SU1045127A1

SU1045127A1 - Substance anti-oxidation activity determination method

Info

Publication number: SU1045127A1
Application number: SU813369746A
Authority: SU
Inventors: Владимир Владимирович Мирончик; Сергей Николаевич Черенкевич; Александр Константинович Говорун
Original assignee: Белорусский научно-исследовательский институт кардиологии
Priority date: 1981-12-25
Filing date: 1981-12-25
Publication date: 1983-09-30

Abstract

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА путем исследовани хемилюминесценции модельной системы, отличающийс тем, что, с целью повышени точности и ускорени способа , раствор исследуемого вещества ввод т в 21,3 ММ этанол-буферный . раствор олеиновой кислоты рН 7,5 и добавл ют инициатор - ионы двухвалентного железа, после чего регистрируют быструю вспышку хемилюминесценции и по снижению величины ее светосуммы посде добавлени исследуемого вещества определ ют антиокислительную активность вещества ,iMETHOD FOR DETERMINING THE ANTI-OXIDATIVE ACTIVITY OF SUBSTANCE by examining the chemiluminescence of the model system, characterized in that, in order to improve the accuracy and speed up the method, the solution of the analyte is introduced into 21.3 MM of ethanol-buffer. a solution of oleic acid pH 7.5 and an initiator - ferrous iron ions are added, after which a rapid flash of chemiluminescence is recorded and the antioxidant activity of the substance is determined by reducing the magnitude of its light sum after adding the test substance, i

Description

Изобретение относитс к фармако логии и может быть использовано как в практической фармакологии,так и в научных медицинских и биохимических исследовани х.The invention relates to pharmacology and can be used both in practical pharmacology and in scientific medical and biochemical research.

Известен способ определени антиокислительной активности веществ путем спектрофотометрического измерени продуктов реакции взаимодействи липидов с субстра-том, включающий приготовление реактивов , поочередное приготовление опытных и контрольных проб, их термостатирование и инкубацию, построение калибровочной кривой ij .A known method for determining the antioxidant activity of substances by spectrophotometric measurement of the reaction products of the interaction of lipids with a substrate, including the preparation of reagents, the alternate preparation of test and control samples, their temperature control and incubation, the construction of a calibration curve ij.

Однако указанный способ не обеспечивает быстроту ос1гществлени , а отсутствие химической стойкости р да реактивов (этанольные растворы перекиси водорода и иодата кали ) существенно снижает точность определени антиркислительной активности.However, this method does not provide rapid implementation, and the lack of chemical resistance of a number of reagents (ethanol solutions of hydrogen peroxide and potassium iodate) significantly reduces the accuracy of the determination of anti-oxidative activity.

Известен способ определени антиокислительной активности веществ путем исследовани хемилюминесценции .модельной системы, включающей митохондрии в изучаемое вещество в присутствии ионов двухвалентного железа 2j . .The known method of determining the antioxidant activity of substances by studying the chemiluminescence of a model system that includes mitochondria in the substance under study in the presence of bivalent iron ions 2j. .

Известный способ не вл етс достаточно точным и быстрым по выполнению . Неточность способа обусловлена, с одной стороны, трудностью определени истинного значени угла наклона условной пр мой начальной стадии медленной вспышки хемилюминесденции в св зи с тем, что зависимость интенсивности хемилюминесцендии от времени не вл етс линейной, а с другой стороны, нестабильностью используемой модели суспензии митЛхондрий, приготовление, которойсв зано с методическими трудност ми их выделени . При этом приготовление суспензии митохондрий занимает не . менее 40-50 мин,а регистраци медленной вспышки хемилюминесценции в зависимости от концентрации антиоксидантов осуществл етс от 30 до 60 мин.The known method is not sufficiently accurate and fast to complete. The inaccuracy of the method is due, on the one hand, to the difficulty of determining the true value of the slope angle of the conditional direct initial stage of a slow flash of the chemiluminescence due to the fact that the dependence of the intensity of the chemiluminescence on time is not linear, and on the other hand, the instability of the mitLchondria suspension model used, preparation, which is associated with the methodological difficulties of their isolation. In this case, the preparation of a mitochondrial suspension takes no. less than 40-50 minutes, and a slow flash of chemiluminescence, depending on the concentration of antioxidants, is recorded from 30 to 60 minutes.

