RU2843673C1 - 2-Алкилтрифенилфосфониевые производные 10H-фенотиазина, способ получения и применение для противоопухолевой терапии - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биоорганической и медицинской химии, направленной на изыскание и разработку новых противоопухолевых лекарственных средств. Предложены 2-алкилтрифенилфосфониевое производное 10Н-фенотиазина формулы 1, 2 или 3, способ его получения и его применение. Изобретение позволяет создать новые эффективные, низкотоксичные кандидаты в лекарства фенотиазиновой структуры, обладающие выраженной противоопухолевой активностью. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 6 пр.

Description

Изобретение относится к области биоорганической и медицинской химии, направленной на изыскание и разработку новых противоопухолевых лекарственных средств, в частности к синтезу серии новых 2-алкилтрифенилфосфониевых солей 10H-фенотиазина, формулы 1-5, которые проявляют цитотоксическое действие in vitro в отношении опухолевых клеточных линий человека HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома человека), HTC116 (колоректальная карцинома человека), A549 (аденокарцинома легкого человека), MCF-7 (аденокарцинома протоков молочной железы человека), Jurkat (Т-лимфобластная лейкемия), THP-1 (острый моноцитарный лейкоз) в низких микромолярных концентрациях.

Трифенилфосфониевые соли формулы 1-5 представляют собой производные 10Н-фенотиазина-2-карбоновой кислоты формулы 6, в которых карбоксильная функция при С-2 позиции ковалентно связана через сложноэфирную или амидную связь пропановым, бутановым, гексановым или октановым мостиками с катионным липофильным митохондриально-направленным фрагментом трифенилфосфония.

Использование изобретения позволит расширить ассортимент противоопухолевых лекарственных средств на основе известного и доступного гетероциклического соединения фенотиазина.

По оценке ВОЗ в 2022 г. было зарегистрировано около 20 миллионов новых случаев онкологических заболеваний, с 9,7 миллионами смертей. Оценки показывают, что примерно у каждого пятого мужчины или женщины рак развивается в течение жизни, тогда как примерно каждый девятый мужчина и каждая двенадцатая женщина умирают от него. Рак легких был основной причиной смертности (1,8 миллиона смертей), за ним следуют колоректальный рак, рак печени, рак женской груди и рак желудка. Рак молочной железы и рак легких были наиболее частыми видами рака у женщин и мужчин соответственно (как случаи, так и смертельные исходы) [Freddie Bray, Mathieu Laversanne, Hyuna Sung, Jacques Ferlay, Rebecca L. Siegel, Isabelle Soerjomataram, Ahmedin Jemal // Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries // CA Cancer J Clin., 2024, 74: 229-263].

В современной противоопухолевой фармакотерапии используется широкий спектр лекарственных препаратов. Однако практически все применяемые сегодня лекарственные средства из-за низкой избирательности цитотоксического действия обладают тяжелыми побочными эффектами и приводят к развитию множественной лекарственной устойчивости опухолей. Препараты нового поколения, имеющие в качестве мишени маркерные молекулы опухоли (например, опухолеспецифические рецепторы), обладают высокой избирательностью действия и низкой токсичностью, но они не решают проблему резистентности злокачественных клеток к терапии. Трансформация здоровых клеток в злокачественную форму включает множественные генетические изменения или мутации, ведущие к гиперпролиферации, устойчивости к апоптозу и уклонению от защитной реакции иммунной системы хозяина. Поэтому крайне важна разработка новых мультитаргетных химиотерапевтических агентов, направленных одновременно на несколько мишеней, с меньшей системной токсичностью и новым механизмом цитотоксического действия.

В настоящее время объединение двух и более фармакофоров в единую молекулу рассматривается как один из перспективных подходов к разработке противоопухолевых лекарственных средств, отвечающих указанным выше критериям. Как правило, такие гибридные молекулы воздействуют на различные мишени и обладают различными механизмами действия. Успех молекулярной гибридизации в химиотерапии рака совершенно очевиден, судя по количеству гибридных соединений, успешно прошедших клинические испытания и/или поступивших на рынок лекарств за последнее десятилетие [Shalini, Vipan Kumar // Have molecular hybrids delivered effective anticancer treatments and what should future drug discovery focus on? // Expert Opinion on Drug Discovery, 2021, 16: 335-363; Bernard Meunier // Hybrid Molecules with a Dual Mode of Action: Dream or Reality? // Accounts of Chemical Research, 2008, 41: 69-77].

Разработка новых лекарств или кандидатов в лекарства на основе фенотиазина (10H-дибензо-[b,e]-1,4-тиазин) является многообещающим подходом из-за разнообразной биологической активности этого трициклического соединения, на основе которого разработаны лекарственные средства – нейролептики хлорпромазин. тиоридазин, трифлуоперазин, трифлуопромазин. В практической медицине эти лекарственные препараты используются в качестве антагонистов дофаминовых рецепторов, лигандов гистаминовых, мускариновых рецепторов для лечения шизофрении и биполярных расстройств [Maike J. Ohlow, Bernd Moosmann // Phenothiazine: the seven lives of pharmacology's first lead structure // Drug Discov. Today, 2011, 16: 119-131].

Проводимые в последние годы исследования по синтезу и биологическому скринингу различных фенотиазиновых молекулярных гибридов выявили другие биологические эффекты этих соединений: антибактериальные, противогрибковые, антималярийные, и что наиболее важно, противоопухолевые эффекты [Marina C. Posso, Fernanda C. Domingues, Susana Ferreira, Samuel Silvestre // Development of Phenothiazine Hybrids with Potential Medicinal Interest: A Review // Molecules, 2022, 27(1): 276]. Из литературных источников известно, что многие производные фенотиазина инициируют индукцию апоптоза, блокируют ангиогенез-стимулирующие действие, дестабилизируют мембраны и ингибируют мультилекарственную резистентность раковых клеток [Chia-Hsien Wu, Li-Yuan Bai, Ming-Hsui Tsai, Po-Chen Chu, Chang-Fang Chiu, Michael Yuanchien Chen, Shih-Jiuan Chiu, Jo-Hua Chian, Jing-Ru Weng // Pharmacological exploitation of the phenothiazine antipsychotics to develop novel antitumor agents-A drug repurposing strategy // Scientific Reports, 2016, 6: 27540; Gabriella Spengler, Ákos Csonka, Joseph Molnar, Leonard Amaral // The Anticancer Activity of the Old Neuroleptic Phenothiazine-type Drug Thioridazine // Anticancer Research, 2016, 36(11): 5701-5706; Alejandro Gutierrez et al. // Phenothiazines induce PP2A-mediated apoptosis in T cell acute lymphoblastic leukemia // The Journal of Clinical Investigation, 2014, 124(2): 644-655].

