SK50762009A3 - Spôsob purifikácie rekombinantného antimikrobiálneho peptidu - Google Patents

Abstract

Je opísaný vysokokópiového plazmid kódujúceho transkripčnú jednotku, ktorá je zložená zo za sebou radených funkčne na seba nadväzujúcich fragmentov v poradí : T7 promótor, sekvencia kódujúca tioredoxín, sekvencia kódujúca 6 za sebou idúcich histidínov, sekvencia kódujúca cieľové miesto pre enterokinázu, sekvencia kódujúca C koncovú časť ľudského katelicidínu LL-37 aT7 transkripčný terminátor. DNA sekvencia transkripčnej jednotky výhodne kóduje tioredoxín a DCD na expresiu v baktériách E. coli. Opisuje sa tiež produkcia fúzovaného polypeptidu zloženého z tioredoxínu a 6 za sebou idúcich histidínov, cieľového miesta pre enterokinázu a LL-37 v baktériách E. coli, ako aj postup izolácie LL-37 kódovaného sekvenciou z transkripčnej jednotky. Popísané je aj použitie LL-37 na prípravu liekovej formy na liečenie bakteriálnych infekcií a infekcií spôsobených hubami u ľudí a zvierat, ako aj spôsob aplikácie liekovej formy. Opisuje sa aj použitie LL-37 na inhibíciu rastu baktérií a húb vo farmaceutických, kozmetických a potravinárskych produktoch.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka sekvencií DNA kódujúcich fúzny proteín obsahujúci, tioredoxín ako fúzny partner, 6 histidínov, enterokinázové štiepne miesto a C-koncovú časť ľudského katelicidínu ako cieľového peptidu s antimikrobiálnymi vlastnosťami. Ďalej sa vynález týka produkcie fúzneho polypeptidu a následnej izolácie cieľového peptidu z bunkového homogenátu. Vynález sa tiež týka použitia cieľového peptidu ako liekovej formy, spôsobu jeho aplikácie a použitia cieľového polypeptidu ako konzervačnej substancie.

Doterajší stav techniky

Epitel mnohobunkových organizmov predstavuje hlavnú bariéru pre prostredie a poskytuje prvú obrannú líniu proti invazívnym mikroorganizmom. V epitely sa antimikrobiálne peptidy zúčastňujú v systéme obrany u mnohých živočíchov, zahrňujúc rastliny, hmyz, obojživelníky a cicavce. Kontrolujú množenie mikroorganizmov v prvých hodinách poškodenia epitelu a počas hojenia rany a hlavne počas niektorých zápalových kožných poškodeniach.

Momentálne predstavujú chemické antibiotiká obmedzený zdroj antimikrobiálnych látok, nakoľko sa neustále objavujú klinické patogénne kmene rezistentné na chemické antibiotiká. V tomto zmysle predstavujú antimikrobiálne peptidy nové perspektívy čo sa týka liečby bakteriálnych, prípadne hubových ochorení infekcií.

Súčasný trend spoločnosti v zdravej výžive predstavuje pre antimikrobiálne peptidy ďalší perspektívny smer ich využitia. Momentálne používané bakteriostatické chemické konzervačné látky prinášajú so sebou aj radu nežiaducich účinkov, ktoré by mohli byť irelevantné v prípade použitia antimikrobiálnych peptidov ako konzervačných substancií.

Jediným doteraz známym ľudským členom antimikrobiálnych peptidov z rodiny katelicidínov je 18 kDa proteín hCAP-18. Ako väčšina antimikrobiálnych peptidov, katelicidíny sú produkované ako inaktívne preproproteíny. Signálna sekvencia je odstránená a výsledný prekurzor je charakteristický konzervatívnou N-doménou a variabilnou C-doménou. Táto Cdoména obsahuje aktívny peptid, ktorý môže byť uvoľnený z prekurzorového peptidu pôsobením serínových proteáz. Proteináza 3 z neutrofilov bola identifikovaná ako hlavná serínová proteáza zodpovedná za extracelulárne štiepenie hCAP-18, ktoré má za následok vznik antimikrobiálneho peptidu LL-37 (Sorensen et al., (2001) Blood 97: 3951-3959). Nedávne štúdie ukázali, že sa