Цель изобретени - повь иение точности и ускорение способа измерений антиокислительной активности вещества .The purpose of the invention is to increase the accuracy and acceleration of the method of measuring the antioxidant activity of a substance.

Указанна цель достигаетс тем, что, согласно способу определени антиокислительной активности вещества путем исследовани хемилюминесценции модельной системы,раствор исследуемого вещества ввод т в 21,3 мМ этанол-буферный раствор олеиновой кислоты рН 7,5 и добавл ют инициатор - ионы двухвалентного железа, после чего регистрируют быструю вспышку хемилюминесценции и по снижению величины ее светосуммы после добавлени исследуемого воцества определ ют антиокислительную активность вещества.This goal is achieved by the fact that, according to the method for determining the antioxidant activity of a substance by studying the chemiluminescence of the model system, the solution of the test substance is introduced into 21.3 mM ethanol-buffered oleic acid solution pH 7.5 and the initiator — ferrous ions is added, after which A rapid flash of chemiluminescence is recorded, and the antioxidant activity of the substance is determined by reducing the magnitude of its light sum after adding the examined organism.

Способ осуществл ют следующим образом.The method is carried out as follows.

Готов т модельную систему с конечной концентрацией олеиновой кислоты 21,3 мМ и рН 7,5. Олеиновую кислоту в количестве 319,3 мМ растеор ют в 4 мл этанола и прибавл ют 7 мл 20 мМ раствора- . Затем тщательно перемешивают, довод т рНмодельнрй системы до 7,5 .-10 н.раствором КОН.К О,8 мл приготовленной модельной системы добавл ют 0,2 мл раствора исследуемого- антиоксиданта (в этаноле или фосфатном буфере) и перенос т кювету в. установку дл A model system is prepared with a final oleic acid concentration of 21.3 mM and pH 7.5. The amount of 319.3 mM oleic acid was dissolved in 4 ml of ethanol and 7 ml of 20 mM solution was added. Then they are thoroughly mixed, the pH of the model system is adjusted to 7.5. -10 N. KOH.K O. solution, 8 ml of the prepared model system are added 0.2 ml of the antioxidant solution under test (in ethanol or phosphate buffer) and transferred to a cuvette in a . installation for

измерени сверхслабых свечений. В данную кювету быстро ввод т 1 мл 2 Юраствора FeSO 7 и регистрируют на самописце или с помощью интенсиметра в течение 3-5 с быстРУ вспьшку хемилюминесценции.Затем провод т контроль аналогично опыту, только вместо раствора анти- оксиданта добавл ют 0,2 мл его растворител . Определ ют светосуммубыстрой вспышки, вычисл ют процент снижени ее по сравнению с контроле-м и данные занос т в протокол исследовани .measurements of super-weak glows. 1 ml of 2 Jurastor FeSO 7 is quickly introduced into this cuvette and recorded on a recorder or using an intensimeter for 3-5 seconds with a fast chemiluminescence test. Then, the control is carried out similarly to the experiment, only 0.2 ml of it is added instead of an antioxidant solution. solvent. A light-flash flash is determined, the percentage of its reduction compared to controls is calculated, and the data is recorded in the study protocol.

Измерение хеми.люминесцеиции провод т с. помощью установок дл измерени сверхслабых световых потоков , работающих в режиме счета фотонов .Measurement of chemiluminescence is carried out with. using facilities for measuring ultra-weak light fluxes operating in the photon counting mode.