Например, сульфонамидные производные фенотиазина 7 проявили цитотоксический эффект (IC₅₀ 8.1 μМ) в отношении линий опухолевых клеток молочной железы T47D, сопоставимый с эталонным препаратом доксорубицином (IC₅₀ 9.8 μМ) [Mostafa M. Ghorab, Mansour S. Alsaid, Nermin Samir, Ghada A. Abdel-Latif, Aiten M. Soliman, Fatma A. Ragab, Dalal A. Abou El Ella // Aromatase inhibitors and apoptotic inducers:Design,synthesis,anticancer activity and molecular modeling studies of novel phenothiazine derivatives carrying sulfonamide moiety as hybrid molecules // European Journal of Medicinal Chemistry, 2017, 134: 304-315]. Результаты исследования механизма противоопухолевого действия показали, что эти производные фенотиазина являются сильнодействующими ингибиторами ароматазы.

Серия гибридов фенотиазина с 1,2,3-триазолом была исследована на антипролиферативную активность в отношении трех раковых линий молочной железы. Гибридное соединение с триметоксифенильным заместителем 8 продемонстрировало выраженный ингибирующий эффект против клеток MCF-7 со значением IC₅₀ 0.8 μМ [Jun-Xia Zhang, Jiao-Mei Guo, Ting-Ting Zhang, Hong-Jun Lin, Nai-Song Qi, Zhen-Guo Li, Ji-Chun Zhou, Zhen-Zhong Zhang // Antiproliferative Phenothiazine Hybrids as Novel Apoptosis Inducers against MCF-7 Breast Cancer // Molecules, 2018, 23(6): 1288].

Соединение фенотиазина и триазолпиридина 9 проявило значительную цитотоксичность в отношении нескольких линий раковых клеток молочной железы человека. Кроме того, цитотоксический эффект этого соединения был в 3.5 раза выше в отношении раковых клетках MCF-7 по сравнению с незлокачественными эпительными клетками молочной железы MCF-10A [Tanisha Sachdeva, May Lee Low, Chun-Wai Mai, Siew Lee Cheong, Yun Khoon Liew, Marilyn Daisy Milton // Design, Synthesis and Characterisation of Novel Phenothiazine-Based Triazolopyridine Derivatives: Evaluation of Anti-Breast Cancer Activity on Human Breast Carcinoma // Chemistry Select, 2019, 4(43): 12701-12707].

Аналог известного нейролептика фенотиазинового ряда трифлуоперазина 10 показал высокую апоптоз-индуцирующую активность в отношении раковых клеток ротовой полости. Важно отметить, что противоопухолевое действие этого фенотиазинового производного было подтверждено также in vivo на ксенотрансплантатных опухолях мышей Ca922 [Chia-Hsien Wu, Li-Yuan Bai, Ming-Hsui Tsai, Po-Chen Chu, Chang-Fang Chiu, Michael Yuanchien Chen, Shih-Jiuan Chiu, Jo-Hua Chian, Jing-Ru Weng // Pharmacological exploitation of the phenothiazine antipsychotics to develop novel antitumor agents-A drug repurposing strategy // Scientific Reports, 2016, 6: 27540].

Исследование на изолированных митохондриях печени крыс известных лекарств фенотиазиновой структуры (хлорпромазина, трифлуоперазина или тиоридазина) показали, что цитотоксичность фенотиазиновых производных связана в значительной степени с митохондриальными дисфункциями, такими как изменение проницаемости мембран митохондрий и снижение митохондриального трансмембранного потенциала [Priscila A. de Faria, Fernanda Bettanin, Rodrigo L.O.R. Cunha, Edgar J. Paredes-Gamero, Paula Homem-de-Mello, Iseli L. Nantes, Tiago Rodrigues // Cytotoxicity of phenothiazine derivatives associated with mitochondrial dysfunction: A structure-activity investigation // Toxicology, 2015, 330: 44-54].

В настоящее время для создания новых противоопухолевых лекарственных средств, мишенью для которых являются митохондрии, активно исследуются конъюгаты цитотоксических соединений с делокализованными липофильными катионными молекулами с малым молекулярным весом, которые могут проходить через липидный бислой клеточных мембран и аккумулироваться внутри митохондрий в более высокой концентрации, чем в цитоплазме. Среди делокализованных липофильных катионов, проникающих через гидрофобные барьеры плазмы и митохондриальные мембраны, наиболее изученным как средство доставки биологически активных веществ в митохондрии клеток является трифенилфосфониевый катион (TPP⁺) [R.A. Smith, R.C. Hartley, H.M. Cochemé, M.P. Murphy // Mitochondrial pharmacology // Trends in Pharmacological Sciences, 2012, 33(6): 341-352; Jacek Zielonka, Adam Sikora, Micael Hardy, Olivier Ouari, Jeannette Vasquez-Vivar, Gang Cheng, Marcos Lopez, Balaraman Kalyanaraman // Mitochondria-Targeted Triphenylphosphonium-Based Compounds: Syntheses, Mechanisms of Action, and Therapeutic and Diagnostic Applications // Chem Rev., 2017, 117(15): 10043-10120].

Катион трифенилфосфония проявляет цитотоксичность только при очень высоких концентрациях. Это свидетельствует о том, что появление цитотоксических свойств у конъюгатов биологически активных веществ с трифенилфосфонием может быть связано с переносимыми лекарствами, а не с самим фрагментом трифенилфосфония.

Несколько широко используемых в практической медицине противоопухолевых препаратов, таких как хлорамбуцил, доксорубицин, цисплатин, тамоксифен, метформин и артемизинин были конъюгированы с трифенилфосфином [Xiaoxia Cheng, Dong Feng, Junyu Lv, Xiaoman Cui, Yichen Wang, Qun Wang, Lei Zhang // Application prospects of triphenylphosphine-based mitochondria-targeted cancer therapy // Cancers, 2023, 15(3): 666].

Конъюгация хлорамбуцила с трифенилфосфином привела к значительному усилению противоопухолевого действия лекарственного средства [Melissa Millard, John D. Gallagher, Bogdan Z. Olenyuk, Nouri Neamati // A selective mitochondrial-targeted chlorambucil with remarkable cytotoxicity in breast and pancreatic cancers // J. Med. Chem., 2013, 56(22): 9170-9179]. На панели линий клеток карциномы молочной железы и поджелудочной железы, резистентных к исходному препарату, полученный Mito-хлорамбуцил 11 воздействовал на митохондриальную ДНК, останавливая клеточный цикл и вызывая усиленную гибель клеток. На модели ксенотрансплантата рака поджелудочной железы человека Mito-хлорамбуцил вызывал более значительную задержку формирования опухоли по сравнению с хлорамбуцилом.

Тамоксифен (Tam) – смешанный агонист/антагонист рецептора эстрогена (ER), используется в качестве средства терапии первой линии при лечении гормонально- зависимого рака груди, но неэффективен при лечении Her2-положительного типа опухоли. В настоящее время Her2-положительный рак молочной железы лечат таргетными препаратами, такими как трастузумаб, эмтанзин, лапатиниб и др. Эти лекарства прицельно воздействуют на гиперэкспрессирующийся в клетках молочной железы рецептор Her2, но со временем эффективность терапии снижается вследствие развивающейся множественной лекарственной устойчивости. Конъюгат тамоксифена с митохондриально-нацеленной группой TPP⁺ 12 проявил высокую эффективность в отношении опухолевых клеток с высоким уровнем экспрессии Her2 [Katerina Rohlenova, Karishma Sachaphibulkij, Jan Stursa, Ayenachew Bezawork-Geleta, Jan Blecha, Berwini Endaya, Lukas Werner, Jiri Cerny, Renata Zobalova, Jacob Goodwin, Tomas Spacek, Elham Alizadeh Pesdar, Bing Yan, Maria Nga Nguyen, Magdalena Vondrusova, Margaryta Sobol, Petr Jezek, Pavel Hozak, Jaroslav Truksa, Jakub Rohlena, Lan-Feng Dong, Jiri Neuzil // Selective disruption of respiratory supercomplexes as a new strategy to suppress Her2 ^high breast cancer // Antioxid. Redox Signal., 2017, 26(2): 84-103].

