SI24364A - Äťezmerna produkcija rekombinantne oblike pernizina v heterolognem ekspresijskem sistemu - Google Patents

Abstract

Izum s spremenjenim DNA zaporedjem, za in vitro izražanje rekombinantne proteaze iz Aeropyrum pernix K1, pernizina v heterolognem ekspresijskem sistemu. Poleg tega se izum nanaša na postopek za pripravo subtilizinu podobne proteaze z uporabo rekombimantnih tehnikami DNA.

Description

1 1

ČEZMERNA PRODUKCIJA REKOMBINANTNE OBLIKE PERNIZINA V HETEROLOGNEM EKSPRESIJSKEM SISTEMU

Področje izuma

Izum predstavlja spremenjeno DNA zaporedje za in vitro izražanje rekombinantne oblike proteaze iz Aeropyrum pernix KI, pemizin, v heterolognem ekspresijskem sistemu. Predstavljen izum se nadalje nanaša na postopke priprave subtilizinu podobne proteaze z uporabo rekombinantne tehnologije DNA.

Ozadje izuma

Aeropyrum pernix KI je hipertermofilen organizem izoliran iz obalnega žveplenega vrelca na Japonskem (Sako et al. 1996. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 46, 4: 1070-1077). A. pernix raste pri temperaturah nad 90°C. Njegov genom je javno dostopen od leta 1999 (Kawarabayasi et al. 1999. DNA Research, 6, 2: 83-101). Zaradi lastnosti, da lahko A. pernix KI živi v ekstremnem okolju so njegovi protein zanimivi za mnoge industrijske aplikacije. Gojenje A. pernix KI v laboratoriju je omogočilo izolacijo in karakterizacijo številnih njegovih proteinov. Med njimi je zelo zanimiv prav pemizin. Prvič ga je opisala skupina Catara in sod. (2003, Extremophiles, 7, 5: 391-399). Pemizin je termostabilna od Ca2+ modulirana serinska proteaza s predpostavljeno katalitično triado H174, S , D . Dokazi, ki potijujeto katalitično triado, so predstavljeni v tem zahtevku (cf. Slika 1).

Patent US 5,693,520 razkriva aktivno rekombinantno tripsinu podobno proteazo, sestavljeno iz aminokislinskih preostankov 25-224 celotnega zaporedja, kot tudi konstrukt DNA, ki kodira prej omenjen encim s celotno sekvenco. Encim je lahko uporaben kot dodatek detergentom. Patent US 2007/0099283-Al razkriva aktivno proteinazo K. Nadalje je opisan postopek za izražanje rekombinantne oblike proteinaze K.

Rekombinantni pemizin brez signalnega zaporedja (prvih 23 aminokislin proteina) so uspešno čezmerno producirali z uporabo E. coli kot ekspresij skijskega organizma, in sicer kot fuzijski protein z glutation-S-transferazo (Catara et al. 2003. Extremophiles, 7, 5: 391-399). Pemizin so posredno zaznali na NaDS-PAGE kot posledico povečane proteolitične cepitve 2 bakterijskega lizata. Izkoristek po čiščenju rekombinantnega pemizina je bil majhen. Aktivnost pemizina so potrdili pri molski masi 34 kDa z uporabo kazeinskega substrata. Količina tako pridobljenega pemizina je premajhna za proizvodnjo encima v velikem industrijskem merilu. Ker je tudi količina pridobljenega pemizina iz zunaj celičnega gojišča po gojenju A. pernix nizka, je potrebno pripraviti ekspresijski sistem za proizvodnjo večjih količin pemizina. 3

Povzetek izuma

Predstavljen izum se nanaša na novo DNA zaporedje, ki kodira pemizin. Izražanje DNA zaporedja, kije del izuma, omogoča velike donose in produktivnost pemizina z uporabo E. coli heterolognega sistema. Predstavljen izum se nanaša tudi na postopke uporabljene za pridobivanje rekombinantne oblike pemizina v drugih heterolognih gostiteljih. Spremenjen gen kodirajoč za pemizin je produciran v presenetljivo visokih donosih v splošnih bakterijskih gostiteljih kot je E. coli. V eni izvedbi izuma je histidinski rep dodan za enostavnejšo detekcijo in čiščenje pemizina. Medtem ko z nativnim zaporedjem gena Ape263.1 proizvedemo manjše količine pemizina kot produkta, je DNA zaporedje podano v izumu optimizirano za izboljšano izražanje pemizina z visokim izkoristkom in produktivnostjo. Sprememba originalnega DNA zaporedja (Ape263.1) se je izkazala za ključno pri izražanju pemizina v visokih izkoristkih in produktivnosti. Aktivnost pemizina smo preverili z uporabo cimografije. Mutacija aminokislinskega zaporedja pemizina v katalitičnem mestu (S355A) je privedla do neaktivnosti pemizina, kar je bilo pričakovano.

Predstavljen izum se nanaša na molekulo nukleotidnega zaporedja s sestavo zaporedja prikazano v SEQ ID NO:3. Druga izvedba izuma se nanaša na zaporedje, ki izhaja iz SEQ ID NO:3 z zamenjavo od 1 do 20, od 1 to 10, ali 1 do 5, ali 1 do 2, ali 1 zamenjanih kodon(ov), vsak zamenjak kodon kodira specifično aminokislino, pri čemer zamenjan kodon smatramo kot zamenjan kodon, ki kodira isto aminokislino. Takšna zaporedja kodirajo enak protein, torej (divji tip) pemizina z alternativnimi kodoni. Medtem ko je bilo ugotovljeno, da je zaporedje prikazano v SEQ ID NO:3 optimalno, bodo izvedenke tega zaporedja pridobljene z zamenjavo kodonov občutno povečale donose in produktivnost pri izražanju proteinskega produkta.

Izum se naprej nanaša na zaporedja izpeljana iz SEQ ID NO:3 z delecijo ali adicijo njih od 1 do 20, ali 1 do 10, ali 1 do 5, ali 1 do 2, ali 1 kodon(ov) zaporedja SEQ ID NO:3. Delecija ali adicija ne privede do spremembe prvotnega bralnega okvirja. Takšna spremenjena DNA zaporedja privedejo do izražanja spremenjenih proteinov. Tako pridobljen spremenjen protein lahko vseeno še vedno ohrani funkcijo pemizina in je tako del priloženega izuma.

Druga zaporedja, optimizirana za izražanje (ne izhajajo iz SEQ ID NO:3), lahko tudi izboljšajo izražanje, ampak ne do takšne mere, kot je izboljšano izražanje z zaporedjem tega izuma. 4 V okviru tega izuma, se "% identičnost" proteina glede na določeno dolžino referenčnega proteina razume kot: peptid, ki je v 50 odstotkih enak referenčnemu polipeptidu, ki je 100 aminokislin dolg, lahko 50 aminokislin dolg polipeptid, kije popolnoma identičen 50 aminokislin dolgemu delu referenčnega polipeptida. To je lahko tudi 100 aminokislin dolg polipeptid, ki je v 50 odstotkih enak referenčnemu polipeptidu po celotni dolžini. Seveda tudi ostali polipeptidi izpolnjujejo enaka merila. Izraz "% identiteta zaporedja", kot se uporablja tukaj, pomeni, da se zaporedja primerjajo kot sledi. Primeijanje zaporedij je izvedeno z različico 9 programa, kjer vrzeli genetskih preračunov skupin (globalni program za poravnavo), s privzeto (BLOSUM62) matriko (vrednosti od -4 do 11), z kaznijo -12 za odprto vrzel (za prvo ničlo v vrzeli) in kazen za razširitev v višini -4 (za vsaki naslednji zaporedni ničli v vrzeli). Po poravnavi se delež identičnosti izračuna tako, da se ujemanje prikaže kot število zadetkov v odstotkih števila aminokislin v referenčnem polipeptidu.

Predložen izum se nanaša tudi na molekule nukleinske kisline, kot je definirano zgoraj, ki nadalje obsega vsaj eno izmed naslednjega: (a) His vključek (npr. SEQ ID NO: 4), (b) TEV cepitveno mesto (npr. SEQ ID NO : 5), (c) GST vključek (npr. SEQ ID NO: 6), in (d) MBP vključek (npr. SEQ ID NO: 7). Prednostno je vsaj ena od omenjenih His vključek, TEV cepitveno mesto, GST vključek ali MBP vključek nahaja na 5 ' delu omenjenega SEQ ID NO: 3 zaporedja ali njegovih homologov, kot je definirano zgoraj.