-2hCAP-18 nachádza vo vysokých koncentráciách v seminálnej plazme a že LL-37 nie je jediný katelicidínový peptid, ktorý je odvodený od hCAP-18. Zistilo sa, že hCAP-18 sa tvorí v mierne kyslom prostredí vagíny serínovou proteázou (gastriksín), ktorá je produkovaná prostatou. Výsledkom štiepenia gastriksínom nie je LL-37, ale jeho o jednu aminokyselinu dlhšia alternatíva ALL-38 s podobnými antimikrobiálnymi vlastnosťami ako LL-37 (Sorensen et al., (2003) J. Biol. Chem. 278: 28540-28546). LL-37 bol najskôr identifikovaný ako širokospektrálny antimikrobiálny peptid s pridanou aktivitou neutralizácie lipopolysacharidov (LPS). LL-37 zabíja obidva gram pozitívne aj gram negatívne baktérie a štúdie na negatívne nabitých membránových modeloch (model vonkajšej bakteriálnej membrány) ukazujú, že smrť buniek nastáva dôsledkom dezintegrácie membrány (Oren et al., (1999) Biochem. J. 341: 501513). Okrem schopnosti zabíjať prokaryotické bunky, vykazuje LL-37 aj cytotoxickú aktivitu pri vysokých koncentráciách, čo sa môže udiať pri degranulácii buniek v mieste zápalu (Johansson et al., (1998) J. Biol. Chem. 273: 3718-3724). Ďalej sa ukázalo, že LL-37 pôsobí ako chemoatraktant na bunky cez chemokíny a formyl-peptidické receptory, z čoho možno usudzovať, že sa LL-37 zúčastňuje akumulácie buniek (Yang et al., (2000) J. Exp. Med. 192: 1069-1074; Yang et al., (2001) Celí Mol. Life Sci. 58: 978-989). Tiež bolo ukázané, že LL-37 reguluje diferenciáciu dendritických buniek a polarizáciu T-buniek indukovanú dendritickými bunkami (Davidson et al., (2004) J. Immunol. 172: 1146-1156). Chemotaktické vlastnosti voči rôznym typom buniek, zahrňujúc neutrofily, monocyty, T-bunky (Yang et al., (2000) J. Exp. Med. 192: 1069-1074) amystocyty (Niyonsaba et al., (2002) Immunology 106: 20-26) a regulácia aktivity dendritických vytvárajú hypotézu, že LL-37 okrem jeho úlohy v dedičnej imunitné má aj svoju úlohu v adaptatívnych imunitných odpovediach (Tjabringa et al., (2005) Phulm. Pharmacol. Therapeut. 18: 321-327). Pred nedávnom sa zistilo, že LL-37 sa zúčastňuje hojenia rán. Ukázalo sa, že rastové faktory, ktoré sa zúčastňujú procesu hojenia rán, indukujú expresiu LL-37 (Sorensen et al., (2003) J. Immunol. 170: 5583-5589) ahCAP18 je silne exprimovaný v hojacom epiteli (Dorschner et al., (2001) J. Invest. Dermatol. 117: 91-97; Heilbom et al., (2003) J. Invest. Dermatol. 120: 379-389). Úloha LL-37 v hojení rán je podporená aj zistením, že protilátky na LL-37 inhibujú reepitelizáciu kožných rán (Heilbom et al., (2003) J. Invest. Dermatol. 120: 379-389). Ďalej sa demonštrovala účasť LL-37 na angiogenéze, ktorá je sprostredkovaná cez formyl-peptidový receptor FPRL1 (Koczulla et al., (2003) J. Clin. Invest. 111: 1665-1672) a bolo ukázané, že je regulovaná expresia pri zápalových procesoch. Boli ukázané zvýšené expresné hladiny hCAP-18 u keratinocytov v zápalových kožných léziách u pacientov s psoriázou (Frohm et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 15258-15263).

ΐ ·. ·>

-3- -- - ,,

Doteraz sa pokúšal LL-37 rekobinantne produkovať v bunkách Pichia pastoris, kde bola potvrdená jeho antimikrobiálna aktivita, ale nebol stanovený potenciál kvasiniek čo sa týka kvantity (Hon get al., (2007) Biotechnol. Lett. 29: 73-78). Tiež bol exprimovaný v bunkách E. coli, pričom v prvom prípade bol exprimovaný v množstve 0,3 mg/1 kultivačného média a jeho kvalita v podobe MIC voči referenčným organizmom nebola stanovovaná (Moon et al., (2006) Biochim. Biophys. Acta 1786: 1351-1358), v druhom prípade bol exprimovaný v množstve 1,7 mg/1 média s MIC 40 μΜ pre divý kmeň E. coli K12 (Li et al., (2006) Protein Expr. Purif. 47: 498-505) a v treťom 2,6 mg/1 média s nešpecifikovanou MIC (Li et al., (2007) Protein Expr. Purif. 54:157-165).