Сравнительное исследование цитотоксичности и внутриклеточного распределения доксорубицина (DOX) и его конъюгата с катионом трифенилфосфония 13 в отношении клеток карциномы молочной железы MDA-MB-435/WT и DOX-резистентных клеток MDA-MB-435/DOX показало, что конъюгат 13 проявил в отношении обеих клеточных линий высокую цитотоксичность [Min Han, Mohammad Reza Vakili, Hoda Soleymani Abyaneh, Ommoleila Molavi, Raymond Lai, Afsaneh Lavasanifar // Mitochondrial delivery of doxorubicin via triphenylphosphine modification for overcoming drug resistance in MDA-MB-435/DOX cells // Mol. Pharm., 2014, 11(8): 2640-2649].

Клиническая эффективность известного противоопухолевого препарата цисплатина сильно ограничена лекарственной резистентностью, кроме того, он не избирателен в отношении опухолевых клеток и имеет серьезные побочные эффекты. Исследования показали, что связанный с трифенилфосфином цисплатин 14, преимущественно накапливается в митохондриях, минуя ядерную ДНК и воздействуя на митохондриальный геном. Этот подход позволяет преодолеть лекарственную устойчивость к цисплатину [Sean Marrache, Rakesh K. Pathak, Shanta Dhar // Detouring of cisplatin to access mitochondrial genome for overcoming resistance // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2014, 111(29): 10444-10449].

Трифенилфосфониевые производные пентациклических тритерпеноидов проявили in vitro значительно более высокое цитотоксическое действие, чем исходные природные тритерпеновые кислоты в отношении опухолевых клеточных линий карциномы Эрлиха, мастоцитомы Р-815 и рака молочной железы MCF-7 [А.Ю. Спивак, Д.А. Недопёкина, Э.Р. Шакурова, Р.Р. Халитова, Р.Р. Губайдуллин, В.Н. Одиноков, У.М. Джемилев, Ю.П. Бельский, Н.В. Бельская, С.А. Станкевич, Е.В. Короткая, В.А. Хазанов // Синтез лупановых тритерпеноидов с трифенилфосфониевыми фрагментами и изучение их противоопухолевой активности // Известия Академии наук. Серия химическая, 2013, 62, №1, 189-199; Darya A. Nedopekina, Rinat R. Gubaidullin, Victor N. Odinokov, Polina V. Maximchik, Boris Zhivotovsky, Yuriy P. Bel'skii, Veniamin A. Khazanov, Arina V. Manuylova, Vladimir Gogvadze, Anna Yu. Spivak // Mitochondria-targeted betulinic and ursolic acid derivatives: synthesis and anticancer activity // Med. Chem. Commun., 2017, 8: 1934-1945; Anna Yu. Spivak, Darya A. Nedopekina, Rezeda R. Khalitova, Rinat R. Gubaidullin, Viktor N. Odinokov, Yuriy P. Bel'skii, Natalia V. Bel'skaya, Veniamin A. Khazanov // Triphenylphosphonium cations of betulinic acid derivatives: synthesis and antitumor activity // Med. Chem. Res., 2017, 26: 518-531].

На сегодняшний день известна только одна работа, в которой описан синтез конъюгатов фенотиазина с катионом трифенилфосфония. Трифенилфосфониевые соли фенотиазина формулы 15-17 представляют собой N-замещенные аналоги фенотиазина, в которых трифенилфосфониевый фрагмент и ядро фенотиазина связаны С-3 алкановым мостиком [Elyse A. Dunn, Marina Roxburgh, Lesley Larsen, Robin A. J. Smith, Alexander D. McLellan, Adam Heikal, Michael P. Murphy, Gregory M. Cook // Incorporation of triphenylphosphonium functionality improves the inhibitory properties of phenothiazine derivatives in Mycobacterium tuberculosis // Bioorganic and Medicinal Chemistry, 2014, 22: 5320-5328].

Ковалентное связывание атома азота в фенотиазиновом ядре с делокализованным липофильным трифенилфосфониевым фрагментом привело к значительной локализации полученных трифенилфосфониевых производных в микобактериальных мембранах, а также к их заметному воздействию на энергетический метаболизм (процесс окисления NADH и потребление кислорода). В результате бактерицидная активность конъюгатов 15-17 против M-tuberculosis превысила бактерицидную активность исходных фенотиазинов в 130 раз. Противоопухолевую активность этих соединений авторы не исследовали.

В связи с изложенными фактами задачей настоящего изобретения является создание новых эффективных, низкотоксичных кандидатов в лекарства фенотиазиновой структуры, обладающих выраженной противоопухолевой активностью. Поставленная задача решается получением трифенилфосфониевых солей фенотиазина формулы 1-5 взаимодействием 10Н-фенотиазина-2-карбоновой кислоты формулы 6 с трифенилфосфоний бромидами, содержащим бромбутановый 18, бромгексановый 19, бромоктановый 20, аминопропановый 21 и аминогексановый 24 заместители, а также исследованием in vitro цитотоксической активности полученных фосфониевых солей в отношении шести опухолевых линий лейкозных клеток и карцином. Следует отметить, что принципиальное отличие полученных нами соединений 1-5 и известных в литературе трифенилфосфониевых солей 15-17 состоит в том, что трифенилфосфониевый катион связан не с атомом азота фенотиазина, а введен в его боковую цепь при С-2 позиции ароматического кольца.

Заявленные соединения 1-5, представляющие собой конъюгаты С(2)-карбокси-10Н-фенотиазина 6 с катионом трифенилфосфония, связанным с молекулой фенотиазина через сложноэфирную или амидную функцию пропановым, бутановым, гексановым или октановым мостиком, синтезировали с использованием карбодиимидного метода или реакцией алкилирования кислотной функции в 2-карбоксифенотиазине 6 в щелочной среде. Для этого предварительно синтезировали 2-карбоксифенотиазин 6 из коммерчески доступного 2-цианофенотиазина путем его кипячения в смеси ледяной уксусной и концентрированной соляной кислот по методу [Matthias Hempe, Alastair K. Harrison, Jonathan S. Ward, Andrei S. Batsanov, Mark A. Fox, Fernando B. Dias, Martin R. Bryce // Cyclophane Molecules Exhibiting Thermally Activated Delayed Fluorescence: Linking Donor Units to Influence Molecular Conformation // J. Org. Chem., 2021, 86(1): 429-445]. Полученный 2-карбоксифенотиазин 6 использовали с качестве основы для синтеза заявленных соединений 1-5 (химические реакции I).

