑化合物與聯脒化合物。該抗癌化合物可為任何此類化合物已知存在者，或未來會發現者之生物性等效物。治療組成物中之五價銻化合物可包括，但不侷限於，葡萄糖酸銻鈉、銻酸甲葡胺，或其生物等效物。治療組成物中之咪唑化合物 2〇可包括，但不侷限於，酮康唑、左美素或其生物等效物。治療組成物中之聯脒化合物可包括，但不侷限於，喷他脒或其生物等效物。該抗癌試劑可為PTPase抑制劑。可治療之癌症可包括，但不侷限於，淋巴癌、多發性骨髓瘤、白血症、黑色素細胞瘤、前列腺癌、乳癌、腎臟癌、膀脱癌。 28 200803835

10 該治療組成物可料治療_症病患。其包含^例係提供—治療組成物以治療癌症，户療利什二扃樂劑。術語利什曼病藥劑係包含目前用於可右Γΐ利什曼病_亦包含藥物與化合物，其尚未發現效治療利什曼病，但未來可能會發現有效者。利什惡病藥劑可落於下列_:五價銻化合物、料化合物與ς 脉化合物’但不侷限於此。利什曼病藥劑之範例包括，但不偈限於樂普諾錠、巴龍黴素、兩性黴素/兩性黴素Β、干擾素、伊曲康吐、酉同康唾、左美素、錄酸甲葡胺、滅特復星、巴龍黴素、戊烧腓、噴他脒、西他馬喧/WR6026、葡萄糖酸銻鈉與這些化合物的生物性等效物。可治療之癌 15 症包括，但不侷限於，淋巴癌、多發性賴瘤、血癌、黑色素細胞瘤、前列腺癌、乳癌、腎臟癌與膀胱癌。治療組成物可用於治療多重癌症病患。治療組成物可包含利什曼病樂劑之混合物與組合物。

20 本發明之另一實施例係提供一治療組成物以治療癌症，包含有葡萄糖酸銻鈉或其生物性等效物。可治療之癌症包括，但不侷限於，淋巴癌、多發性骨髓瘤、血癌、黑色素細胞瘤、前列腺癌、乳癌、腎臟癌與膀胱癌。治療組成物可用於治療多重癌症病患。本發明之另一實施例係提供一治療組成物以治療細胞激素(細胞激素)有關之疾病，其中包含有細胞激素與PTPase 抑制劑。許多疾病包括，但不侷限於，感染性疾病、與pTPase 29 200803835 活性相關之疾病、免疫缺乏症、癌症、感染、病毒感染、多發性硬化症、B型肝炎與c型肝炎，均以細胞激素進行治療。以PTPase抑制劑結合細胞激素可有效改善細胞激素本身之效用。PTPase可干擾共投予之細胞激素，使其失效。 5藉由抑制干擾共投予細胞激素之PTPase，可增進細胞激素之活性。PTPase抑制劑可選自於下列各類化合物：五價銻化β物、味唾化合物與聯味化合物。pTpase抑制劑可為任何此類化合物已知存在者，或未來會發現者之生物性等效物。治療組成物中之五價銻包括.，但不侷限於，葡萄糖酸 10銻鈉、銻酸甲葡胺及這些化合物之生物性等效物。治療組成物中之咪唑化合物包括，但不侷限於，酮康唑、左美素與這些化合物之生物性等效物。治療組成物中之聯咪化合物包括，但不侷限於，喷他脒及生物性等效物。治療組成物可包括這些化合物之混合物或組合物。細胞激素之範例 15包括，但不侷限於，干擾素α、干擾素β、干擾素γ與顆粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子。本發明之另一實施例係提供一治療組成物以治療細胞激素有關之疾病，其中包含有細胞激素與利什曼病藥劑。 2 許多疾病包括，但不侷限於，感染性疾病、與PTPase活性 20相關之疾病、免疫缺乏症、癌症、感染、病毒感染、多發性硬化症、B型肝炎與c型肝炎，均以細胞激素進行治療。利什哭病藥劑可為，但不侷限於，下列各類化合物：五價 δ物米唾化合物與聯味化合物。利什曼病藥劑可為任何此類化合物已知存在者，或未來會發現者之生物性等 30 200803835 效物。利什曼病藥劑之範例包括，但不侷限於，安樂普諾錠、巴龍黴素、兩性黴素/兩性黴素B、干擾素、伊曲康嗤、酮康唑、左美素、銻酸甲葡胺、滅特復星、巴龍黴素、戊烧脒、噴他脒、西他馬啥/WR6026、葡萄糖酸銻納與這些 5化合物的生物性等效物。治療組成物可包含這些化合物的 ^合物與組合物。細胞激素之範例包括，但不侷限於，干擾素α、干擾素β、干擾素γ與顆粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子。本發明之另一實施例係提供一方法以治療癌症，包含 10有彳又予病患一有效Ϊ之抗癌試劑。抗癌試劑係選自於下列種類之一·五價銻化合物、咪唾化合物與聯腓化合物。抗癌試劑可為任何此類化合物已知存在者，或未來會發現者之生物性等效物。抗癌試劑可包含這些化合物的混合物與組合物。治療組成物中之五價銻包括，但不侷限於，葡萄 15糖酸銻鈉、銻酸甲葡胺及這些化合物之生物性等效物。治療組成物中之咪唑化合物包括，但不侷限於，酮康唑、左美素與這些化合物之生物性等效物^治療組成物中之聯咪化合物包括，但不侷限於，噴他脒及生物性等效物。抗癌試劑可為PTpase抑制劑。可治療之癌症包括，但不侷限於， 2〇淋巴癌、多發性骨髓瘤、金癌、黑色素細胞瘤、前列腺癌、乳癌、賢臟癌與膀脱癌。冬方法可用於治療多重癌症病患。本發明之另一實施例係提供一方法以治療癌症，包含有扠予病患一有效量之利什曼病藥劑。利什曼病藥劑可為，但不揭限於，下列化合物：五價録化合物、味唾化合 31 200803835 5 10 15 20 ^聯味化合物。利什曼病_之範例包括，但不偈限於，安樂普諾錠、巴龍黴素、兩性黴素/兩性黴素B、干擾素、二曲康唑、酮康唑、左美素、銻酸甲葡胺、滅特復星、巴龍黴素、戊絲、噴⑽、西他馬唾舰嶋、葡萄糖酸 =鈉與這些化合物的生物性等效物。可治療之癌症包括， ^不=限於’淋巴癌、多發性骨髓瘤、血癌、黑色素細胞 =、前列腺癌、乳癌、腎臟癌與膀胱癌。治療組成物可包含利什曼病藥劑的混合物與組合物。凡本發明之另—實施例係提供—方法以祕癌症，包含有=予病患—有效量之葡萄糖酸銻鈉或其生物性等效物。可治療之癌症包括，但不侷限於，淋巴癌、多發性骨髓瘤、 ::、黑色素細胞瘤、前列腺癌、乳癌、腎臟癌與膀胱癌。本方法可用於治療多重癌症病患。货昍之另 M 貝係誕仏一方法以治療細胞激素有 ΡΤ=Γ,，Γ包含有投予病患—有效量之細胞激素與 ase (^制劑。疾病包括，但不侷限 ρ::，關之疾病―、二:感病: 感^、多發性硬化症、B型肝炎與c型肝炎，均可利用= 價=rpTpase抑制劑可選自於下列各類化 =勿，化合物與《化合物 :可已知之此類或未來發現之化合物的生物療組成物中之五_可包括，但^限於 ^録 :中録酸甲—物之⑽㈣。1= 之一坐化合物包括，但不侷限於，酮康唾、左美素與 32 200803835 這些化e物之生物性等效物。治療組成物中之聯味化合物包括，但不侷限於，噴他肢生物性等效物。治療組成物可包§這二化&物的混合物與組合物。細胞激素之範例包括，但不偈限於，干擾素α、干擾素Ρ、干擾素γ與顆粒細胞 5 /巨嗔細胞集落刺激因子。本發明之另一實施例係提供一方法以治療細胞激素有關之疾病，其中包含有投予病患一有效量之細胞激素與利什曼病藥劑。疾病包括，但不侷限於，感染性疾病、與ρ τ ρ & $ e 活性相關之疾病、免疫缺乏症、癌症、感染、病毒感染、 10多發性硬化症、6型肝炎與c型肝炎，均可利用本方法進行 …療。利什曼病藥劑可為，但不侷限於，下列化合物：五、、弟化a物、咪哇化合物與聯咪化合物。利什曼病藥劑可為任何已知之此類或未來發現之化合物的生物性等效物。本發明方法所使用之利什曼病藥劑之範例包括，但不侷限於，安樂普諾錠、巴龍黴素、兩性黴素/兩性黴素B、干擾素、伊曲康唑、酮康唑、左美素、銻酸甲葡胺、滅特復星、巴龍黴素、戊烷脒、喷他脒、西他馬喹/WR6〇26、葡萄糖酸銻鈉與這些化合物的生物性等效物。治療組成物可包含這些化合物的混合物與組合物。細胞激素之範例包括，但 2〇不侷限於，干擾素α、干擾素β、干擾素γ與顆粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子。本發明之另一實施例係提供一方法以治療細胞激素有關之疾病，其中包含有投予病患一有效量之葡萄糖酸銻鈉或其生物性等效物，及細胞激素。本發明方法所治療之疾 33 200803835 病可包括，但不侷限於《，感朱性疾病、與PTPase活性相關 =丙」文缺乏症、癌症、感染、病毒感染、多發性硬 =可：物C型肝炎，均可利用本方法進行治療。本。於/σ療夕重病症病患。細胞激素之範例包括，但二限於’干擾素α、干擾素Ρ、干擾素γ與顆粒細胞/巨嗤細胞集落刺激因子。本發明之另一實施例係關於分離一化合物，包含有一化口物之混合物。在上述任何實施例中若方法中所提供 ^吏用之化合物包含有-化合物之混合物，則混合物可經 1〇 2離且-或更多分離物可被排除。混合物中之化合物可包含：不同分子量之化合物(例如，聚合物）、構形物、鏡像異構物異構物、類似物、衍生物、未反應前驅物、其他產物、中間物或分解產物。舉例而言，葡萄糖酸録納以多重 ♦。物形式存在，其分子量由1〇〇至4,〇〇〇 amu。利用層析法 15或其他適當方法分離葡萄糖酸銻鈉原始混合物，可產生具備不同PTPase抑制活性之分離物。排除較低或無PTPase抑制/舌f生之分離物，可加強整體溶液之PTpase抑制活性。此外’當最終混合物中具備較低分子物種時，原始混合物之分解或其他產物或成分有關之毒性可降低。 20 本發明之另一實施例係提供一方法以治療與受質磷酸化作用有關之疾病，包含有篩選病變細胞中PRL磷酸酶及突變種之存在。在某些情況下，僅決定某種存在病變細胞中之磷酸酶類型，可能無法提供足夠的資訊以篩選有效的填酸酶抑制劑。舉例而言，若磷酸酶突變，則可能對於某 200803835 種特定的未突變磷酸酶抑制劑產生抵抗力。舉例而言，若以半胱胺酸（cysteine)取代PRL-1 86位置之精胺酸 (arginine)，則酵素對於葡萄糖酸銻鈉的抑制作用抵抗力明顯下降。若病變細胞出現突變種磷酸酶且具有抵抗力，則 5上述犬變情況對於疾病的治療可能很重要。因此，本發明實施例提供一種篩選方法，決定是否一經突變pRL磷酸酶存在於病變細胞内。一步驟包含有篩選病變細胞樣本，以決定是否細胞内含有PRL磷酸酶。另一步驟包含有篩選pRL 磷酸酶上可抵抗PRL磷酸酶抑制劑之突變。另一步驟包含 10 有技予病患一治療有效量之PRLi粦酸酶抑制劑。若prl鱗酸 S#發現為突變種，則所選用對抗疾病之Prl磷酸酶抑制劑不同於非突變之PRL鱗酸酶。這些步驟可以任何順序進行。本發明提供一套組，含有進行本實施例方法配備。套組配備可決定是否樣本含有PRL磷酸酶，其為熟習此技術 15領域者所知。套組配備可決定是否PRL磷酸酶含有一或更多犬變’其為熟習此技術領域者所知。本發明之另一實施例係提供一治療組成物以治療癌症，包含有一PTPase抑制劑與一T-細胞活化劑。T-細胞活化劑係任何有效導致，直接或間接，T細胞執行其效應細胞功 20 能’包括誘發腫瘤浸潤型巨嗟細胞之試劑。T細胞活化劑與 τ細胞效應細胞功能為熟習此技術領域者所知，並揭示於 Abbas專人 ’ Cellular and Molecular Immunology，4.sup.th Ed. 2000與Janeway等人，Immunology，5.sup.th Ed· 2001。T細胞活化劑可為蛋白、胜肽與有機或無機分子。舉例而言， 35 200803835 雙磷酸鹽類與磷酸抗原為熟習此技術領域者所知之有效τ 細胞活化劑。若τ細胞活化劑為蛋白或胜肽，則本發明包含其功能變形物。如本文所指，胜肽Τ細胞活化劑之，，功能變形物，，或”變形物”，係指一胜肽，其於Τ細胞活化劑胜肽之 5 一級胺基酸序列上含有一或更多之修飾，而保有原始蛋白或胜肽Τ細胞活化劑之免疫調節功效。若τ細胞活化劑胜肽之功能變形物具備胺基酸取代，則保留性胺基酸取代反應為車父佳，亦即取代反應仍維持原始胺基酸特性如帶電性、疏水性、構形等。胺基酸保留取代之範例包括下列各類胺 10 基酸之取代：⑴ Μ，I，L，V ; (2) F，Y，W ; (3) K, R，Η ; (4) Α， G，（5) S，T ’（6) Q，Ν，（7) E，D。以變形物胜肽τ細胞活化劑激活T細胞，顯示此變形物胜肽為功能性變形物。在一實施例中，T細胞活化劑為IL-2及其功能性變形物。IL_2係一蛋白/胜肽T細胞活化劑，其為熟習此技術領域者所知

°FDA 15所許可的IL-2配方，例如細胞激素前驅物(pr〇leukin)(chi㈣可由商業上麟。必須理解的是，本文所有的實施例中，τ 細胞活化劑代表包含IL-2，但並不侷限於IL_2。pTpase抑制劑係選自於以下類型之化合物：五價録化合物、味唾化合物或聯雜合物。PTPase_#l可縣何已知存在之此類 20或未來發現之任何化合物之生物性等效物。治療組成物可包含這些化合物的混合物或组合物。治療組成物中之五價銻括不侷限於，葡萄糖酸錄納、錄酸甲葡胺及這些化合物之生物性等效物。治療組成物中之咪唑化合物包括’但不偈限於’酉同唐σ生、、， <、左吴素與這些化合物之生物性 36 200803835 病患等效物。治療組成物中之聯職合物包括，但喷他肺及生物性等效物。可治療之癌症包括，但不偈限於’ 淋巴癌、多發性骨髓瘤、血癌、黑色素細胞瘤、前列腺痕乳癌、腎臟癌與膀胱癌。治療組成物可_療多=症本發明之另_實_係提供—治練成物以治症，包含有-利什曼病藥劑與一 τ'細胞活化劑。利恩= ^卜财“目前純床上與虹詩治療^ • &病之藥物與化合物。利什曼病藥劑-詞亦可包括尚未有政用於冶療利什曼病之藥物與化合物，但未來也許有效。 =什曼病_包括，但不侷限於，以下_之化合物：五 ^貝銻化σ物、咪唾化合物或聯脉化合物。利什曼病藥劑之靶例包括，但不侷限於，安樂普諾旋、巴龍徽素、兩性徽 ^素/兩性黴素Β、干擾素、伊曲康唾、酮康唾、左美素、錄酉文甲葡胺、滅特復星、巴龍黴素、戊㈣、喷他脉、西他馬喹/WR6026、葡萄糖酸銻鈉與這些化合物的生物性等效 ® 物。可治療之癌症包括，但不侷限於，淋巴癌、多發性骨叙瘤、血癌、黑色素細胞瘤、前列腺癌、乳癌、腎臟癌與膀胱癌。治療組成物可用於治療多重癌症病患。治療組成 2〇物可包含利什曼病藥劑之混合物或組合物。本發明之另一實施例係提供一治療組成物以治療癌症’包含有葡萄糖酸銻鈉或其生物性等效物，及一τ_細胞活化劑。可治療之癌症包括，但不侷限於，淋巴癌、多發性骨髓瘤、血癌、黑色素細胞瘤、前列腺癌、乳癌、腎臟 37 200803835 癌與膀胱癌。治療組成物可用於治療多重癌症病患。本發明之另一實施例係提供一治療組成物以治療細胞 /放素有關之疾病，其中包含有τ_細胞活化劑與抑制 °午夕疾病包括，但不侷限於，感染性疾病、與pTpase /舌f生相關之疾病、免疫缺乏症、癌症、感染、病毒感染、夕么1*生硬化症、B型肝炎與c型肝炎，係以細胞激素進行治療，亚可以本發明之組成物治療。以PTPase抑制劑結合孓、、’田胞活化劑，可有效改善τ_細胞活化劑本身之效用並明顯降低毒性。PTPase抑制劑可選自於下列各類化合物：五價弟a物咪唾化合物與聯脉化合物。PTPase抑制劑可為任何已知之此類或未來發現之化合物的生物性等效物。治療、、、成物中之五價銻包括’但不侷限於，葡萄糖酸銻鈉、錄酸甲葡胺及這些化合物之生物性等效物。治療組成物中之口米唾化合物可包括，但不侷限於，綱康唾、左美素與這 15 一化〇物之生物性等效物。治療組成物中之聯脒化合可包不侷限於，噴㈣及生物性等效物。治療組成物可已各k些化合物之混合物或組合物。細胞激素之範例包括’但不偈限於，干擾素α、干擾素P、干擾素γ與顆粒細胞 /巨噬細胞集落刺激因子。林明之另-實施例係提供_治療組成物以治療細胞 =素有=之疾病，其中包含有利什曼病藥劑與了_細胞活化 Λ 疾病包括，但不侷限於，感染性疾病、與PTpase 相關之疾病、免疫缺乏症、癌症、感染、病毒感染、多發性硬化症、B型肝炎與c型肝炎，仙細胞激素進行治 38 200803835 療χ可以本务明之組成物治療。利什曼病藥劑可為，但不侷限於，下列各類化合物：五價錄化合物、味唾化合物錢脉化合物。利什曼病藥劑可為任何已知之此類或未來之化合物的生物性等效物。利什曼病義之範例包 • 5 ^ ’但*侷限於，安樂普諾錠、巴龍黴素、兩性黴素麻《1素B干擾素、伊曲康唾、綱康唾、左美素、録酸甲葡胺、滅特復生、巴龍黴素、戊烷脒、噴他脒、西他馬喹/wR6〇26、匍萄糖酸錦鈉與這些化合物的生物性等效物。治療組成物 _ 彳包含這些化合物的混合物與組合物。細胞激素之範例包 1〇括，但不侷限於，干擾素α、干擾素β、干擾素γ與顆粒細胞 /巨噬細胞集落刺激因子。本發明之另一實施例係提供一治療組成物以治療細胞激素有關之疾病，包含有葡萄糖酸銻鈉或其生物性等效物’及一Τ-細胞活化劑。可治療之疾病包括，但不侷限於， 15 感染性疾病、與PTPase活性相關之疾病、免疫缺乏症、癌 — 症、感染、病毒感染、多發性硬化症、B型肝炎與C型肝炎。 ♦ 治療組成物可用於治療多重癌症病患。所使用之T_細胞活化劑較佳為誘發腫瘤浸潤型巨噬細胞。在一較佳之實施例中’ Τ_細胞活化劑係IL-2。 20 本發明之另一實施例係提供一方法以治療癌症，包含有投予病患一有效量之抗癌試劑與一Τ-細胞活化劑。抗癌試劑係選自於下列種類之一：五價銻化合物、咪唑化合物與聯脒化合物。抗癌試劑可為任何已知之此類或未來發現之化合物的生物性等效物。抗癌試劑可包含這些化合物的 39 200803835 混合物與組合物。治療組成物中之五價銻可包括，但不侷限於，葡萄糖酸錄鈉、銻酸甲葡胺及這些化合物之生物性專效物。/α療組成物中之味0坐化合物可包括，但不侷限於，酮康吐、左美素與這些化合物之生物性等效物。治療組成 5物中之聯脒化合物包括，但不侷限於，噴他脒及生物性等效物。抗癌試劑可為PTPase抑制劑。在一實施例中，孓細胞活化劑係IL-2，及其功能變形物。可治療之癌症包括，但不侷限於，淋巴癌、多發性骨髓瘤、血癌、黑色素細胞瘤、前列腺癌、乳癌、腎臟癌與膀胱癌。本方法可用於治 10療多重癌症病患。本發明之另一實施例係提供一方法以治療癌症，包含有才又予病患一有效量之利什曼病藥劑與一T·細胞活化劑。利什曼病藥劑包括，但不侷限於，以下種類之化合物：五價錄化合物、咪唑化合物或聯脒化合物。利什曼病藥劑之 15範例包括，但不侷限於，安樂普諾錠、巴龍黴素、兩性黴素/兩性黴素B、干擾素、伊曲康0坐、酮康唾、左美素、銻酸甲葡胺、滅特復星、巴龍黴素、戊烷脒、噴他脒、西他馬啥AVR6026 '葡萄糖酸銻鈉與這些化合物的生物性等效物。在一實施例中，T-細胞活化劑係IL-2,及其功能變形物。可冶療之癌症包括，但不侷限於，淋巴癌、多發性骨髓瘤、血癌、黑色素細胞瘤、前列腺癌、乳癌、腎臟癌與膀胱癌。本方去可用於治療多重癌症病患。治療組成物可包含利什八病樂劑之混合物或組合物。本發明之另一實施例係提供一方法以治療癌症，包含 40 200803835 :投予病患-有效量之葡萄糖及一τ'細航化劑。可治療物W效物，巴癌、多發性骨髓瘤、血癌·、黑二二不：限於’淋乳癌、腎臟癌與膀胱癌。在w列腺癌、 5 10 15 ΤΤ，只知例中，Τ-細廉、、去士太及其功能變形物。本方法可用於治療c 關之疾病，包含有投予病患胞激素有 PTPase抑制劑。可 '里、、、田胞活化劑與 1 口療之疾病包括，但不偈限於疾病、與ΡΤΜ活性相關之疾病、免疫缺乏症if :本=感染、多發性硬化症，肝炎 =γγγτ-細胞活化劑較佳為誘發腫瘤浸潤 ^ 、、、田胞。在一實施例中，Τ'細胞活化劑係IL—2，及其工此欠形物。PTPase抑制劑可選自於下列各類化合物··五俨銻化合物、料化合物與聯職合物。pTPase抑制劑可=

