RU2814985C2 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАЛКИЛ ТИОСУЛЬФИНАТОВ С ПОМОЩЬЮ ДВУХКОМПОНЕНТНОЙ СИСТЕМЫ МЕТИОНИН-γ-ЛИАЗА + СУЛЬФОКСИДЫ S-АЛКИЛ-L-ЦИСТЕИНА - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАЛКИЛ ТИОСУЛЬФИНАТОВ С ПОМОЩЬЮ ДВУХКОМПОНЕНТНОЙ СИСТЕМЫ МЕТИОНИН-γ-ЛИАЗА + СУЛЬФОКСИДЫ S-АЛКИЛ-L-ЦИСТЕИНА Download PDFInfo
- Publication number
- RU2814985C2 RU2814985C2 RU2021139509A RU2021139509A RU2814985C2 RU 2814985 C2 RU2814985 C2 RU 2814985C2 RU 2021139509 A RU2021139509 A RU 2021139509A RU 2021139509 A RU2021139509 A RU 2021139509A RU 2814985 C2 RU2814985 C2 RU 2814985C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- methionine
- lyase
- allicin
- cysteine
- thiosulfinates
- Prior art date
Links
- 108010043135 L-methionine gamma-lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 8
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 claims abstract description 9
- 241000186581 Clostridium novyi Species 0.000 claims abstract description 8
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 150000008111 thiosulfinates Chemical class 0.000 claims description 25
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- JDLKFOPOAOFWQN-UHFFFAOYSA-N allicin Chemical compound C=CCSS(=O)CC=C JDLKFOPOAOFWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- JDLKFOPOAOFWQN-VIFPVBQESA-N Allicin Natural products C=CCS[S@](=O)CC=C JDLKFOPOAOFWQN-VIFPVBQESA-N 0.000 description 29
- 235000010081 allicin Nutrition 0.000 description 29
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 16
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 16
- 108010092760 Alliin lyase Proteins 0.000 description 13
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- XUHLIQGRKRUKPH-UHFFFAOYSA-N S-allyl-L-cysteine sulfoxide Natural products OC(=O)C(N)CS(=O)CC=C XUHLIQGRKRUKPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- XUHLIQGRKRUKPH-DYEAUMGKSA-N alliin Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C[S@@](=O)CC=C XUHLIQGRKRUKPH-DYEAUMGKSA-N 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 9
- XUHLIQGRKRUKPH-GCXOYZPQSA-N Alliin Natural products N[C@H](C[S@@](=O)CC=C)C(O)=O XUHLIQGRKRUKPH-GCXOYZPQSA-N 0.000 description 8
- 235000015295 alliin Nutrition 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 8
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 8
- 241000234282 Allium Species 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 6
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 5
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- RRGUMJYEQDVBFP-UHFFFAOYSA-N (Methanesulfinylsulfanyl)methane Chemical compound CSS(C)=O RRGUMJYEQDVBFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 4
- ULXKXLZEOGLCRJ-BYPYZUCNSA-N S-ethyl-L-cysteine zwitterion Chemical compound CCSC[C@H](N)C(O)=O ULXKXLZEOGLCRJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 4
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 4
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 2-oxobutanoic acid Chemical compound CCC(=O)C(O)=O TYEYBOSBBBHJIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 3
- FIWQKOIUXFENIV-UHFFFAOYSA-N S-Ethyl ethanesulfinothioate Chemical group CCSS(=O)CC FIWQKOIUXFENIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WAAGBMYUYFBZIW-YFKPBYRVSA-N S-Propyl-L-cysteine Chemical compound CCCSC[C@H](N)C(O)=O WAAGBMYUYFBZIW-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- IDIDJDIHTAOVLG-UHFFFAOYSA-N S-methyl-L-cysteine Natural products CSCC(N)C(O)=O IDIDJDIHTAOVLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IDIDJDIHTAOVLG-VKHMYHEASA-N S-methylcysteine Chemical compound CSC[C@H](N)C(O)=O IDIDJDIHTAOVLG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- -1 dipropyl thiosulfinates Chemical class 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 101710152053 D-2-hydroxyisocaproate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- CSZTZFUEOCFFJH-UHFFFAOYSA-N Ethiin Chemical compound CCS(=O)CC(N)C(O)=O CSZTZFUEOCFFJH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000003718 Petiveria alliacea Species 0.000 description 2