Химические реакции I

Трифенилфосфоний бромиды с бромалкановыми заместителями 18-20 получали как описано в работе [Jing Pan, Yongik Lee, Gang Cheng, Jacek Zielonka, Qi Zhang, Martina Bajzikova, Donghai Xiong, Shirng-Wern Tsaih, Micael Hardy, Michael Flister, Christopher M. Olsen, Yian Wang, Ole Vang, Jiri Neuzil, Charles R. Myers, Balaraman Kalyanaraman, Ming You // Mitochondria-Targeted Honokiol Confers a Striking Inhibitory Effect on Lung Cancer via Inhibiting Complex I Activity // iScience, 2018, 3, 192-207] сплавлением трифенилфосфина с соответствующими α,ω-дибромалканами (6-кратный мольный избыток дибромалканов по отношению к трифенилфосфину) при 90°C в атмосфере аргона в течение 6 часов (химические реакции II).

Химические реакции II

Конъюгаты 1-3, представляющие собой эфирные производные фенотиазина, получали взаимодействием 2-карбоксифенотиазина 6 с трифенилфосфоний бромидами 18-20 в ДМФА с добавлением поташа в течение 3 часов при 50°C (химические реакции III).

Химические реакции III

Конъюгаты 4 и 5, представляющие собой амидные производные фенотиазина, получали взаимодействием 2-карбоксифенотиазина 6 и трифенилфосфоний бромидов 21 и 24, содержащих аминоалкильные заместители.

В синтезе трифенилфосфониевой соли 21 использовали коммерчески доступный гидробромид 3-бромпропиламина, который вводили в реакцию с трифенилфосфином при кипячении в ацетонитриле в течение 12 часов по методу [Chong-Jing Zhang, Jigang Wang, Jianbin Zhang, Yew Mun Lee, Guangxue Feng, Teck Kwang Lim, Han-Ming Shen, Qingsong Lin, Bin Liu // Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity // Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55(44): 13770-13774] (химические реакции IV).

Химические реакции IV

Выполненный нами синтез трифенилфосфониевого производного 24 включал три последовательные стадии. Начальная стадия синтеза – фталимидная защита одного из двух концевых атомов брома в коммерчески доступном 1,6-дибромгексане, была проведена по методу [Chaitanya A. Kulkarni, Brian D. Fink, Bettine E. Gibbs, Pratik R. Chheda, Meng Wu, William I. Sivitz, Robert J. Kerns // A Novel Triphenylphosphonium Carrier to Target Mitochondria without Uncoupling Oxidative Phosphorylation // J. Med. Chem., 2021, 64, 662-676] путем взаимодействия суспензии фталимида калия с 4-х кратным мольным избытком 1,6-дибромгексана в безводном ДМФА при 90°С в течение 4 часов в атмосфере аргона с последующим завершением реакции при комнатной температуре в течение 10 часов. В результате был получен промежуточный продукт 22 с выходом 56%. Последующие стадии – конденсация с трифенилфосфином и снятие фталимидной защиты выполняли как описано [Gang Cheng, Jacek Zielonka, Olivier Ouari, Marcos Lopez, Donna McAllister, Kathleen Boyle, Christy S. Barrios, James J. Weber, Bryon D. Johnson, Micael Hardy, Michael B. Dwinell, Balaraman Kalyanaraman // Mitochondria-targeted analogs of metformin exhibit enhanced antiproliferative and radiosensitizing effects in pancreatic cancer cells // Cancer Res., 2016, 76(13): 3904-3915]. Взаимодействие соединения 22 с трифенилфосфином при кипячении в ацетонитриле в течение 12 часов дало трифенилфосфониевую соль 23 с выходом 62%. Снятие фталимидной защиты проводили путем кипячения раствора смеси трифенилфосфониевой соли 23 и гидразина моногидрата в этаноле в течение 18 часов с последующей хроматографической очисткой на силикагеле полученного 6-аминогексилтрифенилфосфония 24. Выход продукта 24 составил 87% (химические реакции V).

Химические реакции V

Конъюгаты 4 и 5 получали карбодиимидным методом путем взаимодействия аминопроизводных трифенилфосфина 21 и 24 с 2-карбоксифенотиазином 6 в ДМФА под действием N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC), гидроксибензотриазола (HOBt) и 4-диметиламинопиридина (DMAP) при комнатной температуре (химические реакции VI).

Химические реакции VI

Цитотоксическая активность новых соединений проведена на шести клеточных линиях опухолевого происхождения: HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома человека), HTC116 (колоректальная карцинома человека), A549 (аденокарцинома легкого человека), MCF-7 (аденокарцинома протоков молочной железы человека), Jurkat (T-лимфобластный лейкоз) и THP-1 (острый моноцитарный лейкоз). В качестве контрольных клеток использовали клеточную линию неопухолевого происхождения HEK293 (иммортализованные эмбриональные клетки почки человека).

Полученные конъюгаты 1-5 проявили цитотоксическую активность в микромолярных концентрациях в отношении исследуемых клеточных линий и значительно превосходили по противоопухолевой активности образцы сравнения, в качестве которых использовали исходные фенотиазин и 2-карбоксифенотиазин 6 (таблица 1).

Таблица 1

Влияние веществ на жизнеспособность клеток опухолевых линий in vitro (M ± SEM) ^b

Соединение	IC 50 (µM) a
	HEK293	MCF-7	HTC116	A549	HepG2	THP-1	Jurkat
1	4.30±0.33	3.49±0.37*	4.22±0.24*	2.24±0.08*	6.10±0.14	3.81±0.14*	3.69±0.70*
2	5.01±0.51	1.47±0.11*	1.10±0.08*	0.75±0.05*	3.12±0.29*	2.25±0.15*	4.39±0.16
3	2.00±0.29	1.35±0.16	0.71±0.01*	0.31±0.04*	0.90±0.04*	2.07±0.22	2.59±0.26
4	15.10±1.72	10.93±0.12	16.61±1.40	28.01±5.70*	22.58±1.30	9.08±0.75	9.59±0.10
5	8.52±0.36	2.21±0.19*	2.50±0.40*	3.57±0.53*	9.15±0.31	2.79±0.19*	6.37±0.58*
6	˃100	˃100	˃100	˃100	˃100	˃100	˃100
фенотиазин	79.71±2.96	˃100*	˃100*	54.05±8.43	32.56±13.03	˃100*	˃100*

* – различия значений IC₅₀ в клетках опухолевого происхождения (HepG2, HTC116, MCF-7, A549, Jurkat, THP-1) относительно значений IC₅₀ в контрольных клетках HEK293 статистически достоверны (однофакторный парный дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием критерия Даннета);

^а IC₅₀ (μM) – концентрация, вызывающая полумаксимальное ингибирование жизнеспособности клеток;

^b M – среднее арифметическое значение экспериментальных данных, SEM – стандартная ошибка среднего. Данные IC₅₀ представлены как M ± SEM, полученные по результатам трех независимых экспериментов (N=3).