{何已知之此類或未來發現之化合物的生物性等效物。I 療組成物中之五價銻包括，但不侷限於，葡萄糖酸銻鈉、銻酸甲葡胺及這些化合物之生物性等效物。治療組成物中之咪唑化合物包括，但不侷限於，酮康唑、左美素與這此化合物之生物性等效物。治療組成物中之聯脒化合物包括，但不侷限於，噴他脒及生物性等效物。治療組成物可包έ這些化合物的混合物或組合物。細胞激素之範例包括’但不侷限於，干擾素α、干擾素β、干擾素γ與顆粒細胞 /巨喔細胞集落刺激因子。。本發明之另一實施例係提供一方法以治療細胞激素有 20 200803835 關之赫，包含有投予病患一有效量之τ'細胞活化劑與利什交病藥劑。可治療之疾病包括，但不偈限於，感染性疾病、與PTPase活性相關之疾病：免疫缺乏症、癌症、感染病毒感染、多發性硬化症、_肝炎與c型肝炎，均可以本 5發明之方法治療。在-較佳之實施例中，τ•細胞活化劑係 IL_2,及其功能變形物。利什曼病藥劑可為，但不偈限於，下列各類化合物：五價銻化合物、哺峻化合物與聯脉化合物利什叉病藥劑可為任何已知之此類或未來發現之化合物的生物性等效物。利什曼病藥劑之範例包括，但不舰 10於，安樂普諾錠、巴龍黴素、兩性黴素/兩性黴素B、干擾素、伊曲康唑、酮康唑、左美素、銻酸甲葡胺、滅特復星、巴龍黴素、戊烷脒、噴他脒、西他馬喹/WR6〇26、葡萄糖酉义録鈉與這些化合物的生物性等效物。治療組成物可包含這些化合物的混合物與組合物。 15 本發明之另一實施例係提供一方法以治療細胞激素有關之疾病，包含有投予病患一有效量之葡萄糖酸銻鈉或其生物性等效物，及一τ_細胞活化劑。可治療之疾病包括，但不侷限於，感染性疾病、與PTPase活性相關之疾病、免疫缺乏症、癌症、感染、病毒感染、多發性硬化症、B型肝 20炎與c型肝炎。本方法可用於治療多重癌症病患。所使用之 T-細胞活化劑可為，但不侷限於，IL_2及其功能變形物。本發明之另一實施例係關於分離一化合物，包含化合物之混合物。在上述任何實施例中，若方法中所提供或使用之化合物包含有一化合物之混合物，則混合物可經分 42 200803835 離’且一或更多分離物可被排除。混合物中之化合物可包含不同分子量之化合物(例如，聚合物）、構形物、鏡像異構物、異構物、類似物、衍生物、未反應前驅物、其他產物、中間物或分解產物。舉例而言，葡萄糖酸銻鈉以多重聚合 5物形式存在，其分子量由100至4,000 amu。利用層析法或其他適當方法分離葡萄糖酸銻鈉原始混合物，可產生具備不同PTPase抑制活性之分離物。排除較低或無pTPase抑制活欧之刀離物可加強整體溶液之PTPase抑制活性。此外，當最終混合物中具備較低分子物種時，原始混合物之分解或 1〇其他產物或成分有關之毒性可降低。本發明之另一實施例係提供一方法以降低IL-2毒性，包含有投予一個體任何前述實施例之pTPase抑制劑，及 IL-2或其功能變形物。本方法之另一實施例包含有投予il_2 治療之個體PTPase抑制劑。本方法之另一實施例係提供一增加IL-2療效之方法，包含有投予一個體任何前述實施例之PTPase抑制劑，及虬_2或其功能變形物。本方法之另一實施例包含投予PTPase抑制劑至正在進行IL_2治療之個體。上述之本發明實施例係提供組成物與方法，以預防與 2〇治療蛋白質赂胺酸活性或其異常活性有關之疾病。”預防” 具有保護之意，係針對特定或複數個疾病。，，治療，，意謂舒緩疾病本身，並預防病情加劇。本方法包含投予一足夠量之PTPase抑制齊卜以進行個體之預防或治療。本文所揭示之蕖物u括所有生物性等效物（亦即，藥學上可接受鹽類、 43 200803835 前驅物、衍生物與鹼類形式）。本文中，，混合，，一詞係指混合受質與協同劑·· i)投藥前(“體外混合”）、2)同時與/或連續混合，但文質與協同劑(血管形成生長因子）分開投藥（亦即，靜脈注射管路分開）以進行，，體内混合”。 5 較佳之情況為，投予病患之藥物係本發明所揭示化合物之生物性等效物，其可有效抑制蛋白質酪胺酸磷酸酶。生物性等效物係本發明所揭示化合物之藥學上可接受類似物、前驅物、衍生物與藥學上可接受鹽類。其中，熟習此技術領域者所知之一前驅物，亦可視為前藥，可於給藥部 10位處或附近被轉化為具活性之藥物形式。本發明所揭示之化合物，及其生物性等效物或藥學上可接文鹽類’可依據本發明方法之任何途徑給藥。適合之給藥途徑包括全身性，例如口服或注射、局部、眼内、眼周圍、結膜底部、視網膜底部、脈絡膜前與眼球後。給藥 15途徑可部分依據是否為治療或預防用途。熟習此技術領域者應瞭解到，適用於進行上述實施例中所不治療組成物之投藥方法皆為可取得。雖然特定治療組成物之給樂途控不只一種，但經常只有一種特定途徑可提供更即時且有效的作用。因此，本發明所述之給藥途徑 20 僅作為範例且不設限。依據本發明所投予之特定劑量於一動物，尤其是指人類，應足以於合理時間内有效影響預定之反應。本發明所揭示之治療組成物可投予不同個體，但不侷限於動物，包括哺乳類動物，其中包括人類。其中，熟習此技術領域者 44 200803835 可知投劑量取決於許多因素，包括所採用特殊治療組成物之強度、年齡、物種、狀態或病況，以及動物體重。劑量大小亦取決於給藥途徑、時間與頻率，以及任何不良副作用之存在、本質與程度，其可伴隨特定治療組成物給藥與 5所欲生理反應的出現。熟習此技術領域者可知，不同病情或病況’尤其是慢性病情或病況，可能需要長期治療並進行多次給藥。適用之劑置與藥劑處方，可由熟習此技術領域者所知 • t範圍镇測技術決定。-般而，治療始於較小劑量，.其 1〇低於化合物理想劑量。接著，劑量採取小量增加方式直到達成理想功效。可使用任何適用技術進行給藥，包括，但不侷限於，皮下/、非腸月給藥。皮下給藥之範例包括靜脈注射、動脈 /射/、腹主射。劑量與藥劑處方主要取決於投予之治療 15 20 組成物是否為治療或預防之用、分開或混合、生物性傷害

與伯主之種類、说：t、产rK 、伤芏病史，以及抑制劑或生物活性試劑之種a 須有效_強治、療指標。人類之治療時間

Ulx j w與大乳長’且時間長度等比於病程長度與藥物功效。劑量可為單-劑量或多劑量且維持數天。達到治療目的如本文巾所示，係指經處理宿主或病患出現病情或感染明顯改善，包枯彳匕栝但不侷限於改善存活率、復原更迅速與症狀改善或消降。& ^ — 自除右採取多重劑量，較佳之情況為，投藥頻率取決於，舉例而丄而5 ’宿主種類與癌症種類、投劑量等。臨床醫師可能月匕而要確涊何種給藥途徑與給藥頻率，對 45 200803835 於特定案例最為適用。前面所揭示實施例中適用之組成物，較佳之情況為，包含有/藥學上可接受載體，即所謂賦形劑，以及足以治療或預防特疋疾病之治療組成物量。載體可為任何常用者 5且僅限於化學-物理性考量，例如溶解度與缺乏與化合物之反應能力，以及給藥途徑。熟習此技術領域者可知，除了以下所述藥學上組成物以外，治療組成物可配製成聚合組成物、包容複合物，例如環糊精包容複合物、微脂體、微球體、微膠囊及其類似物(請見，例如美國專利4,997,652; 1〇 5，185，152;以及5,718,922，在此併入本案以作為參考資料）。治療組成物可配製成藥學上可接受酸式鹽。用於藥學上組成物之藥學上可接受酸式鹽之範例包括礦物酸衍生物，例如氫氯酸、氫漠酸、碟酸、偏魏、硝酸與硫酸，以及有機酸，例如酒石酸、醋酸、檸檬酸 '蘋果酸、乳酸、

後。舉例而言，皮質類固醇類，例如、以及前述治療組成物投藥之例如、潑尼松(prednisone)、 46 200803835 甲潑尼龍(methylprednisolone)、地塞米松(dexamethasone)，與三安隆乙醯替（triamcinalone acetinide)，與非皮質類固醇類抗發炎化合物，例如依布普洛芬(ibuprofen)或氟必普芬 (flubiproben)，可共同給藥。 5 下列範例與討論係用於進一步描繪前述分子與方法之用途與功能，並非用於侷限本發明申請專利範圍之範疇。範例 I.葡萄糖酸銻鈉係一有效之蛋白質酪胺酸碗酸酶抑制 1〇劑，可提高造血細胞株之反應利用體外磷酸酶分析法篩選化學試劑以確認SHP-1碟酸酶抑制劑。葡萄糖酸銻鈉係蛋白質酪胺酸磷酸酶，包括 SHP-1、SHP-2與PTP1B而非雙特異性磷酸酶MKP卜之有效體外抑制劑。體外SHP-1磷酸酶活性幾乎可完全被1〇 15 Mg/ml葡萄糖酸銻鈉抑制，此濃度係低於或等於利什曼病患的血清尖峰值。葡萄糖酸銻鈉之體内PTPase抑制活性，可因Baf3細胞内不同蛋白的酪胺酸磷酸化作用提升及造血生長因子IL-3所誘發之Baf3增生反應增加而得見。重要的是，匍萄糖酸録納可加強GM-CSF與IFNa對於TF-1細胞生長的 20 反效果，顯示本藥物在提升不同細胞激素訊息傳遞上的廣泛能力。 A.材料與方法 1.化學試劑蛋白質酪胺酸填酸酶分析套組與蛋白質酪胺酸磷酸酶 47 200803835 IB (PTP1B)之GST融合蛋白係購自 upstate Biotechnology Inc· (Lake Placid, Ν·Υ·)。蘇拉明（suramine)與酒石酸銻鉀係購自Sigma (St· Louis，Μο·)。葡萄糖酸銻鈉（其sb含量為1〇〇 pg/m卜並用於設計往後之葡萄糖酸銻鈉濃度)係受贈自Dr. 5 Xiaosu Hu (Sichuan Medical College，China)。SHP-1 (Yi 等人，Mol· Cell· Biol· 12，836 (1992))與SHP-2 (Frearson等人，Eur. J· Immunol· 26, 1539 (1996))之GST融合蛋白係依據Burshtyn等人，J· Biol· Chem· 272，13066 (1997)所建立之方法製備。SHP-1 cata之GST融合蛋白係純化自DH5a細 10 菌，並轉形一pGEX構築體，其含有鼠科SHP-1 PTPase催化區塊(胺基酸202至554)之密碼區，係利用鼠科SHP-1 cDNA 進行PCR反應而得。絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶1 (MKP1) 之GST融合蛋白係純化自DH5a細菌，並轉形一pGEX構築體，其含有MKP1密碼區，係取自cDNA並利用下列引子進 15 行RT-PCR反應： 1 (MKP 1/5，5’ctggatcctgcgggggctgctgcaggagcgc ; (SEQ ID NO : 1) MKP1/3，5’aagtcgacgcagcttggggaggtggtgat) (SEQ ID NO : 2)。鼠科IL-3 (Yang等人，Blood 91，3746 (1998))、重組人 20 類GM-CSF (Thomassen等人，Clin. Immunol· 95, 85 (2000)) 與重組人類IFNa (Uddin等人，Br· J· HaematoL 101，446 (1998))係如前面所述。酪胺酸磷酸化抗體(抗-ptyr，4G10， UBI)、β-肌動蛋白（Amersham，Arlington Heights，111·)、酿胺酸填酸化 Stat5 (New England BioLab Inc，Beverly，Mass·)與 48 200803835

Jak2 (Affinity BioReagents，Inc.，Golden，Colo·)係商業上購得。 2.體外蛋白質酪胺酸磷酸酶分析體外PTPase活性係利用購得之蛋白質酪胺酸磷酸酶分 5 析套組(UBI)，並依據熟習此技術領域者所知之步驟進行。此分析法係測量體外一合成酪胺酸鱗酸化胜肽 (Arg-Arg-Leu-Ile-Glu-Asp-Ala-Glu-pTyr-Ala-Ala-Arg-Gly) ，其中酪胺酸經去磷酸化(SEQ ID NO : 3)，之去磷酸化反應。簡言之，將0.01 pg GST/PTPase融合蛋白加入50 μΐ Tris 10 緩衝溶液中（lOmMTris，ρΗ7·4)，其含有不同濃度的抑制劑或化學物質（〇-1，〇〇〇 gg/ml)並於22°C反應10分鐘，接著加入0.2 mM酪胺酸磷酸化胜肽並於22°C繼續反應18小時。隨後加入100 μΐ孔雀綠溶液並反應5分鐘，並於5分鐘後以660 nm吸光值進行檢測。 15 欲評估PTPase抑制劑對於SHP-1抑制作用之可逆性，將 GST/SHP-1融合蛋白結合至麩胱甘肽微珠上，並於預靜置於4°C冰冷的Tris緩衝溶液，或含PTPase抑制劑之Tris緩衝溶液中30分鐘。隨後以微珠進行體外PTPase分析，或經Tris 緩衝溶液清洗3次後進行體外PTPase分析。 20 3·細胞、細胞培養與細胞增生分析鼠科造血細胞株Baf3係培養於RPMI 1640培養基，其中添加10%胎牛血清(FCS)與鼠科il-3 (20單位/ml)，並如前面 Damen等人，J· Biol· Chem· 270, 23402 (1995)所述。人類骨髓細胞株TF-1係培養於RPMI 1640,其中添加10%胎牛血清 49 200803835 (FCS)與40 ng/ml重組人類GM-CSF並如前面Thomassen等人，Clin· Immunol. 95, 85 (2000)所述。在細胞增生分析方面，細胞以10% FCS培養基清洗兩次，再懸浮於10% FCS培養基，並繼續於37°C培養16小時，隨後培養於37°C之10% 5 FCS培養基達3-6天，其中含有不同量之細胞激素、葡萄糖酸銻鈉與酒石酸銻鉀。增生分析之細胞數目以MTT分析法或顯微鏡細胞計數法測定。 4·誘發細胞蛋白質磷酸化及西方墨染法在葡萄糖酸銻鈉或過釩酸鈉誘發細胞蛋白質磷酸化方 10 面，Baf3細胞培養於37°c之0.1% FCS RPMI 1640培養基達 16小時。細胞隨後以RPMI 1640培養基清洗兩次，並於葡萄糖酸銻鈉或過釩酸鈉（0.1 mM)存在下培養不同時間點後，加入冰冷溶解緩衝溶液（50 mM Tris、pH 7.4 ; 150 mM NaCl ； 0.2 mM Na3V04 ； 20 mm NaF ； 1% NP40 ； 2 mM 15 PMSF; 20 pg/ml對牛蛋白（Aprotinin)與1 mM鋇酸鈉）進行細胞溶解。欲瞭解葡萄糖酸銻鈉或酒石酸銻鉀對於IL-3_誘發 Jak/Stat磷酸化作用之影響，Baf3細胞移除生長因子16小時，並培養於0.1% FCS RPMI 1640培養基，隨後培養或不培養於葡萄糖酸銻鈉或酒石酸銻鉀10分鐘。接著將IL_3加 20 入細胞懸液中並進行不同時間點培養。隨後收取細胞並溶解於4°C冰冷的溶解緩衝溶液中45分鐘。總細胞裂解物(TCL) 經SDS-PAGE凝膠分離，墨染於硝化纖維膜上（Schleicher & Schuell)，利用特定抗體探測並以強化化學發光套組(ECL， Amersham，Arlington heights，111)顯現。 50 200803835 B ·結果 1·葡萄糖酸銻納抑制體外蛋白質酷胺酸>5粦酸酶藉由體外PTPase分析篩選不同化合物的方式’可知葡萄糖酸銻鈉為PTPases抑制劑。合成酪胺酸磷酸化胜肽之 5 GST/SHP-1融合蛋白之去碟酸化反應，幾乎可完全受10 pg/ml葡萄糖酸銻鈉阻斷(99%)(第3A圖）（數據以三重複樣本之平均值± s.d·表示）。葡萄糖酸銻鈉亦可抑制SHP-2與 PTP1B (第3A圖），然而，欲達到類似程度（約99%)之抑制作用，藥物濃度必須大約10倍以上（100 μ§/π11)(第3A圖）。相較 10之下，PTPase抑制劑蘇拉明之shp]抑制作用效果較差（第 3B圖）。本藥物對於MKP1不具備明顯抑制活性，其為雙特異性蛋白質酪胺酸磷酸酶（第3C圖）。在實驗條件下， SHP]、SHP-2、PTP1B與MKP1之GST融合蛋白在抑制劑存在下，具備胜肽受質之類似PTPase活性（OD 660 nm析光 15 下，高於背景值(0.03)約〇·6)。 2·葡萄糖酸銻鈉針對SHP_ 1 pTPase催化區塊並與碟酸酶形成體外穩定複合物受質去磷酸化反應係經由PTPase催化區塊，其活性常受到N-端與C-端區域調控。欲確認葡萄糖酸銻鈉是否透過 2〇 PTPase催化區塊或调郎區域抑制pTpases，進行葡萄糖酸銻鈉對於GST/SHP· 1融合蛋白與GST/SHp_〗cata融合蛋白（其含有PTPase催化區塊但無SH2區塊並去除c_端區域)作用之比較（第4A圖)。葡萄糖酸銻鈉對於兩蛋白之體外酪胺酸磷酸化胜肽受質去磷酸化反應具備類似活性（第43圖）(數據以 51 200803835 三重複樣本之平均值± S.d.表示），顯示葡萄糖酸銻鈉對於 SHP-1 PTPase活性之抑制作用不需要SHIM SH2區塊與c 端區域。這些結果提供了強而有力的證據，顯示葡萄糖酸銻鈉可直接以SHP-1 PTPase催化區塊為標靶。 5 欲決定葡萄糖酸銻之SHP-1 PTPase體外抑制作用過程是否為可逆，故檢測是否清洗經葡萄糖酸銻鈉前處理之 GST-SHP-1融合蛋白可降低抑制作用。結果顯示葡萄糖酸銻鈉之GST/SHP-1融合蛋白抑制作用不受清洗步驟之影響 (第5圖）。相較之下，蘇拉明之磷酸酶抑制作用幾乎可完全 10 受清洗步驟而減少（第5圖），結果與先前之報告一致(Zhang 等人，J· Biol. Chem· 273, 12281 (1998))。 3·葡萄糖酸銻鈉誘發細胞蛋白質酪胺酸磷酸化作用，並增加Baf3細胞内IL-3-誘發之Jak2/Stat5磷酸化作用確認葡萄糖酸銻鈉對於鼠科IL-3·依賴型細胞株Baf3細 15 胞蛋白質酪胺酸磷酸化作用之影響，以決定是否葡萄糖酸銻鈉可作為體内之PTPase抑制劑。以葡萄糖酸銻鈉處理 Baf3細胞可誘發蛋白質酪胺酸磷酸化作用（第6A圖），其相較於過釩酸鈉（0.1 mM)(第6B圖）之誘發反應更為適度且短暫。細胞蛋白質絡胺酸鱗酸化作用之增加，可見於以藥物 20 處理5分鐘後明顯出現大約55與32 kDa之層帶（第6圖，第1-3 行）。此細胞蛋白質酪胺酸磷酸化誘發反應具備劑量依賴效應，且較高藥物濃度之誘發作用較明顯（第6圖’比較弟2與第3行）。延長處理時間至10、30或60分鐘，發現可增加這些蛋白的磷酸化作用至適當程度（第6圖，第4-12行）。此蛋 52 200803835 白質酪胺酸磷酸化作用之增加並非因為蛋白樣本改變所致，可由卜肌動蛋白樣本得知（第ό圖，下方）。本藥物對於總細胞裂解物(TCL)樣本中多種其他酪胺酸磷酸化細胞蛋白質不具備明顯效用（第6圖），顯示藥物在誘發蛋白質酪胺 5酸磷酸化作用上具備具備某種特異性。其中55與32 kDa蛋白並未被確認。在第6圖中，相較於第4、7與10行，第1行中P32層帶之較弱磷酸化訊號並未被確認一致。欲決定葡萄糖酸録鈉是否於體内抑制SHP-1，進行檢測藥物對於Baf3細胞之IL_3-誘發Jak2路胺酸碟酸化作用（第7 10圖）。細胞移除IL-3後，培養於含有或不含藥物中1〇分鐘，隨後以IL-3進行不同時間點之刺激反應。;[L-3可於藥物存在或不存在下誘發Baf3細胞中Jak2與Stat5之酪胺酸磷酸化作用。然而，細胞内Ja]c2與Stat5之路胺酸填酸化程度於樂物存在下約為不處理藥物時之兩倍，並可由密度儀分 15 析法測定（第7圖，比較第2-6行與第8-12行）。在未經IL-3刺激之細胞中，兩蛋白之酪胺酸填酸化作用於存在或不存在藥物情況下均無法測得（第7圖，第1與第 7行）。延長37°C之藥物培養時間至16小時，亦無法有效誘發Jak2/Stat5酪胺酸磷酸化作用。 20 4·葡萄糖酸銻鈉增加IL-3-誘發之Baf3細胞增生作用 SHP_1已知可降低調節細胞激素訊息傳遞，此現象可由 SHP-1-缺失細胞對於不同細胞激素包括IL-3產生過度反應加以證實。由葡萄糖酸銻鈉對於SHP-1的抑制活性，可預測藥物將增加IL-3-誘發Baf3細胞之增生作用。的確，IL-3-誘 53 200803835 發Baf3增生作用於葡萄糖酸銻鈉〇·3至200 pg/mi存在下有增加之趨勢，且最大有效濃度約4〇 pg/ml (第8A圖）。在較高濃度時(1，〇〇〇 Pg/ml)，藥物會抑制IL_3_誘發Baf3生長（第 8A圖）。此一藥物之生長促進能力係明顯次要的（3·3或1〇單 5位/ml)，而非理想的（30單位/ml) IL-3濃度（第8B圖）。不存在 IL-3時，葡萄糖酸銻鈉於3天的培養下無法造成細胞增生作用，或維持細胞存活能力（第8B圖）。 5·葡萄糖酸銻鈉可擴大gm-CSF與IFNa於TF-1細胞增生作用之相反效果 10 Jak/StanK息途徑之傳遞始於細胞激素，其對於細胞生長苇產生相反效果。人類骨髓血癌細胞株對於 GM-CSF，其促進增生作肖，與IFNa，其抑制細胞生長，有所反應。欲決定是否PTPase抑制劑之作用對於IL_3_起始訊息反應或其他細胞激素的作用上具有獨特性，進行測定 15 TF1細胞於存在或不存在葡萄糖酸銻鈉時對於GM-CSF與 IFNot之生長反應。 TF-1細胞之增生作用係誘發自次要濃度之gm_csf (5-40 ngAn!)，且具備劑量依賴效應（第9a圖）(數據以三重複抓本之平均值土 s.d·表示）。此丁^細胞於5〇葡萄㈣ 2〇銻#5存在下增生作用增加（第从圖）。缺乏gm_csf之培養中無哪有無藥物存在均沒有細胞存活（第9A圖）。這些結果證2，葡萄糖酸錄納可增加GM-CSF對於TIM細胞之生長促、'月匕力⑮在貫驗條件下無法取代生長因子之維持細胞存活能力或促進生長。 54 200803835 在1FNa存在下’由GM-CSF-誘發TF-1細胞之增生作用文抑制（第9BSI)。進_步發現，含有丽以與葡萄糖酸銻鈉 (50 pg/ml)之培養可降低GM_CSF_誘發細胞生長( 第9B與第 9CH) ’顯示iFNa之生長抑制能力因藥物之存在而增加。 5 IFNa因藥物而生長抑制能力增加係由於存在㈣—^卩，顯不IFNcx與藥物之協同作用優於藥物本身之活性而增加實驗條件下之GM-CSF絲裂素訊息傳遞活性。如第9D圖所示，葡萄糖酸銻鈉增加GM-CSF-誘發TF-1 增生作用之能力具備劑量依賴效應，其最佳活性為5〇 1〇 μ8/Π1卜另一方面，較高濃度藥物（第9E圖）處理時，IFNa可產生更大的生長抑制作用。由於低劑量藥物（12 5_5〇吨/如) 對於GM-CSF-誘發細胞生長不產生陰性反應，故所造成的劑量IFNa-誘發生長抑制作用可能來自於特定IFNa訊息的增加。另一方面，較高劑量之藥物結合IFNa所產生之非特 15定毒性可使生長抑制作用更大。 6· Sb (III)型之酒石酸銻鉀缺乏^以⑽抑制能力葡萄糖酸銻鈉係Sb (V)型，可於細胞内轉換為Sb (III) 型’並影響利什曼原蟲生長。Sb (III)型酒石酸銻鉀之體外與體内PTPases抑制活性已確認。 20 不同於葡萄糖酸銻鈉，1-1,000 pg/ml之酒石酸銻鉀無法抑制體外PTPases SHP-1與PTP1B (第10A圖）。亦無法增加1L-3_誘發Stat5磷酸化作用（第10B圖）或IL-3-誘發Baf3細胞增生作用（第10C圖），顯示其於體内缺乏PTPases抑制活性 (數據以三重複樣本之平均值± s.d.表示）。有趣的是，其對 55 200803835 於Baf3細胞具有明顯毒性。綜合結果顯示只有％ (v)型可作為PTPase抑制劑，其轉換為Sb(m)型時失去活性。 C.討論這些數據顯不葡萄糖酸銻鈉係一有效的體外與體内蛋 5白枭胳胺酸喊酸酶抑制劑。葡萄糖酸銻鈉可於體外PTPase 分析中抑制一合成酪胺酸磷酸化胜肽受質經蛋白質酪胺酸磷酸酶（SHP-1，SHP-2 and PTP1B)之去磷酸化反應（第3 圖）。體外PNPP(p-硝基苯磷酸酯，Sigma)iPTpases去磷酸化反應亦可受此藥物抑制。此體内之藥物抑制pTPases活 10性’可同時伴隨兩個快速誘發之未認定56與32 kDa Baf3細胞蛋白質之酪胺酸磷酸化作用（第6圖）。有趣的是，先前研究發現有類似分子量的蛋白在SHP-1缺失細胞中被過度填酸化(Yang等人，Blood 91，3746 (1998))。延長藥物培養時間無法誘發細胞蛋白質酪胺酸磷酸化作用（第6圖），顯示藥 15物實驗條件下可能不穩定，或藥物可能逐步使PTPases失活，且對細胞蛋白質之磷酸化產生相反效果。有趣之處在於，PTPases可受Sb (V)型葡萄糖酸銻鈉抑制，其已知可於細胞内轉形成Sb (III)型且失去PTPase抑制活性（第1〇圖）。細胞内轉形作用因此造成PTPase抑制劑活性喪失，如此可 2〇說明藥物之適度性與短暫誘發酪胺酸磷酸化作用，及對細胞增生作用之適度影響。這可能是好處，因為相較於其他臨床上採用之PTPase抑制劑，其相關藥物毒性可能較低。葡萄糖酸銻鈉之體内PTPases抑制活性，可進一步由增加IL-3_誘發Jak2/Stat5填酸化作用，與IL_3-誘發Baf3細胞增 56 200803835 生作用而得知。先前實驗顯示，SHP-Ι^Γ去磷酸化Jak家族激酶並降低調節細胞激素所啟動之訊息傳遞(Jiao等人，exP·