- 150000008115 S-alk(en)yl-l-cysteine sulfoxides Chemical class 0.000 description 2
- ZZLHPCSGGOGHFW-UHFFFAOYSA-N S-methyl-L-cysteine sulphoxide Natural products CS(=O)CC(N)C(O)=O ZZLHPCSGGOGHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XPRZAEWSYWTDSQ-UHFFFAOYSA-N S-propyl propanethiosulfinate Chemical compound CCCSS(=O)CCC XPRZAEWSYWTDSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000223014 Syzygium aromaticum Species 0.000 description 2
- 235000016639 Syzygium aromaticum Nutrition 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 125000001434 methanylylidene group Chemical group [H]C#[*] 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- OBQBHBOGTLPNJM-HJULIUOESA-N (2r)-2-amino-3-benzylsulfinylpropanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CS(=O)CC1=CC=CC=C1 OBQBHBOGTLPNJM-HJULIUOESA-N 0.000 description 1
- CSZTZFUEOCFFJH-YGVKFDHGSA-N (2r)-2-amino-3-ethylsulfinylpropanoic acid Chemical compound CCS(=O)C[C@H](N)C(O)=O CSZTZFUEOCFFJH-YGVKFDHGSA-N 0.000 description 1
- JZKMSAGUCSIIAH-ITZCMCNPSA-N (2r)-2-amino-3-propylsulfinylpropanoic acid Chemical compound CCCS(=O)C[C@H](N)C(O)=O JZKMSAGUCSIIAH-ITZCMCNPSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 201000002909 Aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 208000036641 Aspergillus infections Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241001161843 Chandra Species 0.000 description 1
- 241000193470 Clostridium sporogenes Species 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000605862 Porphyromonas gingivalis Species 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- OKYHUOHBRKWCQJ-FTJYXMLISA-N S-1-propenyl-L-cysteine sulfoxide zwitterion Chemical compound C\C=C\S(=O)C[C@H](N)C(O)=O OKYHUOHBRKWCQJ-FTJYXMLISA-N 0.000 description 1
- OBQBHBOGTLPNJM-BJOHPYRUSA-N S-Benzyl-L-cysteine sulfoxide Natural products OC(=O)[C@@H](N)C[S@](=O)CC1=CC=CC=C1 OBQBHBOGTLPNJM-BJOHPYRUSA-N 0.000 description 1
- ZZLHPCSGGOGHFW-BUKSALPDSA-N S-Methylcysteine S-oxide Chemical compound CS(=O)C[C@H](N)C(O)=O ZZLHPCSGGOGHFW-BUKSALPDSA-N 0.000 description 1
- JZKMSAGUCSIIAH-UHFFFAOYSA-N S-n-propyl-L-cysteine sulfoxide Natural products CCCS(=O)CC(N)C(O)=O JZKMSAGUCSIIAH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BHLMCOCHAVMHLD-REOHCLBHSA-N S-oxy-L-cysteine Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CS=O BHLMCOCHAVMHLD-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012925 biological evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- OKYHUOHBRKWCQJ-UHFFFAOYSA-N cis S-1-Propenyl-L-cystein Natural products CC=CS(=O)CC(N)C(O)=O OKYHUOHBRKWCQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002634 lipophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 244000000000 soil microbiome Species 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения диалкил тиосульфинатов с помощью реакции β-элиминирования сульфоксидов S-алкил-L-цистеина в присутствии метионин-γ-лиазы из Clostridium novyi при комнатной температуре в калий-фосфатном буфере при рН 7,4. Изобретение обеспечивает эффективное получение диалкил тиосульфинатов. 6 ил., 1 табл., 1 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии и может быть использовано для получения диалкил тиосульфинатов с помощью двухкомпонентной системы пиридоксаль-5'-фосфат-зависимый фермент метионин-γ-лиаза из Clostidium novyi и сульфоксид S-алкил-L-цистеина.