Prednostne izvedbe izuma so molekule nukleinske kisline, ki imajo zaporedja po katerem koli od SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 in SEQ ID NO: 11. Ta zaporedja so prikazana na slikah 5, 6 in 7, vključno s strukturno informacijo o DNA zaporedjih. Sprejeta so tudi izpeljana zaporedja iz SEQ ID: 9 dol 1 z zamenjavo od 1 do 20 ali od 1 do 10 ali od 1 do 5, ali 1 do 2, ali 1 zamenjanih kodon(ov), vsak zamenjan kodon kodira specifično amino kislino, ki vsaka zase nadomešča kodon, pri Čemer zamenjava kodona kodira isto amino kislino kot ustrezno zamenjan kodon. Del predloženega izuma so tudi izpeljana zaporedja iz SEQ ID NO: 9 do 11 z delecijo ali adicijo od 1 do 20 ali od 1 do 10 ali od 1 do 5, ali 1 do 2, ali 1 kodona(ov) na zaporedju v SEQ ID NO: 3. Delecija ali adicija ne privede do spremembe prvotnega bralnega okvirja.

Predstavljen izum vključuje tudi plazmide, vektorje in celice, ki imajo molekule nukleinskih kislin opisanih zgoraj. 5

Predstavljen izum se nanaša tudi na postopke za produkcijo pemizina, zlasti na postopek za izražanje pemizina kot molekulo nukleinske kisline kot je opisano z izumom zgoraj. V izvedbi je prednostno izražena molekula nukleinske kisline v Escherichia coli. Natančneje prednostna izvedba vključuje prenos izraženega proteina v periplazemski ali zunajcelični prostor. V drugi preferenčni izvedbi pridobivanje pemizina poteka iz supematanta kulture.

Kratek opis slik

Slika 1 prikazuje NaDS-PAGE (A) in cimogram (B) ekspresijsko-optimiziranega pemizinacoE (proge 1, 2, 5, 6) in ekspresij sko-optimiziranega mutante pemzinaCOS355AE (proge 3,4, 7, 8). Oligomeriziran pemizin je označen kot o.

Slika 2 prikazuje a dot-blot celotnega celičnega lizata dobljenega iz bakterijskega ekspresijskega sistema z vključenim DNA zaporedjem za pemizin. (A) pred indukcijo, (B) čas (1, 2, 3,4 ur) po indukciji, (+) pozitivna kontrola.

Slika 3 prikazuje imunodetekcijo čistega vzorca po heterolognem izražanju neoptimiziranega in optimiziranega zaporedja za pemizin v bakterijskem ekspresijskem vektorju A in B (dodatno vsebuje GST vključek na N-koncu pemizina).

Slika 4 prikazuje analizo redkih kodonov divjega tipa zaporedja pemizina (črni stolpci) in za E. coli optimizirano zaporedje za pemizin (senčeni stolpci). Prikazane so relativne vrednosti med skupinami kodonov razdeljeni po kvaliteti. Kvaliteta kodona z vrednostjo 100 je naravnana za kodon z najvišjo frekvenco uporabe za določeno aminokislino.

Slika 5 prikazuje DNA zaporedje izuma, ki vsebuje na N-koncu histidinski vključek in je optimizirano zaporedje za pemizin. His vkliuček (dvojno podčrtana), TE V cepitveno mesto (italics) Pernizin kodonsko optimizirano (podpisano, italics), GST vkliuček (podpisano), MBP vključek (črtkano).

Slika 6 prikazuje DNA zaporedje izuma, ki vsebuje na N-koncu histidinski vključek, MBP vključek in optimizirano DNA zaporedje za pemizin. His vkliuček (dvojno podčrtana), TEV cepitveno mesto (italics) Pernizin kodonsko optimizirano (podpisano, italics), GST vkliuček (podpisano), MBP vključek (črtkano).

Slika 7 prikazuje DNA zaporedje izuma, ki vsebuje na N-koncu histidinski vključek, GST vključek in optimizirano DNA zaporedje za oemizin. Hi s vkliuček (dvojno podčrtana), TEV cepitveno mesto (italics) Pernizin kodonsko optimizirano (podpisano, italics), GST vkliuček (podpisano), MBP vk^uček (črtkano).

Podroben opis izuma

Heterologna produkcija rekombinantnih proteinov lahko predstavlja izziv zaradi regulatomih elementov, ki omejujejo izražanje ali pa zaradi redkih kodon, kateri so del tujih genov. Kadar se soočamo z nezadostno translacijo heterolognih proteinov, je ena izmed možnih strategij za odpravo problemov npr., dodatek ali zamenjava fuzijskega vključka (kot so GST, MBP, itd.). Posebej pomembna je pravilna izbira fuzijskega vključka, ker le-ta vpliva ne samo na skupno količino produkcije proteina, ampak ima vpliv tudi na, npr. topnost samega proteina, ki ga proizvajamo.

Druga strategija za produkcijo velikih količin heterolognih proteinov je z izbiro alternativnih gostiteljev, katere lahko izberemo tako, da imamo največjo usklajenost kodonske uporabe med organizmov iz katerega izhaja DNA zaporedje in gostiteljem. Drug pomemben faktor za visoko učinkovitost heterolognega izražanja je lahko sprememba signalnega zaporedja, katera pri velikem številu gostiteljev določa lokacijo izražanja, npr. lahko zagotovi bolj učinkovito izločanje proizvedenega proteina v periplazemski ali zunaj celični prostor. Drugi pogosti pristopi za izboljšanje heterolognega izražanja so poskusi optimiziranja gojišča in drugih parametrov gojenja. Drugi raziskovalci uporabljajo alternativne promotorje, kateri so ustreznejši za gostiteljski organizem v posebnem primeru. V redkih primerih se je heterologno izražanje povečalo z optimizacijo translacije DNA zaporedja, npr. z mestno specifično zamenjavo kodonov ali sintezo gena de novo. Kodonska optimizacija lahko vključuje odpravo sekundarnih struktur v zaporedju, katera ovirajo učinkovito translacijo. Drug ukrep za izboljšanje proizvodnje heterolognih proteinov je zamenjava kodonov, ki so redko uporabljani v gostiteljskem organizmu z takšnimi, ki so pogosteje. Degeneracija genetskega koda omogoča kodiranje posameznih aminokislin z večimi sinonimnimi kodoni. Pogostost uporabe posameznega kodona se lahko spreminja pri različnih organizmih. Medtem, ko je E. coli daleč najbolj uporabljan gostitelj za izražanje tujih genov, se včasih izkaže, da ni primeren gostitelj zaradi zelo različne rabe kodonov med tema dvema organizmoma. Ob heterolognem izražanju gena z neoptimalnimi kodoni v DNA zaporedju pride kot posledica do neučinkovite translacije in včasih tudi do zaustavitve translacije. Heterologno izražanje genov z redkimi kodoni verjetneje izprazni endogene rezerve analogniih tRNA, kar privede do inhibicije rasti, predčasne zaustavitve transkripcije in/ali translacije, zniža stabilnost mRNA in poveča spremembe bralnega okvirja z delecijami ali 8 napačno vgraditvijo nukleotida. Bilo je pokazano, da lahko izboljšamo heterologno ekspresijo v gostitelju z inženiringom tujih genov, tako da prilagodimo kodonsko sestavo ali pa dodamo dodatne kopije za zapis redkih tRNA genov. Rezultat zgoraj opisanih prilagoditev tehnik za izboljšanje izražanja heterolognih genov, vseeno ostaja večinoma nepredvidljiv. Težje je napovedati, ali bo katera izmed predlaganih tehnik, sama ali v kombinaciji, prispevala k zadovoljivem zvišanju stopnje produkcije in izplena heterolognega proteina. Ta nepredvidljivost je še posebej izpostavljena, kadar imamo opravka z izražanjem encimov iz hipertermofilov. Glede opisano stanje, so izumitelji nepričakovano našli rešitev v uporabi DNA zaporedja, ki je priloženo v izumu za proizvodnjo pemizina v E. coli in vodi do zelo zadovoljive produkcije proteina kot produkta z visokim izkoristkom in produktivnostjo. DNA zaporedje v predstavljenem izumu je prikazano na priloženem seznamu zaporedij pod oznako SEQ ID NOG. Kodira rekombinantno subtilizinu podobno preoteazo pemizin. Analogi navedenega zaporedja, ki se razlikujejo v enema ali večih kodonih, ki pa še vedno kodirajo rekombinantno proteazo, so del obsega izuma.