Úlohou tohto vynálezu je získať čistý LL-37, spôsobom vhodným pre biotechnologickú veľkoobjemovú výrobu a takto získaný peptid použiť ako liečivo či konzervačnú látku.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je vysoko kópiový plazmid kódujúci transkripčnú jednotku, ktorá je zložená zo za sebou radených funkčne na seba nadväzujúcich fragmentov v poradí: T7 promótor, sekvencia kódujúca tioredoxín, sekvencia kódujúca 6 za sebou idúcich histidínov, sekvencia kódujúca cieľové miesto pre enterokinázu, sekvencia kódujúca C koncovú časť ľudského katelicidíni hCAP-18 (LL-37) a T7 transkripčný terminátor (Obrázok 1).

Tento plazmid znižuje mieru segregácie plazmidu v bunkách počas kultivácie vo veľkoobjemových fermentoroch bez selekčného tlaku. Vysoká kópiovosť plazmidu nezabezpečuje len zvýšenú mieru stability ale aj vyšší počet kópií exprimovaného génu, čo zvyšuje mieru produkcie mRNA pre fúzny protein a j ej zastúpenie voči ostatným mRNA. Transkripčná jednotka, ktorú plazmid obsahuje je zostavená do funkčného celku. Pozostáva zo za sebou idúcich sekvencií: T7 promótora, sekvencie kódujúcej tioredoxín, sekvencie kódujúcej 6 za sebou idúcich histidínov, sekvencie kódujúcej cieľové miesto pre enterokinázu, sekvencie kódujúcej LL-37, a T7 transkripčného terminátora. Tioredoxín kódovaný touto transkripčnou jednotkou zvyšuje rozpustnosť rekombinantných proteínov pri heterologických expresiach, čo uľahčuje a ekonomicky zvýhodňuje následnú purifikáciu proteínu z rozpustnej frakcie. Tioredoxín v tomto prípade neslúži len ako protein podporujúci rozpustnosť fuzneho proteínu, ale aj neutralizuje antimikrobiálny účinok LL-37, a tým umožňuje jeho bezproblémovú expresiu v bunkách E. coli. His-tag kódovaný transkripčnou jednotkou plazmidu umiestnený medzi sekvencie kódujúce tioredoxín a cieľové miesto pre enterokinázu umožňuje jednoduchú purifikáciu fúzneho proteínu od ostatných bunkových proteínov a zároveň odseparovanie

-4tioredoxínu od LL-37 po odštiepený enterokinázou. Cieľové miesto pre enterikinázu kódované uvedenou transkripčnou jednotkou slúži na bez zvyškové odštiepenie cieľového LL-37 od fúzneho partnera.

Predmetom vynálezu je plazmid uvedený v predchádzajúcom odstavci obsahujúci sekvenciu SEQ ID NO: 1 kódujúcu fuzny partner tioredoxín. Kódujúce sekvencie sú optimalizované na expresný systém E. coli zabezpečujúc priebeh translácie tioredoxínu bez nízkofrekvenčných transferových RNA. Takto konštruovaný plazmid zabezpečuje zrýchlený priebeh translácie fúzneho partnera tioredoxínu.

Predmetom vynálezu je plazmid uvedený v predchádzajúcich dvoch odstavcoch obsahujúci sekvenciu SEQ ID NO: 2 kódujúcu LL-37. Kódujúce sekvencie sú optimalizované na expresný systém E. coli zabezpečujúc priebeh translácie LL-37 bez nízkofrekvenčných transferových RNA. Takto konštruovaný plazmid zabezpečuje zrýchlený priebeh translácie fúzneho partnera tioredoxínu a zároveň LL-37, čo maximalizuje množstvo exprimovaného proteínu oproti ostatným bunkovým proteínom.