Уровень техники
Сульфоксиды S-алк(ен)ил-L-цистеина - небелковые серосодержащие аминокислоты, обнаруженные в растениях подсемейства луковые. При повреждении клеток этих растений сульфоксиды S-алк(ен)ил-L-цистеина превращаются в соответствующие тиосульфинаты под действием фермента аллииназы (ЕС 4.4.1.4) (А. Stoll, Е. Seebeck. Chemical investigations on alliin, the specific principle of garlic. Adv. Enzymol. 1951, 11, 377-400). Впервые сульфоксид S-аллил-L-цистеина (аллиин) был выделен из чеснока в 1947 году (A. Stoll and Е. Seebeck, Experentia, 1947, 3, 114-115). Аллиин является предшественником большинства активных серосодержащих соединений чеснока, образующихся при измельчении чесночных долек. Важнейшим действующим началом чеснока считается диаллил тиосульфинат (аллицин). Антибактериальные свойства аллицина, выделенного из чеснока, впервые были исследованы Cavallito (C.J. Cavallito, J.H. Bailey. Allicin, the antibacterial principle of Allium sativum. I. Isolation, physical properties and antibacterial action. J. Am. Chem. Soc. 1944, 66, 1950-1951). Им же была открыта аллииназа, под действием которой аллиин превращается в аллицин. В клетках чесночной дольки аллииназа содержится в вакуолях, отгороженных от цитоплазмы собственными мембранами, в то время как аллиин равномерно распределен в цитоплазме. Разрушение чесночной клетки ведет к контакту аллииназы и аллиина, в результате чего образуется аллицин. Аллицин - гидрофобная липофильная молекула, обладающая множеством биологических активностей и легко проходящая через клеточные мембраны. Аллицин влияет на множество биологических процессов, в частности в достаточной дозе он оказывает цитотоксическое действие (C.J. Cavallito, J.H. Bailey. Allicin, the antibacterial principle of Allium sativum. I. Isolation, physical properties and antibacterial action. J. Am. Chem. Soc. 1944, 66, 1950-1951). Образование аллицина является защитным механизмом растений (чеснока, лука и других представителей подсемейства) от почвенных бактерий, грибков, червей и т.д. Более высокая эффективность аллицина по отношению к микроорганизмам объясняется наличием у теплокровных больших количеств глутатиона, нейтрализующего аллицин. Позже были выделены еще три сульфоксида из лука: сульфоксид S-метил-L-цистеина (метиин), сульфоксид S-пропил-L-цистеина (пропиин), сульфоксид S-тиранс-1-пропенил-L-цистеина (изоаллиин), сульфоксид S-этил-L-цистеина (этиин) из различных растений подсемейства луковые (R. Kubec, М. Svobodova and J. Velisek. Distribution of S-Alk(en)ylcysteine sulfoxides in some Allium species. Identification Of a new flavor precursor: S-ethylcysteine sulfoxide (Ethiin). J. Agric. Food Chem., 2000, 48, 428-433 doi: 10.1021/jf990938f), сульфоксид S-бензил-L-цистеина из Petiveria alliacea (R. Kubec, R.A. Musah. Cysteine sulfoxide derivatives in Petiveria alliacea. Phytochemistry 2001, 58, 981-985 doi: 10.1016/s0031-9422(01)00304-1).