Kodirajoča regija gena za pemizin iz A. pernix obsega 1293 nukleotidov in je pod oznako SEQ ID NOG. Pemizin kodira zaporedje 430 aminokislin (SEQ ID NO:l). Inventivno zaporedje tega izuma je bilo razvito iz nativnega gena pemizina iz A. pernix z zamenjavo določenih kodonov z nizko pogostostjo z alternativnimi kodoni, ki pa jih gostitelj E. coli pogosteje uporablja, še vedno pa zapisujejo isto aminokislino. Ustvarjeno je bilo optimizirano DNA zaporedje, pemizincoE, kot ekspresijsko optimizirano zaporedje gena za mutant pemizina, pemizinCOS355AE. Kot kontrola je bilo uporabljeno nativno (neoptimizirano) DNA zaporedje.

Predložen izum pokriva analoge zaporedja navedenega v SEQ ID NOG, ki izhaja z zamenjanimi kodoni v inventivnem zaporedju z zamenjavo kodonov. Zamenjani kodoni, v skladu z izumom, so preferenčno vzeti iz tabele rabe kodonov za E. coli, ki je povzeta v Tabeli 1 spodaj. 9

Tabela 1

Aminokislina Kodon Aminokislina Kodon Alanin GCA Leucin TTA Alanin GCC Leucin TTG Alanin GCG Lizin AAA Alanin GCT Lizin AAG Arginin AGA Metionin AT G Arginin AGG Fenilalanin TTC Arginin C GA Arginin CGC Fenilalanin TTT Arginin CGG Prolin CCA Arginin CGT Prolin CCC Asparagin AAC Prolin CCG Asparagin AAT Prolin CCT Aspartat GAC Serin AGC Aspartat GAT Serin AGT Cistein TGC Serin TCA Cistein TGT Serin TCC Glutamat GAA Serin TCG Glutamat GAG Serin TCT Glutamin CAA Stop TAA Glutamin CAG Stop TAG Glicin GGA Stop TGA Glicin GGC Treonin ACA Glicin GGG Treonin ACC Glicin GGT Treonin ACG Histidin CAC Treonin ACT Histidin CAT Triptofan TGG Izolevcin ATA Tirozin TAC Izolevcin AT C Tirozin TAT Izolevcin ATT Valin GTA Levcin CTA Valin GTC Leucin CTC Valin GTG Leucin CTG Valin GTT Leucin CTT V obsegu izuma so zaporedja DNA, katera so izvedena z adicijo ali delecijo kodonov k ali iz zaporedja SEQ ID NO:3, npr., tripleti nukleotidov dodani ali odstranjeni k zaporedju SEQ ID NO:3 v okviru obstoječega bralnega okviija.

Rekombinanten ekspresijski vektor, katerega sestavlja optimizirana DNA pemizina v izumu, je lahko katerikoli vektor, kateri je ustreznejši za postopke tehnologije rekombinantne DNA in katerega izbira je pogojena z gostiteljem, v katerega se vnese. Tako je lahko vektor z avtonomnim podvajanjem ali vektor, ki se po vnosu v gostitelja vgradi in podvaja skupaj z gostiteljevim kromosomom(i).

Glede na izum, je kodirajoče DNA zaporedje za maltoza vezavni protein (MBP), lahko vključeno za povišanje topnosti rekombinantnega proteina. Pemizin se lahko izrazi kot MBP- 10

fuzijski protein, ki se je izkazal ugodno za preprečevanje agregacije pemizina. MBP omogoča enostavnejše čiščenje, ker služi kot afinitetni vključek. Fuzijski protein se veže na kolono iz amiloze, medtem ko se preostali proteini sperejo čez kolono. MBP-fuzijski protein lahko speremo s kolone z raztopino maltose. MBP-vključek ugodno vpliva na samo topnost pemizina. V E. coli ekspresijskem sistemu lahko uporabimo ekspresijske vektoije osnovane na različnih komercialnih vektorjih (npr. pET). Ekspresijski vektorji imajo inducibilne ali konstituivne promotorje (npr. Ρχ7, Piac)· Promotor je lahko katerokoli DNA zaporedje, ki je povezano s kodirajočim DNA zaporedjem za pemizin in izkazuje transkripcijsko aktivnost. Ekspresijski vektor lahko sestavlja tudi terminator transkripcije, selekcijski označevalec, dodatna DNA zaporedja vključkov (npr. Histidin-, GST-vključek). Histidinski vključek lahko uporabimo za enostavnejše čiščenje in lažjo detekcijo pemizina. V ekspresijske vektoije so lahko vstavljeni kodirajoči geni, ki predstavljajo pemizin, pemizincoE in pemizincos355AE.

Zaporedja izuma so predstavljena v priloženem seznamu zaporedij. SEQ ID NO: 1 je divji tip A. pernix aminokislinskega zaporedja za pemizin (Uniprot ime: APE 0263.1; EMBL ime: BAA79178.2; start kodon odstranjen; * stop kodon): GTKIAAIAIA LIFILPLFPV YTGSAAGAST VVIAKINPEE FNPKAVEALQ GKVIYVADLA PVAIISIPGK AVGLLSKLPG VVSVSEDGVV QAMAKPPWAG GGNKSQPAEV LPWGVDYIDA ELVWPDGVTG WVDVNGDGDG EIEVAVIDTG VDKDHPDLAG NIVWGISVLN GRISSNYQDR NGHGTHVTGT VAAIDNDIGV IGVAHSVEIY AVKALGNGGY GSMSDLIIAI DLAVKGPDGV IDADGDGVVA GDPDDDAPEV ISMSLGGSSP PPELHDVIKA AYNLGITIVA AAGNDGADSP SYPAAYPEVI AVGAIDENGN VPSWSNRNPE VAAPGVNILS TYPDDTYEEL SGTSMATPHV SGTVALIQAA RLAAGLPLLP PGSESDTTPD TVRGVLHTTA TDAGDPGYDS LYGYGIIDAY DAVQTAVSS* SEQ ID NO:2 je divji tip DNA zaporedja za pemizin: gtgggaacta agatcgcggc tattgcgatc gcgctgatct tcattctgcc tctcttccct gtttatacgg gatcggcggc tggggctagc acggttgtga tagctaagat taatcctgag gagtttaacc ctaaggcggt ggaggctctt cagggcaagg taatatatgt tgctgatctg gcccccgttg ctataattag cataccagga aaggctgtag gcctgctctc taaactacct ggtgttgtca gcgtttccga ggacggcgtg gtccaggcta tggccaagcc gccgtgggct ggcggcggga ataagtctca gcctgccgag gtcctgcctt ggggtgtcga ctatatcgat gccgagctag tatggcccga tggggttacc ggctgggttg acgttaacgg tgacggggac ggcgagatag aggttgccgt tattgacact ggtgtcgata aggaccatcc cgaccttgca ggcaacattg tctgggggat atctgttttg aacggcagga tatcctccaa ctaccaggat agaaacggcc acggtacaca cgtaacgggc actgtagccg ccatagacaa cgatataggg gtgatagggg ttgcacacag cgtggagatc tacgccgtta aagctctcgg taacgggggt tacggcagct ggagcgacct tataatagct atagaccttg ctgtgaaggg gccggacggc gtaattgacg ctgatggaga tggcgtcgtc gctggggatc cagacgatga tgctccagag gttatctcca tgagcctagg tgggagcagc ccaccaccag aactccacga cgttatcaag gcggcgtaca accttggaat aactattgtc gcagcagcgg gtaacgacgg ggcggacagc ccctcatacc ctgcagccta ccctgaggta atagcggtag gcgctataga cgagaacggc aacgtaccta gctggagcaa tagaaaccct gaggttgctg cacctggagt gaacatacta 11 agcacctacc ccgacgatac gtgtcaggga ctgtggctct cctccgggaa gcgagagtga gctactgacg cgggagaccc tatgacgccg tgcagactgc ctatgaggag ctgagcggca aatacaggct gccaggctgg cactactcca gacaccgtga aggctacgat agcctgtatg cgtctcaagc tga ctagcatggc gactccacac ccgctggcct ccctctactc ggggcgtact gcatactact gatacggtat catagacgcc SEQ ID NO:3 je optimizirano DNA zaporedje za pemizin in del izuma: ggta ccggtctaca gaagaattta ctggcgccgg ccgggcgtcg gccggcggtg gacgcagaac gatggtgaaa gcaggcaaca gatcgcaatg ggcgtcatcg ggctacggta ggtgttatcg gaagtgatta aaagcagctt tcaccgtcgt ggtaatgtgc ctgagtacct catgtttccg ctgccgccgg accgcaaccg gcctacgacg cgaaaatcgc cgggctctgc atccgaaagc tggccattat tgtcagtttc gcaacaaatc tggtctggcc ttgaagttgc ttgtttgggg gccatggtac gtgtggcgca gctggtctga acgcagatgg gtatgagcct ataacctggg atccggctgc cgagctggtc atccggacga gtaccgttgc gtagtgaatc atgctggtga ctgtccaaac cgctatcgct tgctggtgct cgtggaagcg cagcatcccg ggaagatggt tcaaccggca ggatggtgtg cgtcatcgat tatcagtgtc ccatgtcacc cagcgtggaa tctgattatc cgacggtgtg gggcggcagc tattaccatc gtacccggaa taaccgtaat tacgtacgaa cctgatccag cgataccacc cccgggttac ggctgtctcc atcgctctga agcaccgtgg ctgcaaggca ggcaaagccg gttgtccagg gaagtgctgc accggttggg acgggtgtgg ctgaatggcc ggtaccgtgg atctatgcag gcgattgacc gttgctggcg agcccgccgc gttgcggccg gttattgcgg ccggaagtcg gaactgtcag gctgcccgtc ccggacaccg gatagcctgt agttga tctttatcct ttattgcgaa aagtgattta ttggtctgct ctatggccaa cgtggggcgt ttgacgtgaa acaaagatca gtattagctc ccgcaattga ttaaagctct tggccgtgaa atccggatga cggaactgca caggcaatga tcggcgccat ccgcaccggg gcacctcgat tggccgcagg tgcgcggtgt atggttacgg gccgctgttc aatcaacccg tgttgctgat gtctaaactg accgccatgg tgattatatt tggtgacggc tccggacctg taactaccaa caacgatatt gggcaatggt aggcccggat cgatgcgccg tgatgtgatc tggtgccgac cgatgaaaac cgttaacatt ggctacgccg cctgccgctg tctgcatacc cattattgac SEQ ID NO:4 predstavlja vključek His:

C AC C AT C AT C AT C AT C AT SEQ ID NO:5 zapis za restrikcijsko mesto virusa jedkanja tobaka (TEV):

GAGAACCTGTACTTCCAATCC SEQ ID NO:6 zapis za vključek glutation-S-transferazo (GST):

CCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAA

AATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAAGGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTT

CCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGTTAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAA

GCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGAT

ACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGACTTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATG

CTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAAAACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTT

GTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAA

AACGTATTGAAGGTATCCCACAAATTGATAAGTACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGG

CAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCCAAAATCGGATGATTACCCAGATCTGGGTACC 12

SEQ ID N0:7 zapis za vključek maltoza vezalni protein (ΜΒΡ):

AAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTA

AGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTT

GCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTT

GGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCA

AGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAA

ACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGA

ACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTA

AAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATG

AATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTG

GGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCA

AACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAA

AACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTA

CGAGGAAGAGTTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACCATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACA

TCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGAT

GAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTGATTACGATATCCCAGGTACC SEQ ID NO:8 je zapis za domena za restrikcijsko mesto:

TCTTCTGGTGTAGATCTGGGTACC SEQ ID NO:9 je zaporedje glede na izum, ki ga sestavlja optmizirano zaporedje DNA pemizina z N-končnim histidinskim vključkom in restrikcijskim mestom za TEV:

ATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTGTAGATCTGGGTACCGAGAACCTGTACTTCCAATCCAAT GGTA CGAAAATCGC CGCTATCGCT ATCGCTCTGA TCTTTATCCT GCCGCTGTTC CCGGTCTACA CGGGCTCTGC TGCTGGTGCT AGCACCGTGG TTATTGCGAA AATCAACCCG GAAGAATTTA ATCCGAAAGC

CGTGGAAGCG CTGCAAGGCA AAGTGATTTA TGTTGCTGAT CTGGCGCCGG TGGCCATTAT CAGCATCCCG

GGCAAAGCCG TTGGTCTGCT GTCTAAACTG CCGGGCGTCG TGTCAGTTTC GGAAGATGGT GTTGTCCAGG

CTATGGCCAA ACCGCCATGG GCCGGCGGTG GCAACAAATC TCAACCGGCA GAAGTGCTGC CGTGGGGCGT

TGATTATATT GACGCAGAAC TGGTCTGGCC GGATGGTGTG ACCGGTTGGG TTGACGTGAA TGGTGACGGC

GATGGTGAAA TTGAAGTTGC CGTCATCGAT ACGGGTGTGG ACAAAGATCA TCCGGACCTG GCAGGCAACA

TTGTTTGGGG TATCAGTGTC CTGAATGGCC GTATTAGCTC TAACTACCAA GATCGCAATG GCCATGGTAC

CCATGTCACC GGTACCGTGG CCGCAATTGA CAACGATATT GGCGTCATCG GTGTGGCGCA CAGCGTGGAA

ATCTATGCAG TTAAAGCTCT GGGCAATGGT GGCTACGGTA GCTGGTCTGA TCTGATTATC GCGATTGACC

TGGCCGTGAA AGGCCCGGAT GGTGTTATCG ACGCAGATGG CGACGGTGTG GTTGCTGGCG ATCCGGATGA

CGATGCGCCG GAAGTGATTA GTATGAGCCT GGGCGGCAGC AGCCCGCCGC CGGAACTGCA TGATGTGATC

AAAGCAGCTT ATAACCTGGG TATTACCATC GTTGCGGCCG CAGGCAATGA TGGTGCCGAC TCACCGTCGT

ATCCGGCTGC GTACCCGGAA GTTATTGCGG TCGGCGCCAT CGATGAAAAC GGTAATGTGC CGAGCTGGTC

TAACCGTAAT CCGGAAGTCG CCGCACCGGG CGTTAACATT CTGAGTACCT ATCCGGACGA TACGTACGAA

GAACTGTCAG GCACCTCGAT GGCTACGCCG CATGTTTCCG GTACCGTTGC CCTGATCCAG GCTGCCCGTC

TGGCCGCAGG CCTGCCGCTG CTGCCGCCGG GTAGTGAATC CGATACCACC CCGGACACCG TGCGCGGTGT

TCTGCATACC ACCGCAACCG ATGCTGGTGA CCCGGGTTAC GATAGCCTGT ATGGTTACGG CATTATTGAC

GCCTACGACG CTGTCCAAAC GGCTGTCTCC AGT TGA ATT SEQ ID NO: 10 je zaporedje glede na izum, ki ga sestavlja optmizirano zaporedje DNA pemizina z N-končnim histidinskim vključkom, vključkom MBP in restrikcij skim mestom za TEV: 13

ATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTGTAGATCTGGGTACCGAGAACCTGTACTTCCAATCCAAT GGTA CGAAAATCGC CGCTATCGCT ATCGCTCTGA TCTTTATCCT GCCGCTGTTC CCGGTCTACA CGGGCTCTGC TGCTGGTGCT AGCACCGTGG TTATTGCGAA AATCAACCCG GAAGAATTTA ATCCGAAAGC CGTGGAAGCG CTGCAAGGCA AAGTGATTTA TGTTGCTGAT CTGGCGCCGG TGGCCATTAT CAGCATCCCG GGCAAAGCCG TTGGTCTGCT GTCTAAACTG CCGGGCGTCG TGTCAGTTTC GGAAGATGGT GTTGTCCAGG CTATGGCCAA ACCGCCATGG GCCGGCGGTG GCAACAAATC TCAACCGGCA GAAGTGCTGC CGTGGGGCGT TGATTATATT GACGCAGAAC TGGTCTGGCC GGATGGTGTG ACCGGTTGGG TTGACGTGAA TGGTGACGGC GATGGTGAAA TTGAAGTTGC CGTCATCGAT ACGGGTGTGG ACAAAGATCA TCCGGACCTG GCAGGCAACA TTGTTTGGGG TATCAGTGTC CTGAATGGCC GTATTAGCTC TAACTACCAA GATCGCAATG GCCATGGTAC CCATGTCACC GGTACCGTGG CCGCAATTGA CAACGATATT GGCGTCATCG GTGTGGCGCA CAGCGTGGAA ATCTATGCAG TTAAAGCTCT GGGCAATGGT GGCTACGGTA GCTGGTCTGA TCTGATTATC GCGATTGACC TGGCCGTGAA AGGCCCGGAT GGTGTTATCG ACGCAGATGG CGACGGTGTG GTTGCTGGCG ATCCGGATGA CGATGCGCCG GAAGTGATTA GTATGAGCCT GGGCGGCAGC AGCCCGCCGC CGGAACTGCA TGATGTGATC AAAGCAGCTT ATAACCTGGG TATTACCATC GTTGCGGCCG CAGGCAATGA TGGTGCCGAC TCACCGTCGT ATCCGGCTGC GTACCCGGAA GTTATTGCGG TCGGCGCCAT CGATGAAAAC GGTAATGTGC CGAGCTGGTC TAACCGTAAT CCGGAAGTCG CCGCACCGGG CGTTAACATT CTGAGTACCT ATCCGGACGA TACGTACGAA GAACTGTCAG GCACCTCGAT GGCTACGCCG CATGTTTCCG GTACCGTTGC CCTGATCCAG GCTGCCCGTC TGGCCGCAGG CCTGCCGCTG CTGCCGCCGG GTAGTGAATC CGATACCACC CCGGACACCG TGCGCGGTGT TCTGCATACC ACCGCAACCG ATGCTGGTGA CCCGGGTTAC GATAGCCTGT ATGGTTACGG CATTATTGAC GCCTACGACG CTGTCCAAAC GGCTGTCTCC AGT TGA ATT SEQ ID N0:11 je zaporedje glede na izum, ki ga sestavlja optmizirano zaporedje DNA pemizina z N-končnim histidinskim vključkom, vključkom GST in restrikcijskim mestom za TEV:

ATGCACCATCATCATCATCATTCTTCTGGTGTAGATCTGATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGG GCCTTGTGCAACCCACTCGACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGATGAA GGTGATAAATGGCGAAACAAAAAGTTTGAATTGGGTTTGGAGTTTCCCAATCTTCCTTATTATATTGATGGTGATGT TAAATTAACACAGTCTATGGCCATCATACGTTATATAGCTGACAAGCACAACATGTTGGGTGGTTGTCCAAAAGAGC GTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCGAGAATTGCATATAGTAAAGAC TTTGAAACTCTCAAAGTTGATTTTCTTAGCAAGCTACCTGAAATGCTGAAAATGTTCGAAGATCGTTTATGTCATAA AACATATTTAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGTTGTTTTATACATGG ACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTTTAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAAATTGATAAG TACTTGAAATCCAGCAAGTATATAGCATGGCCTTTGCAGGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTGGTGGCGACCATCCTCC AAAATCGGATGATTACCCAGATCTGGGTACCGAGAACCTGTACTTCCAATCCAAT GGTA CGAAAATCGC CGCTATCGCT ATCGCTCTGA TCTTTATCCT GCCGCTGTTC CCGGTCTACA CGGGCTCTGC TGCTGGTGCT

AGCACCGTGG TTATTGCGAA AATCAACCCG GAAGAATTTA ATCCGAAAGC CGTGGAAGCG CTGCAAGGCA

AAGTGATTTA TGTTGCTGAT CTGGCGCCGG TGGCCATTAT CAGCATCCCG GGCAAAGCCG TTGGTCTGCT

GTCTAAACTG CCGGGCGTCG TGTCAGTTTC GGAAGATGGT GTTGTCCAGG CTATGGCCAA ACCGCCATGG

GCCGGCGGTG GCAACAAATC TCAACCGGCA GAAGTGCTGC CGTGGGGCGT TGATTATATT GACGCAGAAC

TGGTCTGGCC GGATGGTGTG ACCGGTTGGG TTGACGTGAA TGGTGACGGC GATGGTGAAA TTGAAGTTGC

CGTCATCGAT ACGGGTGTGG ACAAAGATCA TCCGGACCTG GCAGGCAACA TTGTTTGGGG TATCAGTGTC

CTGAATGGCC GTATTAGCTC TAACTACCAA GATCGCAATG GCCATGGTAC CCATGTCACC GGTACCGTGG

CCGCAATTGA CAACGATATT GGCGTCATCG GTGTGGCGCA CAGCGTGGAA ATCTATGCAG TTAAAGCTCT

GGGCAATGGT GGCTACGGTA GCTGGTCTGA TCTGATTATC GCGATTGACC TGGCCGTGAA AGGCCCGGAT

GGTGTTATCG ACGCAGATGG CGACGGTGTG GTTGCTGGCG ATCCGGATGA CGATGCGCCG GAAGTGATTA

GTATGAGCCT GGGCGGCAGC AGCCCGCCGC CGGAACTGCA TGATGTGATC AAAGCAGCTT ATAACCTGGG

TATTACCATC GTTGCGGCCG CAGGCAATGA TGGTGCCGAC TCACCGTCGT ATCCGGCTGC GTACCCGGAA

GTTATTGCGG TCGGCGCCAT CGATGAAAAC GGTAATGTGC CGAGCTGGTC TAACCGTAAT CCGGAAGTCG

CCGCACCGGG CGTTAACATT CTGAGTACCT ATCCGGACGA TACGTACGAA GAACTGTCAG GCACCTCGAT

GGCTACGCCG CATGTTTCCG GTACCGTTGC CCTGATCCAG GCTGCCCGTC TGGCCGCAGG CCTGCCGCTG

CTGCCGCCGG GTAGTGAATC CGATACCACC CCGGACACCG TGCGCGGTGT TCTGCATACC ACCGCAACCG

ATGCTGGTGA CCCGGGTTAC GATAGCCTGT ATGGTTACGG CATTATTGAC GCCTACGACG CTGTCCAAAC

GGCTGTCTCC AGT TGAATT • · 14

Izum je nadalje opisan v priloženih opisih primerov.

Primeri

Ekspresija proteina

Celice E. coli (BL21(DE3)) z vstavljenim ekspresijskim vektoijem in DNA zaporedjem, ki je del izuma, so bile inducirane in rekombinanten protein s histidinskom vključkom pridobljen iz supematanta lizirane kulture v eni, dveh, treh in štirih urah po indukciji. Posamezne vzorce smo preverili z imonodetekcijskimi metodami. Najboljši izkoristek pemizina je bil dosežen v treh ali štirih urah po indukciji z IPTG (Slika3).

Izolacija rehombinantnega pemizina

Tako pridobljen proteinski produkt pemizinacoE in pemizinaCOS355AE smo očistili z velikostno izključitveno in Ni2+-afinitetno kromatografijo. Histidinski vključek smo odstranili s proteazo TEV in očiščen rekombinanten pemizin uporabili za nadaljne eksperimente.

Detekcija rekombinantne oblike pemizina

Identiteta rekombinantnega pemizinacoE je potrjena z MS/MS in določitvijo N-končnega aminikislinskega zaporedja. NaDS-PAGE prikazuje da se rekombinanten pemizin izraža pri Mr 52 kDa. Izražanje je bilo uspešno samo z uporabo optimiziranega zaporedja za pemizin, pemizin E in pemizin E, medtem ko se kontrolno nativno zaporedje ni izrazilo (Slika 3). Nadaljni eksperimenti z uporabo cimografije so pokazali, da se je pemizincoE izrazil v večinsko neaktivni obliki pri Mr 52 kDa. Neaktivna oblika se med temperaturnim segrevanjem avtoaktivira s proteolitično cepitvijo, pri kateri dobimo aktivni obliki pemizina pri Mr 27 kDa in 36 kDa. in tako aktivira. Mutacija S355A (pemizinCOS355AE) se odrazi v popolni izgubi proteolitične sposobnosti (Slika 1 B). • ·