Predmetom vynálezu je aj produkcia fúzneho proteínu, ktorý je kódovaný plazmidom uvedeným v predchádzajúcich odstavcoch v bunkách E. coli, ktoré by niesli funkčný gén T7 RNA polymerázy a zároveň plazmid spomenutý v predchádzajúcich odstavcoch. Fúzovaný polypeptid je zložený z tioredoxínu a 6 za sebou idúcich hystidínov, cieľového miesta pre enterokinázu a C koncovej časti ľudského katelicidínu hCAP-18 (LL-37), kódovaného plazmidom v kmeňoch E. coli nesúcich systém pre expresiu funkčnej T7 RNA polymerázy a zároveň plazmidu. Predmet zahŕňa produkciu v kmeňoch nesúcich funkčný gén T7 RNA polymerázy na chromozóme pod kontrolou induktibilného, či neinduktibilného promótora. Tiež zahŕňa produkciu v kmeňoch, ktoré nesú gén funkčnej T7 RNA polymerázy na inej DNA jednotke ako je chromozóm pod kontrolou induktibilného, či neinduktibilného promótora. DNA jednotkou môže byť plazmid, fágemid či ďalšie jednotky schopné existencie v bunkách E. coli, ktoré by boli kompatibilné s plazmidom uvedeným v predchádzajúcich odstavcoch.

Ďalším predmetom je spôsob izolácie LL-37 pomocou nasledovných krokov: Príprava bunkového lyzátu z buniek, ktoré obsahujú nadprodukovaný fúzny peptid uvedený v predchádzajúcich odstavcoch pomocou chemickej, mechanickej či zvukovej deštrukcie buniek, prípadne ich kombinácií. Odseparovanie nerozpustných partikúl pomocou filtrácie. Predmet tiež zahrňuje použitie filtračných kaziet s rôznymi MWCO, ktoré by zároveň odstraňovali frakcie rozpustných proteínov neobsahujúcich fúzny proteín uvedený v predchádzajúcich statiach. Purifikácia fúzneho proteínu pomocou IMAC afinitnej chromatografie. Odštiepenie LL-37 od fúzneho partnera pomocou enterokinázy. Predmet tiež zahrňuje použitie fixovanej enterokinázy

-5na odštiepenie LL-37. Odstránenie fúzneho partnera od LL-37 pomocou vychytania fúzneho partnera na IMAC afinitnú matricu.

Predmetom vynálezu je tiež použitie LL-37 pripraveného tak, ako je to opísané v predchádzajúcich odstavcoch na prípravu liekovej formy, ktorá by zabraňovala rozširovaniu, respektíve potláčala infekcie spôsobené mikroorganizmami ako u ľudí tak aj u zvierat. Predmet tiež zahrňuje použitie LL-37 i v kombinácii s ďalšími liečivami na podporu hojenia rán, kde by lieková forma bola použitá na potlačenie infekčného množenia patogénnych mikroorganizmov.

Predmetom vynálezu je aj spôsob aplikácie LL-37 získaného pomocou postupov uvedených v predchádzajúcich odstavcoch.

Posledným predmetom vynálezu je použitie LL-37 pripraveného tak, ako je to opísané v predchádzajúcich odstavcoch na inhibíciu rastu mikroorganizmov vo farmaceutických, kozmetických a potravinárskych produktoch. V takomto prípadne LL-37 slúži v produktoch ako konzervačná látka. Predmet zahŕňa použitie LL-37 aj v kombinácii s inými konzervačnými látkami, prípadne v kombinácii s inými peptidmi či polypeptidmi či už majúcimi alebo nemajúcimi inhibičné vlastnosti na rast mikroorganizmov.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obrázku 1 je znázornená schéma vysoko kópiového plazmidu. P-rz - T7 promótor, trx - sekvencia kódujúca tioredixin, HisTag - sekvencia kódujúca 6 za sebou idúcich histidínov, CME - sekvencia kódujúca cieľové miesto pre enterokinázu, LL-37 - sekvencia kódujúca C koncovú časť ľudského katelicidínu, ΤΤτγ - T7 trasnkripčný terminátor.

Na obrázku 2 je znázornená PAGE separácia celkového proteínu v bunkách E. coli. 1. dráha: štandard molekulových hmotností. 2. dráha: celkový proteín v bunkách pred indukciou expresie. 3. dráha: celkový proteín v bunkách po indukcii.

Na obrázku 3 je znázornená PAGE separácia proteínov počas IMAC purifikácie. L dráha: pred purifikáciou. 2. dráha: Proteíny nezachytené na IMAC kolónke. 3. dráha: eluát z IMAC kolónky.