Hematol. 25, 592 (1997))。在這些Jak激酶中’ IL-3可特別活化Jak2激酶，其磷酸化Stat5蛋白以調節基因表現。葡萄糖 5 酸銻鈉增加IL-3_誘發Jak2/Stat5酪胺酸磷酸化作用，及 IL_3-誘發Baf3細胞增生作用之發現，因此符合藥物體内之 SHP-1抑制作用。然而，仍有可能是，藥物之IL-3-誘發 Jak2/Stat5磷酸化作用及細胞增生作用涉及其他PTPases (例 | 如，CD45 PTPase )，其可參與Jak激酶之去磷酸化反應。的 10 確，葡萄糖酸銻鈉可增加SHP-1-缺失細胞之GM-CSF-誘發 Tyk2/Stat3酪胺酸磷酸化作用。藥物所產生IL-3-誘發 Jak2/Stat5酪胺酸磷酸化作用的增加，明顯出現在IL-3刺激後晚期，顯示藥物之長期磷酸化作用。此藥物作用顯示對於PTPases之作用係於IL-3刺激後晚期結合Jak2/Stat5並活 15 化訊息分子。葡萄糖酸銻鈉之體内PTPases抑制作用，亦符合於藥物 φ 可增加GM-CSF與IFNa於TF-1細胞增生作用之相反效果 (第9與第10圖）。特別的是，本實驗顯示經藥物標的之 PTPases可磷酸化GM-CSF與IFNa共用之訊息分子（例如， 20 Jak家族激酶）。此假設可解釋藥物之細胞激素-依賴效應：其PTPases抑制作用可放大分別由GM-CSF與IFNa開啟之絲裂素與生長抑制訊息。亦顯示藥物具備廣泛能力以增加不同細胞激素之訊息傳遞。值得注意的是，SHP-1在先前研究中已知可降低調節GM-CSF與IFNa之訊息傳遞。據報導， 57 200803835 SHP-1-缺失小鼠之巨噬細胞，相較於控制組，其gm-CSF-誘發細胞生長大約增加2倍。此生長增加程度類似葡萄糖酸銻鈉存在下之增加GM-CSF-誘發TF-1細胞生長情形，且符合於藥物之SHP_1抑制作用。在致死型SHP-1-缺失單核球/ 5巨噬細胞的病理效應觀察方面，可能的情況是，藥物對於 GM-CSF-誘發細胞生長之明顯適度效應在體内產生明顯生物性結果。這些結果亦顯示，葡萄糖酸銻鈉治療濃度之PTPases抑制作用，可增加Jak/Stat磷酸化作用與細胞激素之細胞内反 10應，可能是本藥物治療利什曼病之藥理作用主因。在依賴 Jak/Stat途徑進行訊息傳遞之細胞激素中，ΙΡΝ「γ對於細胞内利什曼原蟲的消除扮演重要角色。此外，經利什曼原蟲_感染之巨嗟細胞IFH-γ訊息傳遞失調並與寄生蟲活化|§11?_1有關。因此，推測葡萄糖酸銻鈉可藉由抑制SHP_i (與其他 15 PTPases)以增加巨噬細胞之IFN.-γ訊息傳遞，以清除細胞内的利什曼原蟲。因此葡萄糖酸銻鈉的抗利什曼原蟲能力可能來自於Sb (V)型可增加細胞訊息傳遞，以及Sb (ΠΙ)型在細胞内轉換為Sb (V)型而毒殺寄生蟲。此功能機制符合先前的研究，即以特定抑制劑調控宿主PTPasesT有效控制利什 20又原触的感染進程，並促進巨嗤細胞内細胞激素之訊息傳遞。依據觀察可知，抗利什曼原蟲藥物亞砷酸鈉可抑制巨噬細胞之LPS-誘發MAP激酶訊息傳遞，故調節細胞内訊息傳遞為常見抗利什曼原蟲藥物之作用機制。以葡萄糖酸銻鈉抑制PTpases之機制，係針對其PTpase 58 200803835 催化區塊。本藥物可有效抑制野生型SHP-1，與突變型 SHIM但保有PTPase區塊，而無N-端SH2區域或C-端區域，故可調節SHP-1活性（第4圖）。此機制亦符合先前之觀察，即藥物可抑制Ρτρ1Β，除非其PTPase催化區塊明顯不具備 5 SHP-1與SHP-2相似性。因此，可以預期藥物不會對MKP1 產生抑制能力，因為雙特異性磷酸酶催化區塊之胺基酸序列與結構實際上不同於酪胺酸特異性pTPases。此機制亦顯示某物對於所有具備相同PTPase催化區塊之絡胺酸特異瞻性PTPases具備抑制活性。雖然這些結果顯示藥物可於體外 10與8111^1形成一穩定複合物並對抗清洗步驟，但是目前對於疋否因為藥物進入PTPase區塊溝槽或形成共價鍵方式尚未清楚。在先前研究中，可知其微妙差異在於PTPases的溝槽結構不同，使酵素對於抑制劑體外的敏感度有所差異。此外亦、員不適於發展更具特異性且有效抑制個別pTPases能 15力之藥物化學衍生物。經證實藥物體外之PTPases敏感性差異顯示體内亦有 • 類似之PTPaSeS差異’其可解釋藥物對於IL-3-誘發細胞增生作用之劑量依賴效應，以及已知較高劑量藥物在臨床上所產生之副作用。葡萄糖酸錄鈉之治療濃度可增加IL-3-誘發 20 BaO增生作用且較高劑量可抑制細胞生長。在臨床應用上:葡萄糖酸銻納之治療濃度具耐受性，但較高劑量會產乍用c括可逆性非特異性Ecg改變與腎臟受損。較高劑量藥物之影響可能與PTPases之抑制作用有關，因其僅對於較高濃度藥物有敏感性。 59 200803835 葡萄糖酸銻鈉（SSG)可協同IFNa2並抵禦小鼠WM9人類黑色素瘤異種皮移植，目前已進入臨床試驗第I期。SSG 亦發現可抑制鼠科腎細胞瘤生長，係透過免疫機制以外的直接生長抑制方式。欲評估SSG在抗腫瘤作用上的生長抑 5 制能力’以及SSG對於不同類型人類惡性腫瘤的效用，我們利用裸鼠結合DU145人類前列腺癌細胞異種皮移植方式 (s.c·)，探討38〇與88〇/11^[〇12之功效，顯示其生長可部分受 SSG抑制，此條件係能完全抑制WM9細胞生長。然而處理 IFNa2可使DU145腫瘤小鼠產生適度之生長抑制效果 10 (33%)，SSG可產生較明顯的DU145腫瘤生長抑制效果

(69%)，iIFNa2存在下效果更好(80%)。以組織學方法進行小鼠多處微小腫瘤之SSG (〜4/處）或SSG/IFNa2 (〜2/處)之處理’相較於單一較大腫瘤之控制組或IFNa2處理小鼠進行研究。相較之下，以SSG/IFNa2處理之WM9腫瘤小鼠可完全 15被抑制，且接種處未發現腫瘤。相同於先前存在之抗SSG 組別’ DU145而非WM9細胞在SSG存在下亦存在有〜4%頻率之群落。此外，未處理SSG之DU145單細胞殖株之體外敏感性明顯不同於SSG處理殖株DU145-7與DU145-9，其SSG 之生長抑制個別為4%與70%，雖然其體外之iFNa2生長抑制 20 敏感性類似。這些結果證實，SSG與SSG/ IFNa2對於DU145與WM9 細胞之體外與體内生長抑制之間具有關聯性，顯示SSG在抗腫瘤作用上具有直接抑制其生長之能力，可用來治療具有SSG-反應性之腫瘤，且明顯對於免疫缺失裸鼠具有效 200803835 用。偵測並分離出DU145細胞中已存在之SSG-抵抗性亞群’可提供一機制以解釋〇11145對於SSG之部分反應，並為一有價值之工具以了解抗SSG能力，以協助未來之臨床用通。重要的是，SSG與SSG/ IFNa2之明顯抗DU145腫瘤能 5力顯不SSG與SSG結合治療對於前列腺癌治療上的效用，並有助於進一步之臨床上評估。蛋白質酪胺酸磷酸酶抑制劑SSG可結合IL-2，並透過T 細胞依賴型免疫機制以抑制鼠科腎細胞瘤生長，目前已進 • 入臨床試驗第1期。欲評估SSG是否會活化初代人類免疫細 10胞’我們進行體外處理SSG單一試劑或結合比^之人類週邊血液中IFNY+細胞的定量。ΐρΝγ係免疫細胞活化指標與免疫調節分子，其於SSGAL-2抗腫瘤作用上的重要性，可利用 IFNy缺失小鼠之缺乏結合能力以對抗腎細胞瘤之實驗表示0 15 由健康個體週邊血液ELISP0T分析之初步確認，顯示 SSG/IL-2處理後ΐΡΝγ+細胞明顯增加（9.1倍），相較於SSG之治療劑量(20 ^/ml)(2.l倍）或IL-2之低劑量時程之Cmax (3〇见㈣叫倍)給藥時，僅引起中度增加。較高劑量现⑽ pg/ml)之單一劑型（1.5倍）或結合效果則較差。細 20胞表現TH2細胞激素IL-5+無法於實驗條件下以單獨或結人方式誘發。以SSG/IL-2誘發週邊職γ+細胞需要處理超: 小時’且需暴露4或16小時後方可偵測。SSG/IL_u#合與單獨投劑’並誘發IFNY+細胞之體外增加情形，可以ELlsp〇T 分析偵測，並採用7位健康捐贈者與6位黑色素瘤病串之週 61 200803835 邊血液進行實驗。健康捐贈者週邊血液iFACS分析顯示經結合給藥之IFNy+細胞誘發情形出現在CD4+與CD8+淋巴細胞。有趣的是，該治療會增加CD4+ (2-5倍)與CD4-(〜3倍) 族群中表現活化指標CD69之淋巴球數目。 5 這些結果首次提出了證據顯示，SSG可於體外作用於 IL-2，以活化初代人類TH1細胞(CD4+IFNy+)，並牽涉較廣泛之週邊血液免疫細胞活化，且無論健康個體與黑色素瘤病患均可，以協助臨床上SSG於IL-2治療及其他癌症免疫療法之評估。依據SSG之作用機制對於抗腫瘤免疫性之重要 10性，可知免疫細胞活化對於SSG之治療以及發展更有效SSG 類似物以作為新治療藥劑相當重要。 II·葡萄糖酸録鈉對於體外人類骨鰱血癌細胞株分化作用與增生作用之影響欲探討以葡萄糖酸銻鈉作為藥物之誘發分化作用以治 15療AML之功效，遂進行不同人類AML細胞株體外葡萄糖酸銻鈉之分化作用功效測定。數據顯示，葡萄糖酸銻鈉可誘發AML細胞株NB4、111^_6〇與1；937之分化作用，且具備劑量與時間依賴效應。在理想劑量下，葡萄糖酸銻納可誘發 NB4、、、田胞之不可逆分化作用至某一程度，並類似於之 20誘發作用。HL-60與U937細胞之葡萄糖酸銻鈉誘發分化作用分別為60%與50%，可因GM_CSF*增加至幾乎等於或大於ATRA之誘發效果。這些結果顯示葡萄糖酸銻鈉及其他 PTPase抑制劑在治療AML上的功效。 A.材料與方法 62 200803835 i.試劑全反式維甲酸(ATRA)、氯化硝基四氮唑藍(NBT)與乙酸豆寇佛波酯(TPA)係購自Sigma (Sant Louis，Mo·)。葡萄糖酸銻納（Pathak等人，J· Immunol· 167, 3391 (2001))與重組人 5類GM-CSF (粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子）(Thomassen等人，Clin· Immunol· 95, 85 (2000))如前面所述。 2·細胞株、細胞培養與細胞增生分析 NB4細胞株係受贈自 Cleveland Clinic Foundation 的 Dan Lindner博士（Lanotte等人，Blood 77，1080 (1991))。 10 HL60 與 U937 細胞株係購自 American Type Culture Collection (Rockville，Md·)。這些人類AML細胞株培養於 RPMI 1640培養基並添加10%胎牛血清(FCS)。在細胞增生分析方面，細胞培養於37。(：之10% FCS培養基並添加不同量的葡萄糖酸銻鈉達6天。培養細胞數目以MTT分析法測 15 定，係如先前Mosmarm，J. Imunol· Methods 65, 55 (1983)所述0 3·誘發分化作用之研究 AML細胞株分化作用之評量係利用其產生超氧化物之能力，可使NBT還原成甲臘(formazan)，並以流式細胞儀分 20 析CD1 lb表面指標之表現。在NBT還原方面，每一細胞懸液係混合等體積的1 mg/ml NBT (Sigma)與2.5 pg/ml TPA溶液，並於37艺下反應30分鐘。反應後，每一樣本中含有紫色曱臘結晶之細胞與缺乏NBT-還原力之細胞（白色細胞)於顯微鏡下各計數20顆細胞。所得數據以百分比表示：紫色 63 200803835 細胞/紫色+白色細胞。在分析細胞表面抗原方面，將細胞暴露於藻紅蛋白（phycoerythrin)(PE)-鍵結之鼠科抗人類 CDllb抗體(DAKO Corp，Carpinteria，Calif.)。於FACScan流式細胞儀分析進行螢光分析（Beckton Dickinson，Mountain 5 View，Calif·) 〇 4·細胞週期分析細胞週期利用流式細胞儀分析，係於ΝΒ4細胞葡萄糖酸銻鈉(250 pg/ml)或ATRA (1 μΜ)不存在或存在下培養3 天後進行。簡單而言，細胞以冰冷乙醇固定並於4°C避光 10 下，以含50 mg/ml埃化丙啶、1 mg/ml Rnase與0.1% NP-40 之溶液培養30分鐘。染色後立刻以CELLFIT程式（Becton Dickinson，Mountain View，Calif.)進行分析。 5 ·利用膜聯蛋白V /碘化丙錠分析偵測凋亡細胞以膜聯蛋白V進行暴露之膜磷脂醯絲胺酸(PS)染色，係 15 使用膜聯蛋白 V分析套組(Pharmingen，San Diego，Calif.)。簡單而言，NB4細胞培養於10% FCS RPMI 1640培養基，其中葡萄糖酸銻鈉（250 pg/ml)或ATRA (1 μΜ)不存在或存在，達3天。細胞隨即以PBS清洗兩次並於結合緩衝溶液（1〇 mM Hepes，pH 7.4 ; 140 mM NaCl ; 2.5 mM CaCl2)中染色 20 15 min，其中含有膜聯蛋白V-FTTC與碘化丙錠。反應因加入10倍體積之結合緩衝溶液而終止並以FACS分析（Becton Dickinson Facsvantage) 〇 B.結果 1.葡萄糖酸銻鈉之AML細胞株NB4誘發分化作用具有 64 200803835 劑量與時間依賴效應 NB4係源自APL病患之人類aml細胞株，可因ATRA而誘發分化成顆粒細胞。欲探討葡萄糖酸銻鈉對於AML之分化作用誘發治療效用，故測定以藥物誘發Νβ4細胞分化成 5更成热的類顆粒細胞之能力，並利用NBT還原與CDllb抗原表現進行分析。 2·葡萄糖酸銻鈉之誘發NB4細胞分化作用具有劑量與時間依賴效應，並可由藥物存在下Nbt陽性細胞之增加而 p 得見 10 葡萄糖酸銻鈉可於所有劑量下產生分化誘發活性（1〇至400 pg/ml)，係以3天或6天之培養進行測定（第11A圖）。最佳之劑量為250 pg/m卜可於NB4細胞存在葡萄糖酸銻鈉6 天下誘發87%之分化作用（第11A圖）。在此劑量下，葡萄糖酸錄鈉-誘發NB4細胞分化作用可於藥物處理24小時後得 15見，之後隨天數而增加並於第6天到達87% (第11B圖>NB4 細胞處理ATRA (1 μΜ) 6天亦可觀察到類似程度的細胞分 φ 化作用（第圖）。葡萄糖酸銻鈉-誘發ΝΒ4細胞分化作用亦可進一步以CDllb陽性細胞之增加而進一步確認，其於葡萄糖酸銻鈉(250 pg/ml)存在3天下，可由控制組的10%到達 20 NB4細胞的24% (第11C圖）。 3.葡萄糖酸綈鈉-誘發之NB4細胞分化涉及細胞生長中止於S期與細胞死亡增加葡萄糖酸銻鈉對於NB_4細胞生長之影響係以MTT分析進行測定。NB4細胞之增生作用明顯可受所有劑量之葡萄 65 200803835 糖酸銻鈉抑制（12·5_400 μ§/ιη1)(第12A圖）。細胞〇1^八含量分析（第12圖）顯示NB4細胞經葡萄糖酸銻鈉(25〇 gg/ml)處理3天後S期明顯增加（第12B圖）。相較之下，NB4細胞經 ATRA(1 μΜ)處理3天後中止於G1期（第12B圖），符合先前之 5研究。以ΝΒ4細胞培養於葡萄糖酸銻鈉(25〇 gg/ml) 6天後之膜聯蛋白v染色，顯示細胞產生凋亡現象（第12c圖）。這些結果證貫葡萄糖酸録鈉誘發之NB4細胞生長中止於§期並對細胞產生毒殺效應。 4·葡萄糖酸銻鈉-誘發之NB4分化作用係不可逆，且需 10要持續暴露於藥物以達到最佳誘發效用接著探討是否葡萄糖酸銻鈉_誘發NB4分化作用可因不存在葡萄糖酸銻鈉而回復。NB4細胞於葡萄糖酸銻鈉（1〇 pg/ml或100 pg/mi)存在下培養6天後清洗並以培養基再懸浮而不處理藥物。細胞隨後繼續培養6天並且每天計數NBT_ 15陽性細胞。如第13A圖所示，在6天内NBT-陽性細胞百分比仍一致，顯示葡萄糖酸銻鈉-誘發NB4分化作用不存在藥物時仍然不可逆。相較之下，ATRA_誘發NB4分化作用顯示與前述研究類似。欲決定是否誘發NB4細胞分化作用需要長期暴露於葡 20萄糖酸銻鈉，將Νβ4細胞培養於藥物（1〇〇 pg/mi)中〇.5至24 小時’隨後清洗並繼續培養6天而不加藥物，之後進行nbt 染色。NB4細胞暴露於藥物〇·5至24小時後NBT-陽性細胞呈現線性增加並於24小時到達最大增加量（16%)(第13Β圖）。因此，ΝΒ4細胞分化作用可於短時間葡萄糖酸銻鈉下被誘 66 200803835 發。然而，暴露24小時之16%NBT_陽性細胞誘發作用實際上低於葡萄糖酸銻鈉（100 pg/ml)培養6天之增加52% (第 11A圖）。由於經培養之分化細胞百*比直接相關於葡萄二酸銻鈉之«時間長短（第丨_)，這赌果顯示葡萄糖酸 5銻鈉之NB4細胞分化作用最佳誘發條件需要持續的藥物^ 露。類似地，相較於長期暴露（第11B圖），ATRA之短期誘發NB4細胞分化作用（第13b圖）較為適度。 5·葡萄糖酸銻鈉可誘發111^_60與1；937細胞株之分化作用 10 欲評估是否葡萄糖酸銻鈉誘發分化作用之能力僅限於 NB4細胞，故測定其對於AML細胞株HL-60與U937之效用。以HL-60與U937細胞培養於不同時間點且不存在或存在不同量之葡萄糖酸銻鈉環境。以NBT·陽性細胞百分比作為測定細胞分化作用之指標。 15 HL-60與U937細胞之葡萄糖酸銻鈉誘發分化作用具有劑量與時間依賴效應（第14圖）。在6天之實驗條件下，葡萄糖酸銻鈉誘發HL-60與U937細胞分化作用之最佳劑量為 400 pg/ml (第14Α與第14C圖）。在此劑量下，培養6天後， HL_60與U937細胞之葡萄糖酸銻鈉-誘發分化作用（大約 20 60%)低於ATRA (HL60為90%且U937為72%)之誘發作用（第 14B與第14D圖）。與NB4細胞相似的是，HL-60與U937細胞分化百分比隨著葡萄糖酸銻鈉培養時間的延長而有等比例增加情況（弟14B與弟14D圖），顯不欲誘發最佳分化必需持續暴露於藥物。PTPase抑制劑亦顯示對於兩AML細胞株的 67 200803835 生長具有抑制能力。在兩細胞株之最佳藥物分化誘發劑量方面（400 gg/mi),培養6天後’葡萄糖酸銻鈉之U937細胞生長抑制作用到達97%且HL-60細胞生長抑制作用到達63% (第12A圖）。 5 6·葡萄糖酸銻鈉-誘發HL-60與U937之分化作用因 GM-CSF而增加測疋I]萄糖酸錄納結合GM-CSF所誘發之HL-60與 U937分化作用。HL-60與U937細胞培養於含有葡萄糖酸銻鈉(400 μ/ml)、（JM-CSF (25 ng/ml)或兩者之環境中 1-6天， 10 並且每天測定NBT-陽性細胞百分比。葡萄糖酸銻鈉-誘發HL_60與U937之分化作用因 GM-CSF而增加，其程度幾乎等於或高於ATRA之誘發作用 (第15圖）。與先前研究相同的是，單獨處理gm_CSF對於 HL-60 (第15A圖）與U937 (第15B圖）之分化作用較輕微，且 15 NBT-陽性細胞(8-10%)於第6天有最大增加量。有趣的是，以HL-60培養於含有GM_CSF與葡萄糖酸銻鈉環境中的 NBT-陽性細胞百分比增加至83%，並可相較於單獨處理葡萄糖酸銻鈉的60% (第15A圖）或單獨處理ATRA的90% (第 14B圖）。更明顯的是，GM-CSF與葡萄糖酸銻鈉之結合處理 20 可誘發U937細胞80%的分化作用，其高於單獨處理葡萄糖酸銻鈉（55%)(第15B圖）或單獨處理ATRA (73%)(第14D 圖）。相較之下，單獨處理GM-CSF無法偵測到NB-4細胞的分化作用，其符合先前的研究，且無法增加葡萄糖酸銻鈉_ 誘發NB4細胞之分化作用。 68 200803835 c.討論這些結果證實，葡萄糖酸銻鈉，一種以往用於利什曼病之藥物及PTPase抑制劑，可於體外誘發AML細胞株 NB4K0與U937之分化作用。這些數據顯示，葡萄糖酸 5錄鈉之誘發刪视-60與⑽7細胞分化為成熟類顆粒細胞之情形，可見於NBT-陽性細胞的增加與CDnb表面指標 (NB4)表現之增加。此藥物分化作用誘發能力於低劑量藥物且短時間暴露下即可測出。以最佳劑量進行長期暴露，並 , 比較葡萄糖酸銻鈉與ATRA之NB4細胞誘發分化作用。以最 10佳劑量葡萄糖酸銻鈉結合GM-CSF可使HL_60與U937細胞之誘發分化作用達到類似ATRA之高度誘發效果。數據更證實，葡萄糖酸銻鈉-誘發分化作用為不可逆，並與生長中止及細胞死亡（可能是凋亡）有關。這些結果證實，葡萄糖酸銻鈉可明顯於體外誘發AML細胞株之分化作用，並顯示葡 15萄糖酸銻鈉為誘發分化作用以治療AML之合適藥物。這些結果顯示，葡萄糖酸銻鈉可有效誘發不同FAB類 _ 型AML細胞之分化作用。可見於表現M3 (NB4與HL-60)與