Аллицин обладает антигрибковой, антибактериальной, антивирусной и антипротейной актиностями (Ankri S, Mirelman D. Antimicrobial properties of allicin from garlic. Microbes Infect. 1999, 1, 125-129 doi: 10.1016/s1286-4579(99)80003-3; Y. Shadkchan, E. Shemesh, D. Mirelman, T. Miron, A. Rabinkov, M. Wilchek, N. Osherov. Efficacy of allicin, the reactive molecule of garlic, in inhibiting Aspergillus spp.in vitro, and in a murine model of disseminated aspergillosis. J. Antimicrob. Chemother. 2004, 53, 832-836 doi: 10.1093/jac/dkh174.). Действие аллицина отличается от других антибиотиков тем, что он быстро проникает через мембрану бактериальной клетки и модифицирует тиоловые группы белков, многие из которых участвуют в важных метаболических процессах (A. Rabinkov, Т. Miron, L. Konstantinovsky, М. Wilchek, D. Mirelman, L. Weiner. The mode of action of allicin: trapping of radicals and interaction with thiol containing proteins. Biochim. Biophys. Acta (1998) 1379, 233-244. doi: 10.1016/s0304-4165(97)00104-9; A. Miiller, J. Eller, F. Albrecht, P. Prochnow, K. Kuhlmann, J.E. Bandow, A.J. Slusarenko, L. Leichert. Allicin Induces Thiol Stress in Bacteria through S-Allylmercapto Modification of Protein Cysteines. J. Biol. Chem. (2016) 291, 11477-11490 doi: 10.1074/jbc.M115.702308). Также известно, что аллицин способен ингибировать различные линии опухолевых клеток in vitro (K. Hirsch, М. Danilenko, J. Giat, Т. Miron, A. Rabinkov, M. Wilchek, D. Mirelman, J. Levy, Y. Sharoni. Effect of purified allicin, the major ingredient of freshly crushed garlic, on cancer cell proliferation. Nutr. Cancer (2000) 38, 245-254 doi: 10.1207/S15327914NC382J4). Однако, аллицин является химически нестабильной молекулой, чувствительной к нагреванию и имеющей непродолжительный срок хранения, так, при -20°С и при рН около 6, он распадается со скоростью 8% в месяц, по этой причине не существует аллицин-содержащих лекарственных препаратов. Было показано, что тиосульфинаты, имеющие в своем составе более длинные насыщенные алкильные группы, более стабильны, чем соединения с более коротким ненасыщенным заместителем (С. Shen, Н. Xiao, K.L. Parkin, In vitro stability and chemical reactivity of thiosulfinates. J. Agric. Food Chem. (2002) 50(9), 2644-51. doi: 10.1021/jf011013e). Аналоги аллицина - диалкил тиосульфинаты (диметил, диэтил и дипропил тиосульфинаты), полученные путем окисления диалкил дисульфидов перекисью водорода, обладают более высокой термостабильностью по сравнению с аллицином и сходными антибактериальной, противогрибковой и противоопухолевой активностями (R. Leontiev, N. Hohaus, С. Jacob, М.С.Н. Gruhlke, A.J. Slusarenko. A Comparison of the Antibacterial and Antifungal Activities of Thiosulfinate Analogues of Allicin. Sci. Rep. 2018, 8, 6763. doi: 10.1038/s41598-018-25154-9; A. Roseblade, A. Ung, M. Bebawy. Synthesis and in vitro biological evaluation of thiosulfinate derivatives for the treatment of human multidrug-resistant breast cancer. Acta Pharmacol. Sin. (2017) 38, 1353-1368 doi: 10.1038/aps.2016.170). Однако, при хранении синтетические диалкил тиосульфинаты распадаются в течение нескольких дней, поэтому представляет практический интерес получение этих соединений in situ с целью использования их как антимикробных и противоопухолевых агентов.
В европейском патенте ЕР 1404853 В1 (David Michael Williams, Chandra Mohen Pant, Process for the production of allicin//2006) описано получение аллицина при помощи выделенной из чеснока аллииназы. В американском патенте US 6689588 В1 (David Mirelman, Ramat Efal, Meir Wilchek, Talia Miron, Kfar Halm, Aharon Rabinkov, Hephzibah Sivaraman, Garlic alliinase covalently bound to carrier for continuous production of allicin//2004) описано получение значительных количеств аллицина из синтетического субстрата аллиина с помощью очищенной иммобилизованной аллииназы. В американском патенте US 20110027341 А1 (David Mirelman, Aharon Rabinkov, Device for in situ production and topical administration of allicin//2008) описано образование аллицина in situ для местного лечения грибковых инфекций с помощью раздельных твердых носителей, содержащих аллиин и аллииназу. Нестабильность аллицина ограничивает его применение. В связи с этим является актуальным получение более стабильных биологически активных аналогов аллицина. Получение и выделение тиосульфинатов с использованием иммобилизованной аллииназы, выделенной из лука, описано в работе (С. Shen, Н. Xiao, K.L. Parkin, In vitro stability and chemical reactivity of thiosulfinates. J. Agric. Food Chem. (2002) 50(9), 2644-51. doi: 10.1021/jfD11013e). Основным недостатком данного метода является тот факт, что аллииназа, получаемая из растительного сырья, ввиду того, что она является гликопротеином, на сегодняшний день не может быть клонирована.