LISTA ZAPOREDIJ

<210> 1 <211> 429 <212> PRT <213> Aeropyrum pernix <400> 1

Gly Thr Lys Ile Ala Ala Ile Ala Ile Ala Leu Ile Phe Ile Leu Pro 15 10 15

Leu Phe Pro Val Tyr Thr Gly Ser Ala Ala Gly Ala Ser Thr Val Val 20 25 30

Ile Ala Lys Ile Asn Pro Glu Glu Phe Asn Pro Lys Ala Val Glu Ala 35 40 45

Leu Gin Gly Lys Val Ile Tyr Val Ala Asp Leu Ala Pro Val Ala Ile 50 55 60

Ile Ser Ile Pro Gly Lys Ala Val Gly Leu Leu Ser Lys Leu Pro Gly 65 70 75 80

Val Val Ser Val Ser Glu Asp Gly Val Val Gin Ala Met Ala Lys Pro 85 90 95

Pro Trp Ala Gly Gly Gly Asn Lys Ser Gin Pro Ala Glu Val Leu Pro 100 105 110

Trp Gly Val Asp Tyr Ile Asp Ala Glu Leu Val Trp Pro Asp Gly Val 115 120 125

Thr Gly Trp Val Asp Val Asn Gly Asp Gly Asp Gly Glu Ile Glu Val 130 135 140

Ala Val Ile Asp Thr Gly Val Asp Lys Asp His Pro Asp Leu Ala Gly 145 150 155 160

Asn Ile Val Trp Gly Ile Ser Val Leu Asn Gly Arg Ile Ser Ser Asn 165

Tyr Gin Asp Arg Asn Gly His 180 Ala Ile Asp Asn Asp Ile Gly 195 Ile Tyr Ala Val Lys Ala Leu 210 215 Asp Leu Ile Ile Ala Ile Asp 225 230 Ile Asp Ala Asp Gly Asp Gly 245 Ala Pro Glu Val Ile Ser Met 260 Glu Leu His Asp Val Ile Lys 275 Val Ala Ala Ala Gly Asn Asp 290 295 Ala Tyr Pro Glu Val Ile Ala 305 310 Val Pro Ser Trp Ser Asn Arg 325 Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Pro Β40

Thr His Val Thr Gly Thr Val Ala 185 190

Ile Gly Val Ala His Ser Val Glu 205

Asn Gly Gly Tyr Gly Ser Trp Ser 220

Ala Val Lys Gly Pro Asp Gly Val 235 240

Val Ala Gly Asp Pro Asp Asp Asp 250 255

Leu Gly Gly Ser Ser Pro Pro Pro 265 270

Ala Tyr Asn Leu Gly Ile Thr Ile 285

Ala Asp Ser Pro Ser Tyr Pro Ala 300

Gly Ala Ile Asp Glu Asn Gly Asn 315 320

Pro Glu Val Ala Ala Pro Gly Val 330 335

Asp Thr Tyr Glu Glu Leu Ser Gly 345 350

Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Thr Val Ala Leu Ile Gin 355 360 365 Αία Αία Arg Leu Αία Αία Gly Leu Pro Leu Leu 370 375

Pro Pro Gly Ser Glu 380

Ser Asp Thr Thr Pro Asp Thr Val Arg Gly Val 385 390 395

Leu His Thr Thr Ala 400

Thr Asp Ala Gly Asp Pro Gly Tyr Asp Ser Leu 405 410

Tyr Gly Tyr Gly Ile 415

Ile Asp Ala Tyr Asp Ala Val Gin Thr Ala Val Ser Ser 425 420

<210> 2 <211> 1293 <212> DNA <213> Aeropyrum pernix <400> 2 gtgggaacta agatcgcggc tattgcgatc gcgctgatct tcattctgcc tctcttccct 60 gtttatacgg gatcggcggc tggggctagc acggttgtga tagctaagat taatcctgag 120 gagtttaacc ctaaggcggt ggaggctctt cagggcaagg taatatatgt tgctgatctg 180 gcccccgttg ctataattag cataccagga aaggctgtag gcctgctctc taaactacct 240 ggtgttgtca gcgtttccga ggacggcgtg gtccaggcta tggccaagcc gccgtgggct 300 ggcggcggga ataagtctca gcctgccgag gtcctgcctt ggggtgtcga ctatatcgat 360 gccgagctag tatggcccga tggggttacc ggctgggttg acgttaacgg tgacggggac 420 ggcgagatag aggttgccgt tattgacact ggtgtcgata aggaccatcc cgaccttgca 480 ggcaacattg tctgggggat atctgttttg aacggcagga tatcctccaa ctaccaggat 540 agaaacggcc acggtacaca cgtaacgggc actgtagccg ccatagacaa cgatataggg 600 gtgatagggg ttgcacacag cgtggagatc tacgccgtta aagctctcgg taacgggggt 660 tacggcagct ggagcgacct tataatagct atagaccttg ctgtgaaggg gccggacggc 720 gtaattgacg ctgatggaga tggcgtcgtc gctggggatc cagacgatga tgctccagag 780 gttatctcca tgagcctagg tgggagcagc ccaccaccag aactccacga cgttatcaag 840 gcggcgtaca accttggaat aactattgtc gcagcagcgg gtaacgacgg ggcggacagc 900 ccctcatacc ctgcagccta ccctgaggta atagcggtag gcgctataga cgagaacggc 960 aacgtaccta gctggagcaa tagaaaccct gaggttgctg cacctggagt gaacatacta 1020 agcacctacc ccgacgatac ctatgaggag ctgagcggca ctagcatggc gactccacac 1080 gtgtcaggga ctgtggctct aatacaggct gccaggctgg ccgctggcct ccctctactc 1140 cctccgggaa gcgagagtga cactactcca gacaccgtga ggggcgtact gcatactact 1200 gctactgacg cgggagaccc aggctacgat agcctgtatg gatacggtat catagacgcc 1260 tatgacgccg tgcagactgc cgtctcaagc tga 1293

<210> 3 <211> 1290 <212> DNA <213> Umetno zaporedje <222» <223> optimizirano DNA zaporedje <400> 3 ggtacgaaaa tcgccgctat cgctatcgct ctgatcttta tcctgccgct gttcccggtc 60 tacacgggct ctgctgctgg tgctagcacc gtggttattg cgaaaatcaa cccggaagaa 120 tttaatccga aagccgtgga agcgctgcaa ggcaaagtga tttatgttgc tgatctggcg 180 ccggtggcca ttatcagcat cccgggcaaa gccgttggtc tgctgtctaa actgccgggc 240 gtcgtgtcag tttcggaaga tggtgttgtc caggctatgg ccaaaccgcc atgggccggc 300 ggtggcaaca aatctcaacc ggcagaagtg ctgccgtggg gcgttgatta tattgacgca 360 gaactggtct ggccggatgg tgtgaccggt tgggttgacg tgaatggtga cggcgatggt 420 gaaattgaag ttgccgtcat cgatacgggt gtggacaaag atcatccgga cctggcaggc 480 aacattgttt ggggtatcag tgtcctgaat ggccgtatta gctctaacta ccaagatcgc 540 aatggccatg gtacccatgt caccggtacc gtggccgcaa ttgacaacga tattggcgtc 600 atcggtgtgg cgcacagcgt ggaaatctat gcagttaaag ctctgggcaa tggtggctac 660 ggtagctggt ctgatctgat tatcgcgatt gacctggccg tgaaaggccc ggatggtgtt 720 780 atcgacgcag atggcgacgg tgtggttgct ggcgatccgg atgacgatgc gccggaagtg attagtatga gcctgggcgg cagcagcccg ccgccggaac tgcatgatgt gatcaaagca 840 gcttataacc tgggtattac catcgttgcg gccgcaggca atgatggtgc cgactcaccg 900 tcgtatccgg ctgcgtaccc ggaagttatt gcggtcggcg ccatcgatga aaacggtaat 960 gtgccgagct ggtctaaccg taatccggaa gtcgccgcac cgggcgttaa cattctgagt 1020 acctatccgg acgatacgta cgaagaactg tcaggcacct cgatggctac gccgcatgtt 1080 tccggtaccg ttgccctgat ccaggctgcc cgtctggccg caggcctgcc gctgctgccg 1140 ccgggtagtg aatccgatac caccccggac accgtgcgcg gtgttctgca taccaccgca 1200 accgatgctg gtgacccggg ttacgatagc ctgtatggtt acggcattat tgacgcctac 1260 gacgctgtcc aaacggctgt ctccagttga 1290

<210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Umetno zaporedje <220> <223> His rep <400> 4 caccatcatc atcatcat 18

<210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Umetno zaporedje <220> <223> TEV cepitveno mesto <400> 5 gagaacctgt acttccaatc c 21 <210> 6 <211> 675 <212> DNA <213> Umetno zaporedje <220> <223> GST oznaka <400> 6 cctatactag gttattggaa aattaagggc cttgtgcaac ccactcgact tcttttggaa 60 tatcttgaag aaaaatatga agagcatttg tatgagcgcg atgaaggtga taaatggcga 120 aacaaaaagt ttgaattggg tttggagttt cccaatcttc cttattatat tgatggtgat 180 gttaaattaa cacagtctat ggccatcata cgttatatag ctgacaagca caacatgttg 240 ggtggttgtc caaaagagcg tgcagagatt tcaatgcttg aaggagcggt tttggatatt 300 agatacggtg tttcgagaat tgcatatagt aaagactttg aaactctcaa agttgatttt 360 cttagcaagc tacctgaaat gctgaaaatg ttcgaagatc gtttatgtca taaaacatat 420 ttaaatggtg atcatgtaac ccatcctgac ttcatgttgt atgacgctct tgatgttgtt 480 ttatacatgg acccaatgtg cctggatgcg ttcccaaaat tagtttgttt taaaaaacgt 540 attgaagcta tcccacaaat tgataagtac ttgaaatcca gcaagtatat agcatggcct 600 ttgcagggct ggcaagccac gtttggtggt ggcgaccatc ctccaaaatc ggatgattac 660 ccagatctgg gtacc 675