M5 (U937)亞型之AML細胞株之誘發分化作用。人類AML 細胞株AML-3亦可受其誘發分化作用，其表現m2亞型。由 20 於葡萄糖酸銻鈉為PTPase抑制劑，故預期葡萄糖酸銻鈉之誘發分化作用直接經由標的PTPase或AML細胞之 PTPases。此機制明顯異於PML/RARa嵌合蛋白，係一主要 ATRA標的並於ATRA-處理NB4細胞中分解。明顯的是，葡萄糖酸銻鈉對於NB4細胞之PML/RARa嵌合蛋白不具效 69 200803835 用，且不與ATRA協同以誘發分化作用。此葡萄糖酸錄納之不同誘發分化作用機制顯示葡萄糖酸銻鈉可特別用於不具反應性AML案例或可抵抗ATRA治療之情況。有可能葡萄糖酸録鈉於AML分化作用中之主要標的在 5 於PTPases，其對於藥物之敏感性較差。這可依據前面有關 PTPases對於抑制劑敏感性不同的觀察而得知，其中具敏感性PTPases (例如，SHP-1)完全抑制時之葡萄糖酸銻鈉為1〇 pg/ml，而不具敏感性PTPases之類似抑制濃度則大於1〇〇 pg/m卜本發明之數據顯示誘發AML細胞分化作用之葡萄糖 10 酸銻鈉最佳劑量為大於100 pg/ml。如此一來，AML中HePTP 之放大與過度表現變得有趣且顯示PTPase為可能的藥物標的。確認葡萄糖酸銻鈉-敏感型與葡萄糖酸銻鈉_抵抗型 AML細胞株内之PTPase表現情形將有助於發現AML分化時之可能PTPase標的。 15 與HL_6〇/U937細胞誘發分化作用之葡萄糖酸銻納最佳劑量分別為250 pg/ml與400 pg/ml。治療利什曼病之標準投劑量為10-20 mg/kg/天，產生之血清中濃度為1〇呢/mi 或以上。然而，較高藥物劑量在臨床上可能可行且具耐受性’因為80-143 mg/kg之高劑量已用於利什曼病之治療。不 20過’就算是標準葡萄糖酸銻鈉劑量仍有某些治療上的優勢，因為低劑量藥（例如，10 pg/ml)於AML細胞仍顯示具備誘發分化作用活性（第9圖）。由GM-CSF增加葡萄糖酸銻鈉-誘發肌⑽與训”分化作用之觀察顯示’臨床上可結合此二試劑以治療Aml (第15 70 200803835 圖）。此葡萄糖酸銻鈉與gm-csf間之作用預期可活化藥物並增加GM-CSF訊息傳遞及細胞激素對於骨髓細胞之生物效應。然而，結合葡萄糖酸銻鈉與GM-CSF僅有利於AML 案例之其中一族群，因為二試劑間之正向作用所產生之誘 5發分化並未出現在NB4細胞，其對於細胞激素不具反應性。此外，葡萄糖酸銻鈉亦可作用於其他細胞激素以誘發分化AML細胞。G-CSF與IFNs已有報導可促進AML細胞之分化作用。如同GM-CSF，此二細胞激素透過jak/stat途徑之訊息傳遞可因葡萄糖酸録納而放大。 10 HI· PTPase抑制劑葡萄糖酸銻鈉可協同IFNs抑制體外人類癌細胞株之生長欲探討以葡萄糖酸銻鈉作為抗癌藥物之功效，故測定其對於不同人類癌細胞株體外之生長功效。數據顯示，葡萄糖酸銻鈉，無論是單獨或結合IFNa與IFNp給藥，均有效 15抑制不同人類細胞株之體外生長，包括淋巴癌、多發性骨髓瘤、白血症、黑色素細胞瘤、前列腺癌、乳癌、腎臟癌、膀胱癌。此外’葡萄糖酸銻納之抗癌活性可增進特定細胞蛋白質酿胺之酸磷酸化並誘發細胞凋亡。葡萄糖酸銻納對於克服具有IFN-抵抗力之癌細胞的效用，可由單獨處理葡 2〇萄糖酸銻鈉之幾乎完全毒殺或結合IFNa的癌細胞株部分生長抑制而得見。葡萄糖酸銻鈉之廣泛體外抗癌活性顯示其可作為新的抗癌藥物，無論是單一劑型或或結合IFNa/p。此外，本藥物經由標的Jak/stat PTPase(s)以增加jak/Statm 息傳遞之情況’顯示其於其他造血生長因子及經由 71 200803835 途徑訊息傳遞之細胞激素等治療上的效用。 A.材料與方法 1.試劑重組人類IFNa (IFNa_2b，特定活性2xl08單位/mg蛋 5 白，Schering Plough)與葡萄糖酸銻鈉係如前面所述(phatak 等人，J· Immunol. 167, 3391 (2001))。重組人類 IFNp (特定活性 2x108 單位 /mg 蛋白）係取自 Aeres-Serono (Rockland， Mass·)。赂胺酸填酸化(Upstate Biotechnology，Lake Placid， Ν·Υ.)、酪胺酸磷酸化Statl與Statl (New England BioLab Inc.， 10 Beverly，Mass·)、SHP-1 與SHP-2(Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz，Calif.)及 β_ 肌動蛋白（Pharmacia，Arlington Heights，111.)等抗體係商業上可購得。 2·細胞、細胞培養與細胞增生作用分析人類細胞株培養於37°C之RPMI 1640或DMEM培養基 15 並添加 10% 胎牛血清（FCS)。DS 與 DR (Fan Dong，the Cleveland Clinic Foundation (CCF))、U266、DU145與C42 (Alex Almasan，CCF)、Peer (John Winfield，University of North Carolina)、H9 (ATCC)、WM9與 WM35 (Ernest Borden， CCF)、MDA231 與 MDA435 (Graham Casey，CCF)、 20 WiT49-Nl (Bryan Williams，CCF)、RC45 與 5637 (S· K· Bandyopadhyay，CCF)均用於本發明之中。在細胞增生作用分析方面，將細胞培養於96孔盤之 10% FCS培養基，其中含不同量之iFNs與/或葡萄糖酸銻鈉，並於37°C中培養3或6天。增生分析中存活之細胞數目 72 200803835 利用MTT分析測定，係如（Phatak等人，j. immunol 167, 3391 (2001))所述。 3·藥物交互作用分析中間值功效分析（Chou等人，Adv· Enzyme Regul. 22, 27 5 (1984))，係最常見研究藥物間交互作用之方法，故用於分析葡萄糖酸銻納與IFNa或IFNP間之交互作用。建立每一單獨藥物及其組合物之劑量反應曲線。建立單獨IFN、單獨葡萄糖酸銻鈉及組合物之中間值功效圖。確定結合指標（ci) 並配合功效片段(FA)進行繪圖。數據利用雙模式分析，相 10 互排除並相互保留。兩相互保留藥物之間的交互作用以下列方程式描述：CI=D.sub.l/ D.sub.xl+D .sub.2/D.sub.x2+ D.sub.lD .sub.2/ D.sub.xlD.sub.x2,其中D.sub.xl與D.sub.x2 係抑制x%生長所需之藥物丨與藥物2劑量。D sub mD.sub.2 之結合亦可抑制X%生長（亦即，藥物1與藥物2具備類似功 15效）。當CI<1時，藥物具有協同性，當CI=1時，藥物具有加成性，且當CI>1時，藥物具有拮抗性。 4·利用膜聯蛋白V/碘化丙錠分析偵測凋亡細胞利用膜聯蛋白V分析套組（Pharmingen，San Diego, Calif·)之膜聯蛋白V進行外膜上磷脂醯絲胺酸（ps)之染 20 色。簡單而言，將U266或WM9細胞培養於10% FCS RPMI 1640培養基，並於不存在或存在葡萄糖酸銻鈉、IFNa或兩者時培養3天。細胞隨後以pbs清洗兩次並以結合緩衝溶液 (10 mM Hepes，pH 7·4 ; 140 mM NaCl ; 2.5 mM CaCl2)染色 15 min ’其中含有膜聯蛋白V_FITC與碘化丙錠。反應因加 73 200803835 入10倍體積之結合緩衝溶液而停止，並以FACS (Becton Dickinson Facsvantage)或螢光顯微鏡分析。 5·利用IFNa與/或葡萄糖酸銻鈉誘發Statl酪胺酸磷酸化作用 5 於葡萄糖酸銻鈉不存在或存在下，以IFNa誘發Statl酪胺酸磷酸化作用，係將細胞培養於37°C之10% FCS RPMI 1640培養基，於不同時間點處理IFNa(5〇u/mi”並於反應終止前5分鐘加入或不加入葡萄糖酸銻鈉，細胞之溶解係利用冰冷之溶解緩衝溶液（1% NP-40 ; 50 mM Tris，pH 7.4 ; 10 100 mM NaCl ; 1 mM EDTA，10%甘油，1〇 mM鉬酸鈉與4 mM AEBSF)。 6.細胞裂解物之製備、SDS-PAGE與西方墨染法細胞裂解物之製備係利用冰冷之溶解緩衝溶液溶解細胞30 min ’並以4 C之14,000 rpm離心15 min分離。在 15 SDS_PAGE方面，以等體積之細胞裂解物混合2X SDS-PAGE 樣本緩衝溶液，90°C加熱5 min後以10% SDS-PAGE凝膠分離。將SDS-PAGE凝膠上之細胞蛋白質轉染至硝化纖維素膜上（Schleicher & Schuell)、以5%牛奶阻斷且抗體探測後利用強化化學發光套組(ECL，Amersham, Arlington heights, 111) 20 顯現。 B.結果 1·葡萄糖酸銻鈉可於體外抑制人類造血性惡性腫瘤細胞株生長’及增加IFNa-誘發細胞之生長抑制

葡萄糖酸銻鈉明顯增加IFNa-抵抗型淋巴癌細胞株DR 74 200803835 之IFNa-誘發生長抑制作用。DR與DS細胞株係源自親代人類淋巴癌細胞株Daudi，其分別可抵抗或對IFNa敏感。由於其IFNa敏感性，DS細胞培養於IFNot (1，〇〇〇 u/mi)時幾乎可於第3天完全死亡（第16C圖）。相較之下，dr細胞處理 5 IFNa僅造成19%之生長抑制作用（第16A與第16B圖）。重要的是，此IFNa-誘發DR細胞之生長抑制作用可因存在不同量之葡萄糖酸銻鈉而增加至46-69% (第16A與第16B圖）。葡萄糖酸録鈉增加IFNa-誘發之生長抑制現象亦可見於培養日守間延長至6天之DR細胞（第16D圖），其中於葡萄糖酸錄鈉 10 12.5 pg/ml與25 pg/ml存在下，IFNa-誘發之生長抑制作用可由39%分別增加至80%與92%。有趣的是，pTPase抑制劑本身在較高劑量時有明顯抑制DR細胞之能力：以5〇 pg/mi與 100 pg/ml單一劑型培養6天後幾乎完全抑制DR細胞之增生 (95-99%)(第16D圖）。葡萄糖酸銻鈉本身具備適度抑制DS細 15 胞的能力（第16C圖）。由葡萄糖酸銻鈉單獨或結合給藥所產生的DR細胞明顯生長抑制作用，促使我們去探討其對於人類造血惡性腫瘤細胞株之抑制效果。U266係人類多發性骨髓瘤細胞株，該疾病目前以IFNa治療。同時，本藥物發現實際上可增加 20 IFNa-誘發U266細胞生長抑制作用（第16E圖）。在其他孓淋巴癌（119)與1^\1^ (Peer)細胞株亦發現葡萄糖酸銻鈉可增加不同程度之IFNa生長抑制活性（表丨）。 2·葡萄糖酸銻鈉可於體外抑制人類非造血性惡性腫瘤細胞株生長及增加IFNa-誘發細胞之生長抑制 75 200803835 葡萄糖酸銻鈉增加IFNa-誘發生長抑制作用，及造成人類造血性惡性腫瘤細胞株本身的生長抑制效果，顯示本藥物可能具備抑制非造血性癌細胞之能力，因本藥物可抑制 PTPases活性(例如，ρτρ i B與SHP-2)且其表現於不同之非造 5 血性組織中。有多個固體腫瘤細胞株被發現對於pTpase抑制劑之單獨或結合IFNa給藥具有敏感性。WM9 (黑色素瘤）、MDA231 (乳癌）與DU145 (前列腺癌）2IFNa_誘發生長抑制，可因處理葡萄糖酸銻鈉而增加（第17A、第17B與第17C圖）。如同 10 DR淋巴癌細胞株，這些腫瘤細胞株對於單一劑量之pTpase 抑制劑具有敏感性，其中5〇吨/㈤丨與1〇〇呢/⑺丨之劑量於6天培養後可殺死全部細胞（第17圖）。兒童腎母細胞瘤（Wilms tumor)細胞株WiT49_N丨對於葡萄糖酸銻鈉亦具有敏感性，但其生長抑制作用不受正1^〇1影響（第17D圖 15 20 本藥物對於其他細胞株之進一步研究顯示，葡萄糖酸録鈉並非對類龍瘤產线紐，而是在於個別細胞株之差異。相較於具敏感性之WM9黑色素瘤細胞株，里色素瘤細胞株蘭35受㈣糖_狀料較祕(表丨）。、不同於dU145前列腺—株，前猶癌細祕c42對於劑具有高度抵抗能力⑷）。同時，亦敎其他多個人類腫瘤細胞株之IFNa與/或_萄__生長效(表〇。 3·葡萄糖酸錄鈉以協同方式增加则細胞中IFNa_鱼 ΙΡΝβ-誘發之生長抑制欲進-步探討葡萄糖轉鈉之增加丽…誘發細以 76 200803835 長抑制作用是否僅出現於本發明藥物組合物，故以藥物對於人類黑色素瘤細胞株WM9中IFNa-或IFNP-誘發生長抑制情況進行比較，其目前以細胞激素進行治療。 • WM9細胞之生長受IFNa抑制（第18A圖），且IFNp更具 5效用（第WB圖）。在葡萄糖酸銻鈉存在下，IFNa-與iFNa-誘發生長抑制作用明顯增加（第18圖）。此葡萄糖酸銻鈉之增加 IFNa/β-誘發生長抑制作用於較低劑量葡萄糖酸銻鈉 (12.5-50 pg/ml)與IFNs (12.5-50單位/ml)存在下即相當明響顯，但較尚劑量亦可發現（第18圖)。因此，葡萄糖酸錄鈉可 10有效增加IFNa與IFNP對於WM9細胞之生長抑制作用。欲決定IFNa/葡萄糖酸銻鈉與IFNp/葡萄糖酸銻鈉組合物中藥物交互作用之本質，第18圖之數據係利用中間值功效分析推倒出結合指標(CI)值，可確認藥物之交互作用為協同（CI<1)、加成(CI=1)或拮抗(CI>1)。結果之計算以相互保 15省與相互排除兩種模式表示，所有檢測劑量均證實IFNa/ 葡萄糖酸銻鈉（第19A圖），及IFNp/葡萄糖酸銻鈉（第19B圖）馨之藥物交互作用屬於協同反應，其CI值低於1。由於葡萄糖酸銻鈉與IFNa組合物對於DR、DU145與MDA231細胞之生長抑制效果類似於WM9細胞（第17圖），此結果亦顯示兩種 2〇試劑在這些細胞株内的作用為協同效應。 4·葡萄糖酸銻鈉之人類癌細胞株生長抑制作用與誘發細胞凋亡有關葡萄糖酸銻鈉單獨與/或結合IFNa對於腫瘤細胞株之月顯生長抑制作用顯示PTPase抑制劑可誘發細胞死亡。故 77 200803835 可决疋U266與WM9細胞株於葡萄糖酸銻鈉、IFNa或兩者存在下之凋亡細胞數目。於葡萄糖酸録鈉單獨存在下，U266細胞凋亡情況增加’而抑制劑與IFNa兩者存在下影響更大（第2〇圖）。於葡 5萄糖酸銻鈉（1〇〇 Kg/ml)存在下，凋亡細胞百分比由8% (控制組)增加至17%。IFNa (1000 u/ml)，可誘發丨6%細胞凋亡。當同時存在葡萄糖酸銻鈉與IFNa時，凋亡細胞數增加至 42/〇 (第20D圖）。藉由螢光顯微鏡之分析顯示，WM9細胞於葡萄糖酸銻鈉、IFNa或兩者存在下可分別由5% (控制組)增 10加至11〇/。、15%或31%。因此，葡萄糖酸銻鈉與IFNa對於這些腫瘤細胞株的生長抑制作用至少部分源自於誘發細胞凋亡0 5·葡萄糖酸錄鈉引起之IFNa-誘發細胞生長抑制作用放大，與增進Statl酪胺酸磷酸化有關 15 欲探討葡萄糖酸銻鈉增加IFNa_誘發細胞生長抑制作用之§τι息傳遞機制，故研究葡萄糖酸銻鈉對於IFNa_誘發

Statl酪胺酸磷酸化作用之效應，其可媒介細胞激素之抗細胞效用。 IFNa-誘發Statl酪胺酸之磷酸化，在細胞株(Dr、WM9 2〇與DU145)内因葡萄糖酸銻納之存在而增加，其中可發現 IFNa與葡萄糖酸銻鈉對於生長抑制之協同作用（第16與第 17圖）。不存在葡萄糖酸銻鈉時，DR細胞之8加隱胺酸構酸化作用可於30 min内經IFNa誘發並於5小時後降低（第 21A圖’弟1-3行）。於葡萄糖酸錄納（1〇 gg/mi)存在下，經3〇 78 200803835 min激活後之Statl酪胺酸磷酸化效應約為控制組的兩倍以上（第21A圖，第2與第5行）並於5小時内維持增加情況（第 21A圖）。以IFNa激活5小時後之Statl酪胺酸鱗酸化作用增加情形亦可見於經葡萄糖酸銻鈉處理之WM9與DU145細胞株 5 (第21B圖）。相較之下，葡萄糖酸銻鈉無法增加WM35與 WiT49-Nl細胞株之IFNa-誘發Statl酪胺酸碌酸化作用（第 21B圖），其中未發現IFNa與葡萄糖酸銻鈉之間具有抗增生之協同效用（表1與第17D圖）。不存在IFNa時，葡萄糖酸銻鈉本身無法誘發DR細胞之Statl酪胺酸磷酸化作用（第21A 10 圖）。IFNa-誘發WiT49-Nl細胞之Statl酪胺酸鱗酸化作用，於葡萄糖酸銻鈉存在下並未增加（第21B圖）。欲評估SHP-1之參與情形，其已知可調節造血細胞之 Jak/Stat磷酸化作用，故測量腫瘤細胞株内之PTPase表現（第 21圖）。如所預期，SHP-1蛋白易於DR細胞中測出（第21A 15 圖）。然而，SHP-1無法於兩黑色素瘤細胞株中測得，雖然其可表現於兒童腎母細胞瘤細胞株(WiT49-Nl)與前列腺癌細胞株(DU145)(第21B圖）。因此，WM9細胞之IFNa-誘發 Statl酪胺酸磷酸化作用增加情形發生於SHP-1缺乏時，且可能藉由其他對PTPase抑制劑具敏感性之PTPases。 20 C.討論癌細胞對於IFNa與IFNP之抵抗情形一直是臨床上細胞激素抗癌治療上的一大隱憂。雖然目前對於癌細胞如何抵抗IFN之機制尚未明瞭，但癌細胞常發現jfn之訊息傳遞下降，並相信此乃一重要因素。增加IFN訊息傳遞之治療試劑 79 200803835 也許可以協助克服此癌細胞抗藥性，但目前並未有完整報導。本發明數據提供證據指出，葡萄糖酸錄納可增加IFN訊息傳遞，並克服不同人類癌細胞株對於腦之抵抗能力。利 5用藥物加強IFNa线息傳遞可由_〜誘發％狀填酸化而清楚證實。此活性可由處理其治療濃度（1〇_2〇pg/ml)而得見且臨床上财受性佳。此外，本藥物增加if·訊息傳遞之能力可有效克服IFN抗藥性，故可發現不同的人類癌細胞株均出現增加IFNa-誘發生長抑制作用現象。 1〇本藥物於25_100叫/ml濃度可有效克服細胞株之IFN- 抵抗性，相較於單獨處理IFNWf僅有部分抑制。這可由本藥物與IFNa結合給藥所造成狐9黑色素瘤細胞完全抑制之結果看出，雖然此二藥劑之單獨處理僅分別達到乃％與 58%之生長抑制效果。類似地，本藥物以25 μ_1濃度結合 15 IFNot可達到幾乎完*__Α23ι乳癌細胞生長之效果，相較於二藥劑單獨處理之65%與79%生長抑制。此wm9細胞與U266細胞之體外藥物單獨或結合IFNa之抗癌活性顯示誘&細胞凋亡有轉。雖然用於治療利什曼病之標準劑里為10 20 mg/kg/天並造成1〇 gg/ml以上之血清殘留量，但 2〇較高藥物劑量在臨床上似乎可行且具耐受性。850 mg/kg/ 天之咼劑量已用於利什曼病之治療。葡萄糖酸銻鈉亦可增加IF Na —誘發生長抑制作用之結果顯不’本藥物也許可以用於改善以膽β治療癌症與其他數種疾病之情形(例如，Β型肝炎與多發性硬化症），這些目 200803835 前都是以細胞激素治療。此外，另外提供之證據顯示， PTPase抑制劑之標的為jak/Stat PTPases，其可降低調節細胞激素訊息傳遞並去磷酸化jak/stat蛋白，此假設係依據先前的發現，即藥物可增加細胞對几_3與GM-CSF之反應，其 5訊息傳遞係經由Jak/Stat途徑，如IFNs。PTPase SHP-1與 CD45已知可降低調節造血細胞之jak/stat酪胺酸碟酸化作用。由於SHP-1(第21B圖，第行)與c：D45之表現未出現於 WM9細胞’其中IFNa-誘發Statl之磷酸化作用因處理藥物 , 而增加，結果顯示這些細胞内存在其他Statl_調節性 10 PTPase⑻並可作為藥物標的。然而數據並未排除shpq* CD45可能作為造血細胞之藥物標的。此一藥物標的灿/8如 PTPase⑷機制顯示，PTPase抑制劑具有經由jak/Stat途徑增加其他細胞激素訊息傳遞之類似活性。目前已有許多經由

