SK136696A3 - Factor xa inhibitors - Google Patents

Factor xa inhibitors Download PDF

Info

Publication number
SK136696A3
SK136696A3 SK1366-96A SK136696A SK136696A3 SK 136696 A3 SK136696 A3 SK 136696A3 SK 136696 A SK136696 A SK 136696A SK 136696 A3 SK136696 A3 SK 136696A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
group
chg
paph
compound
alkyl
Prior art date
Application number
SK1366-96A
Other languages
English (en)
Other versions
SK286094B6 (sk
Inventor
Fahad Al-Obeidi
Michal Lebl
James A Ostrem
Pavel Safar
Alena Stierandova
Peter Strop
Armin Walser
Original Assignee
Selectide Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Selectide Corp filed Critical Selectide Corp
Publication of SK136696A3 publication Critical patent/SK136696A3/sk
Publication of SK286094B6 publication Critical patent/SK286094B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0207—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)4-C(=0), e.g. 'isosters', replacing two amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0815—Tripeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka všeobecne inhibície proteínov, spôsobujúcich zrážanie krvi, a najmä špecifických inhibítorov enzýmu spôsobujúceho zrážanie krvi faktora Xa.
Doterajší stav techniky
Schopnosť tvoriť krvnú zrazeninu je nevyhnutná pre prežitie. Pri určitých chorobných stavoch je však tvorba krvných zrazenín v obehovom systéme sama zdrojom morbidity. V niektorých prípadoch teda môže byť žiaduce zamedzovať tvorbe krvných zrazenín. Nie je však žiaduce inhibovať systém zrážania úplne, pretože by to viedlo k život ohrozujúcemu krvácaniu.
Za účelom zníženia intravaskulárnej tvorby krvných zrazenín sa odborníci snažia vyvinúť účinný inhibítor protrombinázy alebo faktora Xa, ktorý je zabudovaný do protrombinázového komplexu, kde aktivuje trombín počas tvorby zrazeniny.
Vhodné koncentrácie inhibítora faktora Xa by zvyšovali hladinu prostriedkov vytvárajúcich protrombinázu, nutných na vyvolanie zrážania, avšak zbytočne by nepredlžovali proces zrážania, akonáhle by sa dosiahla prahová koncentrácia trombínu. Napriek dlhodobo uznávanej potrebe takéhoto inhibítora však doposiaľ nie je v klinickom použití žiadny účinný špecifický inhibítor faktora Xa.
V mnohých klinických aplikáciách existuje značná potreba antikoagulačného ošetrenia. V súčasnosti dostupné liečivá nie sú v mnohých konkrétnych klinických aplikáciách uspokojivé. Napríklad u takmer 50 % pacientov, ktorí podstupujú totálnu náhradu bedrového kĺbu, sa vyvíja trombóza hlbokých žíl (DVT). V súčasnosti schválené terapie zahrnujú pevné dávky nízkomolekulárneho heparínu (LMWH) a premenné dávky heparínu. I pri tomto liečebnom režime sa u 10 * až 20 % pacientov vyvinie DVT a u 5 až 10 % krvácavé komplikácie.
Ďalšia klinická situácia, v ktorej sú potrebné lepšie antikoagulanty, sa týka tých subjektov, ktoré podstupujú transluminálnu koronárnu angioplastiu a ktoré sú v nebezpečí infarktu myokardu alebo trpia stupňujúcou sa angínou. Súčasná bežne uznávaná terapia, ktorá spočíva v podávaní heparínu a aspirínu, je spojená so 6 až 8 % prípadov uzatvorenia prerušenej cievy do 24 h po zákroku. Podiel krvácavých komplikácií, vyžadujúcich transfúznu terapiu v dôsledku podávania heparínu, je teda približne 7 %. Naviac, i keď je odklad uzatvorenia významný, podávanie heparínu po skončení liečebnej procedúry má malý význam a môže byť škodlivé.
Najbežnejšie používanými inhibítormi zrážania krvi sú heparín a príbuzné sulfátované polysacharidy, LMWH a heparínsulfát. Tieto molekuly vykonávajúí svoje protizrážanlivé účinky podporovaním väzby prírodného regulátora procesu zrážania, antitrombínu III, na trombín a na faktor Xa. Inhibičná aktivita heparínu je primárne zameraná na trombín, ktorý je inaktivovaný približne lOOkrát rýchlejšie než faktor Xa. Heparínsulfát a LMWH, hoci sú heparínu príbuzné, sú trocha účinnejšími inhibítormi Xa než trombínu; rozdiely in vitro sú mierne (3 až 30násobok) a účinky in vivo môžu byť bezvýznamné. Ďalšími v súčasnej dobe klinicky skúšanými antikoagulantami špecifickými pre trombín sú hirudín a hirulog. Tieto antikoagulanty, ktoré inhibujú trombín, sú však tiež spojené s krvácavými komplikáciami.
Preklinické štúdie na paviánoch a psoch preukázali, že špecifické inhibítory faktora Xa zabraňujú tvorbe zrazeniny, bez toho, aby vyvolávali krvácavé vedľajšie účinky, pozorované u priamych inhibítorov trombínu. Takéto inhibítory faktora Xa zahrnujú napríklad 2,7-bis-(4-amidinobenzylidén)-cyklo-heptanón a Na-tozylglycyl-3-amidinofenylalaninmetylester („TENSTOP“), ktoré majú účinné inhibičné koncentrácie (Kj) asi 20 nM, resp. 800 nM. Predstaviteľom skupiny inhibítorov faktora Xa je taktiež kyselina (+)-(2S)-2-(4-({(3S)-l-acetimidoyl-3pyrolidinyl}oxy)fenyl)-3-(7-amidino-2-naftyl)-propánová (Katakura a d’., Biochem. Biophys. Res. Comm. 197:965-972 (1993)). Tieto zlúčeniny však doposiaľ neboli vyvíjané klinicky.
Boli taktiež identifikované špecifické bielkovinové inhibítory faktora Xa, ktoré zahrnujú napríklad antistasin („ATS“) a kliešťový antikoagulačný peptid („TAP“). ATS, ktorý bol izolovaný z pijavice Haementerin officinalis, obsahuje 119 aminokyselín a má K; pre faktor Xa 0,05 nM. TAP, ktorý sa izoluje z kliešťa Ornithodoros moubata, obsahuje 60 aminokyselín a má K; pre faktor Xa asi 0,5 nM.
Účinnosť rekombinačne získaného ATS a TAP bola skúmaná v rôznych systémoch na zvieracích modeloch. Oba inhibítory znižujú dobu krvácania v porovnaní s inými antikoagulantami a zabraňujú zrážaniu v modeli tromboplastínom indukovanej trombózy hlbokej žily s podviazanou jugulárnou žilou. Výsledky získané v tomto modeli korelujú s výsledkami dosahovanými s obvykle doporučovaným liečivom heparínom.
Zistilo sa, že subkutánna ATS predstavuje účinnú liečbu i v tromboplastínom indukovanom modeli roztrúsenej intravaskulárnej koagulácie (DIC). TAP účinne zabraňuje arteriálnej trombóze „vysokého strihu“ a „zníženému prietoku“, vyvolanému chirurgickým vložením polyesterového („DACRON“) štepu, v miere, ktorá spôsobuje klinicky prijateľné predĺženie doby aktivovaného čiastočného tromboplastínu (aPTT), tj. menšie než asi dvojná4 sobné predĺženie. Pre porovnanie heparín ako štandard nezabraňoval trombóze a zníženému prietoku v štepe ani pri päťnásobnom zvýšení aPTT. Zisťovanie aPTT je klinická skúška koagulácie, zvlášť citlivá voči inhibítorom trombínu.
ATS a TAP neboli vyvíjané klinicky. Jednou z veľkých nevýhod týchto dvoch inhibítorov je, že nutné opakované dávky spôsobujú tvorbu neutralizujúcich protilátok, čo limituje ich potenciálne klinické použitie. Veľkosť TAP a ATS naviac znemožňuje ich orálnu aplikáciu, čo ďalej znižuje počet pacientov, ktorí by mohli mať z týchto prostriedkov prospech.
Špecifický inhibítor faktora Xa by mal podstatný význam v praktickej medicíne. Inhibítor faktora Xa by bol účinný najmä za okolností, za ktorých sú v súčasnosti doporučované liečivá, tj. heparín a príbuzné sulfátované polysacharidy, neúčinné alebo účinné iba okrajovo. Existuje teda potreba nájsť nízkomolekulárny inhibítor zrážania krvi, špecifický pre faktor Xa, ktorý je účinný, ale nespôsobuje nežiadúce vedľajšie účinky. Vynález uspokojuje túto potrebu a poskytuje taktiež súvisiace výhody.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu sú zlúčeniny, ktoré špecificky inhibujú aktivitu faktora Xa. Zlúčenina podľa vynálezu má štruktúru zodpovedajúcu vzorcu Xi-Y-I-RX2, kde Xi je vodík (H), acylová, alkylová alebo arylalkylová skupina alebo jedna alebo niekoľko aminokyselín a X2 je modifikovaná C-terminálna skupina, jedna alebo niekoľko karboxy-chrániacich skupín (viď ďalej), jedna alebo niekoľko aminokyselín alebo ďalších substituentov, symboly Y, I a R označujú aminokyseliny tyrozín, izoleucín a arginín a peptidomimetické alebo organické štruktúry, ktoré majú rovnaké funkčné aktivity ako tyrozín, izoleucín a arginín. Ďalej má zlúčenina podľa vynálezu štruktúru Al-A2-(A3)m-B.
Zlúčenina podľa vynálezu môže byť lineárna alebo cyklická, môže mať dĺžku asi 2 až 43 zvyškov a môže byť modifikovaná na N-konci alebo na C-konci alebo na oboch. Takéto zlúčeniny vykazujú špecifickú inhibíciu aktivity faktora Xa s hodnotou K; < 100 μΜ, prednostne K; < 2 nM, a v podstate neinhibujú aktivitu iných proteáz, účastniacich sa koagulačnej kaskády. Konkrétne príklady takýchto zlúčenín zahrnujú Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-LeuPro-NH2; Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3); Ac-Tyr-{lF(CH2NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2 (kde „Ψ“ označuje pseudopeptidickú väzbu, ktorou môže byť napríklad redukovaná väzba, označovaná „(CH2NH)“; pseudopeptidické väzby sa označujú symbolom „Ψ“ v zátvorkách, tj. „{Ψ}“); Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-pyridyl); Αο-ΤΥΓ-Ι1ε-{Ψ(<:Η2ΝΗ)}-Α^Leu-Pro-NH2; Ac-Tyr-Chg-Arg(NO2)-{ T(CH2NH)}-Leu-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg{T(COCH2)}-Gly-Pro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Dab(NT-C3H7N)-Leu-Ala-NH2; Ac-TyrIle-PalMe(3)-NH2; Tyr-Ile-Arg-NH2; (D)-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropyl)Gly-NH2; cyklo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly); Tfa(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-Nal(2)Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; a ich farmaceutický prijateľné soli a C-terminálne deriváty, ako sú amidy, estery, alkoholy a aldehydy (viď taktiež tabuľka 5). Vynález taktiež zahrnuje spôsoby špecifickej inhibície faktora Xa a inhibície zrážania krvi u jedinca. Zahrnuje taktiež spôsoby detekcie hladiny alebo aktivity faktora Xa.
Koagulácia krvi je komplexný proces, zahrnujúci progresívne sa zväčšujúci rad reakcií aktivácie enzýmov, pri ktorých sú plazmové zymogény postupne aktivované obmedzenou proteolýzou. Mechanisticky sa koagulačná kaskáda delí na vnútornú a vonkajšiu dráhu, ktoré sa zbližujú pri aktivácii faktora Xa; následná tvorba trombínu prebieha po jednej spoločnej dráhe (viď obr. 1).
Súčasné dôkazy naznačujú, že vnútorná dráha hraje významnú úlohu pri udržovaní a raste tvorby fibrínu, zatiaľ čo vonkajšia dráha je kritická v iniciačnej fáze krvnej koagulácie. Všeobecne sa uznáva, že koagulácia krvi je fyzicky iniciovaná pri vzniku komplexu tkanivový faktor/faktor Vila. Akonáhle sa vytvorí tento komplex, rýchle iniciuje koaguláciu aktiváciou faktorov IX a X. Novo vytvorený faktor Xa potom vytvorí komplex 1:1 s faktorom Va a fosfolipidmi za vzniku protrombinázového komplexu, ktorý je zodpovedný za premenu rozpustného fibrinogénu na nerozpustný fibrín. S postupom času je aktivita komplexu faktor Vlla/tkanivový faktor (vonkajšia dráha) potlačovaná inhibičným proteínom proteázy Kunitzovho typu TFPI, ktorý v komplexe s faktorom Xa môže priamo inhibovať proteolytickú aktivitu faktora Vlla/tkanivového faktora. Za účelom zachovania procesu koagulácie v prítomnosti inhibovaného vonkajšieho systému je produkovaný ďalší faktor Xa prostredníctvom aktivity vnútornej dráhy sprostredkovanej trombínom. Trombín tak hraje dvojitú katalytickú úlohu, pretože sprostredkováva svoju vlastnú produkciu a premenu fibrinogénu na fibrín.
Autokatalytický charakter tvorby trombínu je významnou poistkou proti nekontrolovanému krvácaniu a zaisťuje, že ak je prítomná daná prahová hladina protrombinázy, prebehne koagulácia krvi úplne, a tak dôjde napríklad ku skončeniu krvácania. Je teda veľmi žiadúce vyvinúť prostriedky, ktoré by inhibovali koaguláciu, bez toho, aby priamo inhibovali trombín.
Predmetem vynálezu sú peptidy YIR, čo sú zlúčeniny, ktoré inhibujú aktivitu faktora Xa, avšak v podstate neinhibujú aktivitu iných proteáz zúčastňujúcich sa dráhy koagulácie krvi. Tu používaný výraz „zlúčenina“ alebo „peptid YIR“ sa vzťahuje na peptid Tyr-Ile-Arg (YIR) nevyskytujúci sa v prírode a jeho analógy a mimetiká, ktoré môžu inhibovať aktivitu faktora Xa. Sekvencia YIR sama o sebe sa tu označuje ako „jednotka YIR“ a je tvorená tripeptidóm tyrozínizoleucín-arginín alebo jeho funkčným ekvivalentom, ako je pAph-Chg-PalMe(3), pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 a pAph-Chg-AMP(4) (skratky viď tabuľka 1). Tieto zlúčeniny podľa vynálezu obsahujú aspoň jednu jednotku YIR alebo jej funkčné ekvivalenty a sú schopné špecificky inhibovať aktivitu faktora Xa. Pre jednoduchosť sa tu všeobecne používajú výrazy „zlúčenina“ a „peptid YIR“ na označenie peptidov podľa vynálezu včítane funkčných ekvivalentov, ako sú analógy peptidov, mimetiká peptidov a syntetické organické zlúčeniny. Funkčný ekvivalent peptidu YIR podľa vynálezu môže byť čiastočne charakterizovaný tu opísanou štruktúrou a hodnotou K; < 100 μΜ pre inhibíciu aktivity faktora Xa (viď príklad XXXVII).
Peptidické analógy peptidu YIR podľa vynálezu zahrnujú napríklad peptidy obsahujúce aminokyseliny nevyskytujúce sa v prírode alebo chemicky modifikované aminokyseliny, pokiaľ si taká zlúčenina uchováva inhibičnú aktivitu pre faktor Xa (viď napríklad tabuľka 2). Podobne mimetiká peptidov sú neaminokyselinové chemické štruktúry, ktoré napodobňujú štruktúru peptidu YIR podľa vynálezu a uchovávajú si inhibičnú aktivitu voči faktoru Xa. Takéto mimetiká sú všeobecne charakterizované podobnou fyzikálnou charakteristikou, ako je veľkosť, náboj alebo hydrofobicita, ktorá je prítomná v zodpovedajúcej priestorovej orientácii, ako má normálny zodpovedajúci peptid YIR. Konkrétnym príkladom peptidového mimetiká je zlúčenina, v ktorej je amidická väzba medzi jednou alebo niekoľkými aminokyselinami nahradená napríklad väzbou uhlíkuhlík alebo inou známou väzbou (viď napríklad Sawyer, v Peptide Based Drug Design, str. 387-422 (ACS, Washington DC, 1995), tu zahrnuté ako odkaz). Predmetom vynálezu sú teda ďalej zlúčeniny inhibujúce faktor Xa štruktúry AlA2-(A3)m-B, kde m je rovné 0 alebo 1 (viď ďalej). Sú tu uvedené príklady týchto peptidov, ktoré môžu byť mimetickými zlúčeninami.
Výraz „aminokyselina“ sa tu používa v najširšom zmysle, zahrnujúcom dvadsať prírodných aminokyselín, ktoré sú prekladané z genetického kódu a tvoria stavebné bloky bielkovín a zahrnujú, ak nie je konkrétne uvedené ináč, La D-aminokyseliny a chemicky modifikované aminokyseliny, ako sú analógy aminokyselín, prírodné aminokyseliny, ktoré sa obvykle nezabudovávajú do bielkovín, ako je norleucín, a chemicky syntetizované zlúčeniny s vlastnosťami, o ktorých je známe, že sú charakteristické pre aminokyselinu. V definícii „aminokyseliny“ sú napríklad zahrnuté analógy alebo mimetiká fenylalanínu ale8 bo prolínu, ktoré umožňujú rovnaké konformačné obmedzenie peptidických zlúčenín ako prírodné Phe alebo Pro a sú odborníkom známe. Takéto analógy a mimetiká sa tu označujú ako „funkčné ekvivalenty“ aminokyseliny. Ďalšie príklady aminokyselín a ich analógov je možné nájsť v Roberts a Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, ed. Gross a Meienhofer, zv. 5, str. 341, Academic Press, Inc., N.Y., 1983 (zahrnuté tu ako odkaz). Skratky aminokyselín a ich analógov a štruktúry mimetík sú uvedené v tabuľke 1.
Tabuľka 1. Skratky používané v opise
zlúčenina skratka # 1 skratka # 2*
acetyl Ac
alanín Ala A
3-(2-tiazolyl)-L-alanín Tza
amidín AMDN
amidoxím (C(NH2)=N-OH) (CNOH.NH2)
(N-metylpyridínium)metyl AMP
(4-(N-metylpyridínium))metyl AMP(4)
l-(N-metylpyridínium)et-l-yl AEMP
l-(4-(N-metylpyridínium))et-l-yl AEMP(4)
arginín Arg R
asparagín Asn N
kyselina asparagová Asp D
benzoyl Bz
2-benzofuránkarboxy Bzf
benzyl Bzl
benzyloxykarbonyl Cbz
5-benzimidazolkarboxy 5-Bzim
t-butyloxykarbonyl Boe
benzotriazol-l-yloxytris-(dimetylamino)-
fosfóniumhexa-fluórofosfát Bop
β-alanín pAla
β-valín pVal
P-(2-pyridyl)-alanín Pal(2)
P-(3-pyridyl)-alanín Pal(3)
P-(4-pyridyl)-alanín Pal(4)
p-(3-N-metylpyridínium)-alanín PalMe(3)
bróm-trispyrolidinofosfónium-
hexafluórofosfát PyBroP
t-butyl tBu, But
t-butyloxykarbonyl Boe
kyselina caffeová Caff
karbonyldiimidazol CDI
cysteín Cys C
5-chlórindol-2-karboxy CICA
cyklohexyl Chx
cyklohexylalanín Cha
cyklohexylglycín Chg
kyselina 2,4-diaminomaslová Dab
dimetylamidínium od Dab Dab(NY-C3H7N)
kyselina 2,3-diaminopropionová Dap
dimetylamidínium od Dap Dap(Np-C3H7N)
3,5-dinitrotyrozín Tyr(3,5-NO2) Y(3,5-NO2)
3,5-dijódtyrozín Tyr(3,5-I) Y(3,5-I)
3,5-dibrómtyrozín Tyr(3,5-Br) Y(3,5-Br)
N,N-diizobutylkarboxamid DIBA
N,N-diizopropylkarboxamid DIPA
4-N,N-dimetylaminopyridín DMAP
9-fluorenylmetyloxykarbonyl Fmoc
5-fluórindol-2-karboxy FICA
formyl For
glutamín Gin Q
kyselina glutámová Glu E
kyselina γ-karboxyglutámová Gla
glycín Gly G
histidín His H
homoarginín hArg hR
5-hydroxyindol-2-karboxy 5-Hic
N-hydroxybenzotriazol HOBt
3-hydroxyprolín Hyp
kyselina iminodioctová Ida
5-aminoindol-2-karboxy 5AM2IN
5-nitroindol-2-karboxy 5NOINDC
DL-indolín-2-karboxy 2INCA
izobutyl iBu
izoleucín íle I
kyselina izonikotínová Isn
kyselina N-metylizonikotínová IsnMe
kyselina izonipekotová Ina
izopropanol iPrOH
1-izochinolínkarboxy 1-Iqc
3-izochinolínkarboxy 3-Iqc
leucín Leu L
terc.leucín Tie
lyzín Lys K
kyselina merkapto-P,P-cyklopenta-
metylénpropiónová Mpp
kyselina merkaptooctová Mpa
kyselina merkaptopropiónová Mpr
metanol MeOH
metionín Met M
4-morfolinokarbonylamid MORA
N-metylmorfolín NMM
1-naftylalanín Nal(l)
2-naftylalanín NA1(2)
kyselina nikotínová Nie
kyselina nipekotová Npa
kyselina N-metylnikotínová NicMe
norarginín nArg nR
norleucín Nie nL
norvalín Nva nV
ornitín Orn
dimetylamidínium od ornitínu Orn(N5-C3H7N)
fenyl Ph
fenylalanín Phe F
p-guanidinofenylalanín Phe(Gua) F(pGua)
p-aminofenylalanín Phe(NH2) F(pNH2)
p-chlórfenylalanín Phe(Cl) F(pCl)
p-fluórfenylalanín Phe(F) F(pF)
p-nitrofenylalanín Phe(NO2) F(pNO2)
p-hydroxyfenylglycín Pgl(OH)
p-toluénsulfonyl Tos
2,2,5,7,8-pentametylchróman-6-sulfonyl Pmc
m-amidinofenylalanín mAph
p-amidinofenylalanín pAph
fenylglycín Pgl
kyselina fenylmalónová Pma
piperidiny 1 PIP
1-piperidinokarbonylamid PÍPA
kyselina L-pipekolonová Pip
prolín Pro P
2-pyrazínkarboxy Pza
2-chinolínkarboxy 2-Qca
4-chinoIínkarboxy 4-Qca
sarkozín Sar
S-terc.butyl SBut
linker SCAL napojený na „TENTAGEL“ SCAL-TG
serín Ser S
tetrahydroizochinolín-3-karboxyl Tie
treonín Thr T
trifluóracetyl Tfa
tryptofán Trp W
tyrozín Tyr Y
3-jódtyrozín Tyr(3-I) Y(3-I)
O-metyltyrozín Tyr(Me) Y(Me)
valín Val V
* Aminokyseliny konfigurácie D sú označené buď prefixom D- s použitím trojpísmenového kódu (napríklad D-Ala, D-Cys, D-Asp, D-Trp) alebo malými písmenami pomocou jednopísmenového kódu (a, c, d, w)
Výraz „aktivita faktora Xa“ sa tu vzťahuje na schopnosť faktora Xa, samotného alebo v súhrne podjednotiek známych ako protrombinázový komplex, katalyzovať premenu protrombínu na trombín. Výraz „inhibícia“ v spojitosti s aktivitou faktora Xa zahrnuje ako priamu, tak nepriamu inhibíciu aktivity faktora Xa. Priame inhibície aktivity faktora Xa je možné dosiahnuť napríklad väzbou peptidu YIR podľa vynálezu na faktor Xa alebo na protrombinázu za účelom zamedzenia väzby protrombínu na aktívne miesto protrombinázového komplexu. Nepriamu inhibíciu aktivity faktora Xa je možné uskutočňovať napríklad väzbou zlúčeniny podľa vynálezu na rozpustný faktor Xa, aby sa zabránilo jeho zabudovaniu do protrombinázového komplexu.
Výraz „špecifická“, používaný tu s odkazom na inhibíciu aktivity faktora Xa,znamená, že peptid YIR môže inhibovať aktivitu faktora Xa bez podstatnej inhibície aktivity iných špecifikovaných proteáz, včítane plazmínu a trombínu (s použitím rovnakej koncentrácie inhibítora). Tieto proteázy sa zúčastňujú kaskády koagulácie krvi a fibrinolýzy (viď tabuľka 2 a ďalej príklad XXVII).
Tabuľka 2. Inhibičná aktivita vybraných zlúčenín proti piatim enzýmom
Kí (μΜ)
zlúčenina Xa trombín plazmín trypsín elastáza
Ac-Y-I-R-L-A-A-F-T 1,5 100 NT > 200* > 100
Ac-Y-I-R-L-P 0,5 > 200 > 200 > 200 > 100
y-I-R-L-P 0,2 > 200 > 200 > 200 > 100
Ac-(iBu)Y-I-R-L-P 0,04 25 > 200 NT > 100
„TENSTOP“ 2 2 > 200 NT > 200
* označuje, že nedošlo k významnej inhibícii aktivity enzýmu pri najvyššej (uvedenej) testovanej koncentrácii zlúčeniny
Výsledky uvedené v tabuľke 2 demonštrujú, že peptidy YIR podľa vynálezu sú použiteľné ako inhibítory faktora Xa, avšak podstatne neinhibujú aktivitu iných serínových proteáz, ako je trombín alebo plazmín, ktoré sa zúčastňujú procesu koagulácie krvi a fíbrinolýzy.