2-Карбоксифенотиазин 6 и фенотиазин показали низкую цитотоксическую активность (IC₅₀ 70-100 µM), однако выявлена специфичность действия фенотиазина на клетки линий HEK293, A549 и HepG2 (таблица 1). Новые трифенилфосфониевые производные фенотиазина 1-5 проявили цитотоксичность в низких микромолярных концентрациях, значительно превысив цитотоксический эффект исходных соединений в отношении всех исследуемых клеточных линий. Наибольшую чувствительность к соединениям 1-3 проявили клеточные линии A549 и HTC116. Соединения 1-3, представляющие собой конъюгаты трифенилфосфония и фенотиазина, связанные сложноэфирной функцией, заметно превзошли по цитотоксическому потенциалу свои амидные аналоги, соединения 4 и 5. Причем, с увеличением длины алканового мостика (n = 4, 6 и 8), цитотоксическая активность этих соединений возрастала. Так, для трифенилфосфониевых солей 1, 2 и 3 значения IC_50, полученные на клеточной линии A549, были соответственно 2.24±0.08 µM, 0.75±0.05 µM и 0.31±0.04 µM. Трифенилфосфониевые соли фенотиазина 2 и 3 показали хорошую селективность в отношении клеточных линий нормального происхождения HEK293 и раковых клеток A549 с величиной индекса селективности 7. Таким образом, С-2 трифенилфосфониевые производные фенотиазина 2 и 3 являются соединениями-лидерами в ряду исследованных конъюгатов, учитывая их высокий противоопухолевый потенциал и селективность цитотоксического действия. Следует отметить, что наиболее чувствительной к действию соединения 4 оказались клеточные линии лейкоза THP-1 (IC₅₀ = 9.08±0.75 µM) и Jurkat (IC₅₀ = 9.59±0.10 µM). Минимальные значения IC₅₀ для соединения 5 установлены в отношении клеток MCF-7 (IC₅₀ = 2.21±0.19 µM) и HTC116 (IC₅₀ = 2.50±0.40 µM).

Преимущества предлагаемого изобретения:

1. Впервые получены и исследованы на противоопухолевую активность новые трифенилфосфониевые соли N-незамещенного 10Н-фенотиазина, в которых трифенилфосфониевый фрагмент и ядро фенотиазина связаны через сложноэфирную или амидную функции алкановыми мостиками. В испытаниях in vitro трифенилфосфониевые производные фенотиазина проявили цитотоксическую активность в отношении исследуемых опухолевых клеточных линий в микромолярных концентрациях.

2. В ряду испытанных трифенилфосфониевых производных фенотиазина наблюдалось влияние длины линкера на проявляемый цитотоксический эффект. Конъюгаты 2 и 3, содержащие сложноэфирную функцию и гексановый или октановый линкер проявили наибольшую цитотоксическую активность в отношении клеточной линии A549 с величиной индекса селективности IS ≈ 7. Данные конъюгаты являются соединениями-лидерами.

3. Целевые соединения 1-5 получены в 2-4 стадии из коммерчески доступного 2-цианофенотиазина и трифенилфосфина с использованием простых реагентов. Простой в препаративном выполнении синтез позволяет получать целевые соединения в любых количествах, необходимых для научных и медицинских исследований.

В связи с изложенными фактами трифенилфосфониевые производные фенотиазина представляют интерес в качестве новых потенциальных противоопухолевых лекарственных агентов.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1

Бромид 4-(трифенилфосфонио)бутил-10Н-фенотиазин-2-оат (1): 2-цианофенотиазин (2.00 г, 8.9 ммоль, 1 экв) смешивали с ледяной CH₃COOH (52.4 мл) и конц. HCl (52,4 мл). Через суспензию барботировали аргон в течение 15 мин и затем кипятили в течение 18 часов. Полученную коричневую смесь охладили до комнатной температуры и отфильтровали, многократно промывая водой, затем растворяли в EtOAc (65 мл) и промыли водой (3×65 мл). Органическую фазу сушили с использованием MgSO₄ и фильтровали. Растворитель удаляли при пониженном давлении и остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле, элюируя смесью растворителей CH₂Cl₂:MeOH 20:1→10:1. В результате получили 10Н-фенотиазин-2-карбоновую кислоту (6) в виде твердого вещества желтого цвета с выходом 92%. Данные спектров ЯМР ¹H и ¹³C соответствовали литературным [Tonmoy Chitta Das, Syed Aziz Quadri, Shivaji Laxman Jadav, Mazahar Farooqui // Synthesis of new 2-substituted-10-phenylsulfonylphenothiazine conjugates and evaluation as anticancer agents by investigating their off-target mechanism // Chemistry & Biology Interface, 2018, 8(2): 84-93].

Смешивали трифенилфосфин (1.0 г, 3.8 ммоль) и 1,4-дибромбутан (22.8 ммоль) в круглодонной колбе с обратным холодильником и нагревали на масляной бане при 90°С в течение 6 часов. Затем смесь в колбе охладили до комнатной температуры. Через 3 часа появилось два слоя: монофосфониевая соль образует твердое вещество внизу колбы, а избыток дибромида – жидкость вверху. Дибромид декантировали, монофосфониевую соль растворяли в CH₂Cl₂ и высаживали эфиром, чтобы убрать непрореагировавший трифенилфосфин. Паста-подобное твердое вещество высушивали в вакууме и очищали колоночной хроматографией на силикагеле (CH₂Cl₂:MeOH 9:1). Получили бромид (4-бромбутил)трифенилфосфония (18). Выход 85%. Спектральные характеристики соединения 18 соответствовали литературным [Jing Pan, Yongik Lee, Gang Cheng, Jacek Zielonka, Qi Zhang, Martina Bajzikova, Donghai Xiong, Shirng-Wern Tsaih, Micael Hardy, Michael Flister, Christopher M. Olsen, Yian Wang, Ole Vang, Jiri Neuzil, Charles R. Myers, Balaraman Kalyanaraman, Ming You // Mitochondria-Targeted Honokiol Confers a Striking Inhibitory Effect on Lung Cancer via Inhibiting Complex I Activity // iScience, 2018, 3, 192-207].