Jak/Stat途徑之細胞激素訊息傳遞(例如，IL_2、il_4與IL-12) 15用於抗癌治療，可因結合PTPase抑制劑而獲得改善。匍萄糖酸錄納作用於IFNa與IFNp，以抑制WM9零色素 φ 瘤細胞之生長係明顯具有協同效應。此一藥物與IFNs間之協同作用符合以PTPase抑制劑增加IFN-誘發Stat U粦酸化作用之結果。雖然有許多其他藥物已知可協同IFNs作用，但 20葡萄糖酸銻鈉是第一個經由標的。IFN訊息傳遞途徑分子而作用之案例。數據證實葡萄糠酸銻鈉能明顯抑制體外人類癌細胞株之生長。此活性在較高劑量(25-100 pg/ml)時最為明顯，且於治療濃度下即可測出實質活性。舉例而言，葡萄糖酸録 81 200803835 鈉於100 pg/ml時可達到完全或幾乎完全毒殺培養6天之 DR、DU145、MDA231與WiT49-Nl細胞。誘發細胞凋亡為殺死癌細胞之主因，並可由WM9與U266細胞於100 pg/ml 葡刼糖酸銻納存在下之細胞凋亡情形增加而得見。不同於 5以治療濃度之藥物協同1FNs，並經由標的Jak/Stat PTPases 以增加IFN-誘發Jak/Stat磷酸化作用及訊息傳遞之情形，此藥物之活性似乎經由其他PTPases以外的jak/Stat途徑，並可由單獨處理10 pg/ml(第21A圖，第4行）或較高濃度藥物，卻仍無法誘發Statl磷酸化作用之情況看出。 10 由某些人類癌細胞株對於藥物本身之敏感顯示，單一劑量之葡萄糖酸銻鈉可有效用於癌症之治療。因此，本研究中藥物敏感性係針對個別癌症細胞株而非特定類型腫瘤之發現顯示，癌細胞藥物敏感性與抵抗性指標之確認變得很重要。藥物抵抗性可能起因於抗藥細胞内缺乏標的 15 PTPases或PTPase受質，而細胞已經適應於缺乏這些分子的生存方式。 IV·葡萄糖酸銻鈉協同IFNa以消除裸鼠身上之人類 WM9黑色素瘤，及明顯抑制其人類前列腺癌DV145腫瘤欲評估是否葡萄糖酸銻鈉具備體内抗癌活性，且該劑 2〇量為臨床上可行並具有耐受性。故測定葡萄糖酸銻鈉單獨或結合IFNa，以抑制裸鼠異種皮移植人類黑色素瘤WM9與人類前列腺瘤DLJ145之功效。 A.方法基於以下考量選擇WM9與DU145細胞株進行研究：1) 82 200803835 此二細胞株在先前研究中發現對於葡萄糖酸銻鈉單獨或結合IFNa具有敏感性（弟17A與第17B圖）；2)兩細胞株已知可使裸鼠產生腫瘤；3)這些細胞株代表人類惡性腫瘤，若沒有有效治療將是生命之重大威脅；4) IFNa現已用於治療黑 5色素瘤與别列腺癌且具有適當成果，可由加入葡萄糖酸娣鈉之結合治療而獲得明顯改善，因其能協同細胞激素作用。以IFNa (每天5〇〇,〇〇〇 U，s.c·)、葡萄糖酸銻鈉(每天12 mg Sb，s.c·)或兩者處理WM9或DU145異種皮移植裸鼠。用於治療之IFNa劑量係與相關研究類似。葡萄糠酸銻鈉劑量 10約440 mg Sb/kg體重（平均小鼠體重27g)，實質上高於標準治療劑量的20 mg Sb/kg，而臨床上有時使用高劑量（143 mg Sb/kg)而不產生嚴重毒性。依據之先前研究選擇葡萄糖酸銻鈉劑量，而小鼠之每曰耐受劑量為20 mg Sb (大約700_800 mg Sb/kg)。同時亦考量葡萄糖酸銻鈉於體外抑制癌細胞株 15生長之效用，其具有劑量依賴效應且100 pg Sb/ml (或100 ug Sb/kg)即可完全或幾乎完全毒殺癌細胞。依據藥物於體内之快速清除率，選擇使用440 mg Sb/kg劑量以確定可初步偵測出藥效。在各細胞株方面，取16隻小鼠於第〇天以胸前皮下注射 20方式接受3xl〇6細胞/處(WM9)或2xl〇6細胞/處(DU145)且兩處/鼠。小鼠分成四組，每組四隻接受治療，係於第2天起注射腿部。以卡尺測量腫瘤大小並決定每一腫瘤之二相交直徑。利用NCI法计异腫瘤體積（長度&寬度]111112/2 =體積 mm3) ° 83 200803835 B.結果 1·葡萄糖酸銻納之單-試劑具備明顯體内抗腫瘤活性並協同麵α消除裸鼠異種皮移植之人類WM9黑色素瘤欲檢測葡萄鑛賴之抗_功效與其如協同^施 5之能力，遂進行葡萄紐銻鈉、及其組合物對於人類素瘤異種皮移植裸鼠之抑制功效評估。將糧9细胞種植於裸鼠，第2天後開始進行不處理(控制組)或處理單 _量或其組合物23天。簡9異種皮移植小鼠之腫瘤體積於處理期間内測量，以作為治療功效之指標（第Μ圖）。 1〇漏9細胞減形紅軸，若秘任何治療财隨時間持續成長的情況。單獨處理IFNa可明顯抑制小氣漏9腫瘤生長，且處理末期之平均腫瘤體積約為控制組的·(第 22A圖，第25天之數據）。有趣的是，在共同處理正術之前，單獨處理葡萄糖酸銻鈉明顯抑制腫瘤生長（第25天之腫瘤 15體積約為控制組的2〇%)。最令人驚奇的是，葡萄糖酸録鈉與IFNcx之結合治療可明顯使WIND腫瘤萎縮並於第^天時消失（第22A圖）。該組小鼠腫瘤消失情況持續至第25天治療結束。其中該組取兩隻小鼠繼續觀察8週而不進行藥物處理。在額外觀察期間内未發現小鼠病肇處有腫瘤長出。因 2〇此可知結合治療可消除裸鼠身上事先形成的WM9腫瘤。這些數據之統计分析顯示，各組間第25天後之腫瘤體積有咼度明顯差異（t檢定：控制組vs葡萄糖酸銻鈉、IFNa 與葡萄糖酸銻鈉/IFNp，p<〇〇1 ;葡萄糖酸銻鈉vs IFNa， P^.01 ;葡萄糖酸銻鈉vs葡萄糖酸銻鈉/IFNa，p<〇〇1)。組 84 200803835 合分析顯示葡萄糖酸銻鈉與IFNa之間的作用具有協同性。 2·葡萄糖酸銻鈉明顯抑制人類前列腺癌Dui45異種皮移植裸鼠之腫瘤生長 .欲檢測葡萄糖酸銻納之抗腫瘤功效與其體内協 5之能力，進行葡萄糖酸銻鈉、IFNoi及其組合物對於人類 DU145黑色素瘤異種皮移植裸鼠之抑制功效評估。如第22B 圖所示’種植DU145細胞之裸鼠所產生的腫瘤明顯無法因 IFNa的單獨治療而受抑制，這與前面的研究相符。在治療 Φ 末期時可發現細胞激素具有適度抗腫瘤活性，其第25天之 1〇平均腫瘤體積約為控制組的70%。相較之下，葡萄糖酸錄鈉單一劑量可明顯抑制DU145腫瘤生長，其第25天之平均腫瘤體積約為控制組的30%。當以葡萄糖酸銻鈉結合正^^ 時’其抗腫瘤活性增加（第25天之平均腫瘤體積為控制組的 18/〇) °綜合這些結果顯示葡萄糖酸銻鈉對於DU145異種皮移植裸鼠具有明顯抗腫瘤活性，且此藥物可作用於IFNaW 達到更好的DU145異種皮移植裸鼠生長抑制作用。 _ 3·裸鼠對於WM9與DU145異種皮移植治療之葡萄糖酸 1 弟鈉有效劑量具有耐受性如前面所討論，葡萄糖酸銻鈉用於治療裸鼠之劑量為 20 卷口 1 〇、《 12 mg Sb/小鼠，s.c·(或大約44〇 mg/kg體重）。因此，別量遠高於利什曼病標準投劑量(每日2〇 mg sb/kg)。欲評估此一高劑量葡萄糖酸銻鈉對於裸鼠之毒性，故觀察25天馬驗期間WM9異種皮移植裸鼠的存活率與體重。所有16隻小鼠於種植WM9細胞後均存活至實驗結束 85 200803835 (第25天），無論其處理内容(控制組、葡萄糖酸錄納、IFNa 或兩者’ 4小鼠/組）。相較於控制組小鼠（第）酸錄納-或處理組，在實）次葡甸糖 TT7XT 、驗^間，以匍甸糠酸銻鈉盥 IFNa結合處理小鼠之平均體重顯減無。此夕/、 5 =?的身體外表、進食或活動狀況並無明顯差異。母組=各取兩隻所進行的切片檢查發現體内顯異常。結合治療組之兩隻小鼠繼續觀察8週且不進行= 處理。在此期間並未發現有任何肉眼可見之異常情況，顯不此一治療並不會造成任何嚴重之長期副作用。 10 C·討論每些結果證實，葡萄糖酸銻鈉可作為單獨試劑，並具有明顯高錢Να之活性，以抑制兩種體内腫瘤。此外，葡萄糖酸銻鈉可協同IFNa進行16天之結合治療以消除裸氣 WM9腫瘤。葡萄糖酸銻鈉亦發現可協同1?^^以達到du_i45 15腫瘤之明顯生長抑制作用，並且優於兩種藥劑單獨使用時之療效。此外，兩腫瘤細胞株之體内葡萄糖酸銻鈉與/*IFNa反應與其體外反應息息相關（表較第17A與第17B圖及第22圖之結果），亦即’ WM9細胞株對於體内葡萄糖酸録鈉與iFNa 20結合治療之敏感性高於DLT145細胞株，並類似於體外實驗之結果。此外，研究中所使用之葡萄糖酸銻鈉劑量(每日12 mg Sb，即每日440 mg Sb/kg)耐受性佳且無嚴重副作用。實驗結論如下：（1)單獨劑量之葡萄糖酸銻鈉具有明顯且廣泛之體内抗腫瘤活性，此劑量為臨床上可行並具有耐 200803835 受性’（2)經a豆貝葡萄橋酸銻鈉與細胞激素特別是iFNa之體内協同作用顯示，結合使用葡萄糖酸銻納可明顯改善目前以IFNa為主之癌症治療；（3)由葡萄糖酸銻鈉之標的為 PTPases，因此，其功能機制不同於目前的抗癌治療，故此 5藥物可作為非反應性癌症或傳統抗癌治療排斥性治療之替代療法；（4)由癌細胞株對於葡萄糖酸銻鈉或葡萄糖酸銻鈉 /IFNct之體外與體内反應間之相關性顯示，先前實驗中所發現其他人類癌細胞株之體外藥劑反應性，將同時於體内產生反應。這進一步顯示，人類的多個具敏感性之惡性腫瘤 10 細胞株(例如，人類乳癌細胞株MDA231與多發性骨髓瘤細胞株U266)將受惠於葡萄糖酸銻鈉/IFNa結合治療；（5)由於裸鼠的研究確認了葡萄糖酸銻鈉與IFNa之間的協同作用，即體外之結果亦出現於體内，另先前研究發現葡萄糖酸銻鈉可於體外協同其他細胞激素（例如，IFNP)故知體内亦可 15 能存在類似結果；因此，葡萄糖酸銻鈉可用於輔助IFNa治療以對抗病毒性或自體免疫性疾病（例如，C型肝炎與多發性硬化症）。 V·葡萄糖酸銻鈉與IL-2在抗Renca腫瘤作用上之交互作用，經由T-細胞依賴型機制，與腫瘤浸潤巨噬細胞之誘發 2〇相關 IL-2療法會誘發後期Renca細胞瘤（RCC) 10-20%之反應率，透過活化免疫細胞，其中蛋白質酪胺酸磷酸酶SHP-1 為關鍵負向調節劑。基於最近的發現，葡萄糖酸銻鈉(SSG) 會抑制SHP-1，SSG與SSG/IL-2組合物之抗-RCC能力與作 87 200803835 用機制，係於鼠類腎癌模式(Renca)中研究。SSG會在Balb/c 小鼠中誘發61%之Renca腫瘤生長抑制，同時使腫瘤浸潤巨噬細胞(MO)增加(2倍），但無法抑制培養物中之Renca細胞增生。SSG/IL-2組合物可更有效抑制腫瘤生長(91%)，並誘 5 發腫瘤浸潤巨嗟細胞(4倍），而單用細胞激素僅有些許作用。知道涉及T細胞，係由於在胸腺裸鼠中，組合物對於 Renca腫瘤生長缺乏活性。雖然SSG或SSG/IL-2治療並不會增加Balb/c小鼠中腫瘤浸潤T細胞，但SSG會增加體外T細胞分泌INF-γ，其可活化巨噬細胞之毒殺腫瘤活性。在經SSG 10 (3倍）或SSG/IL-2組合物（6倍）處理之小鼠中觀察到脾臟巨噬細胞增加，並顯示系統性巨噬細胞之擴展，其為SHP-1 基因缺乏小鼠之一主要特徵。SSG與SSG/IL-2組合物治療在小鼠中有耐受性。這些結果共同顯示SSG之抗Renca腫瘤活性，與IL-2結合，經由與腫瘤浸潤巨噬細胞之誘發相關之 15 T-細胞依賴型機制發揮作用，顯示SSG會增進IL-2療法之抗 RCC效用，藉由增強抗腫瘤免疫性。 A.材料與方法

Renca (Murphy, G. P.5 and W. J. Hrushesky. 1973. A murine renal cell carcinoma. J. Natl. Cancer Inst 50 ^ 1013)， 20 Jurkat (Grillis，s·，and J· Watson 1980. Biochemical and biological characterization of lymphocyte regulatory molecules. V. Identification of an interleukin 2-producing human leukemia T cell line· J. Exp· Med· 152 : 1709)，以及 WM9 (Forseberg，Κ· I. Valyi-Nagy，C· H. Heldin，m· Herlyn， 88 200803835 5 and B. Westermark. 1993. Platelet-derived growth factor (PDGF) in oncogenesis · development of a vascular connective tissue stroma in xenotransplanted human melanoma producing PDGF-BB. Proc Natl Acad Sci USA 90 : 393)細胞株係得自 Cleveland Clinic Foundation (CCF)之同事處，並培養於RPMI 1640培養液中，補充有10%胎牛血清(FCS)。重組IL-2 (Proleukine，22百萬IU/1.3 mg，Chiron， Emeryville，Calif·)係購自 CCF藥廠。SSG如先前描述(Yi，T，. • 10 Μ·Κ· Pathak，D. J· Linder，Μ· Ε· Ketterer，C. Farver and Ε· C. Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate ^ 15 • in synergy with IFNs· J· Immunol· 169 : 5978)。細胞生長抑制試驗，細胞係培養於有或無各劑量SSG存在之情況下6 天，存活之細胞係以MTT試驗定量，如別處所述(pathak，M. K.9 and T. Yi 2001 Sodium stibogluconate is a potent inhibitor of protein tyrosine phosphatase and augments cytokine reponses in hemopoietic cell lines. J. Immunol. 167 ： 3391)〇 2·動物實驗 20 Balb/c小鼠與胸腺缺乏Balb/c小鼠（10週大，母鼠， Taconic農場，Germantown，Ν. γ)係於脅腹接種(s c )Renca 細胞（106細胞/位置）。接種後四天，小鼠置於未經處理（控制組)與經IL-2(105IU/每曰，共5 日，Lp〇、SSG(12mg/日， 1,111•於臀部）或二試劑之組合物處理二週。IL-2之劑量可與先前評估鼠類抗Renca腫瘤免疫性之研究相比（s〇n〇uchi, κ.，τ 89 200803835 A· Hamilton, C.S. Tannenbaum，R· R· Tubbs, R· Bukowski， and J. H. Finke. 1994. Chemokine gene expression in the murine renal cell carcinoma, RENCA5 following treatment in vivo with interferon-alpha and interleukin-2. Am J pathol 5 144 : 747)。SSG之劑量類似於鼠類利什曼症治療之藥物劑量（]^11〇^，11.界.，】.0.86〇11&11311(18.0.\¥1^111:.1988· Immunochemotherapy for intracellular Leishmania donovani infection ： gamma interferon plus pentavalent antimony. J Infec Dis 157 : 973)。腫瘤體積於試驗期間測量，並使用長 10 球面(prolate spheroid)公式計算(V=4/3 X a2b)(Lindner，D. J.， e. C. Borden, and D. V. Kalvakolanu. 1997. Synergistic antitumor effects of a combination of interferons and retinoic acid on human tumor cells in vitro and in vivo. Clin Cancer res 3 : 931)。Student’s試驗係用於評估腫瘤體積差異之顯著 15 性，在不同治療族群中。亦於研究期間記錄小鼠存活率（每曰）與體重(每週）。在研究結束時，Renca腫瘤與主要内臟(心臟、腎臟、肝臟、肺臟與脾臟)係採樣，並進行組織學與免疫組織化學分析。 3·組織學與免疫組織化學 20 採集自小鼠之主要内臟與Renca腫瘤係固定於10%之甲醛或液態氮驟然冷凍。係製備固定樣本之H&E-染色組織切片，並於顯微鏡下評估，如先前所述(Yi，T，. M.K. Pathak， D· J· Linder，Μ· Ε· Ketterer，C. Farver and Ε· C· Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate in 90 200803835 synergy with IFNs· J. Immunol· 169 : 5978)。冷珠組織切片之製備，以及免疫組織化學係如下列流程進行(Joliat，M. J·， P. A. Lang? B. L. Lyons, L. Burzenski, M. A. Lynes? T. Yi, J. P. Sundberg, and L. D. Shultz. 2002. Absence of CD5 5 dramatically reduces progression of pulmonary inflammatory lesions in SHP-1 protein-tyrosine phosphatase-deficient ’viable motheaten’ mice· J. Autoimmun 18 : 105) 〇使用於組織免疫化學之抗體為抗-CD4(大鼠單株抗體，GK1.5複製

株，BD Biosciences，Franklin Lakes，N. J·)、抗CD-8(大鼠單 10 株抗體，53-6.7.5複製株，BD Biosciences，Franklin Lakes，N. J·)、抗-F4/80(大鼠单株抗體 ’ A3-1複製株，Serotec，Oxford， UK) ’ 以及抗-Asialo GM1(兔多株抗體，Cedarlane，Hornby， Canada)。該切片係以Mayer’s蘇木精（hematoxylin)複染 (counterstain)，在顯微鏡檢驗前。係評估2隻小鼠/群組織切 15 片。免疫細胞數目係以下列流程進行半定量：+，〇-1正細胞 /40 X視野；+，2-5正細胞/40 X視野；++，6-10正細胞/40 x 視野等。 4. SSG對於免疫細胞之體外作用

Jurkat細胞係培養於無或有各劑量SSG之環境下16小 2〇時。細胞與培養液上清液係離心分離（1，〇〇〇 g，1〇分鐘）。培養基上清液中之IFN-γ量’係使用ELISA套組定量（R.D. system，Minneapolis，Minn·)，依據使用手冊。 B.結果 1· SSG抑制Balb/c小鼠中Renca腫瘤之生長，但無法抑 91 200803835 制培養之Rene a細胞增生為了研究SSG經由免疫機制發揮潛在之抗_RCC活性，係評估SSG對於Balb/c小鼠中Renca腫瘤之生長抑制。係選用Renca，衍生自Balb/c小鼠自發性腎臟瘤，由於免疫勝任 5小执中’此品種具有腫瘤產生性(Murphy, G. P.，and W. J. Hrushesky. 1973. A murine renal cell carcinoma. J. Natl. Cancer Inst 50 : 1013) 〇一開始便試驗SSG對於培養之Renca細胞生長之影響，以決定是否SSG會直接抑制Renca細胞之生長，在無免 10 疫細胞存在下。

Renca細胞係培養於無或有各劑量sSG(6.25-200 mu.g/ml)之環境下6天，顯示類似之生長（第24A圖），而WM9 黑色素瘤細胞之生長卻可被SSG抑制，為劑量依賴形式，在可比較之條件下（第24B圖），已於先前報導過(Yi，T，. M.K. 15 Pathak, D. J. Linder, Μ. E. Ketterer, C. Farver and E. C. Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate in synergy with IFNs· J. Immunol· 169 : 5978) o SSG對於體内Renca細胞生長之影響，係以SSG處理具有4-天Renca腫瘤之Balb/c小鼠而評估，其每日投以鼠類利 20 什曼症治療之有效劑量(Murray，H. W.，J. D. Berman and S. D. Wright. 1988. Immunochemotherapy for intracellular Leishmania donovani infection : gamma interferon plus pentavalent antimony· J Infec Dis 157 : 973)，為期二週。在治療期間末期，經SSG處理小鼠中之Renca腫瘤（39%)，明 92 200803835 顯小於(ρ<〇·〇 1)那些在未經處理組別中觀察到的（100%)(第 25圖）。該處理之耐受性相當好：處理組中所有小鼠皆在處理末期存活下來（資料未顯示）。因此，SSG作為早一試劑，會誘發Balb/c小鼠明顯的 5 Renca腫瘤生長抑制，且具有良好耐受性。SSG之此抗Renca 腫瘤生長作用並非來自對於Renca腫瘤之直接抑制’因為該藥物對於生長於培養液中之Renca腫瘤並無明顯作用。這些結果顯示SSG之抗Renca腫瘤活性，係經由可能涉及抗腫瘤 φ 免疫性之間接機制作用。 10 2. SSG/IL-2組合物會較單一試劑誘發更有效之Renca 腫瘤生長抑制假設之SSG於Renca腫瘤中之抗腫瘤免疫機制，顯示 Renca腫瘤生長可能會被SSG/IL-2組合物更有效地抑制，其已知可活化抗腫瘤免疫細胞（Rosenberg, S. A. 2000. 15 Interleukin-2 and the development of immunotherapy for the treatment of patients with cancer. Cancer J Sci Am 2000 ： S2)。由於細胞激素已證實在後期RCC中僅誘發低反應率 (Margolin, K. A. 2000. Interleukin-2 in the treatment of renal cancei. Semin Oncol 27 ·· 194)，SSG與IL-2作用抑制Renca 20 腫瘤生長之證據，亦提供臨床前證據，證明有關於SSG可增進IL-2療法藥效之潛力。因此，便試驗SSG/IL-2組合物對於Renca腫瘤生長之影響。

具4-天Renca腫瘤之Balb/c小鼠，係以SSG/IL-2組合物，或僅以IL-2處理，與未經處理之控制組，以及置於SSG 93 200803835 處理之組別比較。SSG/IL-2組合物處理二週會誘發90%之 Renca腫瘤生長抑制，而僅以SSG處理則僅有60% (ρ<0·01)(第 25圖），與先前報導一致（8〇11〇11(：1^，1^.，1\八· Hamilton, C.S. Tannenbaum, R. R. Tubbs, R. Bukowski, and 5 J. H. Finke. 1994. Chemokine gene expression in the murine renal cell carcinoma，RENCA，following treatment in vivo with interferon-alpha and interleukin-2. Am J pathol 144 · 747 ; Samlowski，W. E·，R. Petersen，S. Cuzzocrea，H· Macarthur, D. Burton，J. R. McGregor，and D. Salvemini. 10 2003. A nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase, M40403, inhibits dose-limiting hypotension associated with interleukin-2 and increases its antitumor effects. Nat Med 9 : 750)。組合物具耐受性，由處理末期所有經處理小鼠皆存活，且體重可與未處理組比較可得知，且經處理小鼠在 15主要器官中之組織病理學並無明顯變化（資料未顯示）。這些結果顯示SSG/IL-2組合物會誘發更有效之R enca 腫瘤生長抑制，與單獨試劑相較，與SSG抗Renca腫瘤作用之免疫機制一致。在抗Renca腫瘤作用中，SSG與IL-2作用之能力以及小鼠中組合物治療之耐受性，顯示SSG/IL-2組 20 合療法作為後期RCC增進治療之可能性。 3· SSG與SSG/IL-2組合物治療會誘發腫瘤浸潤巨噬細胞與系統性巨嗟細胞擴展為了更進一步定義SSG與SSG/IL-2組合物在Renca腫瘤生長抑制上之作用機制，係研究這些治療對KRenca腫瘤浸 94 200803835 潤免疫細胞之影響。T、NK與巨噬細胞系細胞為重要的抗腫瘤效應細胞(Rosenberg, S. A· 2001 _ Progress in human tumour immunology and immunotherapy. Nature 411 : 380) ° 這些免疫細胞在Renca腫瘤中，來自不同小鼠，分別經 5 SSG、IL-2或其組合物處理’之相對數目，係以免疫組織化學法定量。 T淋巴球（CD4+或CD8+)係於Renca腫瘤中呈現低數目，如同先前所報導，且在不同處理小鼠中僅有少許差異 , ' (第26A圖），其中NK細胞在腫瘤中未偵測到（資料未顯示）， 10在實驗條件下。雖然腫瘤浸潤巨噬細胞(F4/80+)為控制組與 IL-2處理小鼠組可比較量，然而，有趣的是，在SSG_處理小鼠組中僅顯示些微之增加（約2倍)，而在SSG/IL-2組合物處理小鼠中卻有更明顯之增加（約4倍）（第26A/B圖）。為了评估經SSG-處理與SSG/IL-2組合物處理小鼠之 15尺妨⑶腫瘤中巨噬細胞之增加，是否為腫瘤特異性，或為系統性巨噬細胞擴展之一部分，經不同處理小鼠之脾臟巨噬 • 細胞數目，亦以免疫組織化學定量。脾臟巨噬細胞(F4/80+) 之數目，在SSG-處理小鼠中明顯增加（約3倍），而在組合物處理小鼠中增加更明顯（約6倍），與控制組巨噬細胞 20背景值，或1L-2處理組相較（第27A/B圖）。經不同處理之小既之脾臟顯示類似之Cd4+/CD8+細胞量（第27A圖）。這些結果顯示經SSG處理會誘發Renca腫瘤中巨嗟細胞浸潤，以及顯著之系統性巨噬細胞擴展，其經由IL-2共奴藥而倍增。相對地，SSG或SSG/IL-2處理對於腫瘤浸潤τ 95 200803835 細胞或NK細胞僅有些許作用。SSG與SSG/IL-2對於腫瘤浸潤巨噬細胞與系統性巨噬細胞擴展之選擇性誘發，提供了組織學之證據，支持該處理之抗Renca腫瘤作用之免疫機制，並暗示巨噬細胞為潛在的直接抗Renca腫瘤作用細胞。 5 4· SSG/IL-2抗Renca腫瘤作用需要T細胞之存在假設之機制為巨噬細胞作用為抗Renca腫瘤作用細胞，並未排除涉及T細胞，其可能被SSG或SSG/IL-2活化，分泌誘發巨嗟細胞抗腫瘤活性所需之細胞激素。的確，經 SSG處理之Jurkat T細胞，發現IFN-γ之分泌量增加（第28 10 圖），其可活化巨噬細胞之抗腫瘤作用（Samlowski，W. E.，R. Petersen, S. Cuzzocrea, H. Macarthur, D. Burton, J. R. McGregor, and D. Salvemini. 2003. A nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase，M40403，inhibits dose-limiting hypotension associated with interleukin-2 and increases its 15 antitumor effects· Nat Med 9 : 750 ; Qin，Z·，J· Schwartzkopff， F. Pradera，T· kammertoens，B. Seliger，H· Pircher，and T. Blankenstein. 2003. A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by Cd8+ T cells· Cancer Res 63 ·· 4095)。SSG/IL-2組合物之抗Renca腫 20 瘤藥效，係於缺乏T細胞之無胸腺小鼠中研究，以評估T細胞在該療法之抗Renca腫瘤作用之角色。具4-天Renca腫瘤之無胸腺Balb/c裸鼠，未經處理或以 SSG/IL-2組合物處理二週。Renca腫瘤以二組小鼠可比較之方式成長，在處理期間（第29圖），顯示SSG/IL-2處理對於 96 200803835

Renca腫瘤生長並無抑制作用，在無胸腺小鼠中，在實驗條件下。控制組與SSG/IL-2處理小鼠之Renca腫瘤與脾臟之免疫組織化學分析，顯示在SSG/IL_2處理小鼠之腫瘤中（2倍）與脾臟中（3倍）巨噬細胞之增加，與控制組相較（資料未顯 5 示）。這些結果顯示SSG/IL-2誘發之Renca腫瘤生長抑制，需要T細胞之存在，提供基因上的證據，支持該處理之抗腫瘤免疫機制。 c.討論 10 這裡的結果首度顯示SSG明顯之抗腫瘤活性，係經由免疫機制媒介，且在IL-2存在下而放大。 SSG抗Renca腫瘤作用之免疫機制係經數個證據支持。起初之觀察顯示SSG會在Balb/c小鼠中誘發Renca腫瘤生長抑制’但無法抑制培養之Renca細胞增生，因而產生了 15直接之抗Renca腫瘤機制與SSG毒性之爭論。由組織學證據顯示，SSG誘發之腫瘤浸潤巨噬細胞，與系統性巨噬細胞擴張一致。其經強力的基因證據支持，T細胞為SSG與IL-2 組合物抗Renca腫瘤作用所必須。我們已於先前研究顯示 SSG之抗黑色素瘤活性，其類似於SSG直接作用於黑色素腫 2〇瘤細胞所得之結果，由於SSG會引發培養之黑色素瘤細胞生長抑制，並於免疫缺乏小鼠中抑制黑色素瘤之生長(Yi, T，. Μ·Κ· Pathak，D· J· Linder，Μ· E. Ketterer, C. Farver and Ε· C. Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate in synergy with IFNs. J. Immunol. 169 ： 5978) ° 已報導小鼠 97 200803835 模式中，SSG與重組人類lFN-α作用，抗黑色素腫瘤之能力，可解釋為經由免疫非相關性機制，基礎為SSG/nnsr_a 可協同直接作用於培養之黑色素細胞，造成生長抑制，在缺乏免疫細胞情況下（Yi, Τ,· Μ·Κ· Pathak，D. J. Linder，M. 5 E. Ketterer, C. Farver and E. C. Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate in synergy with IFNs. J. Imnumol· 169: 5978)。涉及小鼠抗黑素瘤活性之IFN活化免疫性，可被排除，由於重組人類IFN-ql之物種特異性，其對於小鼠免疫細胞無活性，但會抑制人類源之黑色素瘤細胞 10 之生長（Yi，Τ，· Μ·κ. Pathak，D· J. Linder，Μ· E· Ketterer，C.