Výraz „substituent“ sa tu vzťahuje na ktorúkoľvek z rôznych chemických skupín, ktorá je substituovaná na peptidický retezec alebo na postranný reťazec peptidu, analógu peptidu, mimetika alebo organickej zlúčeniny podľa vynálezu. Substituent môže zahrnovať ktorúkoľvek z rôznych jednotiek, známych odborníkom (viď napríklad Giannis a Kolter, Angew. Chem. Iní. Ed. Engl. 32:1244-1267 (1993), tu zahrnuté ako odkaz). Sú tu uvedené početné príklady, demonštrujúce substitúciu rôznymi substituentami, napríklad substitúciu fenylalanínu substituentom pNH2 za vzniku F(pNH2) a substitúciu tyrozínu halogénom za vzniku napríklad Y(3-I) alebo Y(3,5-I). Substituentom môže byť ďalej napríklad heteroatóm, ako je dusík (N; viď napríklad Pal), kyslík (O; viď napríklad 0metyltyrozín) alebo síra (S; viď napríklad Tyr(S03H)), ktorý môže byť substituovaný substituentom. Za „substituent“ sa teda tu považuje i jednotka obsahujúca dusík, síru alebo kyslík, ako je skupina -SO3H. Substituentom môže byť ďalej chrániaca skupina aminoskupiny alebo karboxyskupiny.
Výraz „alkyl“ sa tu používa v najširšom zmysle, zahrnujúcim nasýtené alebo nenasýtené lineárne, rozvetvené alebo cyklické reťazce s asi 1 až 13 uhlíkovými atómami. Výraz „alkyl“ teda zahrnuje napríklad metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, sek.butyl, 1-metylbutyl, 2,2-dimetylbutyl, 2-metylpentyl, 2,2dimetylpropyl, n-pentyl a n-hexyl, alkylénové skupiny, cyklické reťazce uhlíkových atómov, ako je cyklohexylová a cyklopentylová skupina, a taktiež kombinácie lineárnych alebo rozvetvených reťazcov a cyklických reťazcov uhlíkových atómov, ako je metyl-cyklohexylová alebo cyklopropyl-metylénová skupina. Ďalej je nutné vziať do úvahy, že alkyl podľa vynálezu môže byť substituovaný substituentom. Podobne sa i výraz „acyl“ používa v najširšom zmysle a zahrnuje nasýtené alebo nenasýtené lineárne, rozvetvené alebo cyklické reťazce s asi 1 až 13 uhlíkovými atómami, ktoré obsahujú karboxylovú skupinu. Výraz „acyl“ teda zahrnuje napríklad skupiny, ako je formyl, acetyl, benzoyl a pod.
Výraz „aryl“ sa vzťahuje na aromatické skupiny s asi 5 až 13 uhlíkovými atómami a aspoň jednou „kruhovou“ skupinou s konjugovaným π-elektrónovým systémom. Príklady arylových skupín zahrnujú napríklad heterocyklické arylové skupiny, biarylové skupiny a ich analógy a deriváty, z ktorých všetky môžu byť prípadne substituované jedným alebo niekoľkými substituentami. Výraz „arylalkyl“ označuje alkyl podľa vyššie uvedenej definície, substituovaný arylovou skupinou. Vhodné arylalkylové skupiny zahrnujú benzyl, pikolyl apod., z ktorých všetky môžu byť prípadne substituované.
Sú tu používané taktiež výrazy „heteroalkyl“, „heteroarylalkyl“ a „heteroaryl“, ktoré sa vzťahujú na alkyl, resp. arylalkyl, resp. aryl, ktorý je substituovaný jedným alebo niekoľkými heteroatómami, ako je atóm dusíka, kyslíka alebo síry. Ďalej sa používa výraz „heterocyklický“ na označenie cyklickej alkylovej alebo arylovej skupiny, ktorá je substituovaná jedným alebo niekoľkými heteroatómami. Rôzne príklady heteroalkylov, heteroarylalkylov, heteroarylov a heterocyklov sú uvedené napríklad v tabuľkách 1 a 3 a sú ináč známe.
Peptidy podľa vynálezu môžu byť na N-konci alebo C-konci modifikované s použitím chrániacej skupiny pre aminoskupinu, resp. pre karboxyskupinu. Sú tu uvedené rôzne takéto modifikácie (viď napríklad tabuľka 3). N-koniec pep.tidu alebo analógu peptidu môže byť modifikovaný tak, že N-terminálna aminoskupina je substituovaná napríklad acetylom, cyklopentylkarboxyskupinou, izochinolylkarboxyskupinou, furoylom, tozylom, pyrazínkarboxyskupinou alebo inou takouto skupinou, ktorá môže byť, ako je vyššie uvedené, substituovaná substituentom. N-terminálna aminoskupina môže byť taktiež substituovaná napríklad obrátenou amidickou väzbou. Je nutné vziať do úvahy, že výraz „aminoskupina“ je tu používaný v širokom zmysle, zahrnujúcom akúkoľvek voľnú aminoskupinu, včítane primárnych, sekundárnych alebo terciárnych aminoskupín, prítomnú v peptide. Naproti tomu výraz „N-koniec“ sa vzťahuje na aaminoskupinu prvej aminokyseliny prítomnej v peptide, zapísanom konvenčným spôsobom.
N-koniec peptidu podľa vynálezu môže byť chránený naviazaním aminochrániacej skupiny. Výraz „amino-chrániaca skupina“ sa tu používa v širokom zmysle a vzťahuje sa na chemickú skupinu, ktorá môže reagovať s voľnou aminoskupinou včítane napríklad α-aminoskupiny prítomnej na N-konci peptidu podľa vynálezu. Tým, že s ňou zreaguje, chráni amino-chrániaca skupina ináč reaktívnu aminoskupinu pred nežiadúcimi reakciami, ku ktorým môže dochádzať napríklad počas syntetického postupu alebo v dôsledku exopeptidázovej aktivity voči konečnej zlúčenine. Modifikáciou aminoskupiny je možné taktiež dosiahnuť ďalšie výhody, napríklad zvýšenie rozpustnosti alebo aktivity zlúčeniny. Rôzne amino-chrániace skupiny sú tu uvedené (viď tabuľka 3) alebo inak známe a zahrnujú napríklad acylové skupiny, ako je acetyl, pikolyl, terc.butylacetyl, terc.butyloxykarbonyl, benzyloxykarbonyl, benzoylové skupiny, napríklad benzyloxím, ako je 2-aryl-2-O-benzyloxim (viď príklad XVI), a taktiež aminoacylový zvyšok, ktorý sám môže byť modifikovaný amino-chrániacou skupinou. Ďalšie amino-chrániace skupiny sú opísané napríklad v The Pepíides, ed. Gross a Meienhofer, zv. 3 (Academic Press, Inc., N.Y. 1981), a Greene a Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. vyd., str. 309-405 (John Wiley & Sons, New
York (1991), oboje sú tu zahrnuté ako odkaz). Produkt akejkoľvek takejto modifikácie N-terminálnej aminoskupiny peptidu alebo analógu peptidu podľa vynálezu sa tu označuje ako „N-terminálny derivát“.
Podobne môže byť karboxyskupina, napríklad karboxyskupina prítomná na C-konci peptidu, chemicky modifikovaná s použitím karboxy-chrániacej skupiny. Výrazy „karboxyskupina“ a „C-koniec“ sa tu používajú spôsobom konzistentným s vyššie uvedenými výrazmi „aminoskupina“ a „N-koniec“. Karboxyskupina, napríklad prítomná na C-konci peptidu, môže byť modifikovaná redukciou Cterminálnej karboxyskupiny na alkohol alebo aldehyd alebo vytvorením orálneho esteru alebo substitúciou karboxyskupiny substituentom, ako je tiazolyl, cyklohexyl alebo iná skupina. Orálne estery sú známe a zahrnujú napríklad alkoxymetylové skupiny, ako je metoxymetyl, etoxymetyl, izopropoxymetyl apod., ct-(Ci až C^alkoxyetylové skupiny, ako je metoxyetyl, etoxyetyl, propoxyetyl, izopropoxyetyl a pod., 2-oxo-l,3-dioxolen-4-ylmetylové skupiny, ako je 5-metyl-2oxo-1,3-dioxolen-4-ylmetyl, 5-fenyl-2-oxo-l,3-dioxolen-4-ylmetyl apod., Ci až C3 alkyltiometylové skupiny, ako je metyltiometyl, etyltiometyl, izopropyltiometyl a pod., acyloxymetylové skupiny, ako je pivaloyloxymetyl, α-acetoxymetyl a pod., ethoxykarbonyl-l-metylovú skupinu, α-acyloxy-oc-substituované metylové skupiny, ako je α-acetoxyetyl, 3-ftalidylové alebo 5,6-dimetylftalidylové skupiny, l-(Ci až C4 alkoxykarbonyloxy)et-l-ylové skupiny, ako je l-(etoxykarbonyloxy)et-l-ylová skupina, a l-(Ct až C4 alkylaminokarbonyloxy)et-1-ylové skupiny, ako je l-(metylaminokarbonyloxy)et-l-ylová skupina.
Peptid podľa vynálezu môže byť modifikovaný naviazaním karboxychrániacej skupiny. Karboxy-chrániace skupiny sú známe a tým, že sú naviazané na peptid, chránia karboxyskupinu pred nežiadúcimi reakciami (viď napríklad vyššie citovaní Greene a Wuts, str. 224-276 (1991), tu zahrnuté ako odkaz). Odborníkovi je zrejmé, že vyššie opísané modifikácie, ktoré je možné uskutočňovať na N-terminálnej aminoskupine alebo na C-terminálnej karboxyskupine peptidu, môžu byť podobne uskutočnené na ktorejkoľvek prítomnej reaktívnej aminoskupine alebo karboxyskupine, napríklad na postrannom reťazci aminokyseliny alebo analógu aminokyseliny v peptide podľa vynálezu. Metódy uskutočňovania týchto modifikácií sú tu uvedené alebo sú známe.
Vynález sa týka zlúčenín, ktoré špecificky inhibujú aktivitu faktora Xa. Zlúčenina podľa vynálezu má všeobecnú štruktúru X1-YIR-X2 alebo jej funkčný ekvivalent, kde Xi je vodík, acyl, alkyl, arylalkyl alebo jedna alebo niekoľko aminokyselín a X2 je modifikovaná C-koncová skupina, jedna alebo niekoľko karboxy-chrániacich skupín, jedna alebo niekoľko aminokyselín alebo iný substituent, ako je amino-chrániaca skupina. Zlúčenina podľa vynálezu je použiteľná ako antikoagulant pre terapeutické ošetrenie rôznych klinických stavov. Zlúčenina podľa vynálezu je taktiež použiteľná v rôznych laboratórnych postupoch pre zamedzenie zrážania krvných vzoriek.
Vynález sa taktiež týka zlúčeniny, ktorá špecificky inhibuje aktivitu faktora Xa, majúcej všeobecný vzorec A1-A2-(A3)m-B, kde m je rovné 0 alebo 1 a A1 je Ri-R2-R3, A2 je R4-R5-R6 a A3 je R7-R8-R9, kde zvyšok Rj je vybraný zo skupiny, tvorenej 1 až 20 aminokyselinami, skupinou
zvyšok X je vybraný zo skupiny tvorenej N, CH a NC(O) a zvyšky R'( a Ri sú nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, acyl, aryl, arylalkyl a aminochrániacu skupinu a zvyšok Ri môže byť substituovaný substituentom; R2 predstavuje -CR99R100-, kde zvyšky R99 a R100 sú nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, aralkyl, heteroarylalkyl a heteroaryl, pričom zvyšky R99 a R100 môžu byť nezávisle substituované substituentom; zvyšok R3 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej -C(O)-, -CH2-, -CHR99-C(O)- a -C(O)-NR35-CH2-C(O)-, kde R35 je skupina CHRj5 mostíkovej skupiny -C(O)-CRs5-; zvyšok R4 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej -CH2- a -NRJ0-, kde zvyšok R50 je vybraný zo skupiny zahr18 nujúcej H, alkyl, arylalkyl a heterocyklickú skupinu; symbol R5 predstavuje >CR2oiR2O2, kde zvyšky R2oi a R202 sú nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, aryl a arylalkyl a kde zvyšky R2oi a R2o2 môžu byť nezávisle substituované substituentom; zvyšok Re je vybraný zo skupiny zahrnujúcej -C(O)-, -CH2a -CHR99-C(O)-; zvyšok R7 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej -CH2- a -NRji, kde zvyšok R5i je vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, arylalkyl, heteroalkyl a heteroarylalkyl a ktorúkoľvek z týchto skupín substituovanú substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej Q a -(CH2)„-Q, kde n je rovné 1 až 5 a zvyšok Q je vybraný zo skupiny zahrnujúcej skupinu amino, amidino, imidazol a guanidino, ktorá môže byť substituovaná substituentom, a mono-, di-, tri- alebo tetraalkylamóniovú alebo farmaceutický prijateľnú soľ, jej izoureid alebo izotioureid; symbol Rg predstavuje -CR2ioR2n-, kde zvyšky R2io a R2n sú nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, alkylaryl a heterocyklickú skupinu a ktorúkoľvek z týchto skupín substituovanú substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej Q a -(CH2)n-Q, kde n je rovné 1 až 5 a symbol Q je vybraný zo skupiny zahrnujúcej skupinu amino, amidino, imidazol a guanidino, ktorá môže byť substituovaná substituentom, a mono-, di-, tri- alebo tetraalkylamónium jej farmaceutický prijateľnej soli, izoureidu alebo tioizoureidu; zvyšok R9 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej -C(O)-, -CH2- a -CHR99-C(O)-; pričom, ak je m rovné 1, je zvyšok B vybraný zo skupiny zahrnujúcej 1 až 20 aminokyselín, -NHRí2,
-NReoRói, -OR70 a -CHR60R6i, kde zvyšok R52 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, arylalkyl, heteroarylalkyl a heteroaryl; pričom zvyšky R6o a R6i sú nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, arylalkyl, aryl, heteroarylalkyl a heteroaryl, kde zvyšok R70 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, acyl, alkyl, arylalkyl a heteroarylalkyl, pričom ak je m rovné 0, je zvyšok B vybraný zo skupiny zahrnujúcej 1 až 20 aminokyselín, -OR70, -NHR52 a -NReoRei a je napojený na Ró amidickú alebo esterovú väzbu; pričom zvyšok B môže byť substituovaný substituentom, s podmienkou, že keď R3 je -CH2- alebo -CHR99-C(O)-, potom R4 je NR50; keď R4 je -CH2-, potom R3 je -C(O)- alebo -CHR99-C(O)-; keď Re je -CH2-, potom R7 je -NHR51-; keď R7 je CH2, potom Rf, je -C(O)- alebo -CHR99-C(O)-; keď R4 je -NR50- a R( je skupina
R*
R,
tvoria R5o a R'i spoločne mostíkovú skupinu vzorca -C(O)-CHR55-, kde symbol CHR55 predstavuje R50 a karbonylová skupina predstavuje R'i, a symboly Ri a R55 nezávisle predstavujú H, Ci až Cô alkyl alebo arylalkyl; a keď R3 je -C(O)NR35-CH2-C(O)-, potom R4 je -NR50-, Ri je skupina
R35 a R'i tvoria spoločne mostíkovú skupinu vzorca -C(O)CHRs5-, kde C(O) predstavuje R'i a CHR55 predstavuje R35; symboly Ri a R55 nezávisle predstavujú H alebo Ci až C6 alkyl (viď napríklad obr. 2).
Zlúčenina podľa vynálezu môže obsahovať cyklický N-koniec tvorený zvyškom Ri, R2, R3 a prípadne R4. Takáto zlúčenina je definovaná napríklad vyššie uvedenou štruktúrou Al-A2-(A3)n-B, kde R4 je -NR50-, Ri je skupina
R’,
R”,
R50 a R'i spoločne tvoria mostíkovú skupinu vzorca -C(O)-CHR55, kde R55 je H, Ri je H alebo metyl; symboly R99 a R100 sú nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, arylalkyl, alkyl a heteroalkyl s 1 až 3 uhlíkovými atómami, pričom zvyšky R99 a Rjoo môžu byť ďalej naviazané na jednotku vybranú zo skupiny zahrnujúcej fenyl, tienyl, tiazolyl, pyridyl, naftyl, tionaftyl, indolyl alebo nasýtený alkyl, alkoxyskupinu, monoalkylaminoskupinu, dialkylaminoskupinu, tetraalkylamónium, arylalkylaminoskupinu, aminoalkylaryl, karboxy-skupinu, halogén, hydroxyskupinu, aminoskupinu, amidoskupinu, amidinoskupinu, guanidinoskupi20 nu, triazolyl a sulfonyl, a zvyšok R3 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej -C(O)- a -C(O)-NR35-CH2-C(O)-.
Ďalej môžu byť v zlúčenine A1-A2-(A3)„-B skupiny R'i a Ri substituované až šiestimi substituentami, zahrnujúcimi napríklad alkyl, a prípadne naviazanými cez skupinu, ako je -OCH2-, -SCH2-, >N-CH2-, >NC(O)-, -CO- alebo NY-CO-NZ, kde symboly Y a Z môžu predstavovať H, alkyl, arylalkyl alebo heteroaralkyl. Zvyšky R99 a Rjoo môžu byť nezávisle substituované substituentom, ako je fenyl, tienyl, tiazolyl, pyridyl, naftyl, tionaftyl alebo indolyl alebo zodpovedajúca nasýtená skupina, prípadne substituovaným až piatimi skupinami, vybranými zo skupiny zahrnujúcej alkyl, alkoxyskupinu, mono-, di- alebo trialkylamín, tetraalkylamónium, arylalkylaminoskupinu, aminoalkylaryl, karboxyskupinu, halogény, hydroxyskupinu, aminoskupinu, amid, amidinoskupinu, guanidinoskupinu, triazolyl alebo sulfonyl. Výhodná zlúčenina so substitúciami v polohe R2 je taká, kde R100 je H a R99 je jedna zo skupín
kde W v substituovanej zlúčenine môže byť napríklad halogén, hydroxyl, aminoskupina alebo amidinoskupina a J môže byť napríklad O, S alebo -NR, kde R je H alebo alkyl, aryl alebo arylalkyl.
Zlúčenina podľa vynálezu, ktorá obsahuje substituent na skupine A2 a vykazuje inhibičnú aktivitu voči faktoru Xa, môže mať napríklad substitúciu R50, R20i alebo R2o2 jedným alebo niekoľkými heteroatómovými substituentami, ako je N, O alebo S. Zvyšok R202 môže byť taktiež substituovaný substituentom vybraným zo skupín
XR kde X je C, N alebo S; R chýba alebo znamená H alebo alkyl, ktorý môže byť substituovaný heteroatómom, a n je 1 až 5.
Zlúčenina podľa vynálezu, ktorá obsahuje substituent na skupine A3 a vykazuje inhibičnú aktivitu voči faktoru Xa, môže zahrnovať napríklad substitúciu R5i jedným alebo niekoľkými substituentami, ako je H, alkyl, arylalkyl alebo heterocyklická skupina, prípadne substituovanými heteroatómom, ako je N, O alebo S. Zvyšky R2io a R2n môžu predstavovať napríklad substituent -(CH2)n-Q, kde n je asi 1 až 5 a kde Q predstavuje amino, amidino, močovinu, imidazol, guanidino, mono-, di-, tri- alebo tetraalkylimínium farmaceutický prijateľnej soli, izoureid alebo tioizoureid. Alternatívne môžu R2io alebo R2n predstavovať napríklad alkyl, aryl alebo alkylaryl. Tieto skupiny môžu byť ďalej substituované substituentom, ako je hydroxyskupina alebo Ci až C4 alkoxyskupina.
Zlúčenina podľa vynálezu môže obsahovať alternatívne usporiadanie substituentov obsahujúcich jednotku B. Takéto alternatívne usporiadanie môže zahrnovať napríklad substitúciu R52 atómom dusíka, kyslíka alebo síry alebo substitúciu Reo, Rei alebo R70 jedným alebo niekoľkými heteroatómami alebo alkylovými skupinami.
Tu uvádzané všeobecné štruktúry predstavujú rôzne zlúčeniny podľa vynálezu, ktoré si uchovávajú inhibičnú aktivitu voči faktoru Xa, poskytovanú tripeptidom YIR. Tieto štruktúry predstavujú taktiež zlúčeniny obsahujúce aminokyseliny, nevyskytujúce sa v prírode, mimetiká aminokyselín a ďalšie organické štruktúry a substituenty vykazujúce podobnú funkciu. Tieto funkčné ekvivalenty dodávajú príslušným priestorovým zoskupeniam požadovaný náboj a silu, ktoré prispievajú k účinnej inhibičnej funkcii voči faktoru Xa.
Konkrétne príklady zlúčenín podľa vynálezu zahrnujú napríklad Ac-TyrIle-Arg-Leu-Ala-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-LeuPro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3); Ac-Tyr-{ T(CH2NH) }-Ile-Arg-LeuPro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-pyridyl); Ac-Tyr-Ile-{T(CH2NH)}-ArgLeu-Pro-NH2; Ac-Tyr-Chg-Arg(NO2)-{T(CH2NH)}-Leu-NH2; Ac-Tyr-Ile-Arg{T(COCH2)}-Gly-Pro-NH2; Ac-Tyr-Ile-Dab(NY-C3H7N)-Leu-Ala-NH2; Ac-TyrIle-PalMe(3)-NH2; Tyr-Ile-Arg-NH2; D-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-(Bzl)Gly(Chx)Gly-(3-guanidopropyl)Gly-NH2; cyklo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly); Tfa(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2; Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2 a Ac-Nal(2)Chg-Arg-Leu-Pro-NH2. Ďalšie peptidy YIR podľa vynálezu sú uvedené napríklad v tabuľkách 3 a 5.
Vynález sa taktiež týka zlúčeniny so štruktúrou A1-A2-(A3)„-B, kde Ri je skupina
zvyšok R'i je vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, -CO-Ra, -SO2-Ra, aminochrániacu skupinu, 1 až 6 aminokyselín, ktoré môžu byť substituované, kde Nkoniec týchto 1 až 6 aminokyselín je substituovaný substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej H, -CO-Ra, -SO2-Ra a amino-chrániacu skupinu; pričom symbol Ra je vybraný zo skupiny zahrnujúcej alkyl, aryl a heteroalkyl; symbol Ri je vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, acyl a alkyl; X je N;-R2 je -CHR99-, kde symbol R99 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej alkyl, aryl, arylalkyl, heteroalkyl a heteroaryl, ktorý môže byť substituovaný substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej 1 až 6 skupín fluóro, chlóro, brómo, jódo, amino, nitro, amidino, amido, karboxy, ester, éter a hydroxy; R3 je -C(O)-; R4 je -NH-; R5 je 23
CHR201-, kde R2oi je alkyl, R6 je -C(0)-; R7 je -NH-; Rg je -CHR2i0-, kde R2i0 je heteroaryl s aspoň jedným formálnym kladným nábojom, kde heteroatómom je 1 až 6 dusíkových atómov; R9 je -C(O)- a zvyšok B je vybraný zo skupiny zahrnujúcej -ORb a -N-RcRd, kde symbol Rb je vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl a karboxy-chrániacu skupinu, symbol Rc je vybraný zo skupiny zahrnujúcej H a alkyl a symbol Rd je vybraný zo skupiny zahrnujúcej alkyl, heteroalkyl a 1 až 20 aminokyselín, ktoré môžu byť substituované substituentom, kde C-koniec tejto zlúčeniny môže byť modifikovaný karboxy-chrániacou skupinou, primárnou amidickou skupinou alebo časťou cyklického peptidu ako sekundárna alebo terciárna amidická skupina tvorená s aminoskupinou Ri. Takáto zlúčenina môže obsahovať jednu alebo niekoľko amino-chrániacich skupín.
Zlúčenina podľa vynálezu môže mať napríklad jednotku Al vybranú zo skupiny zahrnujúcej Tyr, F(pNH2), mAph, pAph a Nal(2), obsahujúcich 0 alebo 1 amino-chrániacu skupinu; jednotku A2 vybranú zo skupiny zahrnujúcej íle a Chg; jednotku A3 vybranú zo skupiny zahrnujúcej Arg, PalMe(3), Dab(NYC3H7N), Dap(Np-C3H7N) a Orn(N8-C3H7N); a jednotku B vybranú zo skupiny zahrnujúcej -H, -OH, -NH2, jednu až päť aminokyselín alebo ich funkčných ekvivalentov a karboxy-chrániacu skupinu. Príklady týchto zlúčenín zahrnujú AcpAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx; Bzf-pAphChg-PalMe(3)-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2; Ac-pAph-Chg-PalMe(3)NH2; cyklopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)NH2; 2-furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2; 5-Me-tienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)NH2; a Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol (viď taktiež tabuľka 5).