Метионин-γ-лиаза (КФ 4.4.1.11) является пиридоксаль-5'-фосфат-зависимым ферментом, катализирующим реакцию расщепления L-метионина с образованием метилмеркаптана, аммония и α-кетобутирата (Фигура 1). Метионин-γ-лиаза была выделена из нескольких бактериальных источников, таких как Pseudomonas putida, Citrobacter freundii, Clostridium sporogenes, Clostridium tetani, Porphyromonas gingivalis. Фермент также катализирует реакцию β-элиминирования L-цистеина и его S-замещенных производных. Наличие подобной каталитической активности позволяет использовать метионин-γ-лиазу для синтеза тиосульфинатов из сульфоксидов S-замещенных L-аминокислот (Фигура 2). Ранее нами был клонирован фермент из Clostridium novyi с экспрессией 55% и получен гомогенный препарат с высокой удельной активностью (V.V. Kulikova, Е.А. Morozova, S.V. Revtovich, M.I. Kotlov, N.V. Anufrieva, N.P. Bazhulina, S. Raboni, S. Faggiano, E. Gabellieri, P. Cioni, Y.F. Belyi, A. Mozzarelli, T.V. Demidkina. Gene cloning, characterization, and cytotoxic activity of methionine γ-lyase from Clostridium novyi. Iubmb Life (2017) 69, 9, 668-676. doi: 10.1002/iub.1649). Наличие клонированного фермента метионин-γ-лиазы позволяет получать достаточные количества фермента и использовать его для ферментативного синтеза диалкил тиосульфинатов, обладающих антимикробными свойствами, в смесях с сульфоксидами S-алкил-L-цистеина - метиином, этиином и пропиином. Преимущество использования ферментативного способа заключается в том, что он позволяет получать тиосульфинаты in situ.
Раскрытие сущности изобретения
Настоящее изобретение посвящено способу получения диалкил тиосульфинатов (диметил-, диэтил- и дипропил тиосульфината) в результате реакции β-элиминирования сульфоксидов S-алкил-L-цистеина, катализируемой пиридоксаль-5'-фосфат-зависимой метионин-γ-лиазой из Clostridium novyi (Фигура 3).
В своем первом воплощении изобретение заключается в получении фермента - пиридоксаль-5'-фосфат-зависимой метионин-γ-лиазы из Clostridium novyi.
Во втором воплощении изобретение представляет реакцию β-элиминирования сульфоксидов S-алкил-L-цистеина под действием фермента, приводящую к получению целевых диалкил тиосульфинатов.
Краткое описание фигур и таблиц
Фигура 1. Реакция расщепления L-метионина, катализируемая метионин-γ-лиазой.
Фигура 2. Реакция β-элиминирования сульфоксидов, катализируемая метионин-γ-лиазой.
Фигура 3. Синтез диалкил тиосульфинатов с помощью метионин-γ-лиазы.
Фигура 4. 1Н-ЯМР спектры - а) ферментативной реакции метиина с метионин-γ-лиазой; б) метиина.
Фигура 5. 1Н-ЯМР спектры - а) ферментативной реакции этиина с метионин-γ-лиазой; б) этиина.
Фигура 6. а) 1Н-ЯМР спектр ферментативной реакции пропиина с метионин-γ-лиазой; б) область сигналов от метальных групп, по которым оценивают степень протекания ферментативной реакции; в) 1Н-ЯМР спектр пропиина.
Таблица 1. Выход диалкил тиосульфинатов в реакционной смеси сульфоксидов S-алкил-L-цистеина (10 мг/мл) с метионин-γ-лиазой из Clostridium novyi.
Осуществление изобретения
Целью изобретения являлось создание способа получения антибактериальных диалкил тиосульфинатов из сульфоксидов S-алкил-L-цистеина при помощи метионин-γ-лиазы из Clostridium novyi.