Farver and E. C. Borden. 2002. Anticancer activity of sodium stibogluconate in synergy with IFNs. J. Immunol. 169 ： 5978)。因此，我們最近的研究顯示新穎之SSG免疫媒介抗腫瘤作用。 15 此SSG之免疫媒介抗腫瘤作用之發現具有顯著之臨床上思義’除了 k供樂物作用機制之外。它表示一較廣之gjSG 應用，作為一有潛力之抗癌療法，有助於對於SSG直接生長抑制敏感或不敏感之病患。此外，SSG之雙重抗腫瘤作用，經由直接之腫瘤生長抑制，以及抗腫瘤免疫性，亦顯 20示當使用於免疫勝任、又具有對直接SSG生長抑制作用敏感之病患時，SSG可能是最有效的。此概念可幫助癌症病患選擇最佳之SSG-基礎療法，且可在未來臨床前研究證實。此外，SSG之免疫媒介抗腫瘤作用，顯示SSG有潛力，可用於與其他免疫活化劑組合，包括IL-2，其為此研究所 98 200803835 試驗者。在此份研究中已顯示SSG/IL-2組合物在抗Renca腫瘤作用上更有效，與單一試劑相較。SSG/IL-2較佳之抗Renca 腫瘤作用，以及該治療於小鼠中之耐受性，提供了臨床前 5 之證據，顯示SSG具有增進IL_2抗RCC療法之潛力，並保證期於臨床上之評估。在此觀點中，值得注意的是几—2在抗 Renca腫瘤實驗中所使用之劑量，約為報導之小鼠最大耐受劑 5 (MTD)之約 25%( Samlowski，W· E·，R· Petersen，S. φ Cuzzocrea, H. Macarthur, D. Burton, J. R. McGregor, and D. 10 Salvemini. 2003. A nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase，M40403, inhibits dose-limiting hypotension associated with interleukin-2 and increases its antitumor effects· Nat Med 9 : 750)。SSG與IL-2在MTD時之耐受性，亦於初步實驗中觀測到（資料未顯示）。因此，更強之對抗 - 15 Renca腫瘤作用可達成，使用最佳化之SSG/IL-2組合療法， - 其經由不同劑量及/或治療時程而定義出。展現SSG與IL-2

• 作用之能力，而不會明顯增加IL-2毒性，其經由IL-2活化T 細胞而產生，會誘發毛細管裂縫(Rosenberg，S. A. 2000. Interleukin-2 and the development of immunotherapy for the 20 treatment of patients with cancer. Cancer J Sci Am 2000 ^ S2)，相關於我們所觀察的，SSG抗Renca腫瘤活性似乎部分經由巨噬細胞所媒介，如下所述，因而並不單依賴IL-2誘發T細胞活化之增加。我們研究的重要發現為SSG會誘發腫瘤浸潤巨噬細 99 200803835 胞，以及明顯之系統性巨噬細胞擴張，其經由IL-2放大。除了提供組織學證據支持SSG抗Renca腫瘤之免疫機制，此 SSG活性亦為一潛在指標，可指示在SSG-處理小鼠中之 SHP-1體内抑制，由於系統性巨噬細胞擴張為SHP-1基因缺 5 乏小鼠之一主要特徵(Green，M· C.，and L· D_ Shultz. 1975. Motheaten, an immunodeficient mutant of the mouse. I. Genetics and pathology. J. Hered 66 · 250 ； Shultz, L. D.? D. R Coman，C· L. Bailey，W. G. Beamer，and C. L. Sidman 1984. ”Viable motheaten，” a new allele at the motheaten locus. I. 10 Pathology. Am J Pathol 116 · 179 ； Shultz, L. D.? P. A. Schweitzer，Τ· V. raj an，t. Yi，J· N. Ihle，R· J. Mattthews，M. L. Thomas, and D. R. Beier. 1993. Mutations at the murine motheaten locus are within the hematopoietic cell protein-tyrosine phosphatase(Hcph) gene· Cell 73 : 1445)〇此 15 外，亦暗示巨噬細胞為該藥物之直接抗腫瘤作用細胞。此種巨噬細胞之假定角色係與SSG無法作用於腫瘤浸潤T細胞一致，並由先前報導支持，顯示巨噬細胞為具有抗腫瘤活性之重要免疫細胞（Samlowski，W· E·，R. Petersen，S. Cuzzocrea, H. Macarthur, D. Burton, J. R. McGregor, and D. 20 Salvemini. 2003. A nonpeptidyl mimic of superoxide dismutase， M40403， inhibits dose-limiting hypotension associated with interleukin-2 and increases its antitumor effects. Nat Med 9 · 750 ； Masztalerz? A.? N. Van Rooijen, W. Den Otter，and L. A. Everse. 2003. Mechanisms fo 100 200803835 macrophage cytotoxicity in IL-2 and IL-12 mediated tumour regression. Cancer Immunol Immunother 52 ·· 235)。顯然，亦提供S SG/IL-2之抗Renca腫瘤作用合理的解釋。由於S SG-誘發之腫瘤浸潤巨噬細胞，係由IL-2放大，SSG/IL-2組合物 5 之抗Renca腫瘤作用，可能產生自該二試劑對於巨噬細胞之交集作用，其直接攻擊腫瘤細胞。然而，目前並不清楚， IL_2如何倍增SSG-誘發之腫瘤浸潤巨噬細胞。雖然IL-2受體表現於單核球上08口丨11〇2&-〇618&(1〇，1_,]^.(^. ：6〇8(：〇，1\ Musso, G. L. Gusella, D. L. Longo, and 1. Varesio. 1995. 10 Interleukin-2 and human monocyte activation. J Leukoc Biol 57 : 13)，其會分化為巨噬細胞，我們觀察到，il-2對於腫瘤浸潤巨噬細胞之作用為T細胞依賴型，與IL-2誘發單核球分化之直接角色相爭論。在此過程中細胞激素涉及IL-2活化T細胞，似乎為另一機制。 15 除了透露巨嗟細胞在SSG抗Renca腫瘤作用上之假設角色之外’我們結論亦顯示T細胞有涉及，其已知在抗腫瘤免疫性方面扮演重要角色(Rosenberg，S. A. 2001. Progress m human tumour immunology and immunotherapy· Nature 411 : 380)。T細胞明顯地為IL-2放大SSG誘發腫瘤浸潤巨嗟 20細胞與系統性巨噬細胞擴張之能力所需。此現象係由於觀察到腫瘤浸潤巨噬細胞與脾臟巨噬細胞擴張量，在 SSG/IL-2處理之無胸腺小鼠中，係類似於在τ細胞勝任 Balb/c小鼠中僅由SSG誘發者。τ細胞之重要性更進一步地由在SSG/IL-2處理之無胸腺小鼠中，腫瘤浸潤巨嗟細胞輕 101 200803835 微增加下，Renca腫瘤生長抑制之缺乏而強調。考慮到低數目之腫瘤浸潤T細胞，以及SSG誘發T細胞分泌IFN-γ之能力，其可活化巨嗟細胞（Schwartzkopff，F. Pradera，T· kammertoens，Β· Seliger，Η· Pircher，and T. Blankenstein· 5 2003. A critical requirement of interferon gamma-mediated angiostasis for tumor rejection by Cd8+ T cells. Cancer Res 63 : 4095)，結果顯示T細胞會媒介SSG/IL-2抗Renca腫瘤作用，經由分泌細胞激素以誘發與活化腫瘤浸潤巨噬細胞。我們發現SSG會經由免疫機制發揮抗Renca腫瘤作 10用，亦在其他觀點中相當顯著。其提供證據，強調在抗利什曼症中假設之SSG免疫機制。特別的是，觀察到的SSG處理小鼠之巨嗤細胞擴張，表不在SSG抗利什曼症療法中此藥理作用之存在，其目前已忽略。不同活性之SSG對抗自由存活之利什曼原蟲無鞭毛體(promastigotes)與細胞内利 15 什曼原蟲無鞭毛體研究(Berman J· D·，and D. J. Wyler. 1980. An in vitro model for investigation of chemotherapeutic agents in leishmaniasis· J· Infect· Dis· 142 : 83)，增加了數種其他化合物之可能性(Berman J· D· 1988· Chemotherapy for leishmaniasis · biochemical mechanisms, clinical efficacy, 20 and future strategies· Rev Infect. Dis· 10 : 560)，具有類似的抗利什曼症特性，可能具有抗癌活性之潛力，經由免疫作用，因此需要重新評估。考慮到SSG之耐受性，以及其可經由抑制SHP-1而活化免疫細胞之能力，表示磷酸酶之精鍊抑制劑可發展為安全之免疫活化劑，用於癌症治療以及其 102 200803835 他免疫療法中。 v.葡萄糖酸銻鈉抑制PRL家族PTPases之抗癌作用收集之資料顯示葡萄糖酸銻納為重組與細胞内PRFs之強效抑制劑，葡萄糖酸銻鈉為非毒性劑量，具有體外生長 5抑制劑活性，且在小鼠模式中可對抗會表現PRLs之癌細胞株。資料顯示葡萄糖酸銻鈉使PRL失去活性為其抗癌作用之一重要機制，因為在葡萄糖酸銻鈉抵抗性癌細胞中， PRL-1之突變形式對於葡萄糖酸銻鈉抑制不具敏感性，並提供對於葡萄糖酸銻鈉生長抑制作用之抵抗性，當異位性表 10現於葡萄糖酸銻鈉反應細胞株中時。這些結果顯示葡萄糖酸銻鈉作為抗癌藥物之潛力，並提供新穎之觀點，可發展 PTPase抑制劑作為標粗療法。 A·材料與方法 · 1·試劑 15 葡刼糖酸銻納、蘇拉明（suramine)、原飢酸納（sodium orthovanadate)，與SHP-1之GST融合蛋白，已於先前描述 (Pathak et al·，J· Immunol· 167 : 3391(2001))。銻酸甲葡胺 (meglumine antimonate)得自 Aventis。人類PRL-1、PRL-2與 PRL-3編碼區域之cdNA係以RT-PCR衍生自H9細胞（Safai等 20 人，Lancet 1，1438 (1984))，並合框架地(in-frame)插至 pGEX載體上。PRL-1R86之cDNA係產生自重組DNA技術，使用PRL-1 cDNA做為模板，依據已建立之流程(Jiao等人， Mol. Cell· Biol. 16, 6985 (1996))。PRL磷酸酶之GST融合蛋白係製備自DH5a細菌，經pGEX融合蛋白建構物轉型，如 103 200803835 先前所述(Yi等人，Mole Cell Biol. 12, 836 (1992))。編碼 PRL，N端接有Flag表位之cDNA (Castrucci等人，J. Virol. 66, 4647 (1992))，係經由重組DNA技術產生，經定序確認其相等性’並選殖至pBabepuro載體上(Yang等人，Blood 91， 5 3746 (1998))。抗Flag單株抗體(M2, Sigma)係購自商業來源。合成之磷酸酪胺酸胜肽（入^-八1^-1^11-14-0111-

Asp-Ala_Gle-Tyr -Ala-Ala-Arg-Gly (SEQ ID NO : 3)，其中酪胺酸經磷酸化；UBI)，以及DiFMUP(6,8-二氟-4-甲基繳形基磷酸鹽，Molecular Probes)，係購入作為受質，用於 10 PTPase 試驗。 2·體外PTPase試驗與免疫錯合物PTPase試驗體外PTPase试驗係用於決定化合物對於重組pTPases 之作用，依據已建立之流程，使用合成之磷酸酪胺酸胜肽或 DiFMUP 作為受質（pathak et al·，J. Immunol. 167 : 15 3391(2001))。簡言之，各PTPase ((u μ§/反應）於5〇吣之 PTPase緩衝液中（50 mM Tds，pH 7.4)，係置於22°C 10分鐘，或如指示在抑制化合物存在或不存在下靜置。受質（〇·2 磷酸酪胺酸胜肽)之後加入，並於22°C反應18小時。各反應之PTPase活性係以加入1〇〇 μι孔雀石綠溶液測量，之後定 20量PTPase自該胜肽受質切下之磷酸鹽，經由光譜法(〇D 660 nm)。使用DiFMUP作為受質之PTPase試驗，係依據先前描述流程進行（Matter等人，：^〇(^111.：8_11}^.1^.(^〇111111· 283，1061(2001))。PTPase試驗之相對活性係以下列公式計异：（在抑制劑化合物存在下之PTPase活性/在抑制劑化合物 104 200803835 不存在下之PTPase活性）χ 100%。為了評估PTPase抑制之可逆性，PTPase之GST融合蛋白係結合至楚胱甘肽 (glutathione)微珠(Pharmacia)上，預先與冰冷之Tris緩衝液 (50 mM Tris，pH 7.0)或含有抑制劑之Tris緩衝液於4°C靜 5 置30分鐘。微珠之後以冰冷之Tris緩衝液清洗三次，或不清洗，之後置於體外PTPase試驗。係進行免疫錯合物PTPase試驗，以評估葡萄糖酸銻鈉對於細胞内PTPase之影響。未經或經葡萄糖酸銻鈉處理5分鐘之細胞，係以新鮮之培養液清洗，之後裂解於冰冷之裂 10 解緩衝液(50 mM tris，pH 7·4 ; 150 mM NaCl ; 1% NP40 ; 2 mMPMSF ; 20 pg/mlAprotinin)中。裂解物係與Flag抗體靜置，進行免疫沈澱試驗。免疫錯合物係以蛋白質G sepharose 微珠(Pharmacia)收集，並以冰冷之裂解緩衝液清洗4次。約 90%各樣本内容物，係分為3份可比較部分，每一份靜置於 15 50 μΐ PTPase緩衝液中（50 mM Tris，pH 7.4 ; 0.2 mM 碟酸赂胺酸胜肽），於22°C靜置18小時。100 μΐ之孔雀石綠溶液(UBI) 係加至每一反應中，在測量OD660吸光值之前，以定量 PTPase自該胜肽受質切下之磷酸鹽（pathak et al.，J. Immunol· 167 : 3391(2001))。剩餘10%各樣本含量係經 20 SDS-PAGE/西方墨染分析，以定量磷酸酶蛋白之相對量。為了评估匍萄糖酸錄納對於細胞内PTPase活性作用之期間，Flag-PRL-2轉染細胞未處理，或以葡萄糖酸銻鈉於37 C處理5分鐘’以培養液清洗二次，移除不含細胞之藥物，之後靜置於37°C新鮮之培養液中24-72小時，之後以冰冷之 105 200803835 裂解緩衝液裂解細胞而終止。Flag-PRL-2係免疫沈澱自該裂解物，並進行於PTPase試驗與SDS-PAGE/西方墨染分析。 3·細胞、細胞培養、細胞生長試驗與轉染 NIH 3T3(Yang等人，Blood 85，87 (1995))，WM9 5 (Forsberg等人，Proc. Nat. Acad Sci· USA 90, 393 (1993))、 DU145(Mickey等人，Cancer Res· 37, 4049 (1977))、LoVo (Drewinko等人，Cancer Res· 36, 467 (1976))、HEY (Buick 等人，Cancer Res· 45, 3668 (1985))、U251 (Yoshida等人， Cancer 50, 410(1982))、A549 (Giard等人，J· Natl· Cancer Inst. 10 51，1417(1973))，及SK-N-SH (Helson等人，Cancer res· 35, 2594(1975))細胞株已描述，並培養於RPMI 1640培養液中，補充有10%胎牛血清(FCS)。為了測量葡萄糖酸錄鈉對於體外細胞生長之影響，細胞係培養於各種葡萄糖酸銻鈉量存在（+)或不存在㈠之條件下6天，存活之細胞以MTT定量 15 (Mosmann，J. Immunol· Methods 65, 55(1983))。係計算葡萄糖酸銻鈉生長抑制百分比（.+-.X%))。葡萄糖酸銻鈉對於細胞外PTPase之作用係使用NIH 3T3或WM9轉染物評估。NIH 3T3或WM9細胞係以 pBabepuro載體(V)或表現Flag-tagged PRL之pBabepuro建構 20 物（BRL)轉染’依據使用手冊。轉染物係於嗓呤黴素 (puromycin)(0.5 pg/ml)存在下二週選出，並延伸至不含,票呤黴素之培養液中，之後使用其測量葡萄糖酸銻鈉對於細胞外Flag-PRL之PTPase活性之影響，以決定細胞於葡萄糖酸録鈉存在或不存在下之生長情況。 106 200803835 4.動物實驗無胸腺裸鼠(nu/nu，NCR)，4週大(Taconic)，係於側腹接種(s.c·) DU145細胞(3 X 106細胞/位置），第〇天。在開始第 2天，小鼠係置於未經處理(控制組），或經葡萄糖酸銻鈉（12 5 mg，s.c·，每日，i.m·於臀部）處理。使用於此研究之葡萄糖酉文録納劑重類似於鼠類利什哭症治療之藥物劑量（Murray 等人1988)。腫瘤體積係經測量，並使用長球面公式計算 (V=4/3 7 a. sup. 2b)(Lindner等人1997)。小鼠之内臟器官與腫瘤接種位置組織之蘇木精(hematoxylin) + e〇sin(H.E.)染 10 色組織切片，係經製備並進行顯微鏡評估。 5·匍萄糖酸録納-抵抗性DU 145殖株之分離與鑑定 DU145細胞係培養於葡萄糖酸銻鈉（100叫/如)存在下，於48孔盤中培養3天。來自含有單一殖株孔之細胞係轉移至錐形瓶中，培養於不含葡萄糖酸銻鈉之培養液中3週， 15使用作為DU145R細胞，進行更進一步之鑑定。Dui45R成長於葡萄糖酸銻鈉存在或不存在下，第6天驗測定生長狀況。PRL編碼區域之cDNA係以RT-PCR衍生自DU145 與DU145R細胞，並定序，使用下述流程。 6·以RT-PCR分析偵測prl磷酸酶之表現 20 周邊血液單核細胞(PBMC)之PRL轉錄子之表現，來自健康捐贈者以及癌細胞株，係以RT_PCR偵測，用於各pRL 之特異性引子對列於下，或使用於GAPDHqRT_pcr產物以洋菜凝膠分離，並以溴化乙咬bronze)染劑染色，其相等性係以限制酶拼湊而確認。引子對序列為： 107 200803835 (SEQ ID NO : 4) huPRL-3/5 ， 5，-TAGGGATCCCGGGAGGCGCCATGGCTCGGATGA-3’ ； (SEQ ID NO : 5) huPRL-{部分（3/3)}， 5，-GAGTCGACCATAACGCAGCACCGGGTCTTGTG-3,； 5 (SEQ ID NO : 6) huPRL-2/5 ， 5，-TAGGATCCCCATAATGAACCGTCCAGCCCCTGT-3,； (SEQ ID NO ： 7) huPRL-2/3 ， 5，-GAGTCGACCTGAACACAGCAATGCCCATTGGT-3,； (SEQ ID NO : 8) huPRL-1/5 ， 10 5，_TAGGATCCCCAACATGGCTCGAATGAACCGCCC-3,； (SEQ ID NO ： 9) huPRL-1/3 ， 5’_GAGGTCGACTTGAATGCAACAGTTGTTTCTAATG_3,。 B.結果 1·葡萄糖酸銻鈉抑制體外重組PRL磷酸酶試驗 15 為了評估葡萄糖酸銻鈉是否為PRL磷酸酶之抑制劑，其對於重組PRL之填酸酶活性之影響係以體外pTpase試驗評估。重組PRL-1、PRL-2與PRL_3之PTPase活性，係以合成磷酸酪胺酸胜肽受質之去磷酸化而評估，在葡萄糖酸銻鈉 20存在下會降低，為劑量依賴形式，100 pg/ml葡萄糖酸銻鈉會產生80_90% PTpase抑制（第30A圖）。葡萄糖酸銻鈉的這些作用係於PRL與藥物預先靜置丨〇分鐘後開始pTPase試驗，加入受質至反應中。由於三種磷酸酶皆以類似方式被葡萄糖酸銻鈉抑制，PRL-3係選用於進一步的試驗中，研究 108 200803835 延長葡萄糖酸銻鈉預靜置時間對於磷酸酶活性之影響。 PRL-3與葡萄糖酸銻鈉預靜置3〇或6〇分鐘，造成更劇烈之抑制，近乎完全抑制pRL_3，發生於葡萄糖酸銻鈉濃度為1〇 pg/ml時（第30B圖）。係偵測prl-3被葡萄糖酸銻鈉抑制情 5況’使用另一受質（DiFMUP)，而已知之磷酸酶抑制劑原釩酸納（Burke et al.，Biopolymers 47，225 (1998))與蘇拉明 (suramine)(Zhang 等人，J· Biol· Chem. 273，12281 (1998))，為較無效，與葡萄糖酸銻鈉相較，在可比較之情況下（第30C圖）。葡萄糖酸銻鈉誘發類似之重組pRL_3與重 10組SHP-1抑制（第30D圖^ΡΚΧ·3被葡萄糖酸銻鈉抑制情況，並不會因為清洗過程而減緩（第30E圖），其有效移除SHP-1 抑制’藉由可逆抑制劑蘇拉明（suramine) (Pathak et al.，J. Immunol· 167 : 3391(2001)) 〇這些結果顯示葡萄糖酸銻鈉為重組PRL磷酸酶體外之 15 強效且不可逆之抑制劑。 2·葡萄糖酸銻鈉使NIH3T3轉染物之細胞外prl失去活性接著採討葡萄糖酸銻鈉對於細胞外PRL鱗酸酶之影響，以決定葡萄糖酸銻鈉是否為體内PRL之抑制劑。 20 Flag_tagged PRL-1表現建構物或控制組載體，係轉染至NIH3T3細胞中，之後以葡萄糖酸銻鈉處理或未處理，使用於免疫沈澱試驗，使用單株抗Flag抗體。免疫沈澱物係經SDS-PAGE/西方墨潰與PTPase試驗分析。Fiag_tagged蛋白，具有約22 kDa之分子量，預期Flag-PRL-1會出現於免疫 109 200803835