Vynález sa ďalej týka zlúčeniny so štruktúrou A1-A2-B, tj. Al-A2-(A3)mB, kde m je 0. V takejto zlúčenine môže B byť heteroarylalkyl, ako je (4-(Nmetylpyridínium))metyl, 2-(3-(N-metylpyridínium))et- 1-yl, l-(4-(N-metylpyridínium))-et-l-yl, (p-amidino)benzyl, 2-(4-(N-metylpyridínium))prop-2-yl a 2-(4(N-metylpyridínium))et-l-yl. Príklady týchto zlúčenín sú Ac-pAph-Chg-AMP(4) a Ac-pAph-Ghg-AEMP(4).
Voľba medzi prítomnosťou L- alebo D-aminokyseliny v zlúčenine podľa vynálezu môže závisieť sčasti na požadovaných vlastnostiach peptidu. Napríklad zabudovanie jednej alebo viac D-aminokyselín môže zlúčenine dodávať zvýšenú stabilitu in vitro alebo in vivo. Zabudovanie jednej alebo niekoľkých Daminokyselín môže taktiež zvyšovať alebo znižovať farmakologickú účinnosť tejto zlúčeniny. V niektorých prípadoch môže byť žiadúce umožniť zlúčenine zostať aktívnou iba počas krátkej doby. V takýchto prípadoch môže zabudovanie jednej alebo niekoľkých L-aminokyselín do zlúčeniny umožniť endogénnym peptidázam v organizme stráviť zlúčeninu in vivo, a tak obmedziť vystavenie organizmu pôsobeniu aktívnej zlúčeniny. Skúsený odborník je schopný stanoviť požadované vlastnosti zlúčeniny podľa vynálezu vzhľadom napríklad na vek a celkový zdravotný stav jedinca.
Zlúčeninu podľa vynálezu je možné syntetizovať chemicky napríklad s použitím automatického syntetizátora (viď príklad I). Selektívnou modifikáciou reaktívnej skupiny, ako je skupina prítomná na postrannom reťazci aminokyseliny alebo N-terminálna alebo C-terminálna reaktívna skupina peptidu, je možné dosiahnuť požadované charaktoristiky zlúčeniny podľa vynálezu, ako je zvýšená rozpustnosť alebo zvýšená inhibičná funkcia.
Ak sa používajú metódy syntézy v pevnej fáze, môže byť chemické zloženie zlúčeniny manipulované, zatiaľ čo je vznikajúci peptid napojený na živicu, alebo po odštiepení peptidu zo živice za vzniku napríklad N-terminálneho derivátu, ako je zlúčenina acetylovaná na N-konci. Podobné modifikácie je možné uskutočňovať taktiež na karboxyskupine zlúčeniny včítane C-terminálnej karboxyskupiny, ktorá môže byť napríklad amidovaná. Odborník môže taktiež syntetizovať peptid YIR podľa vynálezu s použitím organickej chémie v roztokovej fáze. Syntetizovanú zlúčeninu je možné čistiť s použitím známych metód, ako je vysokoúčinná kvapalinová chromatografia s obrátenými fázami (RP-HPLC; viď príklad I) alebo iné separačné metódy založené napríklad na veľkosti, náboji alebo hydrofobicite zlúčeniny. Podobne je možné použiť známe metódy, ako je se25 kvenčná analýza aminokyselín alebo hmotnostná spektrometria (MS), pre charakterizovanie štruktúry zlúčeniny podľa vynálezu (viď príklad I).
Peptidy YIR podľa vynálezu môžu byť lineárne alebo cyklické (viď napríklad ďalej tabuľka 3). Cyklizáciu je možné uskutočňovať vytvorením mostíka medzi dvoma nesusednými zvyškami, jednotkami alebo substituentami, ktoré môžu byť vnútri alebo mimo jednotky YIR. Cyklizáciu je možné taktiež uskutočňovať napríklad vytvorením mostíka medzi jedným zo zvyškov v jednotke YIR a nesusedným zvyškom, jednotkou alebo substituentom mimo sekvencie YIR. Peptidy alebo peptidomimetiká môžu byť napríklad cyklizované prostredníctvom väzieb S-S, -CH2-S-, -CH2-O-CH2-, laktámových alebo esterových, ako už bolo opísané (viď Hrubý, Life Sci. 31:189-199 (1982); Toniolo, Int. J. Pept. Proí. Res. 35:287-300 (1990); Kates a ď., Tetr. Letí. 34:1549-1552 (1993); všetky tieto publikácie sú tu zahrnuté ako odkaz).
Výraz „mimo jednotky YIR“ tu znamená nezahrnujúci tyrozinový, izoleucínový alebo arginínový zvyšok sekvencie YIR alebo jeho ekvivalent prítomný v peptide YIR podľa vynálezu. Naproti tomu výraz „vnútri jednotky YIR“ znamená zahrnujúci aspoň jeden zvyšok zo sekvencie tyrozínu, izoleucínu a arginínu YIR alebo jeho ekvivalent. Výraz „mostík“, vzťahujúci sa na cyklickú zlúčeninu, znamená väzbu vytvorenú medzi dvoma nesusednými aminokyselinami prítomnými v peptide YIR podľa vynálezu.
Cyklizáciu je možné uskutočňovať vytvorením napríklad disulfídickej väzby alebo laktámovej väzby medzi Xi a X2. Zvyšky schopné vytvárať disulfidickú väzbu zahrnujú napríklad Cys, Pen, Mpr a Mpp a ich ekvivalenty obsahujúce 2-amino-skupinu. Zvyšky schopné tvoriť laktámový mostík zahrnujú napríklad Asp, Glu, Lys, Orn, kyselinu α,β-diamino-propionovú, kyselinu a-aminoadipovú, kyselinu α,γ-diamino-maslovú, kyselinu diaminooctovú, kyselinu aminobenzoovú a kyselinu merkaptobenzoovú. Zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť cyklizované napríklad cez laktámovú väzbu, ktorá môže využiť skupinu postranného reťazca jedného nesusedného zvyšku na vytvorenie kovalentnej väzby k N-terminálnej aminoskupine X! alebo Y. Alternatívne mostíkové Štruktúry môžu byť tiež použité pre cyklizáciu zlúčenín podľa vynálezu včítane napríklad peptidov a peptidomimetík, ktoré môžu byť cyklizované prostredníctvom väzieb S-S, -CH2S-, -CH2-O-CH2-, laktámových, esterových alebo iných (viď napríklad vyššie Hrubý, 1982, Toniolo, 1990 a Kates a ď„ 1993).
Prípravok podľa vynálezu môže mať homogénne zloženie alebo môže mať formu zmesi zlúčenín obsahujúcich rôzne kombinácie substituentov. Flexibilita, ktorú dovoľuje výber substituentov, umožňuje značnú kontrolu nad fyzikálnochemickými vlastnosťami analógov peptidických zlúčenín. Výber substituenta ovplyvňuje taktiež väzbovú afinitu zlúčeniny (viď príklady).
Rôzne zlúčeniny obsahujúce rôzne usporiadanie substituentov vykazujú rôznu úroveň inhibičnej aktivity voči faktoru Xa. Tieto zlúčeniny boli syntetizované postupmi, opísanými v príkladoch. Testovanie zlúčenín na inhibičnú aktivitu bolo uskutočňované pomocou testov opísaných v príkladoch XXXVII a XXXVIII. S použitím týchto metód môže skúsený odborník syntetizovať zlúčeniny podľa vynálezu včítane ich modifikácií a stanoviť inhibičnú aktivitu zlúčeniny voči faktoru Xa.
Vynález poskytuje zlúčeniny, ktoré špecificky inhibujú aktivitu faktora Xa. Tieto zlúčeniny majú pre aktivitu faktora Xa hodnotu K; < 100 μΜ, prednostne Kí < 2 nM, a oproti inhibícii faktora Xa v podstate neinhibujú aktivitu iných proteáz zúčastňujúcich sa koagulácie a fibrinolýzy (viď vyššie tabuľka 2). Medzi tieto ďalšie proteázy patrí napríklad trombín a plazmín. Špecificita zlúčenín podľa vynálezu je demonštrovaná ďalej v príklade XXXVII (viď taktiež vyššie tabuľka 2).
Zlúčenina podľa vynálezu môže byť výhodne používaná ako antikoagulant, ktorý je možné uvádzať do styku s krvnou vzorkou pre zamedzenie koagulácie. Napríklad je možné účinné množstvo zlúčeniny podľa vynálezu uviesť do styku s čerstvo odobranou krvnou vzorkou, aby sa zabránilo jej koagulácii. Výraz „účinné množstvo“ vo vzťahu ku zlúčenine podľa vynálezu znamená množstvo zlúčeniny, ktoré inhibuje aktivitu faktora Xa. Skúsenému odborníkovi je známe, že účinné množstvo zlúčeniny podľa vynálezu je možné stanoviť pomocou metód tu opísaných (viď príklady XXXVII a XXXVIII) alebo inak známych. Z hľadiska opisovanej použiteľnosti zlúčeniny podľa vynálezu je skúsenému odborníkovi taktiež zrejmé, že zlúčeninou podľa vynálezu je možné nahradiť prostriedok, ako je heparín. Takéto použitie zlúčeniny podľa vynálezu môže napríklad viesť k úspore nákladov v porovnaní s inými antikoagulantami.
Zlúčenina podľa vynálezu môže byť ďalej podávaná jedincovi pri ošetrovaní rôznych klinických stavov, zahrnujúcich napríklad liečbu kardiovaskulárnej poruchy alebo komplikácií spojených napríklad s infekciou alebo chirurgickým zákrokom. Príklady kardiovaskulárnych porúch sú restenóza po angioplastii, syndróm respiračnej tiesne u dospelých, zlyhanie viac orgánov, mŕtvica a rozptýlené upchávanie ciev intravaskulárnou koaguláciou. Príklady príbuzných komplikácií spojených s chirurgickým zákrokom zahrnujú napríklad trombózu hlbokých a proximálnych žíl, ku ktorej môže dochádzať po chirurgickom zákroku. Zlúčenina podľa vynálezu je teda použiteľná ako liečivo na zníženie alebo inhibíciu nežiadúcej koagulácie u jedinca.
Keďže peptid YIR podľa vynálezu môže inhibovať aktivitu faktora Xa, môže byť táto zlúčenina použiteľná na znižovanie alebo inhibíciu zrážania krvi u jedinca. Výraz „jedinec“ tu zahrnuje stavovce včítane cicavcov, ako je človek, u ktorých sa faktor Xa zúčastňuje zrážacej kaskády.
Zrážanie krvi u jedinca môže byť znížené alebo inhibované podávaním terapeuticky účinného množstva peptidu YIR podľa vynálezu. Výraz „terapeuticky účinné množstvo“ tu znamená dávku peptidu YIR, ktorá musí byť jedincovi podávaná, aby došlo k inhibícii aktivity faktora Xa. Konkrétnejšie, terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podľa vynálezu inhibuje katalytickú aktivitu faktora Xa buď priamo vnútri protrombinázového komplexu alebo ako rozpustná podjednotka, alebo nepriamo inhibiciou zabudovávania faktora Xa do protrombinázového komplexu. Tieto zlúčeniny môžu konkrétne inhibovať aktivitu faktora Xa s hodnotou Kí < 100 μΜ, prednostne Kj < 2 nM. Terapeuticky účinné množstvo je možné stanoviť pomocou metód opísaných napríklad v príkladoch XXXVII a XXXVIII alebo inak známych.
Pri praktickom uskutočňovaní terapeutickej metódy podľa vynálezu závisí konkrétne dávkovanie za účelom získania terapeuticky účinného množstvo farmaceutického prípravku podávaného jedincovi na rôznych úvahách, zahrnujúcich napríklad povahu a intenzitu onemocnenia, rozvrh podávania a vek a telesné charakteristiky jedinca. Príslušné dávkovanie je možné stanoviť pomocou známych klinických prístupov. Vynález sa teda týka spôsobu špecifickej inhibície aktivity faktora Xa uvedením faktora Xa do styku so zlúčeninou obsahujúcou sekvenciu X1-YIR-X2 alebo Al-A2-(A3)m-B, kde m je 0 alebo 1, alebo s jej funkčným ekvivalentom. Ďalej sa vynález týka spôsobu znižovania alebo inhibície tvorby krvnej zrazeniny u jedinca podávaním terapeuticky účinného množstva zlúčeniny podľa vynálezu.
Zlúčenina podľa vynálezu sa všeobe.cne jedincovi podáva ako prípravok obsahujúci zlúčeninu a farmaceutický prijateľný nosič. Výraz „farmaceutický prijateľný nosič“ sa vzťahuje na médium alebo prípravok, ktorý je pre jedinca netoxický alebo má prijateľnú toxicitu podľa stanovení poverenou agentúrou. Tu výraz farmaceutický prijateľný nosič zahrnuje ktorýkoľvek zo štandardných farmaceutických nosičov, ako je fosfátom pufrovaný salinický roztok, voda, emulzia, napríklad olej vo vode alebo voda v oleji, alebo ktorýkoľvek z rôznych typov zmáčacích prostriedkov. Vhodné farmaceutické nosiče a ich formulácie sú opísané v Martin, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15. vyd., (Mack Pub29 lishing Čo., Easton 1975), ktorá publikácia je tu zahrnutá ako odkaz. Tieto prípravky všeobecne obsahujú terapeuticky účinné množstvo zlúčeniny podľa vynálezu spolu s vhodným množstvom nosiča tak, aby zahrnovali príslušnú dávku pre podávanie jedincovi. Nárokované zlúčeniny teda môžu byť použiteľné ako liečivá pre inhibíciu aktivity faktora Xa a zrážanie krvi u jedinca.
Farmaceutický prijateľné nosiče môžu taktiež zahrnovať ďalšie médiá, zlúčeniny alebo modifikácie zlúčeniny inhibujúcej faktor Xa, ktoré zvyšujú jej farmakologické pôsobenie. Farmaceutický prijateľné médium môže napríklad obsahovať adičnú soľ s kyselinou, napríklad soľ vytvorenú s anorganickou kyselinou, ako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina fosforečná, kyselina sírová alebo kyselina chloristá, alebo s organickou kyselinou, ako je kyselina octová, kyselina šťavelová, kyselina maleínová, kyselina jablčná, kyselina vínna, kyselina citrónová, kyselina jantárová alebo kyselina malónová. Ďalšie farmaceutický prijateľné soli zahrnujú napríklad anorganický nitrát, sulfát, acetát, malát, formiát, laktát, tartrát, sukcinát, citrát, p-toluénsulfonát a pod., včítane, bez toho, aby sa na ne obmedzovali, katiónov na báze alkalických kovov a kovov alkalických zemin, ako je sodík, lítium, draslík, vápnik alebo horčík, a taktiež netoxické amónne, kvartérne amónne a amínové katióny, ako je amónium, metylamónium, dimetylamónium, trimetylamónium, tetrametylamónium, etylamónium, trietylamónium a tetraetylamónium.
Príklady modifikácií, ktoré zvyšujú farmakologické pôsobenie zlúčeniny, zahrnujú napríklad esterifikáciu, ako je tvorba Ci až Ce alkylesterov, prednostne Ci až C4 alkylesterov, kde alkylová skupina má priamy alebo rozvetvený reťazec. Ďalšie prijateľné estery zahrnujú napríklad C5 až C7 cykloalkylestery a arylalkylestery, ako sú benzylestery. Tieto estery môžu byť pripravované zo zlúčenín podľa vynálezu bežnými metódami, známymi v odbore chémie peptidov.
Farmaceutický prijateľné modifikácie môžu ďalej zahrnovať napríklad tvorbu amidov peptidov. Takéto amidické modifikácie, ktoré môžu byť uskutoč30 ňované na zlúčeninách podľa vynálezu, zahrnujú napríklad modifikácie odvodené od amoniaku, primárnych Ci až C6 dialkylamínov, kde alkylové skupiny majú priamy alebo rozvetvený reťazec, alebo arylamínov s rôznymi substitúciami. V prípade sekundárnych amínov môže mať amín taktiež formu 5- alebo 6členného heterocyklu obsahujúceho napríklad dusíkový atóm. Spôsoby prípravy takýchto amidov sú známe.
V inom uskutočnení vynálezu môže byť peptid YIR použitý pri teste na identifikáciu prítomnosti faktora Xa alebo na izoláciu faktora Xa vo v podstate čistej forme. Prednostne sa zlúčenina podľa vynálezu značí napríklad rádioizotopom a značená zlúčenina sa deteguje rutinnými metódami, používanými pre detekciu konkrétnej značky. Ďalej môže byť peptid YIR výhodne použitý ako sonda na detekciu umiestnenia alebo veľkosti aktivity faktora Xa in vivo, in vitro alebo ex vivo.
Je pochopitelné, že do rozsahu vynálezu spadajú modifikácie, ktoré podstatne neovplyvňujú aktivitu rôznych uskutočnení vynálezu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Vynález je bližšie opísaný v súvislosti s pripojenými výkresmi, ktoré predstavujú:
obr. 1 schematický diagram koagulačnej kaskády krvi, obr. 2 príklad štruktúry zlúčeniny podľa vynálezu a obr. 3 schéma syntézy pre prípravu niektorých zlúčenín podľa vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Vynález je osvetlený na príkladoch uskutočnenia, ktoré ho však neobmedzujú.
Príklad 1
Postupy syntézy peptidov
Východiskové látky, použité pri syntéze, boli získané od obchodníkov s chemikáliami, ako je Aldrich, Sigma, Fluka, Nová Biochem a Advance Chetech. Počas syntézy týchto zlúčenín boli funkčné skupiny použitých derivátov aminokyselín chránené blokujúcimi skupinami, aby sa zabránilo vedľajším reakciám počas kondenzačných stupňov. Príklady vhodných chrániacich skupín a ich použitie je opísané v The Pepíides, viď vyššie, 1991, a vo zv. 9 Udenfried a Meienhofer, ed., 1987, tu zahrnuté ako odkaz.
Na získanie zlúčenín podľa vynálezu bola použitá všeobecná syntéza peptidov v pevnej fáze. Tieto metódy sú opísané napríklad v Steward a Young, Solid Phase Pepiide Synthesis (Freeman and Čo., San Francisco, 1969), ktorá publikácia je tu zahrnutá ako odkaz.
Ak nie je uvedené inak, boli peptidy syntetizované na polystyrénovej živici sieťovanej 1 % divinylbenzénu. K pevnému nosiču bol naviazaný linker citlivý na kyseliny (Rink Linker; Rink, Tetr. Lett. 28:3787 (1987); Sieber, Tetr. Lett. 28:2107 (1987), ktoré publikácie sú tu zahrnuté ako odkaz). Kondenzácia sa uskutočňovala s použitím Ν,Ν’-diizo-propylkarbodiimidu (DIC) v prítomnosti ekvivalentného množstva HOBt. Všetky kondenzácie sa uskutočňovali buď v Ν,Ν-dimetylformamide (DMF) alebo v zmesi DMF - dichlórmetán (1:1) počas doby 40 min pri teplote miestnosti. Dokončenie kondenzácie bolo monitorované ninhydrínovým testom.
Odštiepenie skupiny Fmoc bolo uskutočňované s použitím 50% piperidínu v DMF počas doby 10 min. Množstvo uvoľneného Fmoc bolo stanovené z absorbancie roztoku po odštiepení chrániacej skupiny pri 300 nm, objeme premývacích roztokov a hmotnosti živice použitej pri syntéze. Druhá (dvojitá) kondenzácia bola uskutočnená, pokiaľ bola kondenzácia v prvom prípade neúplná. Pri každej kondenzáciii bol použitý tento cyklus:
stupeň pôsobenie g peptidu na živicu
2,4násobný prebytok derivátu aminokyseliny 2,4 ekvivalentu 2,4 ekvivalentu kondenzácia počas doby 40 min premývanie (3x8 ml) ninhydrínový test sňatie chrániacich skupín (10 min) piperidín/DMF premývanie (6x8 ml) premývanie (2x8 ml) ninhydrínový test opakovanie od stupňa 2 činidlo a rozpúšťadlo ml DMF
DIC
HOBt
DMF ml 50%
DMF dichlórmetán (DCM)
Po dokončení syntézy peptidu na nosiči bolo uskutočnené konečné odštiepenie Fmoc s nasledujúcimi normálnymi premývacími cyklami a stanovením množstva uvoľnených skupín Fmoc. V niektorých prípadoch bol N“-nechránený peptid acetylovaný trepaním živice s 20násobným prebytkom zmesi acetanhydridu a pyridínu (1:1) v DCM počas doby 15 min. Živica potom bola premývaná postupne s DCM, DMF a DCM a potom sušená vo vákuu.
Živica s naviazaným peptidom bola suspendovaná v zmesi činidla K (King a d’., Iní. J. Pept. Prot. Res. 36:255-266 (1990), ktorá publikácia je tu zahrnutá ako odkaz) (5 ml/g živice s peptidom) počas doby 180 min pri teplote miestnosti, potom bola zmes po odštiepení prefiltrovaná v bezvodom dietyléteri a pevná zrazenina bola izolovaná odstredením a vysušená vo vákuu nad pevnými granulami KOH. Vysušený peptid bol podrobený čisteniu pomocou HPLC s použitím príslušného gradientu 0,1% TFA vo vode a acetonitrile (ACN). Po zhromaždení piku obsahujúceho požadovaný syntetický produkt bol roztok peptidu lyofílizovaný a peptid bol podrobený procesu identifikácie, ktorý zahrnoval elektrosprejovú MS a analýzu aminokyselín, za účelem potvrdenia, že bola syntetizovaná správna zlúčenina.
Pre čistenie peptidu bola vzorka surového lyofilizovaného peptidu rozpustená v zmesi 0,1% vodnej TFA s obsahom 10 až 50 % ACN. Roztok peptidu bol obvykle prefiltrovaný cez injekčnú striekačku napojenú na nylonový filter „ACRODISC“ 13 0,45 μιη (Gelman Sciences; Ann Arbor, MI). Príslušný objem prefiltrovaného roztoku peptidu bol nastreknutý na semipreparatívnu kolónu 08 (Vydac Protein and Peptide 08, 218TP1010; The Separation Group; Hesperia, CA). Prietok gradientu alebo izokratickej zmesi 0,1% TFA pufru a ACN (Čistota pre HPLC) ako eluentu bol udržovaný pomocou Beckmanovho „SYSTEM G0LD“ HPLC. Elúcia peptidu bola monitorovaná detekciou UV pri 230 nm (Beckman, System Gold, programovateľný modul rozpúšťadla 126 a programovateľný detekčný modul 166, riadený softwarom „SYSTEM GOLD“). Po identifikácii piku zodpovedajúceho syntetizovanej zlúčenine pomocou MS bola zlúčenina zhromaždená, lyofilizovaná a biologicky testovaná. MS bola uskutočnená pomocou zariadenia SCIEX API III+. Ďalej bola uskutočnená NMR s použitím zariadenia General Electric (300 MHz). Pri NMR boli vzorky typicky merané v hexadeuterodimetylsulfoxide alebo deuterochloroforme (CDC13; Aldrich).
Aldehydy aminokyselín boli pripravené pomocou známych metód. Aldehydy aminokyselín a peptidov sú opisované napríklad vo Fehrentz a Castro, Syn34 thesis 676 (1983);, Bajusz a ď., J. Med. Chem. 33:1729 (1990); Kawamura a ď., Chem. Pharm. Bull. 17:1902 (1969) a Someno a ď., Chem. Pharm. Bull. 34:1748 (1986), ktoré publikácie sú tu všetky zahrnuté ako odkaz. Syntéza redukovaných peptidických väzieb bola uskutočňovaná na úrovni dipeptidu v roztoku (napríklad Tyr-{T(CH2NH))-Ile), potom bol príslušne chránený dipeptid kondenzovaný so zvyškom peptidu na živici syntézou v pevnej fáze. Alternatívne bol aldehyd chránenej aminokyseliny kondenzovaný s peptidom na živici s použitím metód opísaných v Ho a d’., Pept. Res. 6:10-12 (1993) a v tam citovaných odkazoch, ktoré sú tu všetky zahrnuté ako odkaz.
Príklad 2
Syntéza Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NHj
Pre syntézu Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2 vyššie opísaným spôsobom bol použitý 1 g živice Rink (0,6 mmól NH2/g živice). Výsledný peptid bol analyzovaný pomocou MS. (M + H)+ vypočítané 659,9, nájdené 659,4.
Príklad 3
Syntéza Ac-Tyr-IIe-Arg-Leu-Pro-NH2
Pre syntézu Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2 spôsobom opísaným v príklade I bol použitý 1 g živice Rink (0,6 mmól NH2/g živice). Výsledný peptid mal (M + H)+ vypočítané 685,9, nájdené 685,4.