<210> 7 <211> 1119 <212> DNA <213> Umetno zaporedje <220> <223> MBP oznaka <400> 7 aaaatcgaag aaggtaaact ggtaatctgg attaacggcg ataaaggcta taacggtctc 60 gctgaagtcg gtaagaaatt cgagaaagat accggaatta aagtcaccgt tgagcatccg 120 gataaactgg aagagaaatt cccacaggtt gcggcaactg gcgatggccc tgacattatc 180 ttctgggcac acgaccgctt tggtggctac gctcaatctg gcctgttggc tgaaatcacc 240 ccggacaaag cgttccagga caagctgtat ccgtttacct gggatgccgt acgttacaac 300 ggcaagctga ttgcttaccc gatcgctgtt gaagcgttat cgctgattta taacaaagat 360 ctgctgccga acccgccaaa aacctgggaa gagatcccgg cgctggataa agaactgaaa 420 gcgaaaggta agagcgcgct gatgttcaac ctgcaagaac cgtacttcac ctggccgctg 480 attgctgctg acgggggtta tgcgttcaag tatgaaaacg gcaagtacga cattaaagac 540 gtgggcgtgg ataacgctgg cgcgaaagcg ggtctgacct tcctggttga cctgattaaa 600 aacaaacaca tgaatgcaga caccgattac tccatcgcag aagctgcctt taataaaggc 660 gaaacagcga tgaccatcaa cggcccgtgg gcatggtcca acatcgacac cagcaaagtg 720 aattatggtg taacggtact gccgaccttc aagggtcaac catccaaacc gttcgttggc 780 gtgctgagcg caggtattaa cgccgccagt ccgaacaaag agctggcaaa agagttcctc 840 gaaaactatc tgctgactga tgaaggtctg gaagcggtta ataaagacaa accgctgggt 900 gccgtagcgc tgaagtctta cgaggaagag ttggcgaaag atccacgtat tgccgccacc 960 atggaaaacg cccagaaagg tgaaatcatg ccgaacatcc cgcagatgtc cgctttctgg 1020 tatgccgtgc gtactgcggt gatcaacgcc gccagcggtc gtcagactgt cgatgaagcc 1080 ctgaaagacg cgcagactga ttacgatatc ccaggtacc 1119

<210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Umetno zaporedje <220> <223> poliklonsko restrikcijsko mesto <400> 8 tcttctggtg tagatctggg tace 24

<210> 9 <211> 1362 <212> DNA <213> Umetno zaporedje <220> <223> optimizirano DNA zaporedje pernizina s His repom in TEV cepitvenim mestom na N-koncu <400> 9 atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt gtagatctgg gtaccgagaa cctgtacttc 60 caatccaatg gtacgaaaat cgccgctatc gctatcgctc tgatctttat cctgccgctg 120 ttcccggtct acacgggctc tgctgctggt gctagcaccg tggttattgc gaaaatcaac 180 ccggaagaat ttaatccgaa agccgtggaa gcgctgcaag gcaaagtgat ttatgttgct 240 gatctggcgc cggtggccat tatcagcatc ccgggcaaag ccgttggtct gctgtctaaa 300 ctgccgggcg tcgtgtcagt ttcggaagat ggtgttgtcc aggctatggc caaaccgcca 360 tgggccggcg gtggcaacaa atctcaaccg gcagaagtgc tgccgtgggg cgttgattat 420 attgacgcag aactggtctg gccggatggt gtgaccggtt gggttgacgt gaatggtgac 480 ggcgatggtg aaattgaagt tgccgtcatc gatacgggtg tggacaaaga tcatccggac 540 ctggcaggca acattgtttg gggtatcagt gtcctgaatg gccgtattag ctctaactac 600 caagatcgca atggccatgg tacccatgtc accggtaccg tggccgcaat tgacaacgat 660 attggcgtca tcggtgtggc gcacagcgtg gaaatctatg cagttaaagc tctgggcaat 720 ggtggctacg gtagctggtc tgatctgatt atcgcgattg acctggccgt gaaaggcccg 780 gatggtgtta tcgacgcaga tggcgacggt gtggttgctg gcgatccgga tgacgatgcg 840 ccggaagtga ttagtatgag cctgggcggc agcagcccgc cgccggaact gcatgatgtg 900 atcaaagcag cttataacct gggtattacc atcgttgcgg ccgcaggcaa tgatggtgcc 960 gactcaccgt cgtatccggc tgcgtacccg gaagttattg cggtcggcgc catcgatgaa 1020 aacggtaatg tgccgagctg gtctaaccgt aatccggaag tcgccgcacc gggcgttaac 1080 attctgagta cctatccgga cgatacgtac gaagaactgt caggcacctc gatggctacg 1140 ccgcatgttt ccggtaccgt tgccctgatc caggctgccc gtctggccgc aggcctgccg 1200 ctgctgccgc cgggtagtga atccgatacc accccggaca ccgtgcgcgg tgttctgcat 1260 accaccgcaa ccgatgctgg tgacccgggt tacgatagcc tgtatggtta cggcattatt 1320 gacgcctacg acgctgtcca aacggctgtc tccagttgaa tt 1362

<210> 10 <211> 2481 <212> DNA <213> Umetno zaporedje <220> <223> optimizirano DNA zaporedje pernizina z MBP oznako in TEV cepitvenim mestom na N-koncu <400> 10 atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt gtagatctgg gtaccaaaat cgaagaaggt 60 aaactggtaa tctggattaa cggcgataaa ggctataacg gtctcgctga agtcggtaag 120 aaattcgaga aagataccgg aattaaagtc accgttgagc atccggataa actggaagag 180 aaattcccac aggttgcggc aactggcgat ggccctgaca ttatcttctg ggcacacgac 240 cgctttggtg gctacgctca atctggcctg ttggctgaaa tcaccccgga caaagcgttc 300 caggacaagc tgtatccgtt tacctgggat gccgtacgtt acaacggcaa gctgattgct 360 tacccgatcg ctgttgaagc gttatcgctg atttataaca aagatctgct gccgaacccg 420 ccaaaaacct gggaagagat cccggcgctg gataaagaac tgaaagcgaa aggtaagagc 480 gcgctgatgt tcaacctgca agaaccgtac ttcacctggc cgctgattgc tgctgacggg 540 ggttatgcgt tcaagtatga aaacggcaag tacgacatta aagacgtggg cgtggataac 600 gctggcgcga aagcgggtct gaccttcctg gttgacctga ttaaaaacaa acacatgaat 660 gcagacaccg attactccat cgcagaagct gcctttaata aaggcgaaac agcgatgacc 720 atcaacggcc cgtgggcatg gtccaacatc gacaccagca aagtgaatta tggtgtaacg 780 gtactgccga ccttcaaggg tcaaccatcc aaaccgttcg ttggcgtgct gagcgcaggt 840 attaacgccg ccagtccgaa caaagagctg gcaaaagagt tcctcgaaaa ctatctgctg 900 actgatgaag gtctggaagc ggttaataaa gacaaaccgc tgggtgccgt agcgctgaag 960 tcttacgagg aagagttggc gaaagatcca cgtattgccg ccaccatgga aaacgcccag 1020 aaaggtgaaa tcatgccgaa catcccgcag atgtccgctt tctggtatgc cgtgcgtact 1080 gcggtgatca acgccgccag cggtcgtcag actgtcgatg aagccctgaa agacgcgcag 1140 actgattacg atatcccagg taccgagaac ctgtacttcc aatccaatgg tacgaaaatc 1200 gccgctatcg ctatcgctct gatctttatc ctgccgctgt tcccggtcta cacgggctct 1260 gctgctggtg ctagcaccgt ggttattgcg aaaatcaacc cggaagaatt taatccgaaa 1320 gccgtggaag cgctgcaagg caaagtgatt tatgttgctg atctggcgcc ggtggccatt 1380 atcagcatcc cgggcaaagc cgttggtctg ctgtctaaac tgccgggcgt cgtgtcagtt 1440 tcggaagatg gtgttgtcca ggctatggcc aaaccgccat gggccggcgg tggcaacaaa 1500 tctcaaccgg cagaagtgct gccgtggggc gttgattata ttgacgcaga actggtctgg 1560 ccggatggtg tgaccggttg ggttgacgtg aatggtgacg gcgatggtga aattgaagtt 1620 gccgtcatcg atacgggtgt ggacaaagat catccggacc tggcaggcaa cattgtttgg 1680 ggtatcagtg tcctgaatgg ccgtattagc tctaactacc aagatcgcaa tggccatggt 1740 acccatgtca ccggtaccgt ggccgcaatt gacaacgata ttggcgtcat cggtgtggcg 1800 cacagcgtgg aaatctatgc agttaaagct ctgggcaatg gtggctacgg tagctggtct 1860 gatctgatta tcgcgattga cctggccgtg aaaggcccgg atggtgttat cgacgcagat 1920 ggcgacggtg tggttgctgg cgatccggat gacgatgcgc cggaagtgat tagtatgagc 1980 ctgggcggca gcagcccgcc gccggaactg catgatgtga tcaaagcagc ttataacctg 2040 ggtattacca tcgttgcggc cgcaggcaat gatggtgccg actcaccgtc gtatccggct 2100 gcgtacccgg aagttattgc ggtcggcgcc atcgatgaaa acggtaatgt gccgagctgg 2160 tctaaccgta atccggaagt cgccgcaccg ggcgttaaca ttctgagtac ctatccggac 2220 gatacgtacg aagaactgtc aggcacctcg atggctacgc cgcatgtttc cggtaccgtt 2280 gccctgatcc aggctgcccg tctggccgca ggcctgccgc tgctgccgcc gggtagtgaa 2340 tccgatacca ccccggacac cgtgcgcggt gttctgcata ccaccgcaac cgatgctggt 2400 gacccgggtt acgatagcct gtatggttac ggcattattg acgcctacga cgctgtccaa 2460 acggctgtct ccagttgaat t 2481