К раствору соединения 6 (0.19 г, 0.8 ммоль) в ДМФА (8 мл), перемешивая при комнатной температуре, добавляли K₂CO₃ (0.11 г, 0.8 ммоль) и (4-бромбутил)трифенилфосфония бромид 18 (0.8 ммоль). Смесь перемешивали при 50°С в течение 3 часов (контроль ТСХ). Затем охлаждали до комнатной температуры, фильтровали и растворитель упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на SiO₂ (CHCl₃:MeOH 30:1→1:1). Получили бромид 4-(трифенилфосфонио)бутил-10Н-фенотиазин-2-оат (1). Выход 72%, т. пл. 128-130°С. ИК спектр, ν, см^-1: 1709(COO), 3401 (NH). Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, DMSO), δ, м. д. (J, Гц): 1.69-1.70 (2H, м, H-3'), 1.90-1.93 (2H, м, H-2'), 3.68-3.74 (2H, м, H-1'), 4.28 (2H, т, J ₁ = 5.0 Гц, J ₂ = 10.0 Гц, H-4'), 6.72-6.79 (2H, м, CH в фенотиазине), 6.91-7.02 (3H, м, CH в фенотиазине), 7.14-7.16 (1H, м, CH в фенотиазине), 7.27 (1H, с, CH в фенотиазине), 7.75-7.85 (15H, м, Ph), 8.91 (1H, с, NH в фенотиазине). Спектр ЯМР ¹³С (125 МГц, DMSO), δ, м. д.: 18.89 (C-3'), 20.43 (д, J _C = 50 Гц, C-4'), 29.18 (д, J _C = 17.5 Гц, C-2'), 63.70 (C-1'), 114.69 (C в фенотиазине), 115.09 (C в фенотиазине), 115.70 (C-9), 119.24 (д, J _C,P = 85 Гц, Ph), 122.69 (C-3, C-7), 123.64 (C-1), 126.60 (C-4), 126.76 (C-6), 128.44 (C-8), 129.24 (C-2), 130.74 (д, J _C,P = 12.5 Гц, Ph), 134.11 (д, J _C,P = 10.0 Гц, Ph), 135.35 (Ph), 141.73 (C в фенотиазине), 142.64 (C в фенотиазине), 165.63 (COO). MS: m/z найдено 560.1681 [M-Br] (вычислено для C₃₅H₃₁NO₂PS 560.1808).

Пример 2

Бромид 6-(трифенилфосфонио)гексил-10Н-фенотиазин-2-оат (2): 2-цианофенотиазин трансформировали в соединение 6 (выход 92%) путем кипячения в смеси уксусной и соляной кислот по способу, описанному в примере 1. Бромид (6-бромгексил)трифенилфосфония (19) получали сплавлением трифенилфосфина и 1,6-дибромгексана по способу, описанному в примере 1. Выход 83%. Спектральные характеристики соединения 19 соответствовали литературным [Jing Pan, Yongik Lee, Gang Cheng, Jacek Zielonka, Qi Zhang, Martina Bajzikova, Donghai Xiong, Shirng-Wern Tsaih, Micael Hardy, Michael Flister, Christopher M. Olsen, Yian Wang, Ole Vang, Jiri Neuzil, Charles R. Myers, Balaraman Kalyanaraman, Ming You // Mitochondria-Targeted Honokiol Confers a Striking Inhibitory Effect on Lung Cancer via Inhibiting Complex I Activity // iScience, 2018, 3, 192-207].

Конденсацию соединений 6 и 19 осуществляли этерификацией в щелочной среде с образованием бромида 6-(трифенилфосфонио)гексил-10Н-фенотиазин-2-оата (2) по способу, описанному в примере 1. Выход соединения 2 составил 70%, т. пл. 108-110°С. ИК спектр, ν, см^-1: 1703 (COO), 3397 (NH). Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, DMSO), δ, м. д. (J, Гц): 1.41-1.42 (2H, м, H-3'), 1.53-1.64 (6H, м, H-2', H-4', H-5'), 3.62-3.63 (2H, м, H-1'), 4.19 (2H, т, J ₁ = 5.0 Гц, J ₂ = 10.0 Гц, H-6'), 6.70-6.78 (2H, м, CH в фенотиазине), 6.89-7.01 (3H, м, CH в фенотиазине), 7.28-7.30 (2H, м, CH в фенотиазине), 7.75-7.88 (15H, м, Ph), 8.91 (1H, с, NH в фенотиазине). Спектр ЯМР ¹³С (125 МГц, DMSO), δ, м. д.: 20.86 (д, J _C = 50 Гц, C-6'), 22.17 (C-4'), 25.12 (C-3'), 28.30 (C-2'), 29.97 (д, J _C = 12.5 Гц, C-5'), 64.90 (C-1'), 114.60 (C в фенотиазине), 115.06 (C в фенотиазине), 115.68 (C-9), 119.37 (д, J _C,P = 85 Гц, Ph), 122.66 (C-3), 122.86 (C-7), 123.52 (C-1), 126.73 (C-4, C-6), 128.42 (C-8), 129.38 (C-2), 130.74 (д, J _C,P = 12.5 Гц, Ph), 134.10 (д, J _C,P = 10.0 Гц, Ph), 135.35 (Ph), 141.72 (C в фенотиазине), 142.60 (C в фенотиазине), 165.76 (COO). MS: m/z найдено 588.2151 [M-Br] (вычислено для C₃₇H₃₅NO₂PS 588.2121).

Пример 3

Бромид 8-(трифенилфосфонио)октил-10Н-фенотиазин-2-оат (3): 2-цианофенотиазин трансформировали в соединение 6 (выход 92%) путем кипячения в смеси уксусной и соляной кислот по способу, описанному в примере 1. Бромид (8-бромоктил)трифенилфосфония (20) получали сплавлением трифенилфосфина и 1,8-дибромоктана по способу, описанному в примере 1. Выход 84%. Спектральные характеристики соединения 20 соответствовали литературным [Jing Pan, Yongik Lee, Gang Cheng, Jacek Zielonka, Qi Zhang, Martina Bajzikova, Donghai Xiong, Shirng-Wern Tsaih, Micael Hardy, Michael Flister, Christopher M. Olsen, Yian Wang, Ole Vang, Jiri Neuzil, Charles R. Myers, Balaraman Kalyanaraman, Ming You // Mitochondria-Targeted Honokiol Confers a Striking Inhibitory Effect on Lung Cancer via Inhibiting Complex I Activity // iScience, 2018, 3, 192-207].

Конденсацию соединений 6 и 20 осуществляли этерификацией в щелочной среде с образованием бромида 8-(трифенилфосфонио)октил-10Н-фенотиазин-2-оата (3) по способу, описанному в примере 1. Выход соединения 3 составил 70%, т. пл. 96-98°С. ИК спектр, ν, см^-1: 1698 (COO), 3391 (NH). Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, MeOD), δ, м. д. (J, Гц): 1.28-1.41 (6H, м, H-5'-H-7'), 1.55-1.71 (6H, м, H-2'-H-4'), 3.33-3.39 (2H, м, H-1'), 4.22 (2H, т, J ₁ = 5.0 Гц, J ₂ = 10.0 Гц, H-8'), 6.66-6.94 (5H, м, CH в фенотиазине), 7.26-7.31 (2H, м, CH в фенотиазине), 7.71-7.78 (15H, м, 3Ph). Спектр ЯМР ¹³С (125 МГц, MeOD), δ, м. д.: 23.08 (д, J _C = 50 Гц, C-8'), 23.44 (C-6'), 26.81 (C-4'), 29.56 (C-3'), 29.67 (C-2'), 29.79 (C-5'), 31.46 (д, J _C = 16.2 Гц, C-7'), 66.02 (C-1'), 115.53 (C в фенотиазине), 115.67 (C в фенотиазине), 117.42 (C-9), 119.96 (д, J _C,P = 85 Гц, Ph), 123.27 (C-3), 123.80 (C-7), 125.48 (C-1), 127.00 (C-4), 127.25 (C-6), 128.80 (C-8), 130.47 (C-2), 131.57 (д, J _C,P = 12.5 Гц, Ph), 134.68 (д, J _C,P = 10.0 Гц, Ph), 136.26 (Ph), 142.86 (C в фенотиазине), 143.69 (C в фенотиазине), 167.88 (COO). MS: m/z найдено 616.2445 [M-Br] (вычислено для C₃₉H₃₉NO₂PS 616.2434).