Na obrázku 4 je znázornená PAGE separácia proteínov po proteolytickom štiepení a po separácii na IMAC. 1. dráha: štandard molekulových hmotností. 2. dráha: Trx-LL37. 3. dráha: Trx-LL37 štiepené enterokinázou. 4. dráha: Nezachytené na IMAC (LL-37). 5. dráha: eluát z IMAC (Trx).

-6'3 '1

Príklady uskutočnenia vynálezu:

Príklad 1: Expresia rázneho proteínu v erlenmayerovej banke a purifikácia LL-37

Bunky E. coli boli transformované plazmidom pGPl-2 a plazmidom pJK100-EK-LL37 (3055 bp) nesúcim syntetický úsek kódujúci fúzny proteín, pozostávajúci v poradí z tioredoxínu, His-tagu, cieľového miesta pre enterikinázu a LL-37. Takto natransformované bunky boli očkované z čerstvých nočných kultúr kultivovaných na LB agarových miskách pri teplote 29 °C z izolovanej kolónie na 2 ml tekutej Terrific Broth. Bunky v 2 ml média boli kultivované cez noc na trepačke pri teplote 29 °C a 150 otáčok/min. 1 ml nočnej kultúry sa preočkovalo do 100 ml čerstvého média a kultúra sa pestovala na trepačke pri teplote 29 °C a 150 otáčok/min až do OD6oo=0,5. Po dosiahnutí ODóoo=0,5 sa kultivovalo na trepačke pri teplote 42 °C a 300 otáčok/min po dobu 2 hodín.

Nakultivované bunky sa separovali na centrifúge pri 2000 g a premyli 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8, 0-1 M NaCl. Po premytí sa bunky rozsuspendovali v 10 ml toho istého roztoku s prídavkom 10 mM β-ΜΕ a 1% Tritónu X-100. Suspenzia buniek sa rozbila sonikáciou. Po sonikácii sa suspenzia vystavila teplote 50°C po dobu 1 hodiny a následne inkubovala 16-24 hodín pri teplote 4°C. Nerozpustné partikuly sa odseparovali centrifugáciou pri 2000 g. Kvalitatívne aj kvantitatívne sa expresia overila separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli (Obrázok 2).

ml chromatografickej matrice, modifikovanej chelatačnou funkčnou skupinou a nasýtenou dvojmocným kovovým katiónom, sa naplnila kolónka pre nízkotlakovú chromatografiu. Matrica sa premyla 5 objemami roztoku 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8; 0-1 M NaCl a 1% Tritón X-100. Cez matricu sa nechal pretiecť cytoplazmatický extrakt o objeme, ktorý zodpovedá 10 až 100 mg proteínu. Po pretečení cytoplazmatického extraktu sa matrica premyla 5 objemami roztoku 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8, 0-1 M NaCl. Kolónka sa ďalej premyla 5 objemami roztoku 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8, 0-1 M NaCl, 0-20 mM imidazol. Fúzny proteín sa eluoval 3 objemami roztoku 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8, 0-1 M NaCl, 0,1-1 M imidazol. Koncentrácia proteínov v eluáte sa stanovila Bradfordovou metódou na 0,1 až 1 mg/ml. Kvalitatívne aj kvantitatívne sa účinnosť purifikácie overila separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli (Obrázok3).

Centrifugáciou na ultrafiltračných kyvetách sa odstránil imidazol a uskutočnila sa zmena pufru na 10 až 100 mM Tris-HCl, pH 6-9. K dialyzovanému roztoku sa pridala enterokináza o objeme, ktorý zodpovedal pomeru substrát:enzým 10000:1 až 25:1 a nechal sa inkubovať za

-Ί- - stáleho mierneho miešania pri teplote 0 až 40 °C po dobu 4 až 20 hodín. Kvalitatívne aj kvantitatívne bolo štiepenie overené separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli (Obrázok 4).

ml chromatografíckej matrice uvedenej vyššie sa premylo 5 objemami 10-100 mM Tris-HC1 pH 6-9. Cez matricu sa nechal pretiecť celý roztok štiepenia z predchádzajúcej časti. Zvyšok roztoku sa z matrice odsal striekačkou. Koncentrácia proteínov v roztoku, ktoré sa nezachytili na matrici sa stanovila UV metódou pri vlnových dĺžkach 215 a 225 nm na 25 až 250 pg/ml. Čistota LL-37 sa stanovila separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli a jeho štrukturálna identita MALDI-TOF analýzou. Z LL-37 roztoku sa odstránil pufer dialýzou proti vode vdialyzačnom črievku sMWCO 2 kDa. Pomocou odparovania na vákuovej rotačnej odparke sa vzorka koncentrovala na koncentráciu 0,5 až 2 mg/ml. Antimikrobiálna aktivita sa stanovila CFU testom, kde antimikrobiálny efekt sa zaznamenal od koncentrácie 0,1 pg/ml výslednej koncentrácie.

