SU1673597A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS. мUSсULUS L., используемый дл получени моноклональных антител к теофиллину - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к гибридомной технологии и может быть использовано дл  лекарственного мониторинга при терапии теофиллином. Штамм получают путем гибридизации спленоцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных коньюгированным антигеном теофиллина с гемоцианином, с клетками миеломной линии Р3 - Х63. AG 8653. Клетки характеризуютс  свойствами, типичными дл  гибридом. Продуктивность штамма - 5 - 8 мг/мл монАТ в асцитической жидкости. МонАТ специфичны дл  теофиллина и относ тс  к классу IGG2a. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 367Д. 1 табл.

Description

Изобретение относитс  к гибридомной технологии и может быть использовано дл  лекарственного мониторинга при терапии теофиллином.

Штамм получают следующим образом.

Клетки мышиной миеломной линии Х63 Ад 8653 гибридизуют со соленоцитами мыши линии Balb/c, иммунизируют конъюги- рованныг антигеном теофиллина с гемоцианином.

Мышей иммунизируют 3-4 мес, периодически сыворотку животных анализируют на присутствие антител к теофиллину. Анализ осуществл ют твердофазным иммуно- ферментным методом, в качестве антигена используют конъюгированный антиген теофиллина с человеческим сывороточным альбумином . У животных с высоким титром антител к теофиллину берут селезенку и выдел ют из нее клетки дл  сли ни . Миелом- ную линию Х63. Ад 8653 (стабильную миеломную линию, не секретирующую иммуноглобулины ) выбирают в качестве второго партнера дл  сли ни .

Сли ние клеток провод т с использованием полиэтиленгликол . Отношение числа селезеночных клеток к числу миеломных клеток варьируют от 5:1 до 1:1.

После сли ни  клетки разбавл ют и культивируют в селективной среде, содержащей зминоптерин, гипоксантин и тими- дин, до по влени  растущих клонов.

Супернатанты анализируют твердофазным иммуноферментным методом, в качестве антигена используют коньюгат теофиллина с человеческим сывороточным альбумином, антитела обнаруживают с помощью кроличьих антител к IgG мыши, меченных пероксидазой хрена, так что вы вл ютс  только клоны, продуцирующие антитела класса G.

Дополнительный анализ синтезируемых антител производ т по ингибированию тиофиллином и его аналогом св зывани  антител с сорбированным конъюгатом теофил (Л

С

о VJ

OJ СЛ Ч) VI

лин - человеческий сывороточный альбумин .

Положительные клоны повторно клонируют .

Из положительнгых клонов выбирают клон 2G34, продуцирующий антитела с минимальной перекрестной реактивностью по отношению к метаболитам и аналогам тео- филлина. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) № 367Д.

Клон продуцирует антитела, относ щиес  к подклассу lgG2a.

Дл  получени  больших количеств антител гибридные клетки ввод т внутрибрюшинно мышам, предварительно сенсибилизирован- ным пристанем.

Антитела из асцитных жидкостей ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-цел- люлозе.

Полученные моноклональные антитела используют в иммуноферментном методе определени  теофиллина.

Штамм характеризуетс  следующими признаками.

Культуральные свойства клона 2G34 ти- пичны дл  гибридом. Клетки культивируют в монослое в концентрации 5-10 клеток/мл, врем  субкультивировани  составл ет около 48 ч.

Продуктивность штамма. Штамм проду- цирует специфичные к теофиллину монАТ с концентрацией 5-8 мг/мл в асцитической жидкости.

Криоконсервирование. Криоконсерви- рование гибридомы 0существл ют в смеси равных объемов среды RPM11640 и тел чьей эмбриональной сыворотки, содержащей 15% диметилсульфоксида, по 10 клеток в ампуле. Первые 3 суток ампулы хран т при -70° С, затем перенос т в жидкий азот. По- еле разглаживани  не тер ют своих ростовых свойств.

Характеристика моноклональных антител .

Антитела из асцитов выдел ют солевым осаждением сульфатом аммони  и последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлюло- зе с использованием градиента 0,01 М фосфатного буфера, рН 7,2, 0 - 0,5 М NaCI. Гомогенность выделенных антител прове-

р ют с помощью электрофореза в полиакри- ламидном геле в присутствии додецилсуль- фата натри . Антитела, синтиезируемые клоном 2G34, относ тс  к подклассу G2a, что определено твердофазным иммунофер- ментным методом с использованием козьих антител, к подклассам мышиного иммурог- лобулина G, меченных пероксидазой.

Пример, Использование полученных моноклональных антител дл  иммунофер- ментного определени  теофиллина в сыворотках крови.

Коныогированный антиген тео-г/а-ЧСА раствор ют в 0.05М натрий карбонат-бикар- бонатном буфере (рН 9,6) в концентрации 1 мкг/мл и сорбируют на полистироловых 96-луночных планшетах фирмы NUNK по 100 мкл на лунку при 4° С в течение ночи, затем твердую фазу отмывают 0,05% -ным раствором тритона Х-100 3 раза и 3 раза водой.

Аликвоты по 3 мкл из сывороток крови больных, получавших теофиллин, или лошадиной сыворотки, содержащие известное количество препарата, внос т в лунки планшета и добавл ют по 100 мкл Ig-PO в 0,01 М натрий-фосфатном буфере, содержащем 0,15 М NaCI, 0,05% твин-20 и 0,2% БСА, концентрации 1,1 мг/мл, разведение 1:800. Смесь тщательно встр хивают, инкубируют 20 мин при комнатной температуре, твердую фазу отмывают и приливают раствор субстрата (4 мкл 30%-ного Н202 и 4 мг ор- тофенилендиамина на 100 мл 0,1 М натрий- цитратного буфера, рН 5,0), инкубируют 10 мин в темноте, детекци  при 492 нм.

Специфичность антител, продуцируемых клоном 2G34, к теофиллину представлена в таблице.

Таким образом, использование монАТ позволит осуществл ть контроль за концентрацией препарата в организме больного, индивидуальный подбор дозы теофиллина дл  лечени .

Claims (1)

1. Формула изобретени  Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus L., ВСКК(П) № 367Д, используемый дл  получени  моноклональных антител к теофиллииу.

   Вещество

   Кофеин

   Мочева  кислота

   1-Метилмочева  кислота

   1,3-Диметилмочева  кислота

   Ксантин

   Гипоксантин

   3-Метилксантин

   Аденозин

   Отношение концентраций теофиллина родственною вещества, вызывающее

   50 % -ное ингибирование, %

   0.01

   0.0001

   10

   5

   0.0001 0.001 0,001 0,0001