Пример 4

Бромид 3-(трифенилфосфонио)пропил-10Н-фенотиазин-2-амид (4): 2-цианофенотиазин трансформировали в соединение 6 (выход 92%) путем кипячения в смеси уксусной и соляной кислот по способу, описанному в примере 1.

К раствору коммерчески доступного 3-бромпропиламина гидробромида (0.438 г, 2.0 ммоль) в ацетонитриле (6 мл) добавляли трифенилфосфин (0.524 г, 2.0 ммоль) и кипятили в атмосфере аргона с обратным холодильником в течение 12 часов (контроль ТСХ). Раствор охлаждали, растворитель выпаривали при пониженном давлении, затем полученный твердый продукт промывали горячим гексаном (2×10 мл) и растворяли в EtOAc (2-4 мл). Для высаживания продукта к раствору добавляли гексан (12 мл). Осадок фильтровали с получением бромида (3-аминопропил)трифенилфосфония (21). Выход 72%. Спектральные характеристики и физические константы соответствовали литературным данным [Chong-Jing Zhang, Jigang Wang, Jianbin Zhang, Yew Mun Lee, Guangxue Feng, Teck Kwang Lim, Han-Ming Shen, Qingsong Lin, Bin Liu // Mechanism-Guided Design and Synthesis of a Mitochondria-Targeting Artemisinin Analogue with Enhanced Anticancer Activity // Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55(44): 13770-13774].

Соединение 6 (0.073 г, 0.3 ммоль), EDC (1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) гидрохлорид (0.096 мг, 0.5 ммоль), HOBt (1-гидроксибензотриазол) гидрат (0.068 мг, 0.5 ммоль) растворяли в ДМФА (10 мл) при охлаждении ледяной баней и затем перемешивали в течение 30 минут при комнатной температуре. Добавляли в колбу DMAP (4-диметиламинопиридин) (0.061 мг, 0.5 ммоль) и соединение 21 (0.5 ммоль) и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь упаривали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на SiO₂ (CHCl₃:MeOH 30:1→1:1). Получили бромид 3-(трифенилфосфонио)пропил-10Н-фенотиазин-2-амида (4). Выход 71%, т. пл. 150-152°С. ИК спектр, ν, см^-1: 1632 (CONH), 3426 (NH). Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, MeOD), δ, м. д. (J, Гц): 1.95-1.99 (2H, м, H-2'), 3.48-3.56 (4H, м, Н-1', Н-3'), 6.66-6.97 (5H, м, CH в фенотиазине), 7.11-7.20 (2H, м, CH в фенотиазине), 7.72-7.86 (15H, м, Ph). Спектр ЯМР ¹³С (125 МГц, MeOD), δ, м. д.: 21.20 (д, J _C = 50 Гц, C-3'), 23.88 (д, J _C = 3.7 Гц, C-2'), 41.15 (д, J _C = 18.7 Гц, C-1'), 114.14 (C в фенотиазине), 115.75 (C в фенотиазине), 117.92 (C-9), 120.11 (д, J _C,P = 85 Гц, Ph), 121.64 (C-3), 123.48 (C-7), 123.96 (C-1), 127.26 (C-4), 127.45 (C-6), 128.91 (C-8), 131.75 (д, J _C,P = 12.5 Гц, Ph), 134.47 (C-2), 134.96 (д, J _C.P = 10 Гц, Ph), 136.47 (д, J _C.P = 2.5 Гц, Ph), 143.20 (C в фенотиазине), 144.05 (C в фенотиазине), 169.86 (CONH). MS: m/z найдено 545.1706 [M-Br] (вычислено для C₃₄H₃₀N₂OPS 545.1811).

Пример 5

Бромид 6-(трифенилфосфонио)гексил-10Н-фенотиазин-2-амид (5): 2-цианофенотиазин трансформировали в соединение 6 (выход 92%) путем кипячения в смеси уксусной и соляной кислот по способу, описанному в примере 1.

К перемешиваемому раствору 1,6-дибромгексана (5.3 г, 21.6 ммоль) в безводном ДМФА (20 мл) была добавлена суспензия фталимида калия (1.0 г, 5.4 ммоль) в 16 мл безводного ДМФА. Смесь перемешивали при 90°C в течение 4 часов в атмосфере аргона и затем 10 часов при комнатной температуре. После завершения реакции (контроль ТСХ, EtOAc:гексан, 1:4), реакционную смесь фильтровали для удаления белого осадка бромида калия и фильтрат выпаривали досуха. Неочищенный продукт растворяли в CH₂Cl₂ и очищали колоночной хроматографией на силикагеле (гексан→1:4 EtOAc:гексан). Получили 2-(6-бромгексил)изоиндолин-1,3-диона (22). Выход 56%. Спектральные характеристики совпадали с литературными данными [Gang Cheng, Jacek Zielonka, Olivier Ouari, Marcos Lopez, Donna McAllister, Kathleen Boyle, Christy S. Barrios, James J. Weber, Bryon D. Johnson, Micael Hardy, Michael B. Dwinell, Balaraman Kalyanaraman // Mitochondria-targeted analogs of metformin exhibit enhanced antiproliferative and radiosensitizing effects in pancreatic cancer cells // Cancer Res., 2016, 76(13): 3904-3915].

Трифенилфосфониевую соль 2-(6-бромгексил)изоиндолин-1,3-диона (23) получали путем кипячения в ацетонитриле трифенилфосфина и соединения 22 по способу, описанному в примере 4. Выход 62% .Спектральные характеристики совпадали с литературными [Gang Cheng, Jacek Zielonka, Olivier Ouari, Marcos Lopez, Donna McAllister, Kathleen Boyle, Christy S. Barrios, James J. Weber, Bryon D. Johnson, Micael Hardy, Michael B. Dwinell, Balaraman Kalyanaraman // Mitochondria-targeted analogs of metformin exhibit enhanced antiproliferative and radiosensitizing effects in pancreatic cancer cells // Cancer Res., 2016, 76(13): 3904-3915].

Раствор соединения 23 (0.2 г, 0.35 ммоль) в 2.7 мл EtOH и моногидрата гидразина (0.4 мл) кипятили с обратным холодильником при перемешивании в течение 18 часов с образованием тяжелого белого осадка. Реакционной смеси затем давали остыть до комнатной температуры и фильтровали, осадок тщательно промывали 20 мл холодного EtOH. Выпаривание объединенных фильтратов при пониженном давлении и последующая очистка колоночной хроматографией на SiO₂ (CH₂Cl₂:MeOH 30:1→10:1) дало бромид (6-аминогексил)трифенилфосфония (24). Выход 87%. Спектральные характеристики совпадали с литературными данными [Gang Cheng, Jacek Zielonka, Olivier Ouari, Marcos Lopez, Donna McAllister, Kathleen Boyle, Christy S. Barrios, James J. Weber, Bryon D. Johnson, Micael Hardy, Michael B. Dwinell, Balaraman Kalyanaraman // Mitochondria-targeted analogs of metformin exhibit enhanced antiproliferative and radiosensitizing effects in pancreatic cancer cells // Cancer Res., 2016, 76(13): 3904-3915].