Príklad 2: Expresia rázneho proteínu v nízko objemovom fermentore a purifikácia LL-37

E. coli nesúca funkčný gén T7 RNA polymerázy s induktibilnou transkripciou z arabinózového promótora sa transformovala plazmidom pJK100-EK-LL37 (3055 bp) nesúcim syntetický úsek kódujúci fúzny proteín, pozostávajúci v poradí z tioredoxínu, His-tagu, cieľového miesta pre enterikinázu a LL-37. Transformované bunky sa očkovali z čerstvých nočných kultúr kultivovaných na LB agarových miskách pri teplote 37 °C z izolovanej kolónie na 50 ml tekutej Terrific Broth. Bunky v 50 ml sa kultivovali cez noc na trepačke pri teplote 37 °C a 150 otáčok/min. Celá nočná kultúry sa preočkovala do pripraveného 1 1 fermentora s 0,5 litrami toho istého čerstvého média. Kultúra sa kultivovala vo fermentore pri teplote 37 °C, 501000 otáčok/min, pH 7 a pri vzdušnení 0,1 až 4 wm až do OD6oo=15. Po dosiahnutí ODôoo=15 sa do kultúry pridala arabinóza do výslednej koncentrácie 0,00001 až 0,2%. Kultivácia prebiehala od 3 do 5 hodín.

Po dokončení kultivácie sa odstránilo kultivačné médium a nahradilo roztokom 10 až 200 mM Na_xPO₄ pH 8, 0-1 M NaCl; 10 mM, β-ΜΕ a 1% Tritón X-100 pomocou centrifugácie. Bunky v suspenzii sa rozbili homogenizáciou vo vysoko tlakom dezintegrátore. Po dezintegrácii sa suspenzia vystavila teplote 50 °C po dobu 1 hodiny a následne inkubovala pri teplote 4 °C 1624 hodín. Nerozpustné štruktúry sa oddelili od rozpustnej frakcie pomocou centrifugácie. Kvalitatívne aj kvantitatívne bola expresia a extrakcia overená separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli.

-850 ml chromatografickej matrice, modifikovanej chelatačnou funkčnou skupinou a nasýtenou dvojmocným kovovým katiónom, sa naplnila kolónka na nízkotlakovú chromatografiu. Matrica sa premyla 5 objemami roztoku 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8, 0-1 M NaCl a 1% Tritón X-100. Matrica sa vypustila do kadičky a pridal sa k nej permeát o objeme, ktorý zodpovedá 70 až 700 mg proteínu. Zmes sa inkubovala aspoň 10 minút pri teplote 0 až 30 °C. Po inkubácii sa zmesou opäť naplnila kolónka. Po pretečení roztoku permeátu sa matrica premyla 5 objemami roztoku 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8, 0-1 M NaCl. Ďalšie premytie sa vykonalo 5 objemami roztoku 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8, 0-1 M NaCl, 0-20 mM imidazol a jedným objemom roztoku 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8, 0-1 M NaCl. Fúzny proteín sa eluoval 5 objemami 10 až 200 mM NaH₂PO4, 0-1 M NaCl, 0,1-1 M imidazol. Eluovaný proteín sa detegoval ako jeden pík prietokovým spektrofotometrom. Zachytený pík zodpovedal objemu od 50 do 250 ml. Koncentrácia proteínov sa stanovila Bradfordovou metódou na 0,2 až 4 mg/ml. Kvalitatívna aj kvantitatívna účinnosť purifikácie sa overila separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli.