Клетки Escherichia coli BL21(DE3), содержащие ген метионин-γ-лиазы из Clostridium novyi в плазмиде рЕТ28а, выращивали на индуцирующей среде при +37°С с перемешиванием (180 об/мин) в течение 24 ч. Клетки собирали центрифугированием (5000 об/мин) в течение 20 мин, затем разрушали при помощи ультразвука. Полученную суспензию откручивали при 10000 об/мин 30 мин, затем проводили осаждение нуклеиновых кислот с помощью протамин сульфата (Serva). Далее очистку фермента проводили, используя ионообменную хроматографию на колонке с DEAE-сефарозой (GE Healthcare, Швеция), уравновешенной рабочим буфером (0,05 М калий-фосфатный буфер, рН 8,0, содержащий 1 мМ дитиотреитол и 0,1 мМ пиридоксаль-5'-фосфат). Колонку промывали рабочим буфером, содержащим 100 мМ KCl. Фермент элюировали рабочим буфером, содержащим 0,5 М KCl, далее концентрировали и диализовали против рабочего буфера. Чистоту препарата проверяли с помощью ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях по методу Лэммли (U.K. Laemmli. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (1970) 227(5259):680-5. doi: 10.1038/227680a0). Концентрацию очищенных препаратов определяли спектрофотометрически, используя коэффициент А1% 278 = 0,8 (Е.А. Морозова, Н.П. Бажулина, Н.В. Ануфриева, Д.В. Мамаева, Я.В. Ткачев, С.А. Стрельцов, В.П. Тимофеев, Н.Г. Фалеев, Т.В. Демидкина. Кинетические и спектральные параметры взаимодействия Citrobacter freundii метионин-γ-лиазы с аминокислотами. Биохимия (2010) Т. 75. С. 1272-1280). Готовые препараты фермента хранили в рабочем буфере при -20°С. Удельную активность фермента в реакции с L-метионином определяли при +37°С, измеряя скорость образования α-кетобутирата в сопряженной реакции с D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназой по снижению поглощения NADH при 340 нм (Δε=6220 М-1см-1). Реакционная смесь содержала 100 мМ L-метионина, 0,2 мМ NADH, 10 ед D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназы в рабочем буфере. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализирует образование 1 мкМ/мин α-кетобутирата.
Сульфоксиды S-алкил-L-цистеина (S-метил-L-цистеин, S-этил-L-цистеин, S-пропил-L-цистеин) были синтезированы, как описано ранее (Е. Morozova, V. Kulikova, A. Rodionov, S. Revtovich, N. Anufrieva, Т. Demidkina. Engineered Citrobacter freundii methionine γ-lyase effectively produces antimicrobial thiosulfinates. Biochimie (2016) 128-129, 92-98. doi: 10.1016/j.biochi.2016.07.007; W.H. Briggs, H. Xiao, K.L. Parkin, C. Shen, I.L. Goldman. Differential inhibition of human platelet aggregation by selected Allium thiosulfmates. (2000) J. Agric. Food Chem. 48, 5731-5735. doi: 10.1021/jf0004412).
Сульфоксиды S-метил-L-цистеина, S-этил-L-цистеина и S-пропил-L-цистеина растворяли в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,1 мМ пиридоксаль-5'-фосфата, смешивали с ферментом и инкубировали 1 час при комнатной температуре. В результате реакции получали раствор, содержащий тиосульфинаты. Для количественного определения тиосульфинатов в смеси использовали метод с 2-нитро-5-тиобензоатом (NTB) (Т. Miron, A. Rabinkov, D. Mirelman, L. Weiner, M. Wilchek. A spectrophotometric assay for allicin and alliinase (alliin lyase) activity: reaction of 2-nitro-5-thiobenzoate with thiosulfmates (1998) Anal. Biochem. 265. 317-325. doi: 10.1006/abio. 1998.2924). К реакционной смеси добавляли раствор NTB в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4 до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Инкубировали 30 минут при комнатной температуре и измеряли оптическое поглощение при 412 нм. Концентрацию тиосульфинатов определяли, используя коэффициент молярного поглощения NTB при 412 нм, равный 28300 М-1см-1. Образование тиосульфинатов подтверждали методом 1Н-ЯМР спектроскопии с использованием упомянутого выше буфера, приготовленного на D2O. Спектры 1Н-ЯМР регистрировали на спектрометре АМХ III-400 (Bruker BioSpin, GmbH, Германия) с рабочей частотой 400 МГц. На Фигуре 4а представлен спектр 1Н-ЯМР ферментативной реакции метиина с метионин-γ-лиазой. Степень конверсии метиина (91,7%) оценивали по соотношению сигналов протонов метальной группы метиина при 2,81 м.д. (Фигура 4б) и протонами одной из метальных групп диметил тиосульфината при 3,06 м.д. (на Фигуре 4а).