Конденсацию соединений 6 и 24 осуществляли карбодиимидным методом с образованием бромида 6-(трифенилфосфонио)гексил-10Н-фенотиазин-2-амида (5) по способу, описанному в примере 4. Выход 72%, т. пл. 114-116°С. ИК спектр, ν, см^-1: 1641 (CONH), 3426 (NH). Спектр ЯМР ¹Н (500 МГц, MeOD), δ, м. д. (J, Гц): 0.59-0.60 (2H, м, H-2'), 0.74-0.86 (6H, м, H-3'-H-5'), 2.50-2.52 (2H, м, H-6'), 2.55-2.59 (2H, м, H-1'), 5.85-6.15 (5H, м, CH в фенотиазине), 6.28-6.36 (2H, м, CH в фенотиазине), 6.93-7.07 (15H, м, Ph). Спектр ЯМР ¹³С (125 МГц, MeOD), δ, м. д.: 22.98 (д, J _C = 50 Гц, C-6'), 23.51 (C-5'), 27.13 (C-4'), 30.15 (C-3'), 31.23 (д, J _C = 16.2 Гц, C-2'), 40.68 (C-1'), 114.11 (C в фенотиазине), 115.76 (C в фенотиазине), 117.97 (C-9), 120.37 (д, J _C,P = 85 Гц, Ph), 121.53 (C-3), 123.46 (C-1, C-7), 127.23 (C-4), 127.46 (C-6), 128.89 (C-8), 131.70 (д, J _C,P = 12.5 Гц, Ph), 134.95 (д, J _C,P = 10.0 Гц, Ph), 135.12 (C-2), 136.36 (Ph), 143.28 (C в фенотиазине), 144.03 (C в фенотиазине), 169.64 (CONH). MS: m/z найдено 587.2258 [M-Br] (вычислено для C₃₇H₃₆N₂OPS 587.2280).

Пример 6

Влияние соединений на жизнеспособность опухолевых клеток человека

Исследование цитотоксичности новых веществ проводилось in vitro с использованием клеточных линий неопухолевого происхождения HEK293 (иммортализованные эмбриональные клетки почки человека) и опухолевого происхождения HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома человека), HTC116 (колоректальная карцинома человека), A549 (аденокарцинома легкого человека), MCF-7 (аденокарцинома протоков молочной железы человека), Jurkat (Т-лимфобластная лейкемия), THP-1 (острый моноцитарный лейкоз). Клетки линии HEK293 (20×10³ клеток на лунку), HepG2 (15×10³ клеток на лунку), A549 (5×10³ клеток на лунку), HTC116 (10×10³ клеток на лунку), MCF-7 (10×10³ клеток на лунку) высаживали в 96-луночные планшеты в 100 мкл среды DMEM (Gibco, США) в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, HyClone, США), 2 мМ L-глутамин и 50 мкг/мл гентамицина сульфата (Биолот, Россия). Клетки линии Jurkat (50×10³ клеток на лунку) и THP-1 (20×10³ клеток на лунку) высаживали в 96-луночные планшеты в 100 мкл среды RPMI-1640 (Gibco, США) в присутствии 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS, HyClone, США), 2 мМ L-глутамин и 50 мкг/мл гентамицина сульфата (Биолот, Россия). Через 24 ч к клеткам добавляли вещества в концентрациях 0.1-100 μМ с последующей инкубацией в течение 48 ч при 37°С, 5% СО₂. Конечная концентрация ДМСО составляла 0.1%. Цитотоксические свойства веществ оценивали с помощью МТТ-теста, согласно протоколу изготовителя (Invitrogen, США). После 4-часовой инкубации с МТТ, отбирали среду и добавляли по 50 мкл 100% ДМСО. Абсорбцию измеряли через 10 минут после добавления 100% ДМСО при длине волны 540 нм и референсной длине волны 600 нм, используя мультипланшетный анализатор EnSpire^® Multimode Plate Readers 2300 (Perkin Elmer, США). Находили среднее арифметическое нормализованных значений уровня абсорбции (отношение 540/600 нм) для каждой концентрации исследуемого вещества. Процент жизнеспособности рассчитывали по отношению к контрольной группе интактных клеток (0.1% DMSO), который принимали за 100%. Расчет величины IC₅₀ (концентрация вещества, при которой наблюдается 50%-ное ингибирование жизнеспособности клеток) осуществляли с помощью программы GraphPad Prizm 5.0 (GraphPad Software Inc., США). Данные представлены в виде среднего арифметического значения трех независимых экспериментов (N=3) с указанием стандартной ошибки среднего (M ± SEM). Статистический анализ данных проводили с помощью стандартного пакета программ Statistica 10 (StatSoft. Inc., США). Для выявления значимости различий значений IC₅₀ веществ между линией неопухолевого и опухолевого происхождения применяли дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием критерия Даннета.

Claims (12)

1. 2-Алкилтрифенилфосфониевое производное 10H-фенотиазина формулы 1, 2 или 3.

2. Способ получения 2-алкилтрифенилфосфониевого производного 10H-фенотиазина формулы 1, 2 или 3 по п.1, включающий взаимодействие 10Н-фенотиазин-2-карбоновой кислоты 6 с бромидами 4-бромбутилтрифенилфосфония, 6-бромгексилтрифенилфосфония, 8-бромоктилтрифенилфосфония 18-20.

3. Способ по п.2, включающий следующие стадии:

a) получают 10Н-фенотиазин-2-карбоновую кислоту 6 кипячением коммерчески доступного 2-цианофенотиазина в смеси ледяной уксусной и концентрированной соляной кислот в течение 18 часов с последующей хроматографической очисткой продукта на силикагеле;

b) получают бромиды 4-бромбутилтрифенилфосфония, 6-бромгексилтрифенилфосфония и 8-бромоктилтрифенилфосфония 18-20 сплавлением трифенилфосфина с соответствующими α,ω-дибромалканами (6-кратный мольный избыток дибромалканов по отношению к трифенилфосфину) при 90°С в течение 6 часов в атмосфере аргона с последующей хроматографической очисткой продуктов на силикагеле;

c) эквивалентные количества 10Н-фенотиазин-2-карбоновой кислоты 6, алкилтрифенилфосфониевых солей 18, 19 или 20 и К₂СО₃ растворяют в ДМФА и перемешивают при 50°С в течение 3 часов (контроль ТСХ), затем продукты подвергают очистке методом колоночной хроматографии на силикагеле с получением 2-алкилтрифенилфосфониевого производного 10H-фенотиазина формулы 1, 2 или 3 по п.1.

4. Применение 2-алкилтрифенилфосфониевого производного 10H-фенотиазина формулы 1, 2 или 3 по п.1 в качестве противоопухолевого средства.