Ultrafiltráciou použitím ultrafiltračnej kazety MWCO 5 kDa sa zmenil pufer na 10 až 100 mM Tris-HCl pH 6-9. K retentátu sa pridala enterokináza o objeme, ktorý zodpovedal pomeru substrát:enzým 10000:1 až 25:1 a nechal sa inkubovať za stáleho mierneho miešania pri teplote 0 až 40 °C po dobu 4 až 20 hodín. Kvalitatívne aj kvantitatívne sa štiepenie overilo separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli.

ml chromatografickej matrice uvedenej vyššie sa premylo 5 objemami 10-100 mM Tris-HCl pH 8. Cez matricu v kolónke sa nechal pretiecť celý roztok štiepenia z predchádzajúcej časti. Zvyšky roztoku sa z matrice odsali peristaltickou pumpou. Koncentrácia proteínov v roztoku, ktoré sa nezachytili na matrici sa stanovila UV metódou pri vlnových dĺžkach 215 a 225 nm na 0,1 až 2 mg/ml. Čistota LL-37 sa stanovila separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli (Obrázok 4) a jeho štrukturálna identita pomocou MALDI-TOF analýzy. LL-37 sa purifikoval od pufra a koncentroval ultrafiltráciou použitím ultrafiltračnej kazety MWCO 2 kDa. Antimikrobiálna aktivita sa stanovila CFU testom, prípadne radiálnym difúznym testom.

Príklad č. 3: Expresia fúzneho proteínu v nízko objemovom fermentore apurifikácia LL-37. Štiepenie fixovanou enterokinázou.

-9E. coli nesúca funkčný gén T7 RNA polymerázy s induktibilnou transkripciou z arabinózového promótora sa transformovala plazmidom pJK100-EK-LL37 (3055 bp) nesúcim syntetický úsek kódujúci fúzny proteín, pozostávajúci v poradí z tioredoxínu, His-tagu, cieľového miesta pre enterikinázu a LL-37. Transformované bunky sa očkovali z čerstvých nočných kultúr kultivovaných na LB agarových miskách pri teplote 37 °C z izolovanej kolónie na 50 ml tekutej Terrific Broth. Bunky v 50 ml sa kultivovali cez noc na trepačke pri teplote 37 °C a 150 otáčok/min. Celá nočná kultúry sa preočkovala do pripraveného 1 1 fermentora s 0,5 litrami toho istého čerstvého média. Kultúra sa kultivovala vo fermentore pri teplote 37 °C, 501000 otáčok/min, pH 7 a pri vzdušnení 0,1 až 4 wm až do OD₆₀o=15. Po dosiahnutí ODôoo=15 sa do kultúry pridala arabinóza do výslednej koncentrácie 0,00001 až 0,2%. Kultivácia prebiehala od 3 do 5 hodín.

Po dokončení kultivácie sa odstránilo kultivačné médium a nahradilo roztokom 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8, 0-1 M NaCl; 10 mM, β-ΜΕ a 1% Tritón X-100 pomocou centrifugácie. Bunky v suspenzii sa rozbili homogenizáciou vo vysoko tlakom dezintegrátore. Po dezintegrácii sa suspenzia vystavila teplote 50 °C po dobu 1 hodiny a následne inkubovala pri teplote 4 °C 1624 hodín. Nerozpustné štruktúry sa oddelili od rozpustnej frakcie pomocou centrifugácie. Kvalitatívne aj kvantitatívne sa expresia a extrakcia overili separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli.

ml chromatografickej matrice, modifikovanej chelatačnou funkčnou skupinou a nasýtenou dvojmocným kovovým katiónom, sa naplnila kolónka na nízkotlakovú chromatografiu. Matrica sa premyla 5 objemami roztoku 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8, 0-1 M NaCl a 1% Tritón X-100. Matrica sa vypustila do kadičky a pridal sa k nej permeát s objemom, ktorý zodpovedá 70 až 700 mg proteínu. Zmes sa inkubovala aspoň 10 minút pri teplote 0 až 30 °C. Po inkubácii sa zmesou opäť naplnila kolónka. Po pretečení roztoku permeátu sa matrica premyla 5 objemami roztoku 10 až 200 mM Na_xPC>4 pH 8, 0-1 M NaCl. Ďalšie premytie sa uskutočnilo 5 objemami roztoku 10 až 200 mM Na_xPC>4 pH 8, 0-1 M NaCl, 0-20 mM imidazolu a jedným objemom roztoku 10 až 200 mM Na_xPO4 pH 8, 0-1 M NaCl. Fúzny proteín sa eluoval 5 objemami 10 až 200 mM NaH₂PO₄, 0-1 M NaCl, 0,1-1 M imidazolom. Eluovaný proteín sa detegoval ako jeden pík prietokovým spektrofotometrom. Zachytený pík zodpovedal objemu od 50 do 250 ml. Koncentrácia proteínov sa stanovila Bradfordovou metódou na 0,2 až 4 mg/ml. Kvalitatívna aj kvantitatívna účinnosť purifíkácie sa overila separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli.