На Фигуре 5а представлен спектр 1Н-ЯМР ферментативной реакции этиина с метионин-γ-лиазой. Степень конверсии этиина (81,3%) оценивали по соотношению сигналов протонов метальной группы этиина при 1,13 м.д. (Фигура 5б) и протонами одной из метальных групп диэтил тиосульфината при 1,39 м.д. (Фигура 5а).
На Фигуре 6а представлен спектр 1Н-ЯМР ферментативной реакции пропиина с метионин-γ-лиазой. Из-за слабого различия химических сдвигов метальных групп исходного соединения (Фигура 6б) и продукта (Фигура 6а) происходит наложение сигналов (Фигура 6в). Степень конверсии была оценена по фрагментам сигналов и составила 46,1%.
В следующем Примере описано получение трех тиосульфинатов.
ПРИМЕР L
К раствору сульфоксидов (12,5 мг/мл) S-метил-L-цистеина, S-этил-L-цистеина и S-пропил-L-цистеина в 0,8 мл 50 мМ калий-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего 0,1 мМ пиридоксаль-5'-фосфата, добавляют 0,2 мл раствора метионин-γ-лиазы с концентрацией 2 мг/мл и удельной активностью 40 ед/мг в 50 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,1 мМ пиридоксаль-5'-фосфата. Полученную смесь инкубируют 1 час при комнатной температуре, затем определяют концентрацию диметил тиосульфината, диэтил тиосульфината и дипропил тиосульфината в реакционной смеси (Таблица 1) методом с NTB, для этого к реакционной смеси добавляют раствор NTB в 0,05 М калий-фосфатном буфере, рН 7,4 до конечной концентрации 0,2 мг/мл. Инкубируют 30 минут при комнатной температуре и измеряют оптическое поглощение при 412 нм. Концентрацию тиосульфинатов определяют, используя коэффициент молярного поглощения NTB при 412 нм, равный 28300 М-1см-1. Параллельно проводят реакцию в тех же условиях, с использованием буфера, приготовленного на D2O, далее образцы анализируют методом 1Н-ЯМР спектроскопии. Сигналы продуктов в 1Н-ЯМР спектрах соответствуют литературным данным (R. Leontiev, N. Hohaus, С. Jacob, М.С.Н. Gruhlke, A.J. Slusarenko. A Comparison of the Antibacterial and Antifungal Activities of Thiosulfinate Analogues of Allicin. Sci Rep (2018) 8(1), 6763. doi: 10.1038/s41598-018-25154-9).
Claims (3)
- Ферментативный способ получения диалкил тиосульфинатов с помощью реакции β-элиминирования сульфоксидов S-алкил-L-цистеина в присутствии метионин-γ-лиазы из Clostridium novyi при комнатной температуре в калий-фосфатном буфере, рН 7,4:
-
- где R представляет собой -СН3, -СН2-СН3, -СН2-СН2-СН3.