錯合物中’經或未經葡萄糖酸銻鈉處理後，但未見於控制組（第31A圖）。得自未經處理Flag-PRL-l轉染物之免疫錯合物’顯不出顯著之PTPase活性（約23倍），與控制組轉染物相較（第31B圖）。相對地，得自經處理Flag-PRL-1轉染物之免 5疫錯a物僅具有些微之PTPase活性，類似於控制組細胞 (第31B圖）。此種PTPase活性之缺乏亦見於經葡萄糖酸銻鈉處理Flag-PRL_2之画3T3轉染物（第迎圖），或 Flag-PRL-3(第31F圖）之免疫錯合物，雖然Flag_tagged pRL 在免疫錯合物中，得自經葡萄糖酸錄鈉處理或未處理之細 10胞，存在量類似（第31C與E圖）。攻些結果顯示葡萄糖酸銻鈉處理會使轉染物之細胞外 PRL失去活性，表示葡萄糖酸銻鈉為—有效之體内填酸酶抑制劑。 3.葡萄糖酸銻鈉誘發犯犯乃轉染物中pRL_2失活 15 (inactivation)延長由於觀察到㈣糖酸録鈉會使細胞外PRL失去活性，葡萄糖酸録鈉誘發之PRL失活之時間便為相當重要之議題。由於㈣糖酸錄納對於每—PRL之效料相等（第31 圖遂測定在聰3T3中葡萄糖酸錄納誘發之單—胤失活 20 之時間。 SDS-PAGE/西方墨㈣视·2轉染物係簡單經葡萄糖酸銻納處理5分鐘，清洗以移除不含細胞之藥物，之後靜置不同時間，在細胞㈣之前。得自該細胞之抗％免疫錯合物，係經 /貝與PTPase試驗分析。在免疫錯合物 110 200803835 中，Flag-PRL_2蛋白量皆類似，使用抗Fiag抗體偵測（第32b 圖）。得自經葡萄糖酸銻鈉處理之細胞之免疫錯合物，顯示 PTPase活性明顯降低，與控制組相較（比較第32A圖第1行與第2行），與PRL-2被葡萄糖酸銻鈉處理失活一致。得自經葡 5萄糖酸錄納處理不同日守間之細胞，與細胞清洗之免疫錯合物，顯示逐漸增加PTPase活性，具有時間依賴性性質，在經葡萄糖酸銻鈉處理之細胞中（第32A圖第3-9行）。得自靜置 24小時（第32A圖第7行)之細胞之免疫錯合物PTPase活性，為未經處理細胞之78%。得自靜置48-72小時（第32A圖第8 10 與9行）之細胞之免疫錯合物，顯示之PTPase活性類似於未經處理之細胞。. 這些結果顯示簡單之葡萄糖酸銻鈉處理，對於細胞外 PRL-2活性具有延長之效果，其需要至少24小時，以完全自 NIH3T3轉染物中移除。 15 4·葡萄糖酸銻鈉抑制表現有PRL磷酸酶之人類癌細胞株之體外生長已知PRL磷酸酶之致癌活性，及PRL-3過度表現與大腸癌之轉移有關，一般認為葡萄糖酸銻鈉可能會使人類癌細胞失活，因而具有抗癌活性。PRL在各人類癌細胞株之表 20現量，以及葡萄糖酸銻鈉對於各細胞株之體外生長係經測定0 PRL之表現係於人類肺癌（A549)、卵巢癌（Hey)、直腸癌（LoVo)、神經母細胞瘤（SK-N_SH)、神經膠質瘤（u251)，以及前列腺癌(DU145)(第33圖）細胞株中觀測到。細胞株之 111 200803835 體外生長係於葡萄糖酸錄鈉存在下被抑制，為劑量依賴形式（第34圖）。濃度為1〇〇 μ§/ιη1之葡萄糖酸録納會使細胞株產生接近完全之細胞毒殺作用，在實驗條件下，而低劑量之藥物’亦對這些細胞株展現明顯之生長抑制作用 5圖）。在這些細胞株中^紐前况細胞對藥物最敏感，在濃度為25_U時，產生約8〇%之生長抑制（第叫）。此劑量之葡萄糖酸銻鈉會導致約5〇%生長抑制，於較不敏感之DU145細射，而在其他細胞株巾财6()_76%之生長抑制（第34圖）。 ' 10 $些結果顯示葡萄糖酸錄鈉對於多種表現有不同量之 PRL磷酸酶之細胞株，皆具有體外生長抑制作用。 5.非毒性劑量之葡萄糖_鈉抑聽鼠巾則45腫瘤之生長為了進-步评估葡萄糖酸錄鈉之體内抗癌活性，遂測 15定葡萄糖酸銻鈉對於裸鼠中DU145腫瘤生長之影響。裸鼠係於肩部區域皮下接種〇饥45細胞。接種後兩天，當腫瘤為肉眼可見，，】、鼠係進行未處理(控制組），或經葡萄糖酸銻鈉處理（每日注射44G mg/kg，於臀部區域肌内注射）。在控制組小鼠中，則45腫_示劇烈之成長（第 2〇 35A圖）(數據代表平均值±蠢（n=8))，與先前之報導一致 (M1Ckey等人 ’ Cancer Res. η，4_(1977》。葡萄糖酸錄納處理會抑制約30%之DU145腫瘤生[與控制組小鼠之腫瘤體積比較(第35A圖）。在處理時程末期，接種位置之組織學 »平估顯示在帛萄糖g鱗鈉處理小㉟+，有小腫瘤群聚出 112 200803835

現（第35C圖），與控制組織單一且大許多之腫瘤相較（第35B 圖）。二組中之所有小鼠皆存活，直到實驗結束。其主要器官之組織學結果並不顯著。這些結果顯不葡萄糖酸銻鈉對於小鼠DU145腫瘤生 5長，具有抑制作用，與無明顯毒性相關，並提供證據，說明在非毒性劑量之葡萄糖酸銻鈉具有體内抗腫瘤活性。 6·葡萄糠酸銻鈉-抵抗性DU145R細胞會表現PRL-1石粦酸酶突變形式，對於葡萄糖酸銻鈉抑制作用不敏感在培養物中觀察到DU145細胞對於葡萄糖酸銻鈉出現 10不敏感現象（第34圖），說明了 DU145細胞可能含有亞群，可抵抗該藥物。此現象亦與之前觀察到的，經葡萄糖酸銻鈉小鼠具有DU145小腫瘤群聚之現象(第35C圖）一致，其可能是因為此匍萄糖酸錄納-抵抗性細胞向外生長所致。PRL為致癌性填酸酶，表現於DU145細胞中（第33圖），葡萄糖酸銻 15鈉抑制重組（第30圖）與細胞外PRL(第31圖），而DU145細胞含有葡萄糖酸銻鈉-抵抗性細胞分佈，其表現葡萄糖酸銻鈉 -不敏感PRL突變物，將作更進一步之研究。 DU145細胞係於葡萄糖酸銻鈉存在下（1〇〇 gg/ml)培養 4週。當大部分細胞於該期間内死亡時，某些細胞卻可存 2〇活，並形成獨特之殖株。其中一殖株(DU145R)係單離出，作更進一步之鑑定，顯示在培養時對於葡萄糖酸銻鈉具生長抵抗性，與原DU145細胞相較（第36A圖，數據代表三重複之平均+s.d·值）。得自DU145細胞與葡萄糖酸銻鈉_抵抗性殖株之PRL編碼區塊之cDNA序列分析，顯示prl-2與PRL-3 113 200803835

之cDNA為野生型。有趣的是，得自DU145之PRL-1之CDNA 顯示在位置259出現了核苷酸T，而野生型PRL-1之相對應位置為核苷酸A (第36B圖），結果產生了絲胺酸(S86)被取代為精胺酸(R86)之現象，在PRL-1蛋白之磷酸酶區塊（第36C 5圖）。得自DU145之PRL_1 cDNA之剩餘序列為野生型。得自原DU145細胞之PRL-1 cDNA為野生型（第36B圖）。含有R86之重組PRL-1蛋白係製備，並顯示其體外之 PTPase活性類似於野生型PRL-1(第36D圖，數據代表三重複之平均+s.d·值）。然而，其PTPase活性僅降低約20%，在葡 10萄糖酸銻鈉存在下，相對於野生型PRL-1，其由於藥物誘發之抑制有90%，在可比較條件下（第36E圖，數據代表三重複之平均+s.d.值）。這些結果顯示DU145中含有葡萄糖酸銻鈉-抵抗性細胞’其中突變之PRL-1與野生型磷酸酶共表現。由於突變之 15 PRL-1為具活性之磷酸酶，但對於葡萄糖酸銻鈉抑制作用不敏感，主要係產生對該藥物之癌細胞抵抗性。事實上該突變無法於得自原DU145細胞之PRL_1 cDNA定序分析偵測到’說明了其僅存在於小量細胞分佈中，與葡萄糖酸銻納處理小鼠中，DU145小腫瘤之侷限數目現象一致（第35圖）。 20 7.細胞外PRL-1R86對於葡萄糖酸銻鈉抑制作用不敏感，並產生葡萄糖酸銻鈉在WM9黑色素瘤細胞中誘發之生長抑制抵抗性

為了評估PRL-1R86在癌細胞之葡萄糖酸銻鈉抵抗性中粉〉貝之角色，編碼Flag_tagged PRL]或R86突變之cDNA 114 200803835 係選殖至pBabapuro載體上（Yang等人，Blood 91, 3746(1998))，並轉染至WM9人類黑色素瘤細胞株上，其中内生性PRL係表現出，且在其編碼區塊中無突變產生，經由RT-PCR與序列分析測定。穩定轉染之細胞族群係衍生自 5 之後之嘌呤黴素篩選。為了決定WM9細胞中之R86突變為具活性之磷酸酶，但對於葡萄糖酸銻鈉抑制作用不敏感，WM9轉染物未經處理或經葡萄糖酸銻鈉處理5分鐘，清洗以移除不含細胞之藥物’並裂解於裂解緩衝液中。得自該細胞裂解物之抗Flag 10 免疫錯合物，係以SDS-PAGE/西方墨潰與PTPase試驗分析。如預期的，Flag-tagged PRL-1與R86突變蛋白係於得自相對應之轉染物之免疫錯合物中偵測到，但載體控制组細胞中未偵測到（第37A圖）。得自未經處理之Flag-PRL-Ι與 Flag-R86轉染物之免疫錯合物，顯示出構酸酶活性高於載 15 體控制組之背景值（第37B圖；數據代表三重複之平均卄欣值），顯示轉染物中表現之PRL-1與R86皆具磷酸酶活性。有趣的是，得自葡萄糖酸銻鈉處理之R86轉染物之免疫錯合物，僅顯示中度降低(20-30%)，與未處理之R86細胞相較（第 37B圖），而得自葡萄糖酸銻鈉處理之pRL—丨轉染物之免疫錯 2〇合物係抑制52-90% ’在匍萄糖酸録納處理下，為劑量依賴形式（第37B圖）。因此，細胞外PRL-1R86突變碟酸酶對於葡萄糖酸錄納抑制並不敏感。為了進一步評估PRL-1R86之表現是否會影響葡萄糖酸銻鈉-誘發之生長抑制，該轉染物係培養於葡萄糖酸録納 115 200803835 存在或不存在下6天，存活細胞以MTT試驗測定。該轉染物頒示類似之生長狀況，在葡萄糖酸銻鈉不存在情況下（第 37C圖；數據代表三重複之平均+8(1·值）。在葡萄糖酸錄鈉存在下，PRL-1與載體控制組細胞之生長之抑制為劑量依賴 5型（弟PD圖，數據代表三重複之平均+S.4·值）。然而，R86 轉染物之生長並未受到葡萄糖酸銻鈉之抑制，在125或25 Kg/ml，而其他轉染物生長則受到2(Μ〇%之抑制（第37D 圖）。較高劑量之葡萄糖酸銻鈉（50或1〇〇 Rg/ml)僅誘發R86 細胞中度之生長抑制，與其對於PRL-1細胞之作用相較（第 10 圖）。因此’葡萄糖酸錄鈉在抑制PRL-1R86轉染物方面較無效，顯示WM9細胞中PRL_1R86之異位表現會產生葡萄糖酸銻鈉生長抑制活性之抵抗性。 8.錄酸曱葡胺(Glucantime)抑制SHP-1與prl-3 為了評估含銻化合物亦可作為PTPase抑制劑，係以體 15 外PTPase試驗分析銻酸甲葡胺（Glucantime)抑制SHP-1與 PRL-3之作用。 SHP-1與PRL-3之PTPase活性，將合成碟酸酪胺酸胜肽受質去磷酸化，係於銻酸甲葡胺存在下降低，為劑量依賴形式（第38圖）。就100 pg/ml之銻酸甲葡胺而言，約9〇〇/0之 20 SHP-1被抑制，以及約100%之PRL-3被抑制（第38圖）。 C.討論這些結果絲員不匍甸糖酸錄納為PRL抑制劑。葡萄糖酸銻鈉，以劑量依賴形式，體外抑制重組PRL(第30圖）與 NIH3T3轉染物之細胞外PRL之活性（第31圖）。葡萄糖酸銻 116 200803835 鈉處理會使體外重組PRL(第30圖）與NIH3T3轉染物之細胞外PRL(第31圖）之活性近乎完全喪失，於劑量為1〇時，類似於先所知之PTPase標靶smM之藥效(Pathaketal.， J· Imnumol· 167 ·· 3391(2001))。相對的，SHP-2對於葡萄糖 5酸銻鈉較不敏感，需要100 gg/ml之劑量才能達到可比較之抑制量’而藥物對於MKPI磷酸酶僅具有些許活性，如先前之研究所示。重要的是，葡萄糖酸銻鈉對抗PRL之有效劑量為臨床上可達到的體内劑量，其投以每曰10-20 mg/kg，在標準葡萄糖酸銻鈉治療中（Herwaldt et al.，Am. J. Trop. 10 Med· Hyg· 46, 296 (1992))。短暫暴露於葡萄糖酸銻鈉，會產生細胞外PRL之抑制，持續藥效超過24小時（第31圖），在葡萄糖酸銻鈉治療時，會發生PrL體内失活。觀察到體外葡萄糖酸銻鈉-誘發之PRL-3失活，係以清洗步驟移除（第 30E圖），顯示不可逆抑制劑機制。此作用模式係與葡萄糖 15酸銻鈉-誘發之長時間細胞外PRL-2抑制一致（第31圖），且與延長葡萄糖酸銻鈉與磷酸酶預靜置時間，而使Prl_3失活更有效之現象相關（第30B圖）。此資料亦顯示葡萄糖酸銻鈉具有抗癌活性。葡萄糖酸錄鈉以劑量依賴形式抑制多種人類癌細胞株，包括前列腺 20癌細胞株DU145 (第34圖）。葡萄糖酸銻鈉之體内抗癌活性，係以葡萄糖酸銻鈉抑制裸鼠DU145腫瘤之生長表示，於葡萄糖酸銻鈉之非毒性劑量（第35圖）。事實上其他癌細胞株，與DU145相較，對於體外葡萄糠酸銻鈉更敏感（第34 圖），代表可能該藥物對抗其他癌症更有效，在小鼠模式 117 200803835 中，在可比較之條件下為癌症治療之候選藥物步之臨床評估。這些結果說明葡萄糖酸銻鈉可作並長:供臨床前資料，以作更進一 5 10 15 20 运些結果提供數個證據，說明葡萄糖之抗癌活性至少部分由於癌細胞中之飢失活而造成= 萄糖酸鍊鈉對抗之癌細胞顯示出體外生長抑制（第34圖表現PRL(第33圖）。這些㈣萄糖_鈉㈣之磷酸酶皆: 重組蛋白（第3G圖），或於其細胞外環境（第叫糊）。此外我們顯不DU-145之葡萄糖酸録納_抵抗性殖株，其表 PRL-1之突變形式’一種具磷酸酶活性，但對葡萄糖酸銻鈉抑制不敏感（第36圖），提供對於葡萄糖酸錄鈉之生長抑制作用抵抗性，當異位性表現於WM9黑色素瘤細胞中（第37 圖）。這些結果顯示，PRL]，,亦可能為其他肌，之失活，在葡萄糖酸録鈉對於癌細胞株之生長抑制方面，扮演重要角色。特別是’ PRL-1主要負f媒介葡萄糖酸錄納之生長抑制活性’在劑量範圍為12 5_25 Kg/ml時，其顯示對於 PRL-TR86轉染物無生長抑制作肖，但可有效抑制聊]轉柒細胞之生長（弟37D圖）。與此現象一致，這些劑量之葡萄糖酸銻鈉對於抑制重組與細胞外PRL相當有效（第3〇、31、 36與37圖）’但對於prl_1R86突變物無效（第36與37B圖）。雖然葡萄糖酸銻鈉對於抑制SHP—丨亦顯示類似之藥效（第3〇圖），此PTPase主要表現於造血細胞（Yi等人，Blood 78,2222(1991) ; Yi等人，Molecular & Cellular Biol. 12，836 (1992)) ’未預期出現於實驗之非造血癌細胞株中（第34圖）。 118 200803835 事實上，缺乏SHP-1表現之WM9黑色素瘤細胞係以西方墨染確認，使用抗SHP-1抗體。因此，葡萄糖酸銻鈉對抗WM9 細胞與WM9轉染物之生長抑制活性，係與SHP-1無關。然而，SHP-1被葡萄糖酸銻鈉抑制可發生於造血細胞中，且在 5葡萄糖酸銻鈉活性中扮演重要角色，可放大細胞激素訊號，其被PTPase負向調節（Pathak et aL，J. Immunol. 167 : 3391(2001)) 〇由於葡萄糖酸銻鈉之體外生長抑制活性，與對抗小鼠中DU145腫瘤之活性，類似於經由使癌細胞中之PRL失活， 10葡萄糖酸銻納可能對於人類惡性腫瘤治療相當有助益，其中致癌性磷酸酶係一致性地表現出，並扮演致病角色。雖然目前僅於轉移性直腸癌中觀察到PRL_3表現增加 (Bradbury，Lancet 358, 1245 (2001); Saha等人，Science 294, 1343(2001)) ’事貫上PRL多種人類癌細胞中觀測到可觀之 15表現量（第33圖）’說明了鱗酸酶之表現為人類惡性腫瘤之一般現象。更進一步研究以評估PRL在人類腫瘤樣本中之表現量，將提供重要的資訊，確認人類惡性腫瘤之類型與階段，對於葡萄糖酸銻鈉療法敏感有潛力，可用於臨床評估。在此觀點中，葡萄糖酸銻鈉-不敏感之PRL·〗突變株之辨 20識，便顯示出以PRL定序分析辨認癌症病患中葡萄糖酸銻鈉-敏感，或葡萄糖酸銻鈉·抵抗性人類腫瘤之價值，其中 PRL-1突變可作為葡萄糖酸銻鈉-抵抗性指標。此外，葡萄糠酸銻鈉-不敏感PRL-1突變，提供發展對抗葡萄糖酸銻鈉_ 不敏感PRL抑制劑之基礎，作為另一抗癌療法。 119 200803835 辨識出葡萄糖酸銻鈉可作為首度臨床上可使用具有抗癌活性之PRL抑制劑，代表了在發展以㈣咖抑制劑作標靶療法上之顯著突破，並開啟一個新的研究領域，用於更進-步之機制研究。葡萄糖酸銻鈉中之録與硫氯基團形 5成共價鍵之能力（Berman时dGrogl· 1988)，以及所有酪胺酸磷酸酶催化性半胱胺酸之存在（H〇〇ft van H叫^叫⑶， 1998)，說明半胱胺酸被葡萄糖酸銻鈉_之五價銻修飾，做為-有潛力之失活機制。此假設之作用模式與葡萄糖酸録鈉對於重組PRL-3 (第30圖）與SmM(Pathak et此，； 1〇 MmunoL 167 : 3391(2001))之不可逆_，以及葡萄糖酸錄鈉誘發之細胞外PRL_2抑制之長時效性（第32圖）一致。此假設模式更暗示葡萄糖酸銻鈉之有機片段可提供pTPase催化區域之構形互補，以幫助銻/半胱胺酸交互作用，因而定義出PTPase特異於該抑制劑。此外，該假設之模式提供了一 b合理的解釋，說明MKP1(Pathak et al”】Im麵〇ι 167 : 3391(2001))與PRL_1R86突變物（第36與37圖）對於葡萄糖酸銻鈉抑制之不敏感性。與此假設一致，係發現銻酸甲葡胺 (五價銻共輛至N-甲基葡萄糖胺上）具有PTPase抑制劑活性，可對抗SHP-1與PRL-3(第38圖），以及其他PTPase (其中 20某些不受葡萄糖酸銻鈉影響）。因而可發展出新穎且更具特異性之PTPase抑制劑，以含有銻共軛至不同以有機片段上之化合物為基礎。因此，葡萄糖酸銻鈉代表一新類型之 PTPase抑制劑，可更進一步發展為新穎之療法與實驗工具。 VI·與葡萄糖酸銻鈉中選擇性化合物相關之pTpase 120 200803835 抑制劑活性為了決定在葡萄糖酸銻鈉混合物中是否僅選擇性或所有的化合物皆為有效之PTPase抑制劑，且是否葡萄糖酸録納之PTPase抑制活性僅由於Sb所造成，葡萄糖酸銻鈉係以 5層析法分離。各分液之Sb含量與pTpase活性係測定。 A.材料與方法葡萄糖酸銻鈉混合物係以HPLC分離，使用J〇rdi凝膠管柱（Jordi 100A ; Jordi Associates，Bellingham，Mass)，以水沖 • 提，速度為0.2ml/min，在沖提期間收集分液。沖提物中之 H)化合物相對量係以質譜監測（全掃猫）。葡萄糖酸錄納中之补含量與葡萄糖酸銻鈉分液，皆㈣導絲合電漿質譜定量，依據標準流程，使用Sb溶液標準物，葡萄糖酸錄納與葡萄糖酸銻鈉分液係製備於均一基質，〇 8mhnc^i 2m 肥中。銦使用作為標準物。在分析期間校正曲線趨於釋定 15 (協率飄移429%)。樣本中之处含量值，具有約爲最大 '㈣錯誤值，以所有系統性與隨機錯誤計算為基礎。收集 # 之沖提物中，備測到之_量為約9〇%層析法載入之葡^ B·結果與討論 20 葡萄糖酸銻鈉混合物中之化合物沖提出’在層析過程中，大部心:::：= =，_)。與分液1(—提:二 ^ 致，该分液中未偵測到Sb，以誘導式叙人恭偵質·測（第39績）。分液2_7顯示各祕含量，最=衆 121 200803835 則於刀液4與5，總计為沖提物中处總量之96〇/〇(第拠圖）。各刀液與原葡萄糖酸録納混合物對抗重組§HP-1 PTPase之抑制活性，係以體外ρτρ_試驗評估。葡萄糖酸銻納在sb濃度為10μ§/_，可使SHM失活(第薦圖；數 5據代表三重複之平均+sd•值）。如預期的，由於其未含有可偵測之化合物或Sb (第39B圖），分液1為顯示出對抗sjjh 之活性（第39B圖）。分液6與7亦無法抑制PTPase，雖然具有低含量之Sb (第39B圖）。有趣的是，分液2，具有類似於分液6與7之Sb含量，確有對抗SHP-丨之活性（第398圖）。相對 10的’分液3與4對於SHP-1之PTPase活性僅具有次要之作用 (第39B圖），雖然事實上其Sb含量約為分液2之1〇至2〇倍（第 39B圖）。分液5亦顯示明顯之抗811?_1活性，其汕含量幾乎為分液2之100倍（第39B圖）。重組SHP-2亦被分液2與5抑制’但不受其他分液影響，在可比較之條件下。 15 這些結果顯示，對抗重組SHP之抑制活性，僅與葡萄糖酸銻鈉混合物中之選擇性化合物相關，且並非僅由％量所定義，但可有效抑制PTPase，儘管其Sb含量相當低（第39A 圖），說明了葡萄糖酸銻鈉中僅有少部分之化合物主要反應出該藥物之PTPase抑制活性。這些結果說明葡萄糖酸銻鈉 20 中之活性化合物可經純化，而更為藥效更強，且毒性更小之PTPase標靶療法。愈準確辨識地出最具活性之葡萄糖酸銻鈉物種，亦可提供定義葡萄糠酸銻鈉化學結構之基礎，以及與標靶PTPase之交互作用。這些辨識出之分子亦可提供新穎PTPase抑制劑之合理設計之起始觀點。 122 200803835 VII·左美素(levamisole)、噴他脉(pentamidine)與酮康唑(ketoconazole)具有體外PTPase抑制活性為了評估藥物左美素、噴他脒與酮康唑，其已知可有效對抗利什哭病’可作為PTPase抑制劑，這些藥物之體外 5 效用係經檢驗。 A. 方法體外PTPase試驗係用於決定左美素（sigma)、喷他脒 (American Pharmaceutical Partners，Inc·)與酮康唑（Sigma)對於PTPase之藥效，依據已建立之流程（Pathak et al·, J. 10 Immunol. 167，3391(2001) ; pathak et al·，Leukemia 16, 2285(2002) ; Yi et al·，J· Immunol. 169, 5978(2002))，使用合成性磷酸酪胺酸胜肽或DiFMUP，作為受質，如上節I.A.2 所述。 B. 結果與討論 15 1·左美素、噴他脒與酮康唑具有體外PTPase抑制活性左美素、喷他脒與酮康唑之活性，係進行抗SHP-1、 PTP1B與MLP1(第34與35圖）與GSTm8 (第40C圖）之體外 PTPase試驗。不像葡萄糖酸銻鈉，左美素、喷他脎與酮康唑並不具有明顯的SHP-1 (第34與35圖）與GSTm8(第40C圖） 2〇抑制活性，於治療濃度(3-4 pg/ml)或更高濃度（1 〇_i00 pg/ml) 時。然而，這些藥物可達到明顯的PTP1B活性抑制量（約 80-98%) ’於0.1-1 pg/ml ’而葡萄糠酸銻鈉僅有些許作用（第 40B與41B圖）。此外，三種藥物亦顯示出對於]y[KPl實質上之抑制，而SS無明顯抑制（第41C圖）。 123 200803835 噴他脒與酮康唑之活性亦以測定PRL-1、PRL-2、PRL-3 之體外PTPase試驗而決定（第42圖）。喷他脒可有效對抗 PRL-3，於治療濃度高於0·1-1〇〇 pg/ml，可降低PTPase活性至20_30% (第42A圖）。喷他脒對於PRL-2無效（第42A圖）。 5顚1康唑對於PRL-3有效，於治療濃度大於0.M00 pg/m卜可降低PTPase活性至25-40% (第42B圖）。酮康唑對於PRL-1與 PTPase並不甚有效，在藥物治療濃度為onoo gg/ml，僅維持60-70%之活性（第42B圖）。酮康唑對於prl-2無效（第 42B 圖）。 10 這些結果顯示喷他脒與酮康唑具有某些PTPase之體外抑制活性，且PTPase對於葡萄糖酸録鈉、左美素、喷他脉與酮康唑具有不同敏感度。結果顯示，喷他脒與酮康唑可以細胞内PTPase為標靶，為其抗利什曼病活性之主要機制，因而亦具有抗癌活性。明顯的，葡萄糖酸銻鈉、左美 15素、喷他脒與酮康唑係以不同PTPase為標靶，說明這些抑制劑可對於不同癌細胞具有活性，每-者皆需要獨特之 PTPase，形成其惡性腫瘤之表型。 2·喷他脒於體外抑制WM9細胞之生長，並放大正沁^ 誘發之WM9細胞之生長抑制 2〇 & 了#估其潛在之抗癌活性，噴他脉與酮康4作為單減』，或與IFN-ct組合，對於侧9細胞體外生長之作用，係經測定（第43圖）。喷他脒顯不明_生長抑制活性，單—試劑使用時(第 43A圖）。噴他脉可達到86_97%之抑制，於2 ^ _，該 124 200803835 濃度類似於治療劑量(2-4 mg/kg)(第43A圖）。藥物放大之 IFN-α誘發生長抑制，在0.625-1.25 pg/ml濃度時最明顯。這些結果顯示喷他脒具有明顯的抗癌活性，並可與IFN-a作用。 5 酮康唑於濃度0·625_20 pg/ml時並無明顯的抗WM9細胞之活性，不論是作為單一試劑或是與IFN-a組合時（第43B 圖）。在較高濃度(40 pg/ml)時，酮康唑可達到67%之生長抑制，作為單一試劑，並對於IFN-a活性有次要放大作用（第 43B圖）。由於二藥物皆顯示類似之抑制PTP1B與MKP1之活 10性（第41圖）’其對於WM9細胞之作用差異顯示，ρτρίΒ與 MKP1並非喷他脒抗癌活性所作用之關鍵標乾pTpase。儘管本發明之各種特徵已如上述說明，應瞭解到該特徵可單獨使用，或以任一組合物形式使用。因此，本發明並不侷限於於此所述之特定實施例。 15 此外，應瞭解到熟習此技術領域者可依據本發明申請範圍進行各種變化與修飾。於此描述之實施例為本發明之範例。該揭示可使此技術領域者可進行與使用該實施例，使用本發明申請專利範圍之等效性元件。因此，本發明範圍包括其他實施例，與申請專利範圍或其字面上意義實質 20上無不同者。因此，本發明範圍係依據後述申請專利範圍所疋義。所有於此引用之茶考文獻，包括專利、專利申請案、文獻及類似者，皆在此併入本案以作為參考資料。【圖式簡單說明】弟1圖係葡萄糖酸銻鈉（sodium stibogluconate)(A)與錄 125 200803835 酸曱葡胺(meglumine antimonate)(B)之假設結構。第2圖係S同康嗤（ketoconazole)(A)、左美素 (levamisole)(B)與喷他脒(pentamidine)(C)之假設結構。第3圖係A. SHP-1、SHP-2與PTP1B之GST融合蛋白於不 5 同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)存在下之相對PTPase活性。B· GST/SHP-1融合蛋白於不同量之葡萄糖酸銻鈉或蘇拉明 (suramine)存在下之相對PTPase活性。C. PTP1B與MKP1之 GST融合蛋白於不同量之葡萄糖酸銻鈉存在下之相對 PTPase活性。