Ultrafiltráciou použitím ultrafiltračnej kazety MWCO 5 kDa sa zmenil pufer na 10 až 100 mM Tris-HCl pH 6-9. K retentátu sa pridala enterokináza s objemom, ktorý zodpovedal pomeru

-10substrát:enzým 10000:1 až 25:1 a nechal sa inkubovať za stáleho mierneho miešania pri teplote 0 až 40 °C po dobu 4 až 20 hodín. Kvalitatívne aj kvantitatívne sa štiepenie overilo separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli.

ml chromatografickej matrice uvedenej vyššie sa premylo 5 objemami 10-100 mM Tris-HCl pH 8. Cez matricu v kolónke sa nechal pretiecť celý roztok štiepenia z predchádzajúcej časti. Zvyšky roztoku sa z matrice odsal peristaltickou pumpou. Koncentrácia proteínov v roztoku, ktoré sa nezachytili na matrici sa stanovila UV metódou pri vlnových dĺžkach 215 a 225 nm na 0,1 až 2 mg/ml. Čistota LL-37 sa stanovila separáciou proteínov na denaturačnom polyakrylamidovom géle v elektrickom poli a jeho štrukturálna identita pomocou MALDI-TOF analýzy. LL-37 sa purifikoval od pufra a koncentroval ultrafíltráciou použitím ultrafíltračnej kazety MWCO 2 kDa. Antimikrobiálna aktivita sa stanovila CFU testom, prípadne radiálnym difúznym testom.

Claims (8)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Vysoko-kópiový plazmid kódujúci transkripčnú jednotku, ktoráje zložená zo za sebou radených funkčne na seba nadväzujúcich fragmentov v poradí: T7 promótor, sekvencia kódujúca tioredoxín, sekvencia kódujúca 6 za sebou idúcich histidínov, sekvencia kódujúca cieľové miesto pre enterokinázu, sekvencia kódujúca C koncovú časť ľudského katelicidínu LL-37 a T7 transkripčný terminátor.
2. 2. Plazmid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že úsek kódujúci tioredoxín má sekvenciu podľa SEQ ID NO: 1.
3. 3. Plazmid podľa nárokov 1 a 2, kde úsek kódujúci C koncovú časť ľudského katelicidínu LL-37 má sekvenciu podľa SEQ ID NO: 2.
4. 4. Kmeň E. coli nesúci systém na expresiu funkčnej T7 RNA polymerázy a zároveň plazmid podľa nároku 1 až 3 schopný produkcie fúzovaného polypeptidu zloženého z tioredoxínu a 6 za sebou idúcich hystidínov, cieľového miesta pre enterokinázu a C koncovej časti ľudského katelicidínu LL-37, kódovaného plazmidom podľa nárokov 1 až 3.
5. 5. Spôsob izolácie C koncovej časti ľudského katelicidínu LL-37 kódovaného sekvenciou podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje v poradí tieto kroky:

   - prípravu bunkového homogenátu.

   - odstránenie frakcií neobsahujúcich fuzny polypeptid podľa nároku 4 filtráciou alebo centrifugáciou.

   - purifikáciu IMAC afinitnou chromatografiou.

   - štiepenie enterokinázou.

   - odstránenie tioredoxínu a enterokinázy IMAC chromatografiou.
6. 6. Použitie C koncovej časti ľudského katelicidínu LL-37 kódovanej plazmidom podľa nárokov 1 až 3 izolovanej postupom podľa nároku 5, na prípravu liekovej formy C koncovej časti ľudského katelicidínu LL-37, kde je lieková forma C koncovej časti

   -n-tí ľudského katelicidínu LL-37 použitá na liečenie bakteriálnych infekcií a infekcií spôsobených hubami u ľudí a zvierat.
7. 7. Použitie C koncovej časti ľudského katelicidínu LL-37 podľa nároku 7, kde je lieková forma C koncovej časti ľudského katelicidínu LL-37 určená na lokálne použitie, perorálne použitie, použitie inhaláciou a použitie injekciou.
8. 8. Použitie C koncovej časti ľudského katelicidínu LL-37 kódovanej plazmidom podľa nárokov 1 až 4 a izolovanej postupom podľa nároku 5 na inhibíciu rastu baktérií a húb vo farmaceutických, kozmetických a potravinárskych produktoch, kde C koncová časť ľudského katelicidínu LL-37 slúži ako konzervačná látka.