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2021139509A RU2021139509A (ru) | 2023-06-29 |
RU2814985C2 true RU2814985C2 (ru) | 2024-03-11 |
Family
ID=
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MOROZOVA E.A. et al. Engineered Citrobacter freundii methionine γ-lyase effectively produces antimicrobial thiosulfinates. Biochimie. 2016 Sep-Oct;128-129:92-8. doi: 10.1016/j.biochi.2016.07.007. KULIKOVA V.V. et al. Gene cloning, characterization, and cytotoxic activity of methionine γ-lyase from Clostridium novyi. IUBMB Life, 2017, vol. 69, N.9, pp. 668-676, doi: 10.1002/iub.1649. КУЛИКОВА В.В. и др. Антибактериальное действие тиосульфинатов на мультирезистентные штаммы бактерий, выделенные от больных муковисцидозом. Acta Naturae, 2018, vol. 10, N.3. pp. 83-87, doi: 10.32607/20758251-2018-10-3-77-80. АНУФРИЕВА Н.В. и др. Сульфоксиды - аналоги L-метионина и L-цистеина как пролекарства против грамположительных и грамотрицательных бактерий. Acta Naturae, 2015, vol. 7, N.4, pp. 128-135, doi: 10.32607/20758251-2015-7-4-128-135. SHEN C. et al. In vitro stability and chemical reactivity of thiosulfinates. J Agric Food Chem. 2002, vol. 50, N.9, pp. 2644-2651, doi: 10.1021/jf011013e. MOROZOVA * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yoshimoto et al. | S-Alk (en) ylcysteine sulfoxides in the genus Allium: Proposed biosynthesis, chemical conversion, and bioactivities | |
Ramli et al. | Bromelain: from production to commercialisation | |
Göcer et al. | Carbonic anhydrase inhibitory properties of phenolic sulfonamides derived from dopamine related compounds | |
Fujisawa et al. | Biological and chemical stability of garlic-derived allicin | |
Thomson et al. | The trypanothione–thiol system in Trypanosoma cruzi as a key antioxidant mechanism against peroxynitrite-mediated cytotoxicity | |
Zang et al. | Mechanism of discoloration in processed garlic and onion | |
US10117904B2 (en) | Use of anti-bacterial agents for the treatment of epithelial-related conditions | |
Morozova et al. | Engineered Citrobacter freundii methionine γ-lyase effectively produces antimicrobial thiosulfinates | |
JP7194455B2 (ja) | 操作された微生物からのエリオジクチオールの生合成 | |
Gocer et al. | Spirobisnaphthalenes effectively inhibit carbonic anhydrase | |
Parchem et al. | Enzymatic activities behind degradation of glucosinolates | |
Kamel et al. | Recent studies on the chemistry and biological activities of the organosulfur compounds of garlic (Allium sativum) | |
Kose et al. | The human carbonic anhydrase isoenzymes I and II inhibitory effects of some hydroperoxides, alcohols, and acetates | |
JP2021048881A (ja) | フェノール基質の対応するカテコール生成物への酵素的変換のための方法 | |
Amornwatcharapong et al. | Human and Plasmodium serine hydroxymethyltransferases differ in rate-limiting steps and pH-dependent substrate inhibition behavior | |
US9309508B2 (en) | Boronic and borinic acid compound as inhibitors of sulfenic acid-containing proteins | |
RU2814985C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАЛКИЛ ТИОСУЛЬФИНАТОВ С ПОМОЩЬЮ ДВУХКОМПОНЕНТНОЙ СИСТЕМЫ МЕТИОНИН-γ-ЛИАЗА + СУЛЬФОКСИДЫ S-АЛКИЛ-L-ЦИСТЕИНА | |
WO2020182853A1 (en) | Producing isothiocyanates from callus suspension cultures | |
Kitamura et al. | Occurrence of urea-based soluble epoxide hydrolase inhibitors from the plants in the order Brassicales | |
Costa et al. | Cytotoxic activity of l-lysine alpha-oxidase against leukemia cells | |
JP2006519615A (ja) | 非原核性生物微小藻類を用いる、化合物のバイオトランスフォーメーション | |
Wanat et al. | Substituted phosphonic analogues of phenylglycine as inhibitors of phenylalanine ammonia lyase from potatoes | |
Dhindsa | Hormonal regulation of enzymes of nonautotrophic CO2 fixation in unfertilized cotton ovules | |
Billaud et al. | Maillard reaction products derived from thiol compounds as inhibitors of enzymatic browning of fruits and vegetables: the structure‐activity relationship | |
Polak et al. | Effect of thiosulphinates contained in garlic extract on growth, proton fluxes and membrane potential in maize (Zea mays L.) coleoptile segments |