SU1683621A1

SU1683621A1 - Method of low-temperature preservation of embryos

Info

Publication number: SU1683621A1
Application number: SU874306495A
Authority: SU
Inventors: Валентин Иванович Грищенко; Юрий Владимирович Калугин; Нина Антоновна Лучко; Елена Николаевна Черныш
Original assignee: Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР
Priority date: 1987-09-25
Filing date: 1987-09-25
Publication date: 1991-10-15

Abstract

Изобретение может найти применение дл длительного хранени репродуктивных клеток редких и исчезающих видов животных . Цель - повышение сохранности биологических свойств эмбрионов до стадии бластоциста. Дл достижени цели к эмбрионам мышей, полученным на стадии басто- меров, добавл ют смесь криопротекторов: глицерина, пропиленгликол , диметилсуль- фоксида и 0,4% раствор холина-хлорида, на стандартной фосфатно-солевой среде Дюльбекко до конечной концентрации 4:75- 5,5% каждый. Все процедуры осуществл ют при температуре 4-8&deg;С. После эквилибра- ции эмбрионы разливают в контейнеры, за- взльцовывают их и погружают контейнеры на 5-10 с в порошок цинка, охлажденный до температуры жидкого азота (-196&deg;С). Затем контейнеры перекос т дл хранени в жидкий азот.The invention can be used for long-term storage of reproductive cells of rare and endangered animal species. The goal is to increase the preservation of the biological properties of embryos to the blastocyst stage. To achieve the goal, cryoprotectants: glycerin, propylene glycol, dimethyl sulfoxide and 0.4% choline chloride solution are added to the embryos of mice obtained at the stage of bastomer, on a standard Dulbecco phosphate-saline medium to a final concentration of 4: 75- 5.5% each. All procedures are carried out at a temperature of 4-8 ° C. After equilibration, the embryos are poured into containers, closed up, and the containers are immersed for 5-10 seconds in zinc powder cooled to liquid nitrogen temperature (-196 ° C). The containers are then warped for storage in liquid nitrogen.

Description

Изобретение относитс к криобиологии и может найти применение дл длительного хранени репродуктивных клеток редких и исчезающих видов животных.The invention relates to cryobiology and can be used for long-term storage of reproductive cells of rare and endangered animal species.

Целью изобретени вл етс повышение сохранности биологических свойств эмбрионов до стадии бластоциста.The aim of the invention is to increase the preservation of the biological properties of embryos to the blastocyst stage.

Способ осуществл етс следующим образом .The method is carried out as follows.

Эмбрионы мышей, полученные на стадии 32 бластомеров, разбавл ют 1:1 трем последовательно добавл емыми порци ми с интервалом 3 мин, смеси криопротекторов: глицерина, пропиленгликол и диме- тилсульфоксида (ДМСО) и метилирующего агента - холина-хлорида на стандартной фосфатно-солевой среде Дюльбекко. Концентраци криопротекторов после смешивани с эмбрионами составл ет 4.75 5 ,25%, а холина-хлорида 0,4%. Врем разбавлени составл ет 15-20 мин и вл етс временем эквилибрации. Все указанные процедуры осуществл ют при 4-8°С. После эквилибрации эмбрионы разливают в контейнеры , изготовленные из пищевой фольги , объемом 0,1 мл, которые завальцовывают и погружают на 5-10 с в порошок цинка, охлажденной до температуры жидкого азота (-196°С), а затем перенос т в жидкий азот дл хранени . Размораживание осуществл ют в вод ной бане при 40°С в течение 5 - 10с.Mice embryos obtained in stage 32 blastomeres are diluted 1: 1 with three successively added portions with an interval of 3 minutes, mixtures of cryoprotectants: glycerin, propylene glycol and dimethyl sulfoxide (DMSO) and the methylating agent choline chloride on standard phosphate salt environment Dulbecco. The concentration of cryoprotectants after mixing with embryos is 4.75 5, 25%, and that of choline chloride is 0.4%. The dilution time is 15-20 minutes and is the equilibration time. All of these procedures were performed at 4-8 ° C. After equilibration, embryos are poured into 0.1 ml containers made from food foil, which are rolled and immersed for 5-10 seconds in zinc powder cooled to liquid nitrogen temperature (-196 ° C) and then transferred to liquid nitrogen for storage. Defrosting is carried out in a water bath at 40 ° C for 5-10 s.

П р и м е р 1. 60 эмбрионов раздел ют на 6 групп по 10 эмбрионов. В каждую из групп внесли по 5 капел фосфатно-солевой среды Дюльбекко, содержащий 10,5% глицерина (чда), 10,5% пропиленгликол (чда), 10,5% ДМСО и 0,8% холина-хлорида, приPRI me R 1. 60 embryos are divided into 6 groups of 10 embryos. 5 drops of Dulbecco's phosphate-saline medium containing 10.5% glycerol (chd), 10.5% propylene glycol (chd), 10.5% DMSO and 0.8% choline chloride, were added to each group.

ON 00ON 00

СОWITH

оabout

N)N)

этом концентраци каждого из криопротек- торов составила 5,25%, а холина-хлорида 0,4%. Все процедуры провод т при температуре 4°С. Разбавленные эмбрионы перенос т в контейнеры из пищевой фольги с толщиной стенок 0,03 мм и размерами 1 х1,5 см, обьемом 0,1 мл. Свободные кра контейнера завальцовывают и погружают на 10 с в металлическую емкость, заполненную порошком Zn, и погруженную в жидкий азот. После этого контейнеры перенос т в жидкий азот, где хран т в течение 2 недель. Размораживали в вод ной бане при 40°С. После размораживани развитие в культуре составило 94,8%. Thereby, the concentration of each cryoprotectant was 5.25%, and that of choline chloride was 0.4%. All procedures are performed at 4 ° C. Diluted embryos are transferred to food foil containers with a wall thickness of 0.03 mm and dimensions of 1 x 1.5 cm, with a volume of 0.1 ml. The free edges of the container are rolled and immersed for 10 s in a metal container filled with Zn powder and immersed in liquid nitrogen. The containers are then transferred to liquid nitrogen, where they are stored for 2 weeks. Thawed in a water bath at 40 ° C. After thawing, development in culture was 94.8%.

Дл обосновани концентрации криоп- ротекторов проводили эксперименты аналогично примеру 1,только брали различные концентрации криопротекторов (4,75%).To substantiate the concentration of cryoprotectors, experiments were carried out analogously to Example 1, only different concentrations of cryoprotectants were taken (4.75%).

Сохранность эмбрионов определ ли по данным развити их в культуре до стадииThe safety of embryos was determined according to their development in culture to the stage

бластоцисты.blastocyst

Предложенный способ позвол ет повысить сохранность эмбрионов после размораживани на 27%.,The proposed method allows to increase the safety of embryos after thawing by 27%.

Claims

Invention Formula

The method of low temperature embryo preservation, including freezing to -196 ° C in Dulbecco's phosphate-saline medium with glycerin cryoprotector, characterized in that, in order to improve the preservation of the biological properties of embryos up to the blastocyst stage, 0.4% choline solution is added - chloride, propylene glycol and dimethylsulfoxide to a final concentration of 4.75-5.25% each, and freezing is carried out in a container with zinc powder, previously cooled to -196 ° C.