Príklad 4
Syntéza Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2
Bol použitý 1 g živice Rink (0,6 mmól NH2/g živice). Bola použitá vyššie opísaná všeobecná syntéza v pevnej fáze. Po sňatí chrániacej skupiny z Tyr a príslušnom premytí živice bolo pridaných 50 ekvivalentov izobutyraldehydu v DMF s obsahom 2 % ľadovej kyseliny octovewj. Vzniknutá zmes bola trepaná 4 h pri teplote miestnosti. Po premytí živice DMF s obsahom 2 % kyseliny octovej (2x8 ml) bol pridaný 1 g NaBH3CN v 10 ml DMF s obsahom 2 % kyseliny octovej. Živica bola 30 min trepaná, potom bola prefiltrovaná a bola pridaná čerstvá zmes NaBH3CN v zmesi DMF/kyselina octová a v reakcii sa pokračovalo ešte 30 min.
v
Živica s peptidom potom bola premytá DMF/2 % kyseliny octovej (2x8 ml) a DMF (2x8 ml). Vzniknutý monoalkylovaný peptid na živici bol acetylovaný zmesou acetanhydridu a trietylamínu v DMF (30 ekvivalentov, 6 h). Po riadnom premytí živice bol peptid postupom podľa príkladu I odštiepený a boli sňaté chrániace skupiny. Peptid čistený HPLC bol analyzovaný pomocou MS. (M + H)+ vypočítané 758,5, nájdené 758,4.
Príklad 5
Syntéza Tfa-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2
Rovnaký postup ako v príklade IV bol použitý pre prípravu živice (iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-Rink. Konečná trifluóracetylácia bola uskutočňovaná pôsobením 0,7 M trifluóracetanhydridu v prítomnosti diizopropyletylamínu (DIEA) a N-metylimidazolu (NMI) (1:3:0,3 ekv.) počas doby 45 min. Odštiepenie peptidu zo živice a izolácia peptidu sa uskutočňovala podľa príkladu IV.
Čistený peptid bol identifikovaný pomocou MS. (M + H)+ vypočítané 812,5, nájdené 812,4.
Príklad 6
Syntéza Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3)
Syntéza Boc-Arg(NY-Tos)-N(CH3)O(CH3) bola uskutočnená postupom opísaným v literatúre (viď vyššie Fehrentz a Castro, 1983). Boc-Arg(NY-Tos)N(CH3)O(CH3) (200 mg) bol zmiešaný pri teplote miestnosti s 5 ml kyseliny trifluóroctovej (TFA) a miešaný 20 min. Vymiznutie východiskovej látky bolo monitorované tenkovrstvovou chromatografiou (TLC) s použitím zmesi CHCl3:MeOH:CH3COOH (90:9:1) a vizualizované ninhydrínovým postrekom a osvetlením UV. Odparením zostávajúcej TFA vo vákuu a vysušením vo vákuu nad granulami KOH bola získaná pevná látka so správnou hmotnosťou. (M + H)+ vypočítané 371,4, nájdené 371,2.
V jednej banke bolo 150 mg vyššie pripravenej látky rozpustené v 1 ml DMF, potom bolo pridané 57 μΐ trietylamínu a zmes bola ochladená na 0 °C. V druhej banke bolo 171 mg Z-Tyr-Ile-OH (Biochem Bioscience Inc.; Philadelphia, PA) rozpustené v bezvodom tetrahydrofuráne a ochladené na -10 °C, potom bolo pridané 44 μΐ NNM a 52 μΐ izobutylchlórformiátu pod N2 a zmes bola miešaná 15 min. Vopred pripravený roztok Arg(Tos)N(CH3)OCH3 v DMF bol pridaný ku zmiešanému anhydridu dipeptidu Z-Tyr-Ile-OH a zmes bola miešaná počas doby 30 min pri -10 °C a potom cez noc pri teplote miestnosti.
Po spracovaní reakčnej zmesi spôsobom opísaným v príklade I bol peptid sušený vo vákuu a malý podiel bol prečistený pomocou HPLC a analyzovaný pomocou MS; peptid mal očakávanú molekulovú hmotnosť (781). Výsledný pep37 tid Z-Tyr-Ile-Arg(Tos)-N(CH3)OCH3 bol zmiešaný s 500 μΐ anizolu a podrobený sňatiu chrániacich skupín pomocou HF obvyklým spôsobom. Po spracovaní bolo izolované 169 mg produktu Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3) a identifikované pomocou MS (vypočítané 494, nájdené 493,6). Zostávajúci peptid potom bol rozpustený v 1 ml 1 N HC1 a lyofilizovaný.
Tyr-Ile-Arg-N(CH3)OCH3.2HC1 (76 mg) bol rozpustený v ACN, ochladený na 0 °C a bolo pridané 13 μΐ pyridínu a potom 15 μΐ acetanhydridu. Zmes bola miešaná 3 h pri 0 °C a dokončenie reakcie bolo monitorované ninhydrínovým testom. Po 8 h miešaní pri teplote miestnosti bola reakčná zmes spracovaná a produkt Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)OCH3 bol charakterizovaný pomocou MS (vypočítané 535,3, nájdené 535,6).
Príklad 7
Syntéza Ac-Tyr-{T(CH2NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2
a) Syntéza Fmoc-Tyr(But)-H
4,6 g (10,0 mmól) Fmoc-Tyr(But)-OH, 2,1 g (10,1 mmól) dicyklohexylkarbodiimidu (DCC), 1,26 g (10,1 mmól) benzylmerkaptánu a 0,12 g DMAP bolo podrobené reakcii v DCM spôsobom opísaným v Ho a Ngu (J. Org. Chem. 58:2315 (1993), ktorá publikácia je tu zahrnutá ako odkaz). Po spracovaní bol izolovaný Fmoc-Tyr(But)-S-CH2CíH5 a po redukcii tioesteru miešaním s trietylsilánom v prítomnosti 10% Pd na uhlí a prečistení veľmi rýchlou chromatografiou bol získaný Fmoc-Tyr(But)-H vo výťažku 81 %. NMR a hmotnostné spektrum produktu bolo v súlade s očakávaným rozmedzím.
b) Syntéza Fmoc-Tyr(But)-{T(CH2NH)}-Ile-(O-allyl)
0,73 g (1,66 mmól) Fmoc-Tyr(But)-OH a 0,209 g (3,32 mmól) NaBH3CN v 20 ml 1% AcOH v DMF bolo pridané k roztoku 0,516 g (1,82 mmól) TFA.Ile(O-alyl) v 2 ml DMF. Po 2 h bola reakčná zmes spracovaná a konečný produkt bol prečistený veľmi rýchlou chromatografiou (etylacetát-hexán 35:65) na olejovitý produkt s príslušnými hodnotami NMR a MS. (M + H) vypočítané 598,7, nájdené 599.
c) Syntéza Fmoc-Tyr(But)-{T(CH2NH)}-Ile-OH
K 0,467 g (0,78 mmól) Fmoc-Tyr(But)-{T(CH2NH)}-Ile-O-alyl v 10 ml DCM bolo pridané 89 μΐ (1,56 mmól) HOAc, 20 μΐ trietylamínu (TEA) a 0,02 g komplexu PdCl2(Ph3)2. Bolo pridané naraz 231 μΐ (0,86 nmól) Bu3SnH a zmes bola miešaná 1 h pri teplote miestnosti. Po príslušnom spracovaní reakčnej zmesi bol produkt prečistený veľmi rýchlou chromatografiou (CHCl2-MeOH 20:1) a poskytol očakávaný peptid vo výťažku 69 % (0,319 g). (M + H+) vypočítané 558, nájdené 559. Fmoc-Tyr(But)-{'P(CH2NH)}-Ile-OH potom bol všeobecnou metódou syntézy v pevnej fáze, uvedenou v príklade I, kondenzovaný so živicou Arg(Pmc)-Leu-Pro-Rink. Dokončený peptid na živici Ac-Tyr(But){Ψ((ΖΗ2ΝΗ)}-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Pro-Rink bol obvyklým spôsobom podrobený sňatiu chrániacich skupín a odštiepeniu od živice, ako je uvedené v príklade I, a prečistený pomocou HPLC na kolóne 08.
Príklad 8
Syntéza Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-pyridyl)
Oxímová živica (DeGrado a Kaiser, J. Org. Chem. 45:1295 (1980) (0,862 g, 0,6 mmól/g) bola kondenzovaná cez noc s Boc-Arg(Tos)-OH v prítomnosti DIC/HOBt. Živica bola premytá DMF, potom DCM a acetylovaná zmesou ace39 tanhydrid/DIEA (1:1 ekv.) v DCM. Po premytí živice DCM, DMF a DCM bola sňatá chrániaca skupina pôsobením 25% TFA v DCM počas doby 30 min. Živica potom bola premytá DCM, izopropanolom a DCM. S TFA. Arg(Tos)-OxmR bol kondenzovaný Boc-Ile-OH vo forme symetrického anhydridu (3 ekv.) v prítomnosti 1,5 ekv. DIEA v DCM. Bol opakovaný vyššie opísaný cyklus premývania, acetylácie a snímania chrániacej skupiny. Po sňatí chrániacej skupiny bol podobným spôsobom ako íle naviazaný Boc-Tyr(2-BrZ)-OH, potom bola z dokončeného peptidu Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-OxmR sňatá chrániaca skupina a peptid bol acetylovaný na Ac-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-OxmR. Peptid naviazaný na živicu bol sušený vo vákuu a poskytol celkový výťažok 0,216 g.
K 1/3 živice bolo pridané 100 μΐ (800 gmól) 4-(dimetylamino)pyridínu v prítomnosti 60 μΐ ľadovej kyseliny octovej a 120 μΐ DIEA v 6 ml DCM. Živica bola trepaná cez noc pri teplote miestnosti. Po prefiltrovaní roztoku DCM bola živica premytá 3 ml DMF a filtráty boli spojené s filtrátom DCM. Po odparení rozpúšťadla bol zostávajúci peptid zbavený chrániacich skupín pôsobením HF/anizol a spracovaný obvyklým spôsobom na očakávaný peptid. Bola uskutočnená elektrosprejová MS. (M + H)+ vypočítané 582, nájdené 582,3.
Príklad 9
Syntéza Ac-Tyr-Ile-{T(CH2NH)}-Arg-Leu-Pro-NH2
a) Syntéza Boc-Ile-H
Aldehyd bol syntetizovaný z 1 g Boc-Ile-N(Me)OMe postupom ako v práci Fehrentz a Castro (viď vyššie, 1983). Tento aldehyd bol identifikovaný pomocou TLC a NMR postupom opísaným v tejto literatúre.
b) Syntéza Arg(Tos)-Leu-Pro-MBHa
Syntéza tripeptidu na živicu bola uskutočnená všeobecným prístupom v pevnej fáze, opísaným v príklade I.
c) Syntéza Boc-Ile-{Ψ((ΖΗ2ΝΗ)}-Arg(Tos)-Leu-Pro-MBHA
Boc-Ile-H bol kondenzovaný s naviazaným tripeptidom Arg(Tos)-Leu-ProMBHA reduktívnou amináciou s použitím NaBH3CN v DMF s obsahom 1 % kyseliny octovej. Skupina Boe bola odštiepená obvyklým spôsobom ä Ac-Tyr-OH bol naviazaný pomocou DIC/HOBt. Konečný naviazaný peptid (0,7 g) bol podrobený sňatiu chrániacich skupín a odštiepený od živice s použitím zmesi HF/tioanizol. 19 mg surového Ac-Tyr-Ile-{VF(CH2NH)}-Arg-Leu-Pro-NH2 bolo prečistené pomocou HPLC na kolóne 08 a bolo získané asi 5 mg očakávaného peptidu s čistotou viac než 90 %. (M + H+) vypočítané 687,9, nájdené 688,4.
Príklad 10
Syntéza Ac-Tyr-Ile-Dab(NY-C3H7N)-Leu-Ala-NH2
0,2 g SCAL-TG (Ó,2 mmól NH2/g) (Patek & Lebl, Tetr. Lett. 32:38913894 (1991), ktorá publikácia je tu zahrnutá ako odkaz) bolo kondenzované s Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Dab(Boc)-OH, Fmoc-Ile-OH a Fmoc-Tyr(But)-OH spôsobom opísaným v príklade I. Po acetylácii N-konca a sňatí chrániacich skupín z postranných reťazcov pomocou TFA bol naviazaný peptid AcTyr-Ile-Dab-Leu-Ala-SCAL-TG premytý, neutralizovaný a podrobený pôsobeniu 0,3 M PyBroP/NMI v DMF počas doby 2 h. Dokončený peptid bol odštiepený od živice s použitím IM trifenylfosfinu/(CH3)3SiCl v DCM (3 x 1 h) a potom 100% TFA (1 h). Po izolácii surového peptidu vyzrážaním dietyléterom bol peptid lyofilizovaný z 0,1% vodného roztoku TFA. Peptid Ac-Tyr-Ile-Dab(NT-C3H7N)Leu-Ala-NH2 bol prečistený pomocou HPLC a charakterizovaný pomocou MS. (M + H+) vypočítané 676,4, nájdené 676,4.
Príklad 11
Syntéza Ac-Tyr-Ile-PallVIe(3)-NHi
K 1,0 g živice Rink (0,48 mmól NH2/g) bolo spôsobom opísaným v príklade I naviazané Fmoc-Pal(3)-OH, Fmoc-Ile-OH a Fmoc-Tyr(But)-OH. K 0,25 g dokončeného naviazaného peptidu Fmoc-Tyr(But)-Ile-Pal(3)-Rink bolo pridané 500 μΐ metyljodidu (Mel) v DCM a živica s naviazaným peptidom bola trepaná 6 h. Z dokončeného peptidu Fmoc-Tyr(But)-Ile-PalMe(3)-Rink boli sňaté chrániace skupiny a bola uskutočnená acetylácia a odštiepenie ako v príklade I. Časť surového peptidu bola prečistená pomocou HPLC a konečný peptid bol charakterizovaný pomocou MS.
Príklad 12
Syntéza Ac-cykIo(Glu-Tyr-Ile-Arg-Leu-Lys)-NH2 g SCAL-TG (0,29 mmól NH2/g) (viď príklad X) bol metódami opísanými v príklade I kondenzovaný s Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Leu-OH, FmocArg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Tyr(But)-OH a Fmoc-Glu(OtBu)-OH. Po odštiepení Fmoc bol peptid na živici acetylovaný a premytý DMF a potom DCM. Z naviazaného peptidu Ac-Glu(OtBu)-Tyr(But)-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Lys(Boc)SCAL-TG boli s použitím činidla K sňaté chrániace skupiny, peptid bol neutralizovaný a cyklizovaný s použitím BOP/HOBt/DIEA (5:5:5 ekv.) v DMF počas doby 2 h. Dokončenie kondenzácie bolo monitorované ninhydrínovým testom, ako popisuje Kaiser (Kaiser a ď., Anál. Biochem. 34:595 (1970), ktorá publikácia je tu zahrnutá ako odkaz). Po cyklizácii bol peptid odštiepený zo živice, prečistený pomocou HPLC a charakterizovaný pomocou MS. (M + H)+ vypočítané 844,5, nájdené 844,5.
Príklad 13
Syntéza cyklo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly) g oxímovej živice (viď príklad VIII) (0,6 mmól NH2/g) bol cez noc kondenzovaný s Boc-Gly-OH v prítomnosti DIC/HOBt. Po premytí živice a sňatí chrániacej skupiny boli metódami opísanými v príklade VIII naviazané BocArg(Tos)-OH, Boc-Ile-OH a Boc-Tyr(2-BrZ)-OH. Z jednej tretiny naviazaného peptidu Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-Gly-oximová živica bola sňatá chrániaca skupina a bol kondenzovaný s Boc-Gly pomocou DIC/HOBt. Z dokončeného naviazaného peptidu bola sňatá chrániaca skupina, bol neutralizovaný a cyklizovaný cez noc v DMF s obsahom 1 % kyseliny octovej. Živica bola prefíltrovaná a premytá (DMF), filtráty boli spojené a organické rozpúšťadlo bolo odparené vo vákuu. Zo zostávajúceho peptidu boli sňaté chrániace skupiny (HF/anizol), bol lyofilizovaný, prečistený pomocou HPLC a charakterizovaný pomocou MS. (M + H)* vypočítané 547,8, nájdené 547,8.
Príklad 14
Syntéza N-substituovaných glycínových zlúčenín: syntéza Ac-(Bzl)Gly(Chx)Gly-(3-guanidopropyI)GIy-NH2
Pre syntézu N-substituovaných glycínov bol použitý postup podľa Zuckermanna a ď., (7. Am. Chem. Soc. 114.10646 (1992), ktorá publikácia je tu zahrnutá ako odkaz). 1 g SCAL-TG (0,29 mmól NH2/g) (viď príklad X) bol kondenzovaný v DCM/DMF s kyselinou brómoctovou cez symetrický anhydrid. Každá kondenzačná reakcia bola dvakrát opakovaná. K živici Br-CH2CO-SCAL-TG bol pridaný Boc-NH-CH2CH2CH2NH2 v DMSO a živica bola počas doby 2 h trepaná. Po sňatí chrániacej skupiny bol postup opakovaný, pričom bola striedaná kondenzácia Br-CH2COOH so živicou a reakcia živice s naviazanou kyselinou brómoctovou s príslušným amínom. Živica (Bzl)Gly-(Chx)Gly-(Boc43
NH(CH2)3)Gly-SCAL-TG bola acetylovaná cez noc zmesou acetanhydrid/DIEA/NMI (1:1:0,25) v DMF. Po sňatí skupiny Boe bola živica Ac-(Bzl)Gly(Chx)Gly-(3-aminopropyl)Gly-SCAL-TG podrobená pôsobeniu 1,8M karboxyamidinopyrazol.HCl (Bernatowicz a d’., J. Org. Chem. 57:2497-2502 (1992), ktorá publikácia je tu zahrnutá ako odkaz) v prítomnosti DIEA (1:1) v DMF pri teplote miestnosti počas doby 3 h. Dokončenie guanylácie bolo monitorované Kaiserovým testom. Odštiepenie a spracovanie vzniknutého peptidu bolo uskutočnené ako v príklade X a analýza bola uskutočnená pomocou MS. (M + H)+ vypočítané 502,3, nájdené 502,3.
Príklad 15
Syntéza diketopiperazínových zlúčenín: syntéza cyk!o(Ser-Ida)-Ile-Arg-LeuAla-NH2
Východiskový chránený tetrapeptid Fmoc-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Ala-Rink bol pripravený stratégiou Fmoc na živicu Rink (viď príklad I). Po sňatí Fmoc z naviazaného peptidu bola uskutočnená kondenzácia postupne s FmocIda(OMe)-OH (3 ekv., DIC, HOBt) a Fmoc-Ser(tBu)-OH (7 ekv., symetrický anhydrid). Konečné sňatie chrániacej skupiny a spontánne uzatvorenie kruhu bolo uskutočnené súčasne vystavením pôsobeniu 50% piperidínu/DMF počas doby 1 h. Po premývacích stupňoch bol konečný peptid odštiepený a chrániace skupiny sňaté pomocou TFA/tioanizol/H2O (95:2,5:2,5). Vzniknutý peptid bol spracovaný vyššie uvedeným spôsobom a analyzovaný pomocou HPLC (> 95 %) a MS. (M + H)+ vypočítané 655,38, nájdené 655,4.
Príklad 16
Syntéza Ph-C(NOCH2Ph)-CO-I-R-NH2
0,2 g živice Rink bolo kondenzované s Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH a bola sňatá skupina Fmoc (viď príklad I). K naviazanému peptidu Ile-Arg(Pmc)Rink bola pomocou vyššie opísaného postupu s DIC/HOBt naviazaná PhC(N0CH2Ph)-C00H. Dokončený naviazaný peptid Ph-C(NOCH2Ph)-CO-IleArg(Pmc)-Rink bol spracovaný ako v príklade I a analyzovaný pomocou MS. (M + H)+ vypočítané 524,6, nájdené 524,3.
Príklad 17
Syntéza Ac-pAph-IIe-Arg-Leu-Pro-NH2
Syntéza bola uskutočňovaná na 100 mg živice Rink (0,48 mmól/g) spôsobom podľa príkladu I s použitím týchto derivátov aminokyselín: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Arg(Pmc)-OH, Fmoc-Ile-OH a Fmoc-pAph(Fmoc)-OH (racemická zmes). Pri odštiepovaní a izolácii peptidu so postupovalo ako v príklade I. Oba diastereomérne peptidy boli izolované pomocou RP-HPLC a identifikované pomocou MS. (M + H)+ vypočítané 754,5, nájdené 754,4.
Príklad 18
Syntéza Ac-Tyr-Chg-Arg-olu
Peptidická sekvencia bola vybudovaná na 0,25 g živice Fmoc-Arg(Pmc)Sasrin (0,5 mmól NH2/g živice; Bachem Bioscience) spôsobom opísaným v príklade I. Po sňatí N-terminálnej skupiny Fmoc a acetylácii bol chránený peptid odštiepený od živice redukčným štiepením ako C-terminálny alkohol (Mergler a d’., Peptides str. 177-178 (ed. Schneider a Eberle, Leiden 1993), zahrnuté tu ako odkaz). Živica s naviazaným peptidom bola 24 h trepaná s roztokom NaBH4 (4 ekv.) v 2 ml THF:EtOH (6:1). Po reakcii odštiepenia bola živica premytá DCM a roztoky použité na odštiepenie a na premývanie boli spojené a lyofilizované. Z lyofilizovaného peptidu boli sňaté chrániace skupiny pôsobením TFA/voda/tioanizol (90:5:5) počas doby 2 h a peptid bol izolovaný vyzrážaním. Peptid prečistený pomocou HPLC bol analyzovaný s použitím MS. (M + H)+ vypočítané 505,3, nájdené 505,3.
Príklad 19
Syntéza Ac-Tyr-Chg-Arg-ol.acetátu
Chránený peptidalkohol bol pripravený postupom podľa príkladu XVIII. 10 mg surového materiálu bolo rozpustené v DCM/ACN a podrobené pôsobeniu acetanhydridu (2 mmól) v prítomnosti TEA (2,4 mmól) počas doby 20 min. Roztok bol prefiltrovaný, odparený a z peptidu boli vyššie uvedeným spôsobom sňaté chrániace skupiny. Peptid prečistený HPLC bol analyzovaný pomocou MS. (M + H)+ vypočítané 547,3, nájdené 547,3.
Príklad 20
Syntéza Ac-Phe(pNH2)-Chg-Orn(C(NH)CH3)-Leu-Pro-NH2 g živice „TENTAGEL S“ NH2 (0,28 mmól NH2/g živice; Rapp Polymér, Tubingen, Nemecko) bol funkcionalizovaný linkerom SCAL postupom opísaným v príklade X a boli naviazané tieto aminokyseliny: Fmoc-Pro-OH, Fmoc-LeuOH, Fmoc-Orn(Boc)-OH a Fmoc-Chg-OH. Naviazaný peptid Fmoc-Chg46
Orn(Boc)-Leu-Pro-SCAL-TG bol podrobený pôsobeniu 50% TFA v DCM (1 premytie počas doby 1 mín, potom 1 premytie počas doby 30 min), premytý trikrát DCM, neutralizovaný 5% DIEA v DCM (2 x 30 s) a 2 x DCM. K naviazanému peptidu bol pridaný roztok 1,5 g etylacetimidáthydrochloridu (Aldrich) v 4 ml zmesi pyridín:DIEA 1:1 a 3 ml DMF a v kondenzácii sa pokračovalo cez noc pri teplote miestnosti.
Z naviazaného peptidu Fmoc-Chg-Orn(C(NH)CH3)-Leu-Pro-SCAL-TG bola chrániaca skupina odstránená pôsobením 20% piperidínu v DMF počas doby 12 min, bol premytý 4 x DMF, 4 x DCM a kondenzovaný s Fmoc-Phe(pNHBOC)-OH pomocou DIC/HOBt v DMF. Odstránením Fmoc a acetyláciou zmesou acetanhydrid-pyridín (1:1) počas doby 20 min sa získal naviazaný peptid AcPhe(pNH-BOC)-Chg-Orn(C(NH)CH3)-Leu-Pro-SCAL-TG. Redukciou linkeru SCAL a odštiepením peptidu a nasledujúcim prečistením surového produktu pomocou HPLC bola získaná očakávaná zlúčenina. (M + H)+ vypočítané 740,48, nájdené 740,2.
Príklad 21
Syntéza Ac-Phe(pNH2)-Chg-Dap(Np-C6H,,N)-Leu-Pro-NH2
0,5 g SCAL-TG (0,32 mmól NH2/g) bolo kondenzované s Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Dap(Boc)-OH a Fmoc-Chg-OH. Skupina Boe z postranného reťazca bola sňatá pôsobením 50% TFA počas doby 20 min a peptid naviazaný na živicu bol neutralizovaný premytím 10% DIEA/DCM. Voľná aminoskupina postranného reťazca bola premenená pôsobením 0,3 M PyBroP/NMI v DMF počas doby 20 min na dimetylamidíniovú skupinu. Odstránením skupiny Fmoc pôsobením 50% piperidínu/DMF počas doby 60 min došlo k výmene dimetylamidíniovej skupiny v postrannom reťazci Dap skupinou piperidíniovou. Sekvencia bola dokončená kondenzáciou s Fmoc-Phe(Boc)-OH a sňatím skupiny Fmoc. Peptid bol acetylovaný a odštiepený ako v príklade X. Peptid prečistený pomocou HPLC bol analyzovaný pomocou MS. (M + H)+ vypočítané 752,4, nájdené 752,4.
Príklad 22
Syntéza Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
Racemický H-Phe(pCN)-OH bol syntetizovaný acetamido-malonátovou metódou (Wagner a d’., patent NDR č. 155954, vydaný 21.7.1982, podrobený znovu prieskumu 9.1 1.1988, ktorý je tu zahrnutý ako odkaz). Racemický AcpAph-OH bol syntetizovaný konverziou kyánoskupiny amonolýzou zodpovedajúceho metyltioimidátu (vznikajúceho reakciou kyánoskupiny so sírovodíkom) a následnou metyláciou pomocou Mel.
Pre syntézu peptidu bol použitý 1 g živice „TENTAGEL“ (substitúcia 0,21 mmól NH2/g živice) a linker Knorr (Bernatowicz a d’., Tetr. Letí. 30:4645 (1989), ktorá publikácia je tu zahrnutá ako odkaz). Dipeptid Fmoc-Chg-PalKnorr-TG bol zostavený ako je uvedené v príklade I. Potom bol 3-pyridylalanín metylovaný pôsobením 1 ml Mel v DCM cez noc. Po odstránení Fmoc bol metódou DIC/HOBt naviazaný Ac-pAph-OH a peptid bol spracovaný ako v príklade I. (M + H)+ vypočítané 550,31, nájdené 550,3.
Príklad 23
Syntéza Ac-Tyr-Chg-pAph-Leu-Pro-NH2
Pentapeptid Ac-Tyr(But)-Chg-Phe(pCN)-Leu-Pro-Knorr-TG bol zostavený na 0,4 g „TENTAGEL“ (substitúcia 0,2 mmól NH2/g živice) spôsobom uvedeným v príklade I. Živica bola cez noc vystavená v uzatvorenej injekčnej striekačke pôsobeniu 8 ml zmesi pyridín/trietylamín (75:25) nasýtenej H2S. Tioamid naviazaný na živicu bol metylovaný pôsobením 0,5 ml Mel v 8 ml acetónu počas doby 30 min pri 50 °C a potom premytý acetónom a metanolom. Metyltioimid bol podrobený reakcii s octanom amónnym v metanole počas doby 3 h pri 55 °C za vzniku konečnej zlúčeniny, ktorá bola od živice odštiepená a prečistená vyššie opísaným spôsobom. (M + H)+ vypočítané 760,43, nájdené 761,4.
Príklad 24
Syntéza Ac-Phe(pCH2NH2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
Ac-DL-Phe(pCN)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2 (surový peptid) bol syntetizovaný na 1 g živice Rink (0,6 mmól NH2/g živice) spôsobom uvedeným v príklade I. 125 mg surového peptidu bolo rozpustené v 50 ml MeOH a bolo pridané 0,5 ml suspenzie Raneyovho niklu (Aldrich). Zmes peptidu a katalyzátora bola hydrogenovaná pri 35 psi počas doby 4 h pri teplote miestnosti. Katalyzátor bol odfiltrovaný a roztok bol odparený do sucha. Zvyšok bol lyofílizovaný z 0,1% vodnej TFA obsahujúcej 30 % ACN. Vysušený surový produkt bol prečistený pomocou HPLC a analyzovaný pomocou MS. (M + H)+ vypočítané 741,7, nájdené 741,4.
Príklad 25
Syntéza Ac-Phe(pC(NOH)NH2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
21,1 mg surového peptidu, pripraveného spôsobom uvedeným v príklade XXIV, bolo zmiešané s 60,3 mg NH2OH.HC1 (Aldrich) v 1,5 ml MeOH, 0,7 ml pyridínu a 0,5 ml TEA. Zmes bola miešaná 72 h pri teplote miestnosti, potom bolo vo vákuu odparené rozpúšťadlo a prchavý podiel. Peptid bol prečistený pomocou HPLC a analyzovaný pomocou MS. (M + H) vypočítané 770,3, nájdené 770,4.
Príklad 26
Syntéza zlúčenín A1-A2-B
Zlúčeniny A1-A2-B, tj. zlúčeniny Al-A2-(A3)m-B, kde m je 0, boli pripravené podľa schémy znázornenej na obr. 3. Stručne povedané, kondenzáciou racemického N-acetyl-4-kyánofenylalanínu s metylesterom L-cyklohexylglycínu (H-Chg-OMe) bola získaná zmes dvoch diastereomérnych dipeptidov, ktoré boli rozdelené chromatografiou. Racemický N-acetyl-4-kyánofenylalanín bol čiastočne rozštiepený vytvorením soli s L-cyklohexylglycínmetylesterom. Menej rozpustná D,L-soľ bola ľahko vykryštalizovaná a následnou kondenzáciou sa získal Ac-f(pCN)-Chg-OMe vo v podstate čistej forme. „Matečný lúh“ bol obohatený o L,L-soľ a kondenzáciou sa získal surový Ac-F(pCN)-Chg-OMe, ktorý bol ďalej čistený chromatografiou na silikagéli. Tieto dipeptidestery boli hydrolyzované na zodpovedajúce kyseliny s použitím hydroxidu lítneho v zmesi metanol/voda pri teplote miestnosti. Obe dipeptidické kyseliny boli prevedené na substituované amidy konvenčnou kondenzáciou s príslušnými amínmi RNH2. Amíny, ktoré neboli komerčne dostupné, boli pripravené štandardnými chemickými metódami.
Premena kyánoskupín na zodpovedajúce amidíny bola uskutočnená s použitím štandardných chemických metód buď cez tioamid a metyltioimidát alebo hydrogenáciou zodpovedajúceho amidoxímu (príklad XXV). Posledne uvedená zlúčenina bola získaná reakciou nitrilu s hydroxylamínom. Ďalej uvedené príklady osvetľujú prípravu titulných zlúčenín týmito vybranými metódami. Je však samozrejmé, že zlúčeniny podľa vynálezu môžu byť pripravené rôznymi inými metódami a tu vybrané postupy boli zvolené ako vyhovujúce.
Príklad 27
Syntéza Ac-pAph-Chg-NHCH2-(4-metylpyridínium)
Syntéza Ac-pAph-Chg-NHCH2-(4-metylpyridínium) bola uskutočnená premenou Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2-(4-pyridyl) metódami opísanými v príklade XXII. Konečná zlúčenina bola prečistená pomocou HPLC spôsobom opísaným v príklade I. Analýza MS: (M + H)+ vypočítané 493,29, nájdené 493,3.
Východisková látka bola pripravená takto:
a) 2,32 g (10 mmól) Ac-(D,L)-F(pCN) bolo za zahrievania rozpustené v 75 ml etanolu. Bol pridaný L-cyklohexylglycín-metylester (1,75 g, 10 mmól) a zmes bola miešaná 2 h pri teplote miestnosti. Vyzrážané kryštály boli odfiltrované a vysušené na 1,55 g D,L-soli. Filtrát bol čiastočne odparený a zriedený éterom. Vypadnuté kryštály boli zhromaždené a vysušené a bolo získané 2,1 g L,Lsoli kontaminovanej D,L-soľou. Surová L,L-soľ bola spojená s 20 ml DMF, 0,71 g HOBt a 1,18 g DCC. Zmes bola miešaná 24 h pri teplote miestnosti. Močovina bola odfiltrovaná a filtrát bol odparený. Zvyšok bol rozpustený v metylénchloride a roztok bol premytý IN HC1 a nasýteným vodným roztokom bikarbonátu sodného. Organická vrstva bola vysušená a odparená. Zvyšok bol chromatografovaný na 60 g silikagélu s elúciou 20% acetónom (v/v) v metylénchloride. Kryštalizáciou spojených čistých frakcií zo zmesi metylénchlorid/éter/hexán bolo získané 1,6 g Ac-F(pCN)-Chg-OMe ako bezfarebné kryštály s teplotou topenia 178-180 °C.
b) Zmes 1,93 g (5 mmóí) Ac-F(pCN)-Chg-OMe (z vyššie uvedeného príkladu XXVII.a), 100 ml metanolu, 10 ml vody a 0,75 g hydrátu hydroxidu lxtneho bola miešaná 24 h pri teplote miestnosti pod dusíkom. Po prídavku 2 ml kyseliny octovej boli odparené rozpúšťadlá a zvyšok bo, rozdelený medzi metylénchlorid s obsahom 20 % izopropanolu a IN HC1. Organická vrstva bola vysušená a odparená a zvyšok bol prekryštalizovaný zo zmesi metylénchlorid/éter/hexán, čím poskytol 1,6 g Ac-F(pCN)-Chg-OH ako bezfarebné kryštály s teplotou topenia 216-218 °C.
c) Zmes 150 mg (0,4 mmól) Ac-F(pCN)-Chg-OH (viď vyššie), 65 mg (0,6 mmól) 4-aminometylpyridínu, 124 mg (0,6 mmól) DCC, 60 mg (0,44 mmól) HOBt a 5 ml DMF bola miešaná 20 h pri teplote miestnosti. Močovina bola odfiltrovaná a filtrát bol odparený. Zvyšok bol suspendovaný v metanole a nerozpustný produkt bol odfiltrovaný a poskytol 140 mg bezfarebného Ac-F(pCN)Chg-NHCH2(4-pyridyl). Analytická vzorka bola získaná chromatografíou na silikagéli s použitím zmesi acetón/-metylénchlorid/metanol (4:5:1). Kryštalická pevná látka mala teplotu topenia nad 250 °C.
Príklad 28
Ac-f(4-amidino)-Chg-NHCH2(4-metylpyridínium)
Táto zlúčenina bola pripravená reakciou 150 mg Ac-f(pCN)-ChgNHCH2(4-pyridyl) (viď vyššie) so sírovodíkom, potom s metyljodidom a octanom amónnym, produkt bol izolovaný pomocou HPLC ako homogénna látka. Analýza MS: (M + H)+ vypočítané 493,29, nájdené 493,3.
Východisková látka bola pripravená takto:
a) Zmes 2,8 g Ac-f(pCN), (L)-cyklohexylglycínmetyl-esteru, 940 mg HOBt, 1,57 g DCC a 30 ml DMF bola miešaná 2 dni pri teplote miestnosti. Močovina bola odstránená filtráciou a fíltrát bol odparený. Zvyšok bol rozpustený v metylénchloride a roztok bol premytý IN HC1 a 10% vodným roztokom uhličitanu sodného. Organická fáza bola vysušená a odparená. Kryštalizáciou zvyšku zo zmesi metylén-chlorid/éter/hexán sa získalo 2,05 g bezfarebného Ac-f(pCN)Chg-OMe s teplotou topenia 181-183 °C.
b) Hydrolýza 1,93 g Ac-f(pCN)-Chg-OMe (viď vyššie) s 0,75 g monohydrátu hydroxidu lítneho v 100 ml metanolu a 10 ml vody bola uskutočnená spôsobom opísaným pre L,L-izomér vyššie v príklade XXVII a kryštalizáciou zo zmesi metylén-chlorid/éter bolo získané 1,65 g Ac-f(pCN)-Chg-OH s teplotou topenia 180-182 °C.
c) Zmes 225 mg Ac-f(pCN)-Chg-OH (viď vyššie), 100 mg 4aminometylpyridínu, 90 mg HOBt, 180 mg DCC a 6 ml DMF bola miešaná cez víkend pri teplote miestnosti. Močovina bola odfiltrovaná a filtrát bol odparený. Zvyšok bol miešaný s metanolom a pevný podiel bol odfiltrovaný, čím sa získalo 190 mg kryštalického Ac-f(pCN)-Chg-NHCH2(4-pyridyl) s teplotou topenia nad 250 °C.
Príklad 29
Ac-pAph-Chg-NHCH2CH2(3-metyIpyridínium)
Zmes 125 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2CH2(3-pyridyl), 2 ml DMSO, 10 ml pyridínu a 5 ml trietylamínu bola za chladenia zmesou ľad/voda sýtená sírovodíkom. Potom, čo bola cez noc miešaná pri teplote miestnosti v uzatvorenej lie53 kovke, boli odparené rozpúšťadlá a zvyšok bol získaný pomocou zmesi acetón/éter a vysušením sa získalo 125 mg tioamidu. Táto látka bola spojená s 2 ml DMSO, 5 ml acetónu a 0,75 metyljodidu a zmes bola miešaná v uzatvorenej liekovke cez noc pri teplote miestnosti. Po zriedení toluénom boli odparené rozpúšťadlá a zvyšok bol rozmiešaný s éterom. Éter bol dekantovaný, nahradený čerstvým éterom a v miešaní sa pokračovalo do stuhnutia živičnatého materiálu, načo bol zostávajúci éter odfiltrovaný a zvyšok vysušený.
Získaný zvyšok bol rozpustený v 20 ml metanolu a bolo pridané 0,3 ml kyseliny octovej a 0,4 g octanu amónneho. Zmes bola zahrievaná 2,5 h na 55 až 60 °C a potom boli odparené rozpúšťadlá. Zvyšok bol rozpustený v zmesi voda/ACN/TFA a lyofilizovaný. Surový produkt bol prečistený pomocou HPLC. Analýza MS: (M + H)+ vypočítané 507,31, nájdené 507,3.
Východisková látka bola získaná takto: Zmes 150 mg (0,4 mmól) AcF(pCN)-Chg-OH, 120 mg (0,6 mmól) 2-(3-pyridyl)etylamín-dihydrochloridu, 125 mg DCC, 60 mg HOBt, 0,5 ml diizopropyletylamínu a 10 ml DMF bola miešaná 24 h pri teplote miestnosti. Po odparení. rozpúšťadla bol zvyšok rozmiešaný s metanolom a nerozpustný produkt bol zhromaždený filtráciou a premytý metanolom a éterom, čím sa získalo 110 mg bezfarebných kryštálov. Filtrát bol odparený a zvyšok bol rozpustený v zmesi metylénchlorid/izopropanol. Tento roztok bol premytý 10% vodným roztokom uhličitanu sodného, vysušený a odparený. Zvyšok bol chromatografovaný na 14 g silikagélu s použitím zmesi metylénchlorid/acetón/metanol (5:4:1) a bolo získané 40 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2CH2(3pyridyl) s teplotou topenia 265-268 °C.
b) 2-(3-Pyridyl)etylamíndihydrochlorid bol pripravený týmto spôsobom: Zmes 1,3 g 3-pyridylacetonitrilu, približne 3 g Raneyovho niklu a 30 ml metanolu s obsahom 10 % objemových amoniaku bola hydrogenovaná pri 35 psi počas doby 20 h s použitím Parrovho hydrogenátora. Katalyzátor bol odfiltrovaný cez celit a filtrát bol odparený. Zvyšok bol rozpustený v metylénchloride, roztok vysušený pomocou síranu horečnatého, prefiltrovaný a odparený. Produkt bol prevedený na dihydrochlorid s použitím chlorovodíka v dioxáne. Kryštalizáciou zo zmesi metanol/éter sa získalo 1,4 g bezfarebných kryštálov s teplotou topenia 145-148 °C.
Príklad 30
Ac-pAph-Chg-NHCH2-CH2(4-metylpyridínium)
Táto zlúčenina bola pripravená vyššie opísanými metódami reakciou AcF(pCN)-Chg-NHCH2CH2(4-pyridyl) so sírovodíkom s následnou metyláciou metyljodidom a reakciou s octanom amónnym. Surový produkt bol prečistený pomocou HPLC. Analýza MS: (M + H)+ vypočítané 507,31, nájdené 507,3.
Východisková látka bola získaná kondenzáciou Ac-F(pCN)-Chg-OH s 2(4-pyridyl)etylamíndihydrochloridom spôsobom uvedeným vyššie v príklade XXIX.
2-(4-pyridyl)etylamíndihydrochlorid bol pripravený spôsobom opísaným vyššie pre 2-(3-pyridyl)etylamíndihydrochlorid hydrogenáciou pyridyl-4acetonitrilu na Raneyovom nikle v prítomnosti amoniaku. Dihydrochlorid mal teplotu topenia 220 °C.
Príklad 3 1
Ac-pAph-Chg-NHCH2(4-amidÍnofenyl)
Táto zlúčenina bola pripravená podobnými metódami ako vyššie pôsobením sírovodíka v DMSO, pyridínu a trietylamínu na Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(4kyánofenyl). Získaný bis-tioamid bol metylovaný metyljodidom v DMSO/acetón a potom podrobený reakcii s octanom amónnym, ako je uvedené vyššie. Surový produkt bol prečistený pomocou HPLC. Analýza MS: (M + H)+ vypočítané 520,30, nájdené 520,3.
Východisková látka bola získaná týmto spôsobom: Zmes 75 mg (0,2 mmól) Ac-F(pCN)-Chg-OH, 50 mg (0,3 mmól) (4-kyánofenyl)-metylamínhydrochloridu, 62 mg DCC, 30 mg HOBt, 0,2 ml DIEA a 2 ml DMF bola miešaná 24 h pri teplote miestnosti. Po prefiltrovaní bolo odparené rozpúšťadlo a zvyšok bol rozpustený v metylénchloride s obsahom 20 % izopropanolu. Roztok bol premytý IN HCl a 10% vodným roztokom uhličitanu sodného, potom vysušený a odparený. Zvyšok bol rozmiešaný s malým množstvom zmesi metanol/voda a zhromaždením a vysušením vypadnutého pevného podielu bolo získané 80 mg Ac-F(pCN)-ChgNHCH2(4-kyánofenyl).
(4-Kyánofenyl)metylamínhydrochlorid bol pripravený týmto spôsobom: Zmes 2 g (10 mmól) a-bróm-p-tolunitrilu, 2 g (10,8 mmól) ftalimidu draselného a 30 ml DMF bola zahrievaná 1 min k refluxu. Po ochladení bola zmes okyslená kyselinou octovou a zriedená vodou pre vykryštalizovanie produktu. Kryštály boli odfiltrované, premyté vodou a vysušením sa získalo 2,24 g bezfarebného N(4-kyánofenyl)metylftalimidu s teplotou topenia 182-184 °C.
1,5 g N-(4-kyánofenyl)metylftalimidu bolo suspendované v 50 ml vrúceho metanolu a podrobené pôsobeniu 1 ml hydrazínhydrátu. Po 5 min vznikol číry roztok. Metanol bol odparený a ku zvyšku bola pridaná 2N HCl. Suspenzia bola zahriata k varu a potom ochladená na ľade. Pevný podiel bol odfiltrovaný a filtrát odparený. Zvyšok bol rozpustený ve vode. Roztok bol znovu zahriaty k varu, ochladený a prefiltrovaný. Filtrát bol zalkalizovaný hydroxidom sodným a extrahovaný metylénchloridom s obsahom izopropanolu. Organická fáza bola vysušená a odparená a zvyšok bol prevedený na hydrochlorid, vykryštalizovaný zo zmesi izopropanol/éter a poskytol 0,43 g bezfarebných kryštálov s teplotou topenia nad 260 °C.
(3-Kyánofenyl)metylamínhydrochlorid bol pripravený reakciou a-bróm-mtolunitrilu s ftalimidom draselným za vzniku N-(3-kyánofenyl)metylftalimidu s teplotou topenia 147-148 °C. Reakciou tejto látky s hydrazínhydrátom a prevedením na hydrochlorid vyššie uvedeným spôsobom bol získaný (3kyánofenyl)metylamín s teplotou topenia 223-226 °C.
Príklad 32
Ac-pAph-Chg-NHCH2(3-amidinofenyI)
Táto zlúčenina bola pripravená vyššie opísanými metódami. K Ac-F(pCN)Chg-NHCH2(3-kyánofenyl) bol pridaný sírovodík v DMSO, pyridín a trietylamín. Získaný bis-tioamid bol metylovaný metyljodidom v DMSO/acetóne a potom podrobený vyššie opísaným spôsobom reakcii s octanom amónnym. Surový produkt bol prečistený pomocou HPLC. Analýza MS: (M + H)+ vypočítané 520,30, nájdené 520,3.
Východisková látka bola získaná týmto spôsobom: Zmes 300 mg (0.8 mmól) Ac-F(pCN)-Chg-OH, 200 mg (1,2 mmól) (3-kyánofenyl)metylamínhydrochloridu, 250 mg DCC, 120 mg HOBt, 0,8 ml DIEA a 10 ml DMF bola miešaná 24 h pri teplote miestnosti. Po prefiltrovaní bolo odparené rozpúšťadlo a zvyšok bol rozpustený vo veľkom objeme metylénchloridu s obsahom 20 % izopropanolu. Roztok bol premytý IN HC1 a 10% vodným roztokom uhličitanu sodného, vysušený a odparený. Zvyšok bol rozmiešaný so zmesou izopropanol/éter a zhromaždením a vysušením vypadnutého pevného podielu bolo získané 400 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(3-kyánofenyl).
Príklad 33
Ac-pAph-Chg-NHCH(Me)(4-metylpyridínium)
Zmes diastereomérov titulnej zlúčeniny bola pripravená reakciou zmesi dvoch diastereomérnych Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-pyridyl) so sírovodíkom, potom s Mel a octanom amónnym. Diastereoméry boli rozdelené pomocou HPLC. Analýza MS: (M + H)+ vypočítané 507,31, nájdené 507,3.
Východisková látka bola pripravená týmto spôsobom: Zmes 150 mg (0,4 mmól) Ac-F(pCN)-Chg-OH, 120 mg (0,6 mmól) racemického l-(4pyridyl)etylamíndihydrochloridu, 125 mg DCC, 60 mg HOBt, 0,5 ml DIEA a 10 ml DMF bola miešaná 24 h pri teplote miestnosti. Po prefiltrovaní bolo odparené rozpúšťadlo a zvyšok bol rozpustený vo veľkom objeme metylénchloridu s obsahom 20 % izopropanolu. Roztok bol premytý 10% vodným roztokom uhličitanu sodného, vysušený a odparený. Zvyšok bol rozmiešaný so zmesou izopropanol/éter a vypadnutý pevný podiel bol zhromaždený a vysušený, čím sa získalo 125 mg Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-pyridyl) ako zmes dvoch diastereomérov.
Racemický l-(4-pyridyl)etylamíndihydrochlorid bol pripravený týmto spôsobom: Zmes 1 g 4-acetylpyridín-N-oxidu, 2 g Raneyovho niklu a 30 ml metanolu s obsahem 20 % amoniaku (v/v) bola hydrogenovaná 24 h pri 30 psi. Ka58 talyzátor bol odstránený filtráciou cez celit a fíltrát bol odparený. Zvyšok bol rozpustený v metylénchloride, roztok prefiltrovaný a odparený. Zvyšok bol rozpustený v izopropanole a podrobený pôsobeniu chlorovodíka v éteri. Vyzrážané kryštály boli zhromaždené a vysušené, čím sa získalo 0,9 g látky s teplotou topenia 198-200 °C.
Príklad 34
Syntéza DIPA(m)pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
a) Syntéza Ν,Ν-diizopropylamidu (p-kyánobenzyl)malónovej kyseliny (DIPA(m)Phe(pCN))-OH
Syntéza 2-(p-kyánobenzyl)malónovej kyseliny bola uskutočnená modifikovaným postupom (viď Pinori a ď., patent US 506191 1 (október 1991), ktorý je tu zahrnutý ako odkaz). K roztoku 3,8 g 2,2-dimetyl-l,3-dioxán-4,6-diónu (Meldrumova kyselina; Aldrich) a 1,12 g NaCNBH3 (Aldrich) v 25 ml DMF bolo pridané 2,3 g p-kyánobenzylaldehydu (Aldrich) a zmes bola miešaná 2 h pri teplote miestnosti. K reakčnej zmesi bolo pridané 400 ml vody a roztok bol chladený na vodnom kúpeli a jeho pH upravované na 3,8 až 4 prikvapkávaním 20% vodného roztoku HC1. Biela zrazenina bola oddelená na Buchnerovom lieviku zo sintrovaného skla a premytá chladnou vodou. Zhromaždená zrazenina bola 24 h sušená vo vákuu nad CaCl2. NMR zhromaždenej pevnej látky v CDC13 ukázalo na zlúčeninu 2,2-dimetyl-5-(p-kyáno)benzyl-1,3-dioxán-4,6-dión (DCBD), ktorá má teplotu topenia 135-142 °C a Rf 0,45 (CHCl3-MeOH-kyselina octová 95:4:1).
K 1,5 ml diizopropylamínu v 45 ml DCM boli pridané 3 ml N,Obis(trimetylsilyl)acetamidu (BSA) a roztok bol refluxovaný 7 h v reakčnej banke vybavenej magnetickým miešadlom a chladičom chráneným trubičkou CaCl2. Po ochladení roztoku na teplotu miestnosti bolo pridané 0,8 g DCBD a reakčná zmes bola refluxovaná 3 h (do dokončenia konverzie produktu podľa TLC). Po ochladení reakčnej zmesi bolo opatrne pridané 5 až 8 ml 20% vodného roztoku HC1. Po oddelení vrstiev bola organická vrstva premytá vodou, vysušená (MgSO4) a odparená do sucha na čistý produkt, ktorý bol použitý bez ďalšieho čistenia v ďalšom stupni. Identifikácia zlúčenín bola uskutočnená s použitím NMR v CDC13 a MS.
b) Syntéza DIPA(m)pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2
Peptid na živici DIPA(m)Phe(pCN)-Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink bol syntetizovaný spôsobom opísaným v príklade I. Vzniknutý naviazaný peptid bol podrobený pôsobeniu hydroxylamínhydrochloridu spôsobom opísaným v príklade XXV a bol získaný DIPA(m)Phe(pC(NOH)NH2)-Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink. Po odštiepení peptidu zo živice a lyofilizácii bol surový produkt (120 mg) rozpustený v 80 ml MeOH a 10 ml nasýteného roztoku NH3 v MeOH. K reakčnej zmesi bolo pridané 0,25 ml suspenzie Raneyovho niklu (Aldrich) a zmes bola hydrogenovaná 24 h pri 45 psi. Bol odfiltrovaný katalyzátor, rozpúšťadlo odparené do sucha a zvyšok bol lyofilizovaný z roztoku 1:1 0,1% vodného roztoku TFA a ACN. Surový peptid bol prečistený pomocou HPLC a zlúčenina bola identifikovaná pomocou MS. (M + H)+ vypočítané 824,5, nájdené 824,2.
Príklad 35
Zlúčeniny s niekoľkými substitúciami, ktoré boli syntetizované a účinne inhibovali faktor Xa
č. zlúčenina WDOČÍt. (naj.)
1. Ac- (2-CFjBzl) -Y-I-R-L-P-NH2 860,5 (860,3)
2. Ac- (CH3CH2CH2CH (CH3) CH2) -Yi-r-l-p-nh2 786,5 (786,5)
3. ch3oco-y-i-r-l-p-nh2 742,4 (742,4)
4 . Ac-Y-Chg-R-NH2 518,2 (518,2)
5. Nal(2)-Cha-R-D(O-Allyl)-NH2 679,4 (679,4)
6. y-Tle-R-Nle-P-NH2 660,4 (660,4)
7. Phe (pF·)-I-R-L-P-NH 662,3 (662,3)
8. Ac-(D)Tie(OH)-I-R-L-P-NH2 714,4 (714,4)
9. Ac-Phe(pCN)-I-R-L-P-NH, 711,4 (711,4)
10. Ac-Phe'(pCONH2) -Chg-R-L-P-NH2 755,4 (755,4)
11. y-Chg-R-NH2 476,2 (476,2)
12. Ac-W-Chg-R-L-P-NH2 751,3 (751,3)
13. Ac-Y-I-R-NH-CH (CH3) - (CH2) 2-CH3 562,3 (562,3)
14. Ac-Y-Pgl-R-L-P-NH2 722,2 (722,2)
15. Ac-Y-Chg-R-Ina-NH2 629,4 (629,4)
16. Ac-Tza-Chg-R-NH2 509,3 (509,3)
17. Ac-Y-Chg-R-Pip-NH2 629,4 (629,4)
18. Ac-Phe(pNH2) -Chg-R-NH2 517,2 (517,2)
19. Ac-(Bzl)G-(Chx)Gly(3-guanidxnopropyl)G-NH2 502,3 (502,3)
20. Ac-Y-Chg-R-ol.acetát 547,3 (547,3)
21. Ac-Y-Chg-R-OCH3 533,3 (533,3)
22. Ac-i’-Chg-R-OH 519,3 (519,3)
23. Bz-Y-Chg-R-NH2 532,2 (532,2)
Príklad 36
Kombinácie chemických zmien, ktoré jednotlivo nemusia mať zlepšenú aktivitu, môžu zlepšovať aktivitu
Bola meraná inhibícia aktivity faktora Xa. Ako mieru aktivity peptidu podľa vynálezu je však možné stanoviť akúkoľvek relevantnú mieru biologickej aktivity, ako je vplyv peptidu YIR podľa vynálezu na koaguláciu, účinnosť in vivo, polčas in vivo, orálnu biodostupnosť, orálnu účinnosť alebo polčas.
Sú zobrazené rôzne špecifické zmeny. Ako príklad boli kombinované dve zmeny za účelom preukázania, že ďalšie zlepšenie aktivity bolo dosiahnuté kombináciou zmien aj vtedy, keď pôvodné jednotlivé zmeny nezlepšovali významne aktivitu. Jednotlivými chemickými zmenami bol získaný Ac-Y-I-R-L-P, ktorý mal hodnotu K; = 0,49 μΜ, a (iBu)Y-I-R-L-P s hodnotou K; = 2,6 μΜ, pričom pôvodná zlúčenina Y-I-R-L-P má hodnotu K; = 5,3 μΜ. Kombináciou týchto dvoch zmien vznikol Ac-(iBu)Y-I-R-L-P-NH2, ktorý mal hodnotu K; = 0,04 μΜ. Tieto výsledky teda demonštrujú, že peptid podľa vynálezu s kombináciou dvoch chemických zmien môže mať podstatne zvýšenú inhibičnú aktivitu voči faktoru Xa v porovnaní so zodpovedajúcimi analógmi s jedinou zmenou i v prípade, keď jedna pôvodná zlúčenina, ako je (iBu)Y-I-R-L-P-NH2, nemala významne zvýšenú aktivitu voči pôvodnému Y-I-R-L-P-NH2.
V tabuľke 3 sú uvedené príklady špecifických chemických modifikácií, ktoré viedli ku zlúčeninám s hodnotami inhibície faktora Xa Kj medzi 100 μΜ a 1 pM.
Tabuľka 3. Inhibítory faktora Xa s hodnotou Ki < 100 μΜ
štruktúra MS’ AA’
( 2,2-e(iMe-propyl) Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
( 2-CF3-Bz1 ) y-i-r-l-p-nh2 OK OK
(2-Et-nBu)Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
(2-Me-Bzl)Y-I-R-L-P-NH, OK OK
(2-Me-nBu)Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
(2-Me-n-pentyl) Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
( 3,3-cfiMe-nBu) Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
3 —flenoxypropío n γ ó -Y-Chg-R-NH2 OK OK
5-Bzim-CO-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
5-Bzim-CO-F(pNH2) -Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Y (3,5-Br)-I-R-L-P-NHj OK OK
Y ( 3,5-1)-I-R-L-P-NH2 OK OK
(Chx-CH2) Y-I-R-L-P-NB2 OK OK
(iBu)y-i-r-ob OK OK
(iBu)Y-I-R-L-A-NBj OK OK
(iBu)Y-I-R-L-P-NHj OK OK
(Me)y-I-R-L-A-NB2 OK OK
(Me)Y-I-R-L-A-NHj OK OK
(Me)y-I-R-L-P-NHa OK OK
(Me)Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
5-Hic-Chg-R-NH2 OK OK
Ac-(1,2,3,6-4H-Bzl) Y (SO3H)-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-(1,2,3,6-4H-Bzl)Y-I-R-L-P-NH, OK OK
Ac- (2,3-ďiMe-rSpentyl) Y (SO3H) -I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (2,3-UiMe-rťpentyl) Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (2-CFj-Bzl) Y (SO3H) -I-=R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (2-CF3-Bzl) Y-I-R-L-P-NH, OK OK
Ac-(2Et-nBu)Y-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac-(2-Me-Bzl)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-(2-Me-Bzl)Y-I-R-L-P-NH, OK OK
Ac- (2-Me-nBu) Y {SO3H) -I-R-L-P-NH2. OK OK
Ac-(2-Me-nBu)Y-I-R-L-P-NH2 · OK OK
Ac-(2-Me-n;f>entyl)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- { 2-Me-nrpentyl) Y-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac- ( 3,3-diMe-nBu) Y (SO,H) -I-R-L-P-NH, OK OK
Ac-( 3,3-č/iMe-nBu) Y-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac- (3,3-diMe-n^entyl) Y(SO3H) -I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (3,5,5-Me-3-nr/jexyl) Y-I-R-NH, OK OK
Ac-(3,5,5-Me-3-n^exyl)Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (4 -pyridyl-CH2-) Y-I-R-NH2 OK OK
Ac-(4-MeO-Bzl)Y-I-R-NH2 OK OK
Ac-(Bzl)Y-I-R-NHj OK OK
Ac- (Chx-CH2) Y-I-R-L-P-NH, OK OK
Ac- (óyklopropyl-CHj) Y(SOjE) -I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (éyllopŕopyl-CB,) Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (Et-CH=C (CH3) -CH,) Y (SO3H) -I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (Et-CH=C (CH3 )>—CH2) Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (iBu) F (pNH,) -Chg-R-NH2 OK OK
Ac- (iBu) F (pNH2) -Chg-R-L-P-NHj OK OK
Ac-(iBu)Nal(2)-Chg-R-L-P-NHj OK OK
Ac-(iBu)Y-Chg-R-NH2 OK OK
Ac-(iBu,Y-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Ac- (iBu) Y-I-Dab (ir-C3H,N) -L-P-NH2 OK OK
Ac- (iBu) Y-I-Orn(Né-C3H7N) -L-P-NH2 OK OK
Ac-(iBu)Y-I-R-NH, OK OK
Ac-(iBu)Y-I-R-L-P-NH, OK OK
Ac-(Me)Y-Chg-R-L-P-NH, OK OK
Ac-(Me)Y-I-R-L-A-NH, OK OK
Ac-(Me)Y-I-R-L-P-NH, OK OK
Ac-(nBu)Y-I-R-NH, OK OK
Ac- (trans-CK3-CH=C (CH3) -CH2) Y-I-R-L-P-NH, OK OK
Ac-Tyr(3,5-NOj)-I-R-L-P-NH, OK OK
Ac-(Bzl)G-(Chx)Gly-(3-guanido^ropyl)G-NH2 OK OK
Ac-BAla-Y-I-R-G-NH2 OK OK
Ac-E-Y-I-R-L-K-NHj” OK OK
Ac-E-Y-I-R-L-P-K-NH, OK OK
Ac-F (pCONHj) -Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-F(pCONHj) -I-R-L-P-NHj OK OK
Ac-F(pF)-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-f(pF)-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac-F(pCN)-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac-F (pNH2) -Chg-R-NEj OK OK
Ac-F (pNH2) -Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-F (pNHj) -I-R-L-P-NHj OK OK
Ac-F (ρΝΗ2) -Chg-R- (Bzl) G-G-OH OK OK
Ac-F (pNH2)-Chg-R-(Chx) G-G-OH OK OK
Ac-F (pNH2) -Chg-R- (CH2CH2CH2 (CH2)) G-G-OH OK OK
Ac-G-G-Y-I-R-G-NH2 OK OK
Ac-G-Y-Nle-R-L-NH2 OK OK
Ac-G-y-Nle-R-L-NH2 OK OK
Ac-G-Y-I-R-G-NH2 OK OK
Ac-G-Y-I-R-L-NH2 OK OK
Ac-Nal(1)-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac-Nal(2)-Cha-R-D(O-Allyl)-NH2 OK OK
Ac-Nal(2)-Cha-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-Nal(2)-Chg-R-NH2 OK OK
Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-Nal(2)-I-R-L-P-NH2 OK • .ΌΚ
Ac-Pgl(OH)-I-R-L-NH2 OK OK
Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-pAph-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-Phe(pGua)-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-S-Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-W-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-W-L-R-L-A-NHj OK OK
Ac-Y(Me)-I-R-L-A-NHj OK OK
Ac-Y(Me)-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac-Y-(allo-I)-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-Y-Cha-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-Y-Chg-R-NHj OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-CHjCHj-N (CH3) < OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-Bzl-4-OMe OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-CHj-Chx OK OK-
Ac-Y-Chg-R-NH-CH2CH3-N- (CHj) 2 OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-O-CH3 OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-COOH OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-Chx OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-CH2 (2- (1-Et)pyr .olidinyl) OK OK
Ac-Y-Chg-R-NH-CH2 (2 — ( 6-EtO) benzylt tiazolyl) OK OK
Ac-Y-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-Y-Chg-R(N02) -<ľ (CH2NH) }-L-NH2 OK OK
Ac-Y-Nva-R-NH2 OK OK
Ac-Y-Pen(Me)-R-L-P-NIL, OK OK
Ac-Y-Pgl-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-Y-{ľ(CH2N(Ac) )}-I-R-L-P-NH2 OK ok
Ac-Y-{Ψ (CHjNH) }-I-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-Y-I-R-{T(C0CH2) }-G-P-NH2 OK OK
Ac-Y-I-Dab(NT-C3H7N) -Í.-A-NH2 OK OK
Ac-Y-I-hR-L-A-NH2 OK OK
Ac-Y-I-nR-L-A-NH2 OK OK
Ac-Y-I-PalMe(3)-NH2 OK OK
Ac-Y-I-PalMe(3)-L-P-NH2 OK OK
Ac-Y-I-{ľ(CH2NH) }-R-L-P-NH2 OK OK
Ac-y-I-R-NH2 OK OK
Ac-Y-I-R-NHj OK OK
Ac-Y-I-R-N(Me)O-CH3 OK OK
Ac-Y-I-R-NH-CH2-4-Pyridyl OK OK
Ac-Y-I-R-NH-CH2CH2-N (CH3) 2 OK OK
Ac-Y-I-R~NH~4-mor-£ olinyl OK OK
Ac-Y-I-R-NH-0CH3 OK OK
Ac-Y-I-R-Ňle-Hyp OK OK
Ac-Y-I-R-Nle-A2P OK OK
Ac-Y-I-R-piperidyl OK OK
Ac-Y-I-R-I OK OK
Ac-Y-I-R-I-P OK OK
Ac-Y-I-R-L OK OK
Ac-y-I-R-L-A OK OK
Ac-Y-I-R-L-A OK OK
Ac-Y-I-R-L-A-A-F-T-NB2 OK OK
Ac-y-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac-Y-I-R-L-P-NHj OK OK
Ac-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P(G-A)3)-OH OK OK
Ac-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P(G-A)s) -OH OK OK
Ac-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P)-OH OK OK
Ac-Y-I-R-P-NHj OK . OK
Ac-Y-K-R-L-E-NH? OK OK
Ac-Y-N-R-L-NHj OK OK
Ac-Y-N-R-L-P-NHj OK OK
Ac-Y-T(Me)-R-L-P-NHj OK OK
BAla-Y-I-R-G OK OK
BAla-Y-I-R-G-NHj OK OK
Caff-I-R-NH2 OK OK
Cbz-I-R-L-NHj OK OK
Cbz-Y-I-R-NH2 OK OK
CClF2-CO-Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
cf2h-co-y-i-r-l-p-nh2 OK OK
CFj-CFjCO-Y-I-R-L-P-NHj OK OK
CH3-CHC1-CO-Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
CHj-O-CO-Y-I-R-L-P-NHj OK OK
ch3-so2-y-i-r-l-p-nh2 OK OK
CH3CH2-O-CO-Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
Cl2CHCO-Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
CICHjCO-Y-I-R-NHj OK OK
C-Y-I-R-L-C-NH-, OK OK
D-Tic-I-R-L—A—A-F-T-NH2 OK OK
Et(Et)Y-I-R-L-P-NH, OK OK
E-Y-I-R-K-NH, OK OK
E-Y-I-R-L-K-NH^ OK OK
E-Y-I-R-L-P-K-NHj OK OK
F(pCl,-I-R-I-Sar-NHj ΌΚ OK
F(pF)-I-R-L-P-NH2 OK OK
f(pF)-I-R-L-P-NHj OK OK
F (pNH2) -I-R-L-A-NH2 OK OK
F (pNO2) -I-R-L-A-NHj OK OK
f-I-R-F-P-NH2 OK OK
f-I-R-I-P-NH2 OK OK
F-I-R-L-NH, OK OK
f-i-r-l-p-h-y-g-nh2 OK OK
f-i~r-l-y-v-w-n-nh2 OK OK
For-y-I-R-L~P-NH2 OK OK
For-Y-I-R“L-P-NH2 OK OK
G-G-Y-I-R-G-NH3 OK OK
G-Y-I-R-D-NHj OK OK
g-y-i~r-f-nh2 OK OK
G^Y-I-R-G-NHj OK OK
g-y-i-r-g OK OK
G-Y-I-R-H-NHj· OK OK
G-Y-I-R-I-NHj OK OK
g-y-i-r-k-nh2 OK OK
g-y~i-r-l-nh2 OK OK
g-y-i-r-l-p-nh2 OK OK
g-y-i-r-l-p-a-m-nh2 OK OK
g-y-i-r-l-p-p-v-nh2 OK OK
g-y-i-r-l-p-q-t-nh2 OK OK
G-Y-I-R-L-P-S-Q-NH, OK OK
G-Y-I-R-S-NHj OK OK
G-Y-I-R-T-NHj OK OK
G-Y-I-R-V-NHj OK OK
G-Y-I-R-W-NHj OK OK
g-y-i-r-y-nh2 OK OK
(pOH) CjH^-CHjCHj (OH) -CO-I-R-L-Sar-NH2 OK OK
(pOH) CsH4-CH2CH2CO-I-R-L~A-NH2 OK OK
(pOH) CťH4-CH2CH2CO-I-R-L-P-NH2 OK OK
(pOH) CťH4-CH2CHOH-CO-I-R-L-P-NH2 OK OK
(ρΟΗ) C4H4-OCH (CH3 ,'CO-I-R-L-P-NHj OK OK
(pOH) CeH4-OCH2CO-I-R-L-P-NH2 OK OK
I-H-L-W-Y-I-R-L-P-NH, OK 0K
I-H-L-W-y-I-R-L-P-NHj OK OK
I-q-L-G-Y-I-R-L-P-NH, OK OK
4-MeO-CťH4-CO-I-R-L-A-NH2 OK OK
N-mor^.olinyl-CO-F-I-R-L-P-NHj OK OK
Nal(2) -Cha-R-D (O-Allyl) -NH2 OK OK
Nal(2)-Cha-R-D(O-Allyl)-Sar-NH2 OK OK
Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Nal(2)-I-R-C(Me) -P-NH2 OK OK
N-G-Y-I-R-L-I-H-NHj OK OK
pal-C(SBut)-R-L-P-NH2 OK OK
pal-I-R-C(SBut)-Hyp-NH2 OK OK
pal-I-R-C(SBut)-P-NHj OK OK
£gl(OH)-I-R-L-NH2 OK OK
Ph-C (NOCH2Ph) -CO-I-R-NH2 OK OK
Ph-CH=CH-CO-I-R-L-A-NH2 OK OK
Ph-CH2CH2CH2-CO-I-R-L-A-NH2 OK OK
Ph-CH2CH2CO-I-R-L-A-NH2 OK OK
Pth-Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
s-y-i-r-l-p-nh2 OK OK
Tfa-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-NHa OK OK
Tfa-(iBu)F(pNHj )-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Tfa-(iBu)Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Tfa-(iBu)Y-Chg-R-NH2 OK OK
Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NBj OK OK
Tf a- (iBu) Y-I-Dab (NT-C3H,N) -L-P-NH2 OK OK
Tf a- (iBu) Y-I-Orn (NÓ-C3H7N) -L-P-NH2 OK OK
Tfa-(iBu)Y-I-PalMe(3)-NH2 OK OK
Tfa-(iBu)Y-I-R-NHj OK OK
Tfa-(iBu)Y-I-R-OH OK OK
Tfa-(iBu)Y-I-R-G-NH3 OK OK
Tfa-(iBu)Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
Tfa-(Me)Y-I-R-L-A-NHj OK OK
Tfa-Y(Me)I-R-L-P-NHj OK OK
Tfa-Y-Chg-R-NHj OK OK
Tfa-Y-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
Tfa-y-I-R-L-P-NH2 OK OK
Tfa-Y-I-R-L-P-NH2 OK OK
t-f-g-y-i-r-k-a-nh2 OK OK
Tos-Y-I-R-NH2 OK OK
Tos-G-I-R-V-Sar-NHj OK OK
Tyr(Me)-I-R-L-A-NH2 OK OK
W-F-R-E-M-G-G-G-G-G-NH2 OK OK
W-I-R-E-K-NHj OK OK
w-i-r-n-p-nh2 OK OK
w-i-r-t-p-nh2 OK OK
w-L-R-L-A-NHj OK OK
W-L-R-L-A-NH2 OK OK
w-l-r-l-a-g-g-g-g-g-nh2 OK OK
W-L-R-V-A-ŇHj OK OK
w-L-R-V-A-NHj OK OK
W-L-R-V-A-G-G-G-G-G-NH2 OK OK
y(Me)-I-R-L-P-NH2 OK OK
y-Chg-R-NH2 OK OK
y-Chg-R-L-NH2 OK OK
y-Chg-R-L-P-NH2 OK OK
y-Tle-R-Nle-P-NIIa OK OK
y-Tle-R-Nle-AJP-NH2 OK OK
Y-I-(nR)-L-A-NHj OK OK
y-I-R(C0CH2)-G-P-NH2 OK OK
y-I-R-NH2 OK OK
Y-I-R-NHj OK OK
Y-I-R-E-F“S-D-Y-NH2 OK OK
y-i-r-g-a-nh2 OK OK
Y-I-R-I-NHj OK OK
Y-I-R-I-Y-NH, OK OK
Y-I-R-I-Y-E-R-E-NHj OK OK
Y-I-R-L-NHj OK OK
y-I-R-L-A-NH2 OK OK
Y-I-R-L-a-NH2 OK OK
Y-I-R-L-A-NHj OK OK
Y-I-R-L-A-A-NHj OK OK
y-i-r-l-a-a-f-nh2 OK OK
Y-I-R-L-A-A-F-T-NHj OK OK
Y-I-R-L-M-E-M-T-NH, OK OK
y-I-R-LvP~NH2 OK OK
Y-I-R-L-P-NHj OK OK
Y-I-R-L-P-G-L-L-NHj OK OK
Y-I-R-L-T-K-M-W-NH2 OK OK
Y-I-R-V-A-Q-L-Y-NHj OK OK
Y-I-R-V-M-N-H-R-NHj OK OK
Y-I-R-Y-R-N-P-I-NHj OK OK
Y-R-Y-P-R-D-R-N-NH2 OK OK
y-l-r-f-p-nh2 OK OK
* MS - hmotnostná spektrometria, AA - analýza aminokyselín
** - podčiarknutie označuje cyklizovanú časť peptidu
Príklad 37
Inhibícia vybraných čistených koagulačných enzýmov a iných serínových proteáz in vitro
Schopnosť zlúčeniny podľa vynálezu inhibovať faktor Xa, trombín, elastázu a trypsín bola zisťovaná stanovením koncentrácie peptidu YIR, ktorá inhibuje aktivitu enzýmu o 50 % (IC50). Čistené enzýmy boli použité pri testoch chromogenity. Pre stanovenie inhibičnej konštanty bola hodnota IC50 korigovaná na kompetíciu so substrátom s použitím vzorca
Kj = IC50 x (l/{ 1 + ((koncentrácia substrátu)/Km substrátu)}) (Chen a Prusoff, Biochem. Pharmacol. 22:3099-3018 (1973), ktorá publikácia je tu zahrnutá ako odkaz).
a) Test faktora Xa
Pre tento test bol použitý pufer TBS-P (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 200 mM NaCl, 0,05 % (w/v) PEG-8000, 0,2 % (w/v) NaN3). Hodnota IC5o bola stanovená tak, že v príslušných jamkách mikrotitračnej platne Costar s polovičnou plochou bolo kombinované 25 μΐ ľudského faktora Xa (Enzýme Research Laboratories, Inc., South Bend, IN) v TBS-P, 40 μΐ 10% (v/v) DMSO v TBS-P (neinhibovaná kontrola) alebo rôznych koncentrácií testovaného peptidu, zriedeného v 10% (v/v) DMSO v TBS-P, a substrátu S-2765 (Na-benzyloxykarbonylD-Arg-Gly-L-Arg-p-nitroanilid; Kabi Pharmacia, Inc., Franklin, OH) v TBS-P.
Testy boli uskutočňované preinkubáciou peptidického inhibítora plus enzýmu počas doby 10 min; potom bol zahájený test prídavkom substrátu po získanie konečného objemu 100 μΐ. Počiatočná rýchlosť hydrolýzy chromogénneho substrátu bola meraná zmenou absorbancie pri 405 nM s použitím kinetického doskového čítača Bio-tek Instruments (Ceres UV900HDÍ) pri 25 °C počas lineárnej časti časového priebehu (obvykle 1 až 5 min po prídavku substrátu). Kon72 centrácia inhibítora, ktorá spôsobila 50% pokles rýchlosti hydrolýzy substrátu, bola odhadnutá z lineárnej regresie po vynesení relatívnych rýchlostí hydrolýzy (v porovnaní s neinhibovanou kontrolou) proti logaritmu koncentrácie peptidu. Koncentrácia peptidu bola 0,5 nM a koncentrácia substrátu bola 140 μΜ.
b) Test trombínu
Pre tento test bol použitý pufer TBS-P. Hodnota ICjo bola stanovená spôsobom opísaným v príklade XXXVII.a) s tou výnimkou, že ako substrát bol použitý S-2366 (L-PyroGlu-L-Pro-L-Arg-p-nitroanilid; Kabi) a enzýmom bol ľudský trombín (Enzýme Research Laboratories, Inc.; South Bend, IN). Koncentrácia enzýmu bola 1 nM a koncentrácia substrátu 175 μΜ.
c) Test plazmínu
Pre tento test bol použitý pufer TBS-P. Hodnota IC5o bola stanovená spôsobom opísaným v príklade XXXVII.a) s tou výnimkou, že ako substrát bol použitý S-2251 ((D)-Val-L-Leu-L-Lys-p-nitroanilid; Kabi) a enzýmom bol ľudský plazmín (Kabi). Koncentrácia enzýmu bola 5 nm a koncentrácia substrátu 300 μΜ.
d) Test trypsínu
Pre tento test bol použitý pufer TBS-P s obsahom 10 mM CaCb. Hodnota IC so bola stanovená spôsobom opísaným v príklade XXXVII.a) s tou výnimkou, že ako substrát bol použitý ΒΑΡΝΑ (benzoyl-L-Arg-p-nitroanilid; Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO) a enzýmom bol hovädzí pankreatický trypsín (typ XIII, ošetrený TPCK; Sigma). Koncentrácia enzýmu bola 50 nM a koncentrácia substrátu 300 μΜ.
e) Test elastázy
Pre tento test bol použitý pufer Tris-Cl, pH 7,4, 300 mM NaCl, 2 % (v/v) N-metylpyrolidónu, 0,01 % (v/v) NaN3. Hodnota IC50 bola stanovená spôsobom opísaným v príklade XXXVII.a) s tou výnimkou, že ako substrát bol použitý sukcinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilid (Calbiochem-Nova Biochem Corp.; San Diego, CA) a enzýmom bola ľudská neutrofilová elastáza (Athens Research and x Technology, Inc.; Athens, GA) Koncentrácia enzýmu bola 75 nM a koncentrácia substrátu 600 μΜ.
Hodnoty K; pre vybrané testované zlúčeniny v porovnaní s kontrolnou zlúčeninou „TENSTOP“ (Ν-α-tozyl-Gly-p-amidino-fenylalanímetylester; American Diagnostica, Inc.; Greenwich, CT), čo je reverzibilný inhibítor faktora Xa (Sturzebecher a ď., Thromb. Res. 54:245-252 (1989); Hauptmann a ď., Thromb. Haem. 63:220-223 (1990), ktoré publikácie sú tu zahrnuté ako odkaz) sú uvedené vyššie v tabuľke 2. Výsledky demonštrujú, že peptidy YIR podľa vynálezu môžu inhibovať aktivitu faktora Xa, avšak v podstate neinhibujú aktivitu rôzny- ch iných serínových proteáz včítane trombínu a plazmínu, ktoré sa zúčastňujú procesu koagulácie krvi a fibrinolýzy.
Príklad 38
Testy na stanovenie inhibície koagulácie
Zlúčeniny podľa vynálezu boli testované na schopnosť inhibovať aktivitu faktora Xa. Účinnosť rôznych zlúčenín bola hodnotená pomocou testu protrombínovej doby (PT) in vitro s použitím spojenej plazmy od ľudského darcu. Bol taktiež použitý test ex vivo, pri ktorom bola plazma zhromažďovaná v rôznych časových intervaloch po intravenóznej (iv) aplikácii zlúčeniny potkanom a králikom alebo intraduodenálnej aplikácii potkanom a analyzovaná pomocou testu PT na stanovenie polčasu plazmy. Test PT bol zahájený riedením tromboplastínu, zvoleným tak, aby bolo možné získať predĺžený a vysoko reprodukovateľný konečný bod koagulácie, a označovaným ako ďalej opísaný „test doby zriedeného protrombínu“. Účinnosť rôznych zlúčenín bola stanovená taktiež pomocou potkanieho modelu trombózy s použitím potkanieho arteriovenózneho skratu in vivo.
a) Test doby zriedeného protrombínu in vitro
100 μΐ predohriatej (37 °C) spojenej ľudskej plazmy chudobnej na doštičky (PPP) bolo pridané do pohárika fibrometra (Baxter Diagnostics, Inc.; McGaw Park, IL). Bolo pridané 50 μΐ rôznych koncentrácií testovaných zlúčenín v TBSBSA s vápnikom (50 mM Tris-Cl, 100 mM NaCl, 0,1 % (w/v) hovädzieho sérového albumínu, 20 mM CaCL). V kontrolných experimentoch bol pre meranie doby neinhibovanej koagulácie pridávaný TBS-BSA s vápnikom, avšak bez testovanej zlúčeniny. Do pohárika fibrometra bolo pridané 150 μΐ zriedeného predohriateho králičieho tromboplastínu (Baxter) s vápnikom a bol zapnutý časovač fibrometra. Pred testovaním zlúčeniny bola získaná zrieďovacia krivka králičieho tromboplastínu, ktorá sa používa na výber takého zriedenia tromboplastínu, ktoré poskytuje dobu PT u neinhibovanej kontroly aspoň 30 s. Pokusná koncentrácia poskytujúca 50% inhibíciu koagulácie (EC50) s testovanou zlúčeninou (viď ďalej tabuľka 4) bola vypočítaná z dôb zrieďovacej krivky.
Alternatívne bol test doby zriedeného protrombínu uskutočnený s použitím „výskumného“ variantu na automatizovanom koagulačnom zariadení Instrumentation Laboratories (IL) ACL3000-plus (IL, Miláno, Taliansko). Tromboplastín bol riedený do dosiahnutia doby zrážania 30 až 35 s. Táto doba zrážania bola vzatá ako aktivita 100 %. Štandardná krivka pre kalibráciu bola stanovená postupným dvojnásobným riedením zriedeného tromboplastínového činidla (králičí mozgový tromboplastín IL). Počas testu bola vzorka 50 μΐ (plazma oddelená centrifugovaním) zmiešaná so 100 μΐ tromboplastínového činidla a každých 169 s boli odčítané nefelometrické hodnoty. Doba koagulácie bola stanovená z maximálnej rýchlosti zmeny rozptylu svetla vypočítanej zariadením. Inhibícia sa vyjadruje ako percento aktivity stanovené porovnaním s kalibračnou krivkou.
b) Test doby zriedeného protrombínu ex vivo
Testovaná zlúčenina bola podávaná iv schváleným postupom buď do chvostovej žily (potkan) alebo do ušnej žily (králik). V časových intervaloch po aplikácii testovanej zlúčeniny boli odoberané vzorky po 1 ml krvi z kanylovanej karotídy (potkan) alebo ušnej tepny (králik). Po odstredení na získanie PPP bola plazma okamžite uložená na ľad alebo zmrazená.
Na stanovenie doby zriedeného protrombínu bola plazma predohriata a testovaná vyššie opísaným spôsobom. Percento inhibície bolo vypočítané zo zrieďovacej krivky tromboplastínu, ktorá bola uskutočnená u každej série vzoriek a použitá na stanovenie doby, v ktorej zostane v plazme približne 50 % počiatočnej antikoagulačnej aktivity (Ti/2). Výsledky tohoto experimentu demonštrujú, že peptidy YIR podľa vynálezu môžu inhibovať koaguláciu krvi in vitro a po aplikácii in vivo (viď tabuľka 4).
Tabuľka 4. Aktivity a polčasy vybraných inhibítorov
EC50 spojená ľud- T l/2
potkania králičia
štruktúra ská in vitro ex vivo ex vivo
Ac-Y-Chg-R-NH2 2,5 μΜ 5 min 5 min
Ac-Y-Chg-R-L-P-NH2 225 nM 5 min 5 min
Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2 140 nM 6 min 5 min
Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2 300 nM 15 min 10 min
Rôzne zlúčeniny boli taktiež testované na antikoagulačnú aktivitu s použitím testu doby zriedeného protrombínu ex vivo po aplikácii bolusu iv v rôznych dávkach u potkanov. Zlúčeniny uvedené v tabuľke 5 vykázali aspoň 30% inhibíciu po 10 min od podania < 2 mg/kg uvedenej zlúčeniny. Tieto výsledky demonštrujú, že rôzne reprezentatívne peptidy YIR podľa vynálezu majú podstatnú antikoagulačnú aktivitu. Štruktúra všetkých zlúčenín uvedených v tabuľke 5 bola potvrdená pomocou MS a AA.
Tabuľka 5
1. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx
2. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-2CMT
3. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx . Ac-F(pNH2) -Chg-Dab(Nr-C3NH7,L-P-NH2
5. Bz-F(pNH2) -Chg-R-L-P-NH2
6. Tos-F(pNHj)-Chg-R-L-P-NHj
7. Ac-Y(3-1)-Chg-R-L-P-NB2
8. Ac-pAph-Chg-AMP(4)
9. y-Chg-R-L-NH2
10. Ac-F(pNH2) -Chg-R-ol
11. Cyclopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
12. 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
13. Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NHj
14. 3-Iqc-F(pNH2)-Chg-Ŕ-L-P-NH2
15. Ac-F(pNH2)-Chg-R-T iazolyl
16. 2-Furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
17. 5-Me-t ienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2
18. Ac-Nal(2)-Chg-R-Thiazolyl
19. 2-Bzf-f(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
20. Ac-pAph-Chg-Dab (NY-C3NH7 ) -L-P-NH2
21. Ac-Orn-Nal(2)-Chq-PalMe(3)-Sar-E-NB, ’
22. Ac-Phe(3-1,4-NH2)-Chg-R-L-P-NH2
23. Ac-(iBu)pAph-Chg-R-L-P-NH2
24. Ac-pAph-Chg-R-Gla-P-NH2 . Ac-pAph-Chg-R-Pen (CH2COOH) -P-NH2
26. Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2
27. Ac-F(pNH2)-Chg-R-(Me)L-P-NH2
28. Ac-F(pNH2) -Chg-R-OEt
29. Ac-F (pNHj) -Chg-Orn (N4-C3H7N) -L-P-NH2
30. Ac-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
31. Ac-Nal(2J-Chg-R-L-P-.NHj
32. Ac-pAph-Chg-Dab (NY-C3H7N)
33. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NHj
34. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NHj
35. Ac-pAph-Chg-R-NH2
36. Ac-pAph-Chg-R-OH
37. Ac-Y-Chg-R-NH-Nip-NH2.
38. Ac-K-Nal(2)-Chq-R-Hyp-E-NH-,
39. DIPA-pAph-Chg-R-L-P-NHj
40. DIPA-mF(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
41. Isn-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NS2
42. Pza-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NHj
3. Tfa-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2
44. Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NHj
45. Tf a- (iBu) Y-I-Orn (N6-C3H7N) -L-P-NH2 podčiarknutie označuje cyklickú časť zlúčení ny
V niektorých experimentoch boli testované zlúčeniny aplikované potkanom intraduodenálne. Samci potkanov Sprague-Dawley s hmotnosťou približne 300 g boli anestetizovaní schváleným postupom subkutánne kombináciou ketamín/xylazín. Pravá karotída bola kanylovaná pre odber vzoriek. Bola uskutočnená laparotomia a duodenum bolo kanylované ihlou s guľatým hrotom a podviazané tak, aby steh bol vzdialený od miesta vpichu. Ďalšia sľučka bola umiestnená v blízkosti miesta vpichu kvôli zamedzeniu úniku žalúdočného obsahu. Účinnosť sutúry pri zabraňovaní zlúčenine v dosiahnutí miesta vpichu bola testovaná v závere každého experimentu tlakovou skúškou. Bod vpichu bol približne 4 cm od spojenia duodena so žalúdkom. Zlúčeniny boli podávané v 1 ml normálneho salinického roztoku. Pred podaním testovanej zlúčeniny a po 15, 30, 60, 90 a 120 min po jej podaní bola odobraná vzorka 0,7 ml krvi. Plazma bola oddelená centrifugovaním a testovaná na inhibíciu koagulácie s použitím testu doby zriedeného protrombínu.
Po intraduodenálnej aplikácii < 50 mg/kg zlúčeniny vykázali aspoň 30% inhibíciu pri teste doby zriedeného protrombínu tieto zlúčeniny: Ac-pAph-ChgPalMe(3)-NH-CH2-Chx, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CHx, Bzf-pAph-ChgPalMe(3)-NH2, Ac-F(NH2)-Chg-R-L-P-NH2, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, Ac-pAph-Chg-AMP(4), cyklopentyl-CO-pAphChg-PalMe(3)-NH2, 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, 2-furoyl-pAph-ChgPalMe(3)-NH2, 5-Me-tienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, Ac-Y(3-I)-Chg-R-LP-NH2, Ac-F(pNH2)-Chg-R-ol a Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol.
c) Model trombózy potkaním arteriovenóznym skratom
Antitrombotická účinnosť rôznych zlúčenín podľa vynálezu bola testovaná s použitím potkanieho mimotelového arteriovenózneho (AV) skratu. Obvod AV skratu bol tvorený 20 cm trubičky z polyetylénu (PE) 60, zavedenej do pravej karotídy, 6 cm PE trubičky 160 obsahujúcej mercerované bavlnené vlákno s dĺžkou 6,5 cm (5 cm vystavené prietoku krvi) a druhým úsekom trubičky PE 60 (20 cm), uzatvárajúcim obvod do ľavej jugulárnej žily. Celý obvod bol pred zavedením vyplnený normálnym salinickým roztokom.
Testované zlúčeniny boli podávané kontinuálnou infúziou do chvostovej žily pomocou injekčnej pumpy a krídlatého katétra (infúzny objem 1,02 ml/h). Zlúčenina bola podávaná počas doby 30 min, potom bol skrat otvorený a počas doby 15 min sa nechala pretekať krv (celkove 45 min infúzia). Po uplynutí týchto 15 min bol skrat zaškrtený, vlákno bolo opatrne vybraté a zvážené na analytických váhach. Percento inhibície tvorby trombov bolo vypočítané pomocou hmotnosti trombu získanej u kontrolných potkanov, ktoré dostávali infúziu salinického roztoku.
Rast trombu inhibovali po infúzii < 33 pg/kg/min o aspoň 30 % tieto zlúčeniny: Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NHCHx, Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2, AcpAph-Chg-PalMe(3)-NH2, Ac-pAph-Chg-AMP(4), cyklopentyl-CO-pAph-ChgPalMe(3)-NH2, 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, 2-furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)NH2, 5-Me-tienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol a Tos-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2.
Napriek tomu, že je vynález opísaný s odkazom na uvedené uskutočnenia, je odborníkovi zrejmé, že konkrétne príklady slúžia iba na jeho objasnienie a že je možné bez prekročenia myšlienky vynálezu uskutočňovať rôzne modifikácie. Vynález je teda obmedzený iba nasledujúcimi patentovými nárokmi.

Claims (43)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Zlúčenina, špecificky inhibujúca aktivitu faktora Xa, všeobecného vzorca
    A1-A2-(A3)m-B, kde m je 0 alebo 1,
    A1 je R1-R2-R3,
    A2 je R4-R5-R6,
    A3 je R7-R8-R9, pričom
    Ri predstavuje zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej i) 1 až 20 aminokyselín,
    R7 kde iii)
    X predstavuje zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej N, CH a NC=O a
    R, a Rf predstavujú zvyšky nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, acyl, aryl, arylalkyl a amino-chrániacu skupinu, kde Ri môže byť substituovaný substituentom,
    R2 je -CR99R100-, kde R99 a R100 predstavujú zvyšky nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, arylalkyl, heteroarylalkyl a heteroaryl a kde R99 a R100 môžu byť nezávisle substituované substituentom,
    R3 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej -C(O)-, -CH2-, -CHR99-C(O)- a -C(O)-NR35-CH2-C(O)-, kde R35 je skupina CHR55 mostíkovej skupiny C(O)-CR5Í-,
    R4 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej -CH2- a -NR50-, kde R50 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, arylalkyl a heterocyklus,
    R5 je -CR2oiR2O2-, kde R20i a R202 sú zvyšky nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, aryl a arylalkyl a kde R2oi a R2o2 môžu byť nezávisle substituované substituentom,
    R6 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej -C(O)-, -CH2- a -CHR99-C(O)-,
    R7 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej -CH2- a -NR51-, kde R51 je H, alkyl, arylalkyl, heteroalkyl a heteroarylalkyl, a ktorúkoľvek z týchto skupín substituovanú zvyškom vybraným zo skupiny zahrnujúcej Q a (CH2)n-Q, kde n je 1 až 5 a zvyšok Q je vybraný zo skupiny zahrnujúcej amino, amidino, imidazolovú a guanidinoskupinu, ktorá môže byť substituovaná substituentom, a mono-, di-, tri- alebo tetra-alkylamónium jej farmaceutický prijateľnej soli, izoureidu alebo izotioureidu,
    Rg je -CR2ioR2h-, kde R2io a R2n sú zvyšky nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, alkylaryl a heterocyklus a ktorúkoľvek z týchto skupín substituovanú zvyškom vybraným zo skupiny zahrnujúcej Q a -(CH2)„-Q, kde n je 1 až 5 a zvyšok Q je vybraný zo skupiny zahrnujúcej amino, amidino, imidazolovú a guanidinoskupinu, ktorá môže byť substituovaná substituentom, a mono-, di-, tri- alebo tetra-alkylamónium jej farmaceutický prijateľnej soli, izoureidu alebo izotioureidu,
    R9 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej -C(O)-, -CH2- a -CHR99-C(O)-, pričom, ak je m rovné 1, je zvyšok B vybraný zo skupiny zahrnujúcej 1 až 20 aminokyselín, -NHR52, -NReoRei, -OR70 a -CHReoRei, kde
    R52 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, arylalkyl, heteroarylalkyl a heteroaryl,
    Rgo a Rôi sú zvyšky nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, arylalkyl, aryl, heteroarylalkyl a heteroaryl a
    R70 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, acyl, alkyl, arylalkyl a heteroarylalkyl, a ak je m rovné 0, je zvyšok B vybraný zo skupiny zahrnujúcej 1 až 20 aminokyselín, skupinu -OR70, -NHR52 a -NRgoRei, ktorá je amidickou alebo esterovou väzbou pripojená k Rg, pričom zvyšok B môže byť substituovaný substituentom, s podmienkou, že ak znamená R3 -CH2- alebo -CHR99-C(O)-, R* znamená NR50, keď R4 je -CH2-, potom R3 je -C(O)- alebo -CHR99-C(O)-, keď Rg je -CH2-, potom R7 je -NHR51-, keď R7 je CH2, potom R6 je -C(O)- alebo CHR99-C(O)-, keď R4 je -NR50- a Ri je
    R',
    R”, potom R5o a R'i spoločne tvoria mostíkovú skupinu vzorca -C(O)-CHR55-, kde CHR55 predstavuje R50 a karbonylová skupina predstavuje R'i a Ri a R55 nezávisle predstavujú H, Ci až Cg alkyl alebo arylalkyl, a keď R3 je -C(O)-NR35-CH2-C(O)-, potom R4 je -NR50-, Ri je
    R”,
    R35 a R'! spoločne tvoria mostíkovú skupinu vzorca -C(O)CHR55-, kde C(O) predstavuje R'i a CHRjj predstavuje R35; Ri a R55 nezávisle predstavujú H alebo Ci až Cg alkyl.
  2. 2. Zlúčenina podľa nároku 1, kde
    R4 je -NRso-,
    R50 a R'i spoločne tvoria mostíkovú skupinu vzorca -C(O)-CHR55, kde R55 je H, Ri je H alebo metyl,
    R99 a R100 sú zvyšky nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, arylalkyl, alkyl a heteroalkyl alebo 1 až 3 uhlíkové atómy, pričom R99 a R100 môžu byť ďalej spojené so skupinou vybranou zo skupiny zahrnujúcej fenyl, tienyl, tiazolyl, pyridyl, naftyl, tionaftyl, indolyl alebo nasýtený alkyl, alkoxy, monoalkylamino, dialkylamino, tetraalkylamónium, arylalkylamino, aminoalkylaryl, karboxy, halogéno, hydroxy, amino, amido, amidino, guanidino, triazolyl a sulfonyl, a
    R3 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej -C(O)- a -C(O)-NR3s-CH2C(O)-.
  3. 3. Zlúčenina podľa nároku 1, ďalej obsahujúca mostík medzi dvoma jednotkami vybranými zo skupiny zahrnujúcej Rio a Rb R9 a Rb Rg a Rb R5 a Rb R5 a R2, R5 a Rg a R5 a R9, pričom táto mostíková štruktúra je tvorená štruktúrou -CR4ooR4io(X-Y)R500R510C-, kde zvyšky R400, R410, R500 a R510 sú vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, cykloalkyl, arylalkyl a aryl a zvyšky X a Y sú nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej uhlík, dusík, kyslík, síru, -CO-NH-, -CH2-O-CH2 a ich funkčné ekvivalenty, pričom zvyšky R40o, R410, R500, R510 môžu byť substituované jednotkou vybranou zo skupiny zahrnujúcej alkylovú skupinu a heteroatóm.
  4. 4. Zlúčenina podľa nároku 1, kde zvyšky R'i a Ri sú nezávisle substituované substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej Ci-C6 alkyl, -OCH2-,
    -SCH2-, >N-CH2-, >N-C(O)-, -CO- a NY-CO-NZ, kde zvyšky Y a Z sú nezávisle vybrané zo skupiny zahrnujúcej H, Ci-C8 alkyl, C5-Ci2 arylalkyl a heteroarylalkyl.
  5. 5. Zlúčenina podľa nároku 1, kde zvyšok R2 je substituovaný substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej fenyl, tienyl, tiazolyl, pyridyl, naftyl, tionaftyl, indolyl, alkyl, alkoxy, monoalkylamino, dialkylamino, tetraalkylamónium, arylalkylamino, aminoalkylaryl a karboxy.
  6. 6. Zlúčenina podľa nároku 5, kde zvyšok R2 je substituovaný 1 až 5 substituentami vybranými zo skupiny zahrnujúcej alkyl, alkoxy, monoalkylamino, dialkylamino, tetraalkylamónium, arylalkylamino, aminoalkylaryl, karboxy, halogéno, hydroxy, amino, amido, amidino, guanidino, triazolyl a sulfonyl.
  7. 7. Zlúčeniny podľa nároku 1, kde Rioo je H a zvyšok R99 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej kde zvyšok W je vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, amino, nižší alkyl, prípadne substituovaný amínom, amidom, hydroxylom, karboxylom a amidinoskupinou, a zvyšok J je vybraný zo skupiny zahrnujúcej kyslík, síru, NH a NR, kde zvyšok R je vybraný zo skupiny zahrnujúcej Ci-Ce alkyl, C5-C12 arylalkyl, Ci-Có alkanoyl a C5-C12 aryloyl.
  8. 8. Zlúčenina podľa nároku 1, kde zvyšok R50 je substituovaný substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej jednotku obsahujúcu N-, O- a S-.
  9. 9. Zlúčenina podľa nároku 1, kde zvyšok R50 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl, arylalkyl a heteroarylalkyl.
  10. 10. Zlúčenina podľa nároku 1, kde zvyšky R201 a R202 sú ďalej substituované substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej jednotku obsahujúcu N-, O- a S-.
  11. 11. Zlúčenina podľa nároku 1, kde R202 je H a zvyšok R2oi je vybraný zo skupiny zahrnujúcej
    XR kde X predstavuje C, N alebo S, zvyšok R je vybraný zo skupiny zahrnujúcej H a alkyl, ktorý môže byť substituovaný heteroatómom a n je rovné 1 až 5.
  12. 12. Zlúčenina podľa nároku 1, kde zvyšok R5i je substituovaný substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej jednotku obsahujúcu N-, O- a S-.
  13. 13. Zlúčenina podľa nároku 1, kde zvyšok R2io alebo R2h je substituovaný substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej Q a (CH2)n-Q, kde n je 1 až 5.
  14. 14. Zlúčenina podľa nároku 1, kde zvyšok R52 je substituovaný substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej jednotku obsahujúcu N-, O- a S-.
  15. 15. Zlúčenina podľa nároku 1, kde zvyšky Reo a Rôi sú nezávisle substituované alkylom.
  16. 16. Zlúčenina podľa nároku 1, kde zvyšok R7o je substituovaný alkylom.
  17. 17. Zlúčenina podľa nároku 1, kde
    R'i je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, -CO-Ra, -SO2-Ra, aminochrániacu skupinu, 1 až 6 aminokyselín, ktoré môžu byť substituované, pričom N-koniec týchto 1 až 6 aminokyselín je substituovaný substituen88 tom vybraným zo skupiny zahrnujúcej H, -CO-Ra, -SO2-Ra a aminochrániacu skupinu, a kde
    Ra je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej alkyl, aryl a heteroalkyl,
    Ri je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, acyl a alkyl,
    X je N,
    R2 je -CHR99-, kde R99 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej alkyl, aryl, arylalkyl, heteroalkyl a heteroaryl, ktorý môže byť substituovaný substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej 1 až 6 skupín fluóro, chlóro, brómo, jódo, amino, nitro, amidino, amido, karboxy, esterových, éterových a hydroxy,
    R3 je -C(O)-,
    R4 je -NH-,
    Rs je -CHR20i-, kde R20i je alkyl,
    R6 je -C(O)-,
    R7 je -NH-,
    Rg je -CHR2io-, kde R2i0 je heteroalkyl s aspoň jedným formálnym kladným nábojom, kde heteroatómom je N,
    Rg je -C(O)-, a
    B je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej -ORb a -N-ReRd, kde
    Rb je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl a karboxy-chrániacu skupinu,
    Rc je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H a alkyl, a
    Ra je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej alkyl, heteroalkyl a 1 až 20 aminokyselín, ktorý môže byť substituovaný substituentom, pričom C-koniec uvedenej zlúčeniny môže byť modifikovaný karboxy-chrániacou skupinou, primárnou amidickou skupinou alebo časťou cyklického peptidu ako sekundárna alebo terciárna amidická skupina vytvorená s aminoskupinou v R|.
  18. 18. Zlúčenina podľa nároku 17, kde zvyšok A1 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej Tyr, F(pNH2), mAph, pAph a Nal(2).
  19. 19. Zlúčenina podľa nároku 17, ktorá obsahuje amino-chrániacu skupinu.
  20. 20. Zlúčenina podľa nároku 17, kde zvyšok A2 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej íle a Chg.
  21. 21. Zlúčenina podľa nároku 17, kde zvyšok A3 je vybraný zo skupiny zahrnujúcej Arg, PalMe(3), Dab(N7-C3H7N), Dap(Np-C3H7N) a Orn(Ns-C3H7N).
  22. 22. Zlúčenina podľa nároku 17, kde
    A1 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej Tyr, F(pNH2), mAph, pAph a Nal(2), ktoré obsahujú 0 alebo 1 amino-chrániacu skupinu,
    A2 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej íle a Chg,
    A3 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej Arg, PalMe(3), Dab(NY-C3H7N),
    Dap(Np-C3H7N) a Orn(N®-C3H7N) a
    B je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej -H, -OH, -NH2, 1 až 5 aminokyselín alebo ich funkčných ekvivalentov a karboxy-chrániacu skupinu.
  23. 23. Zlúčenina podľa nároku 22, vybraná zo skupiny zahrnujúcej Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-CHx,
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-2CMT,
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx,
    Ac-F(pNH2)-Chg-Dab(NY-C3H7N)-L-P-NH2,
    Bz-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2,
    Tos-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2,
    Ac-Y(3-I)-Chg-R-L-P-NH2, y-Chg-R-L-NH2,
    Ac-F(pNH2)-Chg-R-ol, cyklopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    3-Iqc-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2,
    Ac-F(pNH2)-Chg-R-NH-2-tiazolyl,
    2-furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    5-Me-2-tienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    Ac-Nal(2)-Chg-R-NH-2-tiazolyl,
    2-Bzf-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2,
    Ac-pAph-Chg-Dab(N7-C3H7N)-L-P-NH2,
    Ac-(iBu)pAph-Chg-R-L-P-NH2,
    Ac-pAph-Chg-R-Gla-P-NH2,
    Ac-pAph-Chg-R-Pen(CH2COOH)-P-NH2,
    Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2,
    Ac-F(pNH2)-Chg-R-(Me)L-P-NH2,
    Ac-F(pNH2)-Chg-R-OEt,
    Ac-F(pNH2)-Chg-Orn(N8-C3H7N)-L-P-NH2,
    Ac-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2,
    Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2,
    Ac-pAph-Chg-Dab(NY-C3H7N)-NH2,
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2,
    Ac-pAph-Chg-R-NH2,
    Ac-pAph-Chg-R-OH,
    Ac-pAph-Chg-R-ol,
    DIPA-(m)Aph-Chg-R-L-P-NH2,
    DIPA-(m)F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2,
    Isn-F(.pNH2)-Chg-R-L-P-NH2,
    Pza-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2,
    Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2 a
    Tfa-(iBu)Y-I-Orn(N8-C3H7N)-L-P-NH2.
  24. 24. Zlúčenina podľa nároku 22, vybraná zo skupiny zahrnujúcej
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx,
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx,
    Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2,
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, cyklopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    2-furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    5-Me-tienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 a
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol.
  25. 25. Zlúčenina podľa nároku 1, kde m je 0.
  26. 26. Zlúčenina podľa nároku 25, kde B je heteroarylalkyl.
  27. 27. Zlúčenina podľa nároku 26, kde uvedený heteroarylalkyl je vybraný zo skupiny zahrnujúcej (4-(N-metylpyridínium))metyl,
    2-(3-(N-metylpyridínium))et-1 -yl,
    1- (4-(N-metylpyridínium))et-l-yl, (p-amidino)benzyl,
    2- (4-(N-metylpyridínium))prop-2-yl a
    2-(4-(N-metylpyridínium))et-l-yl.
  28. 28. Zlúčenina podľa nároku 26, vybraná zo skupiny zahrnujúcej
    Ac-pAph-Chg-AMP(4) a
    Ac-pAph-Chg-AEMP(4).
  29. 29. Zlúčenina nevyskytujúca sa v prírode, špecificky inhibujúca aktivitu faktora Xa, majúca štruktúru X1-YIR-X2, kde
    Xi je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, acyl, alkyl, acylalkyl, arylalkyl a 1 až 20 aminokyselín a
    X2 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej modifikovanú C-terminálnu skupinu, jednu alebo niekoľko karboxy-chrániacich skupín a 1 až 20 aminokyselín, pričom uvedená zlúčenina môže byť substituovaná substituentom.
  30. 30. Zlúčenina podľa nároku 29, kde zvyšok Xi je vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, 1 aminokyselinu a 2 aminokyseliny a zvyšok X2 je vybraný zo sku93 piny zahrnujúcej modifikovanú C-terminálnu skupinu, jednu alebo niekoľko karboxy-chrániacich skupín a 1 až 17 aminokyselín.
  31. 31. Zlúčenina podľa nároku 29, kde uvedená zlúčenina je lineárna.
  32. 32. Zlúčenina podľa nároku 29, kde uvedená zlúčenina je cyklická.
  33. 33. Zlúčenina podľa nároku 32, kde cyklizácia je uskutočnená cez mostík mimo jednotky YIR.
  34. 34. Zlúčenina podľa nároku 33, kde cyklizácia zahrnuje mostík so zvyškom íle prítomným vnútri jednotky YIR.
  35. 35. Zlúčenina podľa nároku 29, vybraná zo skupiny zahrnujúcej
    Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2,
    Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-PrO-NH2,
    Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2,
    Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3),
    Ac-Tyr-{ v|/(CH2NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2,
    Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-pyridyl),
    Ac-Tyr-Ile-{w(CH2NH)}-Arg-Leu-Pro-NH2,
    Ac-Tyr-Chg-Arg(NO2)-{\j/(CH2NH)}-Leu-NH2,
    Ac-Tyr-Ile-Arg-{w(COCH2)}-Gly-Pro-NH2,
    Ac-Tyr-Ile-Dab(NT-C3H7N)-Leu-Ala-NH2,
    Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH2,
    Tyr-Ile-Arg-NH2,
    D-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2,
    Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropyl)Gly-NH2, cyklo(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly),
    Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2,
    Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2,
    Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2,
    Ac-pAph-Chg-PalMe-NH2 a ich farmaceutický prijateľné soli, amidy, estery, alkoholy a aldehydy.
  36. 36. Spôsob špecifickej inhibície aktivity faktora Xa, vyznačujúci sa tým , že sa faktor Xa uvádza do styku so zlúčeninou podľa nároku 1.
  37. 37. Spôsob podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým , že
    Ri je r
    R'i je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, -CORa, -SO2-Ra, aminochrániacu skupinu, 1 až 6 aminokyselín, ktoré môžu byť substituované, pričom N-koniec uvedených 1 až 6 aminokyselín je substituovaný substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej H, -C(O)-Ra, -SO2-Ra a aminochrániacu skupinu, kde
    Ra je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej alkyl, aryl a heteroalkyl,
    Ri je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, acyl a alkyl, x je N,
    R2 je -CHR99-, kde R99 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej alkyl, aryl, arylalkyl, heteroalkyl a heteroaryl, ktorý môže byť substituovaný substituentom vybraným zo skupiny zahrnujúcej 1 až 6 skupín fluóro, chlóro, brómo, jódo, amino, nitro, amidino, amido, karboxy, esterových, éterových a hydroxy,
    Rs je -C(O)-,
    R4 je -NH-,
    R5 je -CHR20i-, kde R20i je alkyl,
    R6 je -C(O)-,
    R7 je -NH-,
    Rg je -CHR2io-, kde R2io je heteroalkyl s aspoň jedným formálnym kladným nábojom, kde heteroatómom je 1 až 6 dusíkových atómov,
    R9 je -C(O)- a
    B je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej -ORb a -N-RcRa, kde
    Rb je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H, alkyl a karboxy-chrániacu skupinu,
    Rc je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej H a alkyl a
    Rd je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej alkyl, heteroalkyl a 1 až 20 aminokyselín, ktoré môžu byť substituované substituentom, pričom C-koniec uvedenej zlúčeniny môže byť modifikovaný karboxy-chrániacou skupinou, primárnou amidickou skupinou alebo časťou cyklického peptidu ako sekundárna alebo terciárna amidická skupina vytvorená s aminoskupinou Rj alebo redukciou na alkohol.
  38. 38. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým , že
    Al je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej Tyr, F(pNH2), mAph, pAph a Nal(2), ktoré obsahujú 0 alebo 1 amino-chrániacu skupinu,
    A2 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej íle a Chg,
    A3 je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej Arg, PalMe(3), Dab(N7-C3H7N),
    Dap(Np-C3H7N) a Orn(N8-C3H7N) a
    B je zvyšok vybraný zo skupiny zahrnujúcej -H, -OH, -NH2, 1 až 5 aminokyselín alebo ich funkčných ekvivalentov a skupinu chrániacu C-koniec.
  39. 39. Spôsob podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým , že uvedená zlúčenina je vybraná zo skupiny zahrnujúcej
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx,
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx,
    Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2, r Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, cyklopentyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2, t
    3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    2-furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2,
    5-Me-2-tienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2 a Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-ol.
  40. 40. Spôsob podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým , že uvedená zlúčenina je vybraná zo skupiny zahrnujúcej
    Ac-Y-I-R-L-A-NH2,
    Ac-Y-I-R-L-P-NH2,
    Ac-(íBu)Y-I-R-L-P-NH2,
    Ac-Y-I-R-N(CH3)O(CH3),
    Ac-Y-{\j/(CH2NH)}-I-R-L-P-NH2,
    Ac-Y-I-R-NH-CH2(4-pyridyl),
    Ac-Y-I-{v(CH2NH)}-R-L-P-NH2,
    Ac-Y-Chg-R(NO2)-{\|/(CH2NH)}-L-NH2,
    Ac-Y-I-R-MCOCH2)}-G-P-NH2,
    Ac-Y-I-Dab(N7-C3H7N)-L-A-NH2,
    Ac-Y-I-PalMe(3)-NH2,
    Y-I-R-NH2)
    D-Y-I-R-L-P-NH2,
    Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-guanidopropyl)Gly-NH2, cyklo(G-Y-I-R-G),
    Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2,
    Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2,
    Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2 a ich farmaceutický prijateľné soli, amidy, estery, alkoholy a aldehydy.
  41. 41. Spôsob inhibície zrážania krvi u jedinca, vyznačujúci sa tým , že sa jedincovi podáva zlúčenina podľa nároku 1.
  42. 42. Spôsob diagnostiky hladiny faktora Xa vo vzorke, vyznačujúci sa tým , že sa vzorka uvádza do styku so zlúčeninou podľa nároku 1 a deteguje sa naviazané množstvo.
  43. 43. Spôsob diagnostiky hladiny aktívneho faktora Xa vo vzorke, vyznačujúci sa tým , že sa vzorka uvádza do styku so zlúčeninou podľa nároku 1 a deteguje sa množstvo enzymatickej aktivity faktora Xa.
SK1366-96A 1994-04-26 1995-04-25 Zlúčenina špecificky inhibujúca aktivitu faktora Xa, farmaceutická kompozícia s jej obsahom a jej použitie SK286094B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US23305494A 1994-04-26 1994-04-26
PCT/US1995/005268 WO1995029189A1 (en) 1994-04-26 1995-04-25 FACTOR Xa INHIBITORS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK136696A3 true SK136696A3 (en) 1997-05-07
SK286094B6 SK286094B6 (sk) 2008-03-05

Family

ID=22875692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1366-96A SK286094B6 (sk) 1994-04-26 1995-04-25 Zlúčenina špecificky inhibujúca aktivitu faktora Xa, farmaceutická kompozícia s jej obsahom a jej použitie

Country Status (27)

Country Link
EP (2) EP0758341B1 (sk)
JP (1) JP3655632B2 (sk)
KR (1) KR100380124B1 (sk)
CN (1) CN1181091C (sk)
AT (1) ATE262536T1 (sk)
AU (1) AU707653B2 (sk)
CA (1) CA2186497C (sk)
CZ (1) CZ296439B6 (sk)
DE (1) DE69532754T2 (sk)
DK (1) DK0758341T3 (sk)
EE (1) EE03973B1 (sk)
ES (1) ES2214500T3 (sk)
FI (1) FI120494B (sk)
HU (1) HUT76346A (sk)
IL (1) IL113505A (sk)
LT (1) LT4218B (sk)
LV (1) LV11740B (sk)
NO (1) NO318759B1 (sk)
NZ (1) NZ284977A (sk)
PL (1) PL188132B1 (sk)
PT (1) PT758341E (sk)
RU (1) RU2152954C1 (sk)
SI (1) SI9520044B (sk)
SK (1) SK286094B6 (sk)
TW (1) TW409129B (sk)
WO (1) WO1995029189A1 (sk)
ZA (1) ZA953361B (sk)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR199700803T1 (xx) * 1995-02-17 1998-02-21 Basf Aktiengesellschaft Trombin-inhibit�rleri olarak yeni dipeptidik amidinler.
US6069130A (en) * 1995-06-07 2000-05-30 Cor Therapeutics, Inc. Ketoheterocyclic inhibitors of factor Xa
US5747458A (en) * 1995-06-07 1998-05-05 Chiron Corporation Urokinase receptor ligands
US5766932A (en) * 1995-12-20 1998-06-16 Hoechst Marion Roussel, Inc. Process for preparing N-acetyl(L)-4-cyanophenylalanine from a mixture of the corresponding D,L ethyl esters using subtilisin
KR100438879B1 (ko) * 1995-12-20 2004-07-16 아벤티스 파마슈티칼스 인크. N-아세틸(L)-4-시아노페닐알라닌Ac-(L)-Phe(4-CN)-OH및N-아세틸-(L)-p-아미디노페닐알라닌-시클로헥실글리신-β-(3-N-메틸피리디늄)-알라닌Ac-(L)-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2의신규제조방법
US6369080B2 (en) 1996-10-11 2002-04-09 Cor Therapeutics, Inc. Selective factor Xa inhibitors
US6063794A (en) 1996-10-11 2000-05-16 Cor Therapeutics Inc. Selective factor Xa inhibitors
US6194435B1 (en) 1996-10-11 2001-02-27 Cor Therapeutics, Inc. Lactams as selective factor Xa inhibitors
US6262047B1 (en) 1996-10-11 2001-07-17 Cor Therapeutics, Inc. Selective factor Xa inhibitors
US6369063B1 (en) 1997-04-14 2002-04-09 Cor Therapeutics, Inc. Selective factor Xa inhibitors
NZ500353A (en) 1997-04-14 2002-02-01 Cor Therapeutics Inc Cyclic diaza compounds that are selective inhibitors of factor Xa
AU741099B2 (en) * 1997-04-14 2001-11-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Selective factor Xa inhibitors
US7109326B2 (en) 1997-04-15 2006-09-19 Genentech, Inc. Halo-alkoxycarbonyl prodrugs
US6218382B1 (en) 1997-08-11 2001-04-17 Cor Therapeutics, Inc Selective factor Xa inhibitors
US6228854B1 (en) 1997-08-11 2001-05-08 Cor Therapeutics, Inc. Selective factor Xa inhibitors
US6333321B1 (en) 1997-08-11 2001-12-25 Cor Therapeutics, Inc. Selective factor Xa inhibitors
GB9727123D0 (en) * 1997-12-22 1998-02-25 Int Centre Genetic Eng & Bio Synthesis of diamines
ATE293599T1 (de) 1997-12-24 2005-05-15 Aventis Pharma Gmbh Indolderivate als faktor xa inhibitoren
EP0987274A1 (en) * 1998-09-15 2000-03-22 Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH Factor VIIa Inhibitors
BR9916732A (pt) * 1999-01-02 2001-09-25 Aventis Pharma Gmbh Derivados de ácido malÈnico, processo para a sua preparação, seu uso e composições farmacêuticas contendo-os (inibição da atividade do fator xa)
CZ20012378A3 (cs) * 1999-01-02 2001-09-12 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Deriváty arylalkanoylu, způsoby jejich přípravy, použití a farmaceutické přípravky obsahující tyto deriváty
EP1016663A1 (en) * 1999-01-02 2000-07-05 Aventis Pharma Deutschland GmbH Novel malonic acid derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them (inhibition of factor Xa activity)
EP1022268A1 (en) * 1999-01-02 2000-07-26 Aventis Pharma Deutschland GmbH Arylalkanoyl derivatives, processes for their preparation, their use and pharmaceutical compositions containing them
EP1059302A1 (en) 1999-06-08 2000-12-13 Aventis Pharma Deutschland GmbH Factor VIIa inhibitors
EP1095933A1 (en) 1999-10-30 2001-05-02 Aventis Pharma Deutschland GmbH Novel N-guanidinoalkylamides, their preparation, their use, and pharmaceutical preparations comprising them
JP5088598B2 (ja) * 1999-12-14 2012-12-05 昭和電工株式会社 シアノベンジルアミン類の塩の製造方法
EA003286B1 (ru) * 1999-12-14 2003-04-24 Сова Денко К.К. Способ получения солей цианобензиламинов
IL150897A0 (en) * 2000-01-28 2003-02-12 Aventis Pharma Gmbh Process for the preparation of acetyl-amidiniophenylalanyl cyclohexylglycyl-pyridinioalaninamides
EP1127884A1 (en) * 2000-02-26 2001-08-29 Aventis Pharma Deutschland GmbH Novel malonic acid derivatives, processes for their preparation, their use as inhibitor of factor XA activity and pharmaceutical compositions containing them
DE10029015A1 (de) 2000-06-15 2001-12-20 Curacyte Ag Hemmstoffe für den Gerinnungsfaktor Xa
JP4274522B2 (ja) 2000-12-06 2009-06-10 サノフィ−アベンティス・ドイチュラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング Ｘａ因子阻害剤としてのグアニジンおよびアミジン誘導体
EP1314733A1 (en) 2001-11-22 2003-05-28 Aventis Pharma Deutschland GmbH Indole-2-carboxamides as factor Xa inhibitors
ATE399175T1 (de) 2002-03-11 2008-07-15 Curacyte Ag Hemmstoffe der urokinase, ihre herstellung und verwendung
SI1569912T1 (sl) 2002-12-03 2015-09-30 Pharmacyclics Llc Derivati 2-(2-hidroksibifenil-3-il)-1h-benzoimidazol-5-karboksamidina kot inhibitorji faktorja viia
US7358268B2 (en) 2002-12-04 2008-04-15 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Imidazole derivatives as factor Xa inhibitors
US7429581B2 (en) 2002-12-23 2008-09-30 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pyrazole-derivatives as factor Xa inhibitors
DE10301300B4 (de) 2003-01-15 2009-07-16 Curacyte Chemistry Gmbh Verwendung von acylierten 4-Amidino- und 4-Guanidinobenzylaminen zur Inhibierung von Plasmakallikrein
US7741341B2 (en) 2003-05-19 2010-06-22 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Benzimidazole-derivatives as factor Xa inhibitors
EP1479680A1 (en) 2003-05-19 2004-11-24 Aventis Pharma Deutschland GmbH Azaindole derivatives as Factor Xa inhibitors
US7317027B2 (en) 2003-05-19 2008-01-08 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Azaindole-derivatives as factor Xa inhibitors
EP1479677A1 (en) 2003-05-19 2004-11-24 Aventis Pharma Deutschland GmbH New indole derivatives as factor xa inhibitors
EP1479675A1 (en) 2003-05-19 2004-11-24 Aventis Pharma Deutschland GmbH Indazole-derivatives as factor Xa inhibitors
US7223780B2 (en) 2003-05-19 2007-05-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Triazole-derivatives as blood clotting enzyme factor Xa inhibitors
DE10342108A1 (de) 2003-09-11 2005-04-14 Curacyte Chemistry Gmbh Basisch-substituierte Benzylaminanaloga als Inhibitoren des Gerinnungsfaktors Xa, ihre Herstellung und Verwendung
EP1568698A1 (en) 2004-02-27 2005-08-31 Aventis Pharma Deutschland GmbH Pyrrole-derivatives as factor Xa inhibitors
CN101087609B (zh) 2004-10-26 2012-11-14 詹森药业有限公司 因子Xa化合物
EP1724269A1 (en) 2005-05-20 2006-11-22 Sanofi-Aventis Deutschland GmbH Heteroaryl-carboxylic acid (sulfamoyl alkyl) amide - derivatives as factor Xa inhibitors
DE102005044319A1 (de) 2005-09-16 2007-03-22 Curacyte Chemistry Gmbh 2-(Aminomethyl)-5-Chlor-Benzylamid-Derivate und ihre Verwendung als Hemmstoffe des Gerinnungsfaktors Xa
DE102006050672A1 (de) 2006-10-24 2008-04-30 Curacyte Discovery Gmbh Hemmstoffe des Plasmins und des Plasmakallikreins
EP1918718A1 (de) * 2006-10-31 2008-05-07 Roche Diagnostics GmbH Verfahren und Vorrichtungen zur elektrochemischen Bestimmung von Faktor Xa-Inhibitoren in Blutproben
CN103071154A (zh) 2007-04-13 2013-05-01 千年药品公司 用起因子xa抑制剂作用的化合物的组合抗凝治疗

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
CA1161431A (en) * 1979-05-11 1984-01-31 Lars G. Svendsen Tripeptide derivatives
US4469679A (en) * 1983-02-16 1984-09-04 Smithkline Beckman Corporation Octapeptide vasopressin antagonists
HU191961B (en) * 1984-08-02 1987-04-28 Richter Gedeon Vegyeszet Process for producing 1,5 and 8 substituted peptides of angiotenzin-ii antagonistic activity
CA2129339C (en) * 1992-02-14 2002-09-10 George P. Vlasuk Inhibitors of thrombosis

Also Published As

Publication number Publication date
NO318759B1 (no) 2005-05-02
EP1384725A3 (en) 2007-02-21
PL188132B1 (pl) 2004-12-31
IL113505A0 (en) 1995-07-31
ES2214500T3 (es) 2004-09-16
IL113505A (en) 1999-12-31
CA2186497C (en) 2008-06-17
PT758341E (pt) 2004-08-31
NO964553L (no) 1996-12-27
WO1995029189A1 (en) 1995-11-02
CZ314096A3 (en) 1997-05-14
ZA953361B (en) 1996-01-12
JPH10503477A (ja) 1998-03-31
LT96151A (en) 1997-05-26
ATE262536T1 (de) 2004-04-15
LT4218B (en) 1997-09-25
AU2368395A (en) 1995-11-16
HUT76346A (en) 1997-08-28
CA2186497A1 (en) 1995-11-02
EP0758341B1 (en) 2004-03-24
CZ296439B6 (cs) 2006-03-15
SK286094B6 (sk) 2008-03-05
PL317067A1 (en) 1997-03-03
FI120494B (fi) 2009-11-13
EP1384725A2 (en) 2004-01-28
SI9520044A (en) 1997-10-31
FI964317A (fi) 1996-10-25
DE69532754T2 (de) 2005-03-10
EP0758341A1 (en) 1997-02-19
DK0758341T3 (da) 2004-06-28
SI9520044B (sl) 2004-08-31
HU9602954D0 (en) 1996-12-30
CN1181091C (zh) 2004-12-22
FI964317A0 (fi) 1996-10-25
CN1147261A (zh) 1997-04-09
NO964553D0 (no) 1996-10-25
NZ284977A (en) 1998-09-24
EE9600146A (et) 1997-04-15
KR100380124B1 (ko) 2003-08-02
LV11740A (lv) 1997-04-20
EE03973B1 (et) 2003-02-17
TW409129B (en) 2000-10-21
AU707653B2 (en) 1999-07-15
DE69532754D1 (de) 2004-04-29
RU2152954C1 (ru) 2000-07-20
JP3655632B2 (ja) 2005-06-02
LV11740B (en) 1997-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2186497C (en) Factor xa inhibitors
AU760580B2 (en) Factor VIIa inhibitors
US5849690A (en) Anti-aggregatory peptides
WO1994003479A1 (en) Thrombin receptor antagonists
US11472838B2 (en) Inhibitors of blood coagulation factor XIII
CA2224180A1 (en) Ketoheterocyclic inhibitors of factor xa
CZ256598A3 (cs) Inhibitory serinové proteázy a farmaceutický prostředek
US7879792B2 (en) Synthetic peptide inhibitors of thrombin and thrombin activation of protease activated receptors 1 and 4
US5849510A (en) Factor Xa inhibitors
CA2026376C (en) Anticoagulant peptides
US6759384B1 (en) Factor Xa inhibitors
KR100330465B1 (ko) 삼관능성항트롬빈및항혈소판펩티드

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of maintenance fees

Effective date: 20110425