<210> 11 <211> 2037 <212> DNA <213> Umetno zaporedje <220> <223> optimizirano DNA zaporedje pernizina, na N-konecu His rep, GST oznaka in TEV cepitveno mesto 11 <400> atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt gtagatctga tgtcccctat actaggttat 60 tggaaaatta agggccttgt gcaacccact cgacttcttt tggaatatct tgaagaaaaa 120 tatgaagagc atttgtatga gcgcgatgaa ggtgataaat ggcgaaacaa aaagtttgaa 180 ttgggtttgg agtttcccaa tcttccttat tatattgatg gtgatgttaa attaacacag 240 tctatggcca tcatacgtta tatagctgac aagcacaaca tgttgggtgg ttgtccaaaa 300 gagcgtgcag agatttcaat gcttgaagga gcggttttgg atattagata cggtgtttcg 360 agaattgcat atagtaaaga ctttgaaact ctcaaagttg attttcttag caagctacct 420 gaaatgctga aaatgttcga agatcgttta tgtcataaaa catatttaaa tggtgatcat 480 gtaacccatc ctgacttcat gttgtatgac gctcttgatg ttgttttata catggaccca 540 atgtgcctgg atgcgttccc aaaattagtt tgttttaaaa aacgtattga agctatccca 600 caaattgata agtacttgaa atccagcaag tatatagcat ggcctttgca gggctggcaa 660 gccacgtttg gtggtggcga ccatcctcca aaatcggatg attacccaga tctgggtacc 720 gagaacctgt acttccaatc caatggtacg aaaatcgccg ctatcgctat cgctctgatc 780 tttatcctgc cgctgttccc ggtctacacg ggctctgctg ctggtgctag caccgtggtt 840 attgcgaaaa tcaacccgga agaatttaat ccgaaagccg tggaagcgct gcaaggcaaa 900 gtgatttatg ttgctgatct ggcgccggtg gccattatca gcatcccggg caaagccgtt 960 ggtctgctgt ctaaactgcc gggcgtcgtg tcagtttcgg aagatggtgt tgtccaggct 1020 atggccaaac cgccatgggc cggcggtggc aacaaatctc aaccggcaga agtgctgccg 1080 tggggcgttg attatattga cgcagaactg gtctggccgg atggtgtgac cggttgggtt 1140 gacgtgaatg gtgacggcga tggtgaaatt gaagttgccg tcatcgatac gggtgtggac 1200 aaagatcatc cggacctggc aggcaacatt gtttggggta tcagtgtcct gaatggccgt 1260 attagctcta actaccaaga tcgcaatggc catggtaccc atgtcaccgg taccgtggcc 1320 gcaattgaca acgatattgg cgtcatcggt gtggcgcaca gcgtggaaat ctatgcagtt 1380 aaagctctgg gcaatggtgg ctacggtagc tggtctgatc tgattatcgc gattgacctg 1440 gccgtgaaag gcccggatgg tgttatcgac gcagatggcg acggtgtggt tgctggcgat 1500 ccggatgacg atgcgccgga gaactgcatg atgtgatcaa ggcaatgatg gtgccgactc ggcgccatcg atgaaaacgg gcaccgggcg ttaacattct acctcgatgg ctacgccgca gccgcaggcc tgccgctgct cgcggtgttc tgcataccac ggttacggca ttattgacgc agtgattagt atgagcctgg agcagcttat aacctgggta accgtcgtat ccggctgcgt taatgtgccg agctggtcta gagtacctat ccggacgata tgtttccggt accgttgccc gccgccgggt agtgaatccg cgcaaccgat gctggtgacc ctacgacgct gtccaaacgg gcggcagcag cccgccgccg ttaccatcgt tgcggccgca acccggaagt tattgcggtc accgtaatcc ggaagtcgcc cgtacgaaga actgtcaggc tgatccaggc tgcccgtctg ataccacccc ggacaccgtg cgggttacga tagcctgtat ctgtctccag ttgaatt 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2037

Claims (10)

1. 27 Zahtevki 1. Molekula nukleinske kisline sestavljena iz zaporedja izbranega iz skupine, ki jo sestavljajo: (i) SEQ ID NO:3; (ii) zaporedje izpeljano iz SEQ ID NO:3 z zamenjavo od 1 do 5 zamenjanih kodonov, vsak kodon kodira specifično aminokislino, ki vsaka zase nadomešča kodon, pri čemer nadomestni kodon kodira isto aminokislino kot zamenjan kodon; (iii) zaporedje izpeljano iz SEQ ID NO: 3 z delecijo ali adicijo od 1 do 10 kodonov z zaporedja SEQ ID NO: 3, pri čemer izbris ali dodatek ne vodi do spremembe v prvotnem bralnem okviru; (iv) zaporedje, ki ima vsaj 97% identičnost zaporedju SEQ ID NO:3.
2. 2. Molekula nukleinske kisline iz zahtevka 1, nadalje sestavljena iz vsaj enega od segmentov: (a) His vključka; (b) TEV cepitveno mesto; (c) GST vključka; in (d) MBP vključka.
3. 3. Molekula nukleinske kisline iz zahtevka 2, pri čemer je vsaj eden izmed segmentov His vključek, TEV cepitveno mesto, GST vključek; in MBP vključek lociran na 5’ opredeljenega zaporedja pod (i), (ii) or (iii).
4. 4. Molekula nukleinske kisline po katerem koli izmed predhodnih zahtevkov pri čemer nukleinska kislina nadalje obsega restrikcijsko mesto na 5’ opredeljenega zaporedja pod (i), (ii) or (iii).
5. 5. Molekula nukleinske kisline po katerem koli od predhodnih zahtevkov, kjer molekula obsega zaporedje po katerem koli od SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 in SEQ ID NO: 11.
6. 6. Vektor, ki obsega molekulo nukleinske kisline po katerem koli izmed zahtevkov 1 do 5.
7. 7. Celica, ki obsega molekulo nukleinske kisline po katerem koli izmed zahtevkov 1 do 5 ali vektor po zahtevku 6.
8. 8. Postopek za izražanje pemizina obsega izražanje molekule nukleinske kisline po katerem koli od zahtevkov 1-5 v heterolognem gostitelju. • ·
9. 9. Postopek iz zahtevka 8, v katerem je heterologni gostitelj Escherichia coli.
10. 10. Postopek iz zahtevka 8 ali 9, v katerem je pemizin pridobljen iz kulture supematanta. $ $ $ $ $