10 第4圖係A. SHP-1 與SHP-1催化區塊(SHP-lcata)之GST 融合蛋白之蛋白區塊結構。B. SHP-1與SHP-1 cata融合蛋白於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)存在下之相對PTPase活性。第5圖係SHP-1之GST融合蛋白與葡萄糖酸銻鈉（SS)或蘇拉明預靜置，隨後清洗(+)或不清洗之相對PTPase活性。 15 第6圖係Baf3細胞除去IL-3達16小時後，培養於葡萄糖酸銻鈉（SS)(A)或過飢酸納(pervanadate)(B)之不同時間下，總細胞裂解物之SDS-PAGE凝膠圖。第7圖係B a f3細胞之總細胞裂解物之S D S - PA G E凝膠圖，顯示葡萄糖酸錄鈉（SS)增加Baf3細胞中IL-3誘發之 20 Jak2/Stat5酪胺酸碗酸化作用。第8圖係A.葡萄糖酸銻鈉（SS)可增加培養於IL-3之Baf3 細胞增生作用。Β·以不同量之IL-3，以及葡萄糖酸銻鈉存在或不存在下，培養Baf3細胞三天後之細胞數。第9圖係A. TF-1細胞培養於不同量之GM-CSF及有或 200803835 無葡萄糖酸銻鈉（SS)三天後之增生作用。Be TF-1細胞培養於GM-CSF與不同量之iFNa及有或無葡萄糖酸銻鈉（SS)三天後之增生作用。C·以細胞生長抑制百分比表示b之結果。 D. TF-1細胞培養於GM-CSF與不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS) 5六天後之增生作用。E· TF-1細胞培養於GM-CSF/IFNa與不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)六天後之增生作用。第10圖係A. SHP-1、PTP1B與MKP1之GST融合蛋白於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)，或酒石酸銻鉀（酒石酸銻鉀)(PSbT)存在下之相對PTPase活性。B. Baf3細胞於葡萄糖 10 酸錄納或酒石酸銻卸存在或不存在下，以il-3激活不同時間之總細胞裂解物SDS-PAGE凝膠圖。c. Baf3細胞於IL-3 (10單位/ min)存在下，培養於不同量之葡萄糖酸銻鈉或酒石酸銻鉀三天後之增生作用。第11圖係Α· NB4細胞暴露於葡萄糖酸銻鈉（ss)三天與 15六天後之NBT-陽性細胞百分比。Β· NB4細胞暴露於全反式維甲酸(ATRA)或葡萄糖酸銻鈉六天後之NBT-陽性細胞百分比。C·控制組研究顯示葡萄糖酸銻鈉-誘發NB4細胞分化作用導致10%CDllb陽性細胞之增加。d. NB4細胞培養於葡萄糖酸銻鈉三天，葡萄糖酸銻鈉-誘發NB4細胞分化作用導 20致24%CDllb陽性細胞之增加。Ε· NB4細胞培養於全反式維甲酸三天，葡萄糖酸銻納-誘發NB4細胞分化作用導致 46%CDllb陽性細胞之增加。第12圖係A. NB4、HL_60與U937細胞培養於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)六天後之生長抑制百分比。Β· NB4細胞 127 200803835 培養於不添加或葡萄糖酸銻鈉或全反式維甲酸(AT R A)存在下之G0/G1、S或G2/M期百分比。C. NB4細胞培養於不添加葡萄糖酸銻鈉或全反式維曱酸三天後之流式細胞儀分析圖 (X軸顯示以膜聯蛋白V (Annexin V) FITC染色，Y軸顯示以 5 碘化丙啶染色）。D· NB4細胞培養於葡萄糖酸銻鈉存在下三天後之流式細胞儀分析圖（X軸顯示以膜聯蛋白V (Annexin V) FITC染色，Y軸顯示以碘化丙啶染色）。E. NB4細胞培養於全反式維甲酸存在下三天後之流式細胞儀分析圖（X軸顯示以膜聯蛋白V (Annexin V) FITC染色，Y軸顯示以碘化丙 10 唆染色）。第13圖係Α· NB4細胞於存在或不存在葡萄糖酸銻鈉 (SS)或全反式維甲酸(ATRA)下培養六天後洗滌，並繼續培養六天之NBT·陽性細胞百分比。Β· NB4細胞於存在或不存在葡萄糖酸銻鈉或全反式維甲酸下培養0.5至24小時後洗 15 滌，並繼續培養六天之NBT_陽性細胞百分比。第14圖係A· HL_60細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS) 存在或不存在下’培養3或6天之NBT-陽性細胞百分比。B. U937細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)存在或不存在下，培養3或6天之NBT-陽性細胞百分比。c· HL_60細胞於全反 20式維甲酸(ATRA)或葡萄糖酸銻鈉存在或不存在下，培養〇或6天之NBT-陽性細胞百分比。d· U937細胞於全反式維甲酸或葡萄糠酸銻鈉存在或不存在下，培養〇或6天之NBT—陽性細胞百分比。第15圖係HL-60 (A)與U937 (B)細胞於粒細胞/巨噬細 128 200803835 胞集落刺激因子(GM-CSF)、葡萄糖酸銻鈉（ss)或兩者存在或不存在下，培養不同時間後之NBT-陽性細胞百分比。第16圖係A. DR細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉（ss)與/ 或IFNct存在或不存在下，培養3天之細胞生長情形。B•由 5圖A數據計算之DR細胞生長抑制百分比。C. DS細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉與/或IFNa存在或不存在下，培養3天之細胞生長情形。D· DR細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉（ss)與 /或IFNa存在或不存在下，培養六天之細胞生長抑制百分比。E· U266細胞以IFNa與不同量之葡萄糖酸銻鈉培養六天 10 之生長抑制百分比。第 17 圖係 WM9 (A)、DU145 (B)、MDA231 (C)與 WiT49-Nl (D)細胞於不同量之葡萄糖酸銻鈉（SS)與/或IFNa 存在或不存在下，培養六天之細胞生長抑制百分比。第18A，B圖係WM9細胞於不同量之SS、IFNa與IFNp存 15 在或不存在下培養六天之細胞生長抑制百分比。第19圖係顯示WM9細胞之葡萄糖酸銻鈉（SS)與 IFNg(A)或IFNP(B)之間協同作用之細胞控制百分比。第20圖係顯示U266細胞於不存在(A)或存在IFNa(B)、葡萄糖酸銻鈉（SS)(C)或兩者(D)下培養三天之流式細胞儀 20 分析圖（X軸顯示以膜聯蛋白V FITC染色，Y軸顯示以碘化丙σ定染色）。第21圖係A. DR細胞於葡萄糖酸銻鈉（SS)不存在或存在下，進行不同時間點之IFNa刺激反應後，總細胞裂解物之SDS-PAGE凝膠圖。B·癌症人類細胞株WM9、WM35、 129 200803835

WiT49-Nl與DU145於葡萄糖酸銻鈉不存在或存在下，以 IFNa刺激五小時之總細胞裂解物之SDS-PAGE凝膠圖。第22A，B圖係葡萄糖酸銻鈉、iFNa或兩者對於裸鼠 WM9與DU145腫瘤體積隨時間之影響。 5 第23圖係WM9異種皮移植裸鼠與控制組體重之比較。第24圖係體外腎瘤細胞(Renca)與WM9細胞對SSG之不同生長反應。腎瘤細胞(A)與WM9 (B)細胞於不同量之SSG 不存在或存在下培養6天。存活細胞隨即以MTT分析進行定量。數據表示三重複樣本之平均值± s.d.。 1〇弟25圖顯示SSG與SSG/IL-2結合治療可抑制Balb/c小鼠腎瘤細胞(Renca)生長。將腎瘤細胞植入Baib/c小鼠（106 細胞/處，s.c·)。小鼠4天後出現腎腫瘤，隨後進行未處理(控制組）或處理IL-2 (105 IU/天，i.p·)、SSG (12 mg/天，i.m·) 或結合以上二試劑。紀錄這些小鼠的腎腫瘤體積（平均值+ 15 s.d.，n=8)並如所示。試劑處理時間如箭頭所指。第26圖顯示SSG與SSG/IL-2結合治療可增加Balb/c小鼠腎腫瘤浸潤巨噬細胞。A. Balb/c小鼠進行不同處理後（第2 圖）腎腫瘤T淋巴細胞與巨噬細胞之相對數目如免疫組織化學所定量。治療結束後由小鼠所採集之腫瘤經組織切片， 2〇並以抗-CD4、抗-CD8或抗-F4/80 mAb染色。比較控制組小鼠腫瘤之基線值，進行處理組小鼠腫瘤CD4+、CD8+與F4/80+ 細胞之評分（增加倍數）。B·不同處理組小鼠腎腫瘤切片之 F4/80+細胞之代表圖（40倍）。第27圖顯示SSG與SSG/IL-2結合治療可增加Balb/c小 130 200803835 鼠脾臟巨噬細胞。A· Balb/c小鼠進行不同處理後（第2圖）脾臟T淋巴細胞與巨噬細胞之相對數目，如免疫組織化學所定量。治療結束後由小鼠所採集之脾臟經組織切片，並以抗 -CD4、抗-CD8或抗-F4/80 mAb染色。比較控制組小鼠脾臟 5之基線值，進行處理組小鼠脾臟CD4+、CD8+與F4/80+細胞之評分(倍數）。B·不同處理組小鼠脾臟之F4/8〇'細胞代表圖 (20倍）。第28圖顯示SSG可增加體外jurkat細胞IFNy之釋放。 _ Jurkat細胞於不同量之SSG不存在或存在下培養16 hrs。經 10 培養Jurkat T細胞上清液之ΐΡΝγ量以ELISA進行定量。數據表示三重複樣本之平均值± s.d.。第29圖顯示IL-2/SSG結合治療對於無胸腺Baib/c小鼠腎腫瘤生長之影響。將腎瘤細胞植入（106細胞/處，sc)無胸腺Balb/c小鼠(nu/nu)。小鼠4天後出現腎腫瘤，隨後進行 15未處理(控制組）或結合處理IL-2 (105 IU/天，i.p·)與SSG (12 mg/天，i.m·)或結合以上二試劑。紀錄這些小鼠的腎腫瘤體 _ 積(平均值± s.d.，n=8)並如所示。試劑處理時間如箭頭所指。第30圖顯示A·重組PRL磷酸酶於葡萄糖酸銻鈉存在或不存在下’進行一合成酿胺酸碟酸化胜肽之去磷酸化反應 20之相對活性。B.不同葡萄糠酸銻鈉之預靜置時間，對於重組PRL-3之受質胜肽去磷酸化活性之影響。c·重組prl-3於不存在或存在不同量之SSG、原釩酸鈉(VO)或蘇拉明下，進行DiFMUP受質去磷酸化反應之相對活性。D.重組與PRL-3於不存在或存在SS下，進行DiFMUP去填酸化反應 131 200803835 之相對活性。Ε·將PRL-3結合至麵胱甘肽（giutathi〇ne)微珠、預靜置於SSG 10分鐘後進行不清洗(清洗-)或清洗(清洗 +)動作以比較相對磷酸酶活性。第31圖係Α· NIH3T3細胞以含控制組載體（v)，或 5 Flag-pRL-l表達構築體轉染後進行未處理(〇)，或葡萄糖酸銻鈉（SSG)處理(5 min)，利用體外PTPase分析法檢測抗_Flag 免疫錯合物，以決定PTPase活性。Β·利用SDS-PAGE/西方墨染偵測免疫錯合物，以決定Flag-PRL-Ι之相對量。c. NIH3T3細胞以Flag-PRL-2轉染後，進行未處理或葡萄糖酸 10 銻鈉處理之PTPase活性。D.利用SDS-PAGE/西方墨染横測免疫錯合物，以決定Flag-PRL-2之相對量。E.NIH3T3細胞以Flag-PRL-3轉染後，進行未處理或葡萄糖酸銻鈉處理之 PTPase活性。F·利用SDS-PAGE/西方墨染偵測免疫錯合物，以決定Flag-PRL-3之相對量。 15 第32圖係A. NIH3T3細胞以Hag-PRL_2轉染後，進行未處理或葡萄糖酸銻鈉（SSG)處理5 min、清洗移除多餘藥物，及不同時間培養後檢測抗-Flag免疫錯合物，以決定相對PTPase活性。B.利用SDS-PAGE/西方墨染偵測免疫錯合物’以決定Flag-PRL-2之相對量。 20 第33圖顯示以RT-PCR決定一組人類癌症細胞株 (A549、HEY、LoVo、SK-N_SH與DU145)，及健康自願者 PBMC之PRLs轉錄子表達情形。第34圖顯示人類癌細胞株A549 (A)、HEY (B)、LoVo (C)、SK-N-SH (D) ' U251 (E)與DU145 (F)於SSG不存在或 132 200803835 存在下’培養6天之生長情形。第35圖係A.小鼠植入DU145細胞2天後不處理(控制組）或處理葡萄糖酸銻鈉（SSG)之腫瘤體積。B·控制組小鼠於25 天後DU145細胞植入部位之組織學研究。C·經SSG處理小鼠 5 於25天後DU145細胞植入部位之組織學研究(DU145腫瘤如箭頭所指）。第36圖係A. DU145與DU145R細胞於葡萄糖酸銻鈉 (SSG)不存在或存在下，培養6天之生長情形。B. DU145或 • DU145R細胞之PRL-1 cDNAs序列（密碼子86附近）。（：· 10 PRL-1 蛋白之S86與R86位置。D· PRL]、PRL-1R86 (R86) 之GST融合蛋白與GST蛋白（控制組）於體外PTPase分析中，對於一合成酪胺酸磷酸化胜肽受質之去磷酸化反應活性。E·以體外PTPase分析決定重組PRL-1與PRL-1R86 (R86) 磷酸酶，於葡萄糖酸銻鈉不存在或存在下之相對PTPase活 15 性。第37圖係A. WM9細胞以含控制組载體（v)或 φ Flag_PRL_ 1或Flag-PRL-1R8 6表達構築體轉染後進行未處理或葡萄糖酸銻鈉（SSG)處理，並利用SDS-PAGE/西方墨染備測抗_Flag免疫錯合物。B·以體外PTPase分析偵測抗-Flag免 20疫錯合物，以決定相對PTPase活性（以未處理之F^g-pRL」轉染細胞組之免疫錯合物PTPase活性當作100%值）。c WM9轉染細胞於不存在葡萄糖酸銻鈉下培養6天之生長情形。D· WM9轉染細胞於葡萄糖酸銻鈉存在下培養6天之相對生長抑制情形。 133 200803835 第38圖顯示體外銻酸甲葡胺存在下之相對SHP-1與 PRL-3 PTPase活性。第39圖係A·分離葡萄糖酸銻鈉之HPLC層析圖，顯示各分液與其中Sb含量。B·重組SHP-1於每一葡萄糖酸銻鈉分液 5 存在下之相對PTPase活性。第 40圖顯示MKP (A)、PTP1B (B)與GSTm8 (C)於左美素(levamisole)、酮康唑(ketoconazole)與喷他脒(pentamidine) 存在下’及以I]萄糖酸錄鈉（SS)為原型劑(model agent)之相對PTPase活性。 10 第41 圖顯示SHP_1 (A)、PTP1B (B)與MKP1 (C)於酮康 0坐(ketoconazole)與喷他脒(pentamidine)存在下，及以葡萄糖酸銻鈉（SS)為原型劑之相對PTPase活性。第42圖係A· PRL-1、PRL-2與PRL-3於不同量之噴他脉 (pentamidine)存在下之相對PTPase活性。B. PRL_1、PRL-2 15 與PRL-3於不同量之酮康唾（ketoconazole)存在下之相對 PTPase活性。C· SHP-1於喷他脒與酮康唑存在下之相對 PTPase活性。第43圖顯示WM9細胞於喷他脉(八)或_康唾(b)之單一劑量或結合IFNa存在下培養6天之生長抑制百分比。 20 【主要元件符號說明】 (無） 134 200803835 序列表 <110> Yi? Taolin

<120> THERAPEUTIC COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL IN MODULATING PROTEIN TYROSINE PHOSPHATASES

<130> 065031-5017-TW <150〉US 60/757, 860 <151> 2006-01-11 <160> 序列：9 <170> Patentin version 304

<210〉序列：1 <211〉登錄號31 <212> 型式:DNA <213> 生物體：DH5a細菌 <400> 序列 i 1 ctggatcctg cgggggctgc tgcaggagcg c 31 <210> 序列：2 <211〉登錄號29 <212> 型式：DNA <213〉生物體：DH5α細菌 <400> 序列：2 aagtcgacgc agcttgggga ggtggtgat 29 <210> 序列：3 <211〉登錄號13 <212> 型式：PRT <213>生物體:未知 <220> <223>其他資訊：人造胜肽以作為PTPase之受質 <400> 序列：3

Ary Arg Leu lie Gin AsP Ala Glu Tyr Ala Arg Gly 1 5 10 <210> 序列：4 <211> 登錄號32 <212> 型式：DNA <213>生物體：人類 <400> 序列：4 taggatcccg ggaggcgcca tggctcggat ga 32 135 32200803835 <210> 序列：5 <211〉登錄號32 <212> 型式：DNA <213>生物體：人類 <400> 序列：5 gagtcgacca taacgcagca ccgggtcttg tg <210> 序列：6 <211> 登錄號33 <212> 型式：DNA <213>生物體：人類 <400> 序列：6 taggatcccc gaacacagca <210> 序列：7 <211〉登錄號33 <212〉型式：DNA <213> 生物體：人類 atgcccattg gt 33 <400> 序列：7 gagtcgacct gaacacagca attgcccattg gt 32 )>>>> 0 12 3 11 lx 11 11 2 2 2 2 序列：8 登錄號33 型式：DNA 生物體：人類 <400> 序列：8 taggatcccc aacatggctc gaatgaaccg ccc 33 )>>>> 0 12 3 11 11 11 11 2 2 2 2 序列：9 登錄號33 DNA 生物體：人類 <400> 序列：9 gagtcgactt gaatgcaaca gttgtttcta tg 32 136 200803835 表1 葡萄糖酸銻納與IFN α之人類腫瘤細胞株生長抑制作用第6天之抑制％

SS12.5 細胞株腫瘤類型 SS IFNa IFNa SS //g/mlSS+ IFNa DR 布氏淋巴瘤 45(15) 39(2) 80(1) 99(1) 99(2) U266 多發性骨瘤 +3(4) 78(10) 93(5) 64(10) 100(7) Η9 T-淋巴瘤 8(16) 86(3) 91(3) nd 99(3) Peer T-ALL +3(5) 86(4) 91(3) nd 98(2) WM9 黑色素細胞瘤 27(12) 58(2) 84(3) 75(4) 100(1) WM35 黑色素細胞瘤 +8(21) 19(3) +3(11) 2(15) 29(10) DU145 前列腺癌 36(1) 70(5) 85⑹ 91(2) 96(2) C42 前列腺癌 0(18) +19(30) 2(18) 15(6) 21⑺ MDA231 乳癌 60(9) 79(2) 93(2) 97(5) 95(3) MDA235 乳癌 6(2) 29(25) 40(39) 97(2) 95(3) WT49-N1 兒童腎因細胞瘤 50(8) 22(11) 31(10) 97(3) 92(0) RC45 腎細胞瘤 18(13) 70(15) 79(7) 66(13) 85(7) 5637 膀胱瘤 23⑺ 28(17) 23(6) 74(9) 71(7) 137

Claims

200803835 十、申請專利範圍： 1. 一種用以治療或預防需要治療或預防前列腺癌之個體的方法，包含投予該個體治療有效量之葡萄糖酸銻鈉 (sodium stibogluconate) 〇 5 2.如申請專利範圍第1項之方法，更包含投以干擾素。 3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該干擾素為干擾素 α ° 4. 如申請專利範圍第3項之方法，其中該干擾素為干擾素 α2 〇 10 5.如申請專利範圍第1項之方法，其中該葡萄糖酸銻鈉之治療有效量為約10 mg至約140 mg。 6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中該葡萄糖酸銻鈉之治療有效量為約20 mg。 7. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該方法包含有非經 15 腸胃投藥。 J 8. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該非經腸胃投藥為靜脈投藥。 9. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該葡萄糖酸銻鈉與干擾素係同時投藥。 20 10.如申請專利範圍第2項之方法，其中該葡萄糖酸銻鈉與干擾素係前後順序投藥。 138