Расчет, При комнатной температуре в течение 5 с регистрируют быструю вспышку хемилюминесценции при добавлении инициатора - ионов двухвалентного желе.за - в кювету с модельной системой, содержащей исследуемый антиоксидант,, и производ т измерение ее интенсивности (число импульсов NQ), затем измер ют интенсивность хеми.шоминесценции в контроле (число импульсов N. ) . Если, например , N(,5000, а N, 7500, то величи-ну антиокислительной активности (АСА) определ ют по формулеCalculation At room temperature for 5 seconds, a rapid flash of chemiluminescence is added when an initiator, divalent jelly ions, is added. Into a cell with a model system containing the antioxidant under test, and its intensity is measured (number of pulses NQ), then the intensity is measured chemomedication in the control (number of pulses N.). If, for example, N (, 5000, and N, 7500, then the magnitude of antioxidant activity (ACA) is determined by the formula

--(-..,oo% 33,,.- (- .., oo% 33 ,,.

АОАAOA

Если шумовой фон хемилюмпнесцентной установки относительно высок, то с целью повышени точности измерени АОА веществ провод т учет вклада шумовых импульсов фотоумножител в измер емую величину. Если дл хемилюминесцентной установки за 5 с зарегистрировано число шумовых импульсов , то АОА вычисл етс по формулеIf the noise background of the chemiluminescence unit is relatively high, then in order to improve the accuracy of measuring AOA substances, the contribution of the noise pulses of the photomultiplier to the measured value is taken into account. If the number of noise pulses is registered for a chemiluminescent unit in 5 seconds, the AOA is calculated using the formula

. , No-Ny / 5000-адО. , No-Ny / 5000-adO

-й ;Г°-Гт15 :) ° Пример . Проведено определение антиокислительнсй активности р да антиоксидантов. Липидорастворимый антиоксидан - oi -токоферол - раствор ют в этаноле перед введением в модельную систему, а водорастворимые антиоксиданты - аскорбинова th; G ° -Gt15 :) ° Example. The antioxidant activity of a number of antioxidants has been determined. The lipid-soluble antioxidant — oi-tocopherol — is dissolved in ethanol before being introduced into the model system, and the water-soluble antioxidants are ascorbic

кислота, никотинова кислота и КАДФ в фосфатном буфере.acid, nicotinic acid and KADP in phosphate buffer.

Антиокислительна активность некоторых антиоксидантов, определ ема предлагаемым способом,при убывании их концентрации в модельной системе представлена в таблице.The antioxidant activity of certain antioxidants, as determined by the proposed method, when their concentration decreases in the model system is presented in the table.

Ход работы по предлагаемому способу занимает 6-8 мин, что дает выигрыш во времени по сравнению с известными способами в 5-7 раз.The progress of the proposed method takes 6-8 minutes, which gives a gain in time compared with the known methods by 5-7 times.

Минимальные концентрации антиокси- о дантов, определ емые предлагаемым способом, составл ют в среднем 510 г вещества. Так, дл ot-токосферола определ ема по предлагаемому способу концентраци 1,210м, а по способу - прототипу 0,.The minimum concentrations of antioxidant, determined by the proposed method, average 510 g of substance. So, for ot-tocospherol, the concentration of 1,210 m determined by the proposed method and, according to the method, to prototype 0 ,.

Предлагаемый способ позвол ет определить антиокислительную активность не только липидораст-воримых но и водорастворимых антиоксидантов, а также обеспечивает высокую чувствительность , хорошую воспроизводимость ., быстр и прост в исполнении.The proposed method makes it possible to determine the antioxidant activity not only of lipid-soluble but also water-soluble antioxidants, and also provides high sensitivity, good reproducibility, is quick and easy to perform.

Claims

METHOD FOR DETERMINING ANTIOXIDATIVE ACTIVITY OF A SUBSTANCE by studying the chemiluminescence of a model system, characterized in that, in order to increase the accuracy and speed up the method, a solution of the test substance is introduced into a 21.3 mm ethanol-buffer solution of oleic acid pH 7.5 and the initiator ions are added ferrous iron, after which a fast flash of chemiluminescence is recorded and the antioxidant activity of the substance is determined by reducing the amount of its light sum by eating the addition of